JP4351539B2 - 遠心力及び／又は毛管力によって流体を正確に移動し、操作する方法及び装置 - Google Patents

Description

発明の背景
本発明は一般に、種々の生物学的及び化学的組成物の分析に適用されるようなマイクロフルイディクスの分野に関する。より具体的には、本発明は、印加される遠心力及び装置中の通路の表面特性から生じる毛管力の両方を使用して分析を実施する方法及び装置を提供する。

体液又は他の流体中の分析対象物、たとえばグルコース、アルブミン又は細菌の存在（又は不在）又は量を測定する際、分析を実施する技術者を支援するために一般に試薬装置が使用される。このような試薬装置は、技術者が試料流体を塗布したのち結果を標準と比較することができる一以上の試薬区域を含む。たとえば、試薬試験片が試料流体に浸漬され、試験片が色を変化させ、色の強さ又はタイプが標準参照カラーチャートと比較される。

多くの体液がそうであるように、試料が複雑な組成を有するとき、このような装置の製造は困難である。同定又は計測される成分は、試薬によって検出されて特徴的な色を出すことができる前に適切な形態に転換されなければならないこともある。試料流体中の他の成分が所望の反応を妨害することもあり、これらの成分は試料から分離されなければならないか、それらの影響が中和されなければならない。ときには、試薬成分は互いに適合性がない。他の場合には、対象成分を濃縮するため、試料を前処理しなければならない。これら及び他の問題が、特定の検定に必要である試薬成分を一つの装置で提供することを困難にする。当該技術には、このような問題を解決し、特定の成分に関して流体試料を分析する能力を提供することを意図した装置の数多くの例がある。

ある異なる手法は、試料を調製し、分析する一連の工程であって、ただし技術者がそれを行うことを要しない一連の工程を実施することである。これを実施する一つの方法は、所望の過程を自動的に行うが、試薬を単離しておくことにより、先に論じた問題を回避することができる装置を製造することによる方法である。小さな試料の場合、このような分析は、マイクロ流体技術を使用することができる。

マイクロ流体装置は小さいが、試料を受け、試料の所望量を選択し、試料を希釈又は洗浄し、それを成分に分離し、試料又はその成分との反応を実施することができる。このような工程を実験室で大きな試料に対して実施するとなると、一般に、技術者が必要な工程を手作業で実施することを要するか、自動化されているとしても、試料及びその成分を移動し、試薬、洗液、希釈剤などを導入するための器具が必要になるであろう。しかし、試料が小さいということは生物学的検定にとって一般的であり、したがって、処理工程を非常に小さな器具で実施しなければならないということになる。実験室器具を約０．０２〜１０．０μLの試料に必要なサイズに小型化することは不可能であり、異なる手法が使用される。μmサイズの通路によって接続された小さな容器が、プラスチック又は他の適切な基材にそのような造作を形成し、得られた基材を別の層で覆うことによって製造される。カバー層が被着される前に、容器は、それに加えられる試薬を含むことができる。また、通路には、所望により、試験される試料に対して湿潤性又は非湿潤性にするための処理を施すことができる。試料、その成分又は他の流体は、壁が湿潤している場合には、毛管作用によってそのような通路を通って移動することができ、流体が通路の壁を湿潤しない場合には、移動が妨げられる。したがって、毛管サイズの通路は、まるで弁が存在するかのように、流体を移動させたり、その移動を妨げたりすることができる。流体をこのようなμmサイズの通路に通して移動させるもう一つの方法は、非湿潤性の壁の抵抗に打ち勝つ遠心力による方法である。この簡潔な記載は、マイクロ流体装置の概要を提供する。具体的な応用は、いくつかを以下に述べる多くの特許で提供されている。

種々の分析対象物のための容器及び通路を設けるために使用される原理のいくつかの詳細な記載が米国特許第６，１４３，２４８号で提供され、これらの原理の応用のさらなる例を米国特許第６，０６３，５８９号に見いだすことができる。これら二つの特許に記載されているマイクロ流体装置は、ディスク形に配置され、流体を一つの容器から別の容器に移動させるために必要に応じて異なる程度の遠心力を提供することができる器具の上で回転させることを意図するものであった。一般に、試料が回転中心の近くに供給され、徐々に増す回転速度が、試料又はその部分を、回転中心からさらに離れたところに配置された容器の中に移動させるものであった。これらの特許は、いかにして特定の量の試料を分析のために単離することができるか、いかにして試料を洗浄又は他の目的のための他の流体と混合することができるか、いかにして試料をその成分に分離することができるかを記載している。

他の特許、たとえば米国特許第４，９０８，１１２号は、電気浸透によって流体を移動させるための電極の使用を記載している。Caliper Technology社は、起電力推進によって流体を移動させるマイクロ流体装置に関するパテントポートフォリオを有している。代表的な例は、米国特許第５，９４２，４４３号、第５，９６５，００１号及び第５，９７６，３３６号である。

米国特許第５，１４１，８６８号では、毛管作用を使用して、試料キャビティ中に配置された電極によって試料の計測を実施することができるキャビティに試料を引き込んでいる。

本発明者らはまた、イムノアッセイ及び核酸検定、たとえば細菌性病原体、タンパク質、薬物、代謝産物及び細胞の検出のための試薬装置を提供する必要性に関心があった。本発明者らの目的は、所与の分析手順のために適合性のない成分が必要であり、分析を実施することができる前に試料の前処理が必要である場合に伴う問題を解決することであった。これらの問題に対する本発明者らの解決法は、先に記載した解決法とは異なり、以下、詳細に記載されるものである。

発明の概要
本発明は一般に、マイクロ流体技術を利用して小さな生物学的試料の分析を改良されたやり方で提供する分析装置として特徴づけることができる。本発明の装置はまた、これまで従来の分析試験片によっては不可能であった分析を可能にする。

本発明の分析装置は、それが通常、試料液体を受けるための、幅約１０〜５００μm、深さ少なくとも５μmの毛管通路によって相互接続されているマイクロリットルサイズの溜めが切られている薄いプラスチックの小片である点で、以下「チップ」と呼ぶこともある。通路は、公知の方法を使用して、好ましくはプラズマ重合によって壁を疎水性又は親水性にすることができる。疎水性又は親水性の程度は、試験される試料流体の性質による要求に応じて調節される。いくつかの実施態様では、疎水性表面は、沈着物が壁に付着することを防ぐように調節される。他の実施態様では、親水性表面は、液体の実質的に完全な排除を提供するように調節される。

二つのタイプの毛管ストッパ、すなわち、疎水性の壁を有する狭いストッパ及び親水性の壁を有する広いストッパが開示される。チップのベース部に所望の造作が形成され、適切な溜めに試薬が配置されたのち、トップ部が被着されてチップを完成する。

いくつかの実施態様では、本発明の分析チップは、試料流体が配置される溜めに接続された親水性毛管の画定されたセグメントを含む。試料流体が毛管作用によってセグメントを満たし、それにより、所望の分析のために後で他の溜めに移すための一定量の試料を提供する。いくつかの実施態様では、画定された毛管セグメントは、各端で雰囲気に通気しているＵ字形ループの形状である。他の実施態様では、画定された毛管セグメントは直線形である。

毛管通路によって接続された多数の溜めを使用することにより、試料流体は、多くの別々の処理を所定の順序で施すことができ、それにより、従来の試験片では解決しがたい問題の多くが回避される。たとえば、試料流体を、適切な試薬と接触させる前に洗浄又は前処理することができる。２種以上の試薬を一つの試料と逐次反応に使用することができる。また、反応した試薬に対して実施される計測の精度を改善するため、反応が起こったのち試料から液体を除去することができる。本発明の典型的な装置のこれら及び他の可能な構造は、図面及び以下の説明で例示される。

好ましい実施態様の説明
マイクロチャネル中の流れ
本発明を利用する装置は通常、当該分野における以前の研究者たちによって提案されてきたよりも小さいチャネルを使用する。特に、本発明で使用されるチャネルは、幅が約１０〜５００μm、好ましくは約２０〜１００μmの範囲であるが、他の人達には一桁大きなチャネルが一般に使用されてきた。より小さなチャネルは分析される試料中の成分を効果的にろ別することができるため、このようなチャネルの最小寸法は約５μmであると考えられる。一般に、チャネルの深さは幅よりも小さい。本発明で好ましい範囲のチャネルが、流れを開始させるときを除いて遠心力を使用することなく、毛管力によって液体試料を動かすことを可能にすることがわかった。たとえば、試料流体に対して疎水性になるように処理されている毛管壁によって動きを止めることが可能である。抵抗する毛管力には遠心力の適用によって打ち勝つことができ、この遠心力は、液流が確立されると除くことができる。あるいはまた、毛管壁が試料流体に対して親水性になるように処理されているならば、流体は、遠心力又は他の力を使用しなくとも、毛管力によって流れる。親水性ストッパがこのようなチャネルに含まれるならば、親水性ストッパの効果に打ち勝つための力の適用によって流れが確立される。その結果、液体を計量し、実施される分析に関する要求に応じて、液体を装置の一つの領域から別の領域に動かすことができる。

遠心力、流体物性、流体表面張力、毛管壁の表面エネルギー及び分析される流体に含まれる粒子の表面エネルギーに関連する数学的モデルを導出した。毛管を通過する流体の流量及び所望の疎水性又は親水性の程度を予測することが可能である。これらの要因の関係から以下の一般原理を導くことができる。

所与の通路に関して、液体と通路の表面との相互作用が、液体の動きに対して有意な影響を及ぼすかもしれないし、及ぼさないかもしれない。通路の表面積対体積比が大きい、すなわち断面積が小さい場合、液体と通路の壁との相互作用は非常に重要になる。これは、呼称直径が約２００μm未満である通路に関する場合、液体試料及び壁の表面エネルギーに対して毛管力が優勢であるとき特に当てはまる。壁が液体で湿潤しているとき、液体は、外力を加えられることなく、通路を通って移動する。逆に、壁が液体で湿潤していないとき、液体は通路から抜けようとする。これらの一般的傾向を利用して、液体を通路に通して移動させたり、異なる断面積を有する別の通路との接合部で動きを止めたりすることができる。液体が休止状態にあるならば、力、たとえば遠心力を加えることによって動かすことができる。あるいはまた、異なる断面積又は表面エネルギーを有する通路間の接合部で必要な圧力変動を導くことができる、空気圧、真空、電気浸透などをはじめとする他の手段を使用してもよい。本発明の特徴は、液体が中を移動する通路がこれまで使用されてきたものよりも小さいということである。これは結果的に、より高い毛管力を利用可能にし、毛管ストッパに打ち勝たなければならない短い期間を除いて外力を要することなく、毛管力だけによって液体を動かすことを可能にする。しかし、より小さな通路は本来、生物学的試料又は試薬中の粒子による閉塞をより受けやすい。その結果、通路壁の表面エネルギーは、試験される試料流体、たとえば血液、尿などとの使用に関する要求に応じて調節される。この特徴は、分析装置のより柔軟な設計を可能にする。装置は、当該技術で使用されてきたディスクよりも小さくすることができ、より小さな試料を用いて操作することができる。装置の説明及び例から他の利点が明らかになる。

本発明の分析装置
本発明の分析装置は「チップ」と呼ぶこともできる。分析装置は一般に小さく平坦であり、一般に約１〜２インチ四方（２５〜５０mm四方）である。試料の量は少なくなる。たとえば、約０．３〜１．５μLしか含まず、したがって、試料流体のための溜めは、試料を容易に見ることができ、適切な器具によって計測することができるよう、比較的幅広く浅くなる。相互接続する毛管通路は、幅が１０〜５００μm、好ましくは２０〜１００μmの範囲であり、その形状は、通路を形成するために使用される方法によって決まる。通路の深さは少なくとも５μmでなければならない。試料の所定量を画定するために毛管のセグメントを使用する場合、毛管は、試薬溜め間の通路よりも大きくすることができる。

毛管及び試料溜めを形成することができるいくつかの方法、たとえば射出成形、レーザ融食、ダイヤモンド練磨又はエンボス加工があるが、チップのコストを下げるために射出成形を使用することが好ましい。一般に、チップのベース部をカットして試料溜め及び毛管の所望のネットワークを形成したのち、ベースの上にトップ部を取り付けてチップを完成させる。

チップは、１回の使用ののち廃棄処分されることを意図したものである。したがって、可能な限り廉価な材料であると同時に試薬及び分析される試料と適合性のある材料で製造される。大部分の場合、チップは、プラスチック、たとえばポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアクリレート又はポリウレタンで製造されるが、代替的に、ケイ酸塩、ガラス、ロウ又は金属から製造されることもできる。

毛管通路は、液体試料又は試薬によって固体表面に形成される接触角に関して定義される疎水性又は親水性のいずれかに調節される。通常、表面は、接触角が９０°未満であるならば親水性とみなされ、接触角がそれよりも大きいならば疎水性とみなされる。表面を処理して疎水性又は親水性にすることができる。好ましくは、プラズマ誘導重合が通路表面で実施される。本発明の分析装置はまた、毛管壁の表面エネルギーを制御するために使用される他の方法、たとえば親水性材料もしくは疎水性材料による被覆、グラフト又はコロナ処理によって製造してもよい。本発明では、意図する試料流体との使用に備えて毛管壁の表面エネルギー、すなわち親水性又は疎水性の程度を調節することが好ましい。たとえば、疎水性通路の壁への沈着物を防ぐため、又は液体が通路中に残らないことを保証するため。

毛管路を通過する液体の移動は、その名が示すように、液体が毛管路を通過して流れることを防ぐ毛管ストッパによって妨げられる。毛管通路が親水性であり、液体の流れを促進するならば、疎水性の毛管ストッパ、すなわち、疎水性の壁を有する小さめの通路を使用することができる。小さなサイズと非湿潤性の壁との組み合わせが液体の浸入に対抗する表面張力を生じさせるため、液体は疎水性ストッパを通過することができない。あるいはまた、毛管が疎水性であるならば、試料溜めと毛管との間にストッパは必要ない。試料溜め中の液体は、液体によって対抗する表面張力に打ち勝ち、液体を疎水性通路に通過させるのに十分な力、たとえば遠心力が加えられるまでは、毛管に入ることを妨げられる。本発明の特徴は、液体の流れを開始させるために遠心力しか要らないということである。ひとたび疎水性通路の壁が液体と完全に接触すると、液体の存在が疎水性表面にともなうエネルギーバリヤーを下げるため、対抗力は減少する。その結果、液体はもはや流れるために遠心力を要しない。必要ではないが、場合によっては、速やかな分析を促進するため、液体が毛管通路を通って流れる間、遠心力を加え続けることが好都合であるかもしれない。

毛管通路が親水性であるとき、試料流体（水性であると仮定する）は、さらなる力を要することなく、自然に毛管を通って流れる。毛管ストッパが必要であるならば、一つの代替方法は、上記のようにストッパとして働くことができる狭めの疎水性区分を使用することである。毛管が親水性であるとしても親水性ストッパを使用することができる。このようなストッパは毛管よりも幅広く、したがって、液体の表面張力が、液体の流れを促進する低めの力を生成する。毛管と幅広のストッパとの間の幅の変化が十分であるならば、液体は、毛管ストッパへの入口で停止する。液体は、最終的にはストッパの親水性壁に沿って浸入するが、適切な形状設計により、壁が親水性であるとしてもストッパが効果的になるよう十分にこの動きを遅らせることができることがわかった。好ましい親水性ストッパが、先に説明した疎水性ストッパ（図３ａ）とともに、図３ｂに示されている。

図１は、本発明の態様を具現化する試験装置を示す。標本、たとえば尿が試薬溜めＲ１に配置される。この装置では、外力の適用なしで液体試料が通路を通過してＲ２に移動しないよう、すべての通路がプラズマ重合によって処理されて疎水性にされている。装置がプラットフォームに配置され、疎水力に打ち勝つのに適切な速度で回転させられると、試料液体はＲ２の中に移動することができ、そこで後続の分析に備えて反応するか、他の方法で準備される。また、Ｒ１に加えられる試料がＲ２によって受けられるよりも大きくなるよう、Ｒ２が満たされている期間中にＲ３が液体を受ける。Ｒ３は、試料の一部の第二の反応を提供することもできるし、単に過剰な試料のためのオーバフローを提供することもできる。あるいはまた、Ｒ３は、望むならば、試料の前処理した部分をＲ２に送ることもできる。Ｒ２とＲ４との間の通路もまた疎水性であるため、試料液体を動かすためにはさらなる遠心力を加えなければならない。遠心力が加えられると、Ｒ５は、Ｒ４からの反応した試料で満たされることもできるし、分析対象物がＲ４で反応し、そこに保持された後に残る液体を受けるために使用されることもできる。このような工程は、他のやり方では液体中の物質によって不明瞭になるであろう場合にＲ４中の反応生成物を計測する改良された能力を提供することができる。図１の設計では、毛管通路が疎水性にされているため、毛管ストッパは設けられていない。しかし、通路が親水性であるならば、Ｒ１、Ｒ２及びＲ４の出口に毛管ストッパが設けられて、ストッパに打ち勝つのに十分な遠心力が加えられるまで、液体が毛管通路を通って移動することを防ぐであろう。十分な遠心力が加えられた後は、毛管力が作用して試料液体を動かし、さらなる遠心力は要らなくなる。すなわち、試料液体を動かすのに毛管力だけで十分になる。溜めＲ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５のそれぞれは、試料液体が溜めを満たしている間に溜めの中のガスを逃がすことができるよう、周囲圧に通じる通路（Ｖ１、Ｖ２、Ｖ３及びＶ４）を有するということが注目されよう。

図２は、計量毛管セグメント及び親水性ストッパを含む第二の試験装置を示す。計量セグメントは、分析精度が改善されるよう、正確な量の液体試料が計量分配されることを保証する。液体の試料が試料溜めＲ１に加えられ、Ｒ１から毛管力によって流れ（通路は親水性である）、ほぼＵ字形の計量ループを満たす。毛管の計量ループ又はセグメントの形状は、図示する形状である必要はない。まっすぐ又は直線形の毛管セグメントを代わりに使用することもできる。ループの両端はＶ１及びＶ２を介して雰囲気に通じている。試料液体は、親水性ストッパＳ１（望むならば、疎水性ストッパでもある）のところまで動く。装置がプラットフォームに配置され、親水性ストッパの抵抗に打ち勝つのに十分な速度で回転させられるならば、試料ループＬに含まれた液体はストッパＳ１を通過し、毛管力によって試薬溜めＲ２に入る。液体が出るとき空気が試料ループに入り、それにより、液柱の長さ、ひいては試薬溜めＲ２に送られる試料の量を決定する空気入口点Ｖ１及びＶ２で液体を分断する。試料ループの下方には、さらなる試薬溜めＲ３があり、これは、以下でさらに論じるように、試料液体と反応したり、後の分析に備えて試料液体を準備するために使用することができる。壁が親水性であるため、液体は毛管力によってＲ２からＲ３まで移動する。毛管壁が疎水性であるならば、対抗力が遠心力の適用によって打ち負かされるまで、液体はＲ３には流入しない。

図３ａ及びｂは、本発明の分析装置に使用することができる疎水性ストッパ（ａ）及び親水性ストッパ（ｂ）を示す。図３ａでは、溜めＲ１が液体で満たされ、その液体が、取り付けられた毛管通路を通って、液体がストッパに入ることを防ぐ表面張力を提供する狭い疎水性毛管通路によってさらなる移動を妨げられるところまで延びている。溜めＲ１から毛管ストッパの方向に力が加えられるならば、対抗力に打ち勝つことができ、Ｒ１中の液体を溜めＲ２に移すことができる。同様に、図３ｂでは、図示する毛管ストッパは、Ｒ１中の液体が溜めＲ２に流入することを防ぐ親水性ストッパである。この場合、毛管ストッパは狭くはなく、親水性の壁を有している。チャネルの幅の増大及びストッパの形状が、表面張力が取り付けられた毛管の外に液体を流れさせることを防ぐ。しかし、上述したように、十分な時間の経過とともに液体は壁に沿って徐々に浸入し、停止効果に打ち勝つということがわかった。大部分の分析目的の場合、試料の分析に要する時間は、液体がその自然な移動によってストッパに打ち勝つのに要する時間に比べて短いため、ストッパはその目的に役立つ。

図４ａは、本発明の多目的分析チップの平面図を示す。通気チャネルＶ１〜Ｖ７、溜め１〜４及び６〜９、毛管ストッパ５ならびにＵ字形の試料ループＬがチップに形成されており、点線が、トップカバーを設置する前にチップベースに形成することができる可能な毛管通路を示す。明らかであるとおり、多くの配置が可能である。一般に、試料ループが毛管力によって満たされ、毛管ストッパ５に通して溜め６〜８に計量分配することができ、そこで試料が試薬と接触し、試薬に対する応答が計測されるよう、試料液体は溜めＲ２に加えられる。溜め１及び３は、さらなる試料液体又は試料を前処理するための別の液体を保持するために使用されよう。溜め４及び９は通常、廃液を保持するためのチャンバとして、又は溜め４の場合には、溜め２からの試料液体のためのオーバフロー又は洗液のための容器として働く。各溜めは、実施される分析の必要性に応じて、適切な通気チャネルに通じていることができる。可能な配置のいくつかが図４ｂ〜ｉに示されている。

図４ｂ〜ｊそれぞれでは、潜在的に可能な毛管通路のいくつかだけが完成し、残りの毛管及び溜めは使用されていない。図４ａに示す通気接続は、理解しやすくするために示していないが、実施される分析に必要であるならば設けられるということが理解されよう。

図４ｂでは、試料液体が溜め２に加えられ、これが、十分な遠心力を加えることによって（あるいはまた、流れに抵抗する力に対抗する他の手段を使用してもよい）流れに対する抵抗が打ち負かされると、疎水性毛管を通って溜め４に流入する。同様に、遠心力を増して、接続する疎水性毛管によって示される初期抵抗に打ち勝つことにより、試料を順に溜め６、８及び９に通して移動させることができる。溜め４、６、８及び９は、所望の分析手法によって求められるような試薬を含むことができる。

図４ｃは、計量された液体試料をループＬから、適量の遠心力を加えることによって打ち負かされる抵抗を有する親水性ストッパ５に通して計量分配する能力を提供する。あるいはまた、さらなる試料を溜め４に移すことができ、そこで試料は試薬によって処理されたのち溜め６に移される。溜め６から、遠心力を増して疎水性毛管の抵抗に打ち勝つことによって試料を順に溜め８及び９に移すことができる。特定の分析に依存して、溜め６、８及び９は、標本中の分子と試薬溜め中の結合相手との間で結合反応、たとえば抗体と抗原、ヌクレオチドとヌクレオチド又はホストとゲストの反応を起こさせるために使用することもできる。加えて、結合対は、検出ラベル又はタグに接合していることもできる。

溜めはまた、粒子及び表面に固定化された結合相手を使用して試薬溜め中の抗体、ヌクレオチド又は抗原を捕捉（トラップ）するため、不純物、未結合物質又は干渉物を洗浄又は反応除去するため、又は検出法の較正もしくは制御のための試薬を加えるために使用してもよい。

通常、溜めの１個が、その溜めに含まれる検出法によってシグナルを生成及び／又は検出する。その例は、電気化学的検出、分光検出、磁気検出及び酵素、指示薬又は染料による反応の検出を含む。

図４ｄは、計量した試料流体を溜め２から計量ループＬ及び親水性ストッパ５を介して順に溜め６及び８に移すための手段を提供する。試料は、さらなる反応のために溜め８に移される前に、溜め６中で濃縮してもよいし、イムノアッセイ及び核酸検定の場合には、必要に応じて分離してもよい。この変形態様では、液体を溜め８から通気チャネルの１個に移すことが可能である。

図４ｅは、溜め６及び８ではなく溜め６及び７が使用されていることを除き、図４ｄに類似している。この変形態様はまた、液体を溜め６から移すために直線形の配置が必要ないことを示す。

図４ｆは、試料が順に溜め６、７及び８を通って移されるという点で、図４ｄ及びｅに類似している。

図４ｇは、計量される試料が、図４ｃ〜ｅのように溜め６に移されるのではなく、溜め７に移される変形態様である。

図４ｈは、試料流体が溜め６に加えられ、疎水性通路の抵抗に打ち勝つのに十分な力を加えることによって溜め８に移されるチップを示す。溜め８には、実施される分析の必要に応じて、溜め３及び４から試薬又は緩衝剤が加えられる。廃液は溜め９に移され、それは、溜め８における結果の読みの精度を改善するのに有益であるかもしれない。

図４ｉは、流体試料が溜め１に導入され、溜め２に移されて、そこで、前記のように計量ループに入る前に前処理されるチップを示す。その後、遠心力の適用によって親水性ストッパ５に打ち勝つことにより、計量された前処理済み試料は溜め６に計量分配される。前記例と同じく、接続する疎水性毛管の抵抗に打ち勝つことにより、試料は、さらなる処理のために他の溜め、この場合は溜め９に移すことができる。

図４ｊは、試料が溜め２ではなく溜め３に加えられる装置を示す。溜め２は洗液を受け、その洗液は、接続通路中の疎水力に打ち勝つことによって溜め４に移される。溜め６は、親水性ストッパ５の抵抗に打ち勝つことにより、Ｕ字形セグメントから計量された試料を受ける。溜め６の中で反応を実施することができ、その後、試料は溜め８に移され、そこで、さらに反応したのち、溜め４から溜め８に移された洗液によって洗浄され、その後、溜め９に移される。そして、溜め８で発現した色が読み取られる。

図５は、一つの液体試料が試料溜めＳに導入され、そこから毛管力によって親水性毛管を通過して１０個の前記タイプの試料ループＬ１〜１０に流入する本発明のチップの変形態様を示す。試料ループは１０個ではなく、チップのサイズに依存していかなる数を設けてもよいことが理解されよう。図５には通気チャネルは示されていないが、存在するということが理解されよう。液体は、親水性ストッパによって各ループ中に止められる。そして、毛管ストッパに打ち勝つための力が加えられると、液体は、分析のための溜めに流入することができる。図４と同様に、多数の可能な毛管チャネル配置を創造することができる。

多くの用途で、以下の例に記載するように、試薬と試料との反応によって発現する色が計測される。また、チップ中の小さな溜めに配置された電極を使用して試料の電気的計測を実施することも可能である。このような分析の例は、電流滴定、インピーダンス測定、電位測定検出法に基づく電気化学的シグナル変換器を含む。

例１
まず、以下の組成の水性コーティング溶液及びエタノールコーティング溶液を調製することにより、ヘモグロビン検出用試薬を調製した。

水性コーティング溶液をろ紙（Whatman社の３MM等級）に塗布し、濡れた紙を９０℃で１５分間乾燥させた。そして、乾燥した試薬をエタノールコーティング溶液で飽和させたのち、再び９０℃で１５分間乾燥させた。

まず、以下の組成の水性コーティング溶液及びトルエンコーティング溶液を調製することにより、アルブミン検出用試薬を調製した。

これらのコーティング溶液を使用してろ紙、この場合は204又は237 Ahlstromろ紙を飽和させ、そのろ紙を、水性溶液での一回目の飽和のち９０℃で５分間乾燥させ、トルエン溶液での二回目の飽和ののち８５℃で５分間乾燥させた。

以下の処方を使用して試験溶液を調製した。タンパク質を計量し、ＭＡＳ溶液源に加えた。ＭＡＳ溶液とは、尿の平均的性質及び極端な性質を模倣するように設計されたリン酸緩衝液である。自然な尿の物性を以下の表に示す。

１０mLメスフラスコ中、ウシアルブミン（Sigma Chemical社A7906）２０．０mgを５mL ＭＡＳ１溶液に加え、旋回させ、アルブミンが完全に水和するまで放置したのち、ＭＡＳ１で量を１０．０mLに調節することにより、２００mg/dLアルブミン溶液（２g/L＝２mg/mL）を調製した。

１Lメスフラスコ中、凍結乾燥ウシヘモグロビン（Sigma Chemical社H2500）１０mgを１L ＭＡＳ１溶液に加えることにより、１．０mg/dLヘモグロビン溶液（１００mg/mL）を調製した。

１mm²のアルブミン及びヘモグロビン検出試薬区域をカットし、図１に示すマイクロ流体設計の別々の試薬溜めに入れ、２mg/Lアルブミン又は０．１mg/dL Ｈｂで試験したのち反応を観察した。デジタル処理機器（Panasonicデジタル5100システムカメラ）を用いて６６０nmでの反射率を計測した。アルブミン又はヘモグロビンを含有する尿及びアルブミン又はヘモグロビンを欠く尿の中で流体を装置に加えて１分後に得られた反射率を記録して、試験片反応性を表した。

２０μl試料を溜めＲ１（図１のチップ設計）に入れ、Applied Motion Products（米カリフォルニア州Watsonville）の513540プログラム式ステップモータドライバを使用して５００rpmで遠心処理して、Ｒ１をＲ２に接続し、Ｒ２をＲ４に接続する毛管中の疎水力に打ち勝つことにより、溜めＲ２及びさらにＲ４に移した。試料５μlと接触させる前と、接触させて１分後とで溜めＲ４中の試薬コーティングされたろ紙の色を計測した。分析後、１，０００rpmで遠心処理することにより、試料液体を溜めＲ５に移した。

反復実験ごとに１分のインキュベーション時間で二つの画像、一つは充填前のフィルタの画像、もう一つは充填後の画像を撮った。４回の反復実験を得た。また、比較のため、従来の試験片と同様なやり方で試薬紙を試験片に取り付けた。

溜めＲ４中のヘモグロビン試薬は、ヘモグロビンに対して、ブランクから試験片の値に等しいヘモグロビン１mg／dLに至る明確な応答を示した。試薬ろ紙は均一な色を発現した。Ｒ４中のヘモグロビン試薬は可溶性であり、チャンバＲ５から洗い出すことができることがわかった。ヘモグロビン試薬をＲ４ではなくＲ２に入れたことを除き、実験を繰り返した。

反復実験ごとに１分のインキュベーション時間で二つの画像、一つは充填前のフィルタの画像、もう一つは充填後の画像を撮った。４回の反復実験を得た。

試料液体で満たす前のチップは、溜めＲ２ではオレンジ色の未反応パッドを有し、Ｒ３又はＲ４では色はなかった。ヘモグロビン試料で満たしたのち、ヘモグロビンに対する指示薬染料の青色がＲ２に見られた。実験の最後で回転速度を１，２００rpmに増すことにより、液体試料を溜めＲ４に輸送した。

さらなる実験では、アルブミン試薬ろ紙を図１の設計の溜めＲ４に入れ、試験を繰り返した。

反復実験ごとに１分のインキュベーション時間で二つの画像、一つは充填前のフィルタの画像、もう一つは充填後の画像を撮った。４回の反復実験を得た。

試料液体で満たす前のチップは、溜めＲ４では未反応パッドを有し、Ｒ３又はＲ２又はＲ５では色はなかった。アルブミン試料で満たしたのち、アルブミンに対する指示薬染料の青色がＲ４に現れた。実験の最後で回転速度を１，２００rpmに増すことにより、液体試料を溜めＲ５に輸送した。

上記例に置き換えて、本発明のチップで使用することができる種々の試薬法がある。試薬は、発生するシグナルの強さが臨床標本で計測される分析対象物の濃度に比例する変化を起こす。これらの試薬は、指示薬染料、金属、酵素、ポリマー、抗体及び支持体に乾着した種々の他の薬品を含有する。よく使用される支持体は、種々の試料吸収及び輸送性を有する紙、膜又はポリマーである。これらを本発明のチップの試薬溜めに導入すると、試薬試験片を使用する分析で遭遇する問題を解決することができる。

試薬試験片は、一つの試薬区域しか使用せずに、分析対象物に対する色応答を生成するために必要なすべての薬品を含有することができる。乾燥試薬試験片で起こる典型的な化学反応は、染料結合、酵素的、免疫学的、ヌクレオチド、酸化的又は還元的な化学反応として分類することができる。場合によっては、一定時期に発生するように仕組まれた最大５種の競合する化学反応が一つの試薬層の中で発生し、尿中の血液を検出する方法が、一つの試薬の中で発生する多数の化学反応の一例である。分析対象物検出反応は、ジイソプロピルベンゼンジヒドロペルオキシドによる指示薬３，３′，５，５′−テトラメチル−ベンジジンの酸化を触媒するヘモグロビンのペルオキシダーゼ様活性に基づく。同じパッドで、アスコルビン酸干渉を除去するため、ジイソプロピルベンゼンジヒドロペルオキシドによるアスコルビン酸の酸化を触媒する第二鉄ＨＥＴＤＡ錯体の触媒活性に基づく第二の反応が起こる。

１種の分析対象物を計測するために多数の試薬層がしばしば使用される。化学試薬系が別々の試薬層に配置され、反応分離工程、たとえばクロマトグラフィー及びろ過を提供する。全血グルコース試験片は、色生成層に干渉する無傷の赤血球を閉じ込めるために多数の試薬区域を使用することが多い。免疫クロマトグラフィー試験片は、別々の試薬区域で起こる化学反応で構成されている。ヒト柔毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）又はアルブミンの検出が、四つの試薬区域を有する試験片の適用例である。試験片の先端の第一の試薬は、試料塗布のためであり、次の反応区域と重なり合って、第一の試薬区域への特許試料（尿）の移動を提供する。そして、処理された試料は、発色のための反応体が固定化されている第三の試薬を横切って移動する。この移動は、過剰な標本を吸収する第四の試薬区域によって駆動される。試験又は捕捉区域と呼ばれる第三の試薬区域、典型的にはニトロセルロース膜では、クロマトグラフィー反応が起こる。第一及び第二の層では、分析対象物特異的抗体が標本中の分析対象物と反応し、クロマトグラフィーによってニトロセルロース膜に移される。抗体は、標識としての色付きラテックス粒子に結合している。試料が分析対象物を含有するならば、その分析対象物が標識抗体と反応する。捕捉区域では、第二の抗体がバンドに固定化され、分析対象物が存在するとき、粒子を捕捉する。色付きの試験ラインが形成される。また、対照ラインが粒子と反応して色を形成することを可能にするため、第二の試薬バンドが捕捉区域に固定化されている。試験系が正しく作動しているとき、患者試料中のｈＣＧの非存在においてさえ、対照ラインにおける色は常に形成する。このような多工程分析は、所望の分析を実施するための適切な試薬が設けられた試薬溜めを有する本発明のチップに移すことができる。

上記アルブミン分析は、他の方法によって実施することもできる。タンパク質、たとえばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、γ−グロブリン（ＩｇＧ）及びベンスジョーンズ（ＢＪＰ）タンパク質は、多様な方法で測定することができる。もっとも簡単な方法は、タンパク質と結合するときの染料の変色に頼る染料結合法である。多くの染料が使用されている。例は、２（４−ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸［ＨＡＰＡ］、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクレゾールブルー、ブロモフェノールブルー、テトラブロモフェノールブルー、ピロガロールレッド及びビス（３′，３″−ジヨード−４′，４″−ジヒドロキシ−５′，５″−ジニトロフェニル）−３，４，５，６−テトラブロモスルホンフタレイン染料（ＤＩＤＮＴＢ）である。多様な基板上での電気泳動を使用してアルブミンを他のタンパク質から単離したのち、アルブミン画分を染色し、続いて清澄化及びデンシトメトリーを実施した。ここで使用される染料の例は、ポンソーレッド、クリスタルバイオレット、アミドブラックである。低濃度のタンパク質、すなわち１０mg/L未満の範囲のアルブミンの場合、免疫学的検定、たとえば免疫比濁法がしばしば使用される。

分析対象物を第一の溜めで試薬と反応させたのち、反応した試薬をさらなる反応のために第二の溜めに送る分離工程が可能である。加えて、試薬を第一の溜めに再懸濁させ、反応のために第二の溜めに移動させることができる。分析対象物又は試薬は、第一又は第二の溜めに閉じ込めることができ、遊離試薬対結合試薬の測定を実施することができる。

遊離試薬対結合試薬の測定は、マルチゾーンイムノアッセイ及び核酸検定に特に有用である。この装置に適合させることができ、許容しうる例である種々のタイプのマルチゾーンイムノアッセイがある。イムノクロマトグラフィーアッセイの適合の場合、試薬フィルタは別々の溜めに配置され、クロマトグラフィーの力が作用しないため、物理的に接触する必要はない。細菌、たとえばグラム陰性種（たとえばE. Coli、Entereobacter、Pseudomonas、Klebsiella）及びグラム陽性種（たとえばStaphylococcus Aureus、Entereococc）の検出のためのイムノアッセイ又はＤＮＡ検定を開発することができる。イムノアッセイは、完全なパネルのタンパク質及びペプチド、たとえばアルブミン、ヘモグロビン、ミオグロブリン、α−１−ミクログロブリン、イムノグロブリン、酵素、糖タンパク質、プロテアーゼ阻害剤及びサイトカインのために開発することができる。たとえば、GreenquistのＵＳ４８０６３１１、Multizone analytical Element Having Labeled Reagent Concentration Zone、１９８９年２月１１日、LiottaのＵＳ４４４６２３２、Enzyme Immunoassay with Two-Zoned Device Having Bound Antigens、１９８４年５月１日を参照。

例２
乾燥試薬の再懸濁の実証
調製
フェノールレッド溶液（０．１Ｍ ＰＢＳ塩水、ｐＨ７．０中０．１％ｗ／ｗ）５μlを図１のチップ設計の溜めＲ３に計量分配し、真空オーブン中、４０℃で１時間乾燥させた。次に、実験の前に、チップを接着性のふたで覆った。ＭＡＳ−１緩衝溶液の試料を溜めＲ１に配置し、前記と同様に５００rpmで遠心処理することによって溜めＲ３に移した。

乾燥後、フェノールレッドを延展し、溜めＲ３の全体を覆った。Ｒ３をＭＡＳ−１緩衝剤で満たしたのち、フェノールレッドをほぼ瞬間的に再懸濁させ、Ｒ３から移動させることができた。

フェノールレッド原液１０μlを３mmフィルタディスク（ＯＢフィルタ）に計量分配し、上記のようにオーブン中で乾燥させた。乾燥後、フィルタをＲ２に配置し、次いで、溜めＲ１をＭＡＳ−１緩衝剤で満たし、液体を溜めＲ２に移した。

液体試料で満たす前、チップは着色されていなかった。フェノールレッドを延展し、溜め全体を覆った。Ｒ３をＭＡＳ−１緩衝剤で満たしたのち、フェノールレッドをほぼ瞬間的に再懸濁させ、溜めＲ５に完全に移すことができた。

上記例のように乾燥試薬が再可溶化される潜在的な用途は以下を含む。

・ろ過
・沈降分析
・細胞溶解
・細胞選別（集団差）：遠心分離
・固相（たとえばマイクロビーズ）における試料分析対象物の富化（濃縮）を使用して感度を改善することができる。富化されたマイクロビーズは、連続遠心処理によって分離することができる。
・多重化を使用して（たとえば多様な試薬チャンバの並列的及び／又は逐次的計量）多数のチャネルそれぞれが別個の画定された結果を出すことを可能にする。多重化は、入口に流動的に接続された多数の計量毛管ループを含む毛管アレイによって実施することもできるし、各計量毛管ループに接続された計量分配チャネル及び／又は毛管ストッパのアレイによって実施することもできる。
・第二の力、たとえば磁力との組み合わせをチップ設計に使用することができる。試薬の支持体として使用される、又は試料成分、たとえば分析対象物もしくは干渉物質を捕捉するために使用される粒子、たとえば磁気ビーズ。物性、たとえば密度による粒子の分離（分画と同様）

例３
図４ｊは、尿を分析するために使用することができるチップを示す。溜め６及び８は、分析に使用される試薬を含み、溜め３は、試料流体を受けるために使用され、溜め２は、洗液を受けるために使用される。溜め３は親水性試料ループＬに接続され、溜め４は疎水性毛管通路によって溜め２に接続されている。

溜め６は、遮断及び緩衝成分、特に分析対象物（試料中の、検出される成分）に対する抗体（青色のラテックス粒子に付着している）及び分析対象物に対する異なる抗体（フルオレセインで標識されている）を含有する繊維状パッドを含む。この例では、分析対象物はヒト柔毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）である。これは溜め６中の両方の抗体と反応する。

溜め８は、フルオレセインに対する抗体が不可逆的に結合しているニトロセルロースパッドを含む。抗体は、溜め６から溜め８に移されるフルオレセインと反応する。

尿試料が溜め３に加えられ、それが通気口Ｖ３とＶ４との間の親水性毛管通路のセグメントを満たし、親水性ストッパ５で止まり、それにより、分析される試料の所定量を確立する。溜め２は、溜め８からのｈＣＧ分析対象物に結合していない青く着色されたラテックス粒子を除去するための洗液、たとえば緩衝塩溶液で満たされる。チップは、適切な速度、通常は約５００rpmでスピンさせて、画定された量の試料をストッパ５に通過させて溜め６に流入させる。同時に、洗液が溜め２から溜め４に流入する。

溜め６中のパッド中の成分が再懸濁し、両方の抗体が試料中の分析対象物に結合するように十分なインキュベーション時間を経過させる。その後、チップをより高いrpm（約１，０００rpm）でスピンさせて、液体を、溜め６から溜め８まで、それらを接続する疎水性通路に通して移す。

フルオレセイン標識された分析対象物抗体が、溜め８に含まれるフルオレセインに対する抗体に結合するためのさらなるインキュベーション時間を可能にする。したがって、分析対象物（ｈＣＧ）は両方の抗体に結合しているため、青く着色されたラテックスもまた、溜め８中の繊維状パッドに付着している。このとき、分析対象物の量を示す青色が溜め８中に存在するが、精度を改善するため、ここで溜めを洗浄する。

チップを、より高いrpm（約２，０００）で三たびスピンさせて、洗液を溜め４から溜め８、さらには溜め９に移す。同時に、すべての未結合液体が溜め８から溜め９に移される。この工程ののち、溜め８中の色は、例１で使用したカメラ手段により、より容易に計測することができる。色は、試料中の分析対象物の濃度、すなわち、溜め６中の分析対象物に結合した、青く着色されたラテックス粒子の量に比例する。

本発明の一つの分析装置を示す図である。 本発明の第二の分析装置を示す図である。 疎水性の毛管ストッパを示す図である。 親水性の毛管ストッパを示す図である。 本発明の多目的分析装置を示す図である。 図４ａの多目的装置を使用して提供することができる代表的な構造を示す図である。 図４ａの多目的装置を使用して提供することができる代表的な構造を示す図である。 図４ａの多目的装置を使用して提供することができる代表的な構造を示す図である。 図４ａの多目的装置を使用して提供することができる代表的な構造を示す図である。 図４ａの多目的装置を使用して提供することができる代表的な構造を示す図である。 図４ａの多目的装置を使用して提供することができる代表的な構造を示す図である。 図４ａの多目的装置を使用して提供することができる代表的な構造を示す図である。 図４ａの多目的装置を使用して提供することができる代表的な構造を示す図である。 図４ａの多目的装置を使用して提供することができる代表的な構造を示す図である。 最大１０個の試料を分析することができる分析装置を示す図である。

Claims (12)

1. 一定量の液体試料を計量分配し、分析するためのマイクロ流体装置であって、
   液体試料を受け、伝送するための試料溜めと、
   試料溜めから液体試料の一部を受けるために試料溜めと流体連通し、その中の互いに異なる二点の間に第一の所定の体積を有するセグメントを含む親水性毛管通路と、
   親水性毛管通路のセグメントを画定する親水性毛管通路内の二点から雰囲気に繋がる二つの通気孔と、
   その中で液体試料が処理される第一試薬溜めと、
   親水性毛管通路のセグメントと試薬留めの間を液的に連絡する移動親水性毛管通路と、
   親水性毛管通路のセグメントと第一試薬溜めの間の移動親水性毛管通路内に配置され、液体試料の移動を妨げる抵抗を有する親水性毛管ストッパであって、セグメントから親水性毛管ストッパまでの移動親水性毛管通路に沿った長さは第二の所定の体積を画定し、圧力、真空、又は電気浸透を用いた力の印加によって抵抗が打ち負かされるまで液体試料の通過を防ぎ、抵抗が液体試料によって打ち負かされると、二つの通気孔から空気が流入し、第一の所定の体積と第二の所定の体積の和に等しい一定量の液体試料が第一試薬溜めに移動するストッパと、
   を含む装置。
2. 一定量の液体試料を計量分配し、分析するためのマイクロ流体装置であって、
   液体試料を受け、伝送するための試料溜めと、
   試料溜めから液体試料の一部を受けるために試料溜めと流体連通し、その中の互いに異なる二点の間に第一の所定の体積を有する親水性毛管通路内のセグメントを含む親水性毛管通路と、
   親水性毛管通路のセグメントを画定する二点から雰囲気に繋がる二つの通気孔と、
   その中で液体試料が処理される第一試薬溜めと、
   親水性毛管通路のセグメントと試薬留めの間を液的に連絡する移動親水性毛管通路と、
   親水性毛管通路のセグメントと第一試薬溜めの間の移動親水性毛管通路内に配置され、液体試料の移動を妨げる抵抗を有する疎水性毛管ストッパであって、セグメントから疎水性毛管ストッパまでの移動親水性毛管通路に沿った長さは第二の所定の体積を画定し、圧力、真空、又は電気浸透を用いた力の印加によって抵抗が打ち負かされるまで液体試料の通過を防ぎ、抵抗が液体試料によって打ち負かされると、二つの通気孔から空気が流入し、第一の所定の体積と第二の所定の体積の和に等しい一定量の液体試料が第一試薬溜めに移動するストッパと、
   を含む装置。
3. 親水性毛管通路を介して第一試薬溜めと液的に連絡している少なくとも一つの第二試薬溜めを含む、請求項１又は２に記載の装置。
4. 親水性毛管通路を介して第二試薬溜めの少なくとも一つと液的に連絡している少なくとも一つの第三試薬溜めを含む、請求項３に記載の装置。
5. 第一試料溜めは一定量の液体試料に含まれる成分と反応するように適合されている試薬を含む、請求項１乃至４に記載の装置。
6. 第一試料溜めは一定量の液体試料に含まれる成分と反応するように適合されている試薬を含み、それによって液体試料中の成分の量を示す応答を生成する、請求項５に記載の装置。
7. 第一試料溜めは一定量の液体試料に含まれる成分と反応し、それによって検出される液体試料中の成分の第二成分に対する干渉を減ずるように適合されている試薬を含む、請求項５に記載の装置。
8. 第一試料溜めは試料液体を前処理するように適合されている試薬を含む、請求項５乃至７に記載の装置。
9. 第一試料溜めは液体試料中の成分と反応し、それによって反応後成分を生成するように適合され試薬を含む、請求項５乃至８に記載の装置。
10. 親水性毛管通路を介して第一試薬溜めと液的に連絡している少なくとも一つの第二試薬溜めを含み、反応後成分はさらに第二試料溜め中で反応し、液体試料中の反応後成分の量を示す応答を生成する、請求項５乃至９に記載の装置。
11. 親水性毛管通路は壁を含み、その壁は液体試料を実質的に完全に排除するように構成された親水性表面を含む、請求項１乃至１０に記載の装置。
12. 液体試料の性質を計測するために第一試料溜め中に配置された電極を含む、請求項１乃至１１に記載の装置。

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