DE69800630T2

DE69800630T2 - Chip zur elektroforetischen Trennung von Molekülen und Verfahren zur Verwendung desselben

Info

Publication number: DE69800630T2
Application number: DE69800630T
Authority: DE
Inventors: Patrick Kaltenbach; Gordon Ross
Original assignee: Agilent Technologies Inc
Current assignee: Agilent Technologies Inc
Priority date: 1998-07-29
Filing date: 1998-07-29
Publication date: 2001-08-23
Anticipated expiration: 2018-07-30
Also published as: DE69800630D1; EP0977030A1; US6254754B1; EP0977030B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die elektrophoretische Trennung von Molekülen, insbesondere Proteinen, und spezieller auf die elektrophoretische Trennung in zwei Richtungen, eine erste Trennung unter Verwendung einer isoelektrischen Fokussierungstechnik entlang einer ersten Richtung und eine zweite Trennung gemäß dem Molekulargewicht der Moleküle entlang einer zweiten Richtung.

Beschreibung des Standes der Technik

Die Erforschung der Biowissenschaften beinhaltet die Klassifizierung und Charakterisierung einer Vielzahl von Biomolekülen. Die Untersuchung von Proteinen ist in den Biowissenschaften überall zu finden, und es wurden viele Techniken verwendet, um Proteine aus einer Vielzahl von Quellen zu isolieren, zu trennen und zu charakterisieren. Etablierte Techniken zur Proteintrennung umfassten Elektrophorese und Flüssigchromatographie. Traditionell wurden elektrophoretische Techniken verwendet, um Proteine zu trennen und zu charakterisieren. Proteine sind, genau wie die Mehrzahl von Biomolekülen, geladen oder können geladen werden, indem die Medien festgelegt werden, in denen sie gelöst werden. Demzufolge bewegen sie sich in Lösung unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes mit einer Geschwindigkeit, die von dem Verhältnis von Ladung zu Masse des Proteins abhängig ist; wenn das Molekül keine Ladung besitzt, weist es keine Beweglichkeit auf.
Zwei traditionelle elektrophoretische Techniken zur Proteintrennung sind die isoelektrische Fokussierung (IEF) und SDS-PAGE.
IEF trennt Proteine auf der Basis ihres isoelektrischen Punktes. Die meisten Proteine tragen eine Anzahl geladener oder ladbarer Seitenketten zusätzlich zu den endständigen N- und C-Spezies, die ebenfalls eine Ladung tragen können. In Abhängigkeit von dem pH-Werk des Puffers, in dem das Protein enthalten ist, tragen diese ladbaren Gruppen eine Ladung von 0 bis +1, wenn es sich um eine Amin- Funktion handelt, und eine Ladung von -1 bis 0, wenn es eine Säuregruppe ist. Da der Ionisierungsgrad auch von der lokalen Umgebung abhängig ist, führt dies zu einer Anzahl von verschiedenen Graden geladener Zustände über das gesamte Protein hinweg. Bei einem bestimmten und idiosynkratischen pH-Wert ist das Gemisch von positiven und negativen Ladungen im Gleichgewicht, und das Protein weist eine Nettoladung von 0 auf. Diese Eigenschaft kann dazu genutzt werden, Proteine auf der Basis des pH-Werts zu trennen, bei dem ihre Nettoladung null ist. Dieser pH-Wert wird als der isoelektrische Punkt oder pl des Proteins bezeichnet.
IEF wird ausgeführt, indem ein pH-Gradient zwischen zwei Elektroden aufgebaut wird, wobei der höchste pH-Wert an der negativen Elektrode (Kathode) und der niedrigste pH-Wert an der positiven Elektrode (Anode) liegt. Ein pH-Gradient kann erzeugt werden, indem ein komplexes Gemisch von Chemikalien verwendet wird, Ampholyte genannt. Diese ordnen sich selbst zwischen der Anode und der Kathode derart an, dass sie einen Gradienten mit zunehmendem pH-Wert von der Anode zur Kathode erzeugen. Wenn Proteine in dieses System eingebracht werden, ist ihre Ladung von dem pH-Wert der Umgebung abhängig, in der sie sich befinden. Wenn der pH-Wert der Umgebung niedriger als der pl der Proteine ist, dann weisen sie eine positive Nettoladung auf und wandern in Richtung der negativen Elektrode. In dieser Richtung nimmt der pH-Wert zu, und die Nettoladung der Proteine wird null, wenn der lokale pH-Wert gleiche ihrem pl ist. Jegliche weitere Bewegung über Diffusion in Richtung der negativen Elektrode setzt das Protein einem pH-Wert aus, der höher als dessen pl ist, und an diesem Punkt wird seine Nettoladung negativ, und umgekehrt. Das Protein wandert dann zurück in Richtung der positiven Elektrode, bis es in dem pH-Bereich fokussiert ist, der gleich dessen pl ist. Auf diese Weise sammeln sich die Proteine in Abhängigkeit von ihren isoelektrischen Punkten in verschiedenen Gebieten, und diese Technik ermöglicht eine Trennung auf der Basis des pl. Wenn eine Standardmischung von Proteinen mit bekannten pls verwendet wird, dann können die Probenproteine durch Berechnen ihrer pls relativ zu den Standards charakterisiert werden. Derartige Trennungen werden traditionell in Trägermedien ausgeführt, d. h. Gels, oder in einem Kapillarformat.
Derartige Techniken zur Durchführung einer Trennung auf der Basis der isoelektrischen Fokussierung sind zum Beispiel in US 5 320 727 offenbart.
Eine zweite Technik zur Trennung von Proteinen besteht darin, diese auf der Basis ihres Molekulargewichts zu trennen. Dies kann ebenfalls unter Verwendung elektrophoretischer Phänomene erreicht werden. In diesem Fall werden die Proteine mit einer Chemikalie (Natriumdodecylsulfat (SDS)) inkubiert, die einen Schwanz aus 12 Kohlenstoffatomen besitzt, der an einer negativ geladenen Sulfonsäuregruppe hängt. Die C&sub1;&sub2;-Kette ist hydrophob und verbindet sich mit hydrophoben Gebieten auf dem Protein, so dass der negative Kopf von dem Protein nach außen vorsteht. Dies wird üblicherweise erreicht, nachdem das Protein denaturiert wurde, und die resultierende Protein-SDS-Struktur ist linear und negativ geladen. Proteine nehmen SDS-Moleküle mit einem relativ konstanten Verhältnis von 1 : 1,4 (Protein:SDS) auf. Daher weisen diese Strukturen äquivalente Verhältnisse von Ladung zu Masse auf. Dies bedeutet, dass die SDS-Protein-Strukturen ähnliche Beweglichkeiten besitzen. SDS-Proteine können getrennt werden, indem bewirkt wird, dass sie durch eine Siebstruktur wandern, die üblicherweise durch Herstellen eines vernetzten Gels oder einer Lösung aus verhakten Polymeren erzeugt wird. In beiden Fällen wandern kleine SDS-Protein-Moleküle schneller als größere SDS-Protein-Moleküle, und jegliches Gemisch derselben wird daher gemäß dem Molekulargewicht getrennt. Wenn eine Standardlösung von Proteinen mit bekanntem Molekulargewicht verwendet wird, dann kann das Molekulargewicht von Probenproteinen durch Vergleichen ihrer Migrationsposition relativ zu jener des bekannten Standards bestimmt werden.
Diese zwei Techniken können kombiniert werden, um eine Trennung eines komplexen Gemisches von Proteinen erstens in einer Richtung durch IEF und zweitens durch SDS-Protein-Sieben bereitzustellen. Die Kombination von zwei Trennselektivitäten in zueinander senkrechten Richtungen stellt einen leistungsfähigen Weg zur Trennung sehr komplexer Gemische oder zur Charakterisierung eines Proteinproduktes dar. Diese Technik wird auf dem Gebiet der Trennung von Proteinen immer mehr verwendet.
Ein kombiniertes Verfahren für eine zweidimensionale Hochauflösungs- Elektrophorese ist in US 5 407 546 offenbart. Dieses bekannte Verfahren umfasst die Schritte des Ausführens eines ersten Trennprozesses auf einer Gel-Basis in einer ersten Richtung durch isoelektrische Fokussierung als erstes und des anschließenden Durchführens eines zweiten Trennprozesses in einer zu der ersten Richtung senkrechten Richtung durch eine von jener der ersten Trennung verschiedene Technik. Gemäß dem in diesem Dokument gelehrten Verfahren wird eine vorgegebene Menge eines IEF-Gemisches auf einem streifenförmigen Vlies verteilt, das auf dem Randgebiet einer Trockengelschicht positioniert ist, um ein IEF-Plateau zu erzeugen. Am Ende einer vorgegebenen Zeitspanne wird das Vlies unter Verwendung eines Pinzettenpaars derart abgezogen, dass das IEF-Plateau in der Trockengelschicht verbleibt. Danach werden zwei Elektrophoreseprozesse unter Verwendung einer gemeinsamen mittigen Kathode und zweier Anoden gleichzeitig ausgeführt, die in zwei Endbereichen der Trockengelschicht vorgesehen sind.
Die zur Unterstützung der Trennungen verwendeten Gels werden im Allgemeinen vom Benutzer hergestellt, sie können aber auch vorgefertigt erworben werden. Diese werden durch Mischen eines Polymers mit einem bestimmten Prozentsatz eines Vernetzungsmittels in einem ebenen Format aufgebaut. Je höher der Prozentsatz an Vernetzungsmittel ist, desto kleiner ist die erzeugte Porengröße. Geringe Porenabmessungen sind für kleine Moleküle von höherem Nutzen und liefern eine bessere Differenzierung oder Auflösung zwischen Proteinen mit ähnlichen Molekulargewichten. Häufig ist es nützlich, ein Gel zu gießen, bei dem die Porenabmessung linear in einer Richtung abnimmt. Dieses wird als Gradientengel bezeichnet und ist in der Lage, bessere Auflösungen bei einem breiten Bereich von Molekulargewichten zu liefern.
Nach der Trennung in einer oder zwei Richtungen können die Proteine mit einem Farbstoff zur Reaktion gebracht werden, wie Coummassie-Blau, der das Protein anfärbt und seine Detektion erlaubt. Alternativ kann der Gelfleck, der das Protein enthält, aus dem Gel herausgeschnitten und das Protein mit einem Enzym, wie Trypsin, aufgeschlossen werden, um kleinere Fragmente zu erhalten. Die Größe und Anzahl dieser Fragmente ist von der Aminosäuresequenz der Proteine abhängig und kann daher definierend und idiosynkratisch sein. Eine weitere Alternative besteht darin, dass die Proteine nach einer Trennung auf dem Gel über Elektroauftragung auf eine Membran transferiert werden können. Auf dieser Membran kann das Protein einer Vielzahl von Tests, wie Immunbeizung, unterworfen oder auf der Membran mit z. B. Trypsin aufgeschlossen werden. Die aus dem Aufschluss auf der Membran resultierenden Fragmente können direkt in ein Massenspektrometer eingebracht werden, das die Molekulargewichte der Fragmente liefert. Die Proteinzahl und das Molekulargewicht des Proteins können bei Vergleich mit einer Protein-Datenbasis ausreichen, um es zu identifizieren. Alternativ kann MSIMS (MS = Massenspektrometrie) durchgeführt werden, um die Peptide der Reihe nach zu ordnen und daher ihre Aminosäuresequenz bereitzustellen.
Die Herstellung und Verwendung eines anderen Aufbaus, der Moleküle unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes in einer Siebmatrix trennt, ist in US 5 427 663 offenbart. Gemäß diesem Dokument werden Moleküle getrennt, die große DNA- Stücke darstellen, wobei die Siebmatrix aus einem Feld physikalischer Säulen besteht, die eine physikalische Matrix erzeugen, die von den DNA-Molekülen durchlaufen werden muss, wenn sie von dem elektrischen Feld über die planare Struktur hinweg getrieben werden. US 5 427 663 offenbart eine Sortiervorrichtung und ein Sortierverfahren zur Fraktionierung und gleichzeitigen Betrachtung von individuellen Mikrostrukturen und Makromolekülen, wie DNA-Molekülen, Proteinen und Polymeren. Gemäß US 5 427 663 wird ein Substrat mit einem flachen Aufnahmegefäß bereitgestellt, das sich auf einer Seite desselben befindet. Es ist ein Feld von Hindernissen vorgesehen, die vom Boden der Aufnahmegefäße nach oben stehen, um mit den Mikrostrukturen wechselzuwirken, um die Migration derselben in einer Migrationsrichtung durch das Aufnahmegefäß hindurch teilweise zu behindern. Elektroden zur Erzeugung eines elektrischen Feldes in dem Fluidmedium, um die Migration der Mikrostrukturen zu induzieren, sind auf zwei Seiten des Aufnahmegefäßes vorgesehen. Das Aufnahmegefäß ist mit einer transparenten Abdeckung derart abgedeckt, dass die Höhe des Aufnahmegefäßes mit der Abmessung der in der Sortiervorrichtung zu sortierenden Mikrostrukturen in Einklang steht. Wenn bewirkt wird, dass die Mikrostrukturen in dem Fluidmedium durch das Aufnahmegefäß wandern, tun dies somit die Mikrostrukturen in im Wesentlichen einer einzigen Schicht. Dies ist ein zum Sieben von SDS-Proteinen unter Verwendung von vernetzen Gels oder verhakten Polymeren analoger Mechanismus.
Allgemeine Techniken zur Herstellung von Mikrostrukturen mit hohen Aspektverhältnissen und großen Strukturhöhen durch Synchrotronstrahlungslithographie, Galvanoformen und Kunststoftformen (LIGA-Prozess) werden von E. W. Becker et al., Microelectronic Engineering 4 (1986), Seiten 35 bis 56 offenbart.
H. Becker et al., J. Micromech. Microeng. 8 (1998), Seiten 24 bis 28 lehren einen planaren Quarzchip mit Submikrometer-Kanälen für zweidimensionale Kapillar- Elektrophoreseanwendungen. In diesem Chip besteht die erste Trennrichtung aus einem einzelnen Kanal, während die zweite Trennrichtung aus einem Feld von 500 Kanälen besteht. Die Kanäle werden unter Verwendung von reaktivem Ionenätzen unter maximal anisotropen Bedingungen hergestellt, was ein Aspektverhältnis von bis zu 5 für die engen Kanäle ergibt, entlang denen die Trennung in der zweiten Richtung durchgeführt wird.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines einfachen Chips zur Durchführung einer elektrophoretischen Trennung, der eine präzise Trennung liefert und der die Möglichkeit einer problemlosen Nachtrennungsbehandlung bietet.
Diese Aufgabe wird durch einen Chip zur Durchführung einer elektrophoretischen Trennung von mikromolekularen oder makromolekularen Strukturen in zwei Dimensionen gelöst, der Folgendes aufweist:
ein Basissubstrat, das eine Hauptoberfläche beinhaltet;
einen Kanal, der in der Hauptoberfläche des Basissubstrats in einer ersten Richtung ausgebildet ist;
Mittel zum Anlegen einer ersten Spannung über den Kanal hinweg, um eine erste Trennung der molekularen Strukturen in der ersten Richtung auf der Basis eines ersten Trennmechanismus zu ermöglichen;
eine zweidimensionale Trennanordnung, die in der Hauptoberfläche des Basissubstrats ausgebildet ist; und
Mittel zum Anlegen einer zweiten Spannung über die Trennanordnung hinweg, um eine zweite Trennung der molekularen Strukturen zu ermöglichen,
wobei
die Trennanordnung aus einer Trennmatrix besteht, die eine flache Vertiefung und ein Feld von einzeln stehenden Säulen beinhaltet, die in der Vertiefung angeordnet sind, wobei sich die Vertiefung senkrecht von dem Kanal weg in einer zweiten Richtung erstreckt, wobei die zweite Spannung über die Trennmatrix hinweg anlegbar ist, um eine zweite Trennung der molekularen Strukturen auf der Basis eines zweiten Trennmechanismus zu ermöglichen, und
mehrere Barrieren vorgesehen sind, um ein Eindringen der Moleküle in der zweiten Richtung zu verhindern, wenn die erste Spannung über den Kanal hinweg angelegt wird, indem das elektrische Feld, das durch die erste Spannung an dem Kanal bewirkt wird, begrenzt wird, wobei die mehreren Barrieren orthogonal zu dem Kanal an dem kanalseitigen Ende in der Vertiefung angeordnet sind.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Durchführung einer elektrophoretischen Trennung unter Verwendung eines derartigen Chips.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Durchführung einer elektrophoretischen Trennung von mikromolekularen oder makromolekularen Strukturen gelöst, das einen Chip verwendet, wie er vorstehend beschrieben ist, und das die Schritte umfasst:
Einführen eines pH-Gradienten in den Kanal;
Einbringen eines Probenvolumens in den Kanal;
Anlegen eines elektrischen Feldes über den Kanal hinweg, indem die erste Spannung eingeschaltet und somit eine Trennung der Strukturen auf der Basis des ersten Trennmechanismus durchgeführt wird;
Ausschalten der ersten Spannung;
Inkubieren der getrennten Moleküle mit Natriumdodecylsulfat; und
Anlegen eines elektrischen Feldes über die Trennmatrix hinweg, indem die zweite Spannung eingeschaltet und somit eine Trennung der Strukturen auf der Basis des zweiten Trennmechanismus durchgeführt wird.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird isoelektrische Fokussierung (IEF) als erster Trennmechanismus verwendet, während der zweite Trennmechanismus auf der Abmessung oder dem Molekulargewicht der zu trennenden Strukturen beruht.
Die vorliegende Erfindung stellt die Fähigkeit bereit, Moleküle, insbesondere Proteine, in orthogonalen Richtungen unter Verwendung unterschiedlicher Trennselektivitäten zu trennen. Diese Fähigkeit basiert auf einer festen, hergestellten Struktur mit variierender Abmessung oder Geometrie, die den Siebeffekt eines Gels nachahmt. Die Struktur sorgt für die Trennung von Proteinen gemäß ihrem isoelektrischen Punkt (isoelektrische Fokussierung), gefolgt von der Trennung gemäß dem Molekulargewicht (SDS-Proteintrennung) in einer dazu senkrechten Richtung.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind die einzeln stehenden Säulen in der Vertiefung derart ausgebildet und angeordnet, dass Abstände zwischen Säulen von dem kanalseitigen Ende der Trennmatrix zu dem in der zweiten Richtung dazu entgegengesetzten Ende der Trennmatrix hin abnehmen, wobei die Abnahme der Abstände vorzugsweise eine lineare Abnahme ist. Somit kann eine selektive Trennung entlang der zweiten Richtung erzielt werden.
Der erfinderische Chip beinhaltet Mittel zur Verhinderung eines Eindringens der Moleküle in der zweiten Richtung, wenn die erste Spannung über den Kanal hinweg angelegt wird, indem das elektrische Feld, das durch die erste Spannung an dem Kanal bewirkt wird, begrenzt wird. Derartige Verhinderungsmittel können durch mehrere Barrieren gebildet sein, die senkrecht zu dem Kanal an dem kanalseitigen Ende in der Vertiefung angeordnet sind. Somit kann gewährleistet werden, dass die Moleküle während der Trennung in der ersten Richtung nicht in die Trennmatrix wandern. Folglich besitzen die Moleküle identische Startpositionen entlang der ersten Richtung relativ zu der Richtung der zweiten Dimension, wenn die Trennung in der zweiten Richtung gestartet wird. Somit können unter Verwendung derartiger Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung präzisere Trennresultate erreicht werden.
In weiteren Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, welche die Präparation für eine Detektionsanalyse nach der Trennung erlauben, beinhaltet der erfinderische Chip des Weiteren ein Decksubstrat, wobei eine Hauptoberfläche des Decksubstrats mit der Hauptoberfläche des Basissubstrats derart verbindbar ist, dass eine Membran zwischen den Hauptoberflächen des Basissubstrats und des Decksubstrats angeordnet ist, wobei die Hauptoberfläche des zweiten Substrats mit einer Kammer versehen ist, die der Trennmatrix zugewandt ist, wenn das zweite Substrat mit dem Basissubstrat verbunden ist, wobei Reagenzien für eine Detektionsanalyse nach der Trennung in die Kammer geladen werden können.
Einlass- und Auslasskanäle der zweiten Kammer erlauben die Einbringung jeglicher Reagenzien auf die Membran, die zum Beispiel einen enzymatischen Aufschluss, eine Immunreaktion oder eine Einfärbung oder Markierung der getrennten Proteine ermöglicht. Es können elektrische Kontakte zur Durchführung einer Elektroaufbringung der getrennten Moleküle, insbesondere Proteine, auf die Membran vorgesehen sein, die sich zwischen dem Basissubstrat und dem Decksubstrat befindet. Die getrennten Moleküle können über die Oberseite der zweiten Kammer visualisiert werden, oder alternativ kann die Membran, auf welche die getrennten Moleküle durch Elektroaufbringung aufgebracht sind, entfernt und direkt in ein Massenspektrometer verbracht werden oder kann für weitere Analysen herausgenommen werden.
Somit stellt die vorliegende Erfindung einen Chip für eine elektrophoretische Trennung bereit, die in einer automatisierten Weise durchgeführt werden kann, wobei die Handhabung der Probe minimiert werden kann. Außerdem erlaubt der erfinderische Chip eine selektive Trennung durch Bereitstellung der Fähigkeit zur Trennung von Molekülen, insbesondere Proteinen, in orthogonalen Richtungen unter Verwendung unterschiedlicher Trennselektivitäten. Des Weiteren liefert die Verwendung einer festen hergestellten Struktur als der Siebmatrix reproduzierbare Ergebnisse, da die feste hergestellte Struktur mit einer präzisen Reproduzierbarkeit gefertigt werden kann.
Das für den erfinderischen Chip verwendete Material ist kein kritisches Merkmal. Wenn jedoch die Fertigung von Chips mit hohem Durchsatz erforderlich ist, ist das Material vorzugsweise ein polymeres Material, wie PMMA (Polymethylmethacrylat), Polycarbonat, Polyethylenterephthalat, Polystyrol oder PDMS (Polydimethylsiloxan). Außerdem kann jegliche geeignete Fertigungstechnik verwendet werden. Die Fertigungstechnik kann von Mikroinjektionsformen bis Mikrotransferformen reichen. Zum Beispiel können die in der vorstehend erwähnten Veröffentlichung von E. W. Becker offenbarten Techniken zur Fertigung des erfinderischen Chips verwendet werden. In jedem Fall sollte das polymere Material im Wesentlichen nicht-porös sein und keine oder eine vernachlässigbare Oberflächenladung aufweisen, um Elektroendosmose zu unterdrücken. Bei Bedarf kann eine zusätzliche polymere Beschichtung verwendet werden.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden im Folgenden unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, in denen:
Fig. 1 eine schematische Draufsicht auf einen Elektrophorese-Chip zeigt;
Fig. 2 eine Perspektivansicht des in Fig. 1 gezeigten Chips ist;
Fig. 3 eine schematische Perspektivansicht einer weiteren Ausführungsform des erfinderischen Chips ist;
Fig. 4 eine vergrößerte Ansicht der unteren rechten Ecke des in Fig. 3 gezeigten Chips ist; und
Fig. 5 eine schematische Seitenansicht einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist, die ein Hauptsubstrat und ein Decksubstrat beinhaltet.

BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG

Nunmehr Bezug nehmend auf die Fig. 1 und 2 wird das Arbeitsprinzip der vorliegenden Erfindung detailliert erläutert. In der folgenden Beschreibung wird die vorliegende Erfindung hauptsächlich unter Bezugnahme auf die elektrophoretische Trennung von Proteinen beschrieben. Für den Fachmann ist jedoch klar, dass die vorliegende Erfindung auf die elektrophoretische Trennung unterschiedlicher molekularer Strukturen und auch makromolekularer Strukturen anwendbar ist.
Ein Chip zur Durchführung einer elektrophoretischen Trennung von Proteinen beinhaltet einen Kanal 12, der in einer Hauptoberfläche eines Basissubstrats 10 des Chips ausgebildet ist und sich in einer Richtung desselben erstreckt. Der Kanal 12 beinhaltet einen Einlass 12a und einen Auslass 12b. Ein Puffer kann über den Einlass 12a in den Kanal 12 gelangen und kann den Kanal 12 über den Auslass 12b verlassen. Der Einlass 12a steht mit einem Pufferreservoir in Fluidverbindung, während der Auslass 12b mit einem Abfallpufferreservoir in Fluidverbindung steht.
Ein Injektionskanal 12c ist in Fluidverbindung mit dem Einlass 12a zwecks Injektion einer Probe vorgesehen. Des Weiteren sind Elektroden, die in Fig. 1 schematisch mit Bezugszeichen 14a und 14b gezeigt sind, zum Anlegen einer Spannung über den Kanal 12 hinweg vorgesehen.
Der Kanal wird dazu verwendet, die IEF-Trennung in der ersten Richtung durchzuführen. Der pH-Gradient, der zur Durchführung einer Trennung durch isoelektrische Fokussierung notwendig ist, kann durch Einbringen eines flüssigen Trägers erzeugt werden, der ein komplexes Gemisch von Ampholyte genannten Chemikalien enthält. Alternativ kann eine Membran (nicht gezeigt) verwendet werden, um den pH-Gradienten bereitzustellen. Die Verwendung einer Membran ist bevorzugt, da ein reproduzierbarerer pH-Gradient erzielt werden kann.
Für die Trennung in der zweiten Richtung ist eine Trennmatrix 20 in der gleichen Hauptoberfläche des Substrats 10 vorgesehen, in der sich auch der Kanal 12 befindet. Die Trennmatrix 20 besteht aus einem gefertigten Feld von Säulen 22. Wie aus Fig. 2 ersichtlich, sind die Säulen 22 in einer Vertiefung 24 angeordnet, die in der Hauptoberfläche des Substrates 10 ausgebildet ist. Auf einer Seite derselben ist die Vertiefung 24 mit dem Kanal 12 verbunden. An der Endseite der Vertiefung 24, die dem kanalseitigen Ende derselben gegenüberliegt, ist ein Auslasskanal 26 vorgesehen.
Die Säulen 22 können entweder gleichmäßig sein, um eine ähnliche analoge Porengröße über die Trennmatrix hinweg bereitzustellen, oder variierende Geometrien oder Dichten aufweisen, so dass die "Porengröße" über die Trennmatrix hinweg variiert. In der in den Fig. 1 und 2 gezeigten Ausführungsform definieren die Säulen, die in Richtung der Kanalseite der Trennmatrix angeordnet sind, eine breitere "Porengröße" im Vergleich zu den Säulen, die in Richtung der Auslass- Seite der Trennmatrix angeordnet sind. In bevorzugten Ausführungsformen liefern die Säulen einen linearen Gradienten mit abnehmender Porengröße von der Kanalseite der Trennmatrix zu der Auslass-Seite derselben. Die Tiefe der Vertiefung 24, d. h. die Höhe der Säulen 22, ist vorzugsweise an die Abmessung der Proteine, Moleküle oder Mikrostrukturen angepasst, die zu trennen sind, so dass die zu trennenden Substanzen durch die Trennmatrix wandern. Wenn die Substanzen durch die Trennmatrix wandern, behindern die Säulen 22 die Migration in Abhängigkeit von der Abmessung der jeweiligen Moleküle derart, dass eine Trennung in der Richtung von dem Kanal 12 zu dem Auslass 26 erzielt werden kann.
Um die Migration der Proteine durch die Trennmatrix bereitzustellen, ist eine weitere Elektrode vorgesehen, die in Fig. 1 schematisch mit 28 bezeichnet ist, um eine Spannung über die Trennmatrix hinweg anzulegen und somit ein elektrisches Feld zu erzeugen, um die Migration der Moleküle zu induzieren.
Wenngleich in Fig. 1 drei Elektroden 14a, 14b und 28 schematisch gezeigt sind, ist klar, dass der erfinderische Chip verschiedene elektrische Verbindungen in einer geeigneten Anordnung beinhalten kann, so dass ein elektrisches Feld über jegliches Paar von gegenüberliegenden oder benachbarten Seiten angelegt werden kann.
Zur Durchführung einer Trennung unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Chips wird über den Einlass 12a ein Puffer in den Kanal 12 eingebracht, wobei entweder durch einen flüssigen Träger oder durch eine Membran (nicht gezeigt) ein pH-Gradient bewirkt wird. Danach wird ein Probenvolumen über den Injektionskanal 12c in den Kanal 12 injiziert. Anschließend wird über Elektroden 14a und 14b durch Einschalten einer ersten Spannung ein elektrisches Feld über den Kanal 12 hinweg angelegt. Unter dem Einfluss dieses elektrischen Feldes wird eine isoelektrische Fokussierungstrennung der Proteine in der Probe durchgeführt. Nach Beendigung der isoelektrischen Fokussierung wird die erste Spannung ausgeschaltet, und die getrennten Moleküle werden mit SDS (Natriumdodecylsulfat) auf der planaren Struktur bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Erzeugung der SDS-Molekülkomplexe wird die Polaritätsrichtung durch Anlegen einer zweiten Spannung zwischen den Elektroden 28 und 14a, 14b umgeschaltet, so dass die SDS-Molekülkomplexe, zum Beispiel die negativ geladenen SDS- Proteinkomplexe, durch die gefertigte Anordnung wandern und entsprechend ihrem Molekulargewicht getrennt werden. Damit ist die Trennung beendet.
Für den Fachmann ist offensichtlich, dass die vorliegende Erfindung, wenngleich sich die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung auf die Trennung von Proteinen beziehen, für die Trennung verschiedener molekularer Strukturen oder makromolekularer Strukturen angewendet werden kann. In jedem Fall sollten die Abmessungen der Trennmatrix, d. h. die Abmessung der Säulen und die Abstände dazwischen, auf die jeweiligen zu trennenden Strukturen angepasst sein. Die Form und das Muster der Säulen sind nicht auf die spezielle Form und das spezielle Muster beschränkt, die in den Figuren gezeigt sind. Vielmehr können die Säulen jegliche gewünschte Form annehmen und können in jeglicher gewünschten Struktur derart angeordnet werden, dass die gewünschte elektrophoretische Trennung erreicht werden kann.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist in den Fig. 3 und 4 gezeigt. Ein Substrat 100 beinhaltet einen IEF-Kanal 102 und eine Trennmatrix 104 auf einer Hauptoberfläche desselben. Wiederum besteht die Trennmatrix aus einer Mehrzahl von Säulen, die in einer in der Hauptoberfläche des Substrates ausgebildeten Vertiefung angeordnet sind. Der Kanal 102 beinhaltet einen Einlass 102a und einen Auslass 102b. Der Einlass steht mit einem Pufferreservoir 106 in Fluidverbindung, während der Auslass 102b mit einem Abfallpufferreservoir 108 in Fluidverbindung steht. Des Weiteren ist ein Auslasskanal 110 an der Auslass- Seite der Trennmatrix 104 vorgesehen. Der Auslasskanal 110 kann mit Hohlräumen 110a, 110b und 110c zur Aufnahme von Abfallpuffer in Fluidverbindung stehen. Wie am besten aus Fig. 4 ersichtlich, die eine vergrößerte Darstellung des unteren rechten Bereichs des in Fig. 3 gezeigten Chips ist, sind in der Hauptoberfläche des Substrats 100 ein Probenhohlraum 112 und ein Abfallhohlraum 114 vorgesehen. Der Probenhohlraum 112 ist über einen Probenkanal 112a mit dem Einlass 102a verbunden. Der Abfallhohlraum 114 ist über einen Abfallkanal 114a mit dem Einlass 102a verbunden. Wie aus Fig. 4 ersichtlich, sind der Kanaleinlass 102a, der Probenkanal 112a und der Abfallkanal 114a so angeordnet, dass sie ein Kreuz bilden.
Eine Probe wird injiziert, indem die Probe von dem Probenhohlraum 112 durch Anlegen eines elektrischen Feldes zwischen den zwei Hohlräumen zu dem Abfallhohlraum 114 bewegt wird. Das Kreuz zwischen dem Kanaleinlass 102a, dem Probenkanal 112a und dem Abfallkanal 114a bestimmt das Injektionsvolumen für die folgende IEF-Trennung. Wie unter Bezugnahme auf die Fig. 1 und 2 beschrieben wurde, wird die IEF-Trennung durch Anlegen eines elektrischen Feldes zwischen den Pufferhohlräumen 106 und 108 durchgeführt.
Um ein Eindringen der Probe in das Feld von Säulen 104 während der IEF- Trennung in dem Kanal 102 zu vermeiden, ist es wesentlich, das elektrische Feld in dem Trennkanal 102 zu halten. Wie aus den Fig. 3 und 4 ersichtlich, wird dies gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung durch Bereitstellen von mehreren Barrieren 120 durchgeführt, die senkrecht zu dem Kanal verlaufen. Die Barrieren 120 wirken dahingehend, das elektrische Feld auf den Kanal 102 zu beschränken, welches durch eine über den Kanal 102 hinweg angelegte Spannung verursacht wird. Ohne diese Barrieren 120 würde sich das elektrische Feld in die Feldstruktur ausbreiten, und die Probenbestandteile würden den Feldlinien folgen. Dies wird durch die Barrieren 120 unterdrückt.
Nach Beendigung der IEF-Trennung wird die Spannung über den Kanal 102 hinweg ausgeschaltet, die getrennten Bestandteile werden mit SDS inkubiert, und eine Spannung wird über das Feld der Säulen hinweg angelegt, um die Trennung in der zweiten Dimension in einer Richtung senkrecht zu dem Kanal 102 durchzuführen. Die Barrieren befinden sich nun in Linie zu dem elektrischen Feld und stören die Trennung in der zweiten Richtung nicht.
Bezugnehmend auf Fig. 5 wird eine Ausführungsform des erfinderischen Chips beschrieben, die eine Nachtrennbehandlungseinheit beinhaltet. Die Nachtrennbehandlungseinheit beinhaltet ein Decksubstrat 200, das dafür ausgelegt ist, mit dem Basissubstrat 10 oder 100 verbunden zu werden. Eine Oberfläche des Decksubstrats 200, in der eine Kammer vorgesehen ist, kann mit der Hauptoberfläche des Basissubstrates verbunden werden, in der die Trennstrukturen definiert sind, so dass die Kammer des Decksubstrates der Trennmatrix zugewandt ist. Des Weiteren kann zum Beispiel eine aus Polyvinylidenfluorid gefertigte Membran 202 zwischen das Decksubstrat 200 und das Basissubstrat und daher zwischen die Trennmatrix und die in dem Decksubstrat 200 definierte Kammer geschichtet angeordnet sein.
Außerdem beinhaltet das Decksubstrat 200 einen Reagenzeinlass 204 und einen Reagenzauslass 206. Über den Reagenzeinlass 204 können nach Beendigung der Trennung in der zweiten Richtung Reagenzien in die in dem Decksubstrat definierte Kammer eingebracht werden. Außerdem können elektrische Kontakte 208 und 210 vorgesehen sein, um eine Elektroauftragung der getrennten Proteine auf die Membran 202 zu erlauben. Zudem ermöglichen der Einlasskanal 204 und der Auslasskanal 206, die mit der Kammer in dem Decksubstrat 200 in Fluidverbindung stehen, die Einbringung jeglicher Reagenzien auf die Membran, was weitere chemische Reaktionen ermöglicht, z. B. einen enzymatischen Aufschluss, eine Immunreaktion oder eine Einfärbung oder Markierung.
Es ist zu erwähnen, dass das Decksubstrat 200 von dem Basissubstrat abgenommen werden kann und von diesem getrennt werden kann. Somit kann die Membran entfernt und direkt in ein Massenspektrometer verbracht oder für eine weitere Analyse herausgenommen werden. Es ist zu erwähnen, dass die gesamte Struktur bei verschiedenen Temperaturen temperaturgeregelt werden kann und dass die getrennten Proteine durch die Oberseite des Decksubstrats 200, d. h. die Oberseite der darin ausgebildeten Kammer in Augenschein genommen werden können. Auf diese Weise wird die Handhabung der Probe minimiert.
Es ist zu erwähnen, dass sich der hierin verwendete Ausdruck "Chip" auf eine Form bezieht, die im Allgemeinen starr, dünn und klein sowie mit menschlichen Fingern handhabbar ist. Das Substrat oder die Substrate, die den Chip bilden, sind starre Schichten aus vorzugsweise polymeren Materialien, wie PMMA, Polycarbonat, Polyethylenterephthalat, Polystyrol oder PDMS. Außerdem können die Substrate aus Silicium oder Siliciumdioxid unter Verwendung von Lithographie und Refraktionsionenätzen als Fertigungstechniken gebildet werden. Die Strukturen in den Substraten können durch jegliche lithographische Techniken und Mikrostrukturierungsprozesse mikrostrukturiert werden, zum Beispiel Laseranwendung oder Ätzen. Des Weiteren können die Substrate über Mikroinjektion geformt sein (LIGA- Prozesse).
Schließlich ist zu erwähnen, dass eine Mehrzahl von Detektionsverfahren anwendbar ist, bei denen die Detektion auf laserinduzierter Fluoreszenz oder auf Densiometern basieren kann, vorzugsweise mit einem Abtastdetektor oder einem CCD.
Schließlich ist zu erwähnen, dass die Länge der Barriere 120 der in den Fig. 3 und 4 gezeigten Ausführungsform der Erfindung derart gewählt ist, dass ein ausreichender elektrischer Widerstand bereitgestellt wird, um eine Migration der Probenbestandteile in eine Richtung orthogonal zu dem IEF-Trennkanal während der IEF-Trennung zu unterdrücken. Im Hinblick darauf kann die Länge der Barrieren 120 im Bereich eines Drittels bis zwei Dritteln der Länge der Trennmatrix liegen.

Claims

1. Chip zum Durchführen einer elektrophoretischen Trennung von molekularen Strukturen in zwei Dimensionen mit

einem Basissubstrat (10; 100), das eine Hauptoberfläche beinhaltet;

einem Kanal (12; 102), der in der Hauptoberfläche des Basissubstrats (10; 100) in einer ersten Richtung ausgebildet ist;

Mitteln (14a, 14b) zum Anlegen einer ersten Spannung über den Kanal (12; 102) hinweg, um eine erste Trennung der molekularen Strukturen in der ersten Richtung auf der Basis eines ersten Trennmechanismus zu ermöglichen;

einer zweidimensionalen Trennanordnung (20; 104), die in der Hauptoberfläche des Basissubstrats (10; 100) ausgebildet ist, und

Mitteln (28) zum Anlegen einer zweiten Spannung über die Trennanordnung (20; 104) hinweg, um eine zweite Trennung der molekularen Strukturen zu ermöglichen,

dadurch gekennzeichnet, dass

- die Trennanordnung aus einer Matrix (20; 104) besteht, die eine flache Vertiefung (24) und ein Feld von einzeln stehenden Säulen (22) beinhaltet, die in der Vertiefung (24) angeordnet sind, wobei sich die Vertiefung senkrecht von dem Kanal (12; 102) weg in einer zweiten Richtung erstreckt, wobei die zweite Spannung über die Trennmatrix (20; 104) hinweg anlegbar ist, um eine zweite Trennung der molekularen Strukturen auf der Basis eines zweiten Trennmechanismus zu ermöglichen, und - mehrere Barrieren (120) vorgesehen sind, um ein Eindringen der Moleküle in der zweiten Richtung zu verhindern, wenn die erste Spannung über den Kanal (102) hinweg angelegt wird, indem das elektrische Feld, das durch die erste Spannung an dem Kanal bewirkt wird, begrenzt wird, wobei die mehreren Barrieren orthogonal zu dem Kanal (102) an dem kanalseitigen Ende in der Vertiefung angeordnet sind.

2. Chip nach Anspruch 1, wobei die Säulen (22) in der Vertiefung (24) derart ausgebildet und angeordnet sind, dass Abstände zwischen Säulen (22) von dem kanalseitigen Ende der Trennmatrix (20; 104) zu dem in der zweiten Richtung dazu entgegengesetzten Ende der Trennmatrix (20; 104) hin abnehmen.

3. Chip nach Anspruch 2, wobei die Säulen (22) in der Vertiefung (24) derart ausgebildet und angeordnet sind, dass die Abnahme der Abstände eine lineare Abnahme ist.

4. Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Kanal (102) einen Einlass (102a) beinhaltet, der mit einem Pufferreservoir (106) verbunden ist und des Weiteren mit einem Probenhohlraum (112) und einem Abfallprobenhohlraum (114) derart verbunden ist, dass eine Probe in den Kanal (102) dadurch injiziert werden kann, dass ein elektrisches Feld zwischen dem Probenhohlraum (112) und dem Abfallprobenhohlraum (114) angelegt wird.

5. Chip nach einem der Ansprüche 1 bis 4, der des Weiteren ein Decksubstrat (200) beinhaltet, wobei eine Hauptoberfläche des Decksubstrats (200) mit der Hauptoberfläche des Basissubstrats (10; 100) derart verbindbar ist, dass eine Membran (202) zwischen den Hauptoberflächen des Basissubstrats (10; 100) und des Decksubstrats (200) angeordnet ist, wobei die Hauptoberfläche des Decksubstrats (200) mit einer Kammer versehen ist, die der Trennmatrix (20; 104) zugewandt ist, wenn das Decksubstrat (200) mit dem Basissubstrat (10; 100) verbunden ist, wobei Reagenzien für eine Detektionsanalyse nach der Trennung in die Kammer geladen werden können.

6. Chip nach Anspruch 5, der des Weiteren Mittel (208, 210) zum Anlegen eines elektrischen Feldes zwischen dem Basissubstrat (10; 100) und dem Decksubstrat (200) beinhaltet, um eine Elektroauftragung von getrennten Molekülen auf die Membran (202) zu ermöglichen.

7. Verfahren zur Durchführung einer elektrophoretischen Trennung von Molekülen unter Verwendung eines Chips gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, das folgende Schritte umfasst:

Einführen eines pH-Gradienten in den Kanal (12; 102);

Einbringen eines Probenvolumens in den Kanal (12; 102);

Anlegen eines elektrischen Feldes über den Kanal (12; 102) hinweg, indem die erste Spannung eingeschaltet und somit eine Trennung der molekularen Strukturen auf der Basis des ersten Trennmechanismus durchgeführt wird;

Ausschalten der ersten Spannung;

Inkubieren der getrennten Moleküle mit Natriumdodecylsulfat;

Anlegen eines elektrischen Feldes über die Trennmatrix (20; 104) hinweg, indem die zweite Spannung eingeschaltet und somit eine Trennung der mikromolekularen Strukturen oder der makromolekularen Strukturen auf der Basis des zweiten Trennmechanismus durchgeführt wird.