KR101519379B1 - 원심력 기반의 미세유동장치 및 이를 이용한 면역분석방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 원심력 기반의 미세유동장치 및 이를 이용한 면역분석방법에 관한 것으로서, 란탄족(III) 킬레이트를 포함하는 나노입자를 표지물질로 사용하고, 표지물질의 광학적 특성을 측정하는데 있어서, 시간분해형광측정법을 사용함으로써, 광학적 특성 측정의 정확도 및 민감도를 향상시킬 수 있다.

Description

원심력 기반의 미세유동장치 및 이를 이용한 면역분석방법{Centrifugal Micro-fluidic Device and Method for immunoassay}

본 발명은 원심력 기반의 미세유동장치 및 이를 이용한 면역분석방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 형광나노입자를 이용하여 유체시료 내 분석대상물질을 검출하는 미세유동장치 및 이를 이용한 면역분석방법에 관한 것이다.

미세유동장치는 소량의 유체를 조작하여 생물학적 또는 화학적인 반응을 수행하는데 사용되는 장치이다.

일반적으로 미세유동장치에서 하나의 독립적인 기능을 수행하는 미세유동구조물은 유체를 가두어 둘 수 있는 챔버와, 유체가 흐를 수 있는 채널 및 유체의 흐름을 조절할 수 있는 밸브를 포함하고, 이들의 다양한 조합에 의해 만들어질 수 있다. 소형의 칩(chip) 상에서 생물학적 또는 화학적인 반응을 포함한 시험을 수행할 수 있도록 칩형태의 기판에 이러한 미세유동 구조물을 배치하고 여러 단계의 처리 및 조작을 수행할 수 있도록 제작된 장치를 랩온어칩(lab-on-a chip)이라 한다. 미세유동구조물 내에서 유체를 이송하기 위해서는 구동 압력이 필요한데, 구동 압력으로서 모세관압이 이용되기도 하고, 별도의 펌프에 의한 압력이 이용되기도 한다. 최근에는 디스크 형상의 플랫폼에 미세유동 구조물을 배치하고 원심력을 이용하여 유체를 이동시키며 일련의 작업을 수행하는 디스크형 미세유동장치들이 제안되고 있다. 이를 일컬어 랩씨디(Lab CD) 또는 랩온어디스크(Lab-on a disk)라 하기도 한다. 원심력을 기반으로 하여 디스크형 플랫폼 내에서 필요한 작업을 빠르고 정확하게 수행할 수 있는 다양한 디스크형 미세유동장치를 제공하기 위한 노력이 계속되고 있다.

그러나 종래의 디스크형 미세유동장치를 이용한 일반적인 임상 실험실에서 사용하는 면역검사방법의 검사절차는 복잡하여 오랜 검사시간이 소요되는 문제점이 있다.

본 발명은 분석대상물질의 보다 정확한 측정 및 분석을 달성할 수 있는 분석방법을 제공하기 위해, 형광나노입자를 이용하여 유체시료 내 분석대상물질을 검출하는 미세유동장치 및 이를 이용한 면역분석방법을 제공한다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 유체시료를 수용하는 시료 챔버, 적어도 한 종류의 표지 접합체를 수용하는 제1 반응 챔버, 제1 반응 챔버와 연결되며, 포획 바인더를 수용하는 제2 반응 챔버, 제2 반응 챔버와 연결되며, 용출버퍼(elution buffer)를 수용하는 버퍼 챔버, 표지 접합체를 최종적으로 수용하는 검출 챔버, 챔버들을 연결하는 채널, 및 채널의 개폐를 위한 밸브를 포함하는 적어도 하나의 미세유동구조물 및 적어도 하나의 검출부를 포함하는 미세유동장치를 제공한다.

표지 접합체의 표지는 란탄족(III) 킬레이트 또는 란탄족(III) 킬레이트를 함유 하는 나노 입자, 착색 고분자(colored polymeric) 나노입자, 형광(fluorescent)물질 또는 형광 물질을 함유하는 나노입자, 인광(phosphorescent) 물질 또는 인광물질을 함유하는 나노입자, 색소 함유 리포좀, 효소(enzyme, HRP, ALP etc.), 초자성 물질(super para-magnetic) 또는 초자성 물질 함유 나노입자, 금속 나노입자 (metal nanoparticle), 카본 나노입자로 구성되는 군에서 선택되는 어느 한 물질일 수 있다.　

또한, 표지 접합체는 건조된 고체 상태일 수 있다.

또한, 표지 접합체는 광학적 신호발현에 필요한 표지를 포함하고, 유체시료 내의 분석대상물질과 특이적으로 결합할 수 있다.

또한, 표지 접합체는 여러 종류의 분석대상물질을 동시에 검출하기 위해 각기 다른 종류의 표지물질을 포함하는 적어도 한 종류의 표지 접합체일 수 있다.

또한, 표지 접합체는 바인더(binder)와 표지(label)로 구성되며, 바인더는 항체, 항원, 리셉터,　리간드,　올리고뉴클레오타이드, 합텐(hapten)　또는 압타머(aptamer)를 포함할 수 있다.

포획 바인더는 표지 접합체의 분석대상물질과의 반응 부위와 다른 반응 부위에 특이적으로 결합할 수 있다.

또한, 포획　바인더는 항체, 항원, 리셉터, 올리고뉴클레오타이드,　합텐(hapten)　또는 압타머(aptamer)를 포함할 수 있다.

제2 반응 챔버는 포획 바인더가 고정 배치될 수 있는 검출 영역을 포함할 수 있다.

미세유동장치는 제1 반응 챔버와 연결되고, 유체시료를 원심분리하여 분석대상물질을 포함하는 상청액을 분리하는 분리 챔버를 더 포함할 수 있다.

검출부는 미세유동구조물의 외부에 배치되고, 미세유동구조물의 검출 챔버에 빛을 조사하는 발광부, 발광부로부터 조사된 빛을 흡수한 검출 챔버가 방출하는 빛을 수신하는 수광부 및 수광부가 수신한 빛의 광학적 특성을 분석하여 분석대상물질의 농도를 산출하는 분석부를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 원심력 기반의 미세유동장치를 이용한 면역분석방법으로서, 유체시료를 미세유동장치에 주입하고 원심분리하여 얻어진 상청액을 제1 반응 챔버로 이송하고, 상청액 내의 분석대상물질에 제1 반응 챔버 내의 표지 접합체를 결합시킴으로써 1차 면역 복합체를 형성한 후, 1차 면역 복합체에 제2 반응 챔버 내의 포획 바인더를 결합시킴으로써 2차 면역 복합체를 형성하며, 버퍼 챔버로부터 이송된 용출버퍼에 의해 2차 면역 복합체로부터 해리된 표지 접합체를 검출 챔버로 이송하고, 미세유동장치의 외부에 배치된 검출부가 　검출 챔버로 이송된 　표지 접합체의 형광성을 측정하여, 분석대상물질의 농도를 산출하는 원심력 기반의 미세유동장치를 이용한 면역분석방법을 제공한다.

표지 접합체의 표지는 란탄족(III) 킬레이트 또는 란탄족(III) 킬레이트를 함유 하는 나노 입자, 착색 고분자(colored polymeric) 나노입자, 형광(fluorescent)물질 또는 형광 물질을 함유하는 나노입자, 인광(phosphorescent) 물질 또는 인광물질을 함유하는 나노입자, 색소 함유 리포좀, 효소(enzyme, HRP, ALP etc.), 초자성 물질(super para-magnetic) 또는 초자성 물질 함유 나노입자, 금속 나노입자 (metal nanoparticle), 카본 나노입자로 구성되는 군에서 선택되는 어느 한 물질일 수 있다.

또한, 표지 접합체는 건조된 고체 상태일 수 있다.

또한, 표지 접합체는 광학적 신호발현에 필요한 표지를 포함하고, 유체시료 내의 분석대상물질과 특이적으로 결합할 수 있다.

또한, 표지 접합체는 여러 종류의 분석대상물질을 동시에 검출하기 위해 각기 다른 종류의 표지물질을 포함하는 적어도 한 종류의 표지 접합체일 수 있다.

또한, 표지 접합체는 바인더(binder)와 표지(label)로 구성되며, 바인더는 항체, 항원, 리셉터, 리간드, 올리고뉴클레오타이드, 합텐(hapten)　또는 압타머(aptamer)를 포함할 수 있다.

포획　바인더는 표지 접합체의 분석대상물질과의 반응 부위와 다른 반응 부위에 특이적으로 결합할 수 있다.

또한, 포획 바인더는 항체, 항원, 리셉터, 올리고뉴클레오타이드, 합텐(hapten)　또는 압타머(aptamer)를 포함할 수 있다.

제2 반응 챔버는 　포획 바인더가 고정배치될 수 있는 검출 영역을 포함할 수 있다.

유체시료, 상청액 또는 버퍼는 미세유동구조물의 회전으로 인한 원심력을 구동압력으로 하여 이송될 수 있다.

표지 접합체의 형광성의 측정은 측정시간을 미세하게 분할하여 수광부가 수신한 빛의 형광성(Fluorescence)을 측정시간 동안 측정하는 시간분해형광측정법(Time-resolved fluorescence measurement)을 이용할 수 있다.

　수광부가 수신한 빛의 형광성은 바로 측정되지 않고 일정한 딜레이 타임(delay time)을 거친 뒤 측정될 수 있다.

본 발명에 따른 미세유동장치 및 이를 이용한 면역분석방법은 ⅰ)복수의 표지물질을 각각 포함하는 복수의 표지 접합체를 동시에 사용함으로써 복수의 분석대상물질을 동시에 검출할 수 있도록 하였고, ⅱ)표지 접합체를 건조된 고체상태로 사용하여 냉장보관이 아닌 실온보관을 가능하게 함으로써, 실제 임상환경에서의 사용성을 향상시켰으며, ⅲ)세척횟수, 채널의 개폐에 사용되는 밸브의 수 및 사용되는 버퍼의 수를 감소시킴으로써 복잡하던 종래의 검사절차를 보다 간단하게 하였고, ⅳ)여기파장(Excitation wavelength)과 방출파장(Emission wavelength)에 있어서 큰 차이를 보이는 형광특성을 가지고 있는 란탄족(III) 킬레이트를 포함하는 나노입자를 표지물질로 사용하고, 시간분해형광측정법(Time-resolved fluorescence measurement)을 통해 방출광의 형광성을 측정함으로써 표지물질의 형광성 측정의 정확도 및 민감도를 크게 향상시켰다.　따라서 본 발명에 따른 미세유동장치 및 이를 이용한 면역분석방법은 신속한 현장검사법으로 활용 가능하다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 미세유동구조물의 구조를 개략적으로 도시한 개략도
도 2a 내지 도 2d는 본 발명의 일 실시예에 의한 분석대상물질과 표지 접합체 및 포획 바인더의 결합 과정을 설명하기 위한 개념도
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 면역분석방법의 순서도
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 검출부를 설명하기 위한 블럭도
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 표지물질의 광학적 특성을 나타낸 그래프
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 시간분해형광측정법을 설명하는 그래프
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 표준곡선을 나타내는 그래프

이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 일 실시예에 따른 원심력 기반의 미세유동장치 및 이를 이용한 면역분석방법을 상세하게 설명한다.

　

도면에서 동일한 도면 부호는 동일한 구성 요소를 나타낸다. 도시된 챔버 및 채널 등의 구조물은 그 형상이 단순화되고, 그 크기의 비가 실제와 달리 확대되거나 축소된 것일 수 있다. 미세유동장치(microfluidic device), 미세 입자(micro-particle) 등의 표현에서 '마이크로(micro-)'는 매크로(macro-)에 대비되는 의미로 사용된 것일 뿐 크기 단위로서 한정적으로 해석되어서는 안 될 것이다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유동구조물의 구조를 개략적으로 도시한 개략도이다. 　

본 발명의 일 실시예에 따르면, 회전체(900), 유체시료를 수용하는 시료 챔버(100), 유체시료를 원심분리하여 분석대상물질을 포함하는 상청액을 분리하는 분리 챔버(200), 표지 접합체를 수용하는 제1 반응 챔버(300), 포획　바인더를 수용하는 제2 반응 챔버(400), 용출버퍼(elution buffer)를 수용하는 버퍼 챔버(500), 결합하지 못한 표지 접합체, 분석대상물질 및 과량의 1차 면역 복합체 등을 포함하는 불순물들를 수용하는 웨이스트 챔버(600), 세척액을 수용하는 세척액 챔버(700), 표지 접합체를 최종적으로 수용하는 검출 챔버(800), 챔버들을 연결하는 채널 및 채널의 개폐를 위한 밸브를 포함하는 적어도 하나의 미세유동구조물(1000) 및 적어도 하나의 검출부(10)를 포함하는 미세유동장치를 제공한다.

　

도 1을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에서 사용된 회전체(900)는 원형의 디스크 형상의 플랫폼(platform)일 수 있다. 그러나 플랫폼은 디스크 형상으로 한정되는 것은 아니다. 그 자체로서 회전 가능한 온전한 원판 형상뿐만 아니라 회전 가능한 프레임(frame)에 안착되어 회전할 수 있는 부채꼴 등의 형상일 수도 있다. 플랫폼은 성형이 용이하고, 그 표면이 생물학적으로 비활성인 아크릴 등의 플라스틱 소재로 만들어질 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니고, 화학적, 생물학적 안정성과 광학적 투명성 그리고 기계적 가공성을 가지는 소재이면 족하다.

플랫폼은 바람직하게는, 플라스틱, PMMA(Polymethylmethacrylate), 유리, 운모, 실리카, 실리콘 웨이퍼의 재료 등의 다양한 재료로부터 선택될 수 있다. 　특히, 플라스틱이 경제적 이유, 가공의 용이성 때문에 선호된다. 사용 가능한 플라스틱 재료로는 폴리프로필렌, 폴리아크릴레이트, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트 등을 들 수 있다.

플랫폼에는 하나 또는 다수의 미세유동구조물이 마련될 수 있다. 예를 들면, 플랫폼을 수 개의 영역으로 나누고 각 영역마다 서로 독립적으로 작동되는 미세유동구조물이 마련될 수 있다.

또한 플랫폼은 여러 층의 판으로 이루어질 수 있다. 판과 판이 서로 마주보는 면에 챔버나 채널 등에 해당하는 음각 구조물을 만들고 이들을 접합함으로써 플랫폼 내부에 공간과 채널을 제공할 수 있다. 판과 판의 접합은 접착제나 양면 접착 테이프를 이용한 접착이나 초음파 융착 등 다양한 방법으로 이루어질 수 있다.

또한, 본 명세서에서 '미세유동구조물'이란 특정한 형태의 구조물을 지칭하는 것이 아니라, 다수의 챔버와 채널 그리고 밸브로 이루어져 유체 유동을 수반하는 구조물을 포괄적으로 지칭한다. 따라서, '미세유동구조물'은 챔버와 채널 및 밸브의 배치 상의 특징 및 그 내부에 수용되어 있는 물질의 종류에 따라 각기 다른 기능을 수행하는 유닛을 구성할 수 있다.

따라서, 미세유동장치는 다양한 화학화합물의 검출 및 이를 통한 환경 유해 물질의 검출, 혈액분석, 소변검사, 항원-항체 반응을 통한 면역검사, 리간드-리셉터 결합을 통한 신규 약물 후보물질의 탐색, DNA/RNA 분석 등 다양한 분야에 폭넓게 이용될 수 있다. 또한, 2개 이상의 분석대상물질을 동시에 검출 및 분석할 수 있다.

　

회전체(900)의 회전으로 인한 원심력을 구동압력으로 하여 혈액샘플 등의 유체시료, 유체시료의 상청액, 버퍼 등이 각 챔버로 이동될 수 있다.

유체시료가 시료 주입구(110)를 통해 미세유동구조물(1000)에 주입되면, 유체시료는 시료 챔버(100)에 수용된다.

시료 챔버(100)는 혈액 등의 유체 상태의 시료를 수용하기 위한 공간을 제공한다. 시료 챔버(100)는 시료를 주입하기 위한 시료 주입구(110)와, 시료가 수용되는 수용부를 구비한다. 수용부에는 분리 챔버(200)와 연결되는 배출구가 마련되어 있다. 도면에는 도시되지는 않았지만, 배출구는 원심력이 작용하지 않을 때에는 유체시료가 분리 챔버(200)로 이동되지 않도록 모세관압력을 형성할 수 있는 형태를 가질 수 있다. 또는, 배출구에 유체시료의 흐름을 통제하기 위한 밸브가 설치될 수도 있다. 또한, 시료 주입구(110)로부터 배출구쪽으로 갈수록 단면크기가 점점 증가하도록 형성하여, 원심력에 의하여 수용부에 수용된 시료가 분리 챔버(200)로 용이하게 유입될 수 있도록 할 수 있다. 시료 주입구(110)와 수용부 사이에는 시료 주입구(110)를 통하여 주입되는 시료의 주입압력에 의하여 수용부로 　시료가 흘러가도록 하는 한편, 수용부에 도달된 시료가 다시 시료 주입구(110) 쪽으로 역류하지 않도록 하기 위하여 모세관 압력을 형성할 수 있는 구조물, 즉 소정 크기 이상의 압력이 작용하는 경우에만 시료를 통과시키는 모세관 밸브의 역할을 하는 구조물이 설치될 수 있다.

유체시료는 회전체(900)의 회전으로 인한 원심력을 구동압력으로 하여 시료 챔버(100)보다 회전체(900)의 중심에서 방사상으로 더 먼 곳에 배치되어 있는, 즉 시료 챔버(100)의 하류에 배치되어 있는 분리 챔버(200)로 이송된다. 분리 챔버(200)는 유체시료를 상청액(예를 들면, 혈청, 혈장 등)과 침강물(예를 들면, 혈구 등)로 원심분리하기 위한 구조물이다. 유체시료는 분리 챔버(200)에서 회전체(900)의 회전으로 인한 원심력에 의해 원심분리되어 분석대상물질을 포함한 상청액과 그 외의 침강물로 분리된다.

유체시료의 원심분리를 위한 분리 챔버(200)는 다양한 형태로 구성될 수 있다. 분리 챔버(200)는 상청액 수집부(미도시)와, 상청액 수집부의 말단에 위치되어 비중이 큰 침강물을 수집하는 공간인 침강물 수집부(미도시)를 포함할 수 있다. 상청액 수집부에는 원심분리된 상청액을 제1 반응 챔버(300)로 분배하기 위한 채널이 마련되어 있다. 밸브는 채널을 통한 시료의 흐름을 제어한다. 밸브는 다양한 형태의 미세유동밸브가 채용될 수 있다. 예로서, 밸브는 외부로부터 동력을 전달받아 개방되기 전에는 유체가 흐를 수 없도록 채널을 폐쇄하고 있는, 소위 폐쇄된 밸브(normally closed valve)일 수 있다.

분리 챔버(200)에는 상청액의 양을 계량하기 위한 상청액 계량부가 포함될 수 도 있다(미도시). 상청액 계량부는 검사에 필요한 양의 상청액을 수용할 수 있는 용적을 가질 수 있다.

　

분석대상물질을 포함하고 있는 상청액은 회전체(900)의 회전으로 인한 원심력을 구동압력으로 하여 분리 챔버(200)로부터 채널을 통해 제1 반응 챔버(300)로 이송된다. 제1 반응 챔버(300)에는 표지 접합체가 수용되어 있다(도 2a 참조).

제1 반응 챔버(300)는 항원-항체 반응, 리간드-리셉터 결합 등을 이용하여 상청액에 포함된 특정 단백질, 포도당, 콜레스테롤, 요산, 크레아티닌, 알코올 등을 검출하기 위한 구조물이다.

표지 접합체는 표지(label)와 바인더(binder)로 구성된다. 표지로는 라텍스 비드(Latex bead), 골드 콜로이드, 실버 콜로이드 등과 같은 금속 콜로이드(Metal colloid), 효소(enzyme; HRP, ALP etc.), 유색 물질, 형광(fluorescent)물질 또는 형광 물질을 함유하는 나노입자, 인광(phosphorescent) 물질 또는 인광물질을 함유하는 나노입자,　야광 물질, 발광 물질, 색소 함유 리포좀, 금속 나노입자 (metal nanoparticle), 카본 나노입자, 착색 고분자(colored polymeric) 나노입자, 초자성 물질(super para-magnetic) 또는 초자성 물질 함유 나노입자,　란탄족(III) 킬레이트 또는 란탄족(III) 킬레이트를 함유 하는 나노 입자　또는 방사능 동위원소 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는 란탄족(III) 킬레이트를 포함하는 나노 입자를 표지물질로 사용한다. 표지물질로 사용되는 란탄족(III) 킬레이트에는 유로피움(Eu), 사마리움(Sm), 디스프로시움(Dy) 또는 터비움(Tb)등이 있다. 바인더로는 상청액 내의 분석대상물질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 항원, 리간드, 리셉터, 올리고뉴클레오타이드, 합텐(hapten) 또는 압타머(aptamer) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 미세유동장치의 제1 반응 챔버(300)에는 한 종류의 분석대상물질을 검출하기 위해 한 종류의 표지물질을 포함하는 단일의 표지 접합체만 수용될 수도 있고, 뿐만 아니라, 여러 종류의 분석대상물질을 동시에 검출하기 위해 각기 다른 종류의 표지물질을 포함하는 여러 종류의 표지 접합체가 수용될 수 도 있다. 예를 들면, 네 종류의 각기 다른 분석대상물질을 동시에 검출하기 위해, 각 분석대상물질에 대한 표지물질로 상술한 란탄족(III) 킬레이트인 유로피움(Eu), 사마리움(Sm), 디스프로시움(Dy) 또는 터비움(Tb)을 각각 포함하는 네 종류의 표지 접합체를 제1 반응 챔버(300)에 수용시킬 수 있는 것이다.

이렇게 되면 하나의 미세유동구조물(1000)에서 복수의 분석대상물질을 검출할 수 있게 되고, 이런 미세유동구조물(1000)을 하나의 미세유동장치에 복수로 설치함으로써 하나의 미세유동장치에서 종래의 다수의 미세유동장치에서 검출할 수 있는 분석대상물질을 동시에 검출할 수 있게 되는 장점이 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 미세유동장치는 하나의 미세유동장치에서 다수의 분석대상물질을 동시에 검출할 수 있으므로 검사의 신속성과 경제적 측면에서 상당히 큰 효과를 가져오는 바, 신속한 현장 검사법으로서의 활용에 기여할 수 있다.

　

그리고 표지 접합체는 액상 또는 건조된 고체상으로 수용될 수 있는데, 액상으로 이루어진 표지 접합체는 그 안정성을 유지하기 위해 냉장수송 및 냉장보관이 요구되고 이는 실제 임상환경에서의 사용성을 떨어뜨리는 요인으로 작용하므로 건조된 고체상으로 수용되는 것이 바람직하다.

표지 접합체가 건조된 고체상으로 제1 반응 챔버(300)에 수용되는 경우, 표지 접합체는 제1 반응 챔버(300)의 내벽에 또는 다공성 부재 등에 임시 고정되어 있을 수 있다. 즉, 제1 반응 챔버(300)에 고정되어 있는 표지 접합체가 상청액의 침투에 의해 용해되어 표지 접합체와 상청액 내의 분석대상물질이 결합하여 1차 면역 복합체를 형성하고 이는 이동 가능한 상태가 된다. 이 과정에서 표지 접합체와 상청액 내의 분석대상물질이 잘 결합할 수 있도록 회전체(900)를 좌우로 수회 흔들어 주는 것이 가능하다.

　

회전체(900)의 회전으로 인한 원심력을 구동압력으로 하여, 1차 면역 복합체를 포함하는 상청액은 채널을 거쳐 제2 반응 챔버(400)로 이송된다.

제2 반응 챔버(400)는 항원-항체 반응 또는 리간드-리셉터 결합 등을 이용하여 상청액에 포함된 특정 단백질, 포도당, 콜레스테롤, 요산, 크레아티닌, 알코올 등을 검출하기 위한 구조물이다. 　　

제2 반응 챔버(400)는 제1 반응 챔버(300)로부터 이송되는 상청액 내의 분석대상물질과 특이적으로 결합하는 포획 바인더를 검출영역에 고정된 채로 수용하고 있다.

이송된 상청액 내의 1차 면역 복합체는 검출영역에 고정되어 있는 포획 바인더와 결합하게 되고 2차 면역 복합체를 형성하게 된다(도 2b 참조). 이 과정에서 1차 면역 복합체와 포획 바인더 사이의 결합이 잘 이루어질 수 있도록, 회전체(900)를 좌우로 수 회 흔들어 주는 것이 가능하다. 반응액에 포함되어 있는 미반응의 표지 접합체 및 반응 여액들은 세척액 챔버(700)로부터 이송된 세척액에 의해 웨이스트 챔버(600)로 보내지고, 제2 반응 챔버(400)에는 2차 면역 복합체가 남게 된다(도 2c 참조).

상술한 세척과정을 거치고 2차 면역 복합체만 남게 되면, 제2 반응 챔버(400)보다 상류에 위치한 버퍼 챔버(500)로부터 원심력을 구동압력으로 하여 용출버퍼가 제2 반응 챔버(400)로 이송된다. 이송된 용출버퍼는 제2 반응 챔버(400)　내의 검출 영역에 고정된 2차 면역 복합체의 항원-항체 결합 또는 리간드-리셉터 결합을 해리시키고, 이로 인해 표지 접합체와 분석대상물질 모두 고정된 포획 바인더로부터 해리된다. 즉 분석대상물질을 기준으로 표지 접합체와 포획　바인더가 모두 해리되는 것이다(도 2d 참조).

종래의 면역분석방법들은 분석대상물질의 검출 시, ⅰ)면역 복합체로부터 별도로 표지 접합체를 해리시키지 않고 면역 복합체 형태에서 바로 표지물질의 광학적 특성을 측정한다거나, ⅱ)표지물질만을 해리시킨 후, 그 표지물질의 광학적 특성을 측정하는 방식을 사용하였다.

그러나 본 발명은 상술한 것처럼, 버퍼 챔버(500)의 용출버퍼를 사용하여 2차 면역 복합체에서 분석대상물질을 기준으로 표지 접합체와 포획 바인더를 모두 해리시키는 방법을 사용한다(도 2d 참조).

본 발명이 제시하는 이와 같은 방식은 기존의 방식들보다 측정의 민감도 및 정확도를 향상시킬 수 있다. 표지물질만을 해리시키는 종래의 방식은 표지 접합체에 표지물질에 해당하는 하나의 화학물질을 부착시키고, 해리시켜야 하는데 이는 기술적으로 어려운 측면이 있고, 또한 동일한 다수의 표지물질이 하나의 군으로 밀집되어 측정될 때보다 높은 측정의 민감도 및 정확도를 기대하기 어려운 측면도 있다.

또한 면역 복합체로부터 별도의 표지 접합체의 분리없이 면역 복합체 상태에서 바로 표지물질의 광학적 특성을 측정하는 방식 역시, 표지 접합체를 따로 분리시킨 후, 표지물질의 광학적 특성을 측정하는 방식에 비해 측정의 민감도 및 정확도가 떨어질 수밖에 없다. 예를 들면, 면역 복합체가 고정되어 부착되어 있는 물리적인 구조물(예를 들면 비드(bead))또한 표지물질의 광학적 특성의 측정을 위해 조사된 빛을 반사할 수 있기 때문에 표지물질의 광학적 특성의 측정에 방해요인으로 작용할 수 있다.

따라서 본 발명처럼 란탄족(III) 킬레이트(예를 들면, 유로피움(Eu))를 포함하는 나노입자를 표지물질로 사용하는 표지 접합체 및 포획 바인더를 모두 분석대상물질로부터 해리시킨 후, 표지 접합체로부터 표지물질의 광학적 특성을 측정하는 방식은 종래의 방식에 비해 구현이 용이하고 측정의 정확도 및 민감도 또한 향상시킬 수 있는 장점이 있다.

　

2차 면역 복합체로부터 해리된 표지 접합체가 포함된 상청액은 회전체(900)의 회전으로 인한 원심력을 구동압력으로 하여 제2 반응 챔버(400)보다 하류에 위치한 검출 챔버(800)로 이송된다. 검출 챔버(800)로 이송된 표지 접합체는 미세유동구조물(1000) 외부에 배치된 검출부(10)에 의해 광학적 특성이 측정된다. 이 과정은 본 발명의 일 실시예에 따른 　미세유동장치를 이용한 면역분석방법에 대한 이하 설명에서 자세히 다루겠다.

　

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세유동장치를 이용한 면역분석방법을 설명하는 순서도이다. 본 실시예에서는, 일 예로서 혈액을 분석하는 과정을 설명한다.

일 예로서, 시료 챔버(100)에 전혈(whole blood)을 주입(S10)하고 미세유동 구조물을 회전시켜 전혈을 분리 챔버(200)로 이송시킨다. 전혈은 회전체(900)의 회전으로 인한 원심력을 구동압력으로 하여 시료 챔버(100)에서 분리 챔버(200)로 이송된다.

분리 챔버(200)로 이송된 전혈은 고속회전을 통해 혈청 또는 혈장을 포함하는 상청액과 혈구를 포함하는 침강물로 원심분리 된다(S20). 그렇게 되면, 혈청 또는 혈장에 비해 상대적으로 무거운 혈구 등은 침강하여 침강물 수집부로 이동되고, 혈구 등에 비해 상대적으로 가벼운 상청액은 상청액 수집부에 남게 된다.

분리된 상청액은 밸브가 개방되면 회전체(900)의 회전으로 인한 원심력을 구동압력으로 하여 채널을 통해 표지 접합체가 수용된 제1 반응 챔버(300)로 이송된다. 제1 반응 챔버(300)에 수용된 건조된 고체상태의 표지 접합체는 상청액의 유입으로 재용해되고, 상청액 내의 분석대상물질과 특이적으로 결합하여, 1차 면역 복합체를 형성한다(S30). 이 과정에서 분석대상물질이 표지 접합체와 잘 결합할 수 있도록 회전체(900)를 좌우로 수회 흔들어 주는 것이 가능하다.

1차 면역 복합체를 포함한 상청액은 밸브가 개방되면 회전체(900)의 회전으로 인한 원심력을 구동압력으로 하여 채널을 통해 포획 바인더가 수용된 제2 반응 챔버(400)로 이송된다. 제2 반응 챔버(400)의 검출영역에 고정되어 있는 포획 바인더는 분석대상물질과 특이적으로 결합하여 2차 면역 복합체를 형성한다(S40). 이 과정에서 1차 면역 복합체가 포획 바인더와 잘 결합할 수 있도록 회전체(900)를 좌우로 수회 흔들어 주는 것이 가능하다.

반응하지 않은 표지 접합체 및 반응 여액을 제2 반응 챔버(400)의 하류에 위치하는 웨이스트 챔버(600)로 보내기 위해, 제2 반응 챔버(400)의 상류에 위치하는 세척액 챔버(700)에 연결된 밸브가 개방되고 회전체(900)의 회전으로 인한 원심력을 구동압력으로 하여 세척액이 채널을 통해 제2 반응 챔버(400)로 유입된다(S50).

세척과정을 거치면, 2차 면역 복합체의 표지 접합체를 해리시키기 위해, 제2 반응 챔버(400)의 상류에 위치하는 버퍼 챔버(500)에 연결된 밸브가 개방되고, 회전체(900)의 회전으로 인한 원심력을 구동압력으로 하여 용출버퍼가 채널을 통해 제2 반응 챔버(400)로 유입된다. 유입된 용출버퍼에 의해 2차 면역 복합체의 분석대상물질을 기준으로 표지 접합체와 포획 바인더가 해리된다(S60).

용출버퍼에 의해 표지 접합체가 해리되면 밸브가 개방되고, 회전체(900)의 회전으로 인한 원심력을 구동압력으로 하여, 표지 접합체를 포함하는 상청액이 채널을 통해 검출 챔버(800)로 이송된다(S70).

표지 접합체를 포함하는 상청액이 검출 챔버(800)로 유입되면, 미세유동구조물(1000)의 외부에 배치되는 검출부(10)가 표지 접합체의 표지물질의 광학적 특성을 측정 및 분석하게 된다(S80).

표지물질의 광학적 특성의 측정 및 분석은 표지물질에 특정파장의 빛을 조사한 후, 표지물질이 방출하는 특정 파장의 빛의 형광성을 시간분해형광측정법을 통해 측정하고, 이를 분석하여 분석대상물질의 농도를 산출함으로써 이루어진다.

표지물질의 광학적 특성의 측정 및 분석은 미세유동구조물(1000)의 외부에 배치되는 검출부(10)를 통해 이루어진다(도 4 참조).

검출부(10)는 미세유동구조물(1000)의 외부에 배치되고, 복수로 마련될 수 있으며, 미세유동구조물(1000)의 검출 챔버(800)에 빛을 조사하는 발광부(11)와 발광부(11)로부터 조사된 빛을 흡수한 검출 챔버(800)가 방출하는 빛을 수신하는 수광부(12) 및 수광부(12)가 수신한 빛의 광학적 특성을 분석하여 분석대상물질의 농도를 산출하는 분석부를 포함한다.

발광부(11)는 소정의 주파수로 점멸하는 광원으로써, LED(light emitting diode)　, LD(laser diode)와 같은 반도체 발광 소자와 할로겐 램프나 제논(Xenon)램프같은 가스 방전 램프를 포함한다.

수광부(12)는 검출 챔버(800)로부터 방출되는 빛의 세기에 따른 전기적 신호를 발생시키는 것으로서, 공핍층 포토 다이오드(depletionlayer photo diode)나 애벌런치 포토 다이오드(avalanche photo diode, APD) 또는 광전자증배관(photomultiplier tubes, PMT)등을 포함한다.

본 실시예에서는 발광부(11)가 미세유동구조물(1000)의 상측에 배치되고 수광부(12)가 미세유동구조물(1000)의 하측에 배치되고 있으나, 이 위치가 상호 반대가 될 수 있음은 물론이고, 반사경 또는 도광 부재 등을 통해 광 경로가 조절될 수 있다.

분석부(13)는 수광부에서 수신된 빛의 형광성을 측정하고, 미리 저장된 표준곡선을 이용하여 수신된 빛의 형광성으로부터 분석대상물질의 농도를 산출해 낸다.

본 발명의 일 실시예는 표지물질로 란탄족(III) 킬레이트를 포함하는 나노입자를 사용한다. 이하 란탄족(III) 킬레이트중 유로피움(Eu)을 예로 들어 설명한다. 유로피움은 여기파장(Excitation wavelength)과 방출파장(Emission wavelength)이 큰 차이를 보이는 형광특성을 가지고 있다(도 5 참조).

특정 파장의 빛에 여기되고 그와 큰 차이를 보이는 파장의 빛을 방출하는 유로피움의 이런 특성은 방출광의 형광성의 측정에 대한 정확도를 향상시켜준다.

표지물질인 유로피움 뿐만이 아니라 검출 챔버(800) 내의 다른 물질들도 조사된 빛을 흡수하고 방출하기 때문에 조사되는 빛의 파장과 큰 파장의 차이를 가지는 빛을 방출하는 유로피움의 이런 특성은 표지물질의 방출광을 측정함에 있어서 다른 물질들의 방출광이 끼치는 간섭을 배제시킬 수 있다. 따라서 표지물질이 방출하는 빛의 형광성을 높은 정확도로 측정할 수 있게 된다.

이런 유로피움의 특성으로 인해 다른 물질들이 방출하는 빛의 영향을 배제시킬 수 있고, 시간분해형광측정법(Time-resolved fluorescence measurement)을 통해 방출광의 형광성을 측정함으로써 더욱 형광성 측정의 정확도를 향상시킬 수 있다.

시간분해형광측정법은 방출광의 형광성을 측정함에 있어서, 측정이 이루어지는 일정시간을 미세하게 분할하여 측정하는 방법을 말한다. 예를 들면, 1초 동안 방출광의 형광성을 측정한다고 할 때, 1㎳마다 측정하는 것이다. 1㎳마다 측정이 이루어지므로 같은 싸이클이 초당 1000번 나타나게 된다(도 6 참조).

도 6을 보면 형광성의 측정이 400㎲에서 800㎲사이에서 이루어짐을 알 수 있다. 이는 표지물질뿐만 아니라 표지물질이 수용되어 있는 검출 챔버(800) 그 자체나 검출 챔버(800)에 유입되었을 수 있는 다른 물질들 또한 조사된 빛을 흡수하여 빛을 방출하므로 이들의 영향을 제거하기 위해 형광성을 바로 측정하지 않고 일정한 딜레이 타임(delay time)을 두고 측정하는 것이다.

이렇게 형광성을 측정함으로써 표지물질 외의 물질들이 방출하는 빛의 영향을 제거할 수 있게 되고 이로 인해 형광성 측정의 정확도 및 민감도가 향상될 수 있다.

본 발명은 ⅰ)표지물질로 란탄족(III) 킬레이트를 포함하는 나노입자(예를 들면 유로피움)를 사용하고 ⅱ)형광성 측정방법으로 시간분해형광측정법을 사용함으로써, 표지물질의 형광성 측정의 정확도 및 민감도를 크게 향상시킬 수 있는 방법을 제시하고 있다. 본 발명은 상술한 것처럼, 두 방법을 조합하여 사용함으로써 유체시료 내의 분석대상물질을 측정하는 종래의 어떤 측정방법보다 　정확도 및 민감도가 현저하게 향상된 분석대상물질의 측정방법을 제시하고 있는 것이다.

상술한 방법을 통해 얻은 표지물질의 형광성을 기초로, 미리 만들어진 표지물질의 형광성에 대한 분석대상물질의 농도를 나타내는 표준곡선(도 7 참조)을 통해 분석대상물질의 농도를 산출하게 된다.

100 : 시료 챔버 　　　　　　　　　　　　　　　　　110 : 시료 주입구
200 : 분리 챔버 　　　　　　　　　　　　　　　　　300 : 제1 반응챔버
400 : 제2 반응 챔버 　　　　　　　　　　　　　500 : 버퍼 챔버
600 : 웨이스트 챔버 　　　　　　　　　　　　　700 : 세척액 챔버
800 : 검출 챔버 　　　　　　　　　　　　　　　　　900 : 회전체
1000 : 미세유동구조물

Claims (23)

1. 적어도 하나의 분석대상물질을 포함하는 시료를 수용하는 시료 챔버;
   상기 적어도 하나의 분석대상물질에 각각 결합하는 적어도 한 종류의 표지 접합체를 수용하는 제1 반응 챔버;
   상기 제1 반응 챔버와 연결되며,　상기 표지 접합체가 결합된 분석대상물질에 결합하는 포획 바인더를 수용하는 제2 반응 챔버;
   상기 제2 반응 챔버와 연결되며, 상기 분석대상물질에 표지 접합체 및 포획 바인더가 결합하여 형성된 복합체에 작용하여 상기 분석대상물질에서 상기 표지 접합체와 포획 바인더를 해리시키는 용출버퍼(elution buffer)를 수용하는 버퍼 챔버;
   상기 용출버퍼에 의해 상기 분석대상물질에서 해리된 표지 접합체를 최종적으로 수용하는 검출 챔버;
   상기 챔버들을 연결하는 채널; 및
   상기 채널의 개폐를 위한 밸브를 포함하는 적어도 하나의 미세유동구조물 및 적어도 하나의 검출부를 포함하는 미세유동장치.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 표지 접합체의 표지는 란탄족(III) 킬레이트 또는 란탄족(III) 킬레이트를 함유하는 나노 입자, 착색 고분자(colored polymeric)나노입자, 형광(fluorescent)물질 또는 형광 물질을 함유하는 나노입자, 인광(phosphorescent) 물질 또는 인광물질을 함유하는 나노입자, 색소 함유 리포좀, 효소(enzyme; HRP, ALP etc.), 초자성 물질(super para-magnetic) 또는 초자성 물질 함유 나노입자, 금속 나노입자(metal nanoparticle) 및 카본 나노입자로 구성되는 군에서 선택되는 어느 한 물질인 미세유동장치.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 표지 접합체는 건조된 고체 상태인 미세유동장치.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 표지 접합체는 광학적 신호발현에 필요한 표지를 포함하고, 상기 시료 내의 분석대상물질과 특이적으로 결합하는 미세유동장치.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 표지 접합체는 여러 종류의 분석대상물질을 동시에 검출하기 위해 각기 다른 종류의 표지물질을 포함하는 적어도 한 종류의 표지 접합체인 미세유동장치.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 표지 접합체는 바인더(binder)와 표지(label)로 구성되며, 상기 바인더는 항체, 항원, 리셉터,　리간드, 올리고뉴클레오타이드, 합텐(hapten)　또는 압타머(aptamer)를 포함하는 미세유동장치.
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 포획 바인더는 상기 표지 접합체의 분석대상물질과의 반응 부위와 다른 반응 부위에 특이적으로 결합하는 미세유동장치.
8. 제 1 항 또는 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 포획　바인더는 항체, 항원, 리셉터, 리간드, 올리고뉴클레오타이드,　합텐(hapten)　또는 압타머(aptamer)를 포함하는 미세유동장치.
9. 제 1 항에 있어서,
   상기 제2 반응 챔버는 상기 포획 바인더가 고정 배치될 수 있는 검출 영역을 포함하는 미세유동장치.
10. 제 1 항에 있어서,
    상기 제1 반응 챔버와 연결되고, 상기 시료를 원심분리하여 분석대상물질을 포함하는 상청액을 분리하는 분리 챔버를 더 포함하는 미세유동장치.
11. 제 1 항에 있어서,
    상기 검출부는 상기 미세유동구조물의 외부에 배치되고, 상기 미세유동구조물의 검출 챔버에 빛을 조사하는 발광부, 상기 발광부로부터 조사된 빛을 흡수한 상기 검출 챔버가 방출하는 빛을 수신하는 수광부 및 상기 수광부가 수신한 빛의 광학적 특성을 분석하여 분석대상물질의 농도를 산출하는 분석부를 포함하는 미세유동장치.
12. 원심력 기반의 미세유동장치를 이용한 면역분석방법으로서,
    적어도 하나의 분석대상물질을 포함하는 시료를 상기 미세유동장치에 주입하고 원심분리하여 얻어진 상청액을 제1 반응 챔버로 이송하고,
    상기 상청액 내의 분석대상물질에 상기 제1 반응 챔버 내의 표지 접합체를 결합시킴으로써 1차 면역 복합체를 형성한 후, 상기 1차 면역 복합체에 제2 반응 챔버 내의 포획 바인더를 결합시킴으로써 2차 면역 복합체를 형성하며,
    버퍼 챔버로부터 이송된 용출버퍼에 의해 상기 2차 면역 복합체로부터 표지 접합체와 분석대상물질을 해리시켜 해리된 상기 표지 접합체를 검출 챔버로 이송하고,
    상기 미세유동장치의 외부에 배치된 검출부가 상기 검출 챔버로 이송된 상기 표지 접합체의 형광성을 측정하여, 상기 분석대상물질의 농도를 산출하는 원심력 기반의 미세유동장치를 이용한 면역분석방법.
13. 제 12 항에 있어서,
    상기 표지 접합체의 표지는 란탄족(III) 킬레이트 또는 란탄족(III) 킬레이트를 함유하는 나노 입자, 착색 고분자(colored polymeric)나노입자, 형광(fluorescent)물질 또는 형광 물질을 함유하는 나노입자, 인광(phosphorescent) 물질 또는 인광물질을 함유하는 나노입자, 색소 함유 리포좀, 효소(enzyme; HRP, ALP etc.), 초자성 물질(super para-magnetic) 또는 초자성 물질 함유 나노입자, 금속 나노입자(metal nanoparticle) 및 카본 나노입자로 구성되는 군에서 선택되는 어느 한 물질인 원심력 기반의 미세유동장치를 이용한 면역분석방법.
14. 제 12 항에 있어서,
    상기 표지 접합체는 건조된 고체 상태인 원심력 기반의 미세유동장치를 이용한 면역분석방법.
15. 제 12 항에 있어서,
    상기 표지 접합체는 광학적 신호발현에 필요한 표지를 포함하고, 상기 시료 내의 분석대상물질과 특이적으로 결합하는 원심력 기반의 미세유동장치를 이용한 면역분석방법.
16. 제 12 항에 있어서,
    상기 표지 접합체는 여러 종류의 분석대상물질을 동시에 검출하기 위해 각기 다른 종류의 표지물질을 포함하는 적어도 한 종류의 표지 접합체인 미세유동장치를 이용한 면역분석방법.
17. 제 12 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표지 접합체는 바인더(binder)와 표지(label)로 구성되며, 상기 바인더는 항체, 항원, 리셉터, 리간드, 올리고뉴클레오타이드, 합텐(hapten)　또는 압타머(aptamer)를 포함하는 원심력 기반의 미세유동장치를 이용한 면역분석방법.
18. 제 12 항에 있어서,
    상기 포획　바인더는 상기 표지 접합체의 분석대상물질과의 반응 부위와 다른 반응 부위에 특이적으로 결합하는 원심력 기반의 미세유동장치를 이용한 면역분석방법.
19. 제 12 항 또는 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포획 바인더는 항체, 항원, 리셉터, 리간드, 올리고뉴클레오타이드, 합텐(hapten)　또는 압타머(aptamer)를 포함하는 원심력 기반의 미세유동장치를 이용한 면역분석방법.
20. 제 12 항에 있어서,
    상기 제2 반응 챔버는 상기 포획 바인더가 고정배치될 수 있는 검출 영역을 포함하는 원심력 기반의 미세유동장치를 이용한 면역분석방법.
21. 제 12 항에 있어서,
    상기 시료, 상청액 또는 버퍼는 상기 미세유동장치의 회전으로 인한 원심력을 구동압력으로 하여 이송되는 원심력 기반의 미세유동장치를 이용한 면역분석방법.
22. 제 12 항에 있어서,
    상기 표지 접합체의 형광성의 측정은 측정시간을 미세하게 분할하여 수광부가 수신한 빛의 형광성(Fluorescence)을 상기 측정시간 동안 측정하는 시간분해형광측정법(Time-resolved fluorescence measurement)을 이용한 원심력 기반의 미세유동장치를 이용한 면역분석방법.
23. 제 22 항에 있어서,
    상기 수광부가 수신한 빛의 형광성은 바로 측정되지 않고 일정한 딜레이 타임(delay time)을 거친 뒤 측정되는 원심력 기반의 미세유동장치를 이용한 면역분석방법.

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