DE69824586T2

DE69824586T2 - Probenträger hoher dichte für die analyse biologischer proben

Info

Publication number: DE69824586T2
Application number: DE69824586T
Authority: DE
Inventors: E. Fred REGNIER; Noubar Afeyan; L. Marvin VESTAL
Original assignee: PerSeptive Biosystems Inc
Current assignee: Applied Biosystems LLC
Priority date: 1997-06-26
Filing date: 1998-06-24
Publication date: 2005-06-23
Anticipated expiration: 2018-06-25
Also published as: EP0991930A1; US20070054416A1; EP0991930B1; WO1999000657A1; DE69824586D1; US20020160536A1

Description

Verwandte Anmeldung
Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen Anmeldung U.S.S.N. 60/050 840, eingereicht am 26. Juni 1997.
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung bezieht sich auf einen Probenhalter für die chemische Analyse und Synthese von Proben und insbesondere auf einen Probenhalter hoher Dichte zum Halten und zum Beibehalten der Trennung von mehreren Proben während eines chemischen Analyse- oder Syntheseverfahrens.
Hintergrund der Erfindung
Molekular-Biologie umfasst eine breite Vielfalt von Techniken für die Analyse von biologischen Proben, einschließlich Nukleinsäuren und Proteinen, von denen viele die Basis von klinischen diagnostischen Untersuchungen bilden. Diese Techniken umfassen beispielsweise Nukleinsäure-Hybridisierungsanalyse, Restriktions-Enzymanalyse, genetische Sequenzanalyse, Liganden/Rezeptoren-Bindungsuntersuchungen und Trennung und Reinigung von Nukleinsäuren und Proteinen. Viele Forschungstechniken in der Molekularbiologie beinhalten ein Durchführen von zahlreichen Vorgängen an einer großen Anzahl von Proben. Diese Vorgänge sind häufig komplex und zeitaufwendig und erfordern im allgemeinen einen hohen Genauigkeitsgrad.
Matrixgestützte Laserdesorptions-Ionisierung (MALDI = matrix-assisted laser desorption ionization) ist eine Technik, die es ermöglicht, dass sehr große Moleküle, wie beispielsweise DNA-Fragmente und Proteine, aus einer festen Probe desorbiert und ohne bedeutende Zersetzung ionisiert werden. Gekoppelt mit Massenspektrometrie ermöglicht die MALDI-Technik, dass Molekulargewichte von biologischen Polymeren und anderen großen Molekülen, einschließlich Industriepolymere, genau bestimmt werden können.
Typischerweise enthält bei einem MALDI-Verfahren eine Probeplatte eine oder eine Mehrzahl von kleinen Mengen einer Mischung der zu analysierenden Probe und eine geeignete Matrix. Nachdem die Proben auf der Probenplatte getrocknet sind, wird die Probenplatte in eine Vakuumkammer angeordnet. Ein Laserstrahl trifft jede Probe, um Probenmoleküle zu desorbieren und ionisieren, wodurch eine Ionenwolke für jede Probe erzeugt wird. Ionen in der Wolke werden durch elektrische Felder extrahiert und laufen zu einem Detektor. Ionen unterschiedlicher Masse erfordern unterschiedliche Zeiten, um zu dem Detektor hin zu wandern. Daher kann man durch Messen der Zeit, die ein Ionenstrahl benötigt, um den Detektor zu erreichen, das Molekulargewicht der Probe bestimmen. Der Laserstrahl trifft typischerweise jeweils einen Probenspot, indem die Probenplatte bezüglich des Laserstrahls bewegt wird.
Im allgemeinen ist eine bei einem MALDI-Verfahren verwendete Probenplatte ein Substrat mit einer flachen Oberfläche. Eine herkömmliche Probenplatte weist verschiedene Nachteile auf. Die herkömmliche Probenplatte kann ein erneutes Mischen von zuvor getrennten Proben erlauben. Wenn die Proben zuerst auf der Probenplatte angeordnet sind, können die Proben physisch getrennt und unterscheidbar sein. Nachdem die Probenlösung auf der Probenplatte aufgebracht ist, können sich jedoch die Proben durch Diffusion verteilen und mit anderen Proben mischen, da es keine Barriere zwischen den Proben gibt. Um die Diffusion und das Mischen der Probe zu vermeiden, können Proben ausreichend voneinander beabstandet sein. Wenn die Proben beabstandet sind, wird jedoch die Probendichte auf der Probenplatte verringert, und somit können mehrere Platten erforderlich sein, um eine große Anzahl von Proben zu analysieren. Da nur eine Probenplatte in einer MALDI-Kammer auf einmal angeordnet wird, und da es etwas dauert, um das notwendige Vakuum in der Kammer zu erzeugen, wird eine schnelle Analyse einer großen Anzahl von Proben schwierig.
Ein weiteres Problem mit der herkömmlichen Probenplatte besteht darin, dass Proben verschwendet werden. Ein auf der Probenplatte angeordnetes Probentröpfchen umfasst typischerweise einen relativ großen Oberflächenbereich verglichen mit dem Laserstrahldurchmesser. Das Probentröpfchen kann etwa 2 mm² abdecken, und ein Laserstrahldurchmesser ist typischerweise ungefähr 100 μm². Somit trifft der Laserstrahl nur einen winzigen Bruchteil der Probe, wobei der Rest der Probe verschwendet wird. Noch ein weiteres Problem mit der herkömmlichen Probenplatte besteht darin, dass, wenn mehrere Proben auf der Platte angeordnet sind, es schwierig ist, jede Probe auf der Platte zu adressieren. Die Fähigkeit, jede Probe zu adressieren, ist bedeutsam, da Proben, die einzeln adressierbar sind, selektiv analysiert werden können. Noch ein weiteres Problem mit der herkömmlichen Probenplatte besteht darin, dass die Analyse langsam ist, da es möglich ist, dass die Probe die Oberfläche der Probenplatte nicht gleichmäßig abdeckt. Beim Erstellen von Proben für MALDI wird typischerweise eine kleine Menge einer Probe mit einer großen Menge einer Matrixflüssigkeit gemischt. Die Mischung wird auf die Probenplatte angeordnet und es wird ihr Gelegenheit gegeben, sich auf der Probenplattenoberfläche zu verteilen und zu trocknen. Da die Mischung eine kleine Menge der Probe umfasst, können bestimmte Bereiche der Plattenoberfläche gar keine Probe aufweisen, wenn die Probe trocknet. Daher muss während einer MALDI-Analyse der Laserstrahl mehrere Spots treffen, um genug Daten von Spots einzusammeln, die die Probe unterstützen. Im allgemeinen benötigt eine MRLDI-Analyse für eine Probe ein Minimum von 30 Sekunden.
Das US-Patent Nr. 5 498 545 beschreibt eine Probenplatte, die physisch getrennte Probenspots umfasst. Die Probenspots werden entweder durch Ätzen von mehreren Löchern in einem Substrat, wie in 1 gezeigt, oder durch Anordnen von Stiften auf einem Substrat getrennt. Ein Spotdurchmesser ist im Millimeterbereich. Diese Spots sind in der Fläche makroskopisch und viel größer als die Fläche des Laserstrahls.
Die US-A-5 498 545 lehrt allgemein ein System zum Analysieren von mehreren Proben. Das System umfasst ein Massenspektrometer zum Analysieren jeder Probe, wenn sie innerhalb einer Probenaufnahmekammer angeordnet ist, und eine Laserquelle, die jede Probe mit einem Laserimpuls trifft, um Probenmoleküle zu desorbieren und ionisieren. Das System umfasst ebenfalls einen Probenträger.
Das Dokument beschreibt drei unterschiedliche Beispiele von Probenträgern. Der erste Probenträger umfasst eine Anzahl von photogeätzten Wannen. Der zweite Probenträger umfasst eine Anzahl von Probenspots, die elektroplattierte Bereiche sind. Jede Probenwanne oder Spot wird mit einem Durchmesser von 1 bis 2,5 mm beschrieben. Der dritte Probenträger umfasst entfernbare senkrechte Stifte.
Die DE-A-42 33 231 lehrt im allgemeinen ein System zum Erfassen und Quantifizieren von organischen Verbindungen. Das System umfasst einen Probentisch, auf dem eine oder mehrere Proben aufgebracht werden können, eine Lichtquelle zum Bestrahlen der Proben und eine Spektralmessvorrichtung. Der Probentisch umfasst eine dünne Schicht, die auf einem Infrarotstrahl reflektierenden Element angebracht ist. Der dünne Film kann Stiftlöcher enthalten, die durch ihn laufen, auf denen eine die Probe enthaltende Lösung aufgebracht ist. Die Stiftlöcher dienen als ein Kern zum Kondensieren der Probe, wobei Diffusion der Probe über den dünnen Film verhindert wird. Alternativ kann der dünne Film durch Laserbestrahlung erzeugte denaturierte Zonen enthalten, auf denen die Lösung aufgebracht wird.
Die EP-A-0 347 579 lehrt im allgemeinen eine Struktur zum Erhalten von kleinen Mengen einer Substanz. Die Struktur umfasst einen Block mit einer oder mehreren Vertiefungen und eine Abdeckung mit Erhebungen, die den Vertiefungen entsprechen. Die Vertiefungen können in die Oberfläche des Blocks mittels eines anisotropen Ätzverfahrens geätzt sein. Bei jedem Beispiel dieses Dokuments ist die Probe in einer Vertiefung in dem Block angeordnet.
Die DE-A-44 08 034 bezieht sich im allgemeinen auf ein Verfahren zur Massenspektrometrie-Analyse einer Probe, das ein Kontaktieren einer Elektrophoreseplatte mit einer Transfermembran, d.h. "electroblotting", umfasst. Herkömmliche Probenplatten und Sonden, die in der Massenspektroskopie-Analyse beim biologischen Screening als ein Halter für eine Bibliothek von Biopolymeren oder als eine Platte zur biologischen Synthese oder Analyse verwendet werden, weise ebenfalls flache Oberflächen, makroskopische Probenspots oder Wannen auf. Daher existieren einige der Proben, die mit Bezug auf die MALDI-Probenplatten erläutert wurden, wie beispielsweise Probendiffusion, kleine Probendichte und verschwendete Proben, ebenfalls mit diesen Platten.
Zusammenfassung der Erfindung
Erfindungsgemäß wird die obige Aufgabe durch einen Probenhalter gemäß Anspruch 1, ein System zur schnellen Analyse einer Mehrzahl von Proben gemäß Anspruch 17 und durch ein Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe gemäß Anspruch 20 erreicht. Die abhängigen Ansprüche beziehen sich auf weitere vorteilhafte Aspekte der Erfindung.
Bei einem Aspekt liefert die Erfindung einen Probenhalter, der viele der Probleme von herkömmlichen Probenhaltern überwindet. Der vorliegende Probenhalter trägt eine Mehrzahl von Proben auf einem kleinen Raum, während eine physische Trennung dieser Proben ermöglicht wird. Der vorliegende Probenhalter ermöglicht ferner, dass jede Probenstelle adressierbar ist, so dass eine selektive Analyse oder Synthese einer Probe durchgeführt werden kann.
Der Probenhalter umfasst ein Substrat, das mikrogefertigt ist, um eine Vielfalt von mikroskopischen Inseln fest zu legen, die durch mindestens einen Sumpf getrennt sind. Die mikroskopischen Inseln legen grobe Trägeroberflächen fest, und der mindestens eine Sumpf blockiert den Transport von Proben zwischen benachbarten Probenträgeroberflächen. Bei einer Ausführungsform ist der mindestens eine Sumpf eine Mehrzahl von untereinander verbundenen Sümpfen, die einen Ablauf bilden, und jeder Sumpf umfasst mindestens ein Loch zur Drainage. Bei einer weiteren Ausführungsform ist die Mehrzahl von untereinander verbundenen Sümpfen auf einer ersten Oberfläche des Substrats angeordnet, und der Probenhalter umfasst ferner eine zweite Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen, die auf der zweiten Oberfläche des Substrats angeordnet sind. Die zweite Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen ist von der ersten Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen versetzt, so dass sich eine Mehrzahl von senkrechten Löchern bildet, die sich durch die Dicke des Substrats erstrecken, wobei die erste Gruppe der untereinander verbundenen Sümpfe die zweite Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen kreuzt. Bei noch einer weiteren Ausführungsform umfasst die Mehrzahl von Inseln Subinseln, die durch mindestens einen Subsumpf getrennt sind, der auf der Probenträgeroberfläche angeordnet ist. Bei noch einer weiteren Ausführungsform ist der Probenhalter innerhalb der Probenkammer eines matrixunterstützten Laserdesorptionsionisations-Massenspektrometers angeordnet.
Bei einem weiteren Aspekt ist die Erfindung durch ein System zur schnellen Analyse einer Mehrzahl von Proben gekennzeichnet. Das System umfasst eine vakuumsteuerbare Kammer, einen Probenhalter zur Anbringung innerhalb der Kammer zum Halten einer Mehrzahl von Proben, eine Laserquelle und ein Massenspektrometer. Der Probenhalter umfasst ein Substrat, das mikrogefertigt ist, um eine Vielfalt von mikroskopischen Inseln fest zu legen, die durch mindestens einen Sumpf getrennt sind. Die Inseln legen Probenträgeroberflächen fest, und der mindestens eine Sumpf blockiert den Transport von Proben zwischen benachbarten Oberflächen. Die Laserquelle umfasst Mittel zum Erzeugen und Richten eines Laserstrahls zum Treffen einer Probe auf einer Probenträgeroberfläche, um Probenmoleküle davon zu desorbieren und zu ionisieren. Das Massenspektrometer analysiert Proben auf dem Probenhalter, indem deren Masse erfasst wird. Bei einer Ausführungsform ist das optische Mittel ein Mittel zum Richten eines Laserstrahls. Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst das System ferner einen Mechanismus zum Bewegen des Probenhalters bezüglich des Laserstrahls, so dass jede Oberfläche der Probenträgeroberflächen von einem stationären Laserstrahl getroffen wird. Bei noch einer weiteren Ausführungsform umfasst jede Probenträgeroberfläche einen Oberflächenbereich, der ungefähr gleich oder kleiner als der Durchmesser des jede Probe treffenden Laserstrahls ist.
Bei noch einem weiteren Aspekt zeichnet sich die Erfindung durch ein Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe aus. Gemäß dem Verfahren wird ein Probenhalter, der ein Substrat umfasst, das mikrogefertigt ist, um eine Vielfalt von mikroskopischen Inseln bereitzustellen, die Probenträgeroberflächen festlegen. Mindestens ein Sumpf trennt benachbarte Trägeroberflächen und blockiert den Transport von Proben zwischen benachbarten Oberflächen. Eine Mehrzahl von Proben wird in Kontakt mit den Probenträgeroberflächen angeordnet, und ein Analyseschritt wird an der biologischen Probe durchgeführt. Bei einer Ausführungsform umfasst der Analyseschritt eine Erfassung durch matrixgestützte Laserdesorptionsionisations-Massenspektrometrie. Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst der Analyseschritt eine Immunountersuchung. Bei noch einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner den Schritt des Anfertigens einer Bibliothek von Polymeren auf dem Probenhalter, so dass jedes Polymer auf einer Probenträgeroberfläche angeordnet ist. Die Bibliothek von Polymeren kann eine Bibliothek von Biopolymeren, wie beispielsweise von Peptiden, Oligonukleotiden oder Proben zum biologischen Screening sein.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Diese und weitere Vorteile der Erfindung können klarer in bezug auf die Beschreibung und die Zeichnungen verstanden werden, in denen zeigen:
1 eine Querschnittsansicht eines Probenhalters des Stands der Technik;
2A eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform des Probenhalters der Erfindung;
2B eine Draufsicht eines Abschnitts des Probenhalters von 2A;
2C eine Querschnittsansicht eines Abschnitts des Probenhalters von 2A, der durch 2C'-2C'' geschnitten ist;
3A eine Draufsicht eines Abschnitts einer Ausführungsform des Probenhalters der Erfindung;
3B eine Querschnittsansicht des Probenhalters von 3A, der durch 3B'-B'' geschnitten ist;
3C eine Querschnittansicht des Probenhalters von 3A, der durch 3C'-C'' geschnitten ist;
4 die Blockierung eines Probentransports zu benachbarten Probenträgeroberflächen mit dem Probenhalter von C;
5 eine Draufsicht einer Ausführungsform des Probenhalters der Erfindung;
6A eine Draufsicht eines Abschnitts einer Ausführungsform des Probenhalters der Erfindung;
6B eine Querschnittsansicht des Probenhalters von 6, der durch 6B'-6B'' geschnitten ist;
7 eine hintere Oberfläche des Probenhalters von 2B;
8 ein schematisches Diagramm einer MALDI-Kammer;
9 ein Verfahren zum Transferieren von Proben auf den Probenhalter der Erfindung; und
10 eine perspektivische Ansicht einer Ausführungsform des Probenhalters der Erfindung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Mit Bezug auf 2A, 2B, 2C umfasst ein Probenhalter 10, der in Übereinstimmung mit der Erfindung aufgebaut ist, ein Substrat 11, das mikrogefertigt ist, um eine Vielfalt von mikroskopischen Inseln 14 fest zu legen, die obere Probenträgeroberflächen 13 festlegen. Der Begriff "Insel" bezieht sich auf eine Struktur, die von dem Substrat 11 hervorsteht. Eine Probenträgeroberfläche 13 ist eine freigelegte Oberfläche auf einer Insel – typischerweise im wesentlichen parallel zu der horizontalen Ebene des Substrats 11 -, im Gegensatz zu Probenhaltern 1 des Stands der Technik die Proben 2 in den Wannen 3 haltern. Mindestens ein Sumpf 12 trennt die Oberflächen 13 von benachbarten Inseln 14. Der Begriff "Sumpf" bezieht sich auf einen ausgenommenen Bereich zwischen benachbarten Inseln 14. Der Sumpf 12 ist eine Ausnehmung tiefer als die Oberflächen 13 der benachbarten Inseln 14. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Sumpf 12 um mindestens 10 μm tiefer. Wie in 4 dargestellt, blockiert der Sumpf 12 den Transport von Proben zwischen den Oberflächen 13 der Inseln 14, indem die wandernde Probe weg von einer Oberfläche 16 zu einer benachbarten Inseloberfläche 17 gesammelt wird. Somit läuft eine auf einer Oberfläche 13 aufgebrachte überschüssige Probe in den Sumpf 12 ab, und es ist weniger wahrscheinlich, dass sie sich mit der Probe auf einer benachbarten Oberfläche mischt. Im allgemeinen neigt eine auf einem Abschnitt einer Oberfläche angeordnete Probe mit der Zeit dazu, in benachbarte Abschnitte der Oberfläche zu diffundieren. Mit Bezug auf 2C verbinden sich die Inseln 14 untereinander an einem ersten Ende 7 durch das Substrat 11. Der Rest jeder Inse1 14 ist jedoch physisch von den benachbarten Inseln 14 getrennt. Jede Insel 14 umfasst mindestens eine freigelegte Oberfläche 13 zum Tragen einer Probe.
Bei einer Ausführungsform umfassen die Sümpfe 12 mindestens ein Loch 5 zum Entleeren der Proben, die sich in den Sümpfen 12 sammeln, weg von dem Probenhalter 10, wie in 2B gezeigt. Beispielsweise kann ein Vakuum an die Rückseite des Probenhalters 10 angelegt werden, um das sich in den Sümpfen 12 sammelnde Material aus den Sümpfen 12 zu saugen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Sümpfe 12 in dem Probenhalter 10 untereinander verbunden, um einen Ablauf zu bilden, wie in 2A, 2B und 2C gezeigt. Ein Ablauf hindert die Proben besser daran, sich zu den benachbarten Inseloberflächen 13 zu bewegen, indem sich die Proben von der Probenträgeroberfläche 13 weg bewegen. Der Ablauf ist breit genug, um Oberflächenspannung zwischen den Proben und den Ablaufoberflächen zu minimieren, um Proben zu veranlassen, hinab zu den Boden der Sümpfe 12 zu fließen, und um die Strömung der Proben in den Ablauf zum Entleeren zu veranlassen.
In den 3A, 3B und 3C entleert bei einer bevorzugten Ausführungsform der Probenhalter 30 die in den Sümpfen 32 gesammelten Proben. Der Probenhalter 30 umfasst eine erste Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen 32, die einen ersten Ablauf bilden, und eine zweite Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen 34, die einen zweiten Ablauf bilden. Die erste Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen 32 und die Probenträgeroberflächen 31 sind auf der ersten Oberfläche des Substrats 36 und die zweite Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen 34 ist an der zweiten Oberfläche des Substrats 38 angeordnet. Die zweite Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen 34 ist von der ersten Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen 32 versetzt angeordnet, so dass die erste Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen 32 die zweite Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen 34 kreuzt, um eine Mehrzahl von Löchern 37 zu erzeugen, die im wesentlichen senkrecht zu dem Substrat sind, und die sich durch die Dicke des Substrats erstrecken. Bei der in 3A, 3B und 3C gezeigten Ausführungsform ist jede Probenträgeroberfläche 31 von vier Löchern 37 zum Entleeren der Proben von dem Probenhalter 30 umgeben. Die Größe und Form der ersten Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen 32 kann, muss jedoch nicht die gleich wie der Größe und Form der zweiten Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen 34 sein.
Bei einer weiteren Ausführungsform umfasst der Probenhalter ein Substrat, das eine Mehrzahl von Probenträgeroberflächen festlegt. Jede Probenträgeroberfläche wird von einer Mehrzahl von senkrechten Kanälen umgeben, die sich durch das Substrat erstrecken, so dass eine auf einer Probenträgeroberfläche angeordnete überschüssige Probe von der Probenoberfläche weg durch die Kanäle abläuft.
In 10 umfasst bei noch einer weiteren Ausführungsform der Probenhalter 80 ein erstes Substrat 82 und ein zweites Substrat 84, das an dem ersten Substrat 82 befestigt ist. Das erste Substrat 82 umfasst eine Mehrzahl von Probenträgeroberflächen 86 und eine Mehrzahl von senkrechten Kanälen 88 benachbart den Probenträgeroberflächen 86. Die senkrechten Kanäle 88 erstrecken sich durch die Dicke des ersten Substrats 82. Das zweite Substrat 84 umfasst eine Mehrzahl von Sümpfen 90 oder untereinander verbundenen Sümpfen, die einen Ablauf festlegen. Die Mehrzahl von Sümpfen 90 des zweiten Substrats 84 sind in Kommunikation mit der Mehrzahl von vertikalen Kanälen 88 des ersten Substrats 82.
Bei den Ausführungsformen von 2A, 2B und 2C sind die Inseln 14 im wesentlichen in Größe und Form identisch, und die Sümpfe 12 sind ebenfalls in Größe und Form identisch. Die Gleichmäßigkeit in der Größe oder Form der Inseln 14, der Probenträgeroberflächen 13 oder der Sümpfe 12, obwohl bevorzugt, ist keine Anforderung der Erfindung. Bei einer beispielhaften Ausführungsform verändern sich die Bereiche der Probenträgeroberfläche 13 auf einem Probenhalter 10 abhängig von einer Eigenschaft der auf jeder Oberfläche 13 angeordneten Probe.
Jede Insel 14 umfasst einen Probenträger-Oberflächenbereich, der in der Größe mikroskopisch ist. Der Begriff "mikroskopisch" bezieht sich auf eine Fläche, die geringer als etwa 10.000 μm², vorzugsweise geringer als etwa 5.000 μm² und am bevorzugsten geringer als etwa 1.000 μm², und bei vielen Ausführungsformen geringer als 100 μm² ist. Kleinere Bereiche der Probenträgeroberfläche 13 bieten zusammen mit engen Abständen zwischen benachbarten Inseln 14 den Vorteil einer erhöhten Probendichte auf einem Probenhalter 10. Bei einer Ausführungsform umfasst der Probenhalter 10 mehr als 1.000 Inseln je cm² der Substratfläche 11. Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Probenhalter 10 mehr als 10.000 Inseln je cm² von Substratfläche. Die ausgewählte Höhe einer Insel 14 (oder die Tiefe des Sumpfes 12) hängt teilweise von dem beabsichtigten Probenvolumen ab, das auf die Probenträgeroberfläche 13 der Insel 14 anzuordnen ist. Der Begriff "Höhe" bezieht sich auf einen Abstand von einem ersten Ende 7 zu einem zweiten Ende 9 einer Insel 14. Die Höhe einer Insel 14 ist vorzugsweise groß genug, um die Probe auf der Probenträgeroberfläche 13 daran zu hindern, sich zu bewegen und die benachbarten Inseloberflächen 13 zu erreichen. Die Höhe einer Insel 14 und der Abstand zwischen der Insel und einer benachbarten Insel 14 legen die Größe des Sumpfes 12 zwischen den beiden Inseln fest. Bei einer Ausführungsform ist der Abstand zwischen benachbarten Inseln 14 geringer als etwa 100 μm. Bei bevorzugten Ausführungsformen ist der Abstand zwischen benachbarten Inseln weniger als ungefähr 50 μm jedoch groß genug, um eine viskose Flüssigkeit daran zu hindern, den Kanal zwischen benachbarten Inseln zu überbrücken. Bei einer bevorzugten Ausführungsform sind die Sümpfe 12 tief und schmal, wie es durch den Zustand der Fertigung ermöglicht wird. Die existierenden Fertigungstechnologien ermöglichen die Erzeugung eines Sumpfes 12 mit einer Tiefe, die 20 mal größer als seine Breite ist. Beispielsweise kann ein Sumpf 12 mit einer Breite von 10 μm eine Tiefe von bis zu 200 μm aufweisen. Da Abmessungen eines Sumpfs 12 durch existierende Fertigungstechnologien begrenzt sind, wird eine größere Tiefe zusammen mit einer engeren Breite mit den Fortschritten bei derartigen Technologien erwartet.
Die Inseln 14 und die Probenträgeroberflächen 13 sind erfindungsgemäß einzeln beispielsweise mit einem Laserstrahl adressierbar. Der Probenhalter 10 kann mindestens zwei oder mehr Bezugspunkte aufweisen, um bei der Identifikation von Probenstellen zu helfen. Außerdem ist eine Insel 14 oder eine Probenträgeroberfläche 13 wiederholt adressierbar, so dass eine mehrfache Analyse oder Synthese an einer Probe durchgeführt werden kann, die auf einer bestimmten Probenträgeroberfläche 13 oder einer Sammlung von benachbarten Oberflächen angeordnet ist. Bei einer Ausführungsform bilden die Inseln 14 auf dem Probenhalter 10 ein Array. Bei der Ausführungsform von 2A, 2B und 2C bilden die Inseln 14 ein zweidimensionales Array, und die Probenträgeroberflächen 13 sind im wesentlichen quadratisch. Erfindungsgemäß können die Probenträgeroberflächen 13 von jeder Form sein, die ausreicht, um eine Probe zu tragen. Bei der Ausführungsform von 5 bilden die Inseln 14 konzentrische Inseln 14, die Probenträgeroberflächen 13 bilden, die ringförmig sind. Dies ermöglicht eine bestimmte Oberfläche durch Rotation des Probenhalters 10 und radialer Bewegung einer Vorrichtung zur Verwendung beim Annähern an eine bestimmte Oberfläche zu adressieren. Bei der Ausführungsform von 6A und 6B bilden die Inseln 14 Subinseln 22 auf jeder Probenträgeroberfläche 13. Die Subinseln 22 werden durch mindestens einen Subsumpf 24 getrennt, der auf der Probenträgeroberfläche 13 angeordnet ist. Die Konfiguration umfasst Subinseln 22, die die Anordnung von mehreren Proben auf einer Probenträgeroberfläche 13 ermöglicht. Die Subinseln 20 können ein Array bilden.
Bei einer weiteren Ausführungsform kann eine elektrische Spannung auf spezifische Probenträgeroberflächen des Probenhalters 10 angewendet werden. Mit Bezug auf 7 umfasst ein Probenhalter 10 eine Mehrzahl von Ablauflöchern 5, die sich durch die Dicke des Probenhalters 10 erstrecken. Jedes Ablaufloch 5 ist in einem Sumpf zwischen zwei oder mehr benachbarten Inseln angeordnet. Metallanschlüsse 6 sind auf einer Rückseite 4 des Probenhalters 10 mikrogefertigt, und jeder Anschluss 6 erstreckt sich zu einem Ablaufloch 5. Mindestens einige der Probenträgeroberflächen und die Wände der Sümpfe sind metallisiert, so dass die Spannung zu diesen Trägeroberflächen gerichtet werden kann.
Viele Techniken können die Inseln 14 und die Sümpfe 12 erzeugen. Bei einer Ausführungsform werden die Inseln 14 und die Sümpfe 12 durch Ätzen der Sümpfe 12 erzeugt. Sowohl isotropische als auch anisotropische Ätzverfahren können verwendet werden, um die Sümpfe 12 zu erzeugen, wobei jedoch die anisotrope Ätztechnik bevorzugt ist, da anisotrope Ätztechniken imstande sind, tiefe, senkrechte, enge Kanäle zu erzeugen. Anisotrope Ätztechniken umfassen beispielsweise tiefes reaktives Ionenätzen, Elektronenstrahlätzen und LIGA (Lithographie-Galvanoformung-Abformung). Diese Ätztechniken sind in der Technik bekannt. LIGA ist ein Verfahren, das die Fertigung von dreidimensionalen Strukturen mit hohen Seitenverhältnissen ermöglicht. Das Verfahren beinhaltet vier Schritte: Bestrahlung, Entwicklung, Galvanoformung und Resist-Stripping. Der Bestrahlungsschritt beinhaltet ein Bestrahlen eines Resists mittels Laser, Elektronenstrahl oder Röntgenstrahl von einer Synchrotronstrahlungsquelle. Bei dem Entwicklungsschritt wird ein Muster in den Resist transferiert, und der Resist wird geätzt, um dreidimensionale Strukturen zu offenbaren, die das Resistmaterial umfassen. Bei dem Galvanoformungsschritt wird eine metallische Form um die Resiststrukturen durch Elektroplattieren erzeugt. Bei dem abschließenden Schritt wird der Resist entfernt, um Kanäle freizulegen. Anisotropes nasses Ätzen kann ebenfalls verwendet werden, um die Sümpfe 12 zu erzeugen. Anisotropes nasses Ätzen erfordert jedoch eine spezifische Art von Substrat 11. Beispielsweise muss das Substrat 11 kristallin sein, und das Ätzen findet entlang einer spezifischen Achse statt.
Beim Fertigen des Probenhalters 10 durch ein Ätzverfahren wird zuerst ein Substrat 11 bereitgestellt. Bei einer Ausführungsform umfasst das Substrat 11 ein leitendes Material. Ein leitendes Material oder eines, das ermöglicht, dass Ladung zu und von der Probe fließt, ist beispielsweise zum Fertigen eines MALDI-Probenhalters geeignet. Ein Substrat kann durch Beschichten eines anorganischen oder organischen Substrats mit einem leitenden Material leitend gemacht werden. Beispielsweise kann Gold auf ein nichtleitendes Substrat, gesputtert werden. Alternativ kann das Substrat 11 ein Metall, ein Glas, ein Kunststoff oder jedes andere Material umfassen, das zum Tragen einer Probe geeignet ist. Das Substrat 11 ist strukturiert, um Flächen zu kennzeichnen, die zu ätzen sind. Das strukturierte Substrat 11 wird geätzt, um die Inseln 14 und die Sümpfe 12 zu erzeugen. Für die Ausführungsformen, bei denen der Probenhalter 30 eine erste und eine zweite Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen 32, 34 aufweist, wie in 3A, 3B und 3C gezeigt, werden sowohl eine erste als auch eine zweite Oberfläche des Substrats 11 strukturiert und geätzt. Für die Ausführungsformen, bei denen die Sümpfe 12 mindestens ein Loch 5 zum Ablaufen umfassen, wie in 2B gezeigt, kann ein zusätzlicher Ätzschritt durchgeführt werden, um die Löcher 5 zu erzeugen. Beispielsweise können Löcher mit Abmessungen von ungefähr 10 μm × 10 μm durch die Dicke eines Substrats mit einer Dicke in dem Bereich von etwa 25 μm bis etwa 100 μm mittels LIGA oder Deep-Reactive-Ionenätztechniken geätzt werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform werden die Inseln 14 auf dem Substrat 11 mittels einer Mikrofertigungs-Aufbringungstechnologie gezüchtet, die in der Technik bekannt ist. Alternativ werden die Inseln 14 mittels einer Technik erzeugt, die als die " LIGA des einfachen Mannes" bezeichnet wird. Gemäß dieser Technik wird eine 30 bis 50 μm dicke Schicht von Photoresist auf einem Substrat 11 angeordnet, wie bei einer herkömmlicher Lithographie strukturiert, um Inseln 14 und Sümpfe 12 fest zu legen, und mit einem Lösungsmittel gewaschen. Bereiche, in denen die Photoresists weggewaschen wurden, definieren Sümpfe 12, und verbleibende Photoresiststrukturen definieren Inseln 14. Bei noch einer weiteren Ausführungsform können die Inseln 14 unabhängig gefertigt und anschließend an dem Substrat 11 gebondet werden.
Bei einer Ausführungsform umfassen die Probenträgeroberflächen 13 eine Oberflächenbeschichtung, die beispielsweise ausgestaltet ist, um die Probenadhäsion an den Trägeroberflächen 13 zu verbessern, um selektive Adsorption von Proben in verschiedenen Regionen des Halters vorzusehen, oder Oberflächeneigenschaften, wie beispielsweise Benetzungseigenschaften der Oberflächen 13 zu ändern. Beispielsweise können kationische oder anionische Teile, Chelatoren, organische Moleküle einschließlich komplexer Zucker und Heparin, bindende Proteine, wie beispielsweise Antikörper, Avidin etc., hydrophobische Beschichtungen (z.B. Oktadecylsilan) die Adhäsion oder Selektivität der Probe auf der Probenträgeroberfläche 13 verbessern. Diese können die Form eines anhaftenden Beschichtungsmaterials annehmen, das auf den Oberflächen 13 gebondet oder einfach adsorbiert ist, und können in jeder Form, einschließlich Gele, Fimbriae und arboriale Beschichtung, sein. Die Beschichtungsschicht kann wie einige Angström dünn oder jede gewünschte Dicke aufweisen. Jede Beschichtungstechnologie, die Fachleuten bekannt ist (oder hiernach entdeckt wird), kann verwendet werden, um die Probenträgeroberflächen 13 zu beschichten. Die zum Beschichten der Probenträgeroberflächen 13 benutzte besondere Beschichtungstechnologie bildet nach derzeitigem Verständnis keinen Aspekt der Erfindung.
Bei einer weiteren Ausführungsform umfassen die Oberflächen eine MALDI-Matrix eines per se bekannten Typs, die bereit ist, eine Probe zur Analyse in einem MALDI-Massenspektrometer aufzunehmen.
Bei einer Ausführungsform sind die Probenträgeroberflächen 13 glatt. Bei einer anderen Ausführungsform sind die Probenträgeroberflächen 13 unregelmäßig. Eine unregelmäßige Oberfläche erhöht den Oberflächenbereich und somit die Menge der auf der Oberfläche angeordneten Probe. Unregelmäßige Oberflächen verbessern ebenfalls die Adhäsion der Probe auf den Probenträgeroberflächen 13 durch Verbessern der physikalischen Bindung zwischen den Proben und den Oberflächen 13. Eine Vielfalt von Verfahren kann die Probenträgeroberflächen 13 unregelmäßig machen. Bei einer beispielhaften Ausführungsform können mehrere Ätzschritte durchgeführt werden, um Sümpfe mit abweichender Tiefe zu erzeugen. Der erste Ätzschritt kann Subsümpfe erzeugen, die 10 μm tief sind, und der zweite Ätzschritt kann Sümpfe erzeugen, die 100 μm tief sind, so dass jede Insel 14 eine Mehrzahl von Subsümpfen umfasst, die die Probenträgeroberfläche auf der Insel 14 unregelmäßig machen. Bei einer weiteren beispielhaften Ausführungsform wird eine organische Beschichtung, wie beispielsweise eine fimbriatierte organische Beschichtung auf den Probenträgeroberflächen 13 aufgebracht. Eine fimbriatierte organische Beschichtung kann die Belastungsfähigkeit um das drei- bis fünffache erhöhen. Bei noch einer weiteren beispielhaften Ausführungsform werden die Probenträgeroberflächen 13 bei einem Eloxalverfahren geätzt, um Poren zu erzeugen, die eine Tiefe von 1 bis 2 μm, einen Durchmesser von 100 bis 500 Angström, eine Porosität von 50 bis 70% und einen Oberflächenbereich größer als 100 qm/g aufweisen. Das Eloxalverfahren wird in L.T. Canham, "Biactive Silicon Structure Fabrication Through Nanoetching Techniques", Advanced Materials, 7:1033 (1995) beschrieben.
Bei einer Ausführungsform kann der Ablauf oder die Oberflächen der Sümpfe 12 behandelt werden, um die Benetzungseigenschaften dieser Oberflächen zu modifizieren. Um die Benetzbarkeit zu verbessern und um es dadurch Proben zu ermöglichen, sich zu verteilen und an dem Boden der Sümpfe 12 zu sammeln, können die Sumpfoberflächen beispielsweise mit einem grenzflächenaktiven Stoff oder einer hydrophobischen Substanz beschichtet sein. Jede Oberflächenbehandlungstechnologie, die Fachleuten bekannt ist (oder die hiernach entdeckt wird) kann verwendet werden, um die Benetzungseigenschaften der Sumpfoberflächen zu modifizieren. Das besondere Verfahren zum Modifizieren der Benetzungseigenschaften der Sumpfoberflächen bildet keinen Aspekt der Erfindung.
Der Probenhalter 10 der Erfindung kann verwendet werden, um eine große Anzahl von dicht angeordneten Proben zur Verwendung bei eine chemischen Analyse oder einer biologischen Synthese zu tragen.
Mit Bezug auf 8 wird der Probenhalter 10 der Erfindung als eine Probenplatte bei einer MALDI-Vorrichtung 40 verwendet. Eine MALDI-Vorrichtung 40 umfasst eine Vakuumkammer 44, einen Probenhalter 10, der innerhalb der Probe 44 zum Halten einer Vielzahl von Proben angeordnet ist, eine Laserquelle 46 und ein Massenspektrometer 48. Die Laserquelle 46 erzeugt einen Laserstrahl 42 zum Treffen einer adressierten Probe auf einer ausgewählten Probenträgeroberfläche 13, um darin angeordnete Probenmoleküle zu desorbieren und ionisieren. Das Massenspektrometer 48 analysiert seriell die Vielzahl von Proben durch Erfassen der desorbierten und ionisierten Probenmoleküle an einer entsprechenden Vielfalt von Inseln. Der Probenhalter 10 ermöglicht die Anordnung einer großen Anzahl von Proben, die voneinander auf einer kleinen Oberfläche physisch getrennt sind. Beispielsweise kann ein Probenhalter 10 mit einer Abmessung von 2 Zoll mal 2 Zoll (4,4 × 4,4 cm) etwa 250.000 Proben (oder mehr) tragen, wobei jede Probe wirksam auf einer Probenträgeroberfläche 13 einer Insel 14 oder einer Gruppe von derartigen Trägeroberflächen isoliert ist. Die für die Probenträgeroberfläche 13 ausgewählten Abmessungen können teilweise von dem Durchmesser des auf eine Probe auftreffenden Laserstrahls 42 abhängen. Bei einer Ausführungsform weist jede Probenträgeroberfläche 13 einen Fläche auf, die ungefähr gleich oder geringfügig kleiner als die Fläche des Laserstrahls 12 ist, so dass im wesentlichen die gesamte, auf der Trägerstruktur 14 angeordneten Probe durch den Laserstrahl 42 beleuchtet wird, wenn die Adresse genau spezifiziert ist. Der Durchmesser eines gegenwärtig bei der MALDI-Analyse verwendeten typischen Laserstrahls 42 beträgt ungefähr 100 μm². Es ist jedoch möglich, den Laserstrahldurchmesser auf etwa 5 μm² zu verringern. Alternativ kann ein Laserstrahl mit kleiner Fläche verwendet werden, um Spezies auf einer adressierten Insel bei mehreren Stellen zu desorbieren und ionisieren. Bei einer weiteren Ausführungsform ist eine Probenträgeroberfläche 13 gefertigt, um eine kleine Oberfläche aufzuweisen, um eine Probe auf der Probenträgeroberfläche 13 zu konzentrieren. Während einer Trocknungsstufe der Probenherstellung kann sich die Probe überall dahin verteilen, wo es die Flüssigkeitsmatrix gibt. Daher kann sich die Probe auf einer größeren Oberfläche auf eine weitere Fläche verteilen, wobei eine weniger konzentrierte Probe erzeugt wird, während sich auf einer kleineren Oberfläche die Probe auf eine engere Fläche verteilt, wobei eine konzentriertere Probe erzeugt wird. Die konzentrierte Probe kann zu MALDI-Spektren mit besserer Auflösung führen.
Außerdem ermöglicht der Probenhalter 10 eine Identifikation jeder Probenposition auf dem Probenhalter 10, so dass jede Probe selektiv adressierbar ist. Auf diese Art und Weise kann die MALDI-Analyse selektiv an einer gewünschten Probe durchgeführt werden. Die Probenposition bezüglich des Laserstrahls 42 kann vielfältig eingestellt werden. Bei einer Ausführungsform ist der Probenhalter 10 auf einem xy-Tisch angeordnet, und die xy-Position wird von einem oder mehreren Schrittmotoren gesteuert, die herkömmlicherweise mit xy-Tischen verwendet werden. Mit der Computersteuerung der Schrittmotoren ermöglicht dieses System, dass jeder ausgewählte Punkt des Probenhalters 10 genau an dem optischen Pfad des Laserstrahls 42 positioniert wird. Bei einer weiteren Ausführungsform wird herkömmliche Optik verwendet, um die Richtung des Laserstrahls 42 mit Bezug auf den Probenhalter 10 zu ändern, wodurch ermöglicht wird, dass unterschiedliche Probenträgeroberflächen 13 bestrahlt werden. Verfahren zum Verändern der Probenposition oder der Laserstrahlposition sind in der Technik bekannt und sind keine Aspekte der Erfindung.
Die Tiefe, Breite und Länge der Sümpfe 12 hängt von zahlreichen Faktoren ab, einschließlich der gewünschten Probendichte an dem Probenhalter 10, dem an jeder Probenträgeroberfläche 13 angeordneten Probenvolumen und dem minimalen inkrementalen Abstand, bei dem der Laserstrahl bezüglich den Probenträgeroberflächen 13 manövriert werden kann. Ein schmalerer Sumpf 12 (oder kürzerer Abstand zwischen benachbarten Inseln 14) ermöglicht, dass eine größere Anzahl von Inseln 14 auf einem Probenhalter 10 erzeugt werden können. Ein kürzerer Abstand zwischen Inseln 14 führt jedoch ebenfalls zu einem kleineren Sumpfvolumen, es sei denn, dass der Sumpf 12 tief ausgeführt werden kann. Ein kurzer Abstand zwischen Inseln 14 kann ebenfalls viskosen Flüssigkeiten ermöglichen, den Kanal zwischen benachbarten Inseln 14 zu überbrücken. Gegenwärtige Mikrofertigungstechnologien ermöglichen die Erzeugung von Kanälen mit einem Seitenverhältnis von bis zu etwa 100. Ein Seitenverhältnis bezieht sich auf das Verhältnis einer Tiefe zu einer Breite eines Kanals, wobei die Tiefe eine Abmessung senkrecht zu einem Substrat und die Breite eine kürzeste Abmessung parallel zu dem Substrat ist. Die aktuelle typische Mikrofertigungstechnologie ermöglicht eine Auflösung bei der Herstellung von Masken und dem Ätzen bis auf etwa 0,1 μm. Daher beträgt die untere Grenze für eine Kanalbreite etwa 0,5 ± 0,1 μm. Da Sumpfabmessungen durch Fertigungsbeschränkungen und nicht durch Ausgestaltung begrenzt sind, werden Sümpfe 12 mit größeren Seitenverhältnissen erwartet, wenn Fertigungstechnologien voranschreiten. Bei Ausführungsformen, bei denen die Sümpfe 12 Ablauflöcher 5 aufweisen, wird durch eine effiziente Entfernung der transportierten Proben die Notwendigkeit für tiefere und breitere Sümpfe vermieden. Bei Ausführungsformen, die Sümpfe 12 ohne die Ablauflöcher 5 aufweisen, müssen jedoch die Sümpfe 12 groß und tief genug sein, um diffundierte Proben am Erreichen weiterer Proben zu hindern, die auf benachbarten Probenträgeroberflächen 13 angeordnet sind.
Die MALDI-Analyse mit dem Probenhalter 10 der Erfindung liefert eine schnelle Analyse einer großen Anzahl von Proben, indem ermöglicht wird, dass eine Vielzahl von Proben auf einer kleinen Oberfläche ohne ineinander zu diffundieren angeordnet werden. Bei einer Ausführungsform benötigt die Analyse für eine Probe weniger als ungefähr 1 Sekunde, wobei jede Analyse ein Beaufschlagen der Probe mit mehr als ungefähr 10 Laserstrahl-Impulsen umfasst. Bei einer weiteren Ausführungsform benötigt die Analyse für eine Probe weniger als ungefähr 100 ms, wobei jede Analyse ein Beaufschlagen der Probe mit ungefähr 100 Laserstrahl-Impulsen umfasst.
Physisch getrennte unterscheidbare Proben können auf dem Probenhalter 10 mittels vieler Verfahren beladen werden. Bei einer Ausführungsform werden die Proben, die mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese getrennt sind, auf den Probenhalter 10 mittels Elektroblotting oder Elution geladen.
Die zweidimensionale Gelelektrophorese beinhaltet zwei sequentielle Trennungen, die orthogonal in einem Gelmedium durchgeführt werden, wobei typischerweise zwei unterschiedliche Trennungskriterien, z.B. isoelektrisches Fokussieren gefolgt von Gelelektrophorese, genutzt werden. Das isoelektrische Fokussieren trennt Proteine gemäß der Ladung, und die Gelelektrophorese trennt Proteine mittels Molekülgröße. Die zweidimensionale Gelelektrophorese erzeugt ein zweidimensionales Muster von Spots, wobei jeder Spot typischerweise aus einem spezifischen Protein besteht. Zweidimensionale Elektrophorese ist in der Technik bekannt.
Elektroblotting beinhaltet den Transfer von Proteinen von dem Gel auf eine andere Oberfläche mittels eines elektrischen Stroms, um ihre Wanderung auf einer Art und Weise ähnlich der ursprünglichen Elektrophorese, jedoch in einer senkrechten Richtung, zu treiben. Elektroblotting ist in der Technik bekannt. Herkömmliches Punkt-Blotting kann ebenfalls verwendet werden, wenn die Oberflächen 13 des Halters behandelt werden, um eine Probe zu adsorbieren oder absorbieren.
Für die Elektroblotting-Ausführungsform kann der Probenhalter 10 eine Vielzahl von Elektroden umfassen, die während der Herstellung des Halters 10 mittels herkömmlicher Festkörperschaltungs-Mikrofertigungstechniken mikrogefertigt wurden, die ermöglichen, eine biologische Probe selektiv zu elektroblotten, die in einem zweidimensionalen Feld, z.B. durch 2D-Elektrophorese, zuvor getrennt wird. Jede Oberfläche 13 oder eine Untermenge davon kann ausgestaltet sein, um einzeln adressiert zu werden, um eine Probe elektrisch anzuziehen oder nicht, wie gewünscht. Die Proteine oder andere Moleküle werden auf der Probenträgeroberfläche 13 selektiv elektrogeblottet, so dass jede auf einer Probenträgeroberfläche 13 angeordnet wird.
Bei einer Elektroblotting-Ausführungsform können die Probenträgeroberflächen 13 des Probenhalters 10 eine gesputterte Goldschicht, die als die Elektroden arbeitet, und eine hydrophobische Beschichtungsschicht mit einer Mischung aus CH₃(CH₂)₇SH und HS-CH₂CO₂H, die über der Goldschicht angeordnet ist, umfassen. Die Mischung stellt Löcher in der hydrophobischen Beschichtung bereit, so dass der Strom die Goldschichtoberfläche erreichen kann. Blotting tritt durch Anlegen von Spannung an die Goldschicht auf. Bei einer bevorzugten Ausführungsform findet das Blotting in einer Kammer unter Heliumdruck statt. Diese Umgebung löst das durch Elektrolyse an der Goldoberfläche erzeugte Gas auf, das andernfalls die Elektrophorese behindern würde. Bei einer weiteren Blotting-Ausführungsform umfasst der Probenhalter 10 eine mit C₁₈ beschichtete Silikaplatte. Die Silikaplatte umfasst Löcher, die sich durch die Dicke der Platte erstrecken, die ungefähr alle 100 Mikrometer positioniert sind. Das Gel, das getrennte Proteine umfasst, ist über der Silikaplatte angeordnet, und eine Spannung wird über die hintere Oberfläche des Probenhalters 10 und des Gels angelegt. Der Halter der Probe 10 umfasst Metallanschlüsse, die auf der hinteren Oberfläche mikrogefertigt sind. Wenn Proteine seitlich wandern um die Löcher zu erreichen, kontaktieren sie die Probenträgeroberfläche 13 und adsorbieren daran. Eine vollständig flache Oberfläche würde Kreise von Analyten um die Löcher erzeugen.
9 veranschaulicht das Eluieren von Proben von einem zweidimensionalen Gel 54 zu dem Probenhalter 10 der Erfindung. Ein Gitter 52, das ein zweidimensionales Gel 54 mit getrennten Biopolymer-Molekülen trägt, ist über einem Probenhalter 10 angeordnet. Eine Lösung 56 läuft durch das Gitter 52 und den Probenhalter 10, um Biopolymer-Moleküle selektiv zu eluieren und getrennte Biopolymer-Moleküle auf die Trägeroberflächen 13 des Probenhalters 10 zu transferieren. Die Lösung 56 wird von dem Probenhalter 10 durch Laufen durch die Sümpfe 12 und die Löcher 5 entleert.
Alternativ kann ein mikroskopischer Punktdrucker die Proben auf die Probenträgeroberflächen 13 laden. Bei einer Ausführungsform umfasst der mikroskopische Druckmechanismus eine robotergesteuerte Ausgabeeinrichtung, die sich von einer Probenträgeroberfläche 13 zu einer anderen Oberfläche 13 auf dem Probenhalter 10 bewegt, wobei eine gewünschte Probe auf jeder Probenträgeroberfläche 13 aufgebracht wird. Beispielsweise kann eine Ausgabeeinrichtung eine Mikropipette, die eine Probe enthält, und ein Robotersystem, das die Position der Mikropipette bezüglich dem Probenhalter 10 steuert, umfassen. Die Ausgabeeinrichtung kann eine Reihe von Mikropipetten oder ein Array von Mikropipetten aufweisen, um mehrere Proben zu liefern. Bei einer anderen Ausführungsform umfasst die Ausgabeeinrichtung eine Tintenstrahldruckvorrichtung. Jedes geeignete Mittel zum Laden einer Probe oder Proben auf dem Probenhalter 10, das in der Technik bekannt ist, kann in Übereinstimmung mit der Erfindung verwendet werden. Das US-Patent 5 599 695 beschreibt viele mikroskopische Druckmechanismen.
Bei anderen Ausführungsformen kann der Probenhalter 10 ebenfalls als ein Substrat bei proteomer oder genomer Forschung verwendet werden. Die Begriffe "Proteomik" oder "Genomik", wie hier verwendet, beziehen sich auf die Wissenschaft von Proteinen oder DNAs, um mehrere unterschiedliche Substanzen mehr oder weniger gleichzeitig zu synthetisieren oder zu untersuchen. Der Probenhalter 10 der Erfindung ermöglicht eine selektive Analyse oder Synthese einer Probe aus einer Vielzahl von Proben, die auf einem einzigen Substrat angeordnet sind. Der Probenhalter 10 erlaubt ferner eine wiederholte Adressierung einer auf einer Probenträgeroberfläche 13 angeordneten Probe zur mehrfachen Analyse.
Bei einer Ausführungsform trennt eine zweidimensionale Gelelektrophorese zuerst biologische Polymere in einer komplexen Probe, und die getrennten Polymere werden auf den Probenhalter 10 der Erfindung geblottet. Entweder vor oder nach dem Blotting wird jedes Polymer zersetzt (digested), um mehrere Fragmente jedes Biopolymers, z.B. eine Leitersequenz, zu erzeugen. Die getrennten fragmentierten Proteine oder DNAs werden dann auf eine von zahlreichen Arten, wie beispielsweise Massenspektrometrie, analysiert, um beispielsweise ihre Sequenz zu bestimmen.
Bei einer anderen Ausführungsform wird der Probenhalter 10 der Erfindung als ein Chemiesubstrat zum Fertigen einer Bibliothek von Polymeren (z.B. PNAs) und genauer gesagt, einer Bibliothek von Biopolymeren, verwendet. Die Biopolymere umfassen beispielsweise, wobei sie jedoch nicht darauf begrenzt sind, Peptide, Oligonukleotide und organische Moleküle. Eine Bibliothek von Biopolymeren kann beispielsweise angefertigt werden, indem zuerst mehrere Reaktionsstoffe auf die Probenträgeroberflächen angeordnet werden, so dass jeder Reaktionsstoff auf einer oder einige wenige benachbarte Probenträgeroberflächen 13 angeordnet ist. Die Reaktionsstoffe werden dann unterschiedlichen Monomeren ausgesetzt, die potentiell mit den Reaktionsteilnehmern wechselwirken. Die Reaktionsteilnehmer können beispielsweise Vernetzungsmoleküle sein. Auf diese Art und Weise kann eine unterschiedliche chemische Reaktion bei jeder Probenträgeroberfläche 13 beliebig erzeugt werden. Ein Array, das eine Bibliothek von Biopolymeren umfasst, kann bei einem Analyseverfahren, wie beispielsweise Hybridisierung oder Medikamentenscreening, verwendet werden. Das US-Patent 5 605 662 beschreibt mikroelektronische Systeme zum Ausführen von molekularen biologischen Reaktionen, wie beispielsweise Nukleinsäurehybridisierung, Antikörper/Antigenreaktionen, klinische Diagnostik und biopolymere Synthese.
Bei noch einer weiteren Ausführungsform umfasst der Probenhalter 10 Bibliotheken unimolekularer, doppelsträngiger Oligonukleotide, die auf den Probenträgeroberflächen 13 ausgebildet sind. Die doppelsträngigen Oligonukleotiden können gebildet werden, indem zuerst ein Teil eines Oligonukleotids auf einer Probenträgeroberfläche 13 angeordnet wird, und anschließend der erste Teil einem zweiten Teil des Oligonukleotiden ausgesetzt wird. Diese Bibliotheken sind bei der pharmazeutischen Forschung für das Screening von zahlreichen biologischen Proben für spezifische Wechselwirkungen zwischen den doppelsträngigen Oligonukleotiden und Peptiden, Proteinen, Arzneimitteln und RNA nützlich. Das US-Patent 5 556 752 beschreibt eine Fertigung von unimolekularen doppelsträngigen Oligonukleotiden auf einem Substrat.
Es ist ersichtlich, dass die gezeigten Ausführungsformen beispielhaft sind und es beabsichtigt ist, den Schutzumfang der Erfindung nur durch den Schutzumfang der beigefügten Ansprüche einzuschränken.

Claims

Probenhalter mit einem Substrat (11), das eine Vielzahl Inseln (14), die Probenträgeroberflächen (13) festlegen, und mindestens einem Sumpf bzw. Wanne (12), der benachbarte Oberflächen (13) trennt und den Transport von Proben zwischen benachbarten Oberflächen (13) sperrt, aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat (11) ein mikrogefertigtes Substrat (11) ist, das die Vielzahl mikroskopischer Inseln (14) festlegt, die von dem Substrat (11) vorstehen.
Probenhalter gemäß Anspruch 1, bei dem der mindestens eine Sumpf (12) eine Mehrzahl untereinander verbundener Sümpfe (12) umfasst, die eine Rinne zur Drainage bilden.
Probenhalter gemäß Anspruch 1, bei dem der mindestens eine Sumpf (12) mindestens ein Loch (37) umfasst, das im wesentlichen senkrecht zu und durch die Oberfläche (11) läuft.
Probenhalter gemäß Anspruch 2, bei dem das Substrat (11) eine erste Oberfläche und eine zweite Oberfläche umfasst, und bei dem die Mehrzahl untereinander verbundener Sümpfe (12) eine erste Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen (32), die Probenträgeroberflächen (13) und die an der ersten Oberfläche des Substrats (11) angeordnete erste Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen (32) umfasst, und wobei der Probenhalter ferner eine zweite Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen (34) umfasst, die auf der zweiten Oberfläche des Substrats (11) angeordnet und von der ersten Gruppe der untereinander verbundenen Sümpfe (32) versetzt sind, um eine Mehrzahl vertikaler Löcher (37) zu erzeugen, die sich durch das Substrat (11) erstrecken, wobei die erste Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen (32) die zweiten Gruppe von untereinander verbundenen Sümpfen (34) kreuzt.
Probenhalter gemäß Anspruch 1, bei dem die mikroskopischen Inseln (14) geometrisch ungleichmäßig sind.
Probenhalter gemäß Anspruch 1, bei dem mindestens eine Insel der Vielzahl Inseln (14) Sub-Inseln (22) umfasst, die durch mindestens einen an der Probenträgeroberfläche angeordneten Sub-Sumpf (24) getrennt sind.
Probenhalter gemäß Anspruch 1, bei dem die Vielzahl Inseln (14) konzentrisch angeordnete Kreise von Inseln (14) umfasst.
Probenhalter gemäß Anspruch 1, bei dem die Probenträgeroberflächen (13) unregelmäßig sind, um die Oberfläche zu vergrößern.
Probenhalter gemäß Anspruch 1, bei dem das Substrat (11) ein leitendes Material umfasst, das eine Ionisierung einer darauf angeordneten Probe ermöglicht.
Probenhalter gemäß Anspruch 1, bei dem die Probenhalteroberflächen (13) eine Überzugsschicht umfassen.
Probenhalter gemäß Anspruch 1, ferner mit einer Mehrzahl Proben für eine Analyse, wobei jede Probe auf einer Probenträgeroberfläche angeordnet ist.
Probenhalter gemäß Anspruch 1, ferner mit einer Elektrode, die auf dem Substrat (11) in elektrischer Verbindung mit einer mikroskopischen Insel angeordnet ist, um Elektro-Blotting einer Probe auf der Probenträgeroberfläche zu ermöglichen.
Probenhalter gemäß Anspruch 1, ferner mit einer Mehrzahl Reaktionsteilnehmer, wobei jeder Reaktionsteilnehmer auf einer Probenträgeroberfläche zum Ausführen einer biologischen Reaktion angeordnet ist.
Probenhalter gemäß Anspruch 1, ferner mit einem auf einer Probenträgeroberfläche angeordneten Polymer.
Probenhalter gemäß Anspruch 14, bei dem das Polymer ein Biopolymer ist.
Probenhalter gemäß Anspruch 14, bei dem das Polymer eine Einzelstrang-Nukleotidsonde umfasst.
System zur schnellen Analyse einer Mehrzahl Proben mit: einer Kammer (44) mit gesteuertem Unterdruck; einem Probenhalter (10) zur Anordnung innerhalb der Kammer zum Halten einer Mehrzahl Proben, dem Probenhalter gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16; einer Laservorrichtung (46), die einen Laserstrahl zum Treffen eine Probe auf einer Probenträgeroberfläche erzeugt und richtet, um Probenmoleküle zu desorbieren und ionisieren; und einem Massenspektrometer (48) zum Analysieren von Proben auf dem Probenhalter durch Erfassen deren Masse nach der Desorption und Ionisation.
System gemäß Anspruch 17, ferner mit einem Mechanismus zum Bewegen des Probenhalters (10) mit Bezug auf den Laserstrahl, so dass jede Probenträgeroberfläche von einem stationären Laserstrahl getroffen werden kann.
System gemäß Anspruch 17, bei dem jede Probenträgeroberfläche einen Oberflächenbereich aufweist, der ungefähr gleich oder kleiner als ein Durchmesser des Laserstrahls ist, der jede Probe trifft.
Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe mit: a) Bereitstellen eines Probenhalters gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16; b) Platzieren einer Mehrzahl Proben in Kontakt mit den Probenträgeroberflächen (13); und c) Durchführen eines Analyseschrittes an der biologischen Probe.
Verfahren gemäß Anspruch 20, bei dem der Schritt b) ein Plazieren einer biologischen Probe in Kontakt mit einer Probenträgeroberfläche umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 20, bei dem der Schritt c) eine Erfassung durch Massenspektrometrie umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 20, bei dem der Schritt b) ein Blotting der getrennten Proteine in dem zweidimensionalen Gel auf den Probenträgeroberflächen (13) umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 20, bei dem der Schritt b) ein Drucken der Vielzahl biologischer Proben auf den Probenträgeroberflächen (13) mittels eines mikroskopischen Druckverfahrens umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 24, bei dem das mikroskopische Druckverfahren ein Ausgeben jeder Probe in der Vielzahl Proben umfasst, die getrennt in einer Vielzahl Mikropipetten enthalten sind, auf einer ausgewählten Probenträgeroberfläche mittels eines Robotersystems, das im Stande ist, die Position der Mikropipetten bezüglich der Probenträgeroberflächen (13) zu manövrieren.
Verfahren gemäß Anspruch 20, bei dem der Schritt c) ein Immunoassay umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 20, ferner mit Anfertigen einer Bibliothek von Polymeren auf dem Probenhalter, so dass jedes Polymer auf einer Probenträgeroberfläche angeordnet ist.
Verfahren gemäß Anspruch 20, bei dem jede Oberfläche der Probenträgeroberflächen (13) getrennt adressierbar ist, und der Schritt c) ein selektives Durchführen einer Analyse auf einer gewünschten Probenträgeroberfläche umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 28, bei dem jede Oberfläche der Probenträgeroberflächen (13) zum selektiven Bilden einer Analyse wiederholt adressierbar ist.