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JP5015610B2 - セルロース分解増強活性を有するポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents

セルロース分解増強活性を有するポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド Download PDF

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Description

発明の分野：
本発明は、セルロース分解増強活性を有する単離されたポリペプチド、及び前記ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。本発明はまた、前記ポリヌクレオチドを含んで成る、核酸構造体、ベクター及び宿主細胞、及び前記ポリペプチドの生成及び使用方法にも関する。
関連技術の記載：
セルロースは、β−１，４−結合により共有結合される単純糖グルコースのポリマーである。多くの微生物は、β−結合されたグルカンを加水分解する酵素を生成する。それらの酵素は、エンドグルカナーゼ、セロビオビドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼを包含する。エンドグルカナーゼは、セルロースポリマーをランダム位置で消化し、それを、セロビオヒドロラーゼによる攻撃に開放する。セロビオヒドロラーゼは、セルロースポリマーの末端からセロビオースの分子を連続的に開放する。セロビオースは、グルコースの水溶性β−１，４−結合されたダイマーである。β−グルコシダーゼは、セロビオースをグルコースに加水分解する。
セルロース供給原料のエタノールへの転換は、多量の供給原料の容易な利用性、材料の燃焼又は陸地充填の回避の所望性、及びエタノール燃料の清浄性の利点を有する。木材、農作物残留物、草葉収穫物及び都市のごみは、エタノール生成のための供給原料としてみなされて来た。それらの材料は主に、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンから成る。セルロースがグルコースに転換されるとすぐに、グルコースは、酵母によりエタノールに容易に発酵される。
セルロース性供給原料の転換性を改良することは、当業界において好都合である。
セルロース分解増強活性を有する単離されたポリペプチド、及び前記ポリペプチドをコードする単離された核酸配列を、セルロース性供給原料の転換性を改良するために供給することが、本発明の目的である。
発明の要約：
本発明は、
（ａ）配列番号２のアミノ酸23〜250と少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）（i）配列番号１のヌクレオチド67〜796、（ii）配列番号１のヌクレオチド67〜796に含まれるcDNA配列、又は（iii）前記（i）もしくは（ii）の相補的鎖と、少なくとも中位の緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列によりコードされるポリペプチド；及び
（ｃ）配列番号２のアミノ酸23〜250の１又は複数のアミノ酸の保存性置換、欠失及び/又は挿入を含んで成る変異体から成る群から選択された、セルロース分解増強活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
本発明はまた、
（ａ）配列番号２のアミノ酸23〜250と少なくとも70％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１のヌクレオチド67〜796と少なくとも70％の同一性を有するポリヌクレオチド；及び
（ｃ）（i）配列番号１のヌクレオチド67〜796、（ii）配列番号１のヌクレオチド67〜805に含まれるcDNA配列、又は（iii）前記（i）もしくは（ii）の相補的鎖と、少なくとも中位の緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドから成る群から選択された、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。
本発明はまた、前記ポリヌクレオチドを含んで成る、核酸構造体、組換え発現ベクター、及び組換え宿主細胞にも関する。
本発明はまた、（ａ）セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んで成る核酸構造体を含んで成る組換え宿主細胞を、前記ポリペプチドの生成の助けと成る条件下で培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法にも関する。
本発明はまた、配列番号１のヌクレオチド１〜66から成るシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列に作用可能に結合されるタンパク質をコードする、前記ヌクレオチド配列に対して外来性の遺伝子を含んで成る核酸構造体にも関する。
本発明はまた、セルロース材料を分解するか又は転換するための方法にも関し、ここで前記セルロース材料を、有効量のセルロース分解タンパク質により、セルロース分解増強活性を有する、有効量のポリペプチドの存在下で処理し、ここで前記セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの不在に比較して、セルロース材料の分解を高める。
本発明はさらに、
（ａ）セルロース材料を、有効量のセルロース分解タンパク質により、セルロース分解増強活性を有する、有効量のポリペプチドの存在下で糖化し、ここで前記セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの不在に比較して、セルロース材料の分解を高め；
（ｂ）段階（ａ）の糖化されたセルロース材料を、１又は複数の発酵微生物と共に発酵し；そして
（ｃ）前記酵素から有機物質を回収することを含んで成る、有機物質の生成方法にも関する。
定義：
セルロース分解増強活性：この用語“セルロース分解増強活性”とは、セルロース分解活性を有するタンパク質による、セルロース材料の加水分解を増強する生物学的活性として、本明細書において定義され得る。本発明のためには、セルロース分解増強活性は、セルロース分解増強活性を有さない等しい合計タンパク質負荷による対照加水分解に比較して（5.01〜7.5mgのセルロース分解タンパク質/PCS中、1gのセルロース）、次の条件下でセルロース分解タンパク質によるセルロース材料の加水分解からの還元糖の上昇を測定することにより決定される： PCS中、1gのセルロース当たり0.01〜2.5mgのセルロース分解増強活性の存在又は不在下での、50℃で５〜７日間の、PCS中、1gのセルロース当たり5.0mgのセルロース分解タンパク質。好ましい態様においては、この後、Tr/AoBGと呼ばれ、そしてNovozymes A/S, Bagsvoerd, Denmarkから得られた、アスペルギラス・オリザエ（WO02/095014）号からのβ−グルコシダーゼを発現するトリコダーマ・レセイの発酵に由来する、セルラーゼタンパク質負荷のセルラーゼ調製物が、セルロース分解活性の源として使用される。
本発明のポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸23〜250として示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドのセルロース分解増強活性の少なくとも20％、好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも60％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、さらにより好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％、及びさらに最も好ましくは少なくとも100％を有する。
セルロース材料：用語“セルロース材料とは、セルロースを含むいずれかの材料として本明細書において定義される。セルロースは一般的に、植物の茎、葉、外皮、皮及び穂軸、又は木の葉、枝及び木部に見出される。セルロース材料はまた、草葉性物質、農作物残留物、山林残留物、都市のごみ、古紙、及び紙パルプ工場残留物であり得るが、但しそれらだけには限定されない。セルロースは、リグノセルロース、すなわちリグニン、セルロース及びヘミセルロースを混合されたマトリックスに含む植物細胞壁材料の形で存在することができることが本明細書において理解される。
好ましい観点においては、セルロース材料は、トウモロコシの茎である。もう１つの好ましい観点においては、セルロース材料は、トウモロコシ繊維である。もう１つの好ましい観点においては、セルロース材料はイネのわらである。もう１つの好ましい観点においては、セルロース材料は、紙及びパルプ処理廃棄物である。もう１つの好ましい観点においては、セルロース材料は、木質又は草葉性植物である。もう１つの好ましい観点においては、セルロース材料はバガスである。
セルロース材料は、そのまま使用され得るか、又は当業界において知られている従来の方法を用いて、前処理にゆだねられ得る。例えば、物理的前処理技法は、種々のタイプの微粉砕、照射、蒸気爆発、及び熱水分解を包含し；化学的前処理技法は、希酸、アルカリ、有機溶液、アンモニア、二酸化硫黄、二酸化炭素及びpH−調節された熱水分解を包含し；そして生物学的前処理技法は、リグニン溶液性微生物の適用を包含することができる（例えば、Hsu, T. -A., 1996, Pretreatment of biomass, in Handbook on Bioethanol : Production and Utilization, Wyman, C. E. , ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh, P. , and Singh, A. , 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D. , 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, M. E. , Baker, J. O., and Overend, R. P. , eds. , ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, C. S. , Cao, N. J. , Du, J. , and Tsao, G. T. , 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T. , ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson, L., and Hahn-Hagerdal, B. , 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; 及び Vallander, L. , and Eriksson, K.-E. L. , 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materials : State of the art, Adv. Biochem. Eng. lBiotechnol. 42: 63-95を参照のこと）。
セルロース分解活性：用語“セルロース分解活性”とは、セルロース材料を加水分解する生物学的活性として本明細書においては定義される。本発明のためには、セルロース分解活性は、セルロース分解タンパク質の添加を伴わないでの対照の加水分解に比較して、次の条件下でセルロース分解混合物によるセルロース材料の加水分解の上昇を測定することにより決定される：50℃で５〜７日間、PCSにおけるgセルロース当たり１〜10mgのセルロース分解タンパク質。好ましい態様においては、この後、Tr/AoBGと呼ばれ、そしてNovozymes A/S, Bagsvoerd, Denmarkから得られた、アスペルギラス・オリザエ（WO02/095014）号からのβ−グルコシダーゼを発現するトリコダーマ・レセイの発酵に由来する、セルラーゼタンパク質負荷のセルラーゼ調製物が、セルロース分解活性の源として使用される。
前処理されたトウモロコシの茎：用語“前処理されたトウモロコシの茎”又は“PGS”とは、熱及び希酸による処理によりトウモロコシの茎に由来するセルロース材料として本明細書において定義される。本発明のためには、PCSは、例９に記載される方法、又は時間、温度及び酸の量におけるその変法により製造される。
ファミリー61グルコシドヒドロラーゼ：用語“ファミリー61グリコシドヒドロラーゼ”又は“ファミリーGH61”とは、B. Henrissat, 1991, A classification of glycosyl hydrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, 及び Henrissat B. , and Bairoch A. , 1996, Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases, Biochem, J. 316: 695-696に従って、グルコシドヒドロラーゼファミリー61に分類されるポリペプチドとして本明細書において定義される。現在、Henrissatは、分類されていないようなGH61ファミリーを列挙し、性質、例えば機構、触媒求核試薬/塩基触媒性プロトンドナー、及び３−D構造が、このファミリーに属するポリペプチドについて知られていないことを示唆する。
単離されたポリペプチド：用語“単離されたポリペプチド”とは、本明細書において使用される場合、SDS−PAGEにより測定される場合、少なくとも20％純粋、好ましくは少なくとも40％純粋、より好ましくは少なくとも60％純粋、さらにより好ましくは少なくとも80％純粋、最も好ましくは少なくとも90％純粋、及びさらに最も好ましくは少なくとも95％純粋であるポリペプチドを言及する。
実質的に純粋なポリペプチド：本明細書においては、用語“実質的に純粋なポリペプチド”とは、多くても10重量％、多くても８重量％、多くても６重量％、多くても５重量％、多くても４重量％、多くても３重量％、多くても２重量％、多くても１重量％及び多くても0.5重量％の天然に関連する他のポリペプチド材料を含むポリペプチド調製物を意味する。従って、実質的に純粋なポリペプチドは、調製物に存在する合計のポリペプチド材料の少なくとも92％純粋、好ましくは少なくとも94％、より好ましくは少なくとも95％、より好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％、より好ましくは少なくとも98％、さらにより好ましくは少なくとも99％、最もより好ましくは少なくとも99.5％、及びさらに最も好ましくは100％純粋であることが好ましい。
本発明のポリペプチドは、好ましくは、実質的に純粋な形で存在する。特に、好ましくは、前記ポリペプチドは“実質的に純粋な形”で存在し、すなわちポリペプチド調製物は、それが天然において関連する他のポリペプチド材料を実質的に有さない。これは、例えば、良く知られている組換え方法により、又は従来の精製方法により前記ポリペプチドを調製することにより達成され得る。
ここで、用語“実質的に純粋なポリペプチド”は、用語“単離されたポリペプチド”及び“単離された形のポリペプチド”と類似語である。
同一性：２種のアミノ酸配列又は２種のヌクレオチド配列間の関連性が、パラメーター“同一性”により記載される。
本発明のためには、２種のアミノ酸配列間の同一性の程度は、Paracel BioView Workbench ソフトウエアー(Paracel, Pasadena, CA)及びblosum62を用いて、blastpアルゴリズム（Higgins, 1989, CABIOS 5: 151- 153）により決定され得る。ギャップペナルティー、存在：11及び延長：１が、対様アリグメントパラメーターとして使用された。
本発明のためには、２種のヌクレオチド配列間の同一性の程度は、LASERGENETM MEGALIGNT ソフトウエアー (DNASTAR, Inc., Madison, WI)、及び同一性の表及び次の複数のアリグメントパラメーターを用いて、Wilbur-Lipman 法(Wilbur and Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730)により決定された：10のギャップペナルティー及び10のギャップ長ペナルティー。対様アリグメントパラメーターは、Ktuple＝３、ギャップペナルティ＝３及び窓＝20である。
ポリペプチドフラグメント：用語“ポリペプチドフラグメント”とは、配列番号２のアミノ酸23〜250のアミノ及び/又はカルボキシル末端から欠失された１又は複数のアミノ酸を有するポリペプチド又はその相同配列として、本明細粗において定義され、ここで前記フラグメントは、セルロース分解増強活性を有する。好ましくは、配列番号２のアミノ酸23〜250のフラグメントは、少なくとも175個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも190個のアミノ酸残基、及び最も好ましくは少なくとも205個のアミノ酸残基を含む。
副配列：用語“副配列”(Subsequence)とは、配列番号１のヌクレオチド67〜805の5’及び/又は3’末端から欠失された１又は複数のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列、又はその相同配列として定義され、ここで前記副配列は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドフラグメントをコードする。好ましくは、配列番号１のヌクレオチド67〜805の副配列は、少なくとも525個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも570個のヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも615個のヌクレオチドを含む。
対立遺伝子変異体：用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を支配する遺伝子の複数の形のいずれかを、本明細書において示す。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然において発生し、そして集団内で多形現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異はサイレントであり得るか（コードされるポリペプチドに変化はない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるポリペプチドである。
単離されたポリヌクレオチド：用語“単離されたポリヌクレオチド”とは、本明細書において使用される場合、アガロースゲル電気泳動により決定される場合、少なくとも20％純粋、好ましくは少なくとも40％純粋、より好ましくは少なくとも60％純粋、さらにより好ましくは少なくとも80％純粋、最も好ましくは少なくとも90％純粋、及びさらに最も好ましくは少なくとも95％純粋であるポリヌクレオチドを言及する。
実質的に純粋なポリヌクレオチド：用語“実質的に純粋なポリヌクレオチド”とは、本明細書において使用される場合、他の外来の又は所望しないコード配列を有さない、及び遺伝子的に構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形でのポリヌクレオチド調製物を言及する。従って、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、多くても10重量％、好ましくは多くても８重量％、より好ましくは多くても６重量％、より好ましくは多くても５重量％、より好ましくは多くても４重量％、より好ましくは多くても３重量％、さらにより好ましくは多くても２重量％、最も好ましくは多くても１重量％及びさらの最も好ましくは多くても0.5重量％の天然において関連する他のポリヌクレオチド材料を含む。
しかしながら、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、天然に存在する5’及び3’末翻訳領域、例えばプロモーター及びターミネーターを含むことができる。実質的に純粋なポリヌクレオチドは少なくとも90％純粋、好ましくは少なくとも92％、より好ましくは少なくとも94％、より好ましくは少なくとも95％、より好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％、さらにより好ましくは少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％及びさらに最も好ましくは多くても99.5％純粋であることが好ましい。
本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、実質的に純粋な形で存在する。特に、好ましくは、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは“実質的に純粋な形”で存在し、すなわちポリヌクレオチド調製物は、それが天然において関連する他のポリヌクレオチド材料を実質的に有さない。ここで、用語“実質的に純粋なポリヌクレオチド”は、用語“単離されたポリヌクレオチド”及び“単離された形のポリヌクレオチド”と類似語である。ポリヌクレオチドは、ゲノムcDNA, RNA, 半合成、合成起源、又はそれらのいずれかの組合せのものであり得る。
cDNA：用語“cDNA”とは、真核細胞から得られる、成熟した、スプライシングされたmRNA分子から逆転写により調製され得るDNA分子を包含する。cDNAは、その対応するゲノムDNAに通常存在するイントロン配列を欠いている。初期一次RNA転写体は、mRNAに対する前駆体であり、そしてそれは、成熟した、スプライシングされたmRNAとして出現する前、一連の段階を通してプロセッシングされる。それらの段階は、スプライシングと呼ばれる工程によるイントロン配列の除去を包含する。従って、mRNAに由来するcDNAは、いずれのイントロン配列も欠いている。
核酸構造体：本明細書において使用される場合、用語“核酸構造体”とは、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又はさもなければ、天然において存在しない態様で核酸のセグメントを含むよう修飾された、一本鎖又は二本鎖核酸分子を意味する。用語、核酸構造体は、核酸構造体が本発明のコード配列の発現のために必要とされる制御配列を含む場合、用語“発現カセット”と類似語である。
制御配列：用語“制御配列”とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために必要であるか、又はそのために好都合であるすべての成分を包含するよう定義される。個々の制御配列は、前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して生来であっても又は外来性であっても良く、又はお互いに対して生来であっても又は外来性であっても良い。そのような制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターを包含するが、但しそれらだけには限定されない。最少で、制御配列は、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを包含する。制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域と制御配列との連結を促進する特定の制限部位を導入するためにリンカーを提供され得る。
作用可能に結合された：用語“作用可能に結合された”とは、本明細書においては、制御配列が、ポリペプチドのコード配列の発現を方向づけるよう、ポリヌクレオチド配列のコード配列に対する適切な位置に配置される形状として定義される。
コード配列：本明細書において使用される場合、用語“コード配列”とは、そのタンパク質生成物のアミノ酸配列を直接的に特定するヌクレオチド配列を包含する。コード配列の境界は一般的に、ATG開始コドン、又は他の開始コドン、例えばGTG及びTTGにより通常、開始し、そしてTAA、TAG及びTGAにより終結する読み取り枠により決定される。コード配列は、DNA、cDNA及び組換えヌクレオチドを包含する。
発現：本発明においては、用語“発現”とは、ポリペプチドの生成に包含されるいずれかの段階、例えば転写、後−転写修飾、翻訳、後−翻訳修飾、及び分泌を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
発現ベクター：本発明においては、用語“発現ベクター”とは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んで成り、そしてその発現を提供する追加のヌクレオチドに作用可能に結合される、線状又は環状のDNA分子を包含する。
宿主細胞：用語“宿主細胞”とは、本明細書において使用される場合、本発明のポリヌクレオチドを含んで成る核酸構造体又は発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、トランスダクション、及び同様のものに対して敏感であるいずれかの細胞系を包含する。
修飾：用語“修飾”とは、配列番号２のアミノ酸23〜250を含んで成るか、又はそれらから成るポリペプチド、又はそれらの相同配列のいずれかの化学的修飾、及び前記ポリペプチドをコードするDNAの遺伝子操作を、本明細書においては意味する。修飾は、１又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入、及び１又は複数のアミノ酸側鎖の置換であり得る。
人工変異体：本明細書において使用される場合、用語“人工多遺伝子”とは、配列番号１の修飾されたヌクレオチド配列、又はその相同配列、又はその成熟コード領域を発現する生物により生成されるセルロース分解増強活性を有するポリペプチドを意味する。修飾されたヌクレオチド配列は、配列番号１で開示されるヌクレオチド配列、又はその相同配列、又はその成熟コード領域の修飾により、ヒト介在を通して得られる。
発明の特定の記載：
セルロース分解増強活性を有するポリペプチド：
第１の観点においては、本発明は、配列番号２（すなわち、成熟ポリペプチド）のアミノ酸23〜250に対して、少なくとも70％、好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、さらに好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％、及びさらに最も好ましくは少なくとも97％、98％又は99％の程度を有するアミノ酸配列を有する単離されたポリペプチド（セルロース分解増強活性を有する）（この後、“相同ポリペプチドと称する）に関する。好ましい観点においては、相同ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸23〜250とは、10個までのアミノ酸、好ましくは５個までのアミノ酸、より好ましくは４個までのアミノ酸、さらにより好ましくは３個までのアミノ酸、最も好ましくは２個までのアミノ酸、及びさらに最も好ましくは１個までのアミノ酸で異なるアミノ酸配列を有する。
本発明のポリペプチドは好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体；又はセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含んで成る。好ましい観点においては、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含んで成る。もう１つの好ましい観点においては、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸23〜250、又はその対立遺伝子変異体；又はセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントを含んで成る。もう１つの好ましい観点においては、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸23〜250を含んで成る。
もう1つの好ましい観点においては、ポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異体；又はセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントから成る。もう１つの好ましい観点においては、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸から成る。もう１つの好ましい観点においては、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸23〜250、又はその対立遺伝子変異体；又はセルロース分解増強活性を有するそのフラグメントから成る。もう１つの好ましい観点においては、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸23〜250から成る。
第２の観点においては、本発明は、（i）配列番号１のヌクレオチド67〜796、（ii）配列番号１のヌクレオチド67〜796に含まれるcDNA配列、（iii）前記（i）もしくは（ii）の副配列、又は（iv）前記（i）、（ii）（iii）の相補的鎖と、非常に低い緊縮条件下で、好ましくは低い緊縮条件下で、より好ましくは中位の緊縮条件下で、より好ましくは中位の高い緊縮条件下で、さらにより好ましくは高い緊縮条件下で、及び最も好ましくは非常に高い緊縮条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、セルロース分解増強活性を有する単離されたポリペプチドに関する（J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York）。配列番号１の副配列は、少なくとも100個の連続したヌクレオチド、又は好ましくは少なくとも200個の連続したヌクレオチドを含む。さらに、副配列は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドフラグメントをコードすることができる。
配列番号１のヌクレオチド配列又はその副配列、及び配列番号２のアミノ酸配列又はそのフラグメントは、当業界において良く知られている方法に従って、異なった属又は種の株からのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするDNAを同定し、そしてクローン化するための核酸プローブを企画するために使用され得る。特に、そのようなプローブは、そこにおける対応する遺伝子を同定し、そして単離するために、標準のサザンブロット方法に従って、興味ある属又は種のゲノム又はcDNAとのハイブリダイゼーションのために使用され得る。そのようなプローブは、完全な配列よりも相当に短いが、しかし少なくとも14個、好ましくは少なくとも25個、より好ましくは少なくとも35個、及び最も好ましくは少なくとも70個の長さのヌクレオチドであるべきである。
しかしながら、好ましくは、核酸プローブは少なくとも100個の長さのヌクレオチドである。例えば、核酸プローブは、少なくとも200個、好ましくは少なくとも300個、より好ましくは少なくとも400個、又は最も好ましくは少なくとも500個の長さのヌクレオチドであり得る。さらに長いプローブ、例えば少なくとも550個、好ましくは少なくとも600個、より好ましくは少なくとも650個、又は最も好ましくは少なくとも700個の長さのヌクレオチドである核酸プローブが使用され得る。DNA及びRNAの両プローブが使用され得る。プローブは典型的には、対応する遺伝子を検出するためにラベルされる（たとえば、32P, 3H, 35S, ビオチン、アビジン、フルオレセイン又はジゴキシゲニンにより）。そのようなプローブは、本発明により包含される。
従って、そのような他の生物から調製されたゲノムDNA又はcDNAライブラリーは、本明細書に記載されるプローブとハイブリダイズし、そしてセルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするDNAについてスクリーンされ得る。そのような生物からのゲノム又は他のDNAは、アガロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技法により分離され得る。ライブラリーからのDNA又は分離されたDNAが、ニトロセルロース又は他の適切なキャリヤー材料に移行され、そしてその上に固定され得る。配列番号１と相同であるクローン又はDNA、又はその副配列を同定するためには、キャリヤー材料がサザンブロットに使用される。
本発明のためには、ハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド配列が、非常に低い〜非常に高い緊縮条件下で、配列番号１に示されるヌクレオチド配列、、配列番号１に含まれるcDNA 、その相補的鎖、又はその副配列に対応するラベルにされた核酸プローブにハイブリダイズすることを示す。核酸プローブがそれらの条件下でハイブリダイズする分子は、X−線フィルムを用いて検出される。
好ましい観点においては、核酸プローブは、配列番号２のポリペプチド又はその副配列をコードする核酸配列である。もう1つの好ましい観点においては、核酸プローブは配列番号１である。もう１つの好ましい観点においては、核酸プローブは、配列番号１の成熟ポリペプチドコード領域である。もう１つの好ましい観点においては、核酸プローブは、E. コリNRRL B-30704に含まれるプラスミドpDZA2-7に含まれる核酸配列であり、ここで前記核酸配列は、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードする。もう１つの好ましい観点においては、核酸プローブは、E. コリNRRLB-30704に含まれるプラスミドpD2A-7に含まれる成熟ポリペプチドコード領域である。
少なくとも100個の長さのヌクレオチドの長さのプローブに関して、非常に低い〜非常に高い緊縮条件は、標準のサザンブロット方法に従っての、５×SSPE, 0.3%SDS, 200μg/ml の剪断され、そして変性されたサケ精子DNA、及び25％ホルムアミド（非常に低い及び低い緊縮に関して）、35％ホルムアミド（中位い及び中位の高い緊縮に関して）、又は50％ホルムアミド（高い及び非常に高い緊縮に関して）における42℃での、最適には12〜24時間のプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションとして定義される。
少なくとも100個の長さのヌクレオチドの長さプローブに関しては、キャリヤー材料は最終的に、２×SSC, 0.2%SDS溶液を用いて、好ましくは少なくとも45℃（非常に低い緊縮）、より好ましくは少なくとも50℃（低い緊縮）、より好ましくは少なくとも55℃（中位の緊縮）、より好ましくは少なくとも60℃（中位の高い緊縮）、さらにより好ましくは少なくとも65℃（高い緊縮）、および最も好ましくは少なくとも70℃（非常に高い緊縮）で、それぞれ15分間、３度洗浄される。
約15個〜約70個の長さのヌクレオチドである短いプローブに関しては、緊縮条件は、0.9MのNaCl、0.09Mのトリス−HCl, pH7.6、 ６mM のEDTA、 0.5のNP-40, 1×Denhardt’s溶液、１mMのピロリン酸ナトリウム、１mMの一塩基性リン酸ナトリウム、0.1mMのATP及び0.2mgの酵母RNA（ml当たり）における、Bolton and McCarthy（1962、Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48: 1390）に従って計算されたTmよりも約５℃〜約10℃低い温度での標準のサザンブロット方法に従っての、最適には12〜24時間のプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及び後−ハイブリダイゼーション洗浄として定義される。
約15個〜約70個の長さのヌクレオチドである短いプローブに関しては、キャリヤー材料は、６×SSC及び0.1％SDSにより15分間、1度、及び６×SSCを用いて、計算されたTmよりも約５℃〜約10℃低い温度でそれぞれ15分間、２度、洗浄される。
第３の観点においては、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列又はその相同配列、またはその成熟ポリペプチドの１又は複数のアミノ酸の保存性置換、欠失及び/又は挿入を含んで成る人工変異体に関する。好ましくは、アミノ酸変更は、マイナーな性質のもの、すなわちタンパク質の折りたたみ及び/又は活性に有意に影響を及ぼさない保存性アミノ酸置換又は挿入；典型的には１〜約30個のアミノ酸の小さな欠失；小さなアミノ−又はカルボキシ−末端−、たとえばアミノ−末端のメチオニン残基の延長；約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長；又は実効電荷又は他の機能、たとえばポリ−ヒスチジン系、抗原性エピトープ又は結合ドメインを変更することにより精製を促進する小さな延長のものである。
保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さなアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）のグループ内である。一般的に、非活性を変更しないアミノ酸置換は当業界において知られており、そしてたとえば、H. Neurath and R.L. Hill, 1979, The Proteins, Academic Press, New York により記載されている。最も通常生じる交換は次のものである： Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/ Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu及びAsp/Gly。
20個の標準のアミノ酸の他に、非標準のアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、６−N−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン及びα−メチルセリン）は、野生型ポリペプチドのアミノ酸残基により置換され得る。制限された数の非保存性アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、アミノ酸残基により置換され得る。“不自然なアミノ酸”は、タンパク質合成の後、修飾され、そして/又は標準のアミノ酸の側鎖とは異なるそれらの側鎖に化学的構造を有する。不自然なアミノ酸は、化学的に合成され得、又は好ましくは、市販されており、そしてピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン及び３,３−ジメチルプロリンを包含する。
他方では、アミノ酸変更は、ポリペプチドの生化学的性質が変更されるような性質のものである。例えば、アミノ酸変更は、ポリペプチドの熱安定性を改良し、基質特異性を変更し、pH最適性を変更し、そして同様のことである、
親ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発、又はアラニン−走査突然変異誘発に従って同定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085, 1989）。後者の技法においては、単一のアラニンの突然変異が分子におけるあらゆる残基に導入され、そして得られる変異体分子は、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、生物学的活性（すなわち、セルロース分解増強活性）について試験される。
また、Hilton など., J. Biol. Chem. 271: 4699-4708, 1996を参照のこと。酵素又は他の生物学的相互作用の活性部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、構造の物理的分析によっても決定され得る。例えば、de Vos など., Science 255: 306-312, 1992; Smith など., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver など., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992を参照のこと。必須アミノ酸の本体はまた、本発明のポリペプチドに関連するポリペプチドとの相同性の分析からも推定され得る。
単一又は複数のアミノ酸置換は、突然変異誘発、組換え及び/又はシャフリング、続く適切なスクリーニング方法、例えばReidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 53-57, 1988), Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989), WO95/17413号又はWO95/22625号により開示される既知の方法を用いて、生成され、そして試験され得る。使用され得る他の方法は、エラー傾向PCR、ファージ表示（例えば、Lowman など., Biochem. 30: 10832-10837, 1991;アメリカ特許第5,223,409号； WO92/06204号）及び特定領域の突然変異誘発（Derbyshire など., Gene 46: 145, 1986; Ner など., DNA 7: 127, 1988）を包含する。
上記に開示されるような突然変異誘発/シャフリング方法は、宿主細胞により発現される、クローン化され、突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために、高い処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る(Ness など., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896)。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発されたDNA分子は、宿主細胞から回収され、そして当業界における標準の方法を用いて急速に配列決定され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける重要な個々のアミノ酸残基の急速な決定を可能にし、そして未知の構造体のポリペプチドに適用され得る。
配列番号２のアミノ酸23〜250のアミノ酸置換、欠失及び/又は挿入の合計数は、10、好ましくは9, より好ましくは、８、より好ましくは７、より好ましくは多くとも６、より好ましくは５、より好ましくは４、さらにより好ましくは３、最も好ましくは２、及びさらに最も好ましくは１である。
セルロース分解増強活性を有するポリペプチド源：
本発明のポリペプチドは、いずれかの属の微生物から得られる。本発明のためには、用語“〜から得られる”とは、所定の源に関して本明細書において使用される場合、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドが前記源により、又は前記源からのヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドが前記源により、又は前記源からのヌクレオチド配列が、挿入されている株により生成されることを意味する。好ましい観点においては、所定の減から得られるポリペプチドは、細胞内分泌される。
本発明のポリペプチドは、細菌ポリペプチドであり得る。例えば、前記ポリペプチドは、グラム陽性細胞ポリペプチド、例えば、バチルス（bacillus）ポリペプチド、例えばバチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウス（Bacillus megaterium）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）又はバチルス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）ポリペプチド；又はストレプトミセス（Streptomyces）ポリペプチド、例えばストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトミセス・ムリナス（Streptomyces murinus）ポリペプチド；又はグラム陰性細菌ポリペプチド、例えばE.コリ（E. coli）又はプソイドモナスsp. (Pseudomonas sp.) ポリペプチドであり得る。
本発明のポリペプチドは、菌類ポリペプチド、及びより好ましくは、酵母ポリペプチド、例えばカンジダ（Candida）、クルイベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizos accharomyces）、又はヤロウイア（Yarrowia）ポリペプチド；又はより好ましくは、糸状菌ポリペプチド、例えばアクレモニウム（Acremonium）、アスペルギラス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、クリプトコーカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、マグナポリス（Magnaporthe）、ムコル（Mucor）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ネオカノマスチックス（Neocallimastix）、ネウロスポラ（Neurospora）、パエシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicillium）、ピロミセス（Piromyces）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）又はトリコダーマ（Trichoderma）ポリペプチドであり得る。
好ましい観点においては、ポリペプチドは、セルロース分解増強活性を有する、サッカロミセス・カルスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイベリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensis）又はサッカロミセス・オビホルミス（Saccharomyces oviformis）ポリペプチドである。
もう１つの好ましい観点においては、前記ポリペプチドは、アスペルギラス・アキュレアタス、アスペルギラス・アワモリ、アスペルギラス・フミガタス、アスペルギラス・ホエチダス、アスペルギラス・ジャポニカ、アスペルギラス・ニジュランス、アスペルギラス・ニガー、アスペルギラス・オリザエ、コプリナス・シネレウス（Coprins cinereus）、ジプロジア・ゴシピナ（Diplodia gossyppina）、フサリウム・バクトリジオイデス、フサリウム・セレアリス、フサリウム・クロックウェレンズ 、フサリウム・クルモラム、フサリウム・グラミネアラム、フサリウム・グラミナム、フサリウム・ヘテロスポラム、フサリウム・ネグンジ、フサリウム・オキシスポラム、フサリウム・レチキュラタム、フサリウム・ロゼウム、フサリウム・サムブシウム、フサリウム・サルコクロウム、フサリウム・スポロトリキオイデス、フサリウム・スルフレウム、フサリウム・トルロサム、フサリウム・トリコセシオイデス、フサリウム・ベネナタム、ヒューミコラ・インソレンス、ヒューミコラ・ラヌギノサ、マグナポルセ・グリセア（Magnaporthe grisea）ムコル・ミエヘイ、ミセリオプソラ・サーモフィリア、ネウロスポラ・クラサ、ペニシリウム・プルプロゲナム、ファネロカエテ・キリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、シュウドプレクタニア・ニグレラ（Pseudoplectania nigrella）、サーモアスカス・アウランチアカス（Thermoascus aurantiacus）、トリコダーマ・ハルジアナム、トリコダーマ・コニンギ、トリコダーマ・ロンジブラキアタム、トリコダーマ・レセイ、トリコダーマ・ビリデ又はトリコダーマ・サカタ ポリペプチドである。
より好ましい観点においては、ポリペプチドは、サーモアスカス・アウランチアカス ポリペプチド、例えば配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
前述の種に関しては、本発明は完全及び不完全状態の両者、及び他の分類学的同等物、例えばアナモルフを、それらが知られている種の名称にかかわらず、包含することが理解されるであろう。当業者は適切な同等物の正体を容易に理解するであろう。
それらの種の株は、次の多くの培養物寄託所から容易に入手できる：American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcaltures (CBS), 及びAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL)。
さらに、そのようなポリペプチドは、他の源、例えば天然源（例えば、土壌、培養土、水、等）から単離された微生物から、上記プローブを用いて同定され、そして得られる。天然の生息地から微生物を単離する技法は当業界において良く知られている。次に、ポリヌクレオチドは、もう1つの微生物のゲノム又はcDNAライブラリーを同様にスクリーニングすることによって誘導され得る。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列がプローブにより検出されると、ポリヌクレオチドは当業者に知られている技法を用いることによって同定され、又はクローン化され得る（例えば、J. Sambrook, 前記 を参照のこと）。
本発明のポリペプチドはまた、もう１つのポリペプチドが前記ポリペプチド又はフラグメントのN−末端又はC−末端で融合されている、融合された又は切断可能な融合ポリペプチドも包含することができる。融合されたポリペプチドは、１つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（又はその一部）を、本発明のヌクレオチド配列（又はその一部）に融合することによって生成される。融合ポリペプチドを生成するための技法は、当業界において知られており、そしてポリペプチドをコードするコード配列を、それらが整合して存在し、そして融合されたポリペプチドの発現が同じプロモーター及びターミネーターの制御下にあるよう、連結することを包含する。
ポリヌクレオチド：
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する単離されたポリヌクレオチドにも関する。
好ましい観点においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１で示される。もう1つの好ましい態様においては、ヌクレオチド配列は、E.コリNRRL B−30704に含まれるプラスミドpDZA2-7に含まれる配列である。もう１つの好ましい観点においては、ヌクレオチド配列は、配列番号１の成熟ポリペプチドコード領域である。もう１つのより好ましい観点においては、ヌクレオチド配列は、E.コリNRRL B−30704に含まれるプラスミドpDZA2-7に含まれる成熟ポリペプチドコード領域である。本発明はまた、遺伝子コードの縮重により配列番号１とは異なる、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチド又はその成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。本発明はまた、セルロース分解増強活性を有する、配列番号２のフラグメントをコードする配列番号１の副配列にも関する。
本発明はまた、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列における少なくとも1つの突然変異を含んで成る変異体ポリヌクレオチドにも関し、ここで前記変異体ヌクレオチド配列は配列番号２のアミノ酸23〜250から成るポリペプチドをコードする。
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離し、又はクローン化するために使用される技法は、当業界において知られており、そしてゲノムDNAからの単離、cDNAからの調製、又はそれらの組み合わせを包含する。そのようなゲノムDNAからの本発明のポリヌクレオチドのクローニングは、例えば良く知られているポリメラーゼ鎖反応（PCR）、又は共有する構造特徴を有するクローン化されたDNAフラグメントを検出するために発現ライブラリーの抗体スクリーニングを用いることによってもたらされ得る。例えば、Innisなど., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application; Academic Press, New York を参照のこと。他の核酸増幅方法、例えばリガーゼ鎖反応（LCR）、連結された活性化転写（LAT）及び核酸配列に基づく増幅（NASBA）が使用され得る。ポリヌクレオチドは、チエラビア株、又は他の又は関連する生物からクローン化され得、そして従って、ヌクレオチド配列のポリペプチドコード領域の対立遺伝子又は種変異体であり得る。
本発明はまた、配列番号１の成熟ポリペプチドコード配列（すなわち、ヌクレオチド67〜805）に対して、少なくとも70％、好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％、及びさらに最も好ましくは少なくとも97％、98％又は99％の同一性の程度を有する、活性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにも関する。
本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の修飾は、そのポリペプチドに実質的に類似するポリペプチドの合成のために必要である。用語、ポリペプチドに“実質的に類似する”とは、ポリペプチドの天然に存在しない形を言及する。それらのポリペプチドは、その天然源から単離されたポリペプチドとは、いくつかの構築された態様で異なり、たとえば非活性、熱安定性、pH最適性又は同様のものにおいて異なる変異体であり得る。
変異体配列は、配列番号１のポリペプチドコード部分として提供されるヌクレオチド配列、たとえばその副配列に基づいて、及び/又はヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドのもう1つのアミノ酸配列を生ぜしめないが、しかし酵素の生成のために意図された宿主生物のコドン使用法に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なったアミノ酸配列を生ぜしめることができるヌクレオチド置換の導入により構成され得る。ヌクレオチド置換の一般的記載のためには、Fordなど., 1991, Protein Expression and Purification 2:95-107を参照のこと。
そのような置換は、分子の機能に対して決定的である領域外で行われ、そしてさらに活性ポリペプチドをもたらすことは、当業者に明らかであろう。本発明の単離されたポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの活性に必須であり、そして従って、好ましくは置換を受けやすくないアミノ酸残基は、当業界において知られている方法、たとえば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発に従って同定され得る（たとえば、Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085を参照のこと）。
後者の技法においては、突然変異は分子における正に荷電された残基ごとに導入され、そしてその得られる変異体分子は、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するためにセルロース分解増強活性について試験される。基質−酵素相互作用の部位はまた、核磁気共鳴分析、クリスタログラフィー又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、立体構造体の分析により決定され得る（たとえば、de Vos など., 1992, Science 255: 306-312; Smith など., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver など., 1992, FEBS Letters 309: 59-64を参照のこと）。
本発明はまた、（i）配列番号１のヌクレオチド67〜805、（ii）配列番号１のヌクレオチド67〜805に含まれるcDNA配列、又は（iii）前記（i）もしくは（ii）の相補的鎖と、非常に低い緊縮条件、好ましくは低い緊縮条件、より好ましくは中位の緊縮条件、より好ましくは中位の高い緊縮条件、さらにより好ましくは高い緊縮条件及び最も好ましくは非常に高い緊縮条件下でハイブリダイズする、本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド、又はその対立遺伝子変異体及びその副配列にも関する。（Sambrook など., 1989, 前記）。
本発明はまた、（a）非常に低い、低い、中位の、中位の高い、高い又は非常に高い緊縮条件下で、（i）配列番号１のヌクレオチド67-805,（ii）配列番号１のヌクレオチド67-805に含まれるcDNA配列、（iii）前記（i）もしくは（ii）の副配列、又は（iii）（i）又は (ii)の相補的鎖とDNA集団とをハイブリダイズせしめ；そして（b）セルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードする、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを単離することによって得られる、単離されたポリヌクレオチドにも関する。
好ましい観点においては、DNA集団は、低い緊縮条件下でハイブリダイズされる。より好ましい観点においては、DNA集団は、中位の緊縮条件下でハイブリダイズされる。さらにより好ましい観点においては、DNA集団は、中位の高い緊縮条件下でハイブリダイズされる。最も好ましくい観点においては、DNA集団は、高い緊縮条件下でハイブリダイズされる。
核酸構造体：
本発明はまた、適切な宿主細胞におけるコード配列の発現を、制御配列と適合できる条件下で指図する、１又は複数の制御配列に作用可能に結合される本発明の単離されたポリヌクレオチドを含んで成る核酸構造体に関する。
本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ポリペプチドの発現を提供するために種々の手段で操作され得る。ベクター中へのその挿入の前、ポリヌクレオチドの操作は、発現ベクターに依存して、所望されるか又は必要とされる。組換えDNA方法を用いてポリヌクレオチドを修飾するための技法は、当業界において良く知られている。
制御配列は、適切なプロモーター配列、すなわち本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞により認識されるヌクレオチド配列であり得る。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を仲介する転写制御配列を含む。プロモーターは、宿主細胞において転写活性を示すいずれかのヌクレオチド配列、たとえば変異体の、切断された、及びハイブリッドのプロモーターであり得、そして宿主細胞に対して相同であるか又は異種である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。
特に細胞宿主細胞において本発明の核酸構造体の転写を方向づけるための適切なプロモーターの例は、E.コリlacオペロン、ストレプトミセス・コエリカラー（Streptomyces coelicolor）アガラーゼ遺伝子（dagA）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）Lバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）α−アミラーゼ遺伝子（amyL）、Bチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）マルトゲン性アミラーゼ遺伝子（amyM）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliguefaciens） α−アミラーゼ遺伝子（amyQ）、バチルス・リケニホルミスペニシリナーゼ遺伝子（penP）、バチルス・サブチリスxylA及びzylB遺伝子及び原生動物のβ−ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター（Villa−Kamaroffなど., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731）、及びtac プロモーター（De Boer など., 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 21-25）である。さらなるプロモーターは、“Useful proteins from recombinant bacteria” in Scientific American, 1980, 242: 74-94; 及びSambrookなど., 1989, 前記に記載される。
糸状菌宿主細胞における本発明の核酸構造体の転写を方向づけるための適切なプロモーターの例は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギラス・ニガー中性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・アワモリグルコアミラーゼ（glaA）、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、アスペルギラス・オリザエ アルカリプロテアーゼ、アスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアセトアミダーゼ、フサリウム・ベネナチュム アミログルコシダーゼ(WO 00/56900号)、フサリウム・ベネナチュムDaria (WO 00/56900号)、フサリウム・ベネナチュムQuinn (WO 00/56900号)、フサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼ（WA96/00787号）、トリコダーマ・レセイβ−グルコシダーゼ、トリコダーマ・レセイセロビオヒドロラーゼI、トリコダーマ・レセイセロビオヒドロラーゼII、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼI、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼII、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼIII、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼIV、トリコダーマ・レセイエンドグルカナーゼV、トリコダーマ・レセイキシラナーゼI、トリコダーマ・レセイキシラナーゼII、トリコダーマ・レセイβ−キシロシダーゼについての遺伝子から得られるプロモーター、並びにNA2-tpiプロモーター（アスペルギラス・ニガー中性α−アミラーゼ及びアスペルギラス・オリザエトリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、及びそれらの切断され、及びハイブリッドのプロモーターである。
酵母宿主においては、有用なプロモーターは、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）エノラーゼ（ENO−１）、サッカロミセス・セレビシアエガラクトキナーゼ（GAL１）、サッカロミセス・セレビシアエアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH2/GAP）、サッカロミセス・セレビシアエトリオースリン酸イソメラーゼ（TPI）、サッカロミセス・セレビシアエメタルチオネイン(CUP1)、及びサッカロミセス・セレビシアエ３−ホスホグリセレートキナーゼから得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Romunosなど., 1992, Yeast8：423−488により記載される。
制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終結するために宿主細胞により認識される配列でもあり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の3’側末端に作用可能に連結される。選択の宿主細胞において機能的であるいずれかのターミネーターが本発明において使用され得る。
糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼ及びフサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼについての遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のための好ましいターミネーターは、サッカロミセス・セレビシアエエノラーゼ、サッカロミセス・セレビシアエチトクロムC（CYC１）、及びサッカロミセス・セレビシアエグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼについての遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、Romanosなど., 1992, 前記により記載される。
制御配列はまた、適切なリーダー配列、すなわち宿主細胞による翻訳のために重要であるmRNAの非翻訳領域でもあり得る。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の5’末端に作用可能に連結される。選択の宿主細胞において機能的であるいずれかのリーダー配列が、本発明において使用され得る。
糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランストリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、サッカロミセス・セレビシアエエノラーゼ（ENO−１）、サッカロミセル・セレビシアエ３−ホスホグリセレートキナーゼ、サッカロミセス・セレビシアエα−因子及びサッカロミセス・セレビシアエアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ADH2/GAP）についての遺伝子から得られる。
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、すなわちヌクレオチド配列の3’末端に操作可能に連結され、そして転写される場合、転写されたmRNAにポリアデノシン残基を付加するためにシグナルとして宿主細胞により認識される配列でもあり得る。選択の宿主細胞において機能的であるいずれかのポリアデニル化配列が，本発明において使用される。
糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギキラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、フサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼ及びアスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼについての遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990により記載されている。
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードし、そしてそのコードされたポリペプチドを細胞の分泌路中に方向づけるシグナルペプチドコード領域でもあり得る。核酸配列のコード配列の5’側末端は、本来、分泌されたポロペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳読み取り枠を整合して、天然において連結されるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。他方では、コード配列の5’側末端は、そのコード配列に対して外来性であるシグナルペプチドコード領域を含むことができる。
そのコード配列が天然において、シグナルペプチドコード領域を含まない外来性シグナルペプチドコード領域が必要とされる。他方では、外来性シグナルペプチドコード領域は、ポリペプチドの増強された分泌を得るために、天然のシグナルペプチドコード領域を単純に置換することができる。しかしながら、選択の宿主細胞の分泌路中に、すなわち培養培地中に分泌される、発現されたポリペプチドを方向づけるいずれかのシグナルペプチドコード領域が、本発明に使用され得る。
細菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、バチルスNCIB11837マルトゲン性アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラスα−アミラーゼ、バチルス・リケニホルミススブチリシン、バチルス・リケニホルミスβ−ラクタマーゼ、バチルス・アステロサーモフィラス中性プロテアーゼ（nprT, nprS, nprM）、及びバチルス・スブチリスprsAについての遺伝子から得られるシグナルペプチド領域である。追加のシグナルペプチドは、Sinomen and Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137 により記載される。
糸状菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード領域は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガー中性アミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイアスペラギン酸プロテイナーゼ、ヒューミコラ・インソレンスセルラーゼ、ヒューミコラ・インソレンスエンドグルカナーゼV、及びヒューミコラ・ラヌギノサリパーゼについての遺伝子から得られたシグナルペプチドコート領域である。
好ましい態様においては、シグナルペプチドコード領域は、配列番号２のアミノ酸１〜22をコードする配列番号１のヌクレオチド１〜66である。
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシアエα−因子及びサッカロミセル・セレビシアエインバーターゼについての遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、Romanos など., 1992, 前記により記載される。
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端で位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であり得る。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は多くの場合、チモーゲン）として知られている。プロポリペプチドは一般的に不活性であり、そしてプロポリペプチドからプロペプチドの触媒又は自己触媒分解により成熟した活性ポリペプチドに転換され得る。プロペプチドコード領域は、バチルス・サブチリスアルカリプロテアーゼ（aprE）、バチルス・サブチリス中性プロテアーゼ（nprT）、サッカロミセス・セレビシアエα−因子、リゾムコル・ミエヘイ アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、及びミセリオプソラ・サーモフィリア ラッカーゼについての遺伝子から得られる（WO95/33836号）。
シグナルペプチド及びプロペプチド領域の両者がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、そのプロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の次に位置し、そしてシグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の次に位置する。
宿主細胞の増殖に関して、ポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することがまた所望される。調節システムの例は、調節化合物の存在を包含する、化学的又は物理的刺激に応答して、遺伝子の発現の開始又は停止を引き起こすそれらのシステムである。原核生物系における調節システムは、lac, tac及びtrpオペレーターシステムお包含する。酵母においては、ADH2システム又はGAL1システムが使用され得る。
糸状菌においては、TAKAα−アミラーゼプロモーター、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼプロモーター及びアスペルギラス・オリザエグルコアミラーゼプロモーターが、調節配列として使用さえ得る。調節配列の他の列は、遺伝子増幅を可能にするそれらの配列である。真核システムにおいては、それらはメトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、及び重金属と共に増幅されるメタロチオネイン遺伝子を包含する。それらの場合、ポリペプチドをコードする核酸配列が、調節配列により作用可能に連結される。
発現ベクター：
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモーター、及び転写及び翻訳停止シグナルを含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記の種々の核酸及び制御配列は、１又は複数の便利な制限部位でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入又は置換を可能にするためにそれらの部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、本発明のポリヌクレオチド配列は、前記配列又は前記配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、そのコード配列はベクターに位置し、その結果、コード配列は発現のための適切な制御配列により作用可能に連結される。
組換え発現ベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられ得、そしてヌクレオチド配列の発現をもたらすことができるいずれかのベクター（たとえば、プラスミド又はウィルス）であり得る。ベクターの選択は典型的には、ベクターが導入される予定である宿主細胞とベクターとの適合性に依存するであろう。ベクターは、線状又は閉環された環状プラスミドであり得る。
ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち染色体存在物として存在するベクター（その複製は染色体複製には無関係である）、たとえばプラスミド、染色体外要素、ミニクロモソーム又は人工染色体であり得る。ベクターは自己複製を確かめるためのいずれかの手段を含むことができる。他方では、ベクターは、糸状菌細胞中に導入される場合、ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。さらに、宿主細胞のゲノム中に導入される全DNA又はトランスポゾンを一緒に含む、単一のベクター又はプラスミド、又は複数のベクター又はプラスミドが使用され得る。
本発明のベクターは好ましくは、形質転換され、トランスフェクトされ、形質導入され、又は同様の細胞の容易な選択を可能にする１又は複数の選択マーカーを含む。選択マーカーは、１つの遺伝子であり、その生成物は、殺生物剤又はウィルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養要求性、及び同様のものを提供する。
細菌選択マーカーの例は、バチルス・サブチリス又はバチルス・リケニホルミスからのdal遺伝子、又は抗生物質、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1及びURA3である。糸状菌宿主細胞に使用するための選択マーカーは、次の群から選択されるが、但しそれらだけには限定されない；amdS (アセトアミダーゼ)、argB (オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar (ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hph (ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD (硝酸レダクターゼ)、pyrG (オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ)、sC (硫酸アデニルトランスフェラーゼ) 及びtrpC (アントラニル酸シンターゼ)、並びにそれらの同等物。アスペルギラス・ニジュランス又はアスペルギラス・オリザエのamdS及びpyrG遺伝子及びストレプトミセス・ヒグロスコピカスのbar遺伝子が、アスペルギラス細胞への使用のために好ましい。
本発明のベクターは好ましくは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの安定した組み込み、又は細胞のゲノムに無関係に細胞におけるベクターの自律的複製を可能にする要素を含む。
宿主細胞のゲノム中への組み込みのためには、ベクターは、相同又は非相同組換えによるゲノム中へのベクターの安定した組み込みのためのベクター中のポリペプチド、又はいずれか他の要素をコードするポリヌクレオチド配列に依存する。他方では、ベクターは、染色体における正確な位置で宿主細胞のゲノム中への相同組換えによる組み込みを方向づけるための追加のヌクレオチド配列を含むことができる。正確な位置での組み込みの可能性を高めるために、組み込み要素は好ましくは、相同組換えの可能性を高めるために対応する標的配列と高い相同性を示す十分な数の核酸、たとえば100〜10,000個の塩基対、好ましくは400〜10,000個の塩基対、及び最も好ましくは800〜10,000個の塩基対を含むべきである。組み込み要素は、宿主細胞のゲノムにおける標的配合と相同であるいずれかの配列であり得る。さらに、組み込み要素は、非コード又はコードヌクレオチド配列であり得る。他方では、ベクターは非相同組換えにより宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得る。
自律複製のためには、ベクターはさらに、問題の宿主細胞においてのベクターの自律的な複製を可能にする複製の起点を含んで成る。複製の起点は、細胞において機能する、いずれかのプラスミドレプリケーター介在性自律複数であり得る。用語“複製の起点”又は“レプリケーターのプラスミド”とは、プラスミド又はベクターのインビボでの複製を可能にするヌクレオチド配列として本明細書において定義される。
複製の細菌起点の例は、E.コリにおける複製を可能にするプラスミドpBR322, pUC19, pACYC177及びpACYC184, 及びバチルスにおける複製を可能にするpUB110, pE194, pTA1060及びpAMβ１の複製の起点である。
酵母宿主細胞への使用のための複製の起点の例は、複製の２ミクロン起点、すなわちARS1, ARS4, ARS1及びCEN3の組み合わせ、及びARS4及びCEN6の組み合わせである。
糸状菌細胞において有用な複数の起点の例は、AMA1及びANS1である（Gems など., 1991, Gene 98 : 61-67; Cullen など., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883号）。AMA1遺伝子の単離、及び前記遺伝子を含んで成るプラスミド又はベクターの構成は、WO00/24883号に開示される方法に従って達成され得る。
本発明のポリヌクレオチドの１以上のコピーが、遺伝子生成物の生成を高めるために宿主細胞中に挿入され得る。ポリヌクレオチドのコピー数の上昇は、宿主細胞ゲノム中に配列の少なくとも１つの追加のコピーを組み込むことによって、又はポリヌクレオチドと共に増幅可能な選択マーカー遺伝子を含むことによって得られ、ここで細胞は選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含み、そしてそれにより、ポリヌクレオチドの追加のコピーが、適切な選択剤の存在下で前記細胞を培養することによって選択され得る。
本発明の組換え発現ベクターを構成するために上記要素を連結するために使用される方法は、当業者に良く知られている（例えば、Sambrookなど., 1989, 前記を参照のこと）。
宿主細胞：
本発明はまた、ポリペプチドの組換え生成において都合良く使用される、本発明のポリヌクレオチドを含んで成る組換え宿主にも関する。本発明のポリヌクレオチドを含んでなるベクターは、そのベクターが染色体組み込み体として、又は前記のような自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入される。用語“宿主細胞”とは、複製の間に生じる突然変異のために、親細胞と同一ではない親細胞のいずれかの子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその源に、かなりの程度依存するであろう。
宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物、又は単細胞微生物、真核生物であり得る。
有用な単細胞は、細菌細胞、たとえば次のグラム陽性細菌バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリクエファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・サーキュランス、バチルス・クラウシ、バチルス・コアギランス、バチルス・ラウタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・スブチリス及びバチルス・スリンギエンシス、又はストレプトミセス細胞、例えばストレプトミセス・リビダンス又はストレプトミセス・ムリナス、又は次のグラム陰性細菌：E.コリ及びプソイドモナスsp.（但し、それらだけには限定されない）である。好ましい態様においては、細菌宿主細胞は、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・ステアロサーモフィラス又はバチルス・サブチリス細胞である。もう１つの好ましい態様においては、バチルス細胞は、好アルカリ性バチルスである。
細菌宿主細胞中へのベクターの導入はたとえば、コンピテント細胞（たとえば、Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, 又はDubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221 を参照のこと）を用いてプロトプラスト形質転換（たとえば、Changand Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115）、エレクトロポレーション（たとえば、Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751を参照のこと）又は接合（たとえば、Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278を参照のこと）によりもたらされ得る。
宿主細胞は、真核生物、たとえば哺乳類、昆虫、植物、又は菌類細胞であり得る。
好ましい態様においては、宿主細胞は菌類細胞である“菌類”とは、本明細書において使用される場合、門アスコミコタ（Ascomycota）、バシジオミコタ（Basidiomycota）、キトリジオミコタ（Chytridiomycota）及びヅイゴミコタ（Zygomycota）（Hawksworth など., Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UKにより定義される）、及びオーミコタ（Oomycota）（Hawksworth など., 1995, 前記、171ページに引用される）、並びに栄養胞子菌（Hawksworh など., 1995, 前記）を包含する。
より好ましい態様においては、菌類宿主細胞は酵母細胞である“酵母”とは、本明細書において使用される場合、子嚢胞子酵母（Endomycetals）、担子胞子酵母、及び不完全菌類（Blastomycetes）に属する酵母を包含する。酵母の分類は未来において変化し得るので、本発明のためには、酵母は、Biology and Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., and Davenport, R.R., eds. Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980) に記載のようにして定義されるであろう。
さらにより好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、カンジダ（Candida）、ハンセヌラ（Hunsenula）、クレベロミセス（Kluyveromyces）、ピチア（Pichia）、サッカロミセス（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces）又はヤロウィア（Yarrowia）である。
最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カルスベルゲンシス（Saccharomyces carlsbergensis）、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyses cerevisiae）、サッカロミセス・ジアスタチカス（Saccharomyces diastaticus）、サッカロミセス・ドウグラシ（Saccharomyces douglasii）、サッカロミセス・クルイビリ（Saccharomyces kluyveri）、サッカロミセス・ノルベンシス（Saccharomyces norbensisi）、又はサッカロミセス・オビホルミス（Saccharomyces oviformis）細胞である。もう1つの最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、来るべろミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）である。もう１つの最も好ましい態様においては、酵母宿主細胞は、ヤロウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）細胞である。
もう１つのより好ましい態様においては、菌類宿主細胞は糸状菌細胞である。“糸状菌”とは、ユーミコタ（Eumycota）及びオーミコタ（Oomycota）のすべての糸状形を包含する（Hawksworthなど., 1995, 前記により定義されるような）。糸状菌は一般的に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複合多糖類から構成される菌子体壁により特徴づけられる。成長増殖は、菌子拡張によってであり、そして炭素代謝は絶対好気性である。対照的に、酵母、たとえばサッカロミセス・セレビシアエによる成長増殖は、単細胞葉状体の発芽によってであり、そして炭素代謝は発酵性である。
さらにより好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム（Acremonium）、アスペルギラス（Aspergillus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）、ビジェルカンデラ（Bjerkandera）、セリポリオプシス（Ceriporiopsis）、コプリナス（Coprinus）、コリオルス（Coriolus）、クリプトコーカス（Cryptococcus）、フィリバシジウム（Filibasidium）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、マグナポルセ（Magnaporthe）、ムコル（Mucor）、ミセリオプソラ（Myceliophthora）、ネオカリマスチックス（Neocallimastix）、ネウロスポラ（Neurospora）、パエシロミセス（Paecilomyces）、ペニシリウム（Penicilium）、ファネロカエテ（Phanerochaete）、フィエビア（Phlebia）、ピロマイセス（Piromyces）、プレウロタス（Pleurotus）、シゾフィラム（Schizophyllum）、タラロミセス（Talaromyces）、サーモアスカス（Thermoascus）、チエラビア（Thielavia）、トリポクラジウム（Tolypocladium）トラメテス（Trametes）又はトリコダーマ（Trichoderma）の種の細胞であるが、但しそれらだけには限定されない。
最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、アスペルギラス・アワモリ、アスペルギラス・フミガタス、アスペルギラス・ホエチダス、アスペルギラス・ジャポニカ、アスペルギラス・ニジュランス、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・オリザエ細胞である。
もう1つの最も好ましい態様においては、糸状菌宿主細胞は、フサリウム・バクトリジオイデス、フサリウム・クロックウェレンズ 、フサリウム・セレアリス、フサリウム・クルモラム、フサリウム・グラミネアラム、フサリウム・グラミナム、フサリウム・ヘテロスポラム、フサリウム・ネグンジ、フサリウム・オキシスポラム、フサリウム・レチキュラタム、フサリウム・ロゼウム、フサリウム・サムブシウム、フサリウム・サルコクロウム、フサリウム・ソラニ、フサリウム・スポロトリキオイデス、フサリウム・スルフレウム、フサリウム・トルロサム、フサリウム・トリコセシオイデス又はフサリウム・ベネナタム細胞である。もう１つの最も好ましい観点においては、糸状菌宿主細胞は、ビジェルカンデラ・アダスタ（Bjerkandera adusta）、 セリポリオプシス・アネイリナ（Ceriporiopsis aneirina）、セリポリオプシス・カレギエア（Ceriporiopsis caregiea）、セリポリオプシス・ギルベスセンス（Ceriporiopsis gilvescens）、セリポリオプシス・パノシンタ（Ceriporiopsis pannocinta）、 セリポリオプシス・リブロサ（Ceriporiopsis rivulosa）、 セリポリオプシス・スブルファ（Ceriporiopsis subrufa）、 セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ceriporiopsis subvermispora）、 コプリンス・シネレウス（Coprins cinereus）、 コリオラス・ヒスタス（Coriolus hirsutus）、ヒューミコラ・インソレンス、ヒューミコラ・ラヌギノサ、ムコル・ミエヘイ、ミセリオプソラ・サーモフィリア、ネウロスポラ・クラサ、ペニシリウム・プルプロゲナム、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Phanerochaete chrysosporium）、フレビア・ラジアタ（Phlebia radiata）、 プレウロタス・エリンギ（Pleurotus eryngii）、チエラビア・テレストリス、トラメテス・ビロサ（Trametes villosa）、トラメテス・ベルシコロル（Trametes versicolor）、トリコダーマ・ハルジアナム、トリコダーマ・コニンギ、トリコダーマ・ロンジブラキアタム、トリコダーマ・レセイ又はトリコダーマ・ビリデ細胞である。
菌類細胞は、プロトプラスト形質転換、プロトプラストの形質転換、及びそれ自体知られている態様での細胞壁の再生を包含する工程により形質転換され得る。アスペルギラス宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許第238023号及びYeltonなど., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81; 1474-1874に記載される。フラリウム種を形質転換するための適切な方法は、Malardierなど., 1989, Gene78: 147-156, 及びWO96/00787号により記載される。酵母は、Becker and Guarente. In Abelson, J.N. and Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito など, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; 及びHinnen など, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75; 1920により記載される方法を用いて形質転換され得る。
生成方法：
本発明はまた、（a）その野生型において、ポリペプチドを生成できる細胞を、ポリペプチドの生成の助けに成る条件かで培養し；そして（b）ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関する。好ましくは、前記細胞は、サーモアスカス属、及びより好ましくは、サーモアスカス・アウレウニアタスである。
本発明はまた、（a）ポリペプチドの生成を助ける条件下で宿主細胞を培養し；そして（b）ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関する。
本発明はまた、（ａ）ポリペプチドの生成の助けとなる条件下で宿主細胞を培養し、ここで前記宿主細胞は配列番号１の成熟ポリペプチドコード領域に少なくとも１つの突然変異を有する変異体ヌクレオチド配列を含んで成り、そして前記変異体ヌクレオチド配列は配列番号２のアミノ酸23〜250から成るポリペプチドをコードし；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドの生成方法にも関する。
本発明の生成方法においては、細胞は、当業界において知られている方法を用いて、ポリペプチドの生成のために適切な栄養培地において培養される。例えば、細胞は、ポリペプチドの発現及び/又は単離を可能にする、適切な培地において、及び条件下で行われる実験室用又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給バッチ、又は団体状態発酵を包含する）により培養され得る。培養は、炭素及び窒素源及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において、当業界において知られている方法を用いて行われる。適切な培地は、市販されているか、又は公開されている組成（例えば、American Type Culture Collection のカタログにおける）に従って調製され得る。ポリペプチドが栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接的に回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞溶解物から回収され得る。
セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは、そのポリペプチドに対して特異的である、当業界において知られている方法を用いて検出され得る。
得られるポリペプチドは、当業界において知られている方法により回収され得る。例えば、ポリペプチドは、従来の方法、例えば遠心分離、濾過、抽出、噴霧−乾燥、蒸発又は沈殿（但し、それらだけには限定されない）により、栄養培地から回収され得る。
本発明のポリペプチドは、当業界において知られている種々の方法、実質的に純粋なポリペプチドを得るために、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動）、示差溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、SDS−PAGE又は抽出（但し、それらだけには限定されない）により精製され得る（例えば、Protein Purification, J.C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publlishers, New York, 1989を参照のこと）。
植物：
本発明はまた、ポリペプチドを、回収可能な量で発現し、そして生成するために、本発明のセルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列により形質転換されている、トランスジェニック植物、植物部分又は植物細胞にも関する。ポリペプチドは、植物又は植物部分から回収され得る。他方では、組換えポリペプチドを含む植物又は植物部分が、食品又は飼料の品質を改良するために、例えば、栄養価値、味のよさ及び流動性質を改良するために、又は抗栄養因子を破壊するために使用され得る。
トランスジェニック植物は、双子葉植物又は単子葉植物であり得る。単子葉植物の例は、草、たとえば湿地帯を好む草（イチゴツナギ属の草、イネ科）、飼草、たとえばウシノケグサ・トボシガラ、ドクムギ、温帯性草、たとえばヌカボ、及び穀草類、たとえば小麦、カラスムギ、ライ麦、大麦、イネ、モロコシ及びトウモロコシである。
双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物、たとえばハウチワマメ、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、豆及び大豆、並びにアブラナ科（ブラシカセアエ科（Brassicaceae））、たとえばカリフラワー、ナタネ及び密接に関連するモデル生物アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis Thaliana）である。
植物部分の例は、茎、カルス、葉、根、果物、種子、及び塊根、並びにそれらの一部を含んで成る個々の組織、例えば表皮、葉肉、柔組織、維管束系、分裂組織である。特定の植物組織、例えばクロロプラスト、アポプラスト（apoplast）、ミトコンドリア、液胞、ペルオキシソーム、及び細胞質が植物部分であると思われる。さらに、いずれの植物細胞でも、その組織起源が何であろうと、植物部分であると見なされる同様に、植物部分、例えば本発明の利用性を促進するために単離された特定の組織及び細胞もまた、植物部分、例えば胚、内胚乳、糊粉及び種子皮として見なされる。
また、そのような植物、植物部分及び植物細胞の子孫も、本発明の範囲内に包含される。
本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物又は植物細胞は、当業界において知られている方法に従って構成され得る。手短には、植物又は植物細胞は、本発明のポリペプチドをコードする１又は複数の発現構造体を植物宿主ゲノム又はクロロプラストゲノム中に組み込み、そしてその得られる修飾された植物又は植物細胞をトランスジェニック植物又は植物細胞に生長せしめることによって構成される。
便利には、発現構造体は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、選択の植物又は植物部分において前記ヌクレオチド配列の発現のために必要とされる適切な調節配列と共に作用可能に関連して含んでなるDNA構造体である。さらに、発現構造体は、その発現構造体が組み込まれている宿主細胞を同定するために有用である選択マーカー、及び問題の植物中への前記構造体の導入のために必要なDNA配列を含むことができる（後者は、使用されるDNA導入方法に依存する）。
調節配列、たとえばプロモーター及びターミネーター配列、及び任意には、シグナル又は遷移配列の選択は、ポリペプチドがいつ、どこで及びいかにして、発現されるかの所望に基づいて決定される。たとえば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、構造的又は誘発的であり、又は進行的、段階的又は組織特異的であり、そして遺伝子生成物は特定の組織又は植物部分、たとえば種子又は葉に標的化され得る。調節配列は、たとえばTague など., Plant Phys., 86: 506, 1988により記載されている。
構成的発現のためには、35S−CaMVプロモーター、トウモロコシユビキチン１、及び米アクチン1プロモーターが使用され得る（Franck など., 1980, Cell 21 : 285-294, Christensen など, 1992, Plant Mo. Biol. 18: 675-689; Zhang など., 1991, Plant Cell 3 : 1155-1165）。器官−特異的プロモーターは、貯蔵組織たとえば種子、ジャガイモ塊茎、及び果物（Edwards & Coruzzi, 1990, Annu. Rev. Genet. 24: 275-303）、又は代謝組織、たとえば分裂組織（Ito など., 1994, Plant Mol. 24: 863-878）からのプロモーター、又は種子特異的プロモーター、たとえばイネからのグルテリン、プロラミン、グロブリン又はアルブミンプロモーター（Wu など., Plant and Cell Physiology Vol.34, No.39, No.8, pp.885-889 (1998)）、Conrad U. など, Journal of Plant Physiology Vol. 152, No.6, pp.708-711 (1998)により記載されるビシア・ファバ（Vicia faba）からのレグミンB４及び未知の種子タンパク質遺伝子からのビシア・ファバプロモーター、種子油本体のタンパク質からのプロモーター（Chen など., Plant and Cell Physiology Vol.39, No.9, pp.935-941 (1998)）、ブラシカ・ナパス（Brassica napus）からの貯蔵タンパク質napAプロモーター、又はたとえばWO91/14772号に記載のような当業界において知られているいずれか他の種子特異的プロモーターであり得る。
さらに、プロモーターは、葉特異的プロモーター、たとえば株又はトマトからのrbcsプロモーター（Kyozuka など., Plant Physiology Vol.102, No.3, pp.991-1000 (1993)）、コレラウィルスあでのメチルトランスフェラーゼ遺伝子プロモーター（Mitra, A. and Higgins, DW, Plant Molecular Biology Vol.26, No.1, pp.85-93 (1994)）、又はイネからのaldP遺伝子プロモーター（Kagayaなど., Molecular and General Genetics Vol.248, No.6, pp.668-674 (1995)）、又は創傷誘発性プロモーター、たとえばジャガイモpin２プロモーター（Xuなど., Plant Molecular Biology Vol.22, No.4, pp.573-588 (1993)）であり得る。同様に、プロモーターは、非生物処理、例えば温度、渇水又は塩分濃度の変更により誘発され得るか、又はプロモーターを活性化する外部から適用される物質、例えばエタノール、エストロゲン、植物ホルモン、例えばエチレン、アブシジン酸及びジベレリン酸、並びに重金属により誘発され得る。
プロモーターエンハンサー要素は、植物において、本発明のポリペプチドのより高い発現を達成するために使用され得る。たとえば、プロモーターエンハンサー要素は、プロモーターと本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との間に配置されるイントロンであり得る。たとえば、Xuなど、前記は、発現を増強するためにイネアクチン１遺伝子アクチン１遺伝子の第１イントロンの使用を開示する。
選択マーカー遺伝子、及び発現構造体のいずれかの他の部分は、当業界において入手できるものから選択され得る。
核酸構造体は、当業界において知られている従来の技法、たとえばアグロバクテリウム−介在性形質転換、ウィルス−介在性形質転換、マイクロインジェクション、粒子衝撃、バイオリスティク形質転換、及びエレクトロポレーションに従って、植物ゲノム中に組込まれる（Gasser など., Science, 244, 1293; Potrykus, Bio/tech. 8,535,1990; Shimamoto など., Natune, 338, 274, 1989）。
現在、アグロバクテリウム・ツメファシエンス介在性遺伝子トランスファーは、トランスジェニック双子葉植物を生成するための好ましい方法（Hooykas & Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38を参照のこと）であるが、しかしながら、それはまた、他の形質転換方法が一般的に、それらの植物のためには好ましいけれども、単子葉植物を形質転換するためにも使用され得る。現在、トランスジェニック単子葉植物を生成するための好ましい方法は、胚カルス又は成長する胚の粒子衝撃法（形質転換性DNAにより被覆された微小金又はタングステン粒子）である（Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil など., 1992, Bio/Technology 10: 667-674）。単子葉植物の形質転換のための他の方法は、Omirulleh B, など., Plant Molecular Biology Vol. 21, No.3, pp.415-428 (1993) により記載されるように、プロトプラスト形質転換に基づかれている。
形質転換に続いて、発現構造体を組み込んでいる形質転換体が、当業界において良く知られている方法に従って、選択され、そして完全な植物に再生される。しばしば、形質転換方法は、例えば２種の別々のT−DNA構造体による同時形質転換、又は特異的組換え酵素による選択遺伝子の部位特異的切除を用いることにより、再生の間、又は次の生成にいて、選択遺伝子の選択的排除のために企画される。
本発明はまた、（ａ）ポリペプチドの生成のために適切な条件下で、本発明のセルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んで成るトランスジェニック植物又は植物細胞を培養し；そして（ｂ）前記ポリペプチドを回収することを含んで成る本発明のポリペプチドを生成するための方法にも関する。
セルロース分解増強活性の除去又は低減：
本発明はまた、同じ条件下で培養される場合、親細胞よりもポリペプチドを少なく生成する変異体細胞をもたらす、本発明のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド配列又はその一部を破壊し、又は欠失することを含んで成る、親細胞の変異体細胞を生成するための方法にも関する。
変異体細胞は、当業界において知られている方法、例えば挿入、破壊、置換又は欠失を用いて、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を低めるか又は排除することにより構成され得る。好ましい観点においては、ヌクレオチド配列が不活性化される。修飾されるか又は不活性化されるヌクレオチド配列は、活性のために必須のコード領域又はその一部、又はコード領域の発現のために必要とされる調節要素であり得る。そのような調節又は制御配列の例は、プロモーター配列又はその機能的部分、すなわちヌクレオチド配列の発現に影響を及ぼすのに十分である部分であり得る。可能性ある修飾のための他の制御配列は、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、転写ターミネーター及び転写活性化因子を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
ヌクレオチド配列の修飾又は不活性化は、親細胞を突然変異誘発にゆだね、そしてヌクレオチド配列の発現が低められているか、又は排除されている変異体細胞を選択することによって行われ得る。特異的又はランダムであり得る突然変異誘発は、例えば適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の使用により、適切なオリゴヌクレオチドの使用により、又はDNA配列をPCR生成された突然変異誘発にゆだねることにより行われ得る。さらに、突然変異誘発は、それらの突然変異誘発剤のいずれかの組み合わせの使用により行われ得る。
本発明のために適切な物理的又は化学的突然変異誘発剤の例は、紫外線（UV）照射、ヒドロキシルアミン、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（MNNG）、O−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（EMS）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチド類似体を包含する。
そのような剤が使用される場合、突然変異誘発は典型的には、選択の突然変異誘発の存在下で、適切な条件下で、突然変異誘発されるベき親細胞をインキュベートし、そして低められた又は発現のない遺伝子を示す変異体細胞をスクリーニングし、そして/又は選択することによって行われる。
ヌクレオチド配列の修飾又は不活性化は、その転写又は翻訳のために必要とされる遺伝子又は調節要素における１又は複数のヌクレオチドの導入、置換又は除去により達成され得る。例えば、ヌクレオチドは、停止コドン導入、開始コドンの除去又は読み取り枠の変更をもたらすために、挿入され又は除去され得る。そのような修飾又は不活性化は、当業者において知られている方法に従って、特定部位の突然変異誘発又はPCR生成された突然変異誘発により達成され得る。主に、修飾はインビボで、すなわち修飾されるべきヌクレオチド配列を発現する細胞に対して直接的に行われ得るが、修飾は下記に例示されるようにインビトロで行われ得ることが好ましい。
細胞によるヌクレオチド配列の発現を排除するか又は低めるための便利な手段の例は、遺伝子置換、遺伝子欠失又は遺伝子破壊の技法に基づかれている。例えば、遺伝子破壊方法においては、内因性ヌクレオチド配列に対応する核酸配列が、欠失遺伝子を生成するために、親細胞を形質転換する欠失性核酸配列を生成するようインビトロで突然変異誘発される。相同組換えにより、その欠失性核酸配列は、その内因性ヌクレオチド配列を置換する。その欠失性ヌクレオチド配列はまた、ヌクレオチド配列が修飾されるか又は破壊されている形質転換体の選択のために使用され得るマーカーをコードする。特に好ましい観点においては、ヌクレオチド配列は、選択マーカー、例えば本明細書に記載されるそれらにより破壊される。
他方では、ヌクレオチド配列の修飾又は不活性化は、ヌクレオチド配列に対して相補的な配列を用いて、確立されたアンチセンス又はRNAi技法により行われ得る。より特定には、細胞によるヌクレオチド配列の発現は、細胞において転写され得、そして細胞において生成されるポリペプチドmRNAに対してハイブリダイズすることができる遺伝子のヌクレオチド配列に対して相補的な配列を導入することによって低められ又は排除され得る。相補的アンチセンスヌクレオチド配列のmRNAへのハイブリダイズを可能にする条件下で、翻訳されるタンパク質の量は低められ又は排除される。
本発明はさらに、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又はその制御配列の破壊又は欠失を含んで成り、又は親細胞に比較してポリペプチドを少なく生成するか、又は全く生成しない変異体細胞をもたらす、親細胞の変異体細胞に関する。
そのようにして創造されたポリペプチド欠失変異体細胞は、生来の及び/又は異種タンパク質の発現のための宿主細胞として特に有用である。従って、本発明はさらに、（ａ）タンパク質の生成のために適切な条件下で変異体細胞を培養し；そして（ｂ）タンパク質を回収することを含んで成る、生来の又は異種タンパク質の生成方法に関する。用語“異種タンパク質”とは、宿主細胞に対して生来ではないタンパク質、生来の配列を変更するために修飾が行われている生来のタンパク質、又はその発現が組換えDNA技法による宿主細胞の操作の結果として定量的に変更されている生来のタンパク質として本明細書において定義される。
さらなる観点においては、本発明は、本発明のポリペプチド及び興味あるタンパク質生成物の両者を生成する細胞の発酵によりセルロース分解増強活性を実質的に有さないタンパク質生成物の生成方法に関し、ここで前記方法は、発酵が完結される前、その間、又は完結された後、セルロース分解増強活性を阻害することができる、有効量の剤を、発酵ブイヨンに添加し、その発酵ブイヨンから興味ある生成物を回収し、そして任意には、回収された生成物を、さらなる精製にゆだねることを含んで成る。
さらなる観点においては、本発明はセルロース分解増強活性を実質的に有さないタンパク質生成物の生成方法に関し、ここで前記方法は、細胞を、生成物の発現を可能にする条件下で培養し、セルロース分解増強活性を実質的に低めるために、前記得られる培養物ブイヨンを、組み合わされたpH及び温度処理にゆだね、そして培養物ブイヨンから生成物を回収することを含んで成る。他方では、前記組み合わされたpH及び温度処理は、培養物ブイヨンから回収された酵素調製物に対して行なわれ得る。前記組み合わされたpH及び温度処理は任意には、セルロース分解増強インヒビターによる処理と組合して使用され得る。
本発明のこの観点によれば、セルロース分解増強活性の少なくとも60％、好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも85％、さらにより好ましくは少なくとも95％、及び最も好ましくは少なくとも99％を除去することが可能である。セルロース分解増強活性の完全な除去は、この方法の使用により得られる。
前記組み合わされたpH及び温度処理は好ましくは、所望する効果を達成するための十分な時間、４〜５の範囲のpH及び80〜90℃の範囲の温度で行われる。
興味ある生成物の培養及び精製のために使用される方法は、当業界において知られている方法により行われ得る。
セルロース分解増強を実質的に有さない生成物を生成するための本発明の方法は、真核生物ポリペプチド、特に菌類タンパク質、例えば酵素の生成において特に興味あるものである。前記酵素は、例えば澱粉分解酵素、脂肪分解酵素、タンパク質分解酵素、細胞分解酵素、オキシドレダクターゼ又は植物細胞壁分解酵素から選択され得る。
そのような酵素の例は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン、グルコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−又はβ−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、インバーターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、フェノールオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼを包含する。セルロース分解増強欠失細胞はまた、医薬的に興味あるもの、例えばホルモン、成長因子、受容体及び同様のものの異種タンパク質を発現するために使用され得る。
用語“真核生物ポリペプチド”とは、生来のポリペプチドのみだけではなく、またアミノ酸置換、欠失又は付加、又は活性、熱安定性、pH耐性及び同様のものを増強するための他のそのような修飾により修飾されているそれらのポリペプチド、例えば酵素を包含する。
もう１つの観点においては、本発明は、本発明の方法により生成される、セルロース分解増強活性を実質的に有さないタンパク質生成物に関する。
組成物：
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含んで成る組成物にも関する。好ましくは、組成物は、そのようなポリペプチドにおいて富化される。用語“富化される”とは、組成物のセルロース分解増強活性が、例えば、少なくとも1.1の富化因子、高められることを示す。
組成物は、主要成分、例えば単一成分組成として本発明のポリペプチドを含んで成る。他方では、組成物はさらに、１又は複数の酵素活性、例えばアミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリン、グリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インバーターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼを含んで成る。追加の酵素は例えば、次の属及び種に属する微生物により生成され得る：アスペルギラス、好ましくはアスペルギラス・アキュレアタス、アスペルギラス・アワモリ、アスペルギラス・フミガタス、アスペルギラス・ホエチダス、アスペルギラス・ジャポニカ、アスペルギラス・ニジュランス、アスペルギラス・ニガー又はアスペルギラス・オリザエ；フサリウム、好ましくはフサリウム・バクトリジオイデス、フサリウム・セレアリス、フサリウム・クロックウェレンズ 、フサリウム・クルモラム、フサリウム・グラミネアラム、フサリウム・グラミナム、フサリウム・ヘテロスポラム、フサリウム・ネグンジ、フサリウム・オキシスポラム、フサリウム・レチキュラタム、フサリウム・ロゼウム、フサリウム・サムブシウム、フサリウム・サルコクロウム、フサリウム・スルフレウム、フサリウム・トルロサム、フサリウム・トリコセシオイデス又はフサリウム・ベネナタム；ヒューミコラ、好ましくはヒューミコラ・インソレンス、又はヒューミコラ・ラヌギノサ；又はトリコダーマ、好ましくはトリコダーマ・ハルジアナム、トリコダーマ・コニンギ、トリコダーマ・ロンジブラキアタム、トリコダーマ・レセイ又はトリコダーマ・ビリデ。
ポリペプチド組成物は、当業界において知られている方法に従って調製され得、そして液体又は乾燥組成物の形で存在することができる。例えば、ポリペプチド組成物は、顆粒又は微粒子の形で存在することができる。組成物に包含されるべきポリペプチドは、当業界において知られている方法に従って安定化され得る。
本発明のポリペプチド組成物の好ましい使用の例は下記に与えられる。本発明のポリペプチド組成物の用量、及び組成物が使用される他の条件は、当業界において知られている方法に基づいて決定され得る。
単糖類、二糖類及び多糖類へのバイオマスの分解又は転換：
本発明はまた、前記セルロース材料を、有効量のセルロース分解タンパク質により、セルロース分解増強活性を有する、有効量のポリペプチドの存在下で処理し、ここで前記セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの不在に比較して、セルロース材料の分解を高める、セルロース材料を分解するか又は転換するための方法にも関する。
本発明のポリペプチド及び宿主細胞が、エタノール、プラスチック、他の製品又は中間体の生成のためのバイオマスからの化学的又は発酵供給材料としての単離類、二糖類及び多糖類の生成に使用され得る。特に、本発明のポリペプチド及び宿主細胞は、セルロース又はヘミセルロースの部分的又は完全な溶解により加工残留物（乾燥された蒸留物穀物、醸造からの古穀物、サトウキビバガス、等）の価値を高めるために使用され得る。セルロース材料のグルコース、キシロース、マンノース、ガラクトース、及びアラビノース、それらのポリマー、又はそれらの由来する生成物へのセルロース分解タンパク質による加工の増強は、下記の通りである。
ポリペプチドは、細胞を有するか又は有さない粗発酵ブイヨンの形で、又は半精製された又は精製された発酵調製物の形で存在することができる。セルロース分解増強タンパク質は、単一成分調製物、例えばファミリー61タンパク質、多成分のタンパク質調製物、例えば多くのファミリー61タンパク質、又は多成分及び単一成分タンパク質調製物の組合せであり得る。セルロース分解増強タンパク質は、酸性、中性又はアルカリ性pH−範囲のいずれかでのセルロース分解タンパク質の活性を増強することができる。他方では、本発明の宿主細胞は、バイオマスによる発酵工程におけるポリペプチドの源として使用され得る。宿主細胞はまた、セルロース分解タンパク質をコードする生来又は異種遺伝子、及びバイオマスの加工において有用な他の酵素を含むことができる。
バイオマスは、木材資源、都市ごみ、古紙、収穫物及び収穫残留物を包含するが、但し、それらだけには限定されない（例えば、Wiselogel など., 1995, in Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp. 105-118, Taylor & Francis, Washington D. C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25 : 695-719; Mosierなど., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, managing editor, Volume 65, pp. 23-40, Springer-Verlag, New Yorkを参照のこと）。
バイオマスの主要細胞壁における有力な多糖は、セルロースであり、第２の最も富んだものはヘミセルロースであり、そして第３のものはペクチンである。細胞が増殖を停止した後に生成される二次細胞壁はまた、多糖類を含み、そしてヘミセルロースに共有結合されるポリマー性リグニンにより強化される。セルロースは、アンヒドロセロビオースのホモポリマー及び従って、線状β−（１−４）−D−グルカンであり、そしてヘミセルロースは、種々の化合物、例えばキシラン、キシログルカン、アラビノキシラン及びマンナンを、広範囲の置換基を有する複合枝分れ鎖の構造体において包含する。一般的に多形的であるが、セルロースは、平行グルカン鎖の不溶性結晶性マトリックスとして主に植物組織に見出される。ヘミセルロースは通常、セルロース、及び細胞壁マトリックスの安定化を助ける他のヘミセルロースに水素結合する。
本発明の方法においては、セルロース分解タンパク質は、セルロース材料のグルコースへの、又はヘミセルロースのキシロース、マンノース、ガラクトース及びアラビノース、それらのポリマー又は下記に記載のようなそれらに由来する生成物への加工に関与するいずれかのタンパク質であり得る。セルロース分解タンパク質は、単一成分調製物、例えばセルラーゼ、多成分調製物、例えば下記のようなエンドグルカナーゼ、セロビオビドロラーゼ、グルコヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼ、又は多成分及び単一成分タンパク質調製物の組合せであり得る。セルロース分解タンパク質は、活性を有し、すなわち酸性、中性又はアルカリ性pH−範囲でセルロースを加水分解する。
セルロース分解タンパク質は、セルロース分解酵素を生成できることが知られている微生物から得られるか又は単離され、そして精製され得る、菌類又は細菌起源のもの、例えばバチルス、シュードモナス、ヒューミコラ、コプリナス、チェラビア、フサリウム、マイセリオプソラ、アクレモニウム、セファロスポリウム、スシタリジウム、ペニシリウム又はアスペルギラスの種のもの（例えば、EP458162号を参照のこと）、特に種ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）（ヌシタリジウム・サーモフィラムとして再分類される；例えばアメリカ特許第4,435,307号を参照のこと）、
コプリナス・シネレウス（Coprins cinereus）、フサリウム・オキシスピラム（Fusarium oxysporum）、マイセリオプソラ・サーモフィラス（Myceliophthora thermophila）、メリピラス・ギガンテウス（Meripilus giganteus）、チェラビア・テレストリス（Thielavia terrestris）、アクレモニウムsp., アクレモニウム・ペルシンナム（Acremonium persicinum）、アクレモニウム・アクレモニウム（Acremonium acremonium）、アクレモニウム・ブラキペニウム（Acremonium brachypenium）、アクレモニウム・ジクロモスポラム（Acremonium dichromosporum）、アクレモニウム・オブクラバタム（Acremonium obclavatum）、アクレモニウム・ピンケルトニアエ（Acremonium pinkettoniae）、アクレモニウム・ロゼオグリセウム（Acremonium roseogriseum）、アクレモニウム・インコロラタム（Acremonium incoloratum）、及びアクレモニウム・フラタム（Acremonium furatum）；
好ましくは、種ヒューミコラ・インソレンスDSM1800、フサリウム・オキシスピラムDSM2672、マイセリオプソラ・サーモフィラスCBS117.65、セファロスピリウムsp. RYM-202, アクレモニウムsp. CBS478.94、アクレモニウムsp. CBS265.95、アクレモニウム、ペルシシナムCBS169.65、アクレモニウムAHU9519、セファロスポリウムsp. CBS535.71、アクレモニウム・ブラキペニウムCBS866.73、アクレモニウム・ジクロモスピラムCBS683.73、アクレモニウム・オブクラバタムCBS311.74、アクレモニウム・ピンケルトニアエCBS157.70、アクレモニウム・オゼオグリセウムCBS134.56、アクレモニウム・インコロラタムCBS146.62及びアクレモニウム・フラタムCBS299.70Hから選択された株により生成されるそれらのものである。
セルロース分解タンパク質はまた、トリコダーマ（特に、トリコダーマ・ピリデ、トリコダーマ・レセイ及びトリコダーマ・コニンギ）、好アルカリ性バチルス（例えば、アメリカ特許第3,844,390号ヨーロッパ特許第458162号を参照のこと）及びストレプトミセス（例えば、ヨーロッパ特許第458162号を参照のこと）から得られる。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。
特に適切なセルロース分解タンパク質は、アルカリ性又は中性セルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、ヨーロッパ特許第495,257号, ヨーロッパ特許第531,372号, WO 96/11262号, WO 96/29397号, WO 98/08940号に記載されるセルラーゼである。他の例は、セルラーゼ変異体、例えばWO 94/07998号, ヨーロッパ特許第531,315号, アメリカ特許第4,435, 307号, アメリカ特許第5,457, 046号, アメリカ特許第5,648, 263号, アメリカ特許第5,686, 593号, アメリカ特許第5,691, 178号, アメリカ特許第5,763, 254号, アメリカ特許第5,776, 757号号, WO 89/09259号, WO 95/24471号, WO 98/12307号, 及び PCT/DK98/00299に記載されるそれらである。
本発明の方法に使用されるセルロース分解タンパク質及びセルロース分解増強タンパク質は、当業界において知られている方法を用いて、適切な炭素及び窒素源、及び無機塩を含む栄養培地上での上記微生物株の発酵により生成され得る（例えば、Bennett, J. W. and LaSure, L. (eds. ), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991を参照のこと）。適切な培地は、商業的に入出できるか、又は公開される成分（例えば、American Type Culture Collectionのカタログにおける）に従って調製され得る。増殖及びセルロース分解タンパク質生成のために適切な温度範囲及び他の条件は、当業界において知られている（Bailey, J. E. , and Ollis, D. F., Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill Book Company, NY, 1986を参照のこと）。
発酵は、セルロース分解タンパク質又はセルロース分解増強タンパク質の発現又は単離をもたらす細胞のいずれかの培養方法であり得る。従って、発酵は、適切な培地において、及びセルロース分解タンパク質又はセルロース分解増強タンパク質の発現又は単離を可能にする条件下で行われる実験室又は産業発酵器における振盪フラスコ培養、小又は大規模発酵（例えば、連続、バッチ、供給バッチ、又は固体状態発酵）を包含するものとして理解され得る。
上記方法により生成される、その得られるセルロース分解タンパク質又はセルロース分解増強タンパク質は、従来の方法、例えば遠心分離、濾過、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿（但し、それらだけには限定されない）により、発酵培地から回収され得る。次に、回収されたタンパク質はさらに、種々のクロマトグラフィー方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又は同様のものにより精製され得る。
セルロースタンパク質は、カルボキシメチルセルロース（CMC）を加水分解し、それにより、インキュベーション混合物の粘度を低める。粘度のその得られる低下は、振盪粘度計（例えば、Sofraser, FranceからのMIVI 3000）により決定され得る。セルラーゼ粘度単位（CEVLI）に関して測定されるセルラーゼ活性の決定は、カルボキシメチルセルロース（CMC）の溶液の粘度を低めるサンプルの能力を測定することにより、サンプルに存在する触媒活性の量を定量化される。アッセイは、セルロース分解タンパク質及び基質のために適切な温度及びpHで行われる。CelluclastTM (Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark)に関しては、アッセイは、0.1Mのリン酸緩衝液（pH9.0）において40℃で30分間、基質としてCMC（333g/lのカルボキシメチルセルロースHercules 7LFD）、及び約3.3〜4.2CEVU/mlの酵素濃度を用いて行われる。CEVU活性は、言及される酵素標準、例えばCELLUZYME TM Standard 17-1194 (Novozymes A/Sから入手できる)に対して計算される。
本発明への使用のために適切なセルロース分解調製物の例は例えば、CELLUCLASTTM (Novozymes A/Sから入手できる) 及びNOVOZYMTM 188 (Novozymes A/Sから入手できる)を包含する。使用され得るセルラーゼを含んで成る他の市販の調製物は、CELLUZYMETM, CEREFLO 及び ULTRAFLO (Novozymes A/S), LAMINEUX 及び SPEZYMETM CP (Genencor Int.),及び ROHAMENT 7069 W (Rohm GmbH)を包含する。セルラーゼ酵素は、約0.001重量％〜約5.0重量％、より好ましくは約0.025重量％〜約4.0重量％、及び最も好ましくは約0.005重量％〜約2.0重量％の固形物の有効量で添加される。
上記で言及されたように、本発明の方法に使用されるセルロース分解タンパク質又はセルロース分解増強タンパク質は、単一成分調製物、すなわち他のセルロース分解成分を実質的に有さない成分であり得る。単一成分は、その単一成分をコードするDNA配列のクローニング、及び前記DNA配列により形質転換され、そして宿主において発現される続く細胞により生成される組換え成分であり得る（例えば、WO 91/17243号及びWO 91/17244号を参照のこと）。単一成分セルロース分解タンパク質の他の例は、JP-07203960-A 及び WO-9206209号に開示されるそれらを包含するが、但しそれらだけには限定されない。宿主は好ましくは、異種宿主であるが（酵素は宿主に対して外来性である）、しかし宿主細胞は一定の条件下でまで、相同宿主でもあり得る（酵素は宿主に対して生来のものである）。単一成分セルロース分解タンパク質はまた、発酵ブイヨンからそのようなタンパク質を精製することにより調製され得る。
本発明の方法の実施において有用な単一成分セルロース分解タンパク質の例は、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、グルコヒドロラーゼ及びβ−グルコシダーゼを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
用語“エンドグルカナーゼ”とは、セルロース、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース及びヒドロキシエチルセルロース）、リケニン、混合されたβ−１，３−グルカン、例えば穀物β−D−グルカン又はキシログルカンにおけるβ−１，４結合、及び、セルロース成分を含む他の植物材料における１，４−β−D−グルコシド結合のエンドヒドロシスを触媒するエンド−１，４−（１，３；１，４）−β−D−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ活性は、Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268の方法に従って、カルボキシメチルセルロース（CMC）加水分解を用いて決定される。
エキソ−１，４−β−D−グルカナーゼは、セロビオヒドロラーゼ及びグルコヒドロラーゼの両者を包含する。
用語“セロビオヒドロラーゼ”とは、セルロース、セロオリゴサッカリド、又は鎖の還元又は非還元性末端からセロビオースを開放する、いずれかのβ−１，４−結合グルコース含有ポリマーにおける１，４−β−D−グルコシド結合の加水分解を触媒する１，４−β−グルカンセロビオヒドロラーゼ（E. E. 3. 2. 1. 91）として本明細書において定義される。本発明のためには、エンドグルカナーゼ活性は、Lever など., 1972, Anal. Biochem. 47: 273- 279 及び van Tilbeurgh など., 1982, FEBS Letters 149: 152-156; van Tilbeurgh and Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288により記載される方法に従って決定される。本発明においては、Leverなどの方法は、トウモロコシの茎におけるセルロースの加水分解を評価するために使用され、そしてVan Tilbeurghなどの方法は、蛍光二糖誘導体に対するセロビオヒドロラーゼ活性を決定するために使用された。
用語“グルコヒドロラーゼ”とは、連続的グルコース単位を除去するために、１，４−β−D−グルカンにおける１，４−結合（O−グルコシル結合）の加水分解を触媒する１，４−β−D−グルカングルコヒドロラーゼ（E. C. 3. 2. 1. 74）として本明細書において定義される。本発明のためには、エンドグルカナーゼ活性は、Himmel など., 1986, J. Biol. Chem. 261: 12948-12955により記載される方法に従って決定される。
用語“β−グルコシダーゼ”とは、β−D―グルコースの開放を伴って、末端の非還元性β−D−グルコース残基の加水分解を触媒する、β−D−グルコシドグルコヒドロラーゼ（E. C. 3. 2. 1. 21）として本明細書において定義される。本発明のためには、β−グルコシダーゼ活性は、Venturi など., 2002, J. Basic Microbiol. 42: 55-66により記載される基本方法（但し、異なった条件が本明細書に記載のように使用される）に従って決定される。１単位のβ−グルコシダーゼ活性は、100mMのクエン酸ナトリウム、0.01％のTween-20において基質としての4mMのｐ−ニトロフェニル−β−D−グルコピラノシドから50℃、pH5での１分当たり生成される1.0μモルのｐ−ニトロフェノールとして定義される。
本発明のポリペプチドは、バイオマス基質のセルロース成分を分解するためにセルロース分解タンパク質と共に使用される（例えば、Brigham など., 1995, in Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp. 119-141, Taylor & Francis, Washington D. C.; Lee, 1997, Journal of Biotechnology 56: 1-24を参照のこと）。
セルロース分解増強活性を有するポリペプチド及びセルロース分解タンパク質の最適量は、いくつかの因子、例えば成分セルロース分解タンパク質の混合物、セルロース基質、セルロース基質の濃度、セルロース基質の前処理、温度、時間、pH及び発酵生物（例えば、同時糖化及び発酵について酵母）の包含に依存するが、但しそれらだけには限定されない。用語“セルロース分解タンパク質”とは、試験される条件下でセルロースを加水分解し、又は転換し、又は分解できるものとして示されるそれらのタンパク質又はタンパク質の混合物として本明細書において定義される。それらの量は通常のアッセイ、例えばBCA（ビシンコニン酸、P. K. Smith など., 1985, Anal. Biochem. 150: 76）により、通常測定され、そして好ましい量は、加水分解されるバイオマスの量に比例して添加される。
好ましい観点において、ｇセルロース材料当たりのセルロース分解増強活性を有するポリペプチドの量は、ｇセルロース当たり、約0.01〜約2.0mg、好ましくは約0.025〜約1.5mg、より好ましくは約0.05〜約1.25mg、より好ましくは約0.075〜約1.25mg、より好ましくは約0.1〜約1.25mg、さらにより好ましくは約0.15〜約1.25mg、及び最も好ましくは約0.25〜約1.0mgである。
もう１つの好ましい観点においては、ｇセルロース材料当たりセルロース分解タンパク質の量は、ｇセルロース当たり、約0.5〜約50mg、好ましくは約0.5〜約40mg、より好ましくは約0.5〜約25mg、より好ましくは約0.75〜約20mg、より好ましくは約0.75〜約15mg、さらにより好ましくは約0.5〜約10mg、及び最も好ましくは約2.4〜約10mgである。
好ましい観点においては、gセルロース分解タンパク質の当たり、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの量は、ｇセルロースタンパク質当たり、約0.005〜約1.0g、好ましくは約0.01〜約1.0g、より好ましくは約0.15〜約0.75g、より好ましくは約0.15〜約0.5g、より好ましくは約0.1〜約0.5g、さらにより好ましくは約0.1〜約0.5g、及び最も好ましくは約0.05〜約0.2gである。
本発明の方法は、セルロース材料を多くの有用な有機生成物、化学物質及び燃料に加工するために使用され得る。エタノールの他に、セルロースから生成され得るいくつかの商品及び特定の化学製品は、キシロース、アセトン、アセテート、グリシン、リシン、有機酸（例えば、乳酸）、１，３−プロパンジオール、ブタンジオール、グリセロース、フルフラール、ポリヒドロキシマルカノエート、シス、シス−ムコン酸及び動物飼料を包含する（Lynd, L. R. , Wyman, C. E. , and Gerngross, T. U., 1999, Biocommodity Engineering, Biotechnol. Prog. , 15: 777-793; Philippidis, G. P., 1996, Cellulose bioconversion technology, in Handbook on Bioethanol :Production and Utilization, Wyman, C. E. , ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; 及び Ryu, D. D. Y. , and Mandels, M. , 1980, Cellulases : biosynthesis and applications, Enz. Microb. Technol., 2: 91-102）。可能性ある共同生成の有益性は、発酵できる炭水化物からの複数の有機生成物の合成以上に拡張する。生物学的加工の後に残存するリグニンに富んでいる残留物は、リグニン由来の化学物質に転換されるか、又は粉末生成のために使用され得る。
本発明の方法に従ってセルロース材料を加工するのに使用される従来の方法は、当業者に良く知られている。本発明の方法は、本発明に従って作動するよう構成されるいずれかの従来のバイオマス加工装置の使用を包含する。
そのような装置は、バッチ−撹拌反応器、限外濾過を伴っての連続流動撹拌反応器、連続プラグ−流動カラム反応器（Gusakov, A. V. , and Sinitsyn, A. P. , 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose :'1. A mathematical model for a batch reactor process, Enz Microb. Technol. 7: 346-352）、アトリッター反応器（Ryu, S. K. , and Lee, J. M., 1983, Bioconversion of waste cellulose by using an attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 53-65）、又は電磁場により誘導される集中的撹拌を伴っての反応器（Gusakov, A. V. , Sinitsyn, A. P., Davydkin, 1. Y. , Davydkin, V. Y. , Protas, O. V. , 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 141-153）を包含する。
従来の方法は、糖化、発酵、別々の加水分解及び発酵（SHF）、同時糖化及び発酵（SSF）、同時糖化及び共発酵（SSCF）、ハイブリッド加水分解及び発酵（HHF）、及び直接的微生物転換（DMC）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
SHFは、第１に、セルロースをグルコースに酵素的に加水分解し、そして次に、グルコースをエタノールに発酵する別々の工程段階を用いる。SSFにおいては、セルロースの酵素的水分解及びグルコースのエタノールへの発酵は、１つの段階に組合される（Philippidis, G. P. , 1996, Cellulose bioconversion technology, in Handbook on Bioethanol : Production and Utilization, Wyman, C. E. , ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212）。
SSCFは、複数の粒の共発酵を包含する（Sheehan, J. , and Himmel, M. , 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U. S. Department of Energy's research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817-827）。HHFは、同じ反応器において、但し異なった温度で行われる２種の別々の段階、すなわち高温の酵素的糖化、続いて発酵株が耐えられ得る低温でのSSFを包含する。DMCは、すべての３種の工程（セルラーゼ生成、セルロース加水分解及び発酵）を、１つの段階で組合す（Lynd, L. R. , Weimer, P. J. , van Zyl, W. H. , and Pretorius, I. S. , 2002, Microbial cellulose utilization: Fundamentals and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66: 506-577）。
“発酵”又は“発酵工程”とは、いずれかの発酵工程、又は発酵段階を含んで成るいずれかの工程を言及する。発酵工程は、発酵生成物、例えば次のものを生成するために使用される発酵工程を包含する：アルコール（例えば、アラビニトール、ブタノール、エタノール、グリセロール、メタノール、１，３−プロパンジオール、ソルビトール及びキシリトール）；有機酢（例えば、酢酸、アセトン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、クエン酸、２，５−ジケト−D−グルコン酸、蟻酸、フマル酸、グルカル酸、グルコン酸、グルタル酸、３−ヒドロプロピオン酸、イタコン酸、乳酸、リンゴ酸、マロン酸、シュウ酸、プロピオン酸、琥珀酸、及びキシロン酸）；ケトン（例えば、アセトン）；アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン、セリン及びトレオニン）；ガス（例えば、メタン、水素（H2）、二酸化炭素（CO2）及び一酸化炭素（CO））。発酵工程はまた、消費できるアルコール産業（例えば、ビール及びワイン）、酪農産業（例えば、発酵された酪農製品）、革産業、及びタバコ産業に使用される発酵工程を包含する。
本発明はさらに、（ａ）セルロース材料を、有効量のセルロース分解タンパク質により、請求項８記載のセルロース分解増強活性を有する、有効量のポリペプチドの存在下で糖化し、ここで前記セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの不在に比較して、セルロース材料の分解を高め；（ｂ）段階（ａ）の糖化されたセルロース材料を、１又は複数の発酵微生物と共に発酵し；そして（ｃ）前記酵素から有機物質を回収することを含んで成る、有機物質の生成方法に関する。セルロース分解増強活性を有するポリペプチドは、細胞を有するか又は有さない粗発酵ブイヨンの形で、又は半精製された又は精製された酵素調製物の形で存在することができる。セルロース分解増強タンパク質は、単一成分調製物、例えば、ファミリー61タンパク質、多成分タンパク質調製物、例えば複数のファミリー61タンパク質、又は多成分及び単一成分タンパク質調製物の組合せであり得る。
有機物質は、醗酵に由来するいずれかの物質であり得る。好ましい観点においては、有機物質はアルコールである。用語“アルコール”とは、１又は複数のヒドロキシル成分を含む有機物質を包含することが理解されるであろう。より好ましい観点においては、アルコールはアラビニトールである。もう１つのより好ましい観点においては、アルコールはブタノールである。もう１つのより好ましい観点においては、アルコールはエタノールである。もう１つのより好ましい観点においては、アルコールはグリセロールである。もう１つのより好ましい観点においては、アルコールはメタノールである。もう１つのより好ましい観点においては、アルコールは１，３−プロパンジオールである。
もう１つのより好ましい観点においては、アルコールはソルビトールである。もう１つのより好ましい観点においては、アルコールはキシリトールである。例えば、Gong, C. S. , Cao, N. J., Du, J. , and Tsao, G. T. , 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T. , ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Silveira, M. M. , and Jonas, R. , 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400-408; Nigam, P. , and Singh, D. , 1995, Processes for fermentative production of xylitol-a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, T. C. , Qureshi, N. and Blaschek, H. P. , 2003, Production of acetone, butanol and ethanol by Clostridium beijerinckii BA101 and in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology and Biotechnology 19 (6): 595-603を参照のこと。
もう１つの好ましい観点においては、有機物質は有機酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸は酢酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸はアセトン酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸はアジピン酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸はアスコルブン酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸はクエン酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸は２,５−ジケト−D−グルコン酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸は蟻酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸はフマル酸である。
もう１つのより好ましい観点においては、有機酸はグルカン酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸はグルコン酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸はグルクロン酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸はグルタル酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸は３−ヒドロキシプロピオン酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸はイタコン酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸は乳酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸はリンゴ酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸はマロン酸である。
もう１つのより好ましい観点においては、有機酸はシュウ酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸はプロピオン酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸は琥珀酸である。もう１つのより好ましい観点においては、有機酸はキシロン酸である。例えば、Chen, R. , and Lee, Y. Y. , 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448を参照のこと。
もう１つの好ましい観点においては、有機物質はケトンである。用語“ケトン”とは、１又は複数のケトン成分を含む有機物質を包含することが理解されるであろう。もう１つのより好ましい観点においては、ケトンはアセトンである。例えば、Qureshi and Blaschek, 2003, 前記を参照のこと。
もう１つの好ましい観点においては、有機物質は、アミノ酸である。もう１つの好ましい観点においては、有機物質は、アスパラギン酸である。もう１つの好ましい観点においては、有機物質は、グルタミン酸である。もう１つの好ましい観点においては、有機物質は、グリシンである。もう１つの好ましい観点においては、有機物質は、リシンである。もう１つの好ましい観点においては、有機物質は、セリンである。もう１つの好ましい観点においては、有機物質は、トレオニンである。例えばRichard, A. , and Margaritis, A. , 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly (glutamic acid) production and other microbial biopolymers, Biotechnology and Bioengineering 87 (4): 501-515を参照のこと。
もう１つの好ましい観点においては、有機物質はガスである。もう１つの好ましい観点においては、有機物質はメタンである。もう１つの好ましい観点においては、有機物質はH2である。もう１つの好ましい観点においては、有機物質はCO2である。もう１つの好ましい観点においては、有機物質はCOである。例えば、Kataoka, N. , A. Miya, and K. Kiriyama, 1997, Studies on hydrogen production by continuous culture system of hydrogen-producing anaerobic bacteria, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; and Gunaseelan V. N. in Biomass and Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-114,1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production: A reviewを参照のこと。
セルロース材料からの有機物質の生成は典型的には、主要段階を必要とする。それらの４種の段階は、前処理、酵素加水分解、発酵及び回収である。エタノールの生成方法が下記に例示されるが、しかし類似する方法が他の有機物質、例えば上記物質を生成するために使用され得ることが理解されるであろう。
前処理：前処理又は前加水分解段階においては、セルロース材料が加熱され、リグニン及び炭水化物構造が分解され、ほとんどのヘミセルロースが溶解され、そしてセルロース画分のセルロース分解酵素への接近を可能にされる。加熱は、上記により直接的に又はスラリーにおいて行われ、ここで触媒がまた、反応を早めるために、上記により直接的に又はスラリーにおいて行われ、ここで触媒がまた、反応を早めるために材料に添加され得る。触媒は、強酸、例えば硫酸及びSO2、又はアルカリ、例えば水酸化ナトリウムを包含する。前処理段階の目的は、酵素及び微生物の侵入を促進することである。セルロース性バイオマスはまた、熱水蒸気暴発前処理を受けやすい（アメリカ特許出願番号第20020164730号を参照のこと）。
糖化：糖化としても知られている酵素加水分解段階においては、本明細書に記載されるような酵素は、前処理された材料に添加され、セルロース画分を、グルコース及び/又は他の糖に転換される。糖化は一般的に、調節されたpH、温度及び混合条件下で撹拌されるタンク反応器又は発酵器において行われる。糖化段階は、200時間まで続くことができる。糖化は、約30℃〜約65℃、特に約50℃の温度で、及び約４〜約５、特に約4.5のpHで行われ得る。酵母により代謝され得るグルコースを生成するために、加水分解は典型的には、β−グルコシダーゼの存在下で行われる。
発酵：発酵段階においては、前処理及び酵素か水分解段階の結果としてセルロース材料から放される糖は、発酵生物、例えば酵母によりエタノールに発酵される。発酵はまた、調節されたpH、温度及び混合条件下で同じ容器において酵素加水分解と同時に行われる。糖化及び発酵が同じ容器において同時に行われる場合、その工程は、同時糖化及び発酵又はSSFと呼ばれる。
いずれかの適切なセルロース基質又は原料は、本発明の発酵工程において使用され得る。基質は一般的に、所望する発酵生成物、すなわち当業界において良く知られているように、発酵及び使用される工程から得られる有機物質に基づいて選択される。本発明の方法に使用されるための適切な基質の例は、セルロース含有材料、例えば木材、又は植物残留物、又は発酵微生物により代謝され、そして発酵培地への直接的な添加により供給され得る、加工されたセルロース材料から得られる低分子糖DP1-3を包含する。
用語“発酵培地”とは、発酵微生物が添加される前の培地、例えば糖化工程に起因する培地、及び同時糖化及び発行工程（SSF）に使用される培地を言及することが理解されるであろう。
“発酵微生物”とは、所望する発酵工程への使用のために適切ないずれかの微生物を言及する。本発明の適切な発酵微生物は、糖、例えばグルコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース又はオリゴ糖を、所望する発酵生成物に直接的に又は間接的に発酵することができ、すなわち転換することができる。発酵微生物の例は、菌類生物、例えば酵母を包含する。好ましい酵母は、サッカロミセスspp. の株、及び特にサッカロミセス・セレビシアエの株を包含する。市販の酵母は、Red Star（商標）TM;/ Lesaffre Ethanol Red (Red Star/Lesaffre, USAから入手できる) 、FALI (Fleischmann's Yeast, a division of Burns Philp Food Inc., USAから入手できる)、SUPERSTART (Alltechから入手できる)、GERT STRAND (Gert Strand AB, Swedenから入手できる) 及び FERMIOL (DSM Specialtiesから入手できる)を包含する。
好ましい観点においては、酵母はサッカロミセスssp. である。より好ましい観点においては、酵母は、サッカロミセス・セレビシアエである。もう１つのより好ましい観点においては、酵母は、サッカロミセス・ジスタチカス（Saccharomyces distaticus）である。もう１つのより好ましい観点においては、酵母は、サッカロミセス・ウバリウム（Saccharomyces uvarum）である。もう１つのより好ましい観点においては、酵母は、クルイベノミセスである。もう１つのより好ましい観点においては、酵母は、クルイベノミセス・マリキシアヌス（Kluyveromyces marxianus）である。もう１つのより好ましい観点においては、酵母は、クルイベノミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis）である。もう１つのより好ましい観点においては、酵母は、カンジダである。
もう１つのより好ましい観点においては、酵母は、カンジダ・シュウドトロピカリス（Candida pseudotropicalis）である。もう１つのより好ましい観点においては、酵母は、カンジダ・ブラシカエ（Candida brassicae）である。もう１つのより好ましい観点においては、酵母は、クラビスポラである。もう１つのより好ましい観点においては、酵母は、クラビスポラ・ルシタニアエ（Clavispora lusitaniae）である。もう１つのより好ましい観点においては、酵母は、クラビスポラ・オプンチア（Clavispora opuntia）である。
もう１つのより好ましい観点においては、酵母は、パキソレンである。もう１つのより好ましい観点においては、酵母は、パキソレン・タンノフィラス（Pachysolen tannophilus）である。もう１つのより好ましい観点においては、酵母は、ブレタノミセスである。もう１つのより好ましい観点においては、酵母は、ブレタノミセス・クラウゼミ（Bretannomyces clausenii）である（Philippidis, G. P. , 1996, Cellulose bioconversion technology, in Handbook on Bioethanol : Production and Utilization, Wyman, C. E. , ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212）。
グルコースをエタノールに効果的に発酵する微生物は、例えばヅイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）及びクロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）を包含する（Philippidis, 1996, 前記）。
上記に記載される生成物はまた、本明細書において記載のように、他の有機物質を生成するために使用され得ることは、当業界において良く知られている。
サッカロミセス・セレビシアエ（Chen, Z. , Ho, N. W. Y. , 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40 : 135-147; Ho, N. W. Y. , Chen, Z, Brainard, A. P. , 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859）、又は細菌、例えばE. コリ（Beall, D. S. , Ohta, K., Ingram, L. O., 1991, Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303）、クレビシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）（Ingram, L. O., Gomes, P. F. , Lai, X. , Moniruzzaman, M. , Wood, B. E. , Yomano, L. P., York, S. W. , 1998, Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214）、及びズイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）（Zhang, M. , Eddy, C. , Deanda, K., Finkelstein, M. , and Picataggio, S. , 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobilis, Science 267: 240-243; Deanda, K., Zhang, M. , Eddy, C. , and Picataggio, S. , 1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470）における異種遺伝子のクローニングは、ヘキソース及びペントースをエタノール転換できる生物の構成を導く（共発酵）。
酵母又はもう１つの微生物は典型的には、分解されたセルロース又は加水分解物に添加され、そして発酵は約24〜約96時間、例えば約35〜約60時間、進行する。温度は典型的には、約26〜約40℃、特に約32℃であり、そしてpHは、約３〜約６、特に約４〜５である。
酵母又はもう１つの微生物は典型的には、分解されたセルロース又は加水分解物に添加され、そして発酵は約24〜約96時間、例えば約35〜約60時間、進行する。温度は典型的には、約26〜約40℃、特に約32℃であり、そしてpHは、約３〜約６、特に約４〜５である。酵母又はもう１つの微生物は好ましくは、約105〜1012、好ましくは約107〜1010、特に約５×107個の生存計数/ml発酵ブイヨンの量で適用される。エタノール生成期の間、酵母細胞計数は好ましくは、約107〜1010、特に約２×108である。発酵のための酵母の使用に関するさらなるガイドは、例えば引用により本明細書に組込まれる、"The Alcohol Textbook" (Editors K. Jacques, T. P. Lyons and D. R. Kelsall, Nottingham University Press, United Kingdom 1999)に見出され得る。
当業界における最も広く使用される工程は、糖化のための保持段階が存在しない、すなわち酵母及び酵素が一緒に添加される、同時糖化及び発酵（SSF）工程である。
エタノール生成に関しては、発酵に続いて、マッシュが蒸留され、エタノールが抽出される。本発明に従って得られるエタノールは、例えば燃料エタノール、飲料エタノール、すなわち飲用スピリット、又は産業用エタノールとして使用され得る。
発酵刺激体が、発酵工程、及び特に発酵微生物の性能、例えば増強速度及びエタノール収率を、さらに改良するために、本明細書において記載される酵素工程のいずれかと組合して使用され得る。“発酵刺激体”とは、発酵微生物、特に酵母の増殖のための刺激体を言及する。増殖のための好ましい発酵刺激体はビタミン及び鉱物を包含する。ビタミンの例は、総合ビタミン、ビオチン、パントテネート、ニコチン酸、メソ−イノシトール、チアミン、ピリドキシン、パラ−アミノ安息香酸、葉酸、リボフラビン、及びビタミンA, B, C, D、及びEを包含する。
例えば、Alfenore など., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae by a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002)（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。鉱物の例は、P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn及びCuを含んで成る栄養物を供給できる、鉱物及び鉱物塩を包含する。
回収：アルコールは、発酵されたセルロース材料から分離され、そして蒸留の従来方法により精製される。約96体積％間での純度を有するエタノールが得られ、例えば燃料用エタノール、飲料スピリット又は産業用エタノールとして使用され得る。
他の有機物質に関しては、当業界において知られているいずれかの方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、粗水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動方法（例えば分離用等電点電気泳動）、示差溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、SDS−PAGE、蒸留又は抽出が使用され得るが、但しそれらだけには限定されない。
本発明の方法においては、セルロース分解タンパク質及びセルロース分解増強ポリペプチドは、セルロース材料の分解を改良するために、１又は複数の追加の酵素活性により補足され得る。好ましい追加の酵素は、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ（例えば、リパーゼ、ホスホリパーゼ及び/又はクチナーゼ）、プロテアーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ又はそれらの混合物である。
本発明の方法においては、追加の酵素が、発酵の前、又は間、例えば発酵微生物の増殖の間又は後、添加され得る。
本明細書に言及される酵素は、いずれかの適切な起源、例えば細菌又は哺乳類起源に由来し、又はそれらから得られる。用語“得られる”とは、酵素が、生来の酵素として酵素を天然において生成する生物から単離されたことを本明細書において意味する。用語“得られる”とはまた、酵素が宿主生物において組換え的に生成され得たことを本明細書において意味し、ここで組換え的に生成された酵素は、宿主生物に対して生来のものであるか又は外来性のものであり、又は欠失され、挿入され、そして/又は置換される１又は複数のアミノ酸を有する修飾されたアミノ酸配列を有し、すなわち変異体及び/又は生来のアミノ酸配列のフラグメントであるか、又は当業界において知られている核酸シャフリング工程により生成される酵素である組換え的に生成された酵素である。天然の変異体は、生来の酵素の意味内に包含され、そして組換え的に、例えば特定部位の突然変異誘発又はシャフリングにより得られる変異体は、外来性酵素の意味内に包含される。
酵素はまた、精製され得る。用語“精製された”とは、本明細書において使用される場合、それが由来する生物からの他の成分を有さない酵素を包含する。用語“精製された”とはまた、それが得られる生来の生物からのほかの成分を有さない酵素を包含する。酵素はまた、存在するわずかに少量の他のタンパク質を伴って、精製され得る。表現“他のタンパク質”とは、特に他の酵素に関する。用語“精製された”とは、本明細書において使用される場合、他の成分、特に他のタンパク質、及び最も特定には、本発明の酵素起源の細胞に存在する他の酵素の除去を言及する。
酵素は、“実質的に純粋”であり得、すなわちそれが生成される生物、例えば組換え的に生成される酵素のための宿主生物からの他の成分を有さない。好ましい観点においては、酵素は、少なくとも75％（w/w）、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、より好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％、さらにより好ましくは少なくとも98％、又は最も好ましくは少なくとも99％純粋である。もう１つの好ましい観点においては、酵素は100％純粋である。
本発明に使用される酵素は、本明細書に記載される方法への使用のために適切ないずれかの形、例えば細胞を有するか又は/有さない粗発酵ブイヨン、乾燥粉末又は顆粒、無粉塵性顆粒、液体、安定化された液体又は保護された酵素の形で存在することができる。顆粒は、アメリカ特許第4,106,991号及び第4,661,452号に開示されるようにして生成され、そして任意には、当業界において知られている方法により被覆され得る。液体酵素調製物は、例えば、確立された方法に従って、安定剤、例えば糖、糖アルコール又はもう１つのポリオール、及び/又は乳酸又はもう１つの有機酸を添加することにより安定化され得る。保護された酵素は、ヨーロッパ特許第238,216号に開示される方法に従って調製され得る。
ヘミセルラーゼ：
ヘミセルロースの酵素加水分解は、広範囲の種類の菌類及び細菌により行われ得る。セルロース分解に類似するヘミセルロース加水分解は、多くの酵素の共同作用を必要とする。
ヘミセルラーゼは、次の３種の一般的なカテゴリーに分類され得る：多糖鎖内の内部結合を攻撃する内部作用性酵素、多糖鎖の還元又は非還元性末端のいずれかから進行的に作用する外部作用性酵素、及びリグニングルコシド結合を加水分解する、アクセサリー酵素、アセチルエステラーゼ及びエステラーゼ、例えばクマル酸エステラーゼ及びフェルラ酸エステラーゼ（Wong, K. K. Y. , Tan, L. U. L., and Saddler, J. N. , 1988, Multiplicity of β-1, 4-xylanase in microorganisms: Functions and applications, Microbiol. Rev. 52: 305-317; Tenkanen, M. , and Poutanen, K. , 1992, Significance of esterases in the degradation of xylans, in Xylans and Xylanases, Visser, J., Beldman, G. , Kuster-van Someren, M. A. , and Voragen, A. G. J. , eds., Elsevier, New York, NY, 203-212; Coughlan, M. P. , and Hazlewood, G. P. , 1993, Hemicellulose and hemicellulases, Portland, London, UK; Brigham, J. S. , Adney, W. S. , and Himmel, M. E. , 1996, Hemicellulases : Diversity and applications, in Handbook on Bioethanol : Production and Utilization, Wyman, C. E. , ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 119- 141）。
ヘミセルラーゼは、キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルキシランエステラーゼ、グルクロニダーゼ、エンド−ガラクタナーゼ、マンナナーゼ、エンド又はエキソ−アラビナーゼ、エキソ−ガラクタナーゼ及びそれらの混合物を包含する。内部作用性ヘミセルラーゼ及び補助酵素の例は、エンドアラビナナーゼ、エンドアラビノガラクタナーゼ、エンドグルカナーゼ、エンドマンナナーゼ、エンドキシラナーゼ及びフェラキサンエンドオキシラナーゼを包含する。
外部作用性ヘミセルラーゼ及び補助酵素の例は、α−L−アラビノシダーゼ、β−L−アラビノシダーゼ、α−１，２−L−フコシダーゼ、α−D−ガラクトシダーゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、β−D−グルコシダーゼ、β−D−グルクロニダーゼ、β−D−マンノシダーゼ、β−D−キシロシダーゼ、エキソグルコシダーゼ、エキソセロビオヒドロラーゼ、エキソマンノビオヒドロラーゼ、エキソマンナナーゼエキソキシラーゼ、キシラン、α−グルクロニダーゼ及びコニフェリンβ−グルコシダーゼを包含する。エステラーゼの例は、アセチルエステラーゼ（アセチルガラクタンエステラーゼ、アセチルマンナンエステラーゼ、及びアセチルキシランエステラーゼ）及びアリールエステラーゼ（クマル酸エステラーゼ及びフェルラ酸エステラーゼ）を包含する
好ましくは、ヘキセルラーゼは、外部作用性ヘミセルラーゼ、及びより好ましくは、pH7以下の酸性条件下でヘミセルロースを加水分解する能力を有する外部作用性ヘミセルラーゼである。本発明のへの使用のために適切なヘミセルラーゼの例は、VISCOZYMETM (Novozymes A/Sから入手できる)を包含する。ヘミセルラーゼは、約0.001〜約5.0重量％、より好ましくは約0.025〜約4.0重量％、及び最も好ましくは約0.005〜約2.0重量％の有効量で添加される。
キシラナーゼ（E. E. 3. 2. 1. 8）は、いずれかの適切な源、例えば菌類及び細菌生物、例えばアスペルギラス、ジスホロトリカム、ペルシリウム、ネウロスポラ、フサリウム、トリコダーマ、ヒューミコラ、サーモミセス及びバシラスから得られる。キシラナーゼを含んで成る、好ましい市販の調製物は、SHEARZYME（商標）, BIOFEED WHEAT（商標）;, BIO-FEED Plus（商標）; L, CELLUCLAST（商標）;, ULTRAFLO（商標）;, VISCOZYME（商標）;, PENTOPAN MONO（商標）; BG, 及び PULPZYME（商標） HC (Novozymes A/S); 及び LAMINEX（商標）及び SPEZYME（商標） CP (Genencor Int.)を包含する。
エステラーゼ：
セルロースの生物転換のために使用され得るエステラーゼは、アセチルエステラーゼ、例えばアセチルガラクタンエステラーゼ、アセチルマンナンエステラーゼ、及びアセチルキシランエステラーゼ、及びリグニングルコシド結合を加水分解するエステラーゼ、例えばクマル酸エステラーゼ及びフェルラ酸エステラーゼを包含する。
本発明において使用される場合、カルボン酸エステルヒドロラーゼとしても知られている“エステラーゼ”は、エステル結合に対して作用する酵素を言及し、そして酵素命名法(Enzyme Nomenclature, 1992, Academic Press, San Diego, California, with Supplement 1 (1993), Supplement 2 (1994), Supplement 3 (1995), Supplement 4 (1997)及び Supplement 5, in Eur. J. Biochem. 223: 1-5,1994 ; Eur. J. Biochem. 232: 1-6,1995 ; Eur. J. Biochem. 237: 1-5,1996 ; Eur. J. Biochem. 250: 1-6,1997,及び Eur. J. Biochem. 264: 610-650,1999に従ってEC3. 1. 1カルボン酸エステルヒドロラーゼにおいて分類される酵素を包含する。
エステラーゼの非制限例は、アリールエステラーゼ、トリアシルグリセロールリパーゼ、アセチルエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、コリンエステラーゼ、トロピンエステラーゼ、ペクチンエステラーゼ、ステロールエステラーゼ、クロロフィラーゼ、L−アラビノノラクトナーゼ、グルコノラクトナーゼ、ウロノラクトナーゼ、タンナーゼ、レチニル−パルミテートエステラーゼ、ヒドロキシブチレート−ダイマーヒドロラーゼ、アシルグリセロールリパーゼ、３−オキソアジペートエノールラクトナーゼ、１，４−ラクトナーゼ、ガラクトリパーゼ、４−ピリドキソラクトナーゼ、アシルアルニチンヒドロラーゼ、アミノアシル−tRNAヒドロラーゼ、D−アラビノノラクトナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、ホスホリパーゼA1、６−アセチルグルコースデアセチラーゼ、リポタンパク質リパーゼ、ジヒドロクマリンリパーゼ、リモニン−D−環−ラクトナーゼ、ステロイド−ラクトナーゼ、トリアセテート−ラクトナーゼ、アクチノマイシンラクトナーゼ、オルセリネート−デプシドヒドロラーゼ、セファロスポリン−Cデアセチラーゼ、クロロゲネートヒドロラーゼ、α−アミノ酸エステラーゼ、４−メチルオキサロアセテートエステラーゼ、カルボキシメレンブテノリダーゼ、デオキシリモネートA−環−ラクトナーゼ、２−アセチル−１−アルキルグリセロホスホコリンエステラーゼ、フサリニン−Cオルニチンエステラーゼ、シナピンエステラーゼ、ワックス−エステルヒドロラーゼ、ホルボール−ジエステルヒドロラーゼ、ホスファチジルイノシトールデアセチラーゼ、シアレートO−アセチルエステラーゼ、アセトキシブチニルビチオフェンデアセチラーゼ、アカチルサクチレートデアセチラーゼ、メチルウンベリフェリル−アセテートデアセチラーゼ、２−ピロン−４，６−ジカルボキシレートラクトナーゼ、N−アセチルガラクトサミノグリカンデアセチラーゼ、幼若ホルモンエステラーゼ、ビス（２−エチルヘキシル）フタレートエステラーゼ、タンパク質−グルタメートメチルエステラーゼ、11−シス−レチニル−パルミテートヒドロラーゼ、すべてのトランス−レチニル−パルミテートヒドロラーゼ、L−ラムノノ−１，４−ラクトナーゼ、５−（３，４−ジアセトキシブト−１−イニル）−２, 2’−ビチオフェンでアセチラーゼ、脂肪−アシル−エチル−エステルシンターゼ、キシロノ−１，４−ラクトナーゼ、N−アセチルグルコサミニルホスファチジルイノシトールでアセチラーゼ、セトラキセートベンジルエステラーゼ、アセチルアルキルグリセロールアセチルヒドロラーゼ及びアセチルキシランエステラーゼを包含する。
本発明への使用のための好ましいエステラーゼは、脂質分解酵素、例えばリパーゼ（EC 3.1. 1.3, EC 3.1. 1.23, 及び/又は EC 3.1. 1.26として分類される）及びホスホリパーゼ（EC 3.1. 1.4 及び/又は EC 3.1. 1.32として分類され, EC 3.1. 1.5として分類されるリソホスホリパーゼを包含する）である。他の好ましいエステラーゼは、クチナーゼ（EC3. 1. 1. 74として分類される）である。
エステラーゼは、発酵微生物の性能を改良するために、例えば発酵微生物の内部及び/又は外部、又は発酵微生物の細胞膜における脂質組成/濃度を変更するために、発酵の間、発酵微生物中への及び/又はそれからの溶質の移動の改良性をもたらすために、及び/又はエタノール収率を高めるためにより代謝できるエネルギー源を供給するために（例えば、トウモロコシ基質からの成分、例えば油を、発酵微生物において有用な成分、例えば不飽和脂肪酸及びグリセロールに転換することにより）、所望する有益性を得るために効果的な量で添加され得る。エステラーゼの有効量の例は、約0.01〜約400LU/g DS（乾燥固形物）である。好ましくは、エステラーゼは、約0.1〜約100LU/g DS、により好ましくは約0.5〜約50LU/g DS及びさらにより好ましくは、約１〜約20LU/g DSで使用される。エステラーゼの量のさらなる最適化はこの後、当業界において知られている標準方法を用いて得られる。
１リパーゼ単位（LU）は、30℃、pH7.0（リン酸緩衝液）で、基質としてトリブチリン及び乳化剤としてアラビアガムを用いて、１分当たり1.0μモルの滴定できる脂肪酸を放す酵素の量である。
好ましい観点においては、エステラーゼは、脂質分解酵素、より好ましくはリパーゼである。本明細書において使用される場合、“脂質分解酵素”とは、リパーゼ及びホスホリパーゼ（リソ−ホスホリパーゼを包含する）を言及する。脂肪分解酵素は好ましくは、微生物起源、特に細菌、菌類又は酵母起源のものである。
使用される脂質分解酵素は、いずれかの源、例えばアブシデア（Absidia）株、特にアブシジア・ブラケスレナ（Absidia blakesleena）及びアブシジア・コリムピフェラ（bsidia corymbifera）、アクロモバクター（Achromobacter）株、アクロモバクター・イオファガス（Achromobacter iophagus）、アエロモナス（Aeromonas）株、アルテルナリア（Alternaria）株、特にアルテルナリア・ブラシシオラ（Altemaria brassiciola）、アスペルギラス（Aspergillus）株、特にアスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、アスペルギラス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）及びアスペルギラス・フラバス（Aspergillus flavus）、アクロモバクター（Achromobacter）株、特にA. イオファガス（Achromobacter iophagus）、アウレオバシジウム（Aureobasidium）株、特にA. プルランス（Aureobasidium pullulans）、バシラス（Bacillus）株、特にB. プミラス（Bacillus pumilus）、B. ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）及びB. サブチリス（Bacillus subtilis）、ベアウベリア（Beauveria）株、ブロコチリックス（Brochothrix）株、特にB. サーモソハタ（Brochothrix thermosohata）、カンジダ（Candida）株、特にC. シリンドラセア（Candida cylindracea）（C. ルゴサ）、C. パラリポリチカ（Candida paralipolytica）及びC. アンタルクチカ（Candida antarctica）、
クロノバクター（Chromobacter）株、特にC. ビスコサム（Chromobacter viscosum）、コプリナス（Coprins）株、特にC. シネレウス（Coprins cinereus）、フサリウム（Fusarium）株、特にF. グラミネアラム（Fusarium graminearum）、F. オキシスポラム（Fusarium oxysporum）、F. ソラニ（Fusarium solani）、F. ソラニpisi（Fusarium solani pisi）、F. ロセウムクルモラム（Fusarium roseum culmorum）及びF. ベネナロム（Fusarium venenatum）、ゲオトリカム（Geotricum）株、特にG. ペニシラタム（Geotricum penicillatum）、ハンセヌラ（Hansenula）株、特にH. アノマラ（Hansenula anomala）、ヒューミコラ（Humicola）株、特にH. プレビスポラ（Humicola brevispora）、H. ブレビスvar. サーモイダエ（Humicola brevis var. thermoidea）、及びH. インソレンス（Humicola insolens）、ヒポザイマ（Hyphozyma）株、レクトパシラス（Lactobacillus）株、特にL. クルバタス（Lactobacillus curvatus）、メタルヒジウム（Metarhizium）株、ムコル（Mucor）株、パエシロミセス（Paecilomyces）株、ペニシリウム（Penicillium）株、特にP. シクロピウム（Penicillium cyclopium）、P. クラストサム（Penicillium crustosum）及びP. エキパンサン（Penicillium expansum）、シェードモナス（Pseudomonas）株、特にP. アエルギノサ（Pseudomonas aeruginosa）、P.アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes）、P. セパクラ（Pseudomonas cepacia）（ブルクホルデリア・セパシア）、P. フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、P. フラギ（Pseudomonas fragi）、P. マルトフィラ（Pseudomonas maltophilia）、P. ハンドシナ（Pseudomonas mendocina）、
P. メフィチカリポリチカ（Pseudomonas mephitica lipolytica）、P. アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes）、P. プランタリ（Pseudomonas plantari）、P. シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalcaligenes）、P. プチダ（Pseudomonas putida）、P. スタゼリ（Pseudomonas stutzeri）、及びP. ウィスコンシネンシス（Pseudomonas wisconsinensis）、リゾオクトニア（Rhizooctonia）株、特にR. ソラニ（Rhizooctonia solani）、リゾムコル（Rhizomucor）株、特にR. ミエヘイ（Rhizomucor miehei）、リゾパス（Rhizopus）株、特にR. ジァポニカス（Rhizopus japonicus）、R. ミクロスポラス（Rhizopus microsporus）、及びR. ノドサス（Rhizopus nodosus）、ロードスポリジウム（Rhodosporidium）株、特にR. トルロイデス（Rhodosporidium toruloides）、ロードトルラ（Rhodotorula）株、特にR. グルチニス（Rhodotorula glutinis）、スポロボロミセス（Sporobolomyces）株、特にS. シバタナス（Sporobolomyces shibatanus）、サーモニセス（Thermomyces）株、特にT. ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）（ヒューミコラ・ラヌギノサ）、チアロスポレラ（Thiarosporella）株、特にT. ファセオリナ（Thiarosporella phaseolina）、トリコダーマ（Trichoderma）株、特にT. ハルジアナム（Trichoderma harzianum）及びT. レセイ（Trichoderma reesei）、及び/又はベルチシリウム（Verticillium）株から誘導され得る。
好ましい観点においては、脂質分解酵素は、アスペルギラス（Aspergillus）、アクロモバクター（Achromobacter）、バチルス（Bacillus）、カンジダ（Candida）、クロモガクター（Chromobacter）、フサリウム（Fusarium）、ヒューミコラ（Humicola）、ヒフォザイマ（Hyphozyma）、シュードモナス（Pseudomonas）、リゾムコル（Rhizomucor）、リゾパス（Rhizopus）又はサーモミセス（Thermomyces）株から誘導される。
より好ましい観点においては、脂質分解酵素はリパーゼである。リパーゼは、例えばトウモロコシ基質に起因する、発酵培地（発酵酵母を含む）におけるトリグリセリド油及び脂肪の構造及び組成を修飾するそれらの能力のために本明細書においては適用され得る。リパーゼは、異なったタイプのトリグリセリド転換、例えば加水分解、エステル化及びエステル交換を触媒する。
適切なリパーゼは、当業界において良く知られているように、酸性、中性及び塩基性リパーゼを介在するが、但し酸性リパーゼ（例えば、Amanoから入手できるリパーゼG AMANO 50）が、中性又は塩基性リパーゼに比較して、リパーゼの低濃度でより効果的であると思われる。本発明への使用のための好ましいリパーゼは、カンジダ・アンタルクチカリパーゼ及びカンジダ・シリンドラセアリパーゼを包含する。より好ましいリパーゼは、精製されたリパーゼ、例えばカンジダ・アンタルクチカリパーゼ（リパーゼA）、カンジダ・アンタルクチカリパーゼ（リパーゼB）、カンジダ・シリンドラセアリパーゼ、及びペニシリウム・カメムベルチリパーゼである。
リパーゼは、EP258,068−Aに開示されるものであり得、又はリパーゼ変異体、例えばWO00/60063号又はWO00/32758号（引用により本明細書に組込まれる）に開示される変異体であり得る。好ましい市販のリパーゼは、LECITASETM, LIPOLASETM, 及び LIPEXTM (Novozymes A/Sから入手できる) and G AMANOTM 50 (Amanoから入手できる)を包含する。
リパーゼは好ましくは、約１〜約400LU/g DS, 好ましくは約１〜約10LU/g DS及びより好ましくは約１〜約5LU/g DSの量で添加される。
本発明のもう１つの好ましい観点においては、エステラーゼは、クチナーゼである。クリナーゼは、クチンを分解できる酵素である。クチナーゼは、いずれかの源から誘導され得る。好ましい観点においては、クチナーゼは、アスペルギラス（Aspergillus）株、特にA. オリザエ（Aspergillus oryzae）、アルテマリア（Altemaria）株、特にA. ブラシンオラ（Altemaria brassiciola）、フサリウム（Fusarium）株、特にF. ソラニ（Fusarium solani）、F. ソラニpisi（Fusarium solani pisi）、 F. ロゼウムクロモラム（Fusarium roseum culmorum）、又はF. ロゼウムサムブシラム（Fusarium roseum sambucium）、ヘルミントスポラム（Helminthosporum）株、特にH. サチビュウム（Helminthosporum sativum）、ヒューミコラ（Humicola）株、特にH. インソレンス（Humicola insolens）、シュードモナス（Pseudomonas）株、特にP. メンドシナ（Pseudomonas mendocina）又はP. プチダ（Pseudomonas putida）、リゾオクトニア（Rhizooctonia）株、特にR. ソラニ（Rhizooctonia solani）、ストレプトミセス（Streptomyces）株、特にS. スカビエス（Streptomyces scabies）、又はウロクラジウム（Ulocladium）株、特にU. コンソルチアレ（Ulocladium consortiale）から誘導される。
最も好ましい観点においては、クチナーゼは、ヒューミコラ・インソレンスの株、特にヒューミコラ・インソレンスDSM1800の株から誘導される。ヒューミコラ・インソレンスクリナーゼはWO96/13580号（引用により本明細書に組みこまれる）に記載される。クチナーゼは、変異体、例えばWO00/34450号及びWO01/92502号（引用により本明細書に組込まれる）に開示される変異体の１つであり得る。好ましいクチナーゼ変異体は、引用により本明細書に組込まれるWO01/92502号の例２に列挙される変異体を包含する。クチナーゼの有効量は、約0.01〜約400LU/g DS、好ましくは約0.1〜約100LU/g DS、及びより好ましくは約１〜約50LU/g DSである。この後、クチナーゼの量のさらなる最適化は、当業界において知られている標準方法を用いて得られる。
もう１つの好ましい観点においては、エステラーゼは、ホスホリパーゼである。本明細書に使用される場合、用語“ホスホリパーゼ”とは、リン脂質に対する活性、例えば加水分解活性を有する酵素である。リン脂質、例えばレシチン又はホスファチジルコリンは、外部（sn-1）及び中間（sn-2）位置において２個の脂肪酸によりエステル化され、そして第３位置においてリン酸によりエステル化されたグリセロールから成る。リン酸は、アミノアルコールにエステル化され得る。いくつかのタイプのホスホリパーゼ活性、例えばリソリン脂質を形成するために１つの脂質アシル基を加水分解するホスホリパーゼA1及びA2（それぞれ、sn-1及びsn-2位置における）；及びリソリン脂質における残る脂肪アシル基を加水分解するリソホスホリパーゼ（又はホスホリパーゼB）が区別され得る。ホスホリパーゼC及びホスホリパーゼD（ホスホジエステラーゼ）は、それぞれジアシルグリセロール又はホスファチジン酸を開放する。
用語“ホスホリパーゼ”とは、ホスホリパーゼ活性、例えばホスホリパーゼA（A1又はA2）、ホスホリパーゼB活性、ホスホリパーゼC活性又はホスホリパーゼD活性を有する酵素を包含する。用語“ホスホリパーゼA”とは、本明細書において使用される場合、ホスホリパーゼA1及び/又はA2活性を有する酵素を包含する。ホスホリパーゼ活性は、他の活性を有する酵素、例えばホスホリパーゼ活性を有するリパーゼにより提供され得る。ホスホリパーゼ活性は、ホスホリパーゼ副活性を有するリパーゼからであり得る。他の観点においては、ホスホリパーゼ酵素活性は、ホスホリパーゼ活性のみを実質的に有する酵素により提供され、そしてホスホリパーゼ酵素活性は副活性ではない。
ホスホリパーゼは、いずれかの起源のもの、例えば動物起源（例えば、哺乳類、例えばウシ又はブタ膵臓）のもの、又はヘビの毒又はハチの毒起源のものであり得る。他方では、ホスホリパーゼは、次の微生物起源のものであり得る：糸状菌、酵母又は細菌、アスペルギラス（Aspergillus）、例えばA. アワモリ（A. awamori）、A. フォエチダス（A. foetidus）、A. ジャポニカス（A. japonicus）、A. ニガー（A. niger）又はA. オリザエ（A. oryzae）；ジクチオステリウム（Dictyostelium）、例えばD. ジスコイデウム（D. discoideum）；フサリウム（Fusarium）、例えばF. クルモラム（F. culmorum）、F. グラミネアラム（F. graminearum）、F. ヘテロスポラム（F. heterosporum）、F. ソラニ（F. solani）、F. オキシスポラム（F. oxysporum）又はF. ベネナタム（F. venenatum）；ムコル（Mucor）、例えばM. ジャバニカス（M. javanicus）、M. ムセド（M. mucedo）又はM. サブチリシマス（M. subtilissimus）；ネウロスポラ（Neurospora）、例えばN. クラサ（N. crassa）；リゾムコル（Rhizomucor）、例えばR. プシラス（R. pusillus）；リゾパス（Rhizopus）、例えばR. アルヒズス（R. arrhizus）、R. ジャポニカス（R. japonicus）、又はR. ストロニファー（R. stolonifer）；
スクレロチニア（Sclerotinia）、例えばS. リベルチアナ（S. libertiana）；トリコファイトン（Trichophyton）、例えばT. ルブラム（T. rubrum）；ホエトゼリニア（Whetzelinia）、例えばW. スクレロチオラム（W. sclerotiorum）；バチルス（Bacillus）、例えばB. メガテリウム（B. megaterium）又はB. サブチリス（B. subtilis）；シトロバクター（Citrobacter）、例えばC. フレウンジ（C. freundii）；エンテロバクター（Enterobacter）、例えばE. フェロゲネス（E. aerogenes）又はE. クロアガエ（E cloacae）；エドワードシエラ（Edwardsiella）、例えばE. タルダ（E. tarda）；エルウィニア（Erwinia）、例えばE. ヘルビコラ（E. herbicola）；エスシェリシア（Escherichia）、例えばE. コリ（E. coli）；クレブシェラ（Klebsiella）、例えばK. プネラモニアエ（K. pneumonie）；プロテウム（Proteus）、例えばP. バルガリス（P. vulgaris）；プロピテンシア（Providencia）、例えばP. スツアルチ（P. stuartii）；サルモネラ（Salmonella）、例えばS. チピムリウム（S. typhimurium）；セラチア（Serratia）、例えばS. リケファシエンス（S. liquefasciens）、S. マルセセンス（S. marcescens）；シゲラ（Shigella）、例えばS. フレキシネリ（S. flexneri）；ストレプトミセス（Streptomyces）、例えばS.ビオレセオルベル（S. violeceoruber）；又はヤルシニア（Yersinia）、例えばY. エンテロコリチカ（Y. enterocolitica）。
好ましい市販のホスホリパーゼは、LECITASETM 及び LECITASETM ULTRA (Novozymes AISから入手できる)を包含する。
ホスホリパーゼの有効量は、約0.01〜約400Lu/g DS、好ましくは約0.1〜約100Lu/g DS、及びより好ましくは約１〜約50LU/g DSである。ホスホリパーゼの量のさらなる最適化は、この後、当業界において知られている標準方法を用いて得られる。
プロテアーゼ：
本発明のもう１つの好ましい観点においては、少なくとも１つの界面活性剤及び少なくとも１つの炭水化物生成酵素が、少なくとも１つのプロテアーゼと組合して使用される。プロテアーゼは、遊離アミノ窒素（FAN）を生成するためのタンパク質を消化するために使用され得る。そのような遊離アミノ酸は、酵母のための栄養物として機能し、それにより、酵母の増殖及び従って、エタノールの生成を増強する。
発酵工程への使用のための発酵微生物は、少なくとも１つのプロテアーゼの存在下で発酵微生物の増殖により生成され得る。いずれの１つの操作理論に制限されないが、有効量の少なくとも１つのプロテアーゼと共に発酵微生物を増殖することが、発酵微生物が続いて、発酵工程において使用される場合、プロテアーゼの添加を伴わない条件下で増殖される発酵微生物に比較して、発酵微生物の遅れ時間を低めると思われる。増殖工程におけるプロテアーゼの作用は、発酵微生物に対して有害であるか又は有益である遺伝子の抑制又は発現を、直接的に又は間接的にもたらし、それにより、遅れ時間を低め、そしてより早い発酵循環をもたらすと思われる。
プロテアーゼは、当業界において良く知られており、そしてペプチド結合の分解を触媒する酵素を言及する。適切なプロテアーゼは、菌類及び細菌プロテアーゼを包含する。好ましいプロテアーゼは、酸性プロテアーゼ、すなわちpH7以下の酸性条件下で、タンパク質を加水分解する能力により特徴づけられるプロテアーゼを包含する。適切な酸性菌類プロテアーゼは、アスペルギラス（Aspergillus）、ムコル（Mucor）、リゾパス（Rhizopus）、カンジダ（Candida）、コリオラス（Coriolus）、エンドチア（Endothia）、エントモフトラ（Enthomophtra）、イリペックス（Irpex）、ペニシラム（Penicillium）、スクレロチウム（Sclerotium）及びトルロピシス（Torulopsis）由来の菌類プロテアーゼを包含する。
アスペルギラス・ニガー（例えば、Koaze など., 1964, Agr. Biol. Chem. Japan 28: 216を参照のこと）、アスペルギラス・サイトイ（Aspergillus saitoi）（例えば、Yoshida, 1954, J. Agr. Chem. Soc. Japan 28: 66を参照のこと）、アスペルギラス・アワモリ（Hayashida など., 1977, Agric. Biol. Chem. 42: 927-933）、アスペルギラス・アキュレアタス（WO95/02044号）、又はアスペルギラス・オリザエ由来のプロテアーゼ；及びムコル・プラシス又はムコル・ミエヘイからの酸性プロテアーゼが特に企画される。
酸性プロテアーゼでない細菌プロテアーゼは、市販の製品ALCALASETM及び NEUTRASETM (Novozymes A/Sから入手できる)を包含する。他のプロテアーゼは、Genencor International, Inc., USA からのGC106及び Novozymes A/SからのNOVOZYMT 50006を包含する。
好ましくは、プロテアーゼは、Handbook of Proteolytic Enzymes, Edited by A. J. Barrett, N. D. Rawlings and J. F. Woessner, Academic Press, San Diego, 1998, Chapter 270に記載のように、アスパラギン酸プロテアーゼである。アスパラギン酸プロテアーゼの適切な例は、Berka など., 1990, Gene 96: 313; Berka など., 1993, Gene 125: 195-198; 及び Gomi など., 1993, Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1095-1100により開示されるそれらを包含する。
ペルオキシダーゼ：
ペルオキシダーゼ活性を有する他の化合物は、いずれかのペルオキシダーゼ（EC1. 11. 1. 7）又はペルオキシダーゼ活性を示す、それらから誘導されたペルオキシダーゼ活性を有するいずれかのフラグメントであり得る。
好ましくは、ペルオキシダーゼは、植物（例えば、ホースラディシュ又は大豆ペルオキシダーゼ）、又は微生物、例えば菌類又は細菌により生成される。
いくつかの好ましい菌類は、不完全菌亜門、ハイフォマイセテス（Hyphomycetes）網、例えば、フサリウム、ヒューミコラ、トリコダーマ、マイロセシウム（Myrothecium）、ベルチシラム（Vetticillum）、アルスロマイセス（Arthromyces）、カルダリオマイセス（Caldariomyces）、ウロクラジウム（Ulocladium）、エムベリシア（Embellisia）、クラドスポリウム（Cladosporium）；又はドレスクレラ（Dreschlera）、特にフサリウム・オキシスポラム（DSM2672）、ヒューミコラ・インソレンス、トリコダーマ・レセイ、マイクロセシウム・ベロカリア（Myrothecium verrucaria）（IFO6113）、ベルチシラム・アルボアトラム（Vetticillum alboatrum）、ベルチシラム・ダヒル（Verticillum dahlie）、アルスロマイセス・ラマサス（Arthromyces ramosus）（FERM P-7754）、カルダリオマイセス・フマゴ（Caldariomyces fumago）、ウロクラジウム・カルタラム（Ulocladium chartarum）、エムベリシア・アリ（Embellisia alli）又はドレスクレラ・ハロデス（Dreschlera haloes）に属する株を包含する。
他の好ましい菌類は、担子菌亜門、バシジオマイセス（Basidiomycetes）網、例えばコプリヌス（Coprins）、ファネロカエト（Phanerochaete）、コリオラス（Coriolus）又はトラメテス（Trametes）、特にコプリヌス・シネレウス f. ミクロスポラス（Coprins cinereus f. microsporus）（IFO8371）、コプリヌス・マクロリガス（Coprins macrorhizus）、ファネロカエト・クリソスピリウム（Phanerochaete chrysosporium）（例えば、NA-12）、又はトラメテス（Trametes）（以前、ポリポラスと呼ばれる）、例えばT. ベルシコロル（T. versicolor）（例えば、PR4 28-A）に属する株を包含する。
さらなる好ましい菌類は、接合菌亜門、マイコラセアエ（Mycoraceae）網、例えば、リゾパス（Rhizopus）又はムコル（Mucor）、特にムコル・ヒエマリス（Mucor hiemalis）に属する株を包含する。
いくつかの好ましい菌類は、アクチノミセス網の株、例えばストレプトミセス・スフェロイデス（Streptomyces spheroids）（ATTC23965）、ストレプトミセス・サーモビオラセウス（Streptomyces thermoviolaceus）（IFO12382）、又はストレプトベルチシラム・ベルチシリウムssp. ベルチシリク（Streptoverticillum verticillium ssp. verticillium）を包含する。
他の好ましい細菌は、ロードバクター・スファエロイデス（Rhodobacter sphaeroides）、ロードモナス・パルストリ（Rhodomonas palustri）、ストレプトコーカス・ラクチス（Streptococcus lactis）、シュドモナス・プロシニア（Pseudomonas purrocinia）（ATCC15958）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）（NRRL B-11）及びバチルス株、例えばバチルス・プミラス（Bacillus pumilus）（ATCC12905）及びバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）を包含する。
さらに好ましい細菌は、ミクソコーカス（Myxococcus）に属する株、例えばM. ビレスセンス（M. virescens）を包含する。
ペルオキシダーゼはまた、ペルオキシダーゼをコードするDNA配列、及びペルオキシダーゼをコードするDNA配列の発現のためのDNA配列を担持する組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞を、ペルオキシダーゼの発現を可能にする条件下で、培養培地において培養し、そして増殖物からペルオキシダーゼを回収することを含んで成る方法により生成されるペルオキシダーゼでもあり得る。
好ましい観点においては、組換え的に生成されたペルオキシダーゼは、WO92/16634号に従って、コプリヌスsp.（Coprinus sp.）, 特にC. マクロリズス（C. macrorhizus）又はC. シネレウス（C. cinereus）から誘導されたペルオキシダーゼである。
本発明においては、ペルオキシダーゼ活性を有する化合物は、ペルオキシダーゼ酵素、及びチトクロム、ヘモグロビン又はペルオキシダーゼ酵素由来のペルオキシダーゼ活性フラグメントを含んで成る。
１ペルオキシダーゼ単位（POXU）は、次の条件下で、pH7.0の0.1Mのリン酸緩衝液、0.88mMの過酸化水素及び1.67mMの2, 2’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネート）（ABTS）において30℃で１分当たり、１μモルの過酸化水素の転換を触媒する酵素の量である。反応は、0.15〜0.30の範囲にあるべきである、418nmでの吸光度の変化により60秒間（混合の後、15秒）、進行する。活性の計算に関しては、36mM-1cm-1の酸化されたABTSの吸収係数及び2μモルのABTS当たりに転換される1μモルのH2O2の化学量論が使用される。
ラッカーゼ：
本発明においては、ラッカーゼ及びラッカーゼ関連酵素は、EC1. 10. 3. 2として分類されるいずれかのラッカーゼ酸素、EC1. 10. 3. 1として分類されるいずれかのカテコールオキシダーゼ酵素、EC1. 3. 3. 5として分類されるいずれかのピリルビンオキシダーゼ酵素、又はEC1. 14. 18. 1として分類されるいずれかのものフェノールモノオキシゲナーゼ酵素を包含する。
上記酵素は、微生物性であり、すなわち細菌又は菌類（糸状菌及び酵母を包含する）から得られるか、又はそれらは植物から誘導され得る。
菌類からの適切な例は、次の株から得られるラッカーゼを包含する：アスペルギラス（Aspergillus）、ニューロスポラ（Neurospora）、例えばN. クラサ（N. crassa）、ポドスポラ（Podospora）、ボトリチス（Botrytis）、コリビア（Collybia）、ホメス（Fomes）、レンチヌス（Lentinus）、プレウロタス（Pleurotus）、トラメテス（Trametes）、例えばT. ビロサ（T. villosa）、及びT. ベルシコロル（T. versicolor）、リゾオクトニア（Rhizooctonia）、例えばR. ソラニ（R. solani）、コプリヌス（Coprins）、例えばC. ニネレウス（C. cinereus）、C. コマタス（C. comatus）、C. フリエシル（C. friesii）、及びC. プリカチリス（C. plicatilis）、プサチレラ（Psathyrella）、例えばP. コンデレアナ（P. condelleana）、パナエオラス（Panaeolus）、例えばP. パピロナセウス（P. papilionaceus）、マイセリオプソラ（Myceliophthora）、例えばM. サーモフィラ（M. thermophila）、シタリジウム（Schytalidium）、例えばS. サーモフィラム（S. thermophilum）、ポリポラス（Polyporus）、例えばP. ピンシタス（P. pinsitus）、ピシノポラス（Pycnoporus）、例えばP. シンナバリマス（P. cinnabarinus）、フレビア（Phlebia）、例えばP. ラジタ（P. radita）（WO92/01046号）又はコリオラス（Coriolus）、例えばC. ヒルスタス（C. hirsutus）（日本特許第2−238885号）。
細菌からの適切な例は、バチルスの株から得られるラッカーゼを包含する。
コプリンス（Coprins）、マイセリオプソラ（Myceliophthora）、ポリポラス（Polyporus）、ピシノポラス（Pycnoporus）、シタリジウム（Scytalidium）又はリゾクトニア（Rhizoctonia）から得られるラッカーゼが好ましくは；特に、コプリヌス・シネレウス（Coprins cinereus）、マイセリオプソラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、ポリポラス・ピンシタス（Polyporus pinsitus）、ピンノポラス・シンナパリヌス（Pycnoporus cinnabarinus）、シタリジウム・サーモフィラム（Scytalidium thermophilum）又はリゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）から得られるラッカーゼが好ましい。
市販のラッカーゼは、NS51001 (ポリポラス・ピンシタス ラッカーゼ, Novozymes A/Sから入手できる) 及び NS51002 (マイセリオプソラ・サーモフィララッカーゼ, Novozymes A/Sから入手できる)である。
ラッカーゼ又はラッカーゼ関連酵素はまた、ラッカーゼをコードするDNA配列、及びラッカーゼをコードするDNA配列の発現のためのDNA配列を担持する組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞を、ラッカーゼの発現を可能にする条件下で、培養培地において培養し、そして増殖物からラッカーゼを回収することを含んで成る方法により生成されるラッカーゼでもあり得る。
ラッカーゼ活性（LACU）は、pH5.5での好気性条件下でシリンガルダジンの酸化から決定される。生成される紫色が530nmで光度測定される。分析条件は、19mMのシリンガルダジン、23mMの酢酸緩衝液、pH5.5、30℃、１分の反応時間である。１ラッカーゼ単位（LACU）は、上記条件下で１分当たり1.0μモルのシリンガルダジンの転換を触媒する酵素の量である。
ラッカーゼ活性（LAMU）は、pH7.5で好気性条件下でシリンガルダジンの酸化から決定される。生成される紫色は、530nmで光度測定される。分析条件は、19mMのシリンガルダジン、23mMのトリス/マレエート、pH7.5、30℃、１分の反応時間である。１ラッカーゼ単位（LAMU）は、上記条件下で１分当たり1.0μモルのシリンガルダジンの転換を触媒する酵素の量である。
本発明のポリペプチドは、上記に示される酵素、及び/又はバイオマス基質のセルロース成分をさらに分解するためにセルロース分解タンパク質と共に使用され得る（例えば、Brigham など., 1995, in Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp. 119-141, Taylor & Francis, Washington D. C.; Lee, 1997, Journal of Biotechnology 56 : 1-24を参照のこと）。
洗剤組成物：
セルロース分解増強活性を有する本発明のポリペプチドは、洗剤組成物に添加され得、そして従って、洗剤組成物の成分になることができる。
本発明の洗剤組成物は、手動又は機械洗濯用洗剤組成物、例えば染色された布の前処理のために適切な洗濯用添加剤組成物及びすすぎ用布ソフトナー組成物として配合され得、又は一般的な家庭用硬質表面洗浄操作における使用のための洗剤組成物として配合され得、又は手動又は機械皿洗い操作のために配合され得る。
特定の観点においては、本発明は、本発明のポリペプチドを含んで成る洗剤添加剤を提供する。前記洗剤添加剤及び洗剤組成物は、１又は複数の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、アミラーゼ、カーボヒドラーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、アラビナーゼ、ガラクタナーゼ、キシラナーゼ、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ及び/又はポロキシダーゼを含んで成ることができる。
一般的に、選択された酵素の性質は、選択された洗剤と適合できるべきであり（すなわち、他の酵素及び非酵素の成分、等とのpH−最適適合性）、そして酵素は効果的な量で存在すべきである。
セルラーゼ：適切なセルラーゼは、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。適切なセルラーゼは、バチルス、ヒューミコラ、フサリウム、チエラビア、アクレモニウム属からのセルラーゼ、例えばアメリカ特許第4,435,307号、アメリカ特許第5,648,263号、アメリカ特許第5,691,178号、アメリカ特許第5,776,757号及びWO89/09259号に開示されるヒューミコラ・インソレンス、マイセリオプソラ・サーモフィラ/オキシスポラムから生成される菌類セルラーゼを包含する。
特に適切なセルラーゼは、色彩保護有益性を有するアルカリ又は中性セルラーゼである。そのようなセルラーゼの例は、ヨーロッパ特許第0495257号、ヨーロッパ特許第0531372号、WO96/11262号、WO96/29397号、WO98/08940号に記載されるセルラーゼである。例の例は、WO94/07998号、ヨーロッパ特許第0531315号、アメリカ特許第5,457,046号、アメリカ特許第5,685,593号、アメリカ特許第5,763,254号、WO95/24471号、WO98/12307号及びPCT/DK98/0299号に記載されるそれらのものである。
市販のセルラーゼは、CelluzymeTM 及びCarezymeTM (Novo Nordisk A/S), ClazinaseTM 及びPuradex HATM (Genencor International Inc.) 及びKAC−500 (B)TM (Kao Corporation) を包含する。
プロテアーゼ：適切なプロテアーゼは、動物、植物又は微生物起源のものを包含する。微生物起源が好ましい。化学的に修飾された、又はタンパク質構築された変異体が含まれる。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ又は金属プロテアーゼ、好ましくはアルカリ微生物プロテアーゼ又はトリプシン−様プロテアーゼであり得る。アルカリプロテアーゼの例は、スブチリシン、特にバチルスに由来するそれらのもの、例えばスブチリシンNovo、スブチリシンCarlsberg、スブチリシン309、スブチリシン147及びスブチリシン168（WO89/06279号に記載される）である。トリプシン−様プロテアーゼの例は、トリプシン（例えば、ブタ又はウシ起源のもの）、及びWO89/06270号及びWO94/25583号に記載されるフサリウムプロテアーゼである。
有用なプロテアーゼの例は、WO92/19729号、WO98/20115号、WO98/20116号及びWO98/34946号に記載される変異体、特に１又は複数の次の位置での置換を有する変異体である：27, 35, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235及び274。
好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、AlcalaseTM, SavinaseTM, PrimaseTM, DuralaseTM, EsperaseTM及びKannaseTM (Novo Nordisk A/S), MaxataseTM, MaxacalTM, MaxapemTM, ProperaseTM, PurafectTM, Purafect OxPTM, FN2TM及びFN3TM (Genencor International Inc.) を包含する。
リパーゼ：適切なリパーゼは、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。有用なリパーゼの例は、ヒューミコラ（別名、サーモミセス）、例えばヨーロッパ特許第258068号及び第305216号に記載のようなヒューミコラ・ラウギノサ（T.ラウギノサ）、又はWO96/13580号に記載のようなヒューミコラ・インソレンス、P.アルカリゲネス又はP.プソイドアルカリゲネス（ヨーロッパ特許第218272号）、P.セパシア（ヨーロッパ特許第331376号）、P.スツゼリ（P.stutzeri）(イギリス特許第1,372,034号)、P.フルオレセンス、プソイドモナスsp. SD705株（WO75/06720号及びWO96/27002号）、P.ウイスコンシネンシス（WO96/12012号）からのリパーゼ、バチルスリーパーゼ、例えばB.スブチリス（Dartoisなど. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360）、B. ステアロサーモフィラス（日本特許64/744992）又はB.プミラス（WO91/16422号）からのリーパーゼを包含する。
他の例は、リパーゼ変異体、例えばWO92/05249号、WO94/01541号、ヨーロッパ特許第407225号、ヨーロッパ特許第206105号、WO95/35381号、WO96/00292号、WO95/30744号、WO94/25576号、WO95/14783号、WO95/22615号、WO97/04079号及びWO97/0720号に記載されるものを包含する。
好ましい市販のリパーゼ酵素は、LipolaseTM 及びLipolase UltraTM (Novo Nordisk A/S) を包含する。
アミラーゼ：適切なアミラーゼ（α−及び/又はβ）は、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。アミラーゼは、バチルス、例えばイギリス特許第1,296,839号により詳細に記載される、B.リケニルホルミスの特許株から得られるα−アミラーゼを包含する。
有用なアミラーゼの例は、WO94/02597号、WO94/18314号、WO96/23873号及びWO/43424号に記載される変異体、特に１又は複数の次の位置での置換を有する変異体である：15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408及び444。
市販のアミラーゼは、DuramylTM, TermamaylTM, FungamylTM 及びBAMTM (Novo Nordisk A/S), RapidaseTM 及びPurastarTM (Genencor International Inc.)である。
ペルオキシダーゼ/オキシダーゼ：適切なペルオキシダーゼ/オキシダーゼは、植物、細菌又は菌類起源のそれらのものを包含する。化学的に修飾された又はタンパク質構築された変異体が包含される。有用なペルオキシダーゼの例は、コプリナス、例えばコプリナス・シネレウス、及びWO93/24618 号、WO95/10602号及びWO98/15257号に記載されるそれらのようなそれらの変異体からのペルオキシダーゼを包含する。
市販のペルオキシダーゼは、GuardzymeTM (Novo Nordisk A/S) を包含する。
洗剤酵素は、１又は複数の酵素を含む別々の添加剤を添加することにより、又はそれらの酵素のすべてを含んで成る組合された添加剤を添加することにより洗剤組成物に包含され得る。本発明の洗剤添加剤、すなわち別々の添加剤又は組合された添加剤が、例えば粒質物、液体、スラリー、等として配合され得る。好ましくは洗剤添加剤配合物は、粒質物、特に非−ダスチング粒質物、液体、特に安定された液体又はスラリーである。
非−ダスチング粒質物は、アメリカ特許第4,106,991号及び第4,661,452号に開示のようにして生成され得、そして任意には、当業界において知られている方法により被覆され得る。蝋被覆材料の例は、1000〜20,000の平均モル重量を有するポリ（酸化エチレン）生成物（ポリエチレングリコール、PEG）；16〜50の酸化エチレン単位を有する、エトキシル化されたノニルフェノール；12〜20個の炭素原子を有するアルコールを有し、そして15〜80の酸化エチレン単位を有する、エトキシ化された脂肪アルコール；脂肪アルコール、脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリグリセリドである。流動層技法による適用のために適切なフィルム形成被覆材料の例は、イギリス特許第1483591号に与えられている。例えば、液体酵素調製物は、確立された方法に従って、ポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、硫酸又は硼酸を添加することによって、安定化される。保護された酵素は、ヨーロッパ特許第238,216号に開示される方法に従って調製され得る。
本発明の洗剤組成物は、いずれかの便利な形、例えば棒状、錠剤、粉末、顆粒、ペースト又は液体の形で存在することができる。液体洗剤は、水性であり、典型的には、70％までの水及び０〜30％の有機溶媒を含み、又は非水性であり得る。
洗剤組成物は、非イオン性、例えば半−極性及び/又はアニオン性及び/又はカチオン性及び/又は両性イオンであり得る１又は複数の界面活性剤を含んで成る。界面活性剤は典型的には、0.1〜60重量％のレベルで存在する。
そこに含まれる場合、洗剤は通常、約１％〜約40％のアニオン性界面活性剤、例えば線状アルキルベンゼンスルホネート、α−オレフィンスルホネート、アルキルスルフェート（脂肪酸スルフェート）、アルコールエトキシスルフェート、第二アルカンスルホネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニル琥珀酸又は石鹸を含むであろう。
そこに含まれる場合、界面活性剤は通常、約0.2％〜約40％の非イオン性界面活性剤、例えばアルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化された脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのN−アシルN−アルキル誘導体（“グルコサミド”）を含むであろう。
洗剤は、０〜65％の洗剤ビルダー又は錯生成剤、例えばゼオライト、ジホスフェート、三リン酸、ホスホネート、カーボネート、シトレート、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン六酢酸、アルキル−又はアルキニル琥珀酸、可溶性シリケート又は層化されたシリケート（例えばHoechstからのSKS−６）を含むことができる。
洗剤は、１又は複数のポリマーを含んで成る。例としては、カルボキシメチルセルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（ビニルピリジン−N−オキシド）、ポリ（ビニルイミダゾール）、ポリカルボキシレート（例えばポリアクリレート、マレイン酸/アクリル酸コポリマー及びラウリルメタクリレート/アクリル酸コポリマーを含んで成る。
洗剤は、H2O2源を含んで成る漂白システム、例えば過酸形成漂白活性化剤、例えばテトラアセチルエチレンジアミン又はノナノイルオキシベンゼンスルホネートと共に組合され得る過硼酸塩又は過炭酸塩を含むことができる。他方では、漂白システムは、例えばアミド、イミド又はスルホン型のペルオキシ酸を含むことができる。
本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸又は硼酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステル又はフェニル硼素酸誘導体、例えば４−ホルミルフェニル硼素酸を用いて安定化され得、そして前記組成物は、例えばWO92/19709号及びWO92/19708号に記載のようにして配合され得る。
洗剤はまた、他の従来の洗剤組成物、例えば布コンディショナー、例えばクレー、泡増強剤、石鹸泡抑制剤、抗腐蝕剤、土壌懸濁剤、抗−土壌再沈着剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤、ヒドロトロープ、曇りインヒビター、又は香料を含むことができる。
洗剤組成物においては、いずれかの酵素、特に本発明の酵素は、洗浄液体１L当たり0.01−100mgの酵素タンパク質、好ましくは洗浄液体１L当たり0.05−5mgの酵素タンパク質、特に洗浄液体１L当たり0.1−1mgの酵素タンパク質に対応する量で添加され得ることが、現在企画される。
洗剤組成物においては、セルロース分解増強活性を有する本発明のポリペプチドは、洗浄液体１L当たり0.001〜100mgのタンパク質、好ましくは0.005〜50mgのタンパク質、より好ましくは0.01〜25mgのタンパク質、さらにより好ましくは0.05〜10mgのタンパク質、最も好ましくは0.05〜5mgのタンパク質及びさらに最も好ましくは0.01〜１mgのタンパク質に対応する量で添加され得る。
セルロース分解増強活性を有する本発明のポリペプチドはまた、WO97/07202号（引例として本明細書組み込まれる）に開示される洗剤配合物に導入され得る。
他の使用：
一般的に、いずれかの植物細胞壁材料の処理は、セルロース分解増強活性を有する本発明のポリペプチドを補足することにより増強され得る。
シグナルペプチド：
本発明はまた、培養培地中へのタンパク質の分泌を可能にする、配列番号２のアミノ酸１〜22から成るシグナルペプチドをコードする、配列番号１のヌクレオチド１〜66から成る核酸配列に作用可能に連結されるタンパク質をコードする、前記核酸配列に対して外来性の遺伝子を含んで成る核酸構造体にも関する。
本発明はまた、組換え発現ベクター、及びそのような構造体を含んで成る組換え宿主細胞にも関する。
本発明はまた、（ａ）そのような組換え宿主細胞を、タンパク質の生成のために適切な条件で培養し；そして（ｂ）タンパク質を回収することを含んで成るタンパク質の生成方法にも関する。
前記核酸配列は、他の制御配列と共に、外来性遺伝子に作用可能に連結され得る。そのような他の制御配列は、前記の通りである。
前記タンパク質は、宿主細胞に対して生来性でも又は異種性でもあり得る。用語“タンパク質”とは、コードされた生成物の特定の長さを言及することを本明細書においては意味せず、そして従って、ペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質を包含する。用語“タンパク質”とはまた、コードされた生成物を形成するために組み合わされ得る核酸のポリペプチドを包含する。タンパク質はまた、少なくとも２種の異なったタンパク質（ここで、１又は複数のタンパク質は宿主細胞に対して生来のものであるか又は異種のものであり得る）から得られた部分又は完全なポリペプチド配列の組み合わせを含んで成るハイブリッドポリペプチドを包含する。タンパク質はさらに、上記タンパク質及びハイブリッドタンパク質の天然に存在する対立遺伝子及び構築された変動性を包含する。
好ましくは、タンパク質は、ホルモン、ホルモン変異体、受容体又はその一部、抗体又はその一部、又はレポーターである。より好ましい態様においては、タンパク質はオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ又はリガーゼである。さらにより好ましい態様においては、タンパク質は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、インバーターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ又はキシラナーゼである。
前記遺伝子は、いずれかの原核、真核生物又は他の源から得られる。
本発明はさらに、次の例により記載されるが、但しそれは本発明を制限するものではない。
材料：
緩衝液及び基質として使用される化物物質は、少なくとも試薬品種の市販の製品であった。
株：
サーモアスカス・アウランチアカス（Thermoaseus aurantiacus）株NN044936 T002-5を、セルロース分解増強活性を有するファミリーGH61ポリペプチドの源として使用した。アスペルギラス・オリザエJaL250株（WO99/61651号）を、セルロース分解増強活性を有するサーモアスカス・アウランチアカスポリペプチドの発現のために使用した。
培地：
サーモアスカス・アウランチアカスの通常のプレート及び増殖のための固体ジャガイモデキストロース培地を、1L当たり39gのジャガイモデキストロース糖（Difco BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ）から構成した。サーモアスカス・アウランチアカス培養物の増殖のための液体培地を、1L当たり、24gのジャガイモデキストロースブイヨンから構成した。
Luria−Bertani（LB）培地を、1L当たり、10gのトリプトン、5gの酵母抽出物及び10gのNaClから構成した。プレートのためのLB培地を同様にして調製したが、但し1L当たり、さらに15gの寒天を含んだ。５−ブロモ−４−クロロ−３−ヨードリル−β−D−ガラクトピラノシド（X-Gal ; Gold Biotechnology, St. Louis, MO）を、N, N’−ジメチルホルムアミドに、1ml当たり40μgの原液濃度で溶解し、そして示差コロニースクリーニングのためにLBプレート上に通常通り広げた。選択的増殖条件のために、アンピシリンをLB培地に、1L当たり50〜100mgの最終濃度で添加した。
NNCYP培地は、1L当たり5.0 g のNH4NO3、 0.5 g の MgS04-7H20、 0.3 g の CaCl2、 2.5 g のクエン酸、 5.0 g の Bacto Peptone、 1.0 g の酵母抽出物、 COVE 微量金属、 及び 約５の最終pＨを達成するための十分なK2HP04から構成された。Cove微量金属溶液は、1L当たり、0.04 g の Na2B407・10H2O、0.4 g の CuS04・5H20、 1.2 g の FeS04・7H20、 0.7 g のMnSO4・H2O、 0.8 gの Na2Mo02・2H20、 及び 10 g のZnS04・7H20から構成された。
例１：ゲノムDNAライブラリー構成：
３％グルコースと共に200mlのNNCYP培地（pH5.0）を含む、500mlのそらせ版付フラスコを、PDA上で増強されたサーモアスカス・アウランチアカスのプレートからの寒天プラグにより接種した。培養物を、170rpmで振盪しながら、45℃で一晩、増殖した。菌糸体を、Whatman #1 フィルター (Whatman Inc., Clifton NJ)を通しての濾過により集め、そして液体窒素下で凍結した。凍結された菌糸体を、冷却された乳鉢において粉末に粉砕し、そしてスキリューカップ管に分配した。粉末を、0.5％のドデシル硫酸リチウム及び0.5mMのGDTAを含む、50mMのCAPS−NaOH緩衝液40mlに懸濁した。
その懸濁液を60℃で２時間、静置し、そして逆さにすることにより定期的に混合した。これに、等体積の中和されたフェノール：クロロホルム（１：１）を添加し、そして管を、回転ホイール上で、37℃で２時間、混合した。Sorvall H1000B ローター (Kendro, Asheville NC)における2500rpmデの10分間の遠心分離の後、水性相を上記のように再抽出し、そして遠心分離した。第２抽出からの水性相を、酢酸アンモニウムの添加により2.5Mにし、そして凍結まで、-20℃で静置した。
融解の後、抽出物を、15,000×gで20分間、遠心分離した。ペレットを捨て、そして上清液における核酸を、0.7体積のイソプロパネールの添加により沈殿した。15,000×gでの遠心分離の後、ペレットを、70％エタノールにより３度すすぎ、空気乾燥し、そして1.0mlの0.1×TEに溶解した。溶解されたペレットを、酢酸アンモニウムの添加により2.0Mにし、そしてエタノールにより63％にすることにより再び沈殿した。ペレットを70％エタノールにより２度すすぎ、乾燥し、そして200μlの0.1×TEに溶解した。溶液において、DNAを、KClにより20mMにした。
サーモアスカス・アウランチアカスゲノムライブラリーを、TOPO（商標） Shotgun Subcloning Kit (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)を用いて構成した。ゲノムDNAを、その製造業者により推薦されるようにして、アルゴン下でネブライザーによりランダムに剪断した。2.5〜5.0kbの挿入体についてのサイズ選択を、TAE緩衝液中、１％アガロースゲル上での分離用ゲルの電気泳動により行った。
ゲノムDNAを、製造業者の説明書に従って、pCR（商標）4Blunt-TOPO中にクローン化し、そしてそれを用いて、E. コリ TOP10細胞 (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)を形質転換した。上記のようにしてアンピシリン及びX−Galにより補充されたLB寒天上での初期プレートを用いて、約64,000個のクローンが生成されたことを評価した。ライブラリーを、組換えクローンの力価の決定に続いてすぐに増幅した。個々の形質転換反応を用いて、1ml当たり100μgのアンピシリンを含むLB培地200mlを接種した。次に、振盪フラスコ培養物を、37℃で一晩、飽和まで増殖し、そしてプラスミドDNAを、アルカリ溶解により抽出し、そしてQiagen Plasmid Maxi キットを用いて精製した。
増幅されたライブラリーを用いて、上記のように、アンピシリン及びX−Galにより補充されたLB寒天上へのE. コリTOP10細胞の再形質転換及びプレート化によりクローンの単離のためのコロニーを生成した。コロニーの採取を、Q-Pix ロボット (Genetix, Hampshire, UK)を用いて、その製造業者の説明書に従って行った。合計22,353個のコロリーをまず、96ウェルプレートに採取し、次に、上記培地セクションに概略される選択条件下で培養し、そして-80℃でグリセロールに原液として貯蔵した。
例２：ローリングサークル型増幅及びマイクロアレイのプリント：
ローリングサークル型増幅（RCA）及び生成物希釈のためのロボット方法を、Biomek FX ロボット (Beckman Coulter, Brea, CA)上での使用のために開発した。TempliPhi DNA Sequencing Template Amplification キット(Amersham Biosciences Corp. , Piscataway, NJ)を、RCAのために使用し、そして製造業者のプロトコールを、ロボット方法において追跡した。
RCA反応を、ライブラリーからの9.972個のクローンに対して行った。二重反復384−ウェル希釈プレート（Genemate, Kaysville, UT）を、ライブラリーの9,600個のRCA生成物から調製し、そしてそれらのクローンを、ポリ−Lリシン被覆されたガラススライド上にプリントし、それぞれ約33Mbのクローン化されたDNAを表すマイクロアレイを製造した。さらに、サーモアスカス・アウランチアカスcbh1（受託番号AX657575）及びxynA（受託番号AJ132635）遺伝子を、正の対照として、及び空のpCR（商標）4Blunt-TOPOベクターを負の対照としてスポットし、そしてRCAを、形質転換されていないE. コリ細胞から調製した。アレイプリント化を、アメリカ特許第5,807,522号に記載される方法を用いて行った。
例３：発酵及びRNA抽出：
すべての発酵を、5.2％（w/v）グルコース又は5.2％セルロースのいずれかの炭素源によりバッチ供給された2LのApplikon発酵器において行なった。基本培地はNNCYPであり、そしてセルロース培地はまた、初期細胞増殖を促進するために0.4％グルコースを含んだ。pHは、水酸化アンモニウム又はリン酸の添加により、発酵の間、調節された。発酵を、42℃、pH5で、約120時間、行った。菌糸体のサンプルを、５回の接種後、１日目に収穫した。菌糸体サンプルをすばやく、MiraclothTM (Calbiochem, San Diego, CA)を通して濾過により培養地から分離し、そして次に、液体窒素において凍結し、そして-80℃で貯蔵した。
FastRNAO キット(Q-BIOgene, Carlsbad, CA)を用いて、その製造業者のプロトコールに従って、菌糸体サンプルからRNA抽出した。RNA品質を、55Vで１〜1.5時間、TBE緩衝液中、１％アガロースゲル上での電気泳動により、又はAgilent 2100バイオアナライザー (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)を用いての毛管電気泳動分析により評価した。品質を、UV分光及び/又はAgilent 2100バイオアナライザー上での分析により測定した。発酵日２，３及び４からのサンプルのみが、マイクロアレイ実験のための十分な品質のRNAを一定して生成した。
例４：蛍光プローブの構成及びマイクロアレイハイブリダイゼーション：
サーモアスカス・アウランチアカスサンプルからの低RNA収率は、マイクロアレイハイブリダイゼーションのための十分な量のRNAを生成するために線状増幅方法（aRNA増幅）の使用を必要した。RNAを増幅し、そしてアミノアリル MessageAmpTm ARNA キット (Ambion, Inc., Austin, TX)を用いて、その製造業者の説明書に従って蛍光ラベルした。
手短には、第１鎖cDNAを、２μgの合計RNAから、T7 Olico（dT）によりプライムされた逆転写により生成した。次に、T7プロモータープライマーを用いて、第２鎖cDNAを合成した。アミノアリル−dUTPを、インビトロ転写の間、aRNA中に組込み、蛍光シアニン色素による続くラベル化を促進した。得られるaRNAを精製し、そして製造業者の説明書に従って、aRNA上のアミノアリル修飾されたUTP残基へのCy3 及びCy5蛍光団(CyeDye Post Labeling Reactive Dyes, Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL)の直接的なカップリングによりラベルした。
蛍光プローブを組合し、精製し、そして真空下で乾燥し、次に、15.5μlの水に再懸濁し、そして次のものに添加した：3.6 μlの20X SSC、 2. 5μl の250 mM HEPES (pH 7.0)、 1.8μl のpoly-dA (500 ug/ml)、及び0. 54μl の10% SDS。ハイブリダイゼーションの前、溶液を0.22μmのフィルターにより濾過し、100℃に２分間、加熱し、そして室温に冷却した。
プローブ（それぞれ5μgのCy3−及びCy5−ラベルされたaRNA）を、カバ−ガラス下でマイクロアレイに適用し、そして湿潤されたチャンバーに配置した。ハイブリダイゼーションを、63℃で一晩（15〜16時間）、行った。走査の前、アレイを、0.03％SDSと共に１×SSC、0.2×SSC及び0.05×SSCにより連続的に洗浄し、そしてテーブルトップ遠心分離機（Sorvall R7, RTH-250 rotor; Asheville, NC）により500rpmで２分間、遠心分離し、過剰の液体を除去した。
マイクロアレイスライドを、Axon GenePixO 4000B スキャナー (Axon Instruments, Inc., Union City, CA)を用いて映像化した。次に、映像及びデータ分析を、GenePix（商標） Pro 5.0ソフトウェアを用いて、その製造業者の説明書に従って行った。マイクロアレイスポットについての蛍光強度値を、GenePix（商標）ソフトウェアを用いて測定し、そして個々のスポットについてのCy5：Cy3強度の比を、デフォールトバックグラウンド減法に従って計算した。Cy5/Cy3強度比が複製アレイ上で2.0又はそれ以上であるスポットを、DNA配列分析のために選択した。
マイクロアレイ分析に続いて、興味あるクローンを、-80℃で貯蔵されたグリセロール細胞懸濁液から選択し、そして単離した。配列決定のために使用されるDNAを、アルカリ溶液方法により調製した。個々のクローンを、pCR（商標）4Blunt-TOPOベクターのポリリンカーを端に有するT7及びM13逆方向プライマー（MWG Biotech, Inc., High Point, NC）を用いて配列決定した。新たな配列を、既知配列の延長を可能にするプライマーを企画するために使用し、そして次に、プライマー−ウォーキング方法を用いて、十分な長さのクローンを得た。
同一性を最初に、blast(n)アルゴリズム（Altschul など., 1990, Joumal of Molecular Biology 215: 403-410）を用いて、DNAレベルで調べた。続いて、６種の可能性ある読取枠の個々におけるDNA配列の推定上の翻訳を、Fasty（Pearson など., 1997, Genomics 46: 24-36）及びtblast(X)( Altschul など., 1990, 前記)を用いることにより公開のデータベース（例えば、SwissProt, SWall, Trembl, Genpept, and GeneseqP）に比較した。
例５：pAILo2発現ベクターの構成：
発現ベクターpAILo1を、NA2-tp：プロモーター、アスペルギラス・ニガーアミログルコシダーゼターミネーター配列（AMGターミネーター）及びアスペルギラス・ニジュランスアセトアミダーゼ遺伝子（amdS）を含んで成るpBANe6（アメリカ特許第6,461,837号）を修飾することにより構成した。pBANe6の修飾を、特定部位の突然変異誘発により、amdS選択マーカーからの位置2051, 2722及び3397bpでの３種のNcoI制限部位をまず排除することにより行った。すべての変化は、amdS遺伝子生成物の実際のタンパク質配列を末変化まま残す“サイレント”であるよう企画された。
それらの３種の部位の除去を、次のプライマー（下線のヌクレオチドは変更された塩基を表す）を用いて、GeneEditor特定部位の突然変異誘発キット（Promega, Madison, WI）により、その製造業者の説明書に従って、同時に行った：
AMDS3NcoMut (2050):
5'-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3' (配列番号3)
AMDS2NcoMut (2721):
5'-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3' (配列番号4)
AMDS1 NcoMut (3396):
5'-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3' (配列番号5)。
次に、すべての３種の予測される配列変化を含んで成るプラスミドを、QuickChange突然変異誘発キット(Stratagene, La Jolla, CA)を用いて、特定に部位の突然変異誘発にゆだね、位置1643でのAMGターミネーターの末端でのNcoI制限部位を排除した。次のプライマー（下線のヌクレオチドは、変更された塩基を表す）を、突然変異誘発のために使用した：
アスペルギラス・ニガーアミログルコシダーゼ（AMG）ターミネーター配列を突然変異誘発するための上方プライマー：
5’− CACCGTGAAAGCCATGCTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG−3’（配列番号６）
アスペルギラス・ニガーアミログルコシダーゼ（AMG）ターミネーター配列を突然変異誘発するための下方プライマー：
5’− CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTTTCACGGTGTCTG−3’（配列番号７）。
pBANe6の修飾における最後の段階を、pAILo1（図２）を生成するために、Quick Change突然変異誘発キット及び次のプライマー（下線のヌクレオチドは変更された塩基を表す）を用いて、ポリリンカーの開始での新しいNcoI制限部位の付加であった：
アスペルギラス・ニガーアミラーゼプロモーター（NA2−tpi）を突然変異誘発するための上方プライマー：
5’− CTATATACACAACTGGATTTACCATGGGCCCGCGGCCGCAGATC−3’（配列番号８）
アスペルギラス・ニガーアミラーゼプロモーター（NA2−tpi）を突然変異誘発するための下方プライマー：
5’− GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG−3’（配列番号９）。
pAILo1のamdS遺伝子を、アスペルギラス・ニジュランスpyrG遺伝子により交換した。プラスミドpBANe10（図３）を、pyrG遺伝子のための源として使用した。pBANe10の配列の分析は、pyrGマーカーがNsiI制限フラグメント内に含まれ、そしてNcoI又はPacI制限部位のいずれも含まないことを示した。andSはまた、NsiI制限部位を端に有するので、選択マーカーを交換するための方法は、NsiI制限フラグメントの単純な交換であった。pAILo1及びpBANe10からのプラスミドDNAを、制限酵素NsiIにより消化し、そして生成物を、標準方法を用いて、アガロースゲル電気泳動により精製した。pyrG遺伝子を含むpBANe10からのNsiIフラグメントを、pAILo1の主鎖に連結し、amdS遺伝子を含む元のNsiI DNAフラグメントを置換した。組換えクローンを、制限消化により分析し、それらが正しい挿入体及び正しい配向を有するかどうかを決定した。時計とは逆方向に転写されたpyrG遺伝子を有するクローンを選択した。新規プラスミドを、pAILo2と命名した（図４）。
例６：アスペルギラス・オリザエ発現ベクターの構成：
下記に示される２種の合成オリゴヌクレオチドプライマーを、ゲノムクローン番号３からの推定上のファミリーGH61Aをコードするサーモアスカス・アウレンチアカス遺伝子をPCR増幅するために企画した。InFusion Cloning キット(BD Biosciences, Palo Alto, CA)を用いて、制限消化又は連結の必要性を伴わないで、発現ベクターpAILo2中にフラグメントを直接的にクローン化した。
前方向プライマー：
5’− CACAACTGGATTTACCATGTCCTTTTCCAAG−3’（配列番号10）
逆方向プライマー：
5’− AGTCACCTCTAGTTATTAACCAGTATACAG−3’（配列番号11）。
太字の文字は、コード配列を表す。残りの配列は、pAILo2の挿入部位に対して相同である。
200pモルの個々の上記プライマーを、GH61Aコード配列を含む元のサーモアスカス・アウレンチアカスゲノムクローン番号３を表すDNA、10 mMの KCI、 20 mMの トリス- HCI pH 8. 8、10 mM の(NH4)2SO4、2 mMの MgS04、0.1% のTriton X-100、 それぞれ200 μMの デオキシリボヌクレオチド(dATP, dTTP, dGTP, and dCTP)、 及び 2単位のVentRe DNA ポリメラーゼ(すべての PCR は、New England Biolabs, Inc., Beverly, MAからの酵素及び試薬に関する)から成るPCR反応（50μlの最終体積）に使用した。増幅条件は、１サイクル、95℃で１分；30サイクル、それぞれ94℃で30秒、50℃で30秒、72℃で１分；及び最終１サイクル、72℃で７分。次に、熱阻止が、４℃ソーキングサイクルに進行した。
次に、フラグメントを、Infusion Cloningキットを用いて、その製造業者の説明書に従ってpAILo2発現ベクター中にクローン化した。ベクターを、NcoI及びPacIにより、製造業者により推薦される条件下で消化した。フラグメントを、MinEluteTMReaction Cleanup Kit (QIAGEN, Valencia, CA)を用いて精製した。遺伝子フラグメント及び線状化されたベクターを、反応において一緒に連結し、ファミリーGH61A遺伝子の転写がNA2−tpiプロモーターの制御下にある発現プラスミドpDZA2（図５）をもたらした。プラスミドpDZA2は、152bpのpAILo2を欠失した。
連結反応は、NcoI及びRocIにより消化された、約100ngのpAILo2、及び100ngのサーモアスカス・アウレンチアカスGH61A精製されたPCR生成物を含んだ。連結条件は、Infusion Cloningキットの製造業者のプロトコールに従った。E. コリXL1-Blue Subcloning-Grade Competent Cells (Stratagene, La Jolla, CA)を、連結生成物により形質転換した。構造体の同一性を、形質転換されたE. コリから精製されたプラスミドからのGH61Aコード配列のDNA配列決定により確めた。組換えプラスミドを含む１つのクローンを、E. コリpDZA2-7と命名した。
例７：セルロース分解増強活性を有するファミリーGH61ポリペプチドをコードするサーモアスカス・アウレンチアカスゲノム配列の特徴化：
サーモアスカス・アウレンチアカスGH61Aゲノムクローン15のDNA配列決定を、バージョン3.1Big Dyeターミネーター化学及びdGTP化学（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）及びプライマーウォーキング方法を用いて、Applied Biosystems Model 3700 Automated DNA Sequencerにより行った。ヌクレオチド配列をアセンブリーし、そしてVector NTI 8 SuiteソフトウェアーパッケージのContigExpress成分 (Informa, Inc., Frederick, MD)を用いて比較した。
セルロース分解増強活性を有するサーモアスカス・アウレンチアカスポリペプチドのヌクレオチド配列（配列番号１）及び推定されるアミノ酸配列（配列番号２）を、図１に示す。そのコード配列は、250個のアミノ酸のタンパク質をコードする。コード配列は、停止コドンを包含する799bpであり、そして46bpの単一のイントロンにより中断される。コード領域は、48.7％のG＋Cである。SignalP プログラム (Nielsenなど., 1997, Protein Engineering 10: 1-6)を用いて、22個のアミノ酸残基のシグナルペプチドが推定され、これは、成熟ポリペプチドが228個のアミノ酸を含むことを示す。
アミノ酸配列の比較一列整列を、blosum62マトリックスと共にParacel BioView Workbench ソフトウェアー (Paracel, Pasadena, CA)を使用するblastpアルゴリズム（Higgins, 1989, 前記）を用いて決定した。ギャップペナルティー、延長11及び延長１を、対様一列整列パラメーターとして使用した。その一列整列は、セルロース分解増強活性を有するファミリーGH61ポリペプチドをコードするサーモアスカス・アウレンチアカス遺伝子の推定されるアミノ酸配列が、それぞれ、アスペルギラス・ニジュランスの仮のタンパク質AN1041.2（受託番号EAA65609）、アスペルギラス・ニジュランスの仮のタンパク質AN7891.2（受託番号EAA59545）及びアスペルギラス・ニジュランスの仮のタンパク質AN9524.2（受託番号EAA66740）からのファミリー61タンパク質の推定されるアミノ酸配列に対して67％、63％及び58％の同一性を共有したことを示した。
プラスミドpDZA2-7を含むE.コリXL1-Blue (Stratagene, La Jolla, CA)を、2004年１月30日の寄託日に、NRRL B−30704としてAgricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street, Peoria, Illinois, 61604に寄託した。
例８：セルロース分解増強活性を有するファミリーGH61ポリペプチドをコードするサーモアスカス・アウレンチアカスゲノム遺伝子のアスペルギラス・オリザエJaL250における発現：
アスペルギラス・オリザエJaL250プロトプラストを、Christensen など., 1988, BiolTechnology 6 : 1419-1422の方法に従って調製した。約1.5μgのpDZA2を用いて、アスペルギラス・オリザエJaL250を形質転換した。プラスミドpAILo2を対照として用いた。
pDZA2によるアスペルギラス・オリザエJaL250の形質転換が約11の形質転換体を生成した。10個の形質転換体を、個々のPDAプレートに単離した。
すべての形質転換の集密PDAプレートを、5mlの0.01％Tween20により洗浄し、そして125mlのガラス振盪フラスコ中の25mlのMDU2BP培地を別々に接種し、そして34℃、250rpmインキュベートした。インキュベーションの6日後、個々の培養物からの上清液５μlを、８〜16％Tris-Glycine SDS-PAGE ゲル (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA)を用いて、その製造業者の説明書に従って分析した。SDS−PAGE分析は、GH61HAバンドが、10個の形質転換体のうち９個に関して、25kDaよりもわずかに高い見掛分子量を伴って移動したことを示した。
例９：セルロース分解増強活性を有するサーモアスカス・アウレンチアカスGH61Aの特徴化：
トウモロコシの茎を、希硫酸を用いて、U. S. Department of Energy National Renewable Energy Laboratory (NREL)で前処理した。次の条件を、前処理のために使用した：190℃での0.048gの硫酸/g乾燥バイオマス及び25％（w/w）乾燥固形物、約１分。NRELに従って、前処理されたトウモロコシの茎（PCR）における水不溶性固形物は、52％セルロース、3.6％ヘミセルロース及び29.8％リグニンを含んだ。
セルロース及びヘミセルロースは、NREL標準分析方法＃002を用いて高性能液体クロマトグラフィーにより糖の続く分析を伴って、２段階硫酸加水分解により決定された。リグニンは、NREL標準分析方法＃003を用いて、硫酸によるセルロース及びヘミセルロースの加水分解の後、重量的に決定された。酵素加水分解の前、PCSを多量のDDI水により洗浄し；水洗浄されたPCSの乾量は20.6％であることが見出された。
サーモアスカス・アウレンチアカスGH61Aポリペプチドを、例８に記載のようにして、アスペルギラス・オリザエにおいて発現し、そしてブイヨンを9500×gで遠心分離し、そして次に、上清液を、PM10 膜 (Millipore, Billerica, MA)を備えたAmicon撹拌細胞を用いて濃縮し、そしてEcono-Pac 10DG 過ラム (BioRad Laboratories, Hercules, CA)を用いて脱塩した。
PCSの加水分解（50mMの酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）1ml当たり10mg）を、1.0mlの合計反応体積を伴って、1.1mlのImmunoware 微小管 (Pierce, Rockford, IL)を用いて行った。T. アウランチアカスGH61Aポリペプチドを、この後、Tr/AoBGと呼ばれ、そしてNovozymes A/S, Bagsvaerd, Denmarkから得られる、アスペルギラス・オリザエ（WO02/095014号）からのβ−グルコシダーゼを発現するトリコダーマ・レセイの発酵に由来するセルラーゼ調製物の加水分解能力を増強するその能力について試験した。PCSの加水分解を、1gのPCS当たり0.2mgのT.アウレンチアカスGH61Aポリペプチドにより補充された、PCS１g当たり2.5mgのTr/AoBGを用いて行った。
PCS加水分解を、50℃で行った（TS Autoflow CO2ジャケット付インキュベーター）。反応は、二重反復して行われ、そしてアリコートは、加水分解の間、採取された。PCS化水分解反応を、20μlの個々の加水分解物のアリコートと、180μlの0.11MのNaOH（停止試薬）とを混合することにより、停止した。適切な連続希釈を、個々のサンプルについて生成し、そして還元糖含有量を、下記のようにして、96ウェルマイクロプレート形に適合されたアッセイを用いて決定した。手短には、適切に希釈されたサンプルの90μlアリコートを、96ウェルの円錐底のマイクロプレートに配置した。
反応を、２％NaOH中、1.5％（w/v）PHBAH60μlを個々のウェルに添加することにより開始した。プレートを、95℃で10分間、カバーしないで加熱した。プレートを、室温（RT）に冷却し、そして50μlの蒸留水を個々のウェルに添加した。個々のウェルからの100μlのアリコートを、平らな底の96ウェルプレートに移し、そしてA410nmでの吸光度を、SpectraMax Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて測定した。グルコース標準（0.4％の水酸化ナトリウムにより希釈された、0.1〜0.0125mg/ml）を用いて、得られたA410nm値をグルコース同等物に翻訳するための標準曲線を調製した。得られる同等物を用いて、個々の反応についてのPCSセルロース転換の百分率を計算した。
還元糖へのセルロース転換の程度（転換、％）を、次の等式を用いて計算した：
転換率(%)＝RS(mg/ml)＊100＊162/（セルロース(mg/ml)＊180）＝RS(mg/ml)＊100/（セルロース(mg/ml)＊1.111）
この等式においては、RSは、グルコース同等物において測定された、溶液における還元糖の濃度（mg/ml）であり、そして因子1.111は、グルコースへのセルロースの転換においての重量増加を表す。
Tr/AoBGのみ（2.5mg/g PCS）、又はT. アウランチアカスGH61Aポリペプチド（0.2mg/g PCS）により補充されたTr/AoBGによるセルロース転換を、表１に要約する：
Figure 0005015610
表１は、T. アウランチアカスGH61AポリペプチドがPCSに対するTr/AoBGの活性を増強したことを示す。T. アウランチアカスGH61Aポリペプチドが単独で（0.2mg/g PCS）、115時間後、わずか0.7％以下のセルロース転換率を生成した。2.5mgのTr/AoBGへの0.2mgのT. アウランチアカスGH61Aポリペプチドの補充が、3.5mgのTr/AoBGによる転換よりも高いセルロース転換をもたらし、このことは、PCSに対するTr/AoBG活性がT. アウランチアカスGH61Aポリペプチドにより増強され、そしてTr/AoBGとT. アウランチアカスGH61Aポリペプチドとの間に相乗効果が存在したことを示唆する。
生物学的材料の寄託：
次の生物学的材料を、Agriculture Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL),1815 University Street, Peoria, Illinois に、ブタペスト条件に基づいて寄託し、そして次の受託番号を付与された：
寄託物：E. coli 株pDZA2-7
受託番号：NRRL B-30704
寄託日：200４年１月30日
前記株は、培養物への接近が、37 C.F.R.§1.14.及び35 U.S.C.§122下で特許及び商標局長により決定される本特許出願の係属の間、利用できることを保証する条件下で寄託された。寄託物は、寄託された株の実質的に純粋な培養物を示す。寄託物は、本出願の対応物又はその子孫が出願される国々における外国特許法により要求される場合、利用できる。しかしながら、寄託物の入手可能性は、政府の指令により許される特許権の低下において本発明を実施する許可を構成しないことが理解されるべきである。
本明細書に記載される発明は、本明細書に開示される特許の態様により範囲を限定されるものではない。何故ならば、それらの態様は本発明のいくつかの観点を例示するものである。いずれかの同等の態様が本発明の範囲内で意図される。実際、本明細書に示され、そして記載されるそれらの修飾の他に、本発明の種々の修飾は、前述の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾はまた本発明の範囲内にある。
種々の文献が本明細書に引用されており、それらの開示は引用により本明細書に組み込まれている。
図１は、サーモアスカス・アウレンチアカスセルロース分解増強活性のゲノムDNA配列及び推定されるアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１及び２）を示す。予測されるイントロンは、イタリック形で示される。予測される（Signal P）シグナルペプチドは下線が引かれている。コード配列は、停止コドンを含む799bpであり、そして56pbの１つのイントロンにより中断される。予測される成熟ポリペプチドは228個のアミノ酸を含む。 図２は、pAILo1の制限地図を示す。 図３は、pBANe10の制限地図を示す。 図４は、pAILo2の制限地図を示す。 図５は、pDZA2の制限地図を示す。

Claims (27)

  1. （ａ）配列番号２のアミノ酸23〜250と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド；及び
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸23〜250の１〜30個のアミノ酸の保存性置換、欠失及び/又は挿入を含んで成る変異体；
    から成る群から選択された、セルロース分解増強活性を有するポリペプチド。
  2. 前記（ａ）におけるアミノ酸配列の同一性が、少なくとも95％である、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記（ａ）におけるアミノ酸配列の同一性が、少なくとも97％である、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  4. 配列番号２のアミノ酸配列からなるもしくは当該アミノ酸配列を含んで成る請求項１に記載のポリペプチド。
  5. 配列番号２のアミノ酸23〜250のアミノ酸配列から成る又は当該アミノ酸配列を含んで成る請求項１に記載のポリペプチド。
  6. E. コリNRRL B-30704に含まれるプラスミドpDZA2-7に含まれるポリヌクレオチドによりコードされる請求項１に記載のポリペプチド。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド。
  8. 発現宿主におけるポリペプチドの生成を指図する１又は複数の制御配列に作用可能に結合される、請求項７に記載のポリヌクレオチドを含んで成る核酸構造体又は組換え発現ベクター。
  9. 請求項７又は８に記載のポリヌクレオチドを含んで成る組換え宿主細胞。
  10. 請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドの生成方法であって、
    （ａ）その野生型において、前記ポリペプチドの生成の助けと成る条件下でそのポリペプチドを生成できる細胞を培養し；そして
    （ｂ）前記ポリペプチドを回収する；
    ことを含んで成る方法。
  11. 請求項１〜６のいずれか１項記載のポリペプチドの生成方法であって、
    （ａ）前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る核酸構造体を含んで成る宿主細胞を、前記ポリペプチドの生成の助けと成る条件下で培養し；そして
    （ｂ）前記ポリペプチドを回収する；
    ことを含んで成る方法。
  12. 請求項１〜６のいずれかの１項記載のポリペプチドの生成方法であって、
    （ａ）請求項１〜６のいずれかの１項記載のセルロース分解増強活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んで成るトランスジェニック植物又は植物細胞を、前記ポリペプチドの生成の助けになる条件下で培養し；そして
    （ｂ）前記ポリペプチドを回収する；
    ことを含んで成る方法。
  13. 請求項１〜６のいずれか１項記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにより形質転換されている、トランスジェニック植物、植物部分又は植物細胞。
  14. 請求項１〜６のいずれか1項記載のセルロース分解増強活性を有するポリペプチド、セルロース分解活性、及び界面活性剤を含んで成る洗剤組成物。
  15. セルロース材料を分解するか又は転換するための方法であって、前記セルロース材料を、有効量のセルロース分解タンパク質により、請求項１〜６のいずれか１項記載のセルロース分解増強活性を有する、有効量のポリペプチドの存在下で処理し、ここで前記セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの不在に比較して、セルロース材料の分解を高める方法。
  16. 前記１又は複数のセルロース分解酵素が、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びβ−グルコシダーゼから成る群から選択される請求項15に記載の方法。
  17. ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、ラッカーゼ又はペルオキシダーゼから成る群から選択された、有効量の１又は複数の酵素により、前記セルロース材料を処理することをさらに含んで成る請求項15又は16に記載の方法。
  18. 前記方法が、前処理工程、同時糖化及び発酵工程（SSF）、又はハイブリッド加水分解及び発酵工程（HHF）における段階である、請求項15〜17のいずれか１項に記載の方法。
  19. 分解されたセルロース材料を回収することをさらに含んで成る請求項15〜18のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記分解されたセルロース材料が、糖である請求項19に記載の方法。
  21. 前記セルロース分解タンパク質及び/又は前記セルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、細胞を含むか又は含まない発酵ブイヨンの形で存在する請求項15〜20のいずれか１項に記載の方法。
  22. （ａ）セルロース材料を、有効量のセルロース分解タンパク質により、請求項１〜６のいずれか１項記載のセルロース分解増強活性を有する、有効量のポリペプチドの存在下で糖化し、ここで前記セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの存在が、セルロース分解増強活性を有するポリペプチドの不在に比較して、セルロース材料の分解を高め；
    （ｂ）段階（ａ）の糖化されたセルロース材料を、１又は複数の発酵微生物と共に発酵し；そして
    （ｃ）前記発酵物から有機物質を回収する；
    ことを含んで成る、有機物質の生成方法。
  23. 前記１又は複数のセルロース分解酵素が、セルラーゼ、エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ及びβ−グルコシダーゼから成る群から選択される請求項22に記載の方法。
  24. ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、ラッカーゼ又はペルオキシダーゼから成る群から選択された、有効量の１又は複数の酵素により、前記セルロース材料を処理することをさらに含んで成る請求項22又は23に記載の方法。
  25. 前記段階（ａ）及び（ｂ）が、同時糖化及び発酵において同時に行われる請求項22〜24のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記有機物質が、アルコール、有機酸、ケトン、アミノ酸又はガスである請求項22〜25のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記セルロース分解タンパク質、及び/又はセルロース分解増強活性を有するポリペプチドが、細胞を有するか又は有さない発酵ブイヨンの形で存在する請求項22〜26に記載の方法。
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