DE69827781T2

DE69827781T2 - Verfahren und systeme zum verbesserten flüssigkeitstransport

Info

Publication number: DE69827781T2
Application number: DE69827781T
Authority: DE
Inventors: T. Theo NIKIFOROV; Sang Jeong
Original assignee: Caliper Life Sciences Inc
Current assignee: Caliper Life Sciences Inc
Priority date: 1997-04-04
Filing date: 1998-03-30
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2018-03-31
Also published as: US6471841B1; US6129826A; AU739133B2; EP0972333A1; CA2284622A1; US5964995A; DE69827781D1; EP0972333A4; WO1998045929A1; AU6788798A; EP0972333B1; ATE283571T1; ES2234107T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es besteht ein wachsendes Interesse an der Entwicklung und Herstellung von Fluidiksystemen im Mikromaßstab zum Erhalt von chemischen und biochemischen Informationen sowohl im Rahmen von präparativen als auch analytischen Methoden. Die Anpassung von Technologien aus der Elektronikindustrie, wie beispielsweise Photolithographie, nasschemisches Ätzen und dergleichen, trug zum Anstieg dieses Interesses bei.
Eines der ersten Gebiete, auf dem Mikrofluidiksysteme zur chemischen und biochemischen Analyse Anwendung fanden, war der Bereich der Kapillarelektrophorese (CE). CE-Systeme setzen im Allgemeinen Kapillaren aus geschmolzenem Silica, und in jüngster Zeit auch in planare Siliciumdioxidsubstrate geätzte Kanäle, ein, die mit einer angemessenen Trennmatrix oder -medium gefüllt sind. Eine zu analysierende Fluidprobe wird an einem Ende der Kapillare oder des Kanals injiziert. Das Anlegen von Spannung entlang der Kapillare ermöglicht dann die elektrophoretische Wanderung der Spezies in der Probe. Unterschiedliche elektrophoretische Mobilitäten der Bestandteile einer Probe, z.B. aufgrund ihrer unterschiedlichen Nettoladung oder Größe, ermöglichen ihre Trennung, Identifikation und Analyse. Um den Aspekt des Trennens der CE-Anwendungen zu verbessern, hat die Forschung nach Wegen zur Maximierung der elektrophoretischen Mobilität geladener Spezies relativ zueinander und relativ zum Fluss des Fluids durch die Kapillare, der z.B. durch Elektroosmose entsteht, gesucht. Vgl. u.a. das U.S.-Patent Nr. 5.015.350 (Wiktorowicz) und das U.S.-Patent Nr. 5.192.405 (Petersen et al).
Abgesehen von diesen CE-Anwendungen haben sich die Technologien der Elektronikindustrie auch auf die Herstellung von Fluidiksystemen in kleinem Maßstab zum Transport von geringen Fluidvolumen entlang relativ kleiner Flächen, um eine oder mehrere vorbereitende oder analytische Manipulationen an diesem Fluid vorzunehmen, konzentriert. Diese Nicht-CE-Fluidiksysteme unterscheiden sich von den CE-Systemen insofern, als ihr Ziel nicht in der elektrophoretischen Trennung der Bestandteile einer Probe oder eines Fluids liegt, sondern auf den Volumentransport der Fluide und der in diesen Fluiden enthaltenen Materialien abzielen. Typischerweise basierten diese Nicht-CE-Fluidiksysteme auf der mechanischen Fluidrichtung und Transportsystemen, wie beispielsweise Miniaturpumpen und -ventilen, um den Transport von Material von einem Ort zu einem anderen durchzuführen. Vgl. beispielsweise die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 97/02357. Die Herstellung solcher mechanischer Systeme kann jedoch äußerst schwierig und kostenaufwendig sein, und sie stellen noch immer keine präzise Fluidiksteuerung von Volumen bereit, deren Menge wesentlich unter dem Mikroliterbereich liegt.
Elektroosmotische (E/O) Fließsysteme wurden beschrieben, die eine wesentliche Verbesserung gegenüber diesen mechanischen Systemen bereitstellen, vgl. z.B. die veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 96/04547 von Ramsey et al. Typischerweise funktionieren derartige Systeme durch Anlegen einer Spannung entlang einem fluidgefüllten Kanal, dessen Oberfläche oder Wände geladene oder ionisierbare, mit diesen assoziierte Gruppen aufweisen, um einen elektroosmotischen Fuss des Fluids in die Richtung des Stroms auszulösen. Trotz der wesentlichen Verbesserungen, die diese elektroosmotischen Fluidleitsysteme bereitstellen, bleibt noch viel Raum für Verbesserungen bei der Anwendung dieser Systeme. Die vorliegende Erfindung befriedigt diese und andere Bedürfnisse.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt im Allgemeinen Verfahren und Systeme bereit, die für den gesteigerten Transport und die Führung von Materialien unter Verwendung des elektroosmotischen Flusses eines Fluids, das eben diese Materialien enthält, sorgen. Beispielsweise stellt die gegenständliche Erfindung in einem ersten Aspekt Verfahren zur Steigerung des Materialtransports durch elektroosmotischen Fluss bereit, wie in Abspruch 1 dargelegt.
In einem verwandten Aspekt stellt die Erfindung weiters Verfahren zum Transport von zumindest einem ersten und einem zweiten diskreten Fluidvolumen entlang einem fluidgefüllten Kanal bereit, wie in Anspruch 12 dargelegt.
Zudem stellt die vorliegende Erfindung Mikrofluidiksysteme bereit, wie in Anspruch 17 dargelegt, die diese gesteigerte Flussleitungs- und Transportverfahren einsetzen, d.h. für einen solchen gesteigerten Fluidransport und -führung innerhalb einer mikroskaligen Fluidkanalstruktur sorgen. Im Besonderen umfassen diese Mikrofluidiksysteme zumindest drei Öffnungen, die an den Enden von zumindest zwei sich kreuzenden Kanälen, die zur Unterstützung des elektroosmotischen Flusses fähig, angeordnet sind. Typischerweise weist zumindest einer der sich kreuzenden Kanäle zumindest eine Querschnittsgröße von etwa 0,1 μm bis etwa 500 μm auf. Jede der Öffnungen kann eine Elektrode umfassen, die in elektrischem Kontakt mit dieser angeordnet ist. Weiters umfasst das System ein in den Kanälen angeordnetes Fluid, wobei das Fluid in elektrischem Kontakt mit den Elektroden steht und worin das Fluid eine wirksame Konzentration einer zwitterionischen Spezies umfasst.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung der Wirkung der elektrophoretischen Mobilität geladener Spezies auf die Wanderung dieser Spezies in einem kohärenten elektroosmotischen Fluidfluss. 1A veranschaulicht eine optimale Situation, in der unterschiedlich geladene chemische Spezies, die in einem Fluid enthalten sind, scheinbare Mobilitäten aufweisen, die im Wesentlichen der elektroosmotischen Flussrate des Fluids entspricht. 1B veranschaulicht eine Situation, in der die scheinbare Mobilität von positiv geladenen Spezies größer als die Rate des elektroosmotischen Flusses und die scheinbare Mobilität von negativ geladenen Spezies geringer ist als die Rate des elektroosmotischen Flusses oder entgegengesetzt zu dieser verläuft, was zu einer elektrophoretischen Vorspannung der geladenen Spezies in den diskreten Fluidvolumen führt. 1C veranschaulicht eine Situation, in der die scheinbaren Mobilitäten einer geladenen Spezies wesentlich von der Rate des elektroosmotischen Flusses des Fluids abweichen, sodass sich die geladen Spezies in den zwei diskreten Fluiden überlappen.
2 ist ein Graph, der die Einwirkung von Sulfobetain auf den elektroosmotischen Fluss und die scheinbare Mobilität geladener Spezies unter den Bedingungen des elektroosmotischen Flusses aufzeigt.
3 veranschaulicht eine Mikrofluidikvorrichtung, die zur Durchführung von Enzymhemmertests verwendet wird.
4 zeigt eine graphischen Vergleich von Enzymhemmertests in Gegenwart und in Abwesenheit der zwitterionischen Verbindung NDSB.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Allgemein
Die vorliegende Erfindung stellt im Allgemeinen Verfahren und Systeme für den gesteigerten Transport und die Führung von Materialien in Fluidiksystemen unter Verwendung des elektroosmotischen Flusses eines Fluids, das eben diese Materialien enthält, bereit. Unter "gesteigertem Transport und Führung" ist allgemein der elektroosmotische Fluss und die Führungsrichtung von Fluiden in Fluidiksystemen zu verstehen, die (1) eine Reduktion der elektrophoretischen Mobilität einer geladenen Spezies relativ zum elektroosmotischen Fluss des diese Spezies enthaltenden Fluids; und/oder (2) einen Anstieg des gesamten elektroosmotischen Flusses dieses Fluids relativ zu Systemen, die die vorliegende Erfindung nicht umsetzen, an den Tag legen, so wie hierin beschrieben ist.
A. Reduktion der elektrophoretischen Mobilität von geladenen Spezies
Wie zuvor angemerkt wurde, besteht das allgemeine Ziel von Kapillarelektrophorese-Anwendungen in der Maximierung der Trennung von verschiedenen, in einer interessierenden Probe enthaltenen Spezies, um diese Spezies getrennt zu analysieren, ihre Gegenwart in der Probe nachzuweisen und dergleichen. Dies wird ausgeführt, indem der Unterschied zwischen den elektrophoretischen Mobilitäten dieser Spezies, der sich aus Unterschieden der Größe und/oder der Nettoladung ergeben kann, maximiert wird.
Bei den hierin beschriebenen E/O-Fluidführungssystemen sind jedoch die Ziele im Vergleich zu denen von CE-Systemen von etwas anderer Art. Im Besonderen besteht das allgemeine Ziel derartiger E/O-Fluidführungssysteme im Transport und/oder der Führung von interessierenden Materialien, die in einem Fluidvolumen oder mehreren diskreten Fluidvolumen enthalten sind, unter Verwendung eines gesteuerten E/O-Flusses von einem Ort im System zu einem anderen. Da diese Fluide im Allgemeinen einer weiteren Manipulation oder Kombination mit anderen Fluiden unterworfen werden sollen, ist es im Allgemeinen wünschenswert, den Transport dieser Fluide ohne wesentliche Veränderung ihrer Konstitution, d.h. ohne elektrophoretische Trennung oder Vorspannung der in den Fluiden enthaltenen Materialien von unterschiedlicher Ladung oder Größe, durchzuführen.
Ähnlich ist es bei der Verwendung dieser Systeme für den seriellen Transport kleiner Fluidvolumen oder mehrerer diskreter Volumen unterschiedlicher Fluide entlang denselben Kanälen wünschenswert, diese Fluidvolumen so kohärent wie möglich zu transportierten, d.h. das Verschmieren dieser Materialien oder die Diffusion der Fluide zu minimieren. Im Besonderen erlaubt, aufgrund der bevorzugten Verwendung dieser Systeme im Mikrofluidikanwendungen, die verbesserte Kohärenz eines bestimmten Fluidvolumens innerhalb des E/O-Flusssystems den Transport einer größeren Anzahl von unterschiedlichen Fluidvolumen pro Zeiteinheit. Spezifisch ermöglicht die Aufrechterhaltung einer höheren Fluidvolumenkohärenz den näher aneinander liegenden Transport von getrennten Fluidvolumen durch die Kanäle des Systems, ohne dass diese Volumen dabei übermäßig vermischt werden. Weiters erlaubt die Aufrechterhaltung der maximalen Fluidvolumenkohärenz während des Transports und der Führung des Fluids eine präzisere Steuerung der volumetrischen Abgabe der Materialien innerhalb dieser Systeme.
Trotz der abweichenden Ziele von CE-Systemen und den in der vorliegenden Erfindung eingesetzten E/O-Flusssytemen führt in beiden Fällen die Anlegung eines elektrischen Felds entlang einem interessierenden Fluid, das geladene Spezies umfasst, im Grunde zum selben Ergebnis. Wenn nun ein interessierendes Fluid geladene Spezies umfasst oder aus einer Vielzahl unterschiedlich geladener chemischer Spezies besteht, so bedeutet dies spezifisch, dass die Anlegung einer Spannung an ein Fluid, z.B. um einen E/O-Fluss auszulösen, zu einer Elektrophorese der unterschiedlich geladenen Spezies mit unterschiedlichen Raten führen. So weisen in einem Kanal mit negativem Oberflächenpotential die negativ geladenen Spezies eine elektrophoretische Mobilität auf, die entgegengesetzt zur Richtung des E/O-Flusses verläuft, während positiv geladene Spezies eine elektrophoretische Mobilität in dieselbe Richtung wie der E/O-Fluss an den Tag legen. Je größer die Anzahl der Ladungen einer bestimmten Spezies, desto größer ihre elektrophoretische Mobilität in dieselbe oder in die entgegengesetzte Richtung des E/O-Flusses. In Systemen; die die elektroohmotische Fluidführung einsetzen, führt dies zu einer tatsächlichen Trennung von unterschiedlich geladenen Spezies, die im transportierten Fluid enthalten sind.
Wird ein bestimmtes Volumen einer gegebenen Fluidprobe transportiert, kann diese Trennung zu einer elektrophoretischen Vorspannung der Probe führen, in der die positiv geladenen Spezies eine größere scheinbare Mobilität als die negativ geladene Spezies aufweisen. So wie hierin verwendet bezeichnet "scheinbare Mobilität" allgemein die Gesamtmobilität einer beliebigen Spezies im Fluidiksystem. Bei den Systemen der vorliegenden Erfindung ist die scheinbare Mobilität typischerweise als die Rate der E/O-Mobilität plus die elektrophoretische Mobilität definiert. Verläuft die elektrophoretische Mobilität entgegengesetzt zur Richtung des E/O-Flusses, d.h. negativ, so führt dies zu einer scheinbaren Mobilität, die geringer ist als die E/O-Mobilität.
Im Fall von Spezies mit hoher elektrophoretischer Mobilität, z.B. stark geladener Spezies, kann diese Wirkung bis zu einem Punkt verstärkt werden, an dem die scheinbare Mobilität einer solchen Spezies wesentlich anders ist als die E/O-Mobilität des Fluids, in dem sie enthalten ist. Beispielsweise können Spezies mit mehrfach negativen Ladungen eine elektrophoretische Mobilität aufweisen, die im Wesentlichen entgegengesetzt zur Richtung der E/O-Mobilität verläuft, was zu einer wesentlichen Reduktion der scheinbaren Mobilität dieser Spezies führt. Ist diese Reduktion ausreichend groß, so kann sie dazu führen, dass Spezies tatsächlich vom transportierten Fluidvolumen "zurückgelassen" werden.
Umgekehrt kann eine Spezies, die mehrere positive Ladungen trägt, eine scheinbare Mobilität aufweisen, die weitaus größer als die des transportierten Fluids und der anderen darin enthaltenen Spezies ist, sodass diese Spezies weit vor dem Fluidvolumen transportiert wird.
Dieses Problem ist von geringerer Bedeutung, wenn große Fluidvolumen von einem Ort zu einem anderen transportiert werden, spezifisch können die Auswirkungen der elektrophoretischen Trennung eines Fluids durch Verwenden größerer Volumen verringert werden, wodurch der Anteil der vorgespannte Abschnitte des Fluids am Gesamtfluid reduziert wird.
Das Ausmaß des Problems wird aber wesentlich größer, wenn ein relativ kleines Fluidvolumen oder mehrere kleine Volumen desselben oder unterschiedlicher Fluide transportiert werden sollen, ohne dabei die in den einzelnen Fluidvolumen enthaltenen Materialien zu trennen oder die separaten Volumen enthaltenen Materialien zu mischen. Spezifisch wandern beim Transport eines oder einer Reihe von diskreten Volumen eines bestimmten Fluids oder mehrerer Fluide, z.B. Proben, Testverbindungen, verschiedene Elemente eines Screening-Systems, Spezies mit scheinbaren Mobilitäten, die wesentlich anders sind als die E/O-Mobilität dieses Fluidvolumens vor und hinter dem Fluidvolumen, wodurch die zu transportierenden Materialien verschmieren. Wie zuvor beschrieben ist dies ein großer Nachteil, wenn eine relativ präzise Fluidsteuerung erwünscht ist oder wenn kleinere tatsächliche Volumen verwendet werden. Sollen beispielsweise Verbindungen gescreent werden, die ein bestimmtes Reaktionsgemisch, z.B. ein biochemisches System, beeinträchtigen, ist es im Allgemeinen wünschenswert, die für diesen Screen benötigten Elemente, beispielsweise Enzyme, Substrat und Testinhibitor, zu mischen und diese Elemente zusammen inkubieren zu lassen, während sie zum letztendlichen Detektionsbereich transportiert werden. Werden nun diese Elemente aufgrund ihrer unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilitäten getrennt, so kann dies wesentliche negative Auswirkungen auf die Gesamteffizienz des Screening-System haben.
Wichtiger noch ist, dass beim Transport einer Spezies in einem ersten transportierten Volumen mit einer scheinbaren Mobilität, die wesentlich unter der E/O-Mobilität des Fluids liegt, während eine Spezies in einem zweiten oder folgenden Volumen eine scheinbare Mobilität aufweist, die wesentlich höher ist als die E/O-Mobilität des zu übermittelnden Fluids, es zu einer Überlappung dieser beiden Spezies im Fluidsystem kommen kann.
Die oben beschriebenen Probleme sind schematisch in 1 dargestellt. 1A zeigt eine optimale Situation, in der diskrete Volumen oder Regionen von Fluiden in einem Kanal (Fluide AB und XY, unterstrichen dargestellt) verschieden geladene Spezies enthalten, z.B. X+ und Y- sowie A+ und B-. In dieser optimalen Situation weisen diese unterschiedlich geladenen chemischen Spezies eine scheinbare Mobilität auf, die nicht wesentlich von der E/O-Mobilität des diese Spezies enthaltenden Fluids ist. In der Folge werden die verschiedenen Spezies im Wesentlichen in ihren separaten Fluidregionen gehalten. 1B veranschaulicht den Schmiereffekt, der auftritt, wenn geladene Spezies aufgrund ihrer größeren elektrophoretischen Mobilitäten damit beginnen, ihre jeweiligen Fluidvolumen oder Regionen zu verlassen. Dies führt zu einem Verschmieren der transportierten Materialien und senkt die Präzision, mit der diese Materialien transportiert werden können, wesentlich. Letztendlich veranschaulicht 1C die Situation, in der sich die elektrophoretische Mobilität der geladenen Spezies so wesentlich von der E/O-Mobilität der Fluidregionen unterscheidet, dass es eine Überlappung und Vermischung der unterschiedlich geladenen Spezies aus unterschiedlichen Fluidregionen eintritt. Das Vermischen separater Fluidvolumen sorgt für wesentliche Probleme, wenn ein Fluidsystem zum seriellen Transport mehrerer unterschiedlicher Fluide eingesetzt wird, wie z.B. in der WO 98/00231 beschrieben ist.
Es wurden Verfahren entwickelt, um eine übermäßige elektrophoretische Mobilität von geladenen Spezies zu verhindern und/oder zu korrigieren, wenn diese Spezies in E/O-Fluidführungssystemen transportiert werden, indem Fluidbarrieren rund um das zu transportierende Fluid eingebaut werden, an denen die elektrophoretische Mobilität dieser geladenen Spezies wesentlich verringert wird, vgl. beispielsweise das U.S.-Patent Nr. 5.880.071.
Im Allgemeinen werden der gesteigerte E/O-Materialtransport und die Führung, für die die vorliegende Erfindung sorgt, durch die Bereitstellung einer Verbindung oder mehrerer Verbindungen innerhalb der Fluidkomponente des Systems, die zur Reduktion der Auswirkungen eines solchen E/O-Systems auf die im Fluid enthaltenen geladenen Spezies fähig sind, erzielt. Beispielsweise führt die Einbindung dieser Verbindungen in den Fluidkomponenten des E/O-Flusssystems typischerweise zu einer Verringerung der elektrophoretischen Mobilität und der scheinbaren Mobilität von unterschiedlich geladenen Spezies.
In bevorzugten Aspekten werden zwitterionische Verbindungen oder Kombinationen solcher zur Reduktion der elektrophoretischen Mobilität von Materialien eingesetzt, die in den unter Verwendung dieser E/O-Fluidführungssysteme zu transportierenden Fluiden enthalten sind, wodurch die in 1A veranschaulichte optimale Situation geschaffen oder im Wesentlichen geschaffen wird.
Ohne an eine bestimmte Betriebstheorie gebunden zu sein wird angenommen, dass solche zwitterionischen Verbindungen zu den geladenen Spezies in einem schichtartigen Komplex in Wechselwirkung treten. Der "Komplex" weist dieselbe Nettoladung wie die geladene Spezies auf, jedoch ist die Ladung in einer sehr viel größeren Struktur verteilt, die das Verhältnis Ladung:Größe wirksam senkt und die elektrophoretische Mobilität des Komplexes reduziert. Da Zwitterionen dipolare Moleküle sind, können sie wirksam auf positiv und negativ geladene Spezies angewendet werden.
Obwohl auch andere Verfahren wirksam zur Reduktion des Verhältnisses Ladung:Größe von Verbindungen in einem E/O-Fluidführungssystem eingesetzt werden können, gehen mit diesen Verfahren zahlreiche Probleme einher. Beispielsweise kann das Anheben oder Senken des pH-Werts des die Spezies enthaltenden Fluids auf wirksame Weise das Ladungsniveau einer chemischen Spezies durch Protonieren oder Deprotonieren von darin enthaltenen funktionellen Gruppen senken. Während dies zwar zur Reduktion der Nettoladung einer Spezies wirksam ist, kann dieses Verfahren auch wesentliche negative Auswirkungen haben. Spezifisch kann, wenn das Fluidiksystem zur Analyse von biologischen Systemen, beispielsweise enzymatischen Reaktionen, Rezeptor/Ligand-Wechselwirkungen, oder zum Transport von anderen, gegenüber extremen pH-Werten empfindlichen Materialien eingesetzt wird, die wesentliche Änderung des pH-Werts, beispielsweise von neutralen oder physiologischen Bedingungen, dazu führen, dass das System deutlich außerhalb des für die folgende Manipulation oder Analyse optimalen pH-Bereichs liegt. In einigen Fällen kann der optimale pH-Bereich zur Senkung der Nettoladung einer bestimmten Spezies aktive Komponenten der transportierten Materialien denaturieren oder anderweitig beeinträchtigen.
Die Eingliederung von zwitterionischen Verbindungen, so wie hierin beschrieben, ist hingegen gut mit Systemen, die zum Transport von dem pH-Wert gegenüber empfindlichen Materialien eingesetzt werden, z.B. Systeme, die zur Analyse biologischer Systeme eingesetzt werden, kompatibel. Im Besonderen können verschiedene zwitterionische Verbindungen, beispielsweise mit unterschiedlicher pH, je nach pH-Empfindlichkeit des transportierten Materials ausgewählt werden. Demgemäß ist die Erfindung, wie aus obiger Erörterung hervorgeht, besonders für E/O-Fluidführungssysteme geeignet, in denen die zu transportierenden Materialien biologische Materialien, wie beispielsweise Enzyme, Substrate, Liganden, Rezeptoren oder andere Elemente aus biologischen oder biochemischen Systemen, wie beispielsweise den in der WO 98/00231 definierten Systemen, umfassen.
Ein weiteres Verfahren kann zur Beeinflussung des Verhältnisses Ladung:Größe eines geladenen Moleküls oder Spezies, das/die in einem E/O-Fluidführungssystem von Interesse ist, herangezogen werden und umfasst die Wechselwirkung des geladenen Moleküls mit einem anderen Molekül oder Spezies, sodass die beiden Moleküle einen Komplex mit einem anderen Verhältnis Ladung:Größe bilden. Fluoreszein ist, nur um ein Beispiel anzuführen, ein Molekül, das zwei negative Ladungen trägt und einen pH-Wert oberhalb des neutralen Bereichs aufweist. Die elektrophoretische Mobilität dieses Moleküls kann einfach durch Zusetzen eines Antikörpers, wie beispielsweise Antifluoreszein, zur Lösung geändert werden. Der resultierende Komplex weist eine wesentlich geringere elektrophoretische Mobilität als Fluoreszein alleine auf. Obwohl diese Verfahren Wirkung zeigt, bringt es auch einige Nachteile mit sich. Da eine Verbindung, die sich mit dem interessierenden geladenen Molekül verbindet, identifiziert werden muss, muss für jede geladene Molekülspezies im Fluid und für jedes der im System verwendeten unterschiedlichen Fluide eine spezifisch bindende Verbindung identifiziert werden. Weiters kann, was auch auf den obgenannten Fall des Fluoreszein/Antifluoreszein-Komplexes zutrifft, die Einbindung eines aktiven Moleküls in einen größeren Komplex negative Auswirkungen auf die gewünschte Aktivität oder Funktion dieses Moleküls haben, d.h. die Fluoreszenz wesentlich senken.
Die Verfahren und Systeme der vorliegenden Erfindung hingegen weisen diese Probleme nicht auf. Beispielsweise ist die Wirkung der zwitterionischen Verbindungen zur Reduktion der elektrophoretischen Mobilität von geladenen Spezies allgemein anwendbar, d.h. es bedarf keiner spezifischen Wechselwirkung zwischen der geladenen Spezies und dem Zwitterion. Zudem hat die Art dieser Wechselwirkung nur eine geringe oder gar keine Auswirkung auf die Eigenschaften des geladenen interessierenden Moleküls.
B. Steigerung der E/O-Mobilität
Zusätzlich zu den Vorteilen der Reduktion der elektrophoretischen Mobilität von geladenen Spezies in Fluiden, die unter Verwendung von E/O-Fluidführungssystemen transportiert werden, kann die Einbindung von zwitterionischen Verbindungen in vielen Systemen auch einen Anstieg der E/O-Mobilität im Fluidführungssystem bewirken, wodurch die scheinbare Mobilität des transportierten Materials weiter optimiert wird.
Im Besonderen hat sich gezeigt, dass die Einbindung von zwitterionischen Verbindungen in Fluiden, die in E/O-Fluidführungssystemen transportiert werden, die E/O-Mobilität dieser Fluide anhebt. Dieser Effekt tritt dann besonders deutlich zutage, wenn diese Fluide eine Proteinkomponente oder eine andere größere, geladene Molekülspezies umfassen.
II. Nützliche Verbindungen für die praktische Anwendung der Erfindung
Eine Vielzahl von zwitterionischen und verwandten chemischen Verbindungen kann gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispielsweise umfassen solche Verbindungen Betain, Sulfobetain, Taurin, Aminomethansulfonsäure, zwitterionische Aminosäuren, wie beispielsweise Glycin, Alanin, β-Alanin usw., sowie andere zwitterionische Verbindungen, wie beispielsweise HEPES, CAPS, MES und Tricin und dergleichen. In besonders bevorzugten Aspekten werden nicht-detergierende Sulfobetaine von niedrigem Molekulargewicht in den Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wie beispielsweise Dimethylethylaminopropansulfonsäure, Dimethylbenzylaminopropansulfonsäure und 3-(N-Pyridinium)propansulfonsäure.
Obwohl sich die Beschreibung hier im Allgemeinen auf eine einzelne Spezies einer zwitterionischen Verbindung bezieht, so versteht es sich, dass die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Kombinationen der oben beschriebenen Verbindungen umfasst. Solche Kombinationen können einfach angepasst werden, um die im Gesamtsystem zu Tage tretenden Auswirkungen sowie ihre Kompatibilität mit den verschiedenen Komponenten des Systems, z.B. Puffer, Enzymen, Substrate, Rezeptoren, Liganden, Testverbindungen und dergleichen, zu optimieren.
Im Allgemeinen kann die Konzentration der zwitterionischen Verbindungen in den Fluiden, die im System enthalten sind, je nach gewünschter Wirkung auf die Re duktion der elektrophoretischen Mobilitäten der im Fluid enthaltenen Materialien variiert werden. Weiters können diese Wirkungen auch abhängig von der Art der im interessierenden Material enthaltenen geladenen Spezies variiert werden. Deshalb steht hierin die verwendete Bezeichnung "wirksame Konzentration" für eine Konzentration von zwitterionischen Verbindungen, die zum Erzielen einer gewünschten Wirkung ausreichend ist und insbesondere zum Erzielen einer gewissen Reduktion der elektrophoretischen Mobilität der geladenen interessierenden Spezies.
Weiters ist unter "Konzentration von zwitterionischen Verbindungen im Fluid" die Menge solcher zugesetzter Verbindungen pro Volumeneinheit zu verstehen, unabhängig von etwaigen folgenden Umwandlungen von solchen Verbindungen im Fluidsystem. Typischerweise liegen wirksame Konzentrationen von zwitterionischen Verbindungen vorzugsweise über etwa 5 mM, typischerweise über etwa 10 mM und häufig über etwa 50 mM. Obwohl zwitterionische Verbindungen bei der praktischen Ausführung der Erfindung im Allgemeinen in Mengen gegenwärtig sein können, die sich der Grenze ihrer Löslichkeit nähern, liegen bevorzugte Konzentrationen der zwitterionischen Verbindungen in Fluiden, die innerhalb des Systems transportiert werden sollen, zwischen etwa 1 mM und 2 M und noch bevorzugter zwischen etwa 5 mM und 2 M.
III Anwendung auf Mikrofluidiksysteme
Wie zuvor festgehalten wurde, ist die vorliegende Erfindung insbesondere in Fluidiksystemen, die E/O-Fluidführungssysteme einsetzen, und insbesondere in mikroskaligen Fluidiksystemen von Nutzen. Unter "E/O-Fluidführungssysteme" sind allgemein Fluidiksysteme zu verstehen, die aus Fluidkanälen oder Durchlässen, Kammern, Öffnungen oder dergleichen bestehen, worin die Bewegung des Fluids im System, d.h. durch die Kanäle oder von einem Kanal zu einem anderen Kanal oder von einer Kammer zu einer anderen Kammer, über den gesteuerten elektroosmotischen Fluss des Fluids selektiv gesteuert wird. Beispiele für derartige gesteuerte E/O-Flusssysteme sind beispielsweise in den veröffentlichten PCT-Anmeldungen Nr. WO 96/04547, Nr. WO 98/00231 und dem U.S.-Patent Nr. 5.880.071 beschrieben.
In bevorzugten Aspekten führen solche Fluidführungssysteme ein interessierendes Fluid durch sich kreuzende Kanalstrukturen, indem ein Spannungsgradient entlang dem gewünschten Weg des Fluidflusses angelegt wird. Typischerweise werden Spannungen gleichzeitig an den sich kreuzenden Fluidwegen angelegt, um einen beschränkten oder gerichteten Fluidfluss fortzubewegen, d.h. den interessierenden Fluidfluss entlang dem gewünschten Weg einzufassen oder zu führen. Fließt beispielsweise das interessierende Fluid entlang einem ersten Kanal, der von einem zweiten Kanal gekreuzt wird, so verbleibt der Fluss des interessierenden Fluids im ersten Kanal, d.h. wird davon abgehalten, in den zweiten, kreuzenden Kanal zu diffundieren, indem gleichzeitig von jeder Seite des kreuzenden Kanals Fluid in den ersten Kanal fließen gelassen wird. Dies wird allgemein durchgeführt, indem gleichzeitig Spannung vom Eingangsende zum Ausgangsende des ersten Kanals und zu jedem Ende des kreuzenden Kanals angelegt wird, wodurch ein angemessener E/O-Fluss erhalten wird. Wie sich versteht, ergibt dies ein Fluidflussmuster im ersten Kanal, das wie eingeschnürt ("pinched") aussieht. In einem weiteren Beispiel kann ein interessierendes Fluid von einem ersten Arm eines ersten Kanals aus in einen ersten Arm eines kreuzenden Kanals geführt werden, indem eine Spannung entlang dem gewünschten Fluidflussweg zur Erzeugung eines Fluidflusses in diese Richtung angelegt wird. Um den Fluidfluss an der Kreuzungsstelle zu regeln, wird ein einschränkender Fluidfluss entlang der gesamten Länge des kreuzenden Kanals erzeugt, was einen "torgesteuerten" Fluidfluss ("gated flow") erzeugt. Das interessierende Fluid kann dann an den verbleibenden Arm des ersten Kanals dosiert abgegeben oder auf geregelte Weise zugeführt werden, indem die Spannung aktiv moduliert wird, um ein Fließen des Fluids in den Arm zuzulassen und gleichzeitig eine Diffusion zu verhindern. Letztendlich können diese Systeme durch Modulieren der Flussrate des durch den Kreuzungspunkt fließenden interessierenden Fluids in Bezug auf den Fluss von Verdünnungsmitteln, die von den kreuzenden Kanälen hineinfließen, als Verdünnungsvorrichtungen verwendet werden.
Unter "mikroskaligen Fluidiksystemen" ist typischerweise ein Fluidsystem zu verstehen, das Speicher, Leitungen oder Kanäle und/oder Kammern umfasst, worin zumindest eine Querschnittsgröße, z.B. die Tiefe, Breite oder der Durchmesser, eines bestimmten Fluidkanals und/oder einer Kammer in einem Bereich von etwa 1 μm bis etwa einschließlich 500 μm liegt. Derartige mikroskalige Fluidiksysteme reichen von einfachen Kapillarsystemen, z.B. solche, die eine einzelne Kapillare aus geschmolzenem Silica zur Abgabe eines bestimmten Fluids oder mehrerer Fluide aus einem Speicher an einem Ende der Kapillare an das andere Ende der Kapillare zur Analyse, Kombination mit anderen Reagenzien und dergleichen umfassen, bis hin zu komplexeren integrierten Multikanal-Mikrofluidikvorrichtungen, in festen Substraten hergestellt sind, wie beispielsweise die in der WO 98/00231 beschriebenen. In bevorzugten Aspekten setzt das mikroskalige Fluidiksystem zumindest einen Kanal und bevorzugter zumindest zwei sich kreuzende Kanäle ein, die zumindest ein Querschnittsmaß im Bereich von 1 μm bis etwa 500 μm und noch bevorzugter zwischen etwa 1 μm und 100 μm aufweisen.
Die Kombination dieser mikroskaligen Maße mit der relativ präzisen Fluidsteuerung, die oben beschrieben wurde, ermöglicht die geregelte, wiederholbare Führung oder Abgabe von äußerst kleinen Fluidvolumen, wobei diese Volumen von den Volumen der Kanäle und/oder Kreuzungspunkte, z.B. einen Probenpfropfen an einem Kreuzungspunkt, oder durch die zeitliche Bestimmung des Fluidflusses, z.B. die Zeitmenge oder die Länge eines in einen Kanal injizierten Fluidpfropfens im Falle der Verwendung des torgesteuerten Flusses, bestimmt werden.
Typischerweise umfassen die in praktischen Umsetzungen der Erfindung verwendeten Mikrofluidiksysteme ein festes Substrat, das die Kanäle und/oder Kammern des Mikrofluidiksystems in sich angeordnet aufweist. Substrate können aus einer Vielzahl verschiedener Materialien hergestellt werden. Beispielsweise stammen in der Herstellung von Mikroflkuidiksystemen angewendete Techniken häufig aus der Elektronikindustrie. In der Folge sind die Substratmaterialien häufig auf Grundlage ihrer Kompatibilität mit diesen Fertigungstechniken ausgewählt, wie beispielsweise Siliciumdioxid, Silicium, Galliumarsenid und dergleichen. Typischerweise sind jedoch Halbleitermaterialien in der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung nicht bevorzugt, da sie mit der Anlegung von elektrischen Feldern durch Fluide ohne einige Modifikationen, wie beispielsweise des Aufbringens einer Isolierschicht, nicht kompatibel sind. Demgemäß sind in einem bevorzugten Aspekt Siliciumdioxidsubstrate in der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Auch andere Substratmaterialien können in den Mikrofluidiksystemen der Erfindung eingesetzt werden und können im Allgemeinen auf der Grundlage ihrer Kompatibilität mit den Bedingungen, denen sie bei der Herstellung einerseits, beispielsweise Kompatibilität mit bekannten Herstellungsverfahren, und beim Betrieb andrerseits, beispielsweise Kompatibilität mit der gesamten Bandbreite der Betriebsbedingungen, einschließlich große Bandbreiten von Salzen, pH-Werten, Zusammensetzungen und der Anlegung von elektrischen Feldern, ausgesetzt sind, gewählt werden. Beispiele für solche Substrate umfassen Polymermaterialien, unter der Voraussetzung, dass diese Materialien entweder selbst oder durch die Modifikation der Oberflächen, die in Kontakt zu den Fluiden des Systems stehen, zur Fortpflanzung eines E/O-Flusses fähig sind.
Typischerweise weist das Substrat eine erste Oberfläche auf und ist im Allgemeinen von planarer Form. Die sich kreuzenden Kanäle sind typischerweise in der Oberfläche des Substrats als Rillen ausgebildet. Wie zuvor angemerkt, können die Kanäle in der Oberfläche des Substrats z.B. unter Verwendung von Photolithographie, eines nasschemischen Ätzverfahrens oder anderen bekannten Mikroherstellungsverfahren ausgebildet werden. Im Allgemeinen wird eine Abdeckschicht über die Oberfläche des Substrats gelegt, um die Rillen abzudecken, wodurch Fluidkanäle oder -durchlässe gebildet werden.
Die Vorrichtungen umfassen im Allgemeinen mehrere darin ausgebildete Öffnungen oder Speicher, wobei diese Öffnungen in elektrischem Kontakt und üblicherweise in Fluidkommunikation mit den sich kreuzenden Kanälen stehen. Diese Öffnungen stellen im Allgemeinen einen Punkt bereit, an dem Elektroden in Kontakt mit den Fluiden angeordnet werden können, um den Fluidfluss zu führen. Diese Öffnungen stellen ebenfalls häufig einen Speicher für die Fluide, die in der Vorrichtung oder im System verwendet werden, bereit. Die verschiedenen Öffnungen sind typischerweise in Kontakt mit den Fluidkanälen an verschiedenen Seiten eines gegebenen Kreu zungspunkt zweier Kanäle angeordnet. Für eine einfache Herstellung sind diese Öffnungen typischerweise in elektrischem Kontakt mit jedem der freien Enden der verschiedenen, in der Vorrichtung eingebauten Kanäle angeordnet. Unter "freie Enden" oder "freies Ende" ist hierin ein nicht gekreuztes Ende eines Kanals zu verstehen.
Zur einfacheren Erörterung werden die Mikrofluidikvorrichtungen und -systeme im Allgemeinen als zwei sich kreuzende Kanäle umfassend beschrieben. Es versteht sich jedoch, dass in solchen Vorrichtungen und Systemen auch einfach mehrere komplexe Kanalstrukturen aus drei, vier, fünf, zehn, zwanzig und mehr sich kreuzenden Kanälen eingebaut sein können. Weiters können derartige Strukturen und Systeme auch parallel angeordnete Kanalstrukturen aufweisen, in denen mehr als ein Hauptkanal von zahlreichen quer verlaufenden Kanälen gekreuzt wird.
Wie oben beschrieben wurde, betrifft die vorliegende Erfindung im Allgemeinen Verfahren zur Steigerung des elektroosmotischen Flusses und im Besonderen die Anwendung dieser Verfahren auf Mikrofluidiksysteme, die einen solchen E/O-Fluss zum Transport und zur Führung von Fluiden in diesen Systemen einsetzen. Dies steht im Gegensatz zu Kapillarelektrophorese-Systemen (CE), die auf eine Minimierung der E/O-Mobilität der Fluide abzielen, während die Unterschiedlichkeit der elektrophoretische Mobilität der in diesen Fluiden enthaltenen Spezies maximiert wird. Dies wird oft durch Einbauen einer Trennmatrix in den Kanälen der CE-Systeme umgesetzt, die diese Ziele unterstützt. Somit sind die hier beschriebenen Systeme im Allgemeinen in Bezug auf Kanäle beschrieben, die einen freien elektroosmotischen Fluss zulassen oder zu einem solchen fähig sind. Darunter ist zu verstehen, dass die Kanäle, in denen ein E/O-Fluss erwünscht ist, im Allgemeinen ein ausreichendes Oberflächenpotential aufweisen, um den E/O-Fluss oder die Mobilität der Fluide und Materialien in diesen Kanälen fortzupflanzen. Gleichzeitig sind die Kanäle frei von Hindernissen, die diesen Fluss hemmen könnten, und insbesondere sind diese Kanäle frei von jedwedem Trennmedium oder Trennmatrix.
Die gegenständliche Erfindung wird weiters unter Bezugnahme auf die folgenden nicht beschränkenden Beispiele erläutert.
BEISPIELE
Die Wirksamkeit der Einbindung von zwitterionischen Verbindungen zur Reduktion der elektrophoretischen Mobilität einer geladenen Spezies in E/O-Flusssystemen wurde in einer Kapillare aus geschmolzenem Silica mit einer Gesamtlänge von 57 m, einer effektiven Länge von 50 cm und einem inneren Durchmesser von 75 um unter Beweis gestellt. Alle Proben liefen in 50 mM eines HEPES-Puffers mit einem pH-Wert von 7,5. Alle Laufpuffer wurden frisch aus einer konzentrierten Stammlösung hergestellt. Für jeden Lauf wurden die Proben für 20 Sekunden in die Kapillare mit Druck injiziert, bei 30 kV getrennt und bei 254 nm detektiert. Nach jedem Lauf wurde die Kapillare mit 1 N NaOH 2 Minuten lang gespült, wonach eine 5-minütige Spülung mit einem Ersatzpuffer durchgeführt wurde.
Das Niveau des elektroosmotischen Flusses in der Kapillare wurde durch Einbinden von Mesityloxid (4 μl in 4 ml H₂O), einem neutralen, detektierbaren Marker, bestimmt, während die Auswirkungen auf die elektrophoretische Mobilität durch Einbinden von 5,0 mM dFMUP (6,8-Difluor-4-methylumbellipherlphosphat) in Wasser, einer nachweisbaren Verbindung mit zwei negativen Ladungen mit neutralem pH-Wert, bestimmt wurde.
Beispiel 1: Verwendung von NDSB-195
Der erste Versuch diente der Untersuchung der Auswirkungen der zwitterionischen Verbindung 3-(N-Ethyl-N,N-dimethylammonium)propansulfonat (NDSP-195) auf die elektrophoretische Mobilität einer geladenen Spezies (dFMUP) im Inneren einer puffergefüllten Kapillare sowie den elektroosmotischen Gesamtfluss dieses Puffers in der Kapillare. Der Versuch wurde einmal in Gegenwart und einmal in Abwesenheit einer Proteinkomponente (0,1 mg/ml BSA) ausgeführt.
Drei unterschiedliche Konzentrationen von NDSB-195 wurden getestet: 0,1 M; 0,5 M; oder die letzte Konzentration von 1,0 M und mit einem negativen Kontrollversuch (kein NDSB-195) verglichen. Bei jedem Lauf wurde die Verweildauer von Mesityloxid und dFMUP bestimmt und zur Berechnung der E/O-Mobilität (μEO) in diesem Lauf, der elektrophoretischen Mobilität (μEP) von dFMUP und der scheinbaren Mobilität (μApp) von dFMUP (μApp = μEO + μEP) herangezogen. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle I als Mittelwerte von drei Läufen aufgeführt.
Tabelle I
2 zeigt eine graphische Darstellung des E/O-Flusses, der elektrophoretischen Mobilität und der scheinbaren Mobilität von dFMP als eine Funktion der ansteigenden Konzentration von NDSB-195 sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von BSA. Die Standardabweichung ist ebenfalls für jeden darstellten Punkt angeführt. Wie aus diesen Daten ersichtlich ist, senkt die Einbindung von NDSB-195 die elektrophoretische Nettomobilität von dFMUP sowohl in Abwesenheit als auch in Gegenwart einer Proteinkomponente (BSA) wesentlich. Zusätzlich zur Reduktion dieser elektrophoretischen Mobilität hebt die Einbindung von NDSB auch die E/O-Flussrate des Systems an. Das Nettoergebnis besteht darin, dass die scheinbare Mobilität der geladenen Spezies näher an die E/O-Flussrate des Systems herangeführt wurde.
Beispiel 2: Verwendung von β-Alanin
Ein ähnlicher Versuch wurde unter Verwendung einer Aminosäure, β-Alanin, als die zwitterionische Verbindung durchgeführt. Im Besonderen wurde β-Alanin im selben, oben beschriebenen System mit zwei unterschiedlichen Konzentrationen, 0,50 M und 1,0 M, eingeführt und mit einem negativen Kontrollversuch (ohne β-Alanin) sowie in Gegenwart und Abwesenheit einer Proteinkomponente verglichen. Der pH-Wert wurde nach dem Zusetzen von β-Alanin nicht angepasst. Die Ergebnisse dieses Versuchs finden sich in der folgenden Tabelle II:
Tabelle II
Erneut sorgt die Einbindung von β-Alanin für eine Abnahme der elektrophoretischen Mobilität von dFMUP und einen Nettoanstieg von dessen scheinbarer Mobilität.
Beispiel 3: Gleichzeitige Anwendung zweier unterschiedlich geladener Spezies
Jedes der obigen Beispiele führt vor Augen, dass die Einbindung von zwitterionischen Verbindungen zu einer Abnahme der elektrophoretischen Mobilität von negativ geladenen Spezies im System (dFMUP) führt. Der folgende Versuch veranschaulicht die gleiche Wirkung in Proben, die sowohl positiv als auch negativ geladene chemische Spezies enthalten.
Dieser Versuch diente dem Test der Wirkung von 1 M NDSB auf die elektrophoretische Mobilität einer positiv geladenen Spezies (Benzylamin) und einer negativ geladenen Spezies (Benzoesäure) im gleichen, oben beschriebenen Kapillarsystem. Bei diesem Versuch wurden zwei verschiedene Puffersysteme verwendet: 200 mM Borat mit einem pH-Wert von 8,7 und 200 mM HEPES mit einem pH-Wert von 7,0. Bei diesen Versuchen wurde ebenfalls Dimethylformamid (DMF) als neutrale Markerverbindung zur Bestätigung der E/O-Mobilität verwendet.
Die unten angeführte Tabelle III veranschaulicht die Auswirkungen der Einbindung der zwitterionischen Verbindung NDSB auf die elektrophoretische Mobilität und die scheinbare Mobilität der positiv und der negativ geladenen Spezies.
Tabelle III
Aus diesen Daten geht deutlich hervor, dass die Einbindung der zwitterionischen Verbindung NDSB in beiden Puffersystemen die elektrophoretische Mobilität sowohl der positiv geladenen Spezies Benzylamin als auch der negativ geladenen Spezies Benzoesäure reduzierte. Obwohl in diesem System NDSB zu einer Abnahme der E/O-Flussrate führte, kam es trotzdem zu einer Schmälerung der Differenz zwischen der E/O-Mobilität und der scheinbaren Mobilität bei beiden der unterschiedliche geladenen Spezies, z.B. nahm die scheinbare Mobilität der positiv geladenen Spezies ab, während die scheinbare Mobilität der negativ geladenen Spezies zunahm.
Beispiel 4: Enzymhemmung in Gegenwart und Abwesenheit von NDSB in einem Mikrofluidiksystem
Eine Enzymhemmungsuntersuchung wurde unter Verwendung einer Mikrofluidikvorrichtung mit einer Vertiefungs-/Kanalstruktur, wie in 3 gezeigt ist, durchgeführt. Standardverfahren der Halbleiter-Photolithographie wurden eingesetzt, um die Ka näle mit einer Breite von 70 μm und einer Tiefe von 10 μm in ein 525 μm dickes Substrat aus Natronkalkglas zu ätzen, und eine zweite, 2 mm dicke Schicht aus Glas mit durch dieses durchgebohrten Löchern mit einem Durchmesser von 3 mm wurde thermisch mit der ersten verbunden, wodurch die verschiedenen Vertiefungen bereitgestellt wurden.
Alle Reagenzien wurden in derselben Pufferlösung verdünnt, die als Laufpuffer dienten: 25 mM HEPES, pH-Wert 7,9, für den Kontrollversuch und 25 mM HEPES, 1 M NDSB-195 (nicht-detergierendes Sulfobetain, MW 195) (erhältlich bei Calbiochem-Novabiochem, La Jolla, CA), pH-Wert 7,9, für die Testläufe. Die Versuchslösungen wurden aus Stammlösungen von 5.000 U/mg mit Leukozytenantigen verwandte Phosphatase (LAR) (Enzym) (New England Biolabs, Beverly, MA), 10 mM dFMUP in Wasser, einem fluorogenen Substrat für LAR (Substrat) (erhältlich bei Molecular Probes, Eugene, OR) und 1,4 mM eines bekannten kompetitiven Inhibitor von LAR (Inhibitor) zubereitet.
Die Detektion der Fluoreszenz wurde unter Verwendung des Inversmikroskops Diaphot 200 von Nikon mit dem Photometer-Controller P101 von Nikon für die Auflichtfluoreszenzdetektion durchgeführt. Eine Opti-Quip 1200.1500 50 W-Wolframhalogenlampe, gekoppelt über ein 10x-Objektiv, stellte die Lichtquelle bereit.
Anregungs- und Emissionswellenlängen wurden mit einem DAPI-Filterwürfel (Chroma, Brattleboro, VT), ausgestattet mit einem dichroitischen Spiegel DM400, einem 340 – 380 nm Anregungsfilter und einem 435 – 485 nm Sperrfilter, ausgewählt. Die Ströme und Spannungen der Reagenzien in Vertiefungen auf dem Chip wurden unter Verwendung eines Caliper 3180 Chip Controllers (Palo Alto, CA) geregelt. Die Ströme und Spannungen lagen in einem Bereich von +/- 10 μA und 0 – 2.000 V. Die Daten wurden von einem Macintosh Power PC 7200/120 erfasst.
Die Kanäle der Vorrichtung wurden mit dem Laufpuffer gefüllt, indem der Puffer in eine Puffervertiefung eingebracht wurde und der Puffer durch die Kapillarwirkung durch die Kanäle verteilen gelassen wurde. 125 nM LAR-Enzym wurden in die En zymvertiefung eingebracht, 50 μM dFMUP wurden in die Substratvertiefung eingebracht, und 200 μm eines bekannten Inhibitors von LAR wurde in die Inhibitorvertiefung eingebracht.
Der Test wurde unter Einsatz des folgenden Injektionszyklus durchgeführt, wobei die letztendlichen Regenzienkonzentrationen im Injektionskanal angeführt sind: (1) Puffer; (2) Substrat (17 μM); (3) Puffer; (4) Substrat + Enzym (83 nM); (5) Puffer; und (6) Substrat + Inhibitor (66 μM) + Enzym. Der Gesamtfluss der Reagenzien blieb während jedem Schritt des Tests konstant, indem eine konstante Gesamtsumme der kombinierten Ströme aus den Vertiefungen aufrechterhalten wurde.
Die Fluoreszenz-Rohdaten aus diesem Versuch sind in 4 aufgeführt. Die Kontrolldaten, z.B. in Abwesenheit von NDSB -195, sind als graue Linie dargestellt, die entlang oder nahe der Grundlinie der Daten verläuft. Wie diesen Daten entnommen werden kann, erzeugt die LAR-Wirkung auf das dFMUP-Substrat nur ein mäßig starkes Signal, das in einem Fluoreszenzintensitätsbereich von 2.200 bis 2.250 liegt. Während ein wenig an Wirkung des Inhibitors im Versuch zu späteren Zeitpunkten ersichtlich ist, ist die Wirkung relativ gering. Ohne sich an eine bestimmte Theorie zu berufen wird angenommen, dass dies die Folge zweier Phänomene ist: (1) das LAR-Enzym tritt mit den Kanalwänden in Wechselwirkung, was zu einem Verschmieren des Enzyms im Versuch führt, was durch das Auftreten eines Signals ausschließlich in der nur das Substrat betreffenden Steuerung angezeigt wird, und (2) die hohe elektrophoretische Mobilität des dFMUP-Substrats, die entgegengesetzt zur elektroosmotischen Mobilität des Systems verläuft, führt zur Trennung von Substrat und Enzym, wodurch die Fähigkeit des Enzyms, auf das Substrat einzuwirken, gemindert wird.
Wurde dann NDSB-195 in das Testsystem eingebunden, wurden die Daten sehr viel deutlicher (schwarze Linie). Im Besonderen führt die Einbindung von NDSB in diesem Versuch zu einer deutlichen Verbesserung des Signals im Vergleich zum selben System ohne zwitterionische Verbindung, einschließlich der Abwesenheit eines Signals in der nur das Substrat betreffenden Kontrolle. Zudem ist auch die Wirkung des Inhibitors sehr viel größer und deutlicher zu erkennen. Der Test wurde in einem ununterbrochen Zyklus von sechs Stunden ohne nachweisbaren Signalverlust oder Anstieg der Hintergrundfluoreszenz durchgeführt.
Obwohl einige Einzelheiten der vorliegenden Erfindung zum Zwecke der Klarheit und des besseren Verständnisses als Veranschaulichung und als Beispiel detailliert beschrieben wurden, versteht es sich, dass gewisse Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Schutzumfanges der beigefügten Ansprüche vorgenommen werden können.

Claims

Verfahren zur Steigerung des Materialtransports durch elektroosmotischen Fluss eines das Material enthaltenden Fluids, umfassend: die Bereitstellung von zumindest einem ersten und einem zweiten diskreten Fluidvolumen in einem fluidgefüllten Kanal, wobei ein erstes Material im ersten diskreten Fluidvolumen, jedoch nicht im zweiten Fluidvolumen enthalten ist; und die Bereitstellung einer wirksamen Konzentration von zumindest einer zwitterionischen Verbindung im ersten diskreten Volumen des Fluids, das das erste Material enthält, um eine elektrophoretische Mobilität des ersten Materials relativ zu einem elektroosmotischen Fluss des ersten diskreten Fluidvolumens, das das Material enthält, zu reduzieren.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die wirksame Konzentration der zwitterionischen Verbindung im diskreten Volumen des Fluids größer ist als etwa 5 mM.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die wirksame Konzentration der zwitterionischen Verbindung im diskreten Volumen des Fluids von etwa 5 mM bis etwa 2 M beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die zwitterionischen Verbindung aus Betain, Sulfobetain, Taurin, Aminomethansulfonsäure, einer zwitterionischen Aminosäure, HEPES, CAPS, MES und Tricin ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin die zwitterionische Verbindung ein nicht-detergierendes Sulfobetain ist.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das nicht-detergierende Sulfobetain aus Dimethylethylaminopropansulfonsäure, Dimethylbenzylaminopropansulfonsäure und 3-(N-Pyridinium)propansulfonsäure ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Material eine Vielzahl unterschiedlich geladener chemischer Spezies umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Material ein Protein umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das Protein ein Enzym ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Leitung und der Transport des diskreten Volumen des Fluids in zumindest einem mikroskaligen Kanal durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das das Material enthaltende diskrete Volumen des Fluids in einem mikroskaligen Fluidiksystem angeordnet ist, welches Folgendes umfasst: ein Substrat mit zumindest zwei darin angeordneten sich kreuzenden Kanälen, zumindest drei Öffnungen, die im Substrat ausgebildet und in Fluidkommunikation mit freien Enden der zumindest zwei sich kreuzenden Kanäle sind; und eine separate Elektrode, die in elektrischem Kontakt mit jeder der Öffnungen angeordnet ist, wodurch ein in jeder der Öffnungen enthaltenes Fluid in elektrischem Kontakt mit den Elektroden steht.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Verfahren den Transport mittels Elektroosmose von zumindest einem ersten und einem zweiten diskreten Fluidvolumen entlang dem fluidgefüllten Kanal umfasst und worin: der erste Schritt der Bereitstellung die Einführung des ersten und des zweiten Fluidvolumens in den fluidgefüllten Kanal umfasst, worin das zumindest erste diskrete Fluidvolumen das erste Material umfasst, das zumindest eine erste chemische Spezies mit einer anderen Nettoladung als eine zumindest zweite chemische Spezies, die im zweiten diskreten Fluidvolumen enthalten ist, ausbildet; der zweite Schritt der Bereitstellung die Bereitstellung einer wirksamen Konzentration einer zwitterionischen Verbindung innerhalb eines jeden der zumindest ersten und zweiten Fluidvolumen zur Reduktion der elektrophoretischen Mobilität der ersten und der zweiten geladenen chemischen Spezies relativ zu einer elektroosmotischen Mobilität des ersten bzw. des zweiten Fluidvolumens umfasst; und das erste und das zweite diskrete Fluidvolumen durch Anlegen einer Spannung von einem Punkt im Kanal zu einem anderen Punkt im Kanal transportiert werden, wodurch das zumindest erste und zweite Fluidvolumen entlang des fluidgefüllten Kanals transportiert werden.
Verfahren nach Anspruch 12, worin das erste und das zweite diskrete Fluidvolumen im Wesentlichen ohne Vermischen der ersten oder der zweiten chemischen Spezies entlang dem fluidgefüllten Kanal transportiert werden.
Verfahren nach Anspruch 13, worin jedes des ersten und des zweiten diskreten Fluidvolumen zumindest zwei unterschiedlich geladene chemische Spezies umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die geladene chemische Spezies eine positiv geladene chemische Spezies umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, worin die geladene chemische Spezies eine negativ geladene chemische Spezies umfasst.
Mikrofluidiksystem, umfassend: zumindest drei an freien Eden von zumindest zwei sich kreuzenden Kanälen angeordnete Öffnungen, worin zumindest einer der Kanäle zumindest eine Querschnittsgröße von etwa 1 μm bis etwa 500 μm aufweist und worin zumindest einer der Kanäle zur Fortpflanzung eines freien elektroosmotischen Flusses eines Fluids im Kanal fähig ist; eine Elektrode, die in elektrischem Kontakt mit jeder der Öffnungen angeordnet ist; und zumindest ein erstes und ein zweites diskretes Fluidvolumen, die in zumindest einem der Kanäle angeordnet sind, wobei die Elektroden ein elektrisches Feld an dem ersten und dem zweiten diskreten Fluidvolumen erzeugen und worin das erste und das zweite diskrete Fluidvolumen eine wirksame Konzentration einer zwitterionischen Verbindung umfassen, um die elektrophoretische Mobilität eines im ersten diskreten Fluidvolumen enthaltenen Materials relativ zu einem elektroosmotischen Fluss des ersten diskreten Fluidvolumens zu reduzieren.
Mikrofluidiksystem nach Anspruch 17, worin die Fluidkanäle Rillen umfassen, die in einer Oberfläche eines ersten planaren Substrats ausgebildet sind, und ein zweites planares Substrat über das erste planare Substrat gelegt ist, um die Fluidkanäle zu bilden.
Mikrofluidiksystem nach Anspruch 18, worin zumindest eines des ersten und des zweiten planaren Substrats Siliciumoxid umfasst.