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CN113544280A - 用于产生发酵液的方法 - Google Patents

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CN113544280A
CN113544280A CN202080018934.1A CN202080018934A CN113544280A CN 113544280 A CN113544280 A CN 113544280A CN 202080018934 A CN202080018934 A CN 202080018934A CN 113544280 A CN113544280 A CN 113544280A
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CN
China
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fermentation broth
whole fermentation
enzyme
fungus
whole
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Application number
CN202080018934.1A
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English (en)
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赫尔曼·简·佩尔
迈克·阿珀尔多恩
罗尔夫·波德曼
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DSM IP Assets BV
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Abstract

本发明涉及一种用于通过培养微生物来产生发酵液的方法。

Description

用于产生发酵液的方法
技术领域
本发明涉及一种用于通过培养微生物来产生发酵液的方法。
背景技术
近年来，酵母和真菌已经成为用于表达纤维素分解酶和半纤维素分解酶的有吸引力的选择，因为它们可以很容易地在简单介质中大规模生长，从而降低生产成本。
特别是丝状真菌，诸如，曲霉属(Aspergillus)和木霉属(Trichoderma)，已被开发成用于筛选和生产的表达平台。它们能够以高水平表达原生和异源酶，这使它们非常适合大规模生产酶。
Molloney(莫洛尼)等人(1983年)，《生物技术与生物工程》，第XXV卷，第1169-1173页描述了埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)在不同诱导底物上生长时产生的纤维素酶对纤维素的水解。
Figure BDA0003247541970000011
(埃利莱)等人(2017年)，《关于生物燃料的生物技术》第10卷第1-17页，描述了一种使用工程化里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株的简单且具有成本效益的纤维素酶生产方法。
尽管已经对纤维素分解酶和半纤维素分解酶及其通过丝状真菌的生产进行了大量研究工作，但酶的高成本仍然限制了它们在生物能源部门等部门的使用和商业化。筛选和发现新的微生物和酶等生物技术的进步可以降低纤维素分解酶和半纤维素分解酶的生产成本。然而，除了酶本身的优化之外，方法设计的优化同样是降低酶生产总成本的关键工具。例如，商业上较便宜的碳水化合物来源和改良的发酵条件可以使纤维素分解酶和半纤维素分解酶组合物的生产更具成本效益。因此，出于经济原因，需要包括旨在降低总体生产成本的具有新颖性和创新性的方法配置。
发明内容
本发明的目的在于提供一种包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的全发酵液的改进生产方法。具体而言，本发明的目的在于提供一种改进的真菌全发酵液生产方法。优化和改进在于在存在诱导剂的情况下培养真菌以产生第一全发酵液，并在不存在诱导剂的情况下培养真菌以产生第二全发酵液，以及混合第一全发酵液和第二全发酵液。
具体实施方式
在本说明书和所附权利要求中，词语“包含(comprise)”和“包括(include)”以及诸如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”和“包括(including)”的变体应被包含性地解读。也就是说，在上下文允许的情况下，这些词旨在传达可能包括未具体列举的其他要素或整数。冠词“一个(a)”和“一个(an)”在本文中用于指代一个或多于一个(即一个或至少一个)冠词的语法对象。举例而言，“要素”可以指一个要素或多于一个要素。如本文所用，术语“酶”是指一种或多种酶。
本文描述了一种用于产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液的方法，其中所述方法包含以下步骤：(i)在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌，以产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液，(ii)在不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌，以产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第二全发酵液，以及混合第一全发酵液和第二全发酵液，以产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液。可选地，可以回收混合全发酵液。可选地，通过在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌或通过在不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌产生的一种或多种另外的全发酵液(即第三、第四、第五、第六等全发酵液)可以与第一全发酵液、第二全发酵液和/或混合全发酵液混合。换言之，如本文所述的全发酵液可以用至少另一种全发酵液加以补充。另一种全发酵液可以来自相同类型的真菌或来自另一种类型的真菌。如本文所用，“包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的发酵液”是指“包含一种或多种纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的发酵液”。
在一个实施例中，混合全发酵液包含的第一全发酵液与第二全发酵液的比率为99％(w/w)至1％(w/w)-70％(w/w)至30％(w/w)、95％(w/w)至5％(w/w)-75％(w/w)至25％(w/w)、90％(w/w)至10％(w/w)-80％(w/w)至20％(w/w)。在一个实施例中，“包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的全发酵液”是指全发酵液包含至少一种纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶。在一个优选的实施例中，全发酵液包含多于一种纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶。
在有利于产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的全发酵液的条件下培养丝状真菌。如本文所用，“有利于产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的全发酵液”是指包含碳源和氮源以及无机盐的合适的生长和生产培养基，20℃至60℃的合适的生长和生产温度，3至8的合适的生长和生产pH值，3周或更短的培养时间。
在存在或不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生如本文所述的包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液或第二全发酵液的步骤可以在使丝状真菌增殖的方法之前进行。增殖可以包含在摇瓶、小容器以及大容器中的几个步骤。
在一个实施例中，用于产生如本文所述的包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液的方法中使用的容器具有至少1m3的体积。优选地，容器具有至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3、至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3的体积。通常，容器将小于1000m3。
在一个实施例中，用于在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液的容器与用于在不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生含括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第二全发酵液的容器相同。在一个实施例中，用于在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液的容器与用于在不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第二全发酵液的容器不同。在容器不同的情况下，它们可以具有相同的体积，但也可以具有不同的体积。
在一个实施例中，用于混合第一全发酵液和第二全发酵液以产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液的容器与用于在存在和/或不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液和/或第二全发酵液的容器相同。在一个实施例中，用于混合第一全发酵液和第二全发酵液以产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液的容器与用于在存在和/或不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液和/或第二全发酵液的容器不同。
在一个实施例中，在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液的步骤在第一容器中进行，在不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第二全发酵液的步骤在第二容器中进行，并且混合第一全发酵液和第二全发酵液以产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液的步骤在第三容器中进行。
在一个实施例中，丝状真菌以补料分批培养方式、分批培养方式、连续培养方式或其任何组合培养。优选地，真菌以补料分批培养方式培养。本领域技术人员熟知各种培养模式及其条件。
在一个实施例中，培养在需氧条件下进行。本领域技术人员熟知用于需氧培养的容器设计，诸如，举例而言，搅拌容器和泡罩塔。
在一个实施例中，一种或多种全发酵液是(部分)纯化的。用于(部分)纯化的方法是技术人员已知的，并且包括但不限于生物质去除、超滤以及色谱法。
在一个优选的实施例中，全发酵液未经(部分)纯化。在一个实施例中，全发酵液是真菌全发酵液，优选为丝状真菌全发酵液。
第一全发酵液可以通过培养非重组和/或重组真菌来制备。第二全发酵液可以通过培养非重组和/或重组真菌来制备。在一个实施例中，真菌是包含一种或多种可以与真菌同源或异源的基因的重组真菌。在一个实施例中，真菌是包含与真菌同源或异源的一种或多种基因的重组真菌，其中所述一种或多种基因编码可降解纤维素底物的酶。在一个实施例中，真菌是包含一种或多种与真菌同源的基因的非重组真菌。在一个实施例中，真菌是包含一种或多种与真菌同源的基因的非重组真菌，其中一种或多种基因编码可降解纤维素底物的酶。混合全发酵液可以是非重组和/或重组真菌的全发酵液的混合物。
在一个实施例中，产生第一全发酵液的真菌与产生第二全发酵液的真菌不同。在一个实施例中，产生第一全发酵液的真菌与产生第二全发酵液的真菌相同。
优选地，细胞在全发酵液中被灭活。全发酵液可以含有有机酸(用于将细胞灭活)、灭活的细胞和/或细胞碎片，以及培养基。如本文所述的全发酵液包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶。
可以改变真菌，以改良或制造酶。例如，真菌可以通过经典的菌株改良程序或通过重组DNA技术进行突变。因此，本文提及的真菌可原样用于产生酶或可被改变以增加产量或产生改变的酶，所述改变的酶可能包含异源酶，例如，纤维素酶和/或半纤维素酶，即最初不是由此真菌产生的酶。优选地，使用真菌，更优选为丝状真菌来产生酶。根据本文所述的方法由真菌产生的酶优选为纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶。有利地，使用嗜热或耐热的丝状真菌。
通常，真菌在适合产生纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的细胞培养基中培养。这些酶能够将纤维素底物水解。合适的培养基是本领域已知的。全发酵液可以通过使真菌生长至静止期并使真菌在限制碳条件下保持足以表达酶的一段时间来制备。一旦所关注的酶被真菌分泌到发酵培养基中，就可以使用全发酵液。全发酵液可以包含真菌。在一些实施例中，全发酵液包含发酵结束时衍生的发酵材料的未分级成分。通常，全发酵液包含用过的培养基和真菌生长至饱和后存在的细胞碎片，在碳限制条件下温育以允许蛋白质合成。在一些实施例中，全发酵液包含用过的细胞培养基、细胞外酶和真菌。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法将全发酵液中存在的真菌裂解、透化或灭活，以产生细胞灭活的全发酵液。在一个实施例中，全发酵液是细胞灭活的全发酵液，其中含有真菌细胞的全发酵液被裂解或灭活。在一些实施例中，通过化学和/或pH处理使真菌裂解，以产生真菌发酵的细胞灭活的全发酵液来将细胞灭活。在一些实施例中，通过化学和/或pH处理使真菌裂解来将细胞灭活并将细胞灭活的发酵混合物的pH调节至合适的pH。在一个实施例中，全发酵液包含第一有机酸组分和第二有机酸组分，所述第一有机酸组分包含至少一种1-5碳有机酸和/或其盐，所述第二有机酸组分包含至少6个或更多个碳有机酸和/或其盐。在一个实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或其任何组合，而第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或其任何组合。
在一个实施例中，包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的全发酵液之一通过在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌而产生，而包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的全发酵液中的另一者通过在不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌而产生。这意味着至少在全发酵液之一的产生期间，在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌，并且至少在其他全发酵液之一的产生期间，在不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌。如本文所用，“在存在诱导剂的情况下”是指在丝状真菌培养之前和/或期间将诱导剂添加到进行培养的培养基中。在一个实施例中，诱导剂以10％(w/v)-0.01％(w/v)的量添加。如本文所用，“在不存在诱导剂的情况下”是指在将丝状真菌培养至进行培养的培养基之前和/或期间不添加或仅添加少量诱导剂。本文所用的“不添加或仅添加少量”是指以0.1％(w/v)或更低，优选为0.01％(w/v)或更低，甚至更优选为低于0.01％(w/v)的量添加诱导剂。
在一个实施例中，在存在诱导剂的情况下在本文所述方法的步骤(i)中培养丝状真菌。酶诱导是响应于特定分子的存在而制造酶的过程。此分子在本文中称为诱导剂。通常，诱导剂是酶作用于其上或由酶产生的化合物。诱导剂选自纤维素、羧甲基纤维素(CMC)、木聚糖、木糖、龙胆二糖、槐糖、乳糖、甘油、葡萄糖、山梨糖醇、纤维二糖、木二糖、半乳糖、海带二糖、麦芽糖、果糖、甘露糖醇、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、山梨糖、通过将葡萄糖与转糖基化β-葡萄糖苷酶温育而由葡萄糖制备的二糖混合物，或其任意组合。
如本文所用，术语“全发酵液”是指通过细胞发酵产生的不经历或极少回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下温育以允许蛋白质合成(例如，通过宿主细胞表达酶)并分泌到细胞培养基中时，产生全发酵液。通常，全发酵液是未分级的，并且包含用过的细胞培养基、细胞外多肽(诸如，纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶)，以及微生物细胞，优选为非活细胞。
如果需要的话，可以将全发酵液分馏，并且可以使用分馏的内容物中的一个或多个。例如，可以从全发酵液中去除灭活的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
全发酵液还可以包含防腐剂和/或抗微生物剂。此类防腐剂和/或试剂是本领域已知的。
如本文所述的全发酵液通常为液体，但可以含有不溶性组分，诸如，灭活细胞、细胞碎片、培养基组分，和/或不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分，以提供澄清的全发酵液。
在一个实施例中，全发酵液可以用一种或多种酶加以补充。在一个实施例中，全发酵液可以用不是内源性表达的或由真菌以相对低水平表达的一种或多种酶活性加以补充，以改进纤维素底物的降解，例如，降解为可发酵糖，诸如，葡萄糖或木糖。补充酶可以作为全发酵液的补充物加入，并且酶可以是单独的全发酵液的组分，或者可以被纯化，或者最低限度地回收和/或纯化。
在一个实施例中，全发酵液包含过表达一种或多种酶(诸如，一种或多种纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶)的重组真菌发酵的全发酵液。在一个实施例中，全发酵液包含过表达一种或多种酶(诸如，纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶)，以改进纤维素底物降解的重组真菌发酵的全发酵液。或者，全发酵液可以包含过表达一种或多种酶(诸如，纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶)的非重组真菌和重组真菌发酵的全发酵液的混合物。或者，全发酵液可以包含过表达一种或多种酶(诸如，纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶)以改进纤维素底物的降解的非重组真菌和重组真菌发酵的全发酵液的混合物。在一个实施例中，全发酵液包含过表达β-葡萄糖苷酶的真菌发酵的全发酵液。或者，全发酵液可以包含非重组真菌发酵的全发酵液和过表达β-葡萄糖苷酶的重组真菌发酵的全发酵液的混合物。
在一个实施例中，丝状真菌选自枝顶孢属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、白僵菌属(Beauvaria)、头孢菌属(Cephalosporium)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、Chaetomium paecilomyces、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochiobolus)、鬼伞属(Coprinus)、隐球菌属(Cryptococcus)、黑蛋巢菌属(Cyathus)、裸孢壳属(Emericella)、内座壳属(Endothia)、Endothia mucor、黑粉酵母属(Filibasidium)、镰刀菌属(Fusarium)、白乔史密斯霉属(Geosmithia)、粘帚霉属(Gilocladium)、腐质霉属(Humicola)、稻瘟菌属(Magnaporthe)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属(Myrothecium)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉孢霉属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、原毛平革菌属(Panerochaete)、侧耳属(Pleurotus)、柄孢壳菌属(Podospora)、梨孢霉属(Pyricularia)、踝节菌属(Rasamsonia)、根毛霉属(Rhizomucor)、根霉属(Rhizopus)、柱顶孢霉属(Scylatidium)、裂褶菌属(Schizophyllum)、壳多孢属(Stagonospora)、篮状菌属(Talaromyces)、热子囊菌属(Thermoascus)、嗜热丝孢菌属(Thermomyces)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、Trametes pleurotus、木霉属(Trichoderma)，以及毛癣菌属(Trichophyton)。在一个优选的实施例中，丝状真菌属于踝节菌属(Rasamsonia)、青霉菌属(Penicillium)、木霉属(Trichoderma)或曲霉属(Aspergillus)。
如前所述，产生第一全发酵液的真菌可以与产生第二全发酵液的真菌不同。产生第一全发酵液的真菌也可以与产生第二全发酵液的真菌相同。在一个实施例中，产生第一全发酵液的真菌可以来自与产生第二全发酵液的真菌不同的属。在一个实施例中，产生第一全发酵液的真菌可以来自与产生第二全发酵液的真菌相同的属。在一个实施例中，产生第一全发酵液的真菌可以来自与产生第二全发酵液的真菌相同的属，但来自与产生第二全发酵液的真菌不同的物种。在一个实施例中，产生第一全发酵液的真菌可以来自与产生第二全发酵液的真菌相同的物种。
“丝状真菌”包括真菌(Eumycota)和卵菌(Oomycota)亚门的所有丝状形式(由Hawksworth等人定义，Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi(Ainsworth和Bisby的真菌词典)，第8版，1995年，CAB国际，剑桥大学出版社，英国)。在许多培养物保藏中心，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物保藏中心(DSM)、荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心、北区研究中心(NRRL)，公众可以轻松获取多种丝状真菌菌株。此类菌株的示例包括黑曲霉CBS 513.88、米曲霉ATCC 20423、IFO4177、ATCC 1011、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892、产黄青霉CBS455.95、桔青霉ATCC 38065、产黄青霉P2、埃默森踝节菌CBS 393.64、顶头孢霉ATCC 36225或ATCC 48272、里氏木霉ATCC 26921或ATCC 56765或ATCC 26921、酱油曲霉ATCC11906、Chrysosporium lucknowense C1、Garg 27K、VKM F-3500-D、ATCC44006及其衍生物。
踝节菌属(Rasamsonia)是一个新属，其包含耐热和嗜热的篮状菌属和白乔史密斯霉属物种(J.Houbraken等人，参见前文)。基于表型、生理学和分子数据，Houbraken等人提议将物种埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、丝衣霉状篮状菌(Talaromycesbyssochlamydoides)、象牙白篮状菌(Talaromyces eburneus)、赭褐白乔史密斯霉(Geosmithia argillacea)和柱孢白乔史密斯霉(Geosmithia cylindrospora)转移到新属Rasamsonia(Rasamsonia gen.nov)。优选的真菌是丝衣霉状篮状菌(Rasamsoniabyssochlamydoides)、踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)、疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lenuginosus)、嗜热篮状菌(Talaromyces thermophilus)、坚脆嗜热子囊菌(Thermoascus crustaceus)、嗜热栖热菌(Thermoascus thermophilus)和橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)，最优选为踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsoniaemersonii)。埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)、Penicillium geosmithiaemersonii和踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)在本文中可互换使用。
在一个实施例中，通过如本文所述的方法产生的全发酵液中的酶具有纤维素材料降解和/或纤维素水解活性。换言之，由真菌产生的酶具有纤维素材料降解和/或纤维素水解活性。换言之，酶是纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶。
在一个实施例中，酶原生于真菌。在另一个实施例中，酶对真菌是异源的。如本文所用，术语“异源的”是指不是天然存在于宿主细胞中的酶。它可能是原生酶的变体，但也可能是另一物种的酶。例如，当踝节菌属(Rasamsonia)的酶由曲霉(Aspergillus)表达时，被认为是异源的。当踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)的酶由丝衣霉状篮状菌(Rasamsonia byssochlamydoides)表达时，也被认为是异源的。然而，当特定踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)菌株的酶由另一个踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsoniaemersonii)菌株表达时，被认为是原生酶。当将合成基因引入菌株并且此基因对与菌株中发现的原生酶相同的酶进行编码时，合成基因编码的酶也被认为是原生酶。
在一个实施例中，真菌过表达酶。真菌可以包含多于一个拷贝的对原生或异源酶进行编码的多核苷酸。通常，酶是纤维素酶、半纤维素酶，和/或果胶酶。
在一个实施例中，真菌还可以产生两种或更多种，例如，三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或更多种酶。一些酶可以是原生酶，而另一些则是异源的。在一个实施例中，真菌产生至少两种纤维素酶。至少两种纤维素酶可以含有相同或不同的活性。真菌可以从真菌以外的来源产生纤维素酶和/或半纤维素酶和/或果胶酶。在由真菌产生后的另一个实施例中，产生的酶可以与一种或多种其他酶组合。酶的组合可以，例如，用于如本文所述由纤维素材料产生糖制产品的方法中或用于由纤维素材料产生发酵产品的方法中。
在一个实施例中，第一全发酵液包含纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、葡聚糖内切酶、β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶、木聚糖内切酶、裂解性多糖单加氧酶、乙酰木聚糖酯酶，或其任何组合。
在一个实施例中，第二全发酵液包含纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、葡聚糖内切酶、β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶、木聚糖内切酶、裂解性多糖单加氧酶、乙酰木聚糖酯酶，或其任何组合。
在一个实施例中，第一全发酵液中的酶与第二全发酵液中的酶不同。在一个实施例中，第一全发酵和第二全发酵中的酶是相同的。在一个实施例中，第一全发酵和第二全发酵中的一种或多种酶相同，且一种或多种不同。在一个实施例中，第一全发酵和第二全发酵中的酶是相同的，但它们基于总蛋白质含量的量不同。例如，第一全发酵液和第二全发酵液都可以包括纤维二糖水解酶，但是基于总蛋白质含量的纤维二糖水解酶的量在两种发酵液之间不同。
如本文所用，β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)是能够催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。这样的多肽可以对β-D-葡萄糖苷具有广泛的特异性，并且还可以水解以下一者或多者：β-D-半乳糖苷、α-L-阿拉伯糖苷、β-D-木糖苷或β-D-岩藻糖苷。这种酶也可称为苦杏仁苷酶、β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶、纤维二糖酶或基因二糖酶。
在一个实施例中，如本文所述的全发酵液包含来自曲霉属(Aspergillus)的β-葡萄糖苷酶，诸如，来自米曲霉(Aspergillus oryzae)β-葡萄糖苷酶，诸如，WO 02/095014中所公开的β-葡萄糖苷酶或WO 2008/057637中公开的具有β-葡萄糖苷酶活性的融合蛋白，或来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的β-葡萄糖苷酶，诸如，WO 2005/047499中的SEQ IDNO:2或WO 2014/130812中的SEQ ID NO:5中所公开的β-葡萄糖苷酶或诸如WO 2012/044915中所公开的烟曲霉β-葡糖苷酶变体，诸如，具有以下取代：F100D、S283G、N456E、F512Y(使用WO 2014/130812中的SEQ ID NO:5编号)的变体，或来自棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、黑曲霉(Aspergillus niger)或白曲霉(Aspergillus kawachi))的β-葡萄糖苷酶。在另一个实施例中，β-葡萄糖苷酶源自青霉属(Penicillium)，诸如，在WO 2007/019442中以SEQ ID NO:2公开的巴西青霉(Penicillium brasilianum)，或源自木霉属(Trichoderma)，诸如，里氏木霉属(Trichoderma reesei)，诸如，在US 6,022,725、US 6,982,159、US 7,045,332、US 7,005,289、US 2006/0258554、US 2004/0102619中描述的那些。在一个实施例中，甚至可以使用细菌β-葡萄糖苷酶。在另一个实施例中，β-葡糖苷酶源自太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)(WO 2011/035029)或囊状长毛盘菌(Trichophaea saccata)(WO 2007/019442)。在一个优选的实施例中，全发酵液包含来自踝节菌属(Rasamsonia)，诸如，踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)的β-葡萄糖苷酶(参见WO 2012/000886)。
如本文所用，葡聚糖内切酶是能够催化纤维素、地衣素或谷物β-D-葡聚糖中的1,4-β-D-糖苷键的内切水解的酶。它们属于EC 3.2.1.4，也可能能够水解也含有1,3-键的β-D-葡聚糖中的1,4-键。葡聚糖内切酶也可称为纤维素酶、微晶纤维素酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶、β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维素糊精酶、1,4-β-D-葡聚糖内切酶、1,4-β-D-葡聚糖内切水解酶或1,4-β-葡聚糖内切酶。
在一个实施例中，葡聚糖内切酶包括GH5葡聚糖内切酶和/或GH7葡聚糖内切酶。这意味着全发酵液中的至少一种葡聚糖内切酶可以是GH5葡聚糖内切酶或GH7葡聚糖内切酶。如果全发酵液中有更多的葡聚糖内切酶，则这些葡聚糖内切酶可以是GH5葡聚糖内切酶、GH7葡聚糖内切酶或GH5葡聚糖内切酶和GH7葡聚糖内切酶的组合。在一个优选的实施例中，葡聚糖内切酶包括GH5葡聚糖内切酶。
在一个实施例中，如本文所述的全发酵液包括葡聚糖内切酶，葡聚糖内切酶来自木霉属(Trichoderma)，诸如，里氏木霉属(Trichoderma reesei)；来自腐质霉属(Humicola)，诸如，特异腐质霉(Humicola insolens)的菌株；来自曲霉属(Aspergillus)，诸如，棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)或白曲霉(Aspergillus kawachii)；来自欧文氏菌属(Erwinia)，诸如，胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)；来自镰刀菌属(Fusarium)，诸如，尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)；来自梭孢壳属(Thielavia)，诸如，太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)；来自腐质霉属(Humicola)，诸如，灰腐质霉高温变种(Humicola grisea var.thermoidea)或特异腐质霉(Humicola insolens)；来自白丝菌属(Melanocarpus)，诸如，热白丝菌(Melanocarpus albomyces)；来自脉孢菌属(Neurospora)，诸如，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；来自毁丝霉属(Myceliophthora)，诸如，嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)；来自枝鼻菌属(Cladorrhinum)，诸如，多生枝鼻菌(Cladorrhinum foecundissimum)；和/或来自金孢子菌属(Chrysosporium)，诸如，鲁克文金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)的菌株。在一个优选的实施例中，葡聚糖内切酶来自踝节菌属(Rasamsonia)，诸如，踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsoniaemersonii)的菌株(参见WO 01/70998)。在一个实施例中，甚至可以使用细菌葡聚糖内切酶，其包括但不限于，解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)葡聚糖内切酶(参见WO 91/05039；WO 93/15186；US 5,275,944；WO 96/02551；US 5,536,655；WO 00/70031；WO05/093050)；嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)葡聚糖内切酶III(参见WO 05/093050)；以及嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)葡聚糖内切酶V(参见WO 05/093050)。
如本文所用，纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能够催化纤维素或纤维四糖中的1,4-β-D-糖苷键的水解，从链的末端释放纤维二糖的任何多肽。这种酶也可称为纤维素酶1,4-β-纤维二糖苷酶、1,4-β-纤维二糖水解酶、1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶、微晶纤维素酶、1,4-β-D-葡聚糖外切酶、纤维二糖外切水解酶，或葡聚糖外切酶。
在一个实施例中，如本文所述的全发酵液包括纤维二糖水解酶I，纤维二糖水解酶I来自曲霉属(Aspergillus)，例如，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，诸如，WO 2011/057140中的SEQ ID NO:6或WO 2014/130812中的SEQ ID NO:6中公开的Cel7A CBH I；来自木霉属(Trichoderma)，诸如，里氏木霉属(Trichoderma reesei)；来自毛壳菌属(Chaetomium)，诸如，嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)；来自篮状菌属(Talaromyces)，诸如，Talaromyces leycettanus或来自青霉菌属(Penicillium)，诸如，埃默森青霉(Penicillium emersonii)。在一个优选的实施例中，全发酵液包括来自踝节菌属(Rasamsonia)，诸如，踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)的纤维二糖水解酶I(参见WO 2010/122141)。
在一个实施例中，如本文所述的全发酵液包括纤维二糖水解酶II，纤维二糖水解酶II来自曲霉属(Aspergillus)，诸如，烟曲霉(Aspergillus fumigatus)，诸如，WO 2014/130812中的SEQ ID NO:7中的烟曲霉，或来自木霉属(Trichoderma)，例如，里氏木霉(Trichoderma reesei)，或来自篮状菌属(Talaromyces)，诸如，Talaromycesleycettanus，或来自梭孢壳属(Thielavia)，诸如，太瑞斯梭孢壳(Thielaviaterrestris)，诸如，来自太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)的纤维二糖水解酶IICEL6A。在一个优选的实施例中，全发酵液包括来自踝节菌属(Rasamsonia)，诸如，踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)的纤维二糖水解酶II(参见WO 2011/098580)。
如本文所用，裂解性多糖单加氧酶是最近被CAZy分类为AA9家族(辅助活性家族9)或AA10家族(辅助活性家族10)的酶。因此，存在AA9裂解性多糖单加氧酶和AA10裂解性多糖单加氧酶。裂解性多糖单加氧酶能够打开结晶的葡聚糖结构，并增强纤维素酶对木质纤维素底物的作用。它们是具有纤维素分解增强活性的酶。裂解性多糖单加氧酶也可能影响纤维寡糖。根据最新文献(参见Isaksen等人，《Journal of Biological Chemistry(生物化学杂志)》，第289卷，第5期，第2632-2642页)，名为GH61的蛋白质(糖苷水解酶家族61或有时称为EGIV)是裂解性多糖单加氧酶。GH61最初基于对一个家族成员中非常弱的1,4-β-d-葡聚糖内切酶活性的测量而被分类为葡聚糖内切酶，但最近被CAZy重新分类为AA9家族。CBM33(碳水化合物结合模块家族33)也是一种裂解性多糖单加氧酶(参见Isaksen等人，《Journalof Biological Chemistry(生物化学杂志)》，第289卷，第5期，第2632-2642页)。CAZy最近将CBM33重新分类为AA10家族。
在一个实施例中，裂解性多糖单加氧酶包括AA9裂解性多糖单加氧酶。这意味着全发酵液中的裂解性多糖单加氧酶中的至少一种是AA9裂解性多糖单加氧酶。在一个实施例中，全发酵液中的所有裂解性多糖单加氧酶均为AA9裂解性多糖单加氧酶。
在一个实施例中，如本文所述的全发酵液包括来自热子囊菌属(Thermoascus)(诸如，橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus))的裂解性多糖单加氧酶，诸如，在WO2005/074656中描述为SEQ ID NO:2和在WO 2014/130812及WO 2010/065830中描述为SEQID NO:1的裂解性多糖单加氧酶；或来自梭孢壳属(Thielavia)(诸如，太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris))的裂解性多糖单加氧酶，诸如，在WO 2005/074647中描述为SEQID NO:8或在WO 2014/130812及WO 2008/148131以及WO 2011/035027中描述为SEQ ID NO:4的裂解性多糖单加氧酶；或来自曲霉属(Aspergillus)(诸如，烟曲霉菌(Aspergillusfumigatus))的裂解性多糖单加氧酶，诸如，在WO 2010/138754中描述为SEQ ID NO:2或在WO 2014/130812中描述为SEQ ID NO:3的裂解性多糖单加氧酶；或来自青霉菌属(Penicillium)(诸如，埃默森青霉(Penicillium emersonii))的裂解性多糖单加氧酶，诸如，在WO 2011/041397中公开为SEQ ID NO:2或在WO 2014/130812中公开为SEQ ID NO:2的裂解性多糖单加氧酶。其他合适的裂解性多糖单加氧酶包括但不限于里氏木霉(trichoderma reesei)(参见WO 2007/089290)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)(参见WO 2009/085935、WO 2009/085859、WO 2009/085864、WO 2009/085868)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)(参见WO2011/005867)、热子囊菌(Thermoascus sp.)(参见WO 2011/039319)以及甲壳嗜热子囊菌(ThermoascusCrustaceous)(参见WO 2011/041504)。可包含在酶组合物中的其他纤维素分解酶描述于WO98/13465、WO 98/015619、WO 98/015633、WO 99/06574、WO 99/10481、WO 99/025847、WO99/031255、WO 2002/101078、WO 2003/027306、WO 2003/052054、WO 2003/052055、WO2003/052056、WO 2003/052057、WO 2003/052118、WO 2004/016760、WO 2004/043980、WO2004/048592、WO 2005/001065、WO 2005/028636、WO 2005/093050、WO 2005/093073、WO2006/074005、WO 2006/117432、WO 2007/071818、WO 2007/071820、WO 2008/008070、WO2008/008793、US 5,457,046、US 5,648,263，以及US 5,686,593中，仅列举几例。在一个优选的实施例中，裂解性多糖单加氧酶来自踝节菌属(Rasamsonia)，例如，踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)(参见WO 2012/000892)。
如本文所用，木聚糖内切酶(EC 3.2.1.8)是能够催化木聚糖中1,4-β-D-木糖苷键的内切水解的任何多肽。这种酶也可称为1,4-β-木聚糖内切酶或1,4-β-D-木聚糖木聚糖水解酶。替代物是EC 3.2.1.136，葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖内切木聚糖酶，一种能够水解葡糖醛酸阿拉伯糖基木聚糖中的1,4木糖苷键的酶。
在一个实施例中，木聚糖内切酶包括GH10木聚糖酶。这意味着如本文所述的全发酵液中的至少一种木聚糖内切酶是GH10木聚糖酶。在一个实施例中，如本文所述的全发酵液中的所有木聚糖内切酶都是GH10木聚糖酶。
在一个实施例中，如本文所述的全发酵液包括来自棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)(参见WO 94/21785)、烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus)(参见WO 2006/078256)、嗜松青霉(Penicillium pinophilum)(参见WO 2011/041405)、青霉菌(Penicillium sp.)(参见WO 2010/126772)、太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)NRRL8126(参见WO 2009/079210)、Talaromyces leycettanus、嗜热裂孢菌(Thermobifidafusca)，或囊状长毛盘菌(Trichophaea saccata)GH10(参见WO 2011/057083)的木聚糖内切酶。在一个优选的实施例中，如本文所述的全发酵液包括来自踝节菌属(Rasamsonia)，诸如，踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)的木聚糖内切酶(参见WO 02/24926)。
如本文所用，β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)是能够催化1,4-β-D-木聚糖水解，以从非还原末端去除连续的D-木糖残基的多肽。β-木糖苷酶也可以水解木二糖。β-木糖苷酶也可称为木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-D-木聚糖木糖水解酶、1,4-β-木糖苷外切酶或木二糖酶。
在一个实施例中，β-木糖苷酶包括GH3β-木糖苷酶。这意味着如本文所述的全发酵液中的至少一种β-木糖苷酶是GH3β-木糖苷酶。在一个实施例中，如本文所述的全发酵液中的所有β-木糖苷酶都是GH3β-木糖苷酶。
在一个实施例中，如本文所述的全发酵液包括来自粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)或里氏木霉(Trichoderma reesei)的β-木糖苷酶。在一个优选的实施例中，如本文所述的全发酵液包括来自踝节菌属(Rasamsonia)，诸如，踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)的β-木糖苷酶(参见WO 2014/118360)。
在一个实施例中，如本文所述的全发酵液还可以包括一种或多种下述酶。
如本文所用，β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)是能够催化含有1,3-键和1,4-键的β-D-葡聚糖中的1,4-β-D-糖苷键水解的任何多肽-葡聚糖。这种多肽可以作用于地衣素和谷类β-D-葡聚糖，但不能作用于仅含有1,3-键或1,4-键的β-D-葡聚糖。这种酶也可称为地衣多糖酶、1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶、β-葡聚糖酶、β-1,3-1,4葡聚糖内切酶、地衣多糖酶或混合键β-葡聚糖酶。这种酶的替代物是EC 3.2.1.6，它被描述为1,3(4)-β-葡聚糖内切酶。当还原基团参与要水解的键的葡萄糖残基本身在C-3处被取代时，这种类型的酶会水解β-D-葡聚糖中的1,3-键或1,4-键。替代名称包括1,3-β-葡聚糖内切酶、海带多糖酶、1,3-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶。底物包括海带多糖、地衣素，以及谷物β-D-葡聚糖。
如本文所用，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)-键和/或(1,3)-键和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖以及阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可称为α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。可包含在如本文所述的全发酵液中的阿拉伯呋喃糖苷酶的示例包括但不限于来自黑曲霉(Aspergillus niger)、特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 1800(参见WO 2006/114094和WO 2009/073383)和M.giganteus(参见WO 2006/114094)的阿拉伯呋喃糖苷酶。
如本文所用，α-D-葡糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)是能够催化以下形式反应的任何多肽：α-D-葡糖醛酸苷+H(2)O＝醇+D-葡糖醛酸。这种酶也可以称为α-葡糖醛酸酶或α-葡糖苷酸酶。这些酶还可以水解4-O-甲基化的葡糖醛酸，它也可以作为木聚糖中的取代基存在。替代物是EC 3.2.1.131：木聚糖α-1,2-葡糖醛酸苷酶，它催化α-1,2-(4-O-甲基)葡糖醛酸键的水解。可包含在如本文所述的全发酵液中的α-葡糖醛酸酶的示例包括但不限于来自棒状曲霉(Aspergillus clavatus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、土曲霉(Aspergillus terreus)、特异腐质霉(Humicola insolens)(参见WO 2010/014706)、Penicillium aurantogriseum(参见WO 2009/068565)，以及里氏木霉(Trichoderma reesei)的α-葡糖醛酸酶。
如本文所用，乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)是能够催化木聚糖和低聚木糖脱乙酰化的任何多肽。这种多肽可以催化来自聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α-萘基乙酸酯或对硝基苯乙酸酯，但通常不来自三乙酰甘油的乙酰基的水解。这种多肽通常不作用于乙酰化甘露聚糖或果胶。可包含在如本文所述的全发酵液中的乙酰木聚糖酯酶的示例包括但不限于来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(参见WO 2010/108918)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、纤细毛壳菌(Chaetomium gracile)、特异腐质霉(Humicolainsolens)DSM 1800(参见2009/073709)、红褐肉座菌(参见WO 2005/001036)、嗜热丝孢菌(Myceliophtera thermophila)(参见WO 2010/014880)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、结节孢霉(Phaeosphaeria nodorum)和太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)NRRL 8126(参见WO 2009/042846)的乙酰木聚糖酯酶。在一个优选的实施例中，如本文所述的全发酵液包含来自踝节菌属(Rasamsonia)，诸如，踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsoniaemersonii)(参见WO 2010/000888)的乙酰木聚糖酯酶。
如本文所用，阿魏酸酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：阿魏酰糖+H2O＝阿魏酸+糖。糖可以是，例如，寡糖或多糖。它通常可以催化酯化糖中4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基(阿魏酰基)的水解，酯化糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖。对硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲酯通常是较差的底物。这种酶也可称为肉桂酸酯水解酶、阿魏酸酯酶或羟基肉桂酸酯酶。它也可以称为半纤维素酶辅助酶，因为它可以帮助木聚糖酶和果胶酶分解植物细胞壁半纤维素和果胶。可包含在如本文所述的全发酵液中的阿魏酸酯酶(阿魏酸酯酶)的示例包括但不限于来自特异腐质霉(Humicola insolens)DSM 1800(参见WO2009/076122)、费希新萨托菌(Neosartorya fischeri)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、橘灰青霉(Penicillium aurantogriseum)(参见WO 2009/127729)以及太瑞斯梭孢壳(Thielavia terrestris)(参见WO 2010/053838和WO 2010/065448)的阿魏酸酯酶。
如本文所用，香豆酰酯酶(EC 3.1.1.73)是能够催化以下形式的反应的任何多肽：香豆酰-糖+H(2)O＝香豆酸+糖。糖可以是，例如，寡糖或多糖。这种酶也可以称为反式-4-香豆酰酯酶、反式-对香豆酰酯酶、对香豆酰酯酶或对香豆酸酯酶。这种酶也属于EC3.1.1.73，因此也可称为阿魏酸酯酶。
如本文所用，α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)是能够催化α-D-半乳糖苷(包括低聚半乳糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖，以及阿拉伯半乳聚糖)中末端非还原性α-D-半乳糖残基的水解的任何多肽。这种多肽还能够水解α-D-岩藻糖苷。这种酶也可以称为蜜二糖酶。
如本文所用，β-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是能够催化β-D-半乳糖苷中末端非还原性β-D-半乳糖残基的水解的任何多肽。这种多肽还能够水解α-L-阿拉伯糖苷。这种酶也可以称为(1->4)-β-D-半乳聚糖外切酶或乳糖酶。
如本文所用，β-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)是能够催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中1,4-β-D-甘露糖苷键的随机水解的任何多肽。这种酶也可以称为甘露聚糖内切1,4-β-甘露糖苷酶或1,4-甘露聚糖内切酶。
如本文所用，β-甘露糖苷酶(EC 3.2.1.25)是能够催化β-D-甘露糖苷中末端非还原性β-D-甘露糖残基的水解的任何多肽。这种酶也可称为甘露聚糖酶或甘露糖酶。
如本文所用，多聚半乳糖醛酸内切酶(EC 3.2.1.15)是能够催化果胶酸和其他半乳糖醛酸中的1,4-α-D-半乳糖苷酸键的随机水解的任何多肽。这种酶也可称为多聚半乳糖醛酸酶果胶解聚酶、果胶酶、多聚半乳糖醛酸内切酶、果胶酶、果胶水解酶、果胶多聚半乳糖醛酸酶、聚-α-1,4-半乳糖醛酸聚糖水解酶、半乳糖醛酸内切酶；D-半乳糖醛酸内切酶或聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸)聚糖水解酶。
如本文所用，果胶甲酯酶(EC 3.1.1.11)是能够催化以下反应的任何酶：果胶+nH2O＝n甲醇+果胶酸盐。这种酶也可称为果胶酯酶、果胶脱甲氧基酶、果胶甲氧基酶、果胶甲酯酶、果胶酶、果胶酯酶或果胶果胶水解酶。
如本文所用，半乳聚糖内切酶(EC 3.2.1.89)是能够催化阿拉伯半乳聚糖中1,4-β-D-半乳糖苷键的内切水解的任何酶。这种酶也可称为阿拉伯半乳聚糖1,4-β-半乳糖苷内切酶、1,4-β-半乳糖苷内切酶、半乳聚糖酶、阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-D-半乳聚糖水解酶。
如本文所用，果胶乙酰酯酶在本文中定义为具有乙酰酯酶活性的任何酶，其催化果胶GalUA残基的羟基处的乙酰基团的脱乙酰化。
如本文所用，果胶内切酶(EC 4.2.2.10)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸甲酯的消除切割，以产生4-脱氧-6-O-甲基-α-D-半乳糖-4-烯醛糖基团(enuronosyl)在其非还原端的寡糖的任何酶。这种酶也可称为果胶裂解酶、果胶反式消除酶；果胶内切酶、聚甲基半乳糖醛酸转移酶、果胶甲基转移酶、果胶裂解酶、PL、PNL或PMGL或(1→4)-6-O-甲基-α-D-半乳糖醛酸裂解酶。
如本文所用，果胶酸裂解酶(EC 4.2.2.2)是能够催化(1→4)-α-D-半乳糖醛酸聚糖的消除切割，以产生4-脱氧-α-D-半乳糖-4-烯醛糖基团在它们的非还原端的寡糖的任何酶。所述酶还可以是已知的多聚半乳糖醛酸转消除酶、果胶酸转消除酶、多聚半乳糖醛酸裂解酶、内切果胶甲基转消除酶、果胶酸转消除酶、内切半乳糖醛酸转消除酶、果胶酸裂解酶、果胶裂解酶、α-1,4-D-内切多聚半乳糖酸裂解酶、PGA裂解酶、PPase-N、内切-α-1,4-聚半乳糖醛酸裂解酶、多聚半乳糖醛酸裂解酶、果胶反式消除酶、多聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸裂解酶。
如本文所用，α鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是能够催化α-L-鼠李糖苷或鼠李糖半乳糖醛酸聚糖中的末端非还原性α-L-鼠李糖残基的水解的任何多肽。这种酶也可以称为α-L-鼠李糖苷酶T、α-L-鼠李糖苷酶N或α-L-鼠李糖苷酶。
如本文所用，半乳糖醛酸外切酶(EC 3.2.1.82)是能够从非还原端水解果胶酸，释放二半乳糖醛酸的任何多肽。这种酶也可以称为聚-α-半乳糖醛酸糖苷外切酶、聚半乳糖醛酸糖苷外切酶或聚半乳糖醛酸糖苷外切酶。
如本文所用，半乳糖醛酸外切酶(EC 3.2.1.67)是能够催化以下反应的任何多肽：(1,4-α-D-半乳糖醛酸)n+H2O＝(1,4-α-D-半乳糖醛酸)n-1+D-半乳糖醛酸。这种酶也可以称为半乳糖醛酸1,4-α-半乳糖醛酸酶、多聚半乳糖醛酸外切酶、多聚(半乳糖醛酸)水解酶、D-半乳糖醛酸外切酶、D-半乳糖醛酸外切酶、多聚-D-半乳糖醛酸外切酶或多聚(1,4-α-D-半乳糖醛酸)半乳糖醛酸水解酶。
如本文所用，胞外多聚半乳糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.9)是能够催化4-(4-脱氧-α-D-半乳糖-4-烯醛糖基)-D-半乳糖醛酸从果胶酸，即去酯化果胶的还原端的消除切割的任何多肽。这种酶可以称为果胶酸二糖裂解酶、果胶酸外切酶、外切果胶酸转消除酶、果胶酸裂解外切酶、胞外多聚半乳糖醛酸反式消除酶、PATE、外切型PATE、外切型PGL或(1→4)-α-D-半乳糖醛酸还原-末端-二糖裂解酶。
如本文所用，鼠李糖半乳糖醛酸聚糖水解酶是能够在由二糖[(1,2-α-L-鼠李糖酰-(1,4)-α-半乳糖醛酸]构成的严格交替的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖结构中以内切方式水解半乳糖醛酸与吡喃鼠李糖基之间的键结的任何多肽。
如本文所用，鼠李糖半乳糖醛酸聚糖裂解酶是能够通过β-消除在鼠李糖半乳糖醛酸聚糖中以内切方式切割α-L-Rhap-(1→4)-α-D-GalpA键的任何多肽。
如本文所用，鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶是催化鼠李糖半乳糖醛酸聚糖中交替的鼠李糖和半乳糖醛酸残基的主链脱乙酰化的任何多肽。
如本文所用，鼠李糖半乳糖醛酸半乳糖醛酸水解酶是能够从严格交替的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖结构的非还原端以外切方式水解半乳糖醛酸的任何多肽。
如本文所用，木糖半乳糖醛酸酶是通过以内切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主链而作用于木糖半乳糖醛酸的任何多肽。这种酶也可以称为木糖半乳糖醛酸水解酶。
如本文所用，α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3.2.1.55)是能够作用于α-L-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-键的α-L-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。这种酶也可称为α-N-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。
如本文所用，阿拉伯聚糖内切酶(EC 3.2.1.99)是能够催化1,5-阿拉伯聚糖中1,5-α-阿拉伯呋喃糖苷键的内切水解的任何多肽。这种酶也可称为阿拉伯糖内切酶、阿拉伯糖内切-1,5-α-L-阿拉伯糖苷酶、1,5-α-L-阿拉伯糖苷内切酶、α-1,5-阿拉伯糖苷内切酶；阿拉伯糖内切酶或1,5-α-L-阿拉伯聚糖1,5-α-L-阿拉伯糖水解酶。
“蛋白酶”包括水解肽键的酶(肽酶)，以及水解肽与其他部分(moieties)(诸如，糖)之间的键的酶。许多蛋白酶在EC 3.4下表征，并且适用于如本文所述的方法。一些特定类型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶、木瓜蛋白酶)和丝氨酸蛋白酶(包括胰凝乳蛋白酶、羧肽酶和金属内肽酶)。
“脂肪酶”包括水解脂质、脂肪酸和酰基甘油酯，包括磷酸甘油酯、脂蛋白、二酰基甘油等的酶。在植物中，脂质被用作结构组分，以限制水分流失和病原体感染。这些脂质包括衍生自脂肪酸的蜡，以及角质和木栓脂。
“木质素酶”包括可以水解或分解木质素聚合物结构的酶。可以分解木质素的酶包括木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶，以及本领域中描述的已知用于解聚或以其他方式破坏木质素聚合物的其他酶。还包括能够水解半纤维素糖(特别是阿拉伯糖)与木质素之间形成的键的酶。木质素酶包括但不限于以下酶组：木质素过氧化物酶(EC1.11.1.14)、锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)、漆酶(EC 1.10.3.2)和阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)。
“己糖基转移酶”(2.4.1-)包括能够催化转移酶反应但也可以催化水解反应(例如，纤维素和/或纤维素降解产物的水解反应)的酶。可以使用的己糖基转移酶的示例是β-葡聚糖基转移酶。这种酶可能能够催化(1,3)(1,4)葡聚糖和/或纤维素和/或纤维素降解产物的降解。
“葡萄糖醛酸酶”包括催化葡糖苷酸，例如，β-葡糖苷酸的水解以产生醇的酶。许多葡萄糖醛酸酶已被表征，并且可能适合使用，例如，β-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.31)、透明质酸-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.36)、葡萄糖醛酸基-二磺基葡萄糖胺葡萄糖醛酸酶(3.2.1.56)、甘草酸β-葡萄糖醛酸酶(3.2.1.128)或α-D-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.139)。
扩展蛋白与植物细胞生长过程中细胞壁结构的松动有关。已经提出扩展蛋白破坏纤维素与其他细胞壁多糖之间的氢键而不具有水解活性。通过这种方式，它们被认为允许纤维素纤维的滑动和细胞壁的扩大。膨胀素是一种扩展蛋白样蛋白质，含有N端碳水化合物结合模块家族1域(CBD)和C端扩展蛋白样域。如本文所述，扩展蛋白样蛋白质或膨胀素样蛋白质可以包括此类域中的一者或两者和/或可以破坏细胞壁的结构(诸如，破坏纤维素结构)，可选地不产生可检测量的还原糖。
纤维素诱导蛋白，例如，cip1或cip2基因或类似基因的多肽产物(参见Foreman等人，J.Biol.Chem.278(34)，31988-31997，2003年)，纤维素/纤维素体整合蛋白，例如，cipA或cipC基因的多肽产物，或支架素或支架素样蛋白。支架素和纤维素整合蛋白是多功能整合亚基，可将纤维素分解亚基组织成多酶复合物。这是通过两个互补的域(即支架素上的内聚域和每个酶单元上的锚定域)的相互作用来实现的。支架素亚基还带有纤维素结合模块(CBM)，CBM介导纤维素体与其底物的附着。支架素或纤维素整合蛋白可以包括此类域中的一者或两者。
过氧化氢酶；术语“过氧化氢酶”是指过氧化氢：过氧化氢氧化还原酶(EC1.11.1.6或EC 1.11.1.21)，其催化两个过氧化氢转化为氧气和两种水。过氧化氢酶活性可以通过基于以下反应在240nm处监测过氧化氢的降解来确定：2H2O2→2H2O+O2。反应在50mM磷酸盐pH 7.0中于25℃下进行，每毫升含有10.3mM底物(H2O2)和大约100单位的酶。在16-24秒内通过分光光度法监测吸光度，这应该对应于吸光度从0.45降低到0.4。一个过氧化氢酶活性单位可以表示为在pH 7.0和25℃下每分钟降解1微摩尔H2O2。
如本文所用，术语“淀粉酶”是指水解直链淀粉和支链淀粉中淀粉中α-1,4-糖苷键的酶，诸如，α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)、葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC3.2.1.3)、葡聚糖1,4-α-麦芽四糖水解酶(EC 3.2.1.60)、葡聚糖1,4-α-麦芽六糖苷酶(EC3.2.1.98)、葡聚糖1,4-α-麦芽三糖水解酶(EC 3.2.1.116)和葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶(EC 3.2.1.133)，以及水解作为支链淀粉中的分支点的α-1,6-糖苷键的酶，诸如，支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)和极限糊精酶(EC 3.2.1.142)。
由真菌产生的全发酵液可以包括上述每一类酶中的一个成员，一类酶中的几个成员，或这些酶类或辅助蛋白(即本文提到的那些本身不具有酶促作用但确实有助于生物量降解的蛋白质)的任何组合。
本文还描述了包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液，其可通过用于产生本文所述的混合全发酵液的方法获得。本文还描述了可通过用于产生如本文所述且包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液的方法获得的混合全发酵液。包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液可以包括任何上述特征和实施例。包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液可以包含任何上述酶。在一个优选的实施例中，可通过用于产生如本文所述的混合全发酵液的方法获得的混合全发酵液包括纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、葡聚糖内切酶、β-葡糖苷酶、木聚糖内切酶、裂解性多糖单加氧酶和乙酰基木聚糖酯酶。可通过用于产生如本文所述的混合全发酵液的方法获得的混合全发酵液还可以包括β-木糖苷酶。
本文还描述了一种由纤维素材料制备糖制产品的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用通过在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌产生包含的纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液和通过在不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌而产生的包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第二全发酵液的组合对纤维素材料进行酶促水解以获得糖制产品，和(b)可选地回收糖制产品。在一个优选的实施例中，步骤(a)用混合全发酵液完成，所述混合全发酵液可通过如本文所述用于产生混合全发酵液的方法获得并且包括纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、葡聚糖内切酶、β-葡糖苷酶、木聚糖内切酶、裂解性多糖单加氧酶和乙酰木聚糖酯酶。可通过如本文所述用于产生混合全发酵液的方法获得的混合全发酵液还可以包括β-木糖苷酶。
本文还描述了一种用于由纤维素材料制备糖制产品的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用混合全发酵液对纤维素材料进行酶促水解以获得糖制产品，所述混合全发酵液可通过如本文所述用于产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液的方法获得并且包括纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、葡聚糖内切酶、β-葡糖苷酶、木聚糖内切酶、裂解性多糖单加氧酶和乙酰木聚糖酯酶，和(b)可选地回收糖制产品。可通过如本文所述用于产生混合全发酵液的方法获得的混合全发酵液还可以包括β-木糖苷酶。
本文还描述了一种用于由纤维素材料制备糖制产品的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液对纤维素材料进行酶促水解，所述混合全发酵液可通过如本文所述获得混合全发酵液的方法获得，和(b)可选地回收糖制产品。
本文还描述了一种由纤维素材料制备糖制产品的方法，所述方法包括以下步骤：(a)用混合全发酵液对纤维素材料进行酶促水解，所述混合全发酵液可通过以下步骤获得：(i)在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液，(ii)在不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第二全发酵液，以及(iii)混合第一全发酵液和第二全发酵液以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液，以获得糖制产品，和(b)可选地回收糖制产品。
本文还描述了一种用于由纤维素材料制备糖制产品的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液，(ii)在不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第二全发酵液，(iii)混合第一全发酵液和第二全发酵液以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液，(iv)用混合全发酵液对纤维素材料进行酶促水解以获得糖制产品，以及(v)可选地回收糖制产品。
本文还描述了一种由纤维素材料制备糖制产品的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液，所述培养在第一发酵液生产容器中进行，(ii)在不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第二全发酵液，所述培养在第二发酵液生产容器中进行，其中第二发酵液生产容器可选地与第一发酵液生产容器位于同一位置，(iii)可选地将包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液和/或第二全发酵液输送到混合发酵液生产容器，(iv)混合第一全发酵液和第二全发酵液以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液，所述混合在混合发酵液生产容器中进行，其中混合发酵液生产容器可选地与第一发酵液生产容器和/或第二发酵液生产容器位于同一位置，(v)可选地将包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液输送到糖生产容器，(vi)用包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液对纤维素材料进行酶促水解以获得糖制产品，所述酶促水解在糖生产容器中进行，其中糖生产容器可选地与第一发酵液生产容器和/或第二发酵液生产容器和/或混合发酵液生产容器位于同一位置，以及(vii)可选地回收糖制产品。
本文还描述了一种包括以下步骤的方法：(i)在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液，所述培养在第一发酵液生产容器中进行，(ii)在不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第二全发酵液，所述培养在第二发酵液生产容器中进行，其中第二发酵液生产容器可选地与第一发酵液生产容器位于同一位置，(iii)混合第一全发酵液和第二全发酵液以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液，所述混合在混合发酵液生产容器中进行，其中混合发酵液生产容器可选地与第一发酵液生产容器和/或第二发酵液生产容器位于同一位置，以及(iv)可选地将包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液提供给糖生产容器，用于用混合全发酵液对纤维素材料进行酶促水解以获得糖制产品的方法，其中糖生产容器可选地与第一发酵液生产容器和/或第二发酵液生产容器和/或混合发酵液生产容器位于同一位置。
本文还描述了一种包括以下步骤的方法：(i)在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液，所述培养在第一发酵液生产容器中进行，(ii)在诱不存在导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第二全发酵液，所述培养在第二发酵液生产容器中进行，其中第二发酵液生产容器可选地与第一发酵液生产容器位于同一位置，(iii)将第一全发酵液和第二全发酵液提供给混合发酵液生产容器，用于混合第一全发酵液和第二全发酵液以产生包括纤维素分解物和/或半纤维素分解物的混合全发酵液的方法和随后将所获得的混合全发酵液用于用混合全发酵液对纤维素材料进行酶促水解以获得糖制产品的方法。可选地，混合发酵液生产容器与第一发酵液生产容器和/或第二发酵液生产容器位于同一位置。
可选地，在如本文所述的由纤维素材料产生糖制产品的任何方法中，相同的容器用于步骤(i)和步骤(ii)。例如，当在同一容器中首先产生第一全发酵液，然后产生第二全发酵液时就是这种情况。
本文还描述了一种由纤维素材料制备糖制产品的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液，所述培养在第一发酵液生产容器中进行，(ii)在不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第二全发酵液，所述培养在第二发酵液生产容器中进行，(iii)用包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液对纤维素材料进行酶促水解以获得糖制产品，所述酶促水解在糖生产容器中进行，并且所述混合全发酵液通过混合包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一发酵液和第二全发酵液产生，所述混合在混合发酵液生产容器中进行，以及(iv)可选地回收糖制产品。可选地，第一发酵液生产容器与第二发酵液生产容器和/或混合发酵液生产容器位于同一位置。可选地，第二发酵液生产容器与混合发酵液生产容器位于同一位置。
在如本文所述的由纤维素材料产生糖制产品的方法的一个实施例中，混合全发酵液可以通过混合包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一发酵液和第二全发酵液来产生，所述混合在糖生产容器中进行。例如，第一发酵液和第二全发酵液可以同时(即以混合全发酵液的形式)提供给纤维素材料或分别或顺序提供(即第一发酵液和第二全发酵液分别或顺序添加到纤维素材料中，并且混合发生在纤维素材料内，而不是在添加到纤维素材料之前)。
本文还描述了一种由纤维素材料制备糖制产品的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液，所述培养在第一发酵液生产容器中进行，(ii)在不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第二全发酵液，所述培养在第二发酵液生产容器中进行，(iii)混合第一全发酵液和第二全发酵液以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液，所述混合在混合发酵液生产容器中进行，其中第一发酵液生产容器和/或第二发酵液生产容器和/或混合发酵液生产容器位于同一位置，(iv)将包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液输送到糖生产容器中，其中糖生产容器不与第一发酵液生产容器和/或第二发酵液生产容器和/或混合发酵液生产容器位于同一位置，(v)用混合全发酵液对纤维素材料进行酶促水解以获得糖制产品，所述酶促水解在糖生产容器中进行，以及(vi)可选地回收糖制产品。
本文还描述了一种由纤维素材料制备糖制产品的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液，所述培养在第一发酵液生产容器中进行，(ii)在不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第二全发酵液，所述培养在第二发酵液生产容器中进行，其中第一发酵液生产容器和第二发酵液生产容器位于同一位置，(iii)将包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液和第二全发酵液输送到混合发酵液生产容器，其中混合发酵液生产容器不与第一发酵液生产容器和第二发酵液生产容器位于同一位置，(iv)混合第一全发酵液和第二全发酵液以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液，所述混合在混合发酵液生产容器中进行，(v)用混合全发酵液对纤维素材料进行酶促水解以获得糖制产品，所述酶促水解在糖生产容器中进行，以及(vi)可选地回收糖制产品。在一个实施例中，糖生产容器与混合发酵液生产容器位于同一位置。在另一个实施例中，糖生产容器不与混合发酵液生产容器位于同一位置。
本文还描述了一种由纤维素材料制备糖制产品的方法，所述方法包括以下步骤：(i)在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液，所述培养在第一发酵液生产容器中进行，(ii)在不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第二全发酵液，所述培养在第二发酵液生产容器中进行，其中第一发酵液生产容器和第二发酵液生产容器不在同一位置，(iii)将包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液和/或第二全发酵液输送到混合发酵液生产容器，其中混合发酵液生产容器可选地与第一发酵液生产容器或第二发酵液生产容器位于同一位置，(iv)混合第一全发酵液和第二全发酵液以产生包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液，所述混合在混合发酵液生产容器中进行，(v)将包括纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液输送到糖生产容器中，(vi)用混合全发酵液对纤维素材料进行酶促水解以获得糖制产品，所述酶促水解在糖生产容器中进行，其中糖生产容器不与混合发酵液生产容器位于同一位置，以及(vii)可选地回收糖制产品。
本文还描述了一种由纤维素材料制备发酵产品的方法，包括以下步骤：(a)执行如本文所述的由纤维素材料制备糖制产品的方法，(b)使糖制产品发酵以产生发酵产品，以及(c)可选地回收发酵产品。
通常，在酶促水解中使用几种酶，即使用具有不同纤维素分解活性的几种酶。这些酶可以是上述任何酶或其任何组合。它们可以通过如本文所述的混合全发酵液生产方法产生。真菌只能产生这些酶中的一种，但也可以产生多于一种，即两种、三种、四种或甚至更多的酶。如果酶促水解所需的酶不是全部由真菌产生，则可以在培养后将剩余的酶添加到任何全发酵液中。它们也可以在酶促水解过程中被添加到纤维素材料中。
在一个实施例中，纤维素材料是木质纤维素材料。在一个实施例中，在酶促水解之前或期间对纤维素材料进行至少一次固/液分离。在一个实施例中，在酶促水解之前或期间对纤维素材料进行预处理和至少一次固/液分离。固/液分离的方法和条件将取决于所使用的纤维素材料的类型，并且在本领域技术人员的范围内。示例包括但不限于离心、旋风分离、过滤、倾析、筛分以及沉降。在固/液分离过程中，可以使用改进分离的手段和/或辅助手段。
在替代实施例中，当酶促水解包括单独的液化步骤和糖化步骤(如下文更详细描述的)时，液化步骤的产物可用于真菌的培养。这可以在添加或不添加酶促水解的纤维素材料的情况下完成。当然，部分酶促水解的纤维素材料、部分预处理的纤维素材料、液化步骤的产物以及外部碳和营养源的每一种组合也可用于真菌的培养。
在一个实施例中，酶促水解至少包括液化步骤以及糖化步骤，在液化步骤中纤维素材料和/或预处理的纤维素材料在至少第一容器中水解，在糖化步骤中液化材料在至少第一容器中水解和/或在至少第二容器中水解。糖化可以在与液化相同的容器中进行(即至少第一容器)，也可以在单独的容器中进行(即至少第二容器)。所以，在酶促水解中，液化和糖化可以组合起来。或者，液化和糖化可以是分开的步骤。在一个实施例中，液化与糖化之间存在固/液分离。
酶促水解可以在一个或多个容器中执行，但也可以在一个或多个管或任何其他连续系统中执行。当酶促水解包括液化步骤和糖化步骤时，这也适用。液化步骤可以在一个或多个容器中执行，但也可以在一个或多个管或任何其他连续系统中执行和/或糖化步骤可以在一个或多个容器中执行，但也可以在一个或多个管或任何其他连续系统中执行。用于本发明的容器的示例包括但不限于补料分批搅拌容器、分批搅拌容器、具有超滤的连续流搅拌容器，以及连续活塞流塔反应器。可以通过一个或多个叶轮、泵和/或静态混合器进行搅拌。
在一个实施例中，纤维素材料和/或预处理的纤维素材料可以添加到用于酶促水解的一个或多个容器中。在一个实施例中，在添加纤维素材料和/或预处理的纤维素材料之前，用于酶促水解的酶已经存在于一个或多个容器中。在另一个实施例中，可将用于酶促水解的酶添加到一个或多个容器中。在一个实施例中，在添加用于酶促水解的酶之前，纤维素材料和/或预处理的纤维素材料已经存在于一个或多个容器中。在一个实施例中，将纤维素材料和/或预处理的纤维素材料以及用于酶促水解的酶同时添加到一个或多个容器中。用于酶促水解的酶可以是水性组合物。当酶促水解包括液化步骤和糖化步骤时，此段落同样适用。
在一个实施例中，总酶促水解时间为10至300小时、20至250小时，优选为30至200小时，更优选为40至150小时。
在一个实施例中，酶促水解在40℃至90℃、45℃至80℃、50℃至70℃、55℃至65℃的温度下进行。
在一个实施例中，酶促水解进行到木质纤维素材料中70％或更多、80％或更多、85％或更多、90％或更多、92％或更多、95％或更多的可用糖被释放为止。
在一个实施例中，在酶促水解过程中加入氧。在一个实施例中，在酶促水解的至少一部分期间加入氧。在酶促水解过程中可以连续或不连续地加入氧。在一个实施例中，在酶促水解过程中加入一次或多次氧。在一个实施例中，可以在酶促水解之前、在向用于酶促水解的容器中加入纤维素材料期间、在向用于酶促水解的容器中加入酶期间、在酶促水解的一部分期间、在全部酶促水解或其任何组合过程中加入氧。将氧加入到用于酶促水解的一个或多个容器中。
氧可以以多种形式加入。例如，氧可以以氧气、富氧气体，诸如，富氧空气，或空气的形式加入。如何加氧的示例包括但不限于通过以下方式来加氧：鼓泡、鼓风、电解、化学加氧、从顶部填充酶促水解所用的一个或多个容器(将水解产物投入到容器并因此将氧引入水解产物中)和将氧加入到所述一个或多个容器的顶部空间。当氧被加入到容器的顶部空间时，可以提供水解反应所需的足够的氧气。通常，可以控制和/或改变加入到容器中的氧量。通过在所述容器中的部分水解时间期间仅添加氧，可以限制供应的氧。另一种选择是加入低浓度的氧，例如，通过使用空气和循环空气(离开容器的空气)的混合物或用惰性气体“稀释”空气。可以通过在较长的水解时间段内加入氧、通过加入更高浓度的氧或通过加入更多空气来增加加入的氧量。另一种控制氧浓度的方式是添加氧消耗器和/或氧发生器。可以将氧引入，例如，吹入纤维素材料的液体水解容器内容物中。它也可以吹入容器的顶部空间。
在一个实施例中，在将纤维素材料和/或预处理的纤维素材料加入到所述一个或多个容器之前和/或期间和/或之后，将氧加入到用于酶促水解的一个或多个容器中。氧可以与进入水解容器的纤维素材料和/或预处理的纤维素材料一起引入。氧可被引入将进入容器的材料流中或与通过容器的外部回路的部分容器内容物一起引入。
在一个实施例中，用于酶促水解的容器具有至少1m3的体积。优选地，容器具有至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3，至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少200m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3、至少600m3、至少700m3、至少800m3、至少900m3、至少1000m3、至少1500m3、至少2000m3、至少2500m3的体积。通常，容器将小于3000m3或5000m3。在一个实施例中，纤维素材料的酶促水解在具有10-5000m3体积的容器中进行。
在酶促水解中使用多个容器的情况下，它们可以具有相同的体积，但也可以具有不同的体积。在酶促水解包括单独的液化步骤和糖化步骤的情况下，用于液化步骤的容器和用于糖化步骤的容器可以具有相同的体积，但也可以具有不同的体积。
在一个优选的实施例中，酶促水解和发酵是分开的步骤。或者，它们也可以组合。示例包括但不限于单独水解和发酵(SHF)、同时糖化和发酵(SSF)、同时糖化和共发酵(SSCF)、混合水解和发酵(HHF)、单独水解和共发酵(SHCF)、混合水解和共发酵(HHCF)，以及直接微生物转化(DMC)，有时也称为综合生物加工(CBP)。
在一个实施例中，纤维素材料是木质纤维素材料。适用于本文所述方法的纤维素材料包括生物质，例如，原始生物质和/或非原始生物质，诸如，农业生物质、商业有机物、建筑和拆除垃圾、城市固体废物、废纸，以及庭院废物。生物质的常见形式包括树木、灌木和草、小麦、小麦秸秆、甘蔗、甘蔗秸秆、甘蔗渣、柳枝稷、芒草、能源甘蔗、玉米、玉米秸秆、玉米壳、玉米芯、玉米纤维、玉米粒、油菜籽茎、大豆茎、甜高粱、通常称为“麸皮或纤维”的谷物，诸如，玉米、小麦和大麦(包括湿磨和干磨)的碾磨产品和副产品、酒糟干谷物以及市政固体废物、废纸，以及庭院废物。生物质还可以是但不限于草本材料、农业残余物、林业残余物、城市固体废物、废纸和纸浆和造纸厂残余物。“农业生物质”包括树枝、灌木、藤茎、玉米和玉米壳、能源作物、森林、水果、花卉、谷物、草、草本作物、树叶、树皮、针叶、原木、根、树苗、短轮伐木本作物、灌木丛、柳枝稷、树木、蔬菜、果皮、葡萄藤、甜菜浆、小麦中种、燕麦壳和硬木和软木(不包括含有有害物质的木材)。此外，农业生物质包括从农业过程(包括农业和林业活动)产生的有机废料，特别是林业木材废料。农业生物质可以是任何上述单独或其任何组合或混合物。如本文所述的方法中使用的酶可以极其有效地水解纤维素材料，例如，玉米秸秆、小麦秸秆、甘蔗秸秆、玉米纤维和/或甘蔗渣，然后可以将其进一步转化为产品，诸如，乙醇、沼气、丁醇、塑料、有机酸、溶剂、动物饲料补充剂、药物、维生素、氨基酸、酶或化学原料。此外，水解过程之后的中间产物，例如，作为沼气生产中间体的乳酸，可以用作其他材料的构建块。
在一个实施例中，纤维素材料在酶促水解之前和/或期间被预处理。预处理方法是本领域已知的，并且包括但不限于加热、机械、化学改性、生物改性及其任何组合。通常执行预处理以提高纤维素材料的酶促水解的可及性和/或在纤维素材料中水解半纤维素和/或溶解半纤维素和/或纤维素和/或木质素。在一个实施例中，预处理包括用蒸汽爆破、热水处理或用稀酸或稀碱处理来处理纤维素材料。预处理方法的示例包括但不限于蒸汽处理(例如，在100-260℃、压力7-45巴、中性pH值下处理1-10分钟)、稀酸处理(例如，在存在或不存在蒸汽的情况下，用0.1–5％H2SO4和/或SO2和/或HNO3和/或HCl，在温度120-200℃，压力2-15巴，酸性pH值下处理2-30分钟)，有机溶剂处理(例如，在存在有机溶剂和蒸汽的情况下，用1–1.5％H2SO4，在温度160-200℃，压力7-30巴，酸性pH值下处理30-60分钟)，石灰处理(例如，在存在水/蒸汽的情况下，用0.1-2％NaOH/Ca(OH)2，在60-160℃、压力1-10巴、碱性pH值下处理60-4800分钟)，ARP处理(例如，用5-15％NH3，在150-180℃，压力9-17巴，碱性pH值下处理10-90分钟)，AFEX处理(例如，用>15％NH3，在60-140℃，压力8-20巴，碱性pH值下处理5-30分钟)。对于上述所有情况，1巴是100.000帕斯卡(Pa)。
可以洗涤纤维素材料。在一个实施例中，可以在预处理之前和/或之后洗涤纤维素材料。洗涤步骤可以在纤维素材料和/或预处理的纤维素材料的固/液分离之前和/或之后执行。如果在固/液分离后执行，则可以洗涤在固/液分离后获得的固体部分。洗涤步骤可用于去除可作为发酵和/或水解步骤的抑制剂的水溶性化合物。洗涤步骤可以以技术人员已知的方式进行。除了洗涤，还有其他解毒方法。预处理的纤维素材料也可以通过这些方法中的任何(或任何组合)解毒，这些方法包括但不限于固/液分离、真空蒸发、萃取、吸附、中和、过度石灰、添加还原剂、添加解毒酶，诸如，漆酶或过氧化物酶，添加能够为水解产物解毒的微生物。
技术人员可以选择酶促水解期间的pH。在一个实施例中，水解期间的pH可以是3.0至6.4。重要的是，如本文所述的方法可以在水解反应中使用高水平的(纤维素材料的)干物质进行。在一个实施例中，酶促水解中纤维素材料的干物质含量为10％–40％(w/w)、11％–35％(w/w)、12％–30％(w/w)、13％–29％(w/w)、14％–28％(w/w)、15％–27％(w/w)、16％–26％(w/w)、17％–25％(w/w)。
如前所述，本文还描述了一种由纤维素材料制备发酵产品的方法，包括以下步骤：(a)执行如本文所述的由纤维素材料制备糖制产品的方法，(b)使糖制产品发酵以产生发酵产品，以及(c)可选地回收发酵产品。
在一个实施例中，用于酶促水解的容器具有至少1m3的体积。优选地，容器具有至少1m3、至少2m3、至少3m3、至少4m3、至少5m3、至少6m3、至少7m3、至少8m3、至少9m3、至少10m3、至少15m3、至少20m3、至少25m3、至少30m3，至少35m3、至少40m3、至少45m3、至少50m3、至少60m3、至少70m3、至少75m3、至少80m3、至少90m3、至少100m3、至少200m3、至少300m3、至少400m3、至少500m3、至少600m3、至少700m3、至少800m3、至少900m3、至少1000m3、至少1500m3、至少2000m3、至少2500m3、至少3000m3、至少3500m3、至少4000m3、至少4500m3的体积。通常，容器将小于5000m3。
在一个实施例中，发酵步骤在一个或多个容器中执行。发酵可以在执行酶促水解的相同容器中进行。
在一个实施例中，发酵是其中微生物用于使包括糖，例如，葡萄糖、L-阿拉伯糖和/或木糖的碳源发酵的步骤。碳源可以包括任何碳水化合物低聚物或多聚物，其包含L-阿拉伯糖、木糖或葡萄糖单元(诸如，举例而言，木质纤维素、木聚糖、纤维素、淀粉、阿拉伯聚糖等)。为了从此类碳水化合物中释放木糖或葡萄糖单元，可将合适的糖酶(诸如，木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等)添加到发酵培养基中或可由修饰的宿主细胞产生。在后一种情况下，可以对修饰的宿主细胞进行基因工程改造，以产生和排出此类糖酶。使用低聚或多聚葡萄糖来源的另一个优点是它能够在发酵过程中保持较低浓度的游离葡萄糖，例如，通过使用限速量的糖酶。反过来，这将防止对非葡萄糖，诸如，木糖的代谢和运输所需的系统的抑制。在优选的方法中，修饰的宿主细胞使L-阿拉伯糖(可选地，木糖)和葡萄糖两者发酵，优选为同时发酵，在这种情况下优选使用对葡萄糖抑制不敏感的修饰的宿主细胞，以防止双生生长。除了L-阿拉伯糖，可选的木糖(和葡萄糖)来源作为碳源的之外，发酵培养基将进一步包括修饰的宿主细胞生长所需的适当成分。用于微生物，诸如，酵母或丝状真菌生长的发酵培养基的组合物是本领域公知的。
在相同条件下，发酵时间可能比常规发酵更短，其中部分酶促水解仍然必须在发酵过程中进行。在一个实施例中，对于含有50g/l葡萄糖和来自木质纤维素材料的相应其他糖(例如，50g/l木糖、35g/l L-阿拉伯糖和10g/l半乳糖)的糖组合物，发酵时间为100小时或更短，90小时或更短，80小时或更短，70小时或更短，或60小时或更短。对于更稀的糖组合物，发酵时间可以相应地减少。在一个实施例中，乙醇生产步骤的发酵时间对于由C6糖制成的乙醇在10-50小时之间，而对于由C5糖制成的乙醇在20-100小时之间。在一个实施例中，琥珀酸生产步骤的发酵时间在20-70小时之间。
发酵过程可以是需氧或厌氧发酵过程。厌氧发酵过程在本文中定义为在不存在氧或其中基本上不消耗氧，优选为消耗小于5、2.5或1mmol/L/h，更优选为0mmol/L/h的情况下进行的发酵过程(即氧消耗是不可检测的)，并且其中有机分子既充当电子供体又充当电子受体。在不存在氧的情况下，糖酵解和生物质形成中产生的NADH不能被氧化磷酸化氧化。为了解决这个问题，许多微生物使用丙酮酸或其衍生物之一作为电子和氢受体，从而再生NAD+。因此，在优选的厌氧发酵过程中，丙酮酸用作电子(和氢受体)，并被还原为发酵产品，诸如，乙醇、乳酸、3-羟基-丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、富马酸、氨基酸、1,3-丙二醇、乙烯、甘油、丁醇、β-内酰胺抗生素和头孢菌素。在一个优选的实施例中，发酵过程是厌氧的。厌氧过程是有利的，因为它比需氧过程便宜：需要较少的特殊设备。此外，预计厌氧过程比需氧过程产生更高的产品产率。与厌氧过程相比，在需氧条件下，通常生物质产率较高。因此，通常在需氧条件下，预期产品产率低于在厌氧条件下。
在另一个实施例中，发酵过程在限氧条件下。更优选地，发酵过程是需氧的，并且在限氧条件下。限氧发酵过程是这样一种过程，其中氧消耗受到氧从气体到液体的转移的限制。氧限制的程度由进入的气流的量和组成以及所用发酵设备的实际混合/传质特性决定。优选地，在限氧条件下的过程中，氧消耗速率为至少5.5mmol/L/h，更优选为至少6mmol/L/h，甚至更优选为至少7mmol/L/h。
发酵过程优选地在对修饰细胞最佳的温度下进行。因此，对于大多数酵母或真菌细胞，发酵过程在低于42℃，优选为38℃或更低的温度下进行。对于酵母或丝状真菌宿主细胞，发酵过程优选在低于35、33、30或28℃的温度和高于20、22或25℃的温度下进行。在一个实施例中，醇发酵步骤和有机酸发酵步骤在25℃和35℃之间进行。
在一个实施例中，发酵用发酵微生物，例如，酵母进行。在本发明的一个实施例中，C5糖的醇(例如，乙醇)发酵是用C5发酵微生物进行的。在本发明的一个实施例中，C6糖的醇(例如，乙醇)发酵用C5发酵微生物或商业C6发酵微生物进行。适用于乙醇生产的市售酵母包括但不限于BIOFERMTM AFT和XR(NABC-North American Bioproducts Corporation(北美生物制品公司)，乔治亚州(GA)，美国))、ETHANOL REDTM酵母(Fermentis/Lesaffre(弗曼迪斯/乐斯福)，美国)、FALITM(Fleischmann′s Yeast(弗莱施曼酵母)，美国)、FERMIOLTM(DSMSpecialties(帝斯曼食品配料部))、GERT STRANDTM(Gert Strand AB，瑞典)以及SUPERSTARTTM和THERMOSACCTM新鲜酵母(Ethanol Technology(乙醇技术)，威斯康星州(WI)，美国)。
在一个实施例中，产醇微生物是能够使至少一种C5糖发酵的微生物。可选地，它还能够使至少一种C6糖发酵。在一个实施例中，本申请描述了一种由纤维素材料制备乙醇的方法，包括以下步骤：(a)执行如上所述的由纤维素材料制备糖制产品的方法，(b)使糖制产品发酵以产生乙醇；以及(c)可选地回收乙醇。发酵可以用能够使至少一种C5糖发酵的微生物(例如，酵母)来进行。
产醇微生物可以是原核或真核生物。所述方法中使用的微生物可以是基因工程微生物。合适的产醇生物体的示例是酵母，例如，酵母菌属，例如，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、巴氏酵母(Saccharomyces pastorianus)或葡萄汁酵母(Saccharomycesuvarum)、汉逊酵母属(Hansenula)、伊萨酵母属(Issatchenkia)，例如，东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis)、毕赤酵母(Pichia)，例如，树干毕赤酵母(Pichia stipites)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、克鲁维酵母(Kluyveromyces)，例如，脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fagilis)、假丝酵母(Candida)，例如，假热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)或Candida acidothermophilum、管囊酵母属(Pachysolen)，例如，嗜鞣质菅囊酵母(Pachysolen tannophilus)或细菌，例如，乳酸杆菌(Lactobacillus)，例如，乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、地芽孢杆菌(Geobacillus)、发酵单胞菌(Zymomonas)，例如，运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)，例如，Clostridium phytofermentans、埃希氏杆菌属(Escherichia)，例如，大肠杆菌(E.coli)、克雷伯氏菌(Klebsiella)，例如，催产克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)。在一个实施例中，能够使至少一种C5糖发酵的微生物是酵母。在一个实施例中，酵母属于酿酒酵母属(Saccharomyces)，优选属于酿酒酵母种(the species Saccharomyces cerevisiae)。在根据本发明的方法中使用的酵母，例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)能够转化己糖(C6)糖和戊糖(C5)糖。在根据本发明的方法中使用的酵母，例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)可以使至少一种C6糖和至少一种C5糖厌氧发酵。例如，除了葡萄糖之外，酵母还能够在厌氧条件下使用L-阿拉伯糖和木糖。在一个实施例中，酵母能够将L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖和/或5-磷酸木酮糖和/或转化为所需的发酵产品，例如，转化为乙醇。能够从L-阿拉伯糖产生乙醇的生物体，例如，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株，可以通过修饰从合适的来源引入araA(L-阿拉伯糖异构酶)、araB(L-乙二酸核酮糖(L-ribuloglyoxalate))和araD(L-核酮糖-5-P4-差向异构酶)基因的宿主酵母而产生。可以将此类基因引入宿主细胞，以使其能够使用阿拉伯糖。WO2003/095627中描述了这种方法。可以使用来自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的araA、araB和araD基因，并且这些基因在WO2008/041840中公开。可以使用来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的araA基因和来自大肠杆菌(Escherichia coli)的araB和araD基因，这些基因在EP1499708中公开。在另一个实施例中，araA、araB和araD基因可源自棒杆菌属(Clavibacter)、节杆菌属(Arthrobacter)和/或革兰氏菌属(Gramella)中的至少一种，特别是密歇根棒杆菌(Clavibacter michiganensis)、金黄色节杆菌(Arthrobacteraurescens)和/或福尔塞氏杆菌(Gramella forsetii)中的一种，如WO 2009011591中所公开。在一个实施例中，酵母还可以包括一个或多个拷贝的木糖异构酶基因和/或一个或多个拷贝的木糖还原酶和/或木糖醇脱氢酶。
酵母可以包括一种或多种基因修饰，以允许酵母使木糖发酵。基因修饰的示例是引入一个或多个xylA-基因、XYL1基因和XYL2基因和/或XKS1-基因；醛糖还原酶(GRE3)基因的缺失；PPP基因TAL1、TKL1、RPE1和RKI1的过表达，以允许增加细胞中通过戊糖磷酸途径的通量。EP1468093和/或WO2006/009434中描述了基因工程酵母的示例。
合适的商业酵母的示例是RN1016，它是来自荷兰DSM的木糖和葡萄糖发酵酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株。
在一个实施例中，用于产生乙醇的发酵过程是厌氧的。厌氧已经在本文前面定义。在另一个优选的实施例中，用于产生乙醇的发酵过程是需氧的。在另一个优选的实施例中，用于产生乙醇的发酵过程在限氧条件下，更优选为在需氧和限氧条件下进行。限氧条件已在本文前面定义。
或者，对于上述发酵过程，可以使用至少两种不同的细胞，这意味着此过程是共发酵过程。上述发酵过程的所有优选实施例也是此共发酵过程的优选实施例：发酵产品的识别、L-阿拉伯糖来源和木糖来源的识别、发酵条件(需氧或厌氧条件、限氧条件、进行此过程的温度、乙醇的生产率、乙醇的产率)。
可以通过本发明的方法产生的发酵产品可以是源自发酵的任何物质。它们包括但不限于醇类(诸如，阿拉伯糖醇、丁醇、乙醇、甘油、甲醇、1,3-丙二醇、山梨糖醇和木糖醇)；有机酸类(诸如，乙酸、丙酮酸、己二酸、抗坏血酸、丙烯酸、柠檬酸、2,5-二酮-D-葡萄糖酸、甲酸、富马酸、葡萄糖二酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、戊二酸酸、3-羟基丙酸、衣康酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、草酸、草酰乙酸、丙酸、琥珀酸和木糖酸)；酮类(诸如，丙酮)；氨基酸类(诸如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、色氨酸和苏氨酸)；烷烃类(例如，戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷、十一烷和十二烷)；环烷烃类(诸如，环戊烷、环己烷、环庚烷和环辛烷)；烯烃类(诸如，戊烯、己烯、庚烯和辛烯)；以及气体(诸如，甲烷、氢气(H2)、二氧化碳(CO2)和一氧化碳(CO))。发酵产品还可以是蛋白质、维生素、药物、动物饲料补充剂、特种化学品、化学原料、塑料、溶剂、乙烯、酶，诸如，蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化还原酶、转移酶或木聚糖酶。在一个优选的实施例中，通过如本文所述的发酵方法制备醇。在一个优选的实施例中，乙醇通过如本文所述的发酵方法制备。
如本文所述的方法可以包括回收通过方法制造的所有种类的产品，包括发酵产品，诸如，乙醇。发酵产品可以以技术人员已知的方式与发酵液分离。回收技术的示例包括但不限于色谱法、电泳程序、差异溶解度、蒸馏，或萃取。因此，对于每种发酵产品，技术人员将能够选择合适的分离技术。例如，可以通过蒸馏，例如，以常规方式蒸汽蒸馏/真空蒸馏，从酵母发酵液中分离乙醇。
实施例
实施例1
混合全发酵液的酶促水解
根据WO 2011/000949中描述的方法，通过在存在纤维素诱导剂的情况下培养踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)来产生包括纤维素分解酶和半纤维素分解酶的第一全发酵液。此外，包括纤维素分解酶和半纤维素分解酶的第二全发酵液是根据WO2011/000949中描述的方法通过在发酵培养基中存在和不存在诱导剂的情况下培养过表达踝节菌属埃默森蓝状菌(Rasamsonia emersonii)β-葡糖苷酶(描述于WO2012/000890)的Rasamsonia emersonii而产生的。如果第二全发酵液是用诱导剂产生的，则使用纤维素作为诱导剂。
预处理的纤维素材料(预处理的玉米秸秆)通过在186℃下温育玉米秸秆6.7分钟来制备。在热处理之前，用H2SO4浸渍玉米秸秆10分钟，以在预处理期间将pH值设置为2.3。
酶促水解实验在2L斯科特(Scott)瓶中进行，此瓶放置在恒温62℃和振荡速度120rpm的振荡温育箱中。酶促水解反应用如上制备的酸预处理的玉米秸秆(aCS)在17％w/w的最终干物质浓度和4.5的pH值下执行。每次酶促水解用每个斯科特(Scott)瓶500g反应混合物进行。
在每个实验开始时，向每克预处理的玉米秸秆干物质添加43mg第一全发酵液(用诱导剂制成)和6.6mg或3.3mg第二全发酵液(诱导和非诱导)。在酶促水解过程中，pH值由pH电极手动测量，并在需要时调节至pH 4.5。酶促水解144小时后取样进行分析，立即以4000xg离心8分钟。将上清液用0.2μm尼龙滤器(Whatman)过滤并储存在4℃下，直到如下所述分析糖含量为止。
根据2008年1月的NREL技术报告NREL/TP-510-42623，使用配备Aminex HPX-87H柱的HPLC测量稀释样品的糖浓度。结果如表1所示。
表1：用不同的混合全发酵液对酸预处理的玉米秸秆进行酶促水解144小时后的葡萄糖浓度。
Figure BDA0003247541970000381
*测得存在于第二发酵液(在存在和不存在诱导剂的情况下制备)中的葡萄糖量<0.01g/l。
表1中的结果清楚地表明，当使用包括诱导和非诱导全发酵液的组合的混合全发酵液时，葡萄糖释放量更高(参见实验1和实验2与实验3和实验4之间的比较)。

Claims (14)

1.一种用于产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液的方法，其中所述方法包含以下步骤：
(i)在存在诱导剂的情况下培养丝状真菌，以产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第一全发酵液，
(ii)在不存在诱导剂的情况下培养丝状真菌，以产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的第二全发酵液，以及
(iii)混合所述第一全发酵液和第二全发酵液，以产生包含纤维素分解酶和/或半纤维素分解酶的混合全发酵液。
2.根据权利要求1所述的方法，所述丝状真菌选自枝顶孢属、伞菌属、曲霉属、短梗霉属、白僵菌属、头孢菌属、拟蜡菌属、Chaetomium paecilomyces、金孢子菌属、麦角菌属、旋孢腔菌属、鬼伞属、隐球菌属、黑蛋巢菌属、裸孢壳属、内座壳属、Endothia mucor、黑粉酵母属、镰刀菌属、白乔史密斯霉属、粘帚霉属、腐质霉属、稻瘟菌属、毛霉菌属、毁丝霉属、漆斑菌属、新考玛脂霉属、脉孢霉属、拟青霉属、青霉菌属、瘤胃壶菌属、原毛平革菌属、侧耳属、柄孢壳菌属、梨孢霉属、踝节菌属、根毛霉属、根霉属、柱顶孢霉属、裂褶菌属、壳多孢属、篮状菌属、热子囊菌属、嗜热丝孢菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、Trametes pleurotus、木霉属，以及毛癣菌属。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，产生所述第一全发酵液的真菌与产生所述第二全发酵液的真菌不同。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，产生所述第一全发酵液的真菌与产生所述第二全发酵液的真菌相同。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述混合全发酵液包含的第一全发酵液与第二全发酵液的比率为99％(w/w)至1％(w/w)-70％(w/w)至30％(w/w)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，在步骤(i)中所述丝状真菌在存在诱导剂的情况下培养，所述诱导剂选自纤维素、羧甲基纤维素(CMC)、木聚糖、木糖、龙胆二糖、槐糖、乳糖、甘油、葡萄糖、山梨糖醇、纤维二糖、木二糖、半乳糖、海带二糖、麦芽糖、果糖、甘露糖醇、阿拉伯糖、阿拉伯糖醇、山梨糖、通过将葡萄糖与转糖基化β-葡萄糖苷酶温育而由葡萄糖制备的二糖混合物，或其任意组合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述第一全发酵液包含纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、葡聚糖内切酶、β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶、木聚糖内切酶、裂解性多糖单加氧酶、乙酰木聚糖酯酶，或其任何组合。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述第二全发酵液包含纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、葡聚糖内切酶、β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶、木聚糖内切酶、裂解性多糖单加氧酶、乙酰木聚糖酯酶，或其任何组合。
9.一种通过根据权利要求1至8中任一项所述的方法获得的混合全发酵液，其包含纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、葡聚糖内切酶、β-葡糖苷酶、木聚糖内切酶、裂解性多糖单加氧酶，以及乙酰木聚糖酯酶。
10.一种由纤维素材料制备糖制产品的方法，所述方法包含以下步骤：
a)用根据权利要求9所述的混合全发酵液对所述纤维素材料进行酶促水解，以获得所述糖制产品，和
b)可选地回收所述糖制产品。
11.一种由纤维素材料制备发酵产品的方法，所述方法包含以下步骤：
执行根据权利要求10所述的方法，
使所述糖制产品发酵，以产生所述发酵产品，以及
可选地回收所述发酵产品。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中，所述酶促水解中纤维素材料的干物质含量为10％–40％(w/w)。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述发酵由酵母完成。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中，所述纤维素材料的酶促水解是在体积为10-500,000m3的容器中进行的。
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