JP4202748B2 - タンパク加水分解物 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク加水分解物及び食品組成物(food composition)におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の源からの加水分解タンパクが、食品工業界において幅広く使用されている。例えば、それらは、通常、脱水スープにおける成分として、フレーバーとして、及び、例えば、メイラード反応後の食品フレーバーを得るために他の加工食品中において使用される。それらは、また、種々の疾患及び代謝障害に罹患した患者用の栄養補助剤としての医薬用途が見い出されている。比較的新しい開発においては、それらが、医薬が不要な消費者、運動選手又は減量目的の者などのための製品において、又はパーソナルケア用途において使用されている。更に、現場で、加水分解タンパクは、発酵食品におけるフレーバーの開発において重要な役割を果している。後者においては、使用される微生物学的スタータ培地により、通常、原材料がアミノ酸へ加水分解される原因であるタンパク分解酵素が排出される。これらのアミノ酸の代謝的変化により、例えば、発酵乳製品(dairy product)、例えばチーズ又はヨーグルト、種々のミート製品、ビール及びワインに特徴的な強力なフレーバー化合物及び揮発物が生じる。
【０００３】
従来のタンパク加水分解物は、タンパク源を過酷な化学的条件に付することにより製造されるが、そのような加水分解物を酵素加水分解により得ることに興味が集中してきている。化学的及び酵素的経路の双方とも、最大効率及び最低コストでタンパク源から高レベルのアミノ酸を放出させることを目的とする。このため、安価に入手可能なタンパク源、例えば、大豆ミール及び小麦グルテンが、加水分解を製造するために評判の良い基質である。可能な限り多くのアミノ酸を遊離するために、酵素的経路においては、数種のエンド-及びエキソ-プロテアーゼの複合混合物のいずれかを利用するか(例えばWO 94/25580参照)、又は、エンドプロテアーゼを、単一であるが広範なスペクトルのエキソプロテアーゼと組み合わせる(WO-A-98/27827)。全てのケースにおいて、その目的は、加水分解の程度を高くすること及び多様な遊離アミノ酸を含む最終製品を得ることである。
【０００４】
遊離アミノ酸自体により、多くの味影響がもたらされ、これらの味影響は、非常に基本的なもの(苦味、甘味、酸味及び"旨味")であり、かつ、これらの味を感じるのに必要なアミノ酸濃度は高い。個々のアミノ酸の閾値は、0.3〜80ミリモル/リットルであり得る。このような高い閾値にもかかわらず、遊離アミノ酸は、多くのメカニズムを介して非常に低い濃度範囲で主要知覚作用をもたらし得る。
これらのメカニズムの1つは、遊離グルタミン酸を包含し、強力な風味強化作用をもたらし得るが、これは、グルタミン酸と5'-リボヌクレオチドとの相互作用による。適切な濃度の5'-リボヌクレオチド、例えば5'-IMP及び5'-GMPと組み合わせる場合、グルタミン酸により生じる旨味の検知閾値が、ほとんど2つのオーダー規模で低減されることが知られている。
【０００５】
他のフレーバー強化メカニズムは、メイラード反応を包含する。遊離アミノ酸と比較すると、遊離アミノ酸が糖と反応したメイラード反応生成物は、特により強い味及び香りの特徴を示す。メイラード反応においては、圧倒的に、その遊離アミノ酸について報告されているものより数オーダー規模で低減された閾値を有する複合フレーバー及び香り系が開発されているかもしれない。
メイラード反応生成物は、高温で、通常、食品製造の際の調理、焼成又はローストの間に形成される。これらの処理の間に、色及び一連の芳香(a large array of aromas)の双方が発展する。これらの反応において、アミノ基が最初の工程として還元化合物と反応し、最終的に、反応経路の全系列へと進行する。食品に含まれるアミノ化合物は、主に、遊離アミノ酸及びタンパクであり、還元化合物は、主に、還元糖を意味する。メイラード反応に影響を及ぼす要因としては、含まれる糖及びアミノ酸のタイプ並びに物理的要因、例えばpH、温度、水分活性(aw)、反応時間などが挙げられる。
【０００６】
単糖及び二糖の双方がメイラード反応において機能し得る。一般には、アルドースはケトースより反応性が高く、ペントースはヘキソース又は二糖より反応性が高く、また、糖のタイプが生じるフレーバー化合物の量に大きく影響する一方、反応に包含されるアミノ酸は、形成されるフレーバーの性質を大きく左右するとされる。例えば、メイラード反応系に純粋なメチオニンが包含されることにより、植物性又はシチューノート(stewed note)がもたらされるケースが多く、純粋なシステインではミート様フレーバーがもたらされ、純粋なプロリン、ヒドロキシプロリン及びロイシンでは、ベーカリー芳香がもたらされる(R. F. Hurrell, Food Flavours, Part A: Introduction, Elsevier Scienctific Publishing Company, Eds.: I. D. Morton and A. J. Macleod)。これらの結果は、食品成分中に存在するような数種のアミノ酸の混合物よりむしろ純粋なアミノ酸を用いることにより得られるので、その結果が単に天然的状況の全体的単純化を示すのみであることが明らかである。同様に、食品中に天然的に存在する糖は、味及び芳香の開発に対し更に複雑化・影響する。
【０００７】
メイラード反応とは別に、アミノ酸は、また、周囲温度で重大な化学的変化を受け得る。後者のタイプの変化は、酵素依存性であり、発酵食品、例えばビール、ヨーグルト、チーズの熟成、及びミート及びワインの熟成工程において極めて一般的である。これらの発酵工程においては、遊離アミノ酸が、使用される原材料又は微生物学的スタータのいずれかからのタンパク分解酵素活性により使用される原材料から遊離される。熟成期間に、微生物学的代謝活性により、遊離アミノ酸は、感覚的特性が高められた誘導体へ転化される。例えば、L-ロイシン、L-イソロイシン及びL-バリンにより、ビール発酵の際に価値あるフーゼルアルコール、例えばアミルアルコール及びイソブタノールの形成が導かれる。L-ロイシンは、例えば3-メチルブタナール及び3-メチルブタノールなどの保存ミート(cured meat)化合物用前駆物質として知られるが、L-フェニルアラニンによりベンズアセトアルデヒドが導かれ得る。同様に、チーズ揮発物、例えばメタンチオール及びジメチルジスルフィドが、チーズにおけるメチオニンの存在に由来し、及びメチルプロパン酸及びメチルプロパナールがバリンに由来することが分かった。従って、ワイン製造に使用され、おいしいワインを提供することが知られている"サーリー(surlie)"法は、存在するアミノ酸、例えばアスパラギン酸、アルギニン、アラニン、ロイシン及びリシンの量の増加に基づく。
【０００８】
従来のタンパク加水分解法(WO 94/25580及びWO 98/27827)では、全ての利用可能なアミノ酸を放出することを目的とし、そのように多くの異なるアミノ酸が存在すると、最終製品において所望の味又は芳香がぼやけたものとなるであろう。
WO 98/14599は、こうじ菌から得られる数種のポリペプチド、及び、これらのポリペプチドを(特異的又は特異的でない)エンドペプチダーゼ及び(特異的又は特異的でない)エキソペプチダーゼと組み合わせて製造される加水分解物に関するものである。WO 98/14599は、上昇した、例えば1.1倍高い含量のLeu、Gly、Ala及び/又はProを有する加水分解物を記載するが、そのような加水分解物の使用を記載していない。
EP-A-799577は、Phe(フェニルアラニン)含量が低減されたホエータンパク加水分解物を記載する。このホエータンパク加水分解物は、PKU(フェニルケトン症)に罹患した患者用の食品として使用される。
フォークトら(Food Chemistry 51 (1994) pp. 7-14)は、種子タンパクのインビトロでのタンパク分解による、ココア特有の芳香前駆物質の製造を記載する。ココア特有の芳香前駆物質は、単に、1つの基質、ココアビシリン類グロブリンタンパクの特異的加水分解により得ることができる。
【０００９】
【発明の内容】
本発明によれば、所望のフレーバー作用が、本発明のタンパク加水分解物中の単一の所望の遊離アミノ酸のモル分率が、同一タンパク含有基質の酸加水分解により得られるものに比し、少なくとも2.5倍高い(濃縮係数)である場合に得ることができる。本発明により、そのようなタンパク加水分解物が、多くの場合、選択タンパク含有基質と、酵素との特定の組み合わせにより得られることが証明される。
【００１０】
本発明は、他のもののうち、タンパク加水分解物であって、
タンパク含有基質の酵素加水分解により得ることができ、
遊離アミノ酸及びペプチドを含み、
タンパク加水分解物中に存在する少なくとも1種の遊離アミノ酸のモル分率が、遊離アミノ酸へと完全に加水分解された同一タンパク含有基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも2.5倍、好ましくは少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも3.5倍高く、従って、濃縮係数が、少なくとも2.5、好ましくは少なくとも3、より好ましくは3.5であり、
タンパク加水分解物における少なくとも1種の遊離アミノ酸のモル分率が少なくとも25%であり、かつ、
タンパク加水分解物におけるアミノ酸指数(amino acid quotient)(AAQ)が少なくとも10%である
ことを特徴とするタンパク加水分解物を提供する。
【００１１】
本発明は、更に、本発明のタンパク加水分解物を含む食品組成物に関する。
本発明は、更に、タンパク加水分解物を製造する方法であって、
水性条件下、5〜75℃及びｐH3〜9で、タンパク含有基質を、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼにより加水分解し、それによりエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼの組み合わせ作用で、タンパク含有基質から少なくとも1種の遊離アミノ酸を放出させる工程と、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼのインキュベーションを、タンパク加水分解物中に存在する少なくとも1種の遊離アミノ酸のモル分率が、遊離アミノ酸へと完全に加水分解された同一タンパク含有基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも2.5倍、好ましくは少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも3.5倍高いタンパク加水分解物を得るのに適する時間行う工程を含み、
タンパク加水分解物における少なくとも1種の遊離アミノ酸のモル分率が少なくとも25%であり、かつ、
タンパク加水分解物におけるアミノ酸指数(AAQ)が少なくとも10%であることを特徴とする方法に関する。
【００１２】
更に、本発明は、以下の(a)〜(f)のいずれかであるタンパク加水分解物に関する：
(a)遊離ロイシンのモル分率が少なくとも25%であるホエータンパク加水分解物又はトウモロコシタンパク加水分解物；
(b)遊離リシンのモル分率が少なくとも25%であるホエータンパク加水分解物；
(c)遊離アルギニンのモル分率が少なくとも25%である大豆タンパク加水分解物；
(d)遊離リシンのモル分率が少なくとも25%である大豆タンパク加水分解物；
(e)遊離ロイシンのモル分率が少なくとも25%であるヘモグロビン加水分解物；又は
(f)遊離グルタミン酸のモル分率が少なくとも25%であるウシ血清アルブミン(BSA)加水分解物フラクション。
【００１３】
一般に、AAQは40%未満であり、好ましくは、AAQは15〜30%である。一般に、少なくとも1種のアミノ酸のモル分率は80%未満であり、好ましくは、このモル分率は25〜50%、より好ましくは25〜40%である。
好ましくは、タンパク含有基質の加水分解は、酵素加水分解、より好ましくはエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼによる酵素加水分解である。
本発明のタンパク加水分解物を含む食品組成物は、例えば、発酵、加工、調理及び/又は還元糖との反応後に、改良された風味を示すことを見い出した。
組成物中のある遊離アミノ酸のモル分率は、その遊離アミノ酸の組成物中におけるモル濃度を、その同一組成物中における全ての遊離アミノ酸(アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン及びバリン)のモル濃度の合計で割った値×100%としたものとして定義する。本願明細書において合計又は全てのアミノ酸とは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、チロシン及びバリンの合計を意味する。
【００１４】
酵素加水分解された組成物中におけるある遊離アミノ酸のモル分率及びタンパク含有基質を完全に加水分解することにより得た組成物中におけるある遊離アミノ酸のモル分率の測定は、材料及び方法の項で記載する。
更に、酵素加水分解の間に遊離される、遊離Gln及びGlu、及び、遊離Asn及びAspのそれぞれの量の合計は、強酸での完全な加水分解後に得られる遊離Glu及びAspの量に匹敵するものとして取り扱った(酸加水分解によりGln及びAsn残留物が脱アミド化され、"更なる"遊離Glu及び遊離Aspが生じる)。一般に、Glu及びGlnについては、Glu及びGlnのモル分率の合計が、遊離アミノ酸に完全に加水分解された同一タンパク含有基質の加水分解物におけるGlu及びGlnのモル分率の合計に比し、少なくとも2.5倍(濃縮係数)、好ましくは少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも3.5倍高い。遊離アミノ酸の濃縮係数は、タンパク加水分解物中に存在する遊離アミノ酸のモル分率を、遊離アミノ酸に完全に加水分解されたタンパク加水分解物中に存在する遊離アミノ酸のモル分率で割った値を意味する。Glu/Gln比が知られている場合、例えば、単一鎖タンパクのケース(実施例８参照)においては、Glu及びGlnは別々に計算することができる。Asp及びAsnについては、Asp及びAsnのモル分率の合計は、タンパク含有基質を遊離アミノ酸へ完全に加水分解した同一タンパク含有基質の加水分解物中におけるAsp及びAsnのモル分率の合計に比し、少なくとも2.5倍、好ましくは少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも3.5倍高い。本発明において、用語"遊離アミノ酸へ完全に加水分解"又は"タンパク含有基質を遊離アミノ酸へ完全に加水分解"とは、ウォーターズ(米国のミルフォードMA)の方法に従って行った、タンパク含有基質の酸加水分解を意味し、その方法は、材料及び方法の項に記載する。
【００１５】
本発明のタンパク加水分解物は、ある遊離アミノ酸が比較的高いモル分率で存在することにより特徴付けられる。従って、これらのタンパク加水分解物の全体的加水分解の程度は依然として制限される。本願明細書において、アミノ酸指数(AAQ)は、加水分解の程度を測定するために使用する。AAQは、タンパク含有基質を遊離アミノ酸へ完全に加水分解することにより得られた加水分解物中に存在するアミノ酸の全量に対する、タンパク含有基質を酵素加水分解することにより得られた加水分解物中に存在する遊離アミノ酸の全量である。AAQは、パーセントで表す。AAQは、加水分解物中に存在する全ての遊離アミノ酸のモル濃度の合計値を、タンパク含有基質を遊離アミノ酸へ完全に加水分解した時の加水分解物中に存在する全てのアミノ酸のモル濃度の合計値で割ることにより計算することができる(×100%)。本発明のタンパク加水分解物は、AAQが10〜50%であってもよく、好ましくは10〜40%である。
【００１６】
好ましいアミノ酸は、所望の、食品適合性フレーバー(味及び芳香)化合物を生じ得るアミノ酸である。例えば、適切な糖グリシンを用いる加熱によりビーフブロス様フレーバー性質が生じ、ロイシンではチョコレート又はパンの皮様フレーバー性質が生じ、フェニルアラニンではチョコレート又はキャラメル様フレーバー性質が生じ、かつ、リシンではポテト又はボイルしたミート様フレーバー性質が生じ得ることが知られている。
本発明の特定のアミノ酸又は一連のアミノ酸が濃縮されたタンパク加水分解物は、選択された糖との組み合わせで使用することにより、特定のフレーバー性質を食品又は食品成分に付与し得る。この特定のフレーバー性質は、パン、特にその皮の焼成の間に生じるように、食品製造の際の調理、焼成又はロースト工程で生じ得る(ここで、本発明のタンパク加水分解物は、ドウ又はドウ上に添加している)。しかしながら、タンパク加水分解物及び適切な糖が、また、前反応(他の食品成分の不在下)することにより、適切なフレーバー成分を得ることができる。
【００１７】
微生物の作用による遊離アミノ酸のフレーバー化合物への転化は、メイラード反応を含む転化より報告が非常に少ない。多くのアミノ酸が、発酵製品、例えばチーズ、発酵ソーセージ及びビールなどの芳香発生を指摘されているが、疎水性アミノ酸、例えばバリン、ロイシン、イソロイシン及びフェニルアラニン並びに硫黄含有アミノ酸、例えばメチオニンが、特に重要であることが知られている。ワインの熟成には、高レベルの遊離アルギニン、リシン及びアラニンが特に著しい。
特に、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ及びＬｙｓは、適切な糖を用いて加熱すると、所望のフレーバー化合物を提供することが知られる化合物である。更に、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ及びＡｌａは、適切な微生物による発酵の際に、フレーバー化合物に良好に転化され得るアミノ酸として知られる。本発明の好ましい態様においては、遊離アミノ酸が、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒから選ばれ、より好ましくは該アミノ酸が、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ又はＡｒｇから選ばれ、最も好ましくは該アミノ酸が、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ又はＡｒｇから選ばれる。
【００１８】
本発明に従って使用可能なタンパク含有基質は、ヒト又は動物の消費に適切なタンパク含有材料である。好ましくは、タンパク含有材料のタンパク含量は、実在的(substantial)なものであり、それは、少なくとも20%w/wがタンパクであることを意味する。好ましくは、タンパク含有基質は、質量/乾燥質量をベースとして、少なくとも40%のタンパク、より好ましくは少なくとも50%のタンパク、最も好ましくは少なくとも70%のタンパクを含有する。
本発明に従って使用可能なタンパク含有基質の例としては、大豆タンパク、小麦グルテン、ナタネタンパク、エンドウ豆タンパク、アルファルファタンパク、ヒマワリタンパク、豆科マメタンパク、ワタ又はゴマタンパク、トウモロコシタンパク、大麦タンパク、モロコシタンパク、ポテトタンパク、ライスタンパク、コーヒータンパク、動物由来タンパク、例えば乳タンパク(例えばカゼイン、ホエータンパク)、卵白、魚タンパク、ミートタンパク(ゼラチン、コラーゲンを含む)、血液タンパク(例えばヘモグロビン)、毛髪、羽毛及びフィッシュミールが挙げられる。好ましいタンパク含有基質としては、ホエータンパク、ヘモグロビン、ゼラチン、カゼイン、トウモロコシタンパク、大豆タンパク及びグルテンが挙げられる。
【００１９】
本発明のタンパク加水分解物は、特定のアミノ酸が選択的に濃縮されているので、関連最終製品(食品組成物)の通常の成分に属するタンパク含有基質が好ましいことが明らかである。特定のアミノ酸が例外的に濃縮された更なるタンパク含有基質は、タンパク加水分解物用の源として好ましい。後者のタンパク含有基質の典型例は、ホエータンパク(Leu及びLysが濃縮)、小麦グルテン(Gln及びProが濃縮)、化学的脱アミド化された小麦グルテン(Glu及びProが濃縮)、トウモロコシタンパク(Leu及びProが濃縮)、ヘモグロビン(Leu、His及びValが濃縮)、フィッシュ濃縮物又はカゼイン(Met及びLysが濃縮)、ピーナッツ(Argが濃縮)、ライスプロテイン(Phe及びArgが濃縮)、及び、例えば、トリプトファンが濃縮されたホエーのβ-ラクトアルブミン(lactabumine)フラクションとしてのタンパクフラクションである。得られるタンパク加水分解物は、食品用フレーバーを提供することができ、及び好ましくは、これらのフレーバーは、タンパク含有基質に関連しない。例えば、ココアタンパク加水分解物は、ココアフレーバーを提供し得ると予想されるが、ホエー又はライスタンパク加水分解物がココアフレーバーを提供し得ることは予想されない。好ましくは、本発明のタンパク加水分解物は、タンパク含有基質源に関連しない新規かつ予期せぬフレーバーを提供する。例えば、ホエータンパク加水分解物は、ホエータンパクフレーバーの代わりに、例えば、ミート、チーズ又はココアフレーバーを提供する。
【００２０】
本発明のタンパク加水分解物は、タンパク含有基質を、適切なエンド-プロテアーゼ及びエキソプロテアーゼを用いて加水分解することにより得ることができる。従来の酵素タンパク加水分解方法(WO 94/25580; WO 98/27827)では、典型的に、広範な特異性を有する数種のエンド及びエキソプロテアーゼの粗混合物を使用するが、本発明の加水分解方法では、エンド及びエキソプロテアーゼの組み合わせ選択を慎重に行う必要がある。タンパク含有基質の酸加水分解物に比し、あるアミノ酸が少なくとも2.5倍濃縮されたタンパク加水分解物を、タンパク含有基質の酵素加水分解により生じるのに適するエンド及びエキソプロテアーゼは、好ましくは、ある又は選択された一連のアミノ酸残留物の近隣での開裂の優先性を有する。更に、タンパク含有基質の酸加水分解物に比し、あるアミノ酸が少なくとも2.5倍濃縮されたタンパク加水分解物を、タンパク含有基質の酵素加水分解により生じるのに適切なエンド及びエキソプロテアーゼの双方は、好ましくは純粋なものであり、それは、エンド及び／又はエキソプロテアーゼが、主に、少なくとも60%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも90%及び最も好ましくは少なくとも95%の単一のタンパク分解活性を有することを意味する。エキソペプチダーゼの選択性の程度に依存して、純粋な又はより低純度のエンドプロテアーゼが必要とされる。エンドプロテアーゼの選択性の程度に依存して、純粋な又はより低純度のエキソプロテアーゼが必要とされる。エンド及びエキソプロテアーゼの選択性は、所望のタンパク加水分解物が得られるように少なくともオーバーラップすべきである。例えば、同一タンパク含有基質の酸加水分解物に比し、遊離アミノ酸ロイシンが少なくとも2.5倍多いタンパク加水分解物を得るためには、ロイシンに対して幾らかの選択性を有するエンド及びエキソプロテアーゼが必要とされる。高純度のプロテアーゼは、例えば、粗タンパク分解酵素生成物の精製により、又は、過剰産生の組換えDNA株を用いて酵素を製造することにより得ることができる。本発明において適切なプロテアーゼは、好ましくは、食品用途に利用可能な商業的なもの及び/又は組換体である。タンパク分解活性をコードする遺伝子を、この遺伝子を過剰発現する宿主生物体においてクローニングする、rDNA-技術を用いて製造されるプロテアーゼは、通常、酵素活性の汚染が低い酵素生成物を提供し、従って、高価な回復工程を必要としない場合がある。クローニング遺伝子を過剰発現する宿主生物体としては、酵母、菌類又はバクテリア(例えばサッカロミセス、クライベロミセス、アスペルギウス、トリコデルマ、大腸菌、バチラスなど)がよく知られている。
【００２１】
本発明に従ってタンパク加水分解物を得るために、タンパク含有基質を、エンド及びエキソプロテアーゼの組み合わせを用いて加水分解することができ、ここで、エンド及びエキソプロテアーゼの少なくとも1つ、好ましくはエンド及びエキソプロテアーゼの双方が、純粋で、特定の一連のアミノ酸に対して選択的なものであり、又は、アミノ酸を優先的に放出するが、これらのアミノ酸は、タンパク加水分解物中において濃縮されていることが意図されたものである。
適切なエンドプロテアーゼは、動物、植物又は微生物由来のものであってもよい。これらのものとしては、組換え型酵素、例えば、遺伝子工学的技術により得られる酵素が挙げられる。あるアミノ酸の近隣を優先的に開裂する、好ましい選択的エンドプロテアーゼとしては、トリプシン(EC 3.4.21.4)、エラスターゼ(EC 3.4.21.36)、キモトリプシン(EC 3.4.21.1)、サーモリシン(EC 3.4.24.27)、プロリルオリゴペプチダーゼ(EC 3.4.21.26)、グルタミルエンドペプチダーゼI(EC 3.4.21.19)、微生物コラゲナーゼ(EC 3.4.24.3)、ペプチジル-Aspメタロペプチダーゼ(EC 3.4.24.33)、グリシルエンドペプチダーゼ(EC 3.4.22.25)、サッカロリシン(EC 3.4.24.37)、中性プロテアーゼ(EC 3.4.24.28)、ストレプトグリシンB(EC 3.4.21.81)、グルタミルエンドペプチダーゼII(EC 3.4.21.82)、加工プロリン特異性ペチジル-プロリルシス-トランスのイソメラーゼ、及びレンネット様特異性、例えばミクロビアルレンネットを有する酵素、例えばケカビ属ペプシン(EC 3.4.23.23)が挙げられる。特定のアミノ酸の近隣の開裂についての優先性が強くはないが、選択された群のアミノ酸のほぼ近隣を開裂する、好ましい非選択的エンドプロテアーゼとしては、例えばサブチリシン(EC 3.4.21.14)及びパパイン(EC 3.4.22.2)が挙げられる。
【００２２】
適切なエキソペプチダーゼ(又はエキソプロテアーゼ、その用語は可換である)は、カルボキシペプチダーゼ及び/又はアミノペプチダーゼを含み得る。これらの細胞外酵素は、動物、植物又は微生物材料に由来するものであってもよい。それらのものとしては、組換え型酵素、例えば遺伝子工学的技術により得られるものが挙げられる。
あるアミノ酸の近隣を優先的に開裂する、好ましい選択的カルボキシペプチダーゼとしては、A.ニガー由来のカルボキシペプチダーゼB(EC 3.4.17.2)、CPD-I(pep G)及びCPD-II(pep F)が挙げられる(ダル デガンらのAppl. Environ Microbiol, 58(7): 2144-2152, 1992)。
あるアミノ酸の近隣を開裂する優先性は強くないが、いずれかのアミノ酸残基の近隣をほとんど開裂する、好ましい非選択的カルボキシペプチダーゼとしては、P. janthinellum由来のCPD-S₁及びS. cerevisae由来のCPD-Yが挙げられる(ダル デガンらのAppl. Environ Microbial, 58(7): 2144-2152, 1992)。
あるアミノ酸の近隣を優先的に開裂する、好ましい選択的アミノペプチダーゼとしては、プロリルイミノペプチダーゼ(EC 3.4.11.5)、アエロモナスプロテオリティカ(proteolytica)由来の微生物ロイシルアミノペプチダーゼ(EC 3.4.11.10)又はアスペルギルス由来のロイシルアミノペプチダーゼ、及びEP 773990に記載されたようなメチオニルアミノペプチダーゼ(EC 3.4.11.18)及びフェニルアラニン特異性アミノペプチダーゼが挙げられる。
【００２３】
あるアミノ酸の近隣を開裂する優先性が強くないが、いずれかのアミノ酸の近隣をほとんど開裂する、好ましい非選択的アミノペプチダーゼとしては、好熱アミノペプチダーゼ(EC 3.4.11.12)が挙げられる。
エンド及びエキソプロテアーゼの好ましい組み合わせとしては以下のものが挙げられる：
(a)ストレプトグリシンB又はトリプシン又はパパインエンドプロテアーゼとCPD II(Arg又はLys放出用)；
(b)キモトリプシン又はサーモリシン又は中性プロテアーゼとCPD I(Tyr、Phe又はTrp放出用)；
(c)サーモリシン又は中性プロテアーゼと微生物ロイシルアミノペプチダーゼ又はアスペルギルス由来のロイシルアミノペプチダーゼ(Leu、Ile、Phe又はVal放出用)；
(d)中性プロテアーゼ又はサブチリシンとCPD I(Phe又はAla放出用)；
(e)エラスターゼとCPD I(Ala放出用)；
(f)レンネット様プロテアーゼとアスペルギルス由来のロイシルアミノペプチダーゼ又はメチオニルアミノペプチダーゼ(Met放出用)；
(g)工学的プロリン特異性ペプチジル-プロリルシス-トランスのイソメラーゼ(シプロアーゼ(cyproase))とプロリルアミノペプチダーゼ(Pro放出用)；
(h)プロリン特異性エンドプロテアーゼと麦芽酵素又はCPD-Y(Pro放出用)；及び(i)グルタミルエンドペプチダーゼとCPD-I(Glu放出用)。
【００２４】
最も濃縮された状態でアミノ酸を有し、かつ、最適な味を有するタンパク加水分解物を得るためには、エンド及びエキソプロテアーゼの好ましい組み合わせを、適切な又は選択されたタンパク含有基質と組み合わせるのがよい。好ましい選択的酵素の組み合わせを、1種又は2種以上の所望のアミノ酸が比較的濃縮されたタンパク含有基質と共にインキュベートすることにより、好ましい酵素と基質の組み合わせが確立され得る。
濃縮されたタンパク加水分解物を得るのに好ましい酵素と基質の組み合わせとしては、以下のものが挙げられる：
(a)ホエータンパクとトリプシン又はパパイン及びカルボキシペプチダーゼCPD II(Lys又はArg濃縮)、又はホエータンパクとサーモリシン及びアエロモナスプロテオリティカアミノペプチダーゼ又は他のロイシルアミノペプチダーゼ(Leu濃縮)；
(b)トウモロコシタンパクとサーモリシン及びロイシルアミノペプチダーゼ(Leu濃縮)；
(c)ライスタンパクとサーモリシン及びアスペルギルス由来のロイシルアミノペプチダーゼ(Phe及びLeu放出用)；
(d)グルテンと工学的プロリン特異性ペプチジル-プロリルシス-トランスのイソメラーゼ(シプロアーゼ)及びプロリルアミノペプチダーゼ(Pro放出用)；
(e)コーンタンパクとサーモリシン及びロイシンアミノペプチダーゼ(Leu濃縮)；
(f)大豆タンパク単離物とトリプシン又はパパイン及びカルボキシペプチダーゼCPD II(Arg及びLys濃縮)；
(g)BSAとグルタミルエンドペプチダーゼ及びCPD-I(Glu放出用)；及び
(h)ヘモグロビンとサーモリシン及びロイシルアミノペプチダーゼ(Leu濃縮)。
【００２５】
基質及び酵素(エンド及びエキソプロテアーゼ)の組み合わせにより、例えば、以下のタンパク加水分解物が生じ得る：
−ホエータンパク加水分解物であって、遊離ロイシンのモル分率が少なくとも25%、好ましくは少なくとも27%、より好ましくは少なくとも30%であり、又は、遊離リシンのモル分率が好ましくは少なくとも25%、好ましくは少なくとも35%、より好ましくは少なくとも40%のもの；
−コーンタンパク加水分解物であって、遊離ロイシンのモル分率が少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも35%であるもの；
−大豆タンパク加水分解物であって、遊離アルギニンのモル分率が少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%であり、又は、遊離リシンのモル分率が少なくとも25%であるもの；
−BSA加水分解物であって、遊離グルタミン酸のモル分率が少なくとも25%のもの；及び
−ヘモグロビン加水分解物であって、遊離ロイシンのモル分率が少なくとも25%、好ましくは少なくとも30%、より好ましくは少なくとも35%のもの。
【００２６】
本発明のタンパク加水分解物は、タンパク含有基質と適切な酵素、エンド及びエキソプロテアーゼとを、タンパク加水分解に適するpH及び温度条件下でインキュベートすることにより製造することができる。適切なpH及び温度は、プロテアーゼの最適条件に依存し、それは、pH約3〜9、温度約5〜75℃で変動し得る。例外的にこれらの範囲外の条件が酵素にとって最適であるかもしれない。
タンパク加水分解のための酵素及び条件は、本発明の所望のタンパク加水分解物が得られるように選択する。例えば、ロイシンが濃縮されたホエータンパク加水分解物を得ることが望まれる場合、ホエータンパク基質を選択し、ロイシン特異性エンド及びエキソプロテアーゼを用いて、該エンド及びエキソプロテアーゼがホエータンパクからロイシンを特異的に放出するのに適する条件下で加水分解する。例えば、ホエーの加水分解を、5時間、サーモリシン及びアエロモナスプロテオリティカロイシルアミノペプチダーゼを用いて、pH8、40℃で行って、ホエータンパク加水分解物を得るが、該タンパク加水分解物中に存在する遊離ロイシンのモル分率は、遊離アミノ酸に完全に加水分解された同一ホエータンパク基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも2.5倍高い。遊離アミノ酸に完全に加水分解されたホエータンパク加水分解物との比較のために、ホエータンパクをウォーターズに従って酸加水分解する(米国のミルフォードMA; 材料及び方法の項を参照)。
【００２７】
本発明のタンパク加水分解物を得るために、タンパク含有基質を水に添加して、水性サスペンションを得る。タンパク含有基質は、乾燥質量のタンパク含有基質/全質量のサスペンションをベースとして、1〜18%、好ましくは3〜15%、より好ましくは5〜13%の量で添加することができる。その量は、タンパク含有基質の水中への溶解性に依存し得る。エンド及びエキソプロテアーゼは、タンパク含有基質が添加される水中に予め存在していてもよく、又はエンド及びエキソプロテアーゼを、タンパク含有基質の水性サスペンションの製造後に添加してもよい。タンパク含有基質、エンド及びエキソプロテアーゼは、一緒にインキュベートすることができ、又は、エキソプロテアーゼを、タンパク含有基質とエンドプロテアーゼのインキュベーション後にインキュベートしてもよく、ここで、場合により、エンドプロテアーゼは、エキソプロテアーゼのインキュベーションの開始前に不活性化されていてもよい。温度及びpHなどの条件は、好ましくは、酵素を水又はサスペンションに添加する前に合わせる。一度酵素(エンド及びエキソプロテアーゼ)及びタンパク含有基質が直接接触すると、タンパク加水分解が開始する。タンパク加水分解の間、pHは、一定のpHに制御してもしなくてもよい。pHを一定に制御する場合(又はpHを所定の範囲内に保つ場合)、そのpHは、例えば、食品適合性の酸又はアルカリのいずれかを添加することにより調節することができる。例えば、水酸加水分解ナトリウム又はカリウムを、食品適合性アルカリとして使用することができ、また、塩酸を食品適合性酸として使用することができる。
【００２８】
所望のタンパク加水分解物が水性サスペンション中に生じたら、好ましくは、タンパク加水分解を、存在する酵素を不活性化することにより停止する。不活性化は、pHを低下させて5未満とするか又はpHを上昇させて8より高くし、併せて、サスペンションを加熱して少なくとも70℃より高く、好ましくは少なくとも90℃とすることにより行うことができる。例外的に、この範囲外の条件が、プロテアーゼの不活性化に必要とされるかもしれない。しかしながら、不活性化は、水性サスペンション中に存在するアミノ酸及びペプチドに影響しないものとすべきである。当該技術分野における当業者は、プロテアーゼを不活性化する最適条件を選択することができる。
【００２９】
本発明のタンパク加水分解物を含む水性サスペンションは、好ましくは、例えば、パウダー又はペースト形態のタンパク濃縮物を得るために、更に処理されるであろう。タンパク加水分解物を含む水性サスペンションは、例えば、遠心分離し、及び/又は(限外)ろ過し、次いで、例えば蒸発により濃縮し、及び場合によりいずれかの都合の良い方法で乾燥、例えばスプレードライ、凍結乾燥、流動乾燥処理、又はこれらの方法の組み合わせ処理してもよい。当該技術分野における当業者は、選択される方法が、生成物の配合(及びその更なる使用)に依存するであろうことを理解するであろう。例えば、タンパク加水分解物を特定の糖と組み合わせて、加熱により特定の反応生成物を得ることが意図される場合、タンパク加水分解物は、不本意な(不十分な)メイラード反応をもたらすであろう過酷な条件には付されないであろう。タンパク加水分解物を食品発酵工程に使用することが意図される場合、タンパク加水分解物の回収のための条件は、発酵により所望のフレーバーを生じるであろう遊離アミノ酸に影響を及ぼさないものとすべきである。最終タンパク加水分解物製品は、好ましくは、濃縮形態、例えば濃縮液体、ペースト、パウダー又は顆粒状物で配合される。濃縮製品は、少なくとも20%の乾燥材料(乾燥材料の質量/全質量)、好ましくは少なくとも30%の乾燥材料(乾燥材料の質量/全質量)、より好ましくは少なくとも40%の乾燥材料(乾燥材料の質量/全質量)を含む。顆粒状物又はパウダーは、少なくとも80%の乾燥材料(乾燥材料の質量/全質量)、好ましくは少なくとも90%の乾燥材料(乾燥材料の質量/全質量)を含む。
【００３０】
あるいはまた、タンパク加水分解物を含む、タンパク加水分解後に得られる水性サスペンションを、反応フレーバー又は発酵フレーバーの製造に直接使用してもよい。例えば、反応フレーバーの製造においては、例えば、遠心分離又は濃縮後の、タンパク加水分解物を含む水性サスペンションに糖を補って、その後加熱してもよい。反応後、反応フレーバー組成物を、例えば、加熱製品の濃縮及び/又は乾燥により得ることができる。発酵フレーバーの製造においては、遠心分離又は濃縮後の、タンパク加水分解物を含む水性サスペンションを、食品用微生物と共に、該微生物がタンパク加水分解物を発酵するのに適する条件下でインキュベートしてもよい。発酵後、発酵フレーバーを、例えば、発酵製品の濃縮及び/又は乾燥により得ることができる。
【００３１】
エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼを用いるタンパク含有基質の酵素加水分解後に得られる遊離アミノ酸及びペプチドを含むタンパク加水分解物であって、その中に存在する少なくとも1種の遊離アミノ酸のモル分率が、遊離アミノ酸に完全に加水分解された同一タンパク含有基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも2.5倍、好ましくは少なくとも3倍、より好ましくは少なくとも3.5倍高いものは、食品を含む数種の用途に用いることができる。本発明のタンパク加水分解物は、例えば、毛髪及び皮膚を処理するための化粧品中に使用することができ、又は、耐久力(physical endurance recovery)強化のためのスポーツドリンクに添加することができる。特に、本発明のタンパク加水分解物は、食品、発酵食品及び発酵食品フレーバーの製造において用いるのに適しており、また、反応フレーバー組成物の製造において用いるのに適しており、該反応フレーバー組成物は、タンパク加水分解物が糖と反応して得られる。注目すべき及び顕著なフレーバー特性は、本発明のタンパク加水分解物を上記食品製造において使用した際に得ることができる。本発明のタンパク加水分解物は、好ましくは、食品の風味を改善することができる。
【００３２】
本発明のタンパク加水分解物は、上述したような発酵食品成分又は製品の製造において使用することができる。発酵食品成分又は製品は、少なくとも1つの発酵工程により製造され、そこでは、処理される食品に内生的な酵素を活性的に入れ込むか又は食品用微生物を食品と共にインキュベートして発酵食品を得る。発酵食品の例は、例えば、ミート製品、例えばハム又はソーセージ、ヨーグルト、チーズ、ビール、ウイスキー、ワイン及びシャンパンである。発酵食品フレーバーは、発酵食品から得られるフレーバーである。これらの発酵食品フレーバーは、本発明のタンパク加水分解物を食品用微生物と共にインキュベートし、それにより、タンパク加水分解物を発酵させて、所望のフレーバーとすることにより得ることができる。
本発明のタンパク加水分解物を用いて発酵食品を製造する方法は、発酵食品の発酵前又はその間にタンパク加水分解物を添加する工程を包含するであろう。製品の内生的酵素又は発酵微生物により、特定のアミノ酸が、このタイプの発酵食品に特徴的な付加的フレーバーに転化される。また、このタイプの発酵食品に特徴的でないフレーバーをこの方法で製造して、驚くべき新規な風味を有する発酵食品を得ることができる。
【００３３】
発酵食品は、例えば、チーズであってもよく、ここで、酸加水分解物に比して少なくとも2.5倍高いモル分率の遊離アミノ酸は、Met、Leu又はPheである。このケースにおいて、アミノ酸が濃縮されたなタンパク加水分解物は、牛乳の凝固工程の直前又はその間に牛乳に添加することができる。存在する遊離アミノ酸の損失を最小限とするために、加水分解物を、製造工程においていくらか遅れて添加してもよい。例えば、チェダーチーズの製造において、加水分解物を、その塩と共に、チップ化凝乳に直接添加してもよい。同様に、本発明のタンパク加水分解物を酵素改質チーズに添加して、天然チーズの芳香の発生を更に促進することができる。そのような乳製品の改善のためには、タンパク加水分解物は、好ましくは、乳タンパク、例えばカゼイン又はホエーから誘導されたものである。
発酵食品はビールであってもよく、ここで、そのモル分率が、酸加水分解物のものに比し少なくとも2.5倍高いモル分率の遊離アミノ酸が、Leu、Ile又はValである。このケースにおいて、タンパク加水分解物は、ライス又は大麦又はコーンタンパクから得られたものであってもよく(例えば最終製品ラガービールの芳香性質を改善するため)、又は、それは、小麦グルテンから得られたものであってもよい(例えば最終製品小麦ビールの香気成分を改善するため)。ビールの製造において、アミノ酸が濃縮されたタンパク加水分解物は、ビール酵母による発酵が行われる容器の渦流(whirlpool)、遠心分離及びアップストリームの直後に添加してもよい。
【００３４】
発酵食品は、また、発酵された又は保存されたミート製品であってもよく、ここでそのタンパク加水分解物は、ミート又は血液タンパクから得られたものであってもよく、また、酸加水分解物におけるものに比し少なくとも2.5倍高いモル分率の遊離アミノ酸がLeu、Ile、Phe、Lys、His、Pro又はGlyであってもよい。発酵ミート製品について、タンパク加水分解物は、他の化合物、例えば塩及びデキストロースなどと共に、又は微生物スタータ培地と共に導入してもよい。保存ミート製品について、タンパク加水分解物を使用し、これを適切な量のグルコース、塩及び亜硝酸塩と共に溶解することにより、"醸造物"を製造することができる。酸と芳香形成微生物、例えばラクトバチラス及びスタフィロコッカスカルノーサスとの適切な混合物の接種により、10〜22℃の温度での接種の数日後に芳香醸造物が生じる。酸性pH値を中和するためのジホスフェートの添加の際、醸造物をミート、例えばハムに注入してもよい。ミートの調理、好ましくは芳香をその中に保持するためのバッグにおけるものにより、最終的に、安全で食味の良い製品が得られる。アミノ酸が濃縮されたタンパク加水分解物からの揮発性フレーバー化合物の形成を刺激するために、適切な微生物スタータ株が不可欠である。本発明のタンパク加水分解物は、また、亜硝酸塩と組み合わせて使用して、乾燥保存ハムを製造することが可能である。
【００３５】
本発明のタンパク加水分解物は、反応フレーバーの製造において使用することができる。タンパク加水分解物及び糖を含有する組成物を、その後、反応させて、反応フレーバー組成物を得る。糖は、例えば、アルドース及びケトース並びに二糖、例えばキシロース、キシルロース、グルコース、フルクトース、マルトース、スクロース又はそれらの混合物から選択することができる。
タンパク加水分解物及び少なくとも1種の還元糖を加熱して、メイラード反応として知られる一連の反応を開始させる。アミノ基(特に遊離アミノ酸のもの)は、最初の工程として還元化合物と反応する。他の反応経路の全体的な系が続き、最終的に、(複雑な)反応フレーバー組成物が得られる。本発明のタンパク加水分解物の使用により、新たなタイプのフレーバーを得ることができる。これらの(反応)フレーバーを食品に添加して、食品の風味を改善することができる。反応フレーバーを製造するために、アミノ酸が濃縮されたタンパク加水分解物及び所望の糖を、水中に適切な比で溶解し、次いで、加熱する。全ての水を蒸発した後、加熱工程は、直ちに停止するか又は継続して120℃付近又は180℃程度まで加熱する。後者のインキュベーション条件により、非常に異なるフレーバー及び芳香性質が得られる。最終的に、乾燥した反応製品をパウダーとして回収し、フレーバー成分として使用することができる。
【００３６】
あるいはまた、タンパク加水分解物及び糖の反応は、水及び例えば油又は脂肪を含有するか又は全体的に水を含まない混合物中において行うことができるが、これは、例えば、糖及び加水分解物を、本質的に水を含まない系、例えばポリアルコール中に溶解することによる。この最後の方法の利点は、100℃を超える温度でさえ、反応が液体中において進行すること、及び、最終製品が、フレーバー成分の投与が促進される液体形態にあることである。
【００３７】
材料及び方法
単離された大豆タンパクを、ルーカスマイアー(ドイツのハンブルグ)製のソイアミン90 HVとして得た。
コーングルテン(トウモロコシグルテン)を、セレスター(ドイツのクレーフェルト)製のマイシン13875として得た。
ホエータンパクを、ハヴェノホーグウェト(オランダのGorinchem)製のWPC 80又はWPC 75のいずれかとして得た。
ヘモグロビンを、ハリメクス(オランダのLoenen)製のHGP po-feed(約90％タンパク)として得た。
ウシ血清アルブミンを、シグマ-アルドリッチ製の純度98%のフラクションVパウダーとして得た。
【００３８】
K.ラクチス(ATCC 8585)は、ATCC: American Type of Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USAから得て；バイテックLS-25プラススタータ培地は、ラクトバチラス及びスタフィロコッカスカルノーサスの混合物を含み、かつ、Gewurzmuller (オランダのDoetinchem)から商業的に入手可能である。パンの焼成実験において使用した酵母は、DSM Gist (オランダのデルフト)製の新鮮なブロック酵母菌として得た。チーズスタータ培地DS 5 LT1を、また、DSM Gistから得た。
酵素を、購入し、それ自体を使用し、又は更なる精製工程を行うか行わずに実験サンプルとした。アエロモナスアミノペプチダーゼ及びサーモリシンをシグマから購入した。購入したアエロモナスアミノペプチダーゼは、タンパク1mgあたりで50〜150(シグマ)ユニットの活性を有していた。貯蔵液として、630シグマユニット/mlの活性に相当する、水1mlあたりで15.3mgの固体を含む(として得られる)ものを製造した。購入したサーモリシンは、タンパク1mgあたりで50〜100(シグマ)ユニットの活性を有していた。貯蔵液として、2200シグマユニット/mlの活性に相当する、水1mlあたりで50mgの固体を含む(として得られる)ものを製造した。トリプシン(200 FIP-U/g)を、メルク(ドイツのダルムシュタッド)から購入し、乾燥パウダーとして用いた。
【００３９】
サーモアーゼ(Thermoase) C160(サーモリシン)(lot nr. P9EB761) 1,650,000 PU (プロテアーゼユニット)/gを、大和化成KK(日本の大阪)から得た。
350,000 LAPユニット/gの活性を有するコロラーゼ(Corolase)LAP(アスペルギルス由来のロイシルアミノペプチダーゼ)(batch 1999-07-20)を、ロームエンジーム(ドイツのダルムシュタッド)として得た。
約5000NF/mgの活性を有するコルプリン(Collupuline)液(パパイン)を、DSM Gist(フランスのSeclin)から得た。
B.インターメディウス由来のグルタミルエンドペプチダーゼを、Shevelev, A. B.らのPlasmid (2000), 43(3), 190-199に記載されたように、B.サブチリス培地から単離した。記載の条件下で、Z-Glu-pNAに対する精製酵素の活性は、ミリグラムあたりで約1ユニットであった。
【００４０】
カルボキシペプチダーゼCPD-II(PepF)を、pepF遺伝子の複数のコピーを含む過剰産生A.ニガー(niger)株の培地ろ過により得た。発表されたpepF配列情報(バン デン ホンバーグらの(1994) Gene 151, 73-79)を用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを設計したが、これは、当該技術分野における当業者に知られているPCR反応を用いて、A.ニガーのグルコアミラーゼ(glaA)プロモーターと5'-非コード配列を、ATG開始コドンからTAA終止コドンまでのpepF構造遺伝子に直接融合させたものである。構造遺伝子のグルコアミラーゼプロモーターへの融合についての類似する例が報告されている(EP-A-0 420 358、EP-A-0 463 706及びWO 99/38956)。最初に、pepF構造遺伝子を、A.ニガーのGAM4(CBS513.88)染色体DNAからPCR増幅し、精製した。第2に、glaA遺伝子のプロモーター領域を、3'-末端に、pepF構造遺伝子の5'-末端をオーバーラップするプライマーを用いてPCR増幅した。第3に、2つのPCRフラグメントを、融合PCRを介してglaAプロモーターのオリゴヌクレオチドプライマー5'、及び逆方向にpepFの停止コドンをオーバーラップするオリゴヌクレオチロプライマーに融合させた。第4に、得られた融合フラグメントを、A.ニガー発現ベクターpGBTOP8(WO 99/38956)中においてクローニングし、glaAプロモーター、PepF構造遺伝子及びglaAターミネーターを含む融合プラスミドを得た。本質的に、WO 99/38956に記載されたように、このプラスミドをNot Iで消化し、Xho Iで消化したpGBBAAS-1を用いて同時軽質転換を、A.ニガーのGAM4(CBS513.88)に対して行った。アセトアミドプレートでの成長のために選択される形質転換体を、コロニーPCRにより分析して、既知の技術を用いて、pepF発現カセットの存在を調べた。A.ニガーのPepF形質転換体を、先に記載したような方法(WO 99/38956)を用いて、振とうフラスコ中において培養した。34℃で6日間成長させた後、培養物を限外ろ過して、菌糸体を除去した。CPD II酵素を、ダル デガンらにより記載された方法(Appl. Environ. Mcrobiol. 58 (7) pp21144-2152 (1992))の単純化バージョンを用いて精製した。適切な量の緩衝液Aでの希釈後、限外ろ過を、Akta系におけるQセファロースFFカラムにおいて行った。緩衝液Aは、50mMリン酸緩衝液pH6.0とし、かつ、緩衝液Bは、1M NaClを含む50mMリン酸緩衝液pH6.0とした。溶出を、10%緩衝液B(緩衝液A中)から50%緩衝液B(緩衝液A中)への勾配で行った。活性フラクションを、pH4.1で合成ペプチドFA-Ala-Lys-OH (Bachem)に対する酵素活性のベースとしてプールした。最終的な、実質的に精製された酵素の活性は、1176 U/mlであり、50mM酢酸ナトリウム/1mM EDTA (pH4.1)中の5mM FA-Ala-Lys-OHにおいてアッセイした。加水分解の速度は、331nmで、数分間、25℃とした。1ユニットを、1分あたりに分解された基質1マイクロモルとして定義した。
【００４１】
カルボキシペプチダーゼCPD-1(PepG)の単離を、A.ニガーの培養ブロスから、また、CABS-セファロース工程を省略したことを除いてはF.ダル デガンら(Appl. Environ. Microbiol., 58(7), pp. 2144-2152 (1992))に従って行った。最終的な、実質的に精製された酵素の活性が、与えられているようなこの酵素についての活性測定プロトコールを用いて、25℃でpH4.5でFA-Phe-Ala-OHおいて150ユニット/mlであることを確認した。
バチラス ステアロサーモフィラス(株NCIMB 8924)からのアミノペプチダーゼIIを、ストールら(BBA 438 (1976) 212-220)に記載の手順に従って単離した。酵素の純度は、天然及び変性(SDS)状態下でのゲル電気泳動により試験した。単離した酵素の同定は、酵素のアミノ末端の9つのアミノ酸のエドマン分解により行った。酵素を、CoCl2の添加により活性化した。ローリー試薬を用いて、最終酵素溶液のタンパク濃度が、1mlあたりで7.2mgタンパクであると評価した。ロイシン-p-ニトロアニリドを基質として用いて、この溶液のエキソペプチダーゼ活性を、1mlあたりで420ユニットとして評価した。活性試験を、pH7.2、基質1リットルあたり3ミリモルで、15分間、25℃で行い、かつ、吸収を、ブランクに対して400ナノメーターで測定した。
【００４２】
加水分解物中における遊離アミノ酸のモル濃度の測定
種々のタンパク基質に対する酵素インキュベーションを、実施例に記載のpH及び温度条件下で撹拌しながら行った。インキュベーションの停止は、示した時間インターバル後に、最大許容速度で、15分間、エッペンドルフ遠心機において又はHereaus Megafuge 3.0Rにおいて遠心分離して、非溶解タンパク基質を除去することにより行った。次いで、上澄のpHを調整し、95℃で加熱して、残留タンパク分解活性を失活させた。形成された更なる沈澱物を、別の遠心分離により除去した。除去後、上澄をアミノ酸分析を行うまで凍結保存した。あるいはまた、上澄を凍結乾燥して、実験における更なる試験を可能にした。
アミノ酸分析を、ウォーターズのアミノ酸分析系(米国のミルフォードMA)の操作マニュアルに記載されたようなピコタグ(PicoTag)法に従って上澄について行った。アミノ酸分析は、サンプル材料を解凍直後に行った。その終了までに、適切なサンプルを溶融液から得て、希酸へ添加し、かつ、均質化した。後者の溶液から、新たなサンプルを採取し、乾燥し、フェニルイソチオシアネートを用いて誘導した。存在する種々の誘導アミノ酸をHPLC法を用いて定量化した。
【００４３】
遊離アミノ酸に完全に加水分解した加水分解物中における遊離アミノ酸のモル濃度の測定
遊離アミノ酸を得るためのタンパク加水分解物の酸加水分解は、ウォーターズに従って6N HClでの気相加水分解により行った。要約すれば、この手段は次のとおりである。酵素加水分解後に得られた透明タンパク含有上清のサンプルを、希HCl溶液中において均質化した。得られた溶液を、次いで、ウォーターズによる気相加水分解に付した。この酸加水分解後、アミノ酸を、ピコタグ法(上記参照)に従って誘導及び分析した。
酸加水分解の間にTrp及びCysが分解するので、これらのアミノ酸は、記載のデータ中には含まれない。しかしながら、Gln及びAsn残留物は酸加水分解の間にGlu及びAspへ転化されるので、通常は、GluとGlnとの値、及びAspとAsnとの値を一緒に合わせて、酸加水分解前に得られるデータとの比較を可能にした。唯一、実施例８においては、以下の異なる手段である。
【００４４】
【実施例】
実施例１
アミノ酸、ロイシン及びバリンを、パンの皮様香気を発するメイラード生成物と関連付けた。パンの焼成の間にそのような香気が生じるのを促進するためには、これらの2種のアミノ酸が比較的濃縮された天然タンパク加水分解物を生じさせるのが有利であった。選択的アミノ酸濃縮を達成するために、ロイシン及びバリンが比較的濃縮されたタンパク基質を、選択的エンドプロテアーゼ及び選択的エキソプロテアーゼと組み合わせた。微生物起源の酵素サーモリシンは、バルキーな疎水性アミノ酸、Ile、Leu、Val及びPheのアミノ末端鎖でペプチド結合を開裂することが知られている。
種々の選択的アミノペプチダーゼが科学文献において知られているが、それらの大抵のものは、哺乳類組織から単離され、又は膜結合することが知られている。後者の2つの特徴から、これらの酵素は、食品用及び低コスト用途のための魅力に欠けたものとなる。例外的なものは、アエロモナスプロテオリティカ由来の細菌性アミノペプチダーゼ(EC 3.4.11.10)である。この酵素は、微生物起源のものであり、特に溶解性であり、また、疎水性アミノ酸に対する明らかな優先性を示し、かつ、アスパラギン酸、グルタミン酸及びシステイン酸のみが除去に対して特に抵抗性である(prescott, J. M. and Wilkes, S. H., Methods in Enzymol: 45, 530 (1976))。
【００４５】
望ましくないアミノ酸を付随的に放出することなしに可能な限り多くのロイシンを放出するためには、酵素加水分解に使用するタンパク基質を慎重に選択すべきことが明らかである。多くの商業的に入手可能なタンパク基質のうち、ホエータンパク単離物、ヘモグロビン及びトウモロコシタンパク単離物のみが、ロイシン及びバリンを比較的濃縮して含む。本実施例では、ホエータンパク単離物(WPC 80)を使用した。
タンパク基質、サーモリシン及びアエロモナスプロテオリティカアミノペプチダーゼを、全て同時に、以下に記載の条件下でインキュベートした。インキュベーション５時間後、液体を、材料及び方法の項に記載したように処理した。沈澱した又は溶解しなかった材料を、エッペンドルフ遠心機において最大速度で15分間の遠心分離により除去した。上清を除去し、-20℃で凍結保存した。
上清のサンプルを、解凍直後に、ウォーターズ(米国のミルフォードMA)のピコタグ法に従ってアミノ酸含量について分析した。
表1に、6N HCl加水分解後に存在するアミノ酸の分布を、酵素を用いたインキュベーション後にみられるアミノ酸の分布との比較で記載する。全ての関連アミノ酸について、濃縮係数、モル分率及びAAQ値を、記載の定義に従って計算した。モル分率及び濃縮係数は、全てのアミノ酸について記載する(それぞれ、T+Ae及びT+Ae/6N HClとして記載する表1参照)。Trp及びCys値は省略し、Glu及びGln、Asp及びAsn値は、合わせて表１において１つの値とした。
【００４６】
表１：基質ホエータンパク単離物

【００４７】
注：
T+Ae=サーモリシン+アエロモナスプロテオリティカアミノペプチダーゼでの処理後のアミノ酸のモル分率；他に記載のない限り、全ての更なる実施例において、酵素の添加量は、材料及び方法の項に記載したような酵素製造物でのものを意味する。
6N HCl=酵素インキュベーション後の加水分解ホエータンパクを6N HCl加水分解(ウォーターズ)した後に得られるアミノ酸のモル分率。
T+Ae/6N HCl=T+Ae-インキュベーション後のAAのモル分率／6N HCl加水分解後のAAのモル分率。
この欄(T+Ae/6N HCl)は、遊離アミノ酸の濃縮係数を示す。
条件：10％(w/w)WPC 80を含有する、100ミリモル/リットルのリン酸緩衝液2マイクロリットルに、20マイクロリットルのサーモリシン(シグマ)及び33マイクロリットルのアエロモナスプロテオリティカアミノペプチダーゼを添加した。インキュベーションを5時間、40℃、pH8.0で行った。
使用した２種の酵素の選択性が制限されているにもかかわらず、それらとホエータンパク単離物との組み合わせにより、印象的な結果が得られた：ロイシン、イソロイシン及びバリンは一緒に全ての遊離アミノ酸の50％を大きく超える(ホエーの酸加水分解を利用して得ることができるものより少なくとも３倍高い)。それにもかかわらず、イソロイシン及びバリンのモル分率(共に21.5％)は本実験において低過ぎ、加水分解物中において全体としてロイシンのみ(モル分率33.3%)が適合(comply)する。このインキュベーションにおけるAAQレベルは、約15%であった。
【００４８】
実施例２
実施例１においては、ホエータンパク単離物を、サーモリシン及びアエロモナスプロテオリティカから得られる選択的アミノペプチダーゼを用いてインキュベートしたが、この目的は、このケースにおいてロイシンとなる特定のアミノ酸の関連期間における収率を最大化することであった。満足の行く結果が得られたが、その結果が、使用したエンドプロテアーゼの選択性によるのか又はエキソプロテアーゼの選択性によるのかが依然として不明であった。
本実施例においては、インキュベーションを、サーモリシンと、アエロモナス由来の選択的アミノペプチダーゼ又はバチラス ステアロサーモフィラス由来の広範スペクトルアミノペプチダーゼAPIIのいずれかとを用いて行った。広範スペクトル好熱性アミノペプチダーゼAPIIは、先の材料及び方法の項に記載したバチラス ステアロサーモフィラス株NCIMB8924から単離した。
酵素インキュベーションを表２の下に記載した条件下で行い、その後、反応を停止し、実施例１に記載したように処理した。比較的短いインキュベーション時間を選択して、可能な限り、アエロモナスアミノペプチダーゼに対するアミノペプチダーゼAPIIの不特異的開裂パターンを最小化した。
【００４９】
表２：基質ホエータンパク単離物

【００５０】
注：
T+Ae=サーモリシン+アエロモナスプロテオリティカアミノペプチダーゼ
T+AP=サーモリシン+B.ステアロサーモフィラスAPII
6N HCl=酵素インキュベーション後に6N HCl加水分解(ウォーターズ)したホエータンパク
条件：T+AP：1ミリモル/リットルのCoCl2及び10％(w/w)WPC 80を含有する、100ミリモル/リットルのリン酸緩衝液1850マイクロリットルに、10マイクロリットルのサーモリシン(シグマ)及び140マイクロリットルのB. サーモフィラスAPIIを添加した。インキュベーションを、1時間、60℃、pH8.0で行った。
T+Ae：実施例１と同様であるが、インキュベーション時間は1時間のみとした。
サーモリシン及びアエロモナスアミノペプチダーゼの組み合わせ作用により、利用可能な遊離アミノ酸モル分率36%を示すロイシン(酸加水分解により得られるものより少なくとも3倍高いものであった)、3.3の濃縮係数が生じた。両インキュベーションは、約12％のAAQ値を示した。
サーモリシン及びAPIIでのインキュベーションにおいて、ロイシンは、22%を示し、酸加水分解により得られるものに比しちょうど約2倍高く、少なくとも25%のモル分率の要件を満たしていない。サーモリシン及びアエロモナスアミノペプチダーゼは、従って、ホエータンパクからのロイシンの放出の好ましい組み合わせを示す。
【００５１】
実施例3
実施例1及び2においては、ホエータンパク単離物の選択的分解を、種々の酵素でのインキュベーション後に存在する遊離アミノ酸含量を分析することにより証明した。実施例２においては、サーモリシンとアエロモナスアミノペプチダーゼの組み合わせにより、酸加水分解物の場合に比し、ロイシンが有意に濃縮された(3.3倍の)加水分解物が生じることが示された。サーモリシンをB. ステアロサーモフィラスAPII酵素と組み合わせることにより、酸加水分解物の場合に比し、ロイシン含量が濃縮された、即ち2.1の係数の加水分解物が生じた。
そのような相違が、メイラード反応における注目すべき香り作用をもたらし得るか否かを確認するために、多くの実験を行った。最初の実験では、0.13gの純粋なロイシンを、グルコース(0.19g)、フルクトース(0.19g)、マルトース(0.39g)又はスクロース(0.39g)と、水中において、撹拌下に、135℃の温度で反応させた。本実験の目的は、いずれの糖が、存在する過剰なロイシンとの組み合わせで香りを放出するのに最も効果的であるかを見い出すことであった。加熱約90分後、存在する全ての水を蒸発した。加熱約60分後(幾らかの水が散逸)、グルコース及びフルクトースを含むバイアルに、甘いパンの皮のような香りが生じ始めたが、マルトース及びスクロースを含有するバイアルには、カカオの印象しかなかった。135℃で100分間の加熱後、グルコース及びフルクトースにより弱い香りが生じたが、マルトース及びスクロースでは、より強い甘いパンの皮のような香りが生じた。
【００５２】
フルクトースを用いるインキュベーションにより、最も強いパンの皮のような香りが生じたので、この糖を、実施例２に記載の加水分解物でのメイラード反応を行うために選択した。
各インキュベーションにおいて存在する全遊離アミノ酸についてのデータを用いて、3つの反応バイアルを、遊離アミノ酸が同量含まれるように製造した(2ミリリットル中に約40マイクロモル)。必要であれば、幾らかの水を添加して、3つのバイアルのそれぞれの量を同一とした。最終的に、少々過剰モルのフルクトースを(55マイクロモル)、各バイアルに添加し、かつ、反応の開始を、バイアルを127℃に加熱することにより行った。
全ての水の消費後、経験を積んだパネラーに、各バイアルから放たれる香りについてのコメントをもらった。彼らのコメントを表3に要約する。
使用した基質では、重要な乳特性が初期の香り性質の特徴であるとされる。香りの放出における有意な差は、サーモリシンとAPIIで処理したサンプル対サーモリシンとアエロモナスアミノペプチダーゼで処理したサンプルに起因し得る。サーモリシンとAPIIでの消化において得られるようなほんの2.1の特定のアミノ酸の濃縮係数は、メイラード反応において香りを十分に誘導するのに不適切であるのが明らかである。
【００５３】
表３

【００５４】
注：
T+Ae=サーモリシン+アエロモナスプロテオリティカアミノペプチダーゼで製造したホエータンパク加水分解物
T+APII=サーモリシン+バチラス ステアロサーモフィラスAPIIで製造したホエータンパク加水分解物
【００５５】
実施例４
実施例３においては、本発明のタンパク加水分解物が、メイラード実験において特定の芳香を生じ得ることを証明した。本実施例での目的は、本発明のタンパク加水分解物を使用して、微生物でのインキュベーションにおいて特定の芳香形成を刺激することが可能であることを証明することである。
商業的なヘモグロビンパウダー(オランダのハリメクス製HGP Po-Feed)を出発物質として、5%(w/w)サスペンションを蒸留水中において製造し、その後、pHを、4N HClを用いて7.0に調整した。
【００５６】
このサスペンションの一部500mlを、工業的サーモリシン(日本の大和化成製サーモアーゼ C160)でインキュベートし、また、別の500mlを、前記サーモリシンと工業的ロイシン特異性のアスペルギルス由来のアミノペプチダーゼ(ロームエンジーム(ドイツ)からのコロラーゼLAP)を用いてインキュベートした。サスペンション500mlあたり、2.5gのサーモアーゼパウダーを添加し、コロラーゼLAP液体は0.2mlとした。双方の酵素インキュベーションを50℃で4時間行い、次いで、反応の停止を、4N HClを用いて液体をpH3.0に酸性化することにより行った。即座に、2つの酸性化サスペンションを遠心分離(Heraeus Megafuge 3.0Rにおいて3500rpmで30分)して、ヘムをヘモグロビンから沈澱させ、２つの上清を収集し、95℃で30分間の加熱処理に付した。サーモアーゼ及びコロラーゼLAPでのインキュベーションにより誘導された上清のうち、少量のサンプルをアミノ酸分析のために用いた。その後、双方の上清を凍結乾燥した。サーモアーゼのみを用いてインキュベートしたサスペンションは20gの乾燥パウダーを生じ、また、2つの酵素を用いてインキュベートしたサスペンションは18gの乾燥パウダーを生じた。
【００５７】
エンド-(即ちサーモアーゼ)及びエキソプロテアーゼ(即ちコロラーゼLAP)の双方を用いてインキュベートすることにより製造したヘモグロビン加水分解物中に存在する遊離アミノ酸の分析により、非常に濃縮されたロイシン、イソロイシン及びメチオニンが示された(表4)。しかしながら、イソロイシン及びメチオニンの双方のモル分率の値は、必要とされる25%より低く、従って、ロイシンのみが適合する。材料及び方法の項に要約した手段に従って測定した調製物のアミノ酸指数は15%であり、ロイシンのモル分率は37%であった。サーモアーゼのみを用いてヘモグロビンをインキュベートすることによるアミノ酸の遊離は非常に限られたものであり、従って、これらのデータは表において省略してある。
【００５８】
表４：基質ヘモグロビン

【００５９】
注：
T+C=サーモアーゼ+コロラーゼLAP
6N HCl=酵素インキュベーション後に6N HCl加水分解したヘモグロビン
条件：500ml水pH7中の、2.5gのサーモアーゼパウダー及び200マイクロリットルのコロラーゼLAPを用いて50℃で4時間インキュベートされたヘモグロビン5%(w/w)。
【００６０】
本発明に従って特定のアミノ酸が濃縮されたタンパク加水分解物が、異なる発酵工程において特定の芳香を生じ得ることを証明するために、多くの実験を行った。
第１の実験では、酵母菌クライベロミセス ラチスを、サーモアーゼ又はサーモアーゼ/コロラーゼLAP-加水分解ヘモグロビンのいずれかを補充した最小培地中において成長させ、その後、2つの発酵ブロスの芳香について、経験を積んだパネラーに比較してもらった。40gのNaCl/リットル、14.2gのNa₂HPO₄及び0.34gのKNO₃/リットルを含む最小培地を、最終pH5.5に調整し、かつ、サーモアーゼ-加水分解ヘモグロビンパウダー又はサーモアーゼ/コロラーゼLAP-加水分解ヘモグロビンパウダーのいずれかを0.5g/リットル補充した。2つの培地を、デュプロ(duplo)でボトルに詰め(100mlボトル中50ml)、120℃で20分間滅菌した。温度が30℃に達した後、ボトルに、K.ラチス(ATCC 8585)を十分に成長させた1%前培地を接種し、それを遠心分離し、同一量の生理的食塩水中に再懸濁して、前培地で使用したYEPD培地中に存在する遊離アミノ酸の大部分を除去した。その後、ボトルを閉じ、20℃で7日間撹拌なしにインキュベートした。ボトルを再び開口した際、2つの培地上の空気の香りをパネラー数人に嗅いでもらった。彼らの所見を表5に記載した。
【００６１】
第2の実験においては、種々のラクトバチラス及びスタフィロコッカス カルノーサスを含有する商業的なミートスタータ培地(meat starter culture)を、最小培地中において、サーモアーゼ-又はサーモアーゼ/コロラーゼLAP-加水分解ヘモグロビンパウダーのいずれかを補充した、デキストロース及び亜硝酸塩の存在下で成長させた。インキュベーション後、2つの発酵ボトルの香りを、経験を積んだパネラーに比較してもらった。本実験においては、培地には、6gのデキストロース/リットル、20gのクロロゾ塩/リットル(クロロゾ塩は、フェルステーヘン(オランダのロッテルダム)により供給される商業的製品であり、NaCl中に0.6%亜硝酸塩を含む)、及びサーモアーゼ-又はサーモアーゼ/コロラーゼLAP加水分解ヘモグロビンパウダーのいずれかを1g/リットル含ませた。2つの培地のpH値を5.5に調整し、かつ、培地1リットルあたり0.3gのバイテックLS-25プラススタータ培地で接種し、即ち、培地の前滅菌なしとした。発酵を密閉ボトル中(100mlボトル中に50ml)において、22℃で30時間、次いで、15℃で2日間、及び次いで6℃で3日間行った。この期間、双方の発酵物のpHを約4.0に低減させた。
発酵物の香りは、前述のように、ボトルの開口直後に試験した。パネラーの所見を表5に記載する。
【００６２】
表５：異なるヘモグロビン加水分解物が補充され、かつ、異なる微生物スタータ培地が接種された最少培地の香りの印象

【００６３】
第3の実験では、本発明のロイシンが濃縮されたヘモグロビン調製物を、工業的に製造された乾燥発酵ソーセージ(セルベラートタイプ)において試験した。
このため、サーモアーゼのみ又はサーモアーゼ+コロラーゼLAPを含み、かつ、表4に記載した規定に合う、大部分のヘモグロビン加水分解物を製造した。凍結乾燥後、各パウダー75gを、ミート、コラーゲン、脂肪、調理済外皮、デキストロース、アスコルビン酸ナトリウムの混合物8kg(2つ)に添加し、十分に混合した。塩(0.6%亜硝酸塩)及びコショウ以外に、後に加水分解物を添加することによりもたらされる芳香の相違の確認を図るために、他の種は導入しなかった。ミートドウの第3部分に対しては、加水分解物を添加しなかった。加水分解物の添加前に、ミートドウは、約17%のミートタンパクを含んでいた。バイテックLS-25プラスを、3つの全ての製造物中においてスタータ培地として使用した。
18℃で21日間及び49日間のインキュベートをして少なくとも20%の水を除いた後、ソーセージをスライスし、経験を積んだパネラーにより評価してもらった。高レベルで遊離ロイシンを含むヘモグロビン加水分解物を含有するドウから製造したソーセージは、加水分解物を添加していないバターから製造したソーセージに比し、より強いブロス様風味を有するとみなされた。サーモアーゼのみを接種した加水分解物を含有するソーセージの風味は、遊離ロイシンが高レベルで濃縮されたドウに比し弱いが、参照材料に比し強い、中間的なものであった。
【００６４】
実施例5
本発明の加水分解物は、単独の使用で、ソーセージに対してより高いブロス様芳香性質を与えることができないが、より強いパンの香りを有するパンを焼成するためには有用である。
ホエータンパク及びヘモグロビンと同様に、トウモロコシタンパクは、ロイシンが非常に濃縮されているが、これらの代替品に比しパンへの導入に適しており、これは、その特徴的な穀物の香りに由来する。実施例4で使用したサーモアーゼ及びコロラーゼLAPの同一の組み合わせを用いて、トウモロコシタンパク(セレスター(ドイツのクレーフェルト)からのマイシン13875)を表6の説明書きに特定した条件下で消化した。インキュベーション後、酵素の不活性化を、4N HClを用いてそのpHを5.0に低減することにより行い、次いで、95℃で45分間加熱した。アミノ酸分析のサンプルを採取し、その後、材料の残りを凍結乾燥した。
【００６５】
酵素加水分解物及び6N HCl加水分解物のアミノ酸分析により、遊離ロイシンが大量に生成され、そのAAQが32%で、その濃縮係数が5.8であり、そのモル分率が41.8%であることが示された。ロイシン以外に、他のアミノ酸のいずれも要件を満たしていなかった。
ドウへの添加前に、1.11、5.56及び11.13gの凍結乾燥加水分解物を20mlの水中に溶解した。20mlの水の一部に加水分解物を含ませた。次いで、これらの20ml水部分のそれぞれを、以下のものを含むパンのドウと混合した：2000gの小麦粉、40gの塩、44gの新鮮な酵母菌、並びに、80mgのアスコルビン酸、50mgのフェルミジームP200及び120mgのフェルミジームHS2000(いずれもDSMベーカリーイングレディエンツ(オランダのデルフト)を含有する別の水1150ml。
30℃で35分間の前発酵後、ドウを更に34℃で75分間発酵させた。焼成を280℃で10分間行い、次いで、更に、225℃で20分間行った。翌日、パンをスライスし、経験をつんだパネラーにより評価してもらった。
最も低い加水分解物用量(ドウ3100gあたり1.11g)では、パンの香りに目立った影響はみられなかった。しかしながら、最も高い添加レベル(ドウ3100gあたり11.13g)では、強い小麦粉の香りが生じ、それは、加水分解物を添加しなかったパンと明らかに区別可能であった。不本意なことに、この高い添加レベルは、全体的ローフ量(loaf volume)に対しては負の影響を有していた。5.56gの加水分解物の添加により、強い芳香効果は下がったが、ローフ量に対して悪影響を及ぼさなかった。
【００６６】
表６：基質コーンタンパク

【００６７】
注：
T+C=サーモアーゼ+コロラーゼLAP
6N HCl=酵素インキュベーション後に6N HCl加水分解したトウモロコシタンパク
条件：6%(w/w)マイシンを含有する水500mlに対して、2.5gのサーモアーゼと0.2mlのコロラーゼLAPを添加した。インキュベーションを、初期pH7、50℃で4時間行った。
【００６８】
実施例６
本実施例では、この特定の基質についての酵素の新たな組み合わせを用いてホエータンパク単離物(WPC 75)からのリシン又はロイシンの選択的な濃縮さを説明する。形成される2つの加水分解物を使用して、チーズの官能特性に影響を与えた。
種々の芳香発生工程におけるロイシンの役割を、ここで適切に説明する。リシンを用いて、メイラード反応においてポテト様風味を生じさせることが知られている。更にリシンは、チーズ及び"サーリー(sur lie)"ワインなどの発酵製品の風味の発達と関連付けされている。
ホエータンパク単離物は、リシン及びロイシンが非常に濃縮されているが、アルギニン含量が比較的低い。ロイシンを選択的に放出するために、サーモアーゼ及びコロラーゼLAPの酵素の組み合わせを再び使用した(表7参照)。リシンを選択的に遊離するために、ホエータンパクを、最初に、インキュベートしたが、これは、すい臓トリプシン(メルク製)を用いて行って、アルギニン又はリシンのカルボキシル側での開裂を生じさせ、次いで、低pHで、A.ニガーのカルボキシペプチダーゼCPD IIを用いて行った。CPD IIは、塩基性アミノ酸、例えばArg及びLysを放出することについて強い優先性を示した。後者のインキュベーションの詳細を表8に記載する。
酵素インキュベーション及びその後の処理は、材料及び方法の項に記載した。サーモアーゼ及びコロラーゼLAPの組み合わせにより得られたデータから、ロイシンのみが、基準を満たし、3.1の濃縮係数、19.1%のAAQ値及び34.1%のモル分率値を有することが明らかである(表7)。トリプシン及びCPD IIを用いるインキュベーションにおいて、リシン及びアルギニンの双方が、最終加水分解物中において非常に過度に示されたが、リシンのみが基準を満たし、17.3の濃縮係数、10.4%のAAQ値、及び44%のモル分率値を有していた(表8)。
【００６９】
表７：基質ホエータンパク

【００７０】
注：
T+C=サーモアーゼ+コロラーゼLAP
6N HCl=酵素インキュベーション後に6N HCl加水分解したホエータンパク
条件：WPC 75を500mlの水中に溶解して、濃度を6%とし、その後、0.1gのサーモアーゼと0.20mlのコロラーゼLAPを添加した。インキュベーションは、pHを7に調節しながら50℃で4時間行った。
【００７１】
表８：基質ホエータンパク

【００７２】
注：
Tr+F=トリプシン+CPD II
6N HCl=酵素インキュベーション後に6N HCl加水分解したホエータンパク
条件：WPC 75を100mlの水に溶解して、濃度を6%(w/w)とした。次いで、0.1gのトリプシンパウダー(メルク)を添加し、かつ、初期pH7、60℃で2時間インキュベートした。4N HClを用いてpHを5に低減した後、0.2mlの精製CPD IIを添加し、かつ、消化をpH5、40℃で更に3時間継続した。
【００７３】
加水分解物中に残存する微量の活性プロテアーゼにより、チーズに深刻な苦味が生じ得るため、両加水分解物を、チーズへの添加前に、pH5、95℃で45分間の加熱処理に付した。
チーズの官能特性に対する両加水分解物の影響を試験するため、オランダのNIZOにより開発されたCh-イージーモデルを採用した(G.スミットらのVoedingsmiddelentechnologie 8(1995) 19-21)。低温殺菌したCh-イージーベースを30℃に冷却し、その後、レギュラースタータ培地(このケースにおいては、DSM(オランダのデルフト)製のDS 5 LT1)を、依然として液状のCh-イージーベース200gあたり、凍結乾燥加水分解物のいずれか１つ500mgと共に添加した。参照材料には、加水分解物を添加しなかった。ガラス棒での撹拌後、液状ペーストを無菌的に小カップへ移し、その中において材料を固定した。Ch-イージーの熟成を18℃で2週間行い、その後、種々の製品について、経験を積んだ風味パネラーに評価してもらった。
添加なしの参照材料と比較して、ロイシンが濃縮された加水分解物を添加したCh-イージー材料は、とても強い香り及びフレーバー特性を示し、その特性は、古い及び成熟したチーズから予想できるであろう。リシンが濃縮された加水分解物を添加したCh-イージー材料は、より控えめな香り及び風味特性を生じ、パネラーは、このチーズを参照材料の場合と区別するのが困難であるとした。
添加を伴うチーズのテクスチャーは、添加なしのチーズのテクスチャーに類似することが証明された。
【００７４】
実施例7
実施例6においては、酵素を適切に組み合わせることにより、本発明の異なるタンパク加水分解物を、単一の動物タンパク源から製造することができることを証明した。驚くべきことに、同一の原材料から得られる加水分解物が、適切な微生物スタータ培地でのインキュベーションの際に異なる芳香特性をもたらし得る。
この実施例においては、本発明の方法の多用性の証明を、工業的に重要な植物性タンパクを異なる酵素に付することにより行う。再び、異なるアミノ酸が濃縮された、本発明の加水分解物を得ることができる。このケースにおいては、単一の遊離アミノ酸としてのアルギニン又は2種の異なる遊離アミノ酸としてのアルギニンとリシンのいずれかである。そのような異なる加水分解物がメイラード又は発酵工程において区別可能な芳香を生じる可能性は、先に十分に例示した。そのような芳香強化性とは別に、遊離アルギニンは、また、必須の食品栄養素であるとされており、ホルモン分泌、酸化窒素形成及びヒトの創傷治癒刺激と関連付けられている。更に、アルギニンが濃縮されたタンパク加水分解物は、パーソナルケア用途に有用な特性を有することが求められている。本発明の加水分解物は、また、それ自体で有用である。
本実験においては、大豆タンパク単離物(ソイアミン90 HV)を、最初に、植物性タンパク(パパイン又はコルプリン(Collupuline))及び微生物由来のカルボキシペプチダーゼ(CPD II)の組み合わせを用いてインキュベートして、遊離アルギニンが濃縮された、本発明の加水分解物を得た。表9に記載のデータから、このアミノ酸のみが全ての基準を満たし、濃縮係数4.2、及びモル分率及びAAQ値についてそれぞれ26.9%及び10.3%の値を有していた。
【００７５】
表９：基質大豆タンパク単離物

【００７６】
注：
Co+F=コルプリン+CPD II
6N HCl=酵素インキュベーション後の6N HCl加水分解した大豆タンパク加水分解物
条件：大豆タンパク単離物を200mlの水中に溶解し、濃度を6%(w/w)とし、その後、そのpHを7.2に調製し、1mlのコルプリンを添加した。インキュベーションを60℃で2時間行った。その後、pHを5に低減し、0.5mlのCPD IIを添加し、消化を、更に3時間、40℃、初期pH7.15で及び3時間、40℃、pH5で継続した。
第２インキュベーションにおいては、大豆タンパク単離物のインキュベーションを、動物源のプロテアーゼ(メルク製トリプシン)及び微生物CPD IIの組み合わせを用いて行った。この第2インキュベーションにおいては、アルギニン及びリシンの双方が全ての基準を満たし、濃縮係数がそれぞれ5.5及び3.9で、モル分率値がそれぞれ34.7及び26.2%であり、AAQ値が11.7%であった。第2インキュベーションの詳細を表10に記載する。
【００７７】
表10：基質大豆タンパク単離物

【００７８】
注：
Tr+F=トリプシン+CPD II
6N HCl=酵素インキュベーション後に6N HCl加水分解した大豆タンパク単離物
条件：大豆タンパク単離物を、200mlの水中に溶解し、濃度を6%(w/w)とした。pHを7.0に調整した後、0.2gのトリプシンパウダー(メルク)を添加し、60℃で2時間30分インキュベートした。その後、pHを5.0に低減し、0.5mlのCPD IIを添加し、40℃で更に3時間インキュベートした。
【００７９】
実施例8
多くの芳香形成工程における遊離グルタミン酸の本質的役割は文献に記載されており、MSG、グルタミン酸のナトリウム塩が、単一の最重要風味強化成分として認識されている。この点を鑑みると、本発明のタンパク加水分解物が、メイラード又は発酵工程のいずれかにおける有意な芳香利点との関連性で遊離グルタミン酸を濃縮して含む態様を含むことを明らかにするのが重要である。
本発明の加水分解物中においてグルタミン酸が濃縮されていることを証明する際の一般的な問題は、この濃縮係数の測定にある。濃縮係数を測定するには、遊離及び結合グルタミン酸のレベルについての定量データが必要とされる。不本意なことに、結合グルタミン酸については証明することができず、なぜなら、6N HClでの処理の間、結合グルタミンが脱アミノ化され、グルタミン酸に転化されるからである。後者の問題を解決するために、本実施例においては、グルタミン酸のグルタミン残基に対する比が正確に知られているタンパク基質の１つを用いた。入手可能なこの情報を利用して、6N HCl処理後の遊離グルタミン酸の濃度を、単純な掛け算により得た。
Glu対Gln比が91〜29のウシ血清アルブミン(シグマ)(Dairy Technology: Principles of Milk Properties and Processes; P. Walstra ed; Marcel Dekker, Inc.)を使用し、精製グルタミルエンドペプチダーゼと精製CPD Iとの混合物を用いて表11の下に記載の条件下で消化した。
データによれば、得られる加水分解物中におけるグルタミン酸の飽和率は、2.7であった。そのモル分率及びAAQの値は、それぞれ、26.3及び19.3であった。
【００８０】
表11：基質ウシ血清アルブミン

【００８１】
注：
EG+G=グルタミルエンドペプチダーゼ+CPD I
6N HCl=酵素インキュベーション後に6N HCl加水分解したウシ血清アルブミン
条件：ウシ血清アルブミンを2mlの水中に溶解し、濃度を5%(w/w)とし、その後、pHを8.0に調整し、1mgのグルタミルエンドプロテアーゼを添加し、50℃で3時間30分間インキュベートした。その後、pHを5.0に低減し、0.05mlのCPD Iを添加し、更に25分間50℃でインキュベートした。

Claims (23)

1. タンパク加水分解物であって、
   タンパク含有基質の酵素加水分解により得ることができ、
   遊離アミノ酸及びペプチドを含み、
   タンパク加水分解物中に存在する少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が、遊離アミノ酸へと完全に加水分解された同一タンパク含有基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも２．５倍高く、
   タンパク加水分解物における少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が少なくとも２５％であり、かつ、
   タンパク加水分解物におけるアミノ酸指数（ＡＡＱ）が少なくとも１０％である
   ことを特徴とするタンパク加水分解物。
2. ＡＡＱが、１５〜５０％である請求項１に記載のタンパク加水分解物。
3. タンパク含有基質の加水分解が、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼによる酵素加水分解である請求項１又は２に記載のタンパク加水分解物。
4. 少なくとも１種の遊離アミノ酸が、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ又はＴｈｒから選ばれる請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク加水分解物。
5. 濃縮液、ペースト、パウダー又は顆粒状形態にある請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク加水分解物。
6. タンパク含有基質が、ホエータンパク、ヘモグロビン、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ライス、グルテン又は大豆タンパクから選ばれる請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク加水分解物。
7. 食品組成物の風味を改良できる請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク加水分解物。
8. タンパク加水分解物を製造する方法であって、
   水性条件下、５〜７５℃及びｐＨ３〜９で、タンパク含有基質を、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼにより加水分解し、それによりエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼの組み合わせ作用で、タンパク含有基質から少なくとも１種の遊離アミノ酸を放出させる工程と、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼのインキュベーションを、タンパク加水分解物中に存在する少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が、遊離アミノ酸へと完全に加水分解された同一タンパク含有基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも２．５倍高いタンパク加水分解物を得るのに適する時間行う工程を含み、
   タンパク加水分解物における少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が少なくとも２５％であり、かつ、
   タンパク加水分解物におけるアミノ酸指数（ＡＡＱ）が少なくとも１０％であることを特徴とする方法。
9. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク加水分解物を含む食品組成物。
10. 発酵食品である請求項９に記載の食品組成物。
11. 反応フレーバーである請求項９に記載の食品組成物。
12. 以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかであることを特徴とするタンパク加水分解物であって、
    タンパク加水分解物中に存在する少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が、遊離アミノ酸へと完全に加水分解された同一タンパク含有基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも２．５倍高く、
    タンパク加水分解物におけるアミノ酸指数（ＡＡＱ）が少なくとも１０％であるタンパク加水分解物：
    （ａ）遊離ロイシンのモル分率が少なくとも２５％であるか又は遊離リシンのモル分率が少なくとも２５％であるホエータンパク加水分解物；
    （ｂ）遊離ロイシンのモル分率が少なくとも２５％であるトウモロコシタンパク加水分解物；
    （ｃ）遊離アルギニンのモル分率が少なくとも２５％であるか又は遊離リシンのモル分率が少なくとも２５％である大豆タンパク加水分解物；
    （ｄ）遊離Ｇｌｕのモル分率が少なくとも２５％であるＢＳＡタンパク加水分解物；又は
    （ｅ）遊離ロイシンのモル分率が少なくとも２５％であるヘモグロビン加水分解物。
13. 食品組成物を製造する際の、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク加水分解物の使用。
14. 発酵タンパク加水分解物を製造する方法であって、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク加水分解物を、食品用微生物を用いて発酵させることを含む方法。
15. タンパク加水分解物であって、
    タンパク含有基質の酵素加水分解により得ることができ、
    遊離アミノ酸及びペプチドを含み、
    タンパク加水分解物中に存在する少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が、遊離アミノ酸へと完全に加水分解された同一タンパク含有基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも３倍高く、
    タンパク加水分解物における少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が少なくとも２５％であり、かつ、
    タンパク加水分解物におけるアミノ酸指数（ＡＡＱ）が少なくとも１０％である
    ことを特徴とするタンパク加水分解物。
16. タンパク加水分解物であって、
    タンパク含有基質の酵素加水分解により得ることができ、
    遊離アミノ酸及びペプチドを含み、
    タンパク加水分解物中に存在する少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が、遊離アミノ酸へと完全に加水分解された同一タンパク含有基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも３．５倍高く、
    タンパク加水分解物における少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が少なくとも２５％であり、かつ、
    タンパク加水分解物におけるアミノ酸指数（ＡＡＱ）が少なくとも１０％である
    ことを特徴とするタンパク加水分解物。
17. ＡＡＱが、１５〜４０％であることを特徴とする、請求項１記載のタンパク加水分解物。
18. ＡＡＱが、１０〜３０％であることを特徴とする、請求項１記載のタンパク加水分解物。
19. 少なくとも１種の遊離アミノ酸が、Ｇｌｕ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ又はＡｒｇから選ばれる請求項１〜７及び１５〜１８のいずれか１項に記載のタンパク加水分解物。
20. 少なくとも１種の遊離アミノ酸が、Ｇｌｕ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ又はＡｒｇから選ばれる請求項１〜７及び１５〜１８のいずれか１項に記載のタンパク加水分解物。
21. タンパク加水分解物を製造する方法であって、
    水性条件下、５〜７５℃及びｐＨ３〜９で、タンパク含有基質を、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼにより加水分解し、それによりエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼの組み合わせ作用で、タンパク含有基質から少なくとも１種の遊離アミノ酸を放出させる工程と、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼのインキュベーションを、タンパク加水分解物中に存在する少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が、遊離アミノ酸へと完全に加水分解された同一タンパク含有基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも３倍高いタンパク加水分解物を得るのに適する時間行う工程を含み、
    タンパク加水分解物における少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が少なくとも２５％であり、かつ、
    タンパク加水分解物におけるアミノ酸指数（ＡＡＱ）が少なくとも１０％であることを特徴とする方法。
22. タンパク加水分解物を製造する方法であって、
    水性条件下、５〜７５℃及びｐＨ３〜９で、タンパク含有基質を、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼにより加水分解し、それによりエンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼの組み合わせ作用で、タンパク含有基質から少なくとも１種の遊離アミノ酸を放出させる工程と、エンドプロテアーゼ及びエキソプロテアーゼのインキュベーションを、タンパク加水分解物中に存在する少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が、遊離アミノ酸へと完全に加水分解された同一タンパク含有基質の加水分解物におけるものに比し、少なくとも３．５倍高いタンパク加水分解物を得るのに適する時間行う工程を含み、
    タンパク加水分解物における少なくとも１種の遊離アミノ酸のモル分率が少なくとも２５％であり、かつ、
    タンパク加水分解物におけるアミノ酸指数（ＡＡＱ）が少なくとも１０％であることを特徴とする方法。
23. 請求項９に記載の食品組成物であって、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかであることを特徴とする食品組成物：
    （ａ）チーズ、ここで、少なくとも１種の遊離アミノ酸がＭｅｔである；
    （ｂ）発酵ソーセージ、ここで、少なくとも１種の遊離アミノ酸がＬｅｕ又はＰｈｅである；
    （ｃ）ビール、ここで、少なくとも１種の遊離アミノ酸がＬｅｕ、Ｖａｌ又はＩｌｅである；
    （ｄ）ワイン、ここで、少なくとも１種の遊離アミノ酸がＡｒｇ又はＬｅｕである；又は
    （ｅ）ウイスキー、ここで、少なくとも１種の遊離アミノ酸がＶａｌである。