JP3335623B2 - ズブチリシン変異体 - Google Patents
ズブチリシン変異体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 （発明の分野） 本発明は前駆体カルボニルヒドロラーゼの１つ以上の
アミノ酸残基、特にバチルス アミロリクエファシエン
ス（Bacillus amylolihvefaciens）のズブチリシン中の
残基＋123および、または＋274に対応する部位のアミノ
酸残基が別のアミノ酸に置換した新しいカルボニルヒド
ロラーゼに関する。一般にこのようなカルボニルヒドロ
ラーゼ変異体は前駆体アミノ酸配列中のこれらのアミノ
酸残基の１つまたは両方の置換のみまたは別の置換を組
合せた置換、前駆体アミノ酸配列中の挿入または欠失を
コードするような天然もしくは組換えカルボニルヒドロ
ラーゼをコードする前駆体DNA配列のインビトロ突然変
異誘発により得られる。
アミノ酸残基、特にバチルス アミロリクエファシエン
ス（Bacillus amylolihvefaciens）のズブチリシン中の
残基＋123および、または＋274に対応する部位のアミノ
酸残基が別のアミノ酸に置換した新しいカルボニルヒド
ロラーゼに関する。一般にこのようなカルボニルヒドロ
ラーゼ変異体は前駆体アミノ酸配列中のこれらのアミノ
酸残基の１つまたは両方の置換のみまたは別の置換を組
合せた置換、前駆体アミノ酸配列中の挿入または欠失を
コードするような天然もしくは組換えカルボニルヒドロ
ラーゼをコードする前駆体DNA配列のインビトロ突然変
異誘発により得られる。
（発明の背景） セリンプロテアーゼはカルボニルヒドロラーゼのサブ
グループである。これらに広範囲の特異性および生物学
的機能を有する多様なクラスの酵素が含まれる。ストラ
ウド（Stroud）、R.M.（1974）、Sci.Amer.,131、74〜8
8。それらの機能的多様性にもかかわらずセリンプロテ
アーゼの触媒機械は少なくとも２つの遺伝的に異なる酵
素群：ズブチリシンおよび哺乳類キモトリプシン関連お
よび相同的バクテリアセリンプロテアーゼ（たとえば、
トリプシンおよびS.グレシウス（gresius）トリプシ
ン）によって手がかりが得られてきた。これら２つのセ
リンプロテアーゼ群はその触媒機構が著しく似ている。
クラウト（Kraut）、J.（1977）、Ann.Rev.Biochem.,4
6、331−358、さらに一次構造は関連がないが２つの酵
素群の３次構造がセリン、ヒスチジンおよびアスパラギ
ン酸からなるアミノ酸の保存的触媒性三つ組を有してい
る。
グループである。これらに広範囲の特異性および生物学
的機能を有する多様なクラスの酵素が含まれる。ストラ
ウド（Stroud）、R.M.（1974）、Sci.Amer.,131、74〜8
8。それらの機能的多様性にもかかわらずセリンプロテ
アーゼの触媒機械は少なくとも２つの遺伝的に異なる酵
素群：ズブチリシンおよび哺乳類キモトリプシン関連お
よび相同的バクテリアセリンプロテアーゼ（たとえば、
トリプシンおよびS.グレシウス（gresius）トリプシ
ン）によって手がかりが得られてきた。これら２つのセ
リンプロテアーゼ群はその触媒機構が著しく似ている。
クラウト（Kraut）、J.（1977）、Ann.Rev.Biochem.,4
6、331−358、さらに一次構造は関連がないが２つの酵
素群の３次構造がセリン、ヒスチジンおよびアスパラギ
ン酸からなるアミノ酸の保存的触媒性三つ組を有してい
る。
ズブチリシンは広範囲のバチルス（Bacillus）種およ
び他の微生物から大量に分泌されるセリンエンドプロテ
アーゼ（MW 27.000）である。ズブチリシンのたんぱく
質配列は少なくとも４種のバチルス（Bacillus）由来の
ものが決定されている。マークランド（Markland）F.S.
等（1983）、Honne−Seyler's Z,Physiol,Chem.,364,15
37−1540。2.5Aの分解能のバチルス アミロリクエファ
シエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）のズブチリシ
ンの三次元結晶構造も報告されている。ライト（Wrigh
t）、C.S.等（1969）、Nature,221、235−242、ドレン
ス（Drenth）、J.等（1972）、Eur.J.Biochem.,26、177
−181。これらの研究でズブチリシンは一般に哺乳類セ
リンプロテアーゼとは関係がないが、同様の活性部位を
有していることが示された。共有結合で結合したペプチ
ドインヒビターを含むズブチリシン（ロバータス（Robe
rtus）、J.D.,等（1972）Biochem.,11、2439−2449）ま
たは生成物複合体（ロバータス（Robertus）J.D.等（19
72）、J.Biol.Chem.,251、1097−1103）のＸ線結晶構造
もズブチリシンの活性部位および推測上の基質結合クレ
フトに関する情報を提供している。さらに、多数の速度
論的および化学修飾的研究がズブチリシンに関して報告
されており（フィリップ（Philipp）、M.等（1983）、M
ol.Cell.Biochem.,51、５−32;スベンセン（Svendse
n）、B.（1976）、Carlsbera Res.Comm.,41、237−291;
マークランド（Marklasnd）、F.S.Id.）、その中にはズ
ブチリシンの残基222のメチオニンの側鎖を過酸化水素
でメチオニン−スルホキシドに転換したもの（ストファ
ー（Stanffer）、D.C.等（1965）、J.Biol.Chem.244、5
333−5338）および残基221のセリンの側鎖を化学修飾す
ることによりシスティンに変換したもの（ポルガー（Po
lgar）等、（1981）、Biochimica et Biophysica Acta,
667、351−354）が含まれている。
び他の微生物から大量に分泌されるセリンエンドプロテ
アーゼ（MW 27.000）である。ズブチリシンのたんぱく
質配列は少なくとも４種のバチルス（Bacillus）由来の
ものが決定されている。マークランド（Markland）F.S.
等（1983）、Honne−Seyler's Z,Physiol,Chem.,364,15
37−1540。2.5Aの分解能のバチルス アミロリクエファ
シエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）のズブチリシ
ンの三次元結晶構造も報告されている。ライト（Wrigh
t）、C.S.等（1969）、Nature,221、235−242、ドレン
ス（Drenth）、J.等（1972）、Eur.J.Biochem.,26、177
−181。これらの研究でズブチリシンは一般に哺乳類セ
リンプロテアーゼとは関係がないが、同様の活性部位を
有していることが示された。共有結合で結合したペプチ
ドインヒビターを含むズブチリシン（ロバータス（Robe
rtus）、J.D.,等（1972）Biochem.,11、2439−2449）ま
たは生成物複合体（ロバータス（Robertus）J.D.等（19
72）、J.Biol.Chem.,251、1097−1103）のＸ線結晶構造
もズブチリシンの活性部位および推測上の基質結合クレ
フトに関する情報を提供している。さらに、多数の速度
論的および化学修飾的研究がズブチリシンに関して報告
されており（フィリップ（Philipp）、M.等（1983）、M
ol.Cell.Biochem.,51、５−32;スベンセン（Svendse
n）、B.（1976）、Carlsbera Res.Comm.,41、237−291;
マークランド（Marklasnd）、F.S.Id.）、その中にはズ
ブチリシンの残基222のメチオニンの側鎖を過酸化水素
でメチオニン−スルホキシドに転換したもの（ストファ
ー（Stanffer）、D.C.等（1965）、J.Biol.Chem.244、5
333−5338）および残基221のセリンの側鎖を化学修飾す
ることによりシスティンに変換したもの（ポルガー（Po
lgar）等、（1981）、Biochimica et Biophysica Acta,
667、351−354）が含まれている。
各々1985年１月９日に公表された米国特許No.4,760,0
25およびEPO公開No.0 130 756はバチルス アミロリク
エファシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）のズブ
チリシンのチロシン−１、アスパラギン酸＋32、アスパ
ラギン＋155、チロシン＋104、メチオニン＋222、グリ
シン＋166、ヒスチジン＋64、グリシン＋169、フェニル
アラニン＋189、セリン＋33、セリン＋221、チロシン＋
217、グルタミン酸＋156およびアラニン＋152に対応す
るズブチリシンのアミノ酸残基の修飾について公開して
いる。1988年１月７日に公表されたEPO公開No.0 251 44
6は有用なズブチリシン変異体を形成するバチルス ア
ミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefacien
s）のズブチリシンの他のアミノ酸残基および置換、挿
入または欠失による修正可能な、および米国特許No.4,7
60,025で同定されている残基の修飾と組合せ得るそれら
の等価物を公開している。しかし本明細書で同定されて
いる特定の残基はそれらの参考文献において同定された
ものではない。同様に各々1989年10月19日刊行のPCT公
開No.WO 89/09819およびWO 89/09830はズブチリシンを
コードするヌクレオチド配列を変異させて作ったズブチ
リシン酵素を公開している。これら各々の刊行物におい
て修正し得る多くのアミノ酸が同定されている。しか
し、先に述べた参考文献同様ここにも本発明の残基は同
定されていない。
25およびEPO公開No.0 130 756はバチルス アミロリク
エファシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）のズブ
チリシンのチロシン−１、アスパラギン酸＋32、アスパ
ラギン＋155、チロシン＋104、メチオニン＋222、グリ
シン＋166、ヒスチジン＋64、グリシン＋169、フェニル
アラニン＋189、セリン＋33、セリン＋221、チロシン＋
217、グルタミン酸＋156およびアラニン＋152に対応す
るズブチリシンのアミノ酸残基の修飾について公開して
いる。1988年１月７日に公表されたEPO公開No.0 251 44
6は有用なズブチリシン変異体を形成するバチルス ア
ミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefacien
s）のズブチリシンの他のアミノ酸残基および置換、挿
入または欠失による修正可能な、および米国特許No.4,7
60,025で同定されている残基の修飾と組合せ得るそれら
の等価物を公開している。しかし本明細書で同定されて
いる特定の残基はそれらの参考文献において同定された
ものではない。同様に各々1989年10月19日刊行のPCT公
開No.WO 89/09819およびWO 89/09830はズブチリシンを
コードするヌクレオチド配列を変異させて作ったズブチ
リシン酵素を公開している。これら各々の刊行物におい
て修正し得る多くのアミノ酸が同定されている。しか
し、先に述べた参考文献同様ここにも本発明の残基は同
定されていない。
したがって本発明の目的はバチルス アミロリクエフ
ァシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）のズブチリ
シン中＋123および、または＋274に対応する前駆体カル
ボニルヒドロラーゼ中のアミノ酸残基の置換を含むカル
ボニルヒドロラーゼ変異体を提供することにある。一般
にこのような変異体はそのような変異体のアミノ酸が誘
導される前駆体のカルボニルヒドロラーゼのいくつかの
性質とは異なる少なくとも１つの性質を有している。
ァシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）のズブチリ
シン中＋123および、または＋274に対応する前駆体カル
ボニルヒドロラーゼ中のアミノ酸残基の置換を含むカル
ボニルヒドロラーゼ変異体を提供することにある。一般
にこのような変異体はそのような変異体のアミノ酸が誘
導される前駆体のカルボニルヒドロラーゼのいくつかの
性質とは異なる少なくとも１つの性質を有している。
さらに本発明の目的はこのようなカルボニルヒドロラ
ーゼ変異体をコードするDNA配列ならびにこれらの変異
体DNA配列を含む発現ベクターを提供することにある。
ーゼ変異体をコードするDNA配列ならびにこれらの変異
体DNA配列を含む発現ベクターを提供することにある。
さらに本発明の目的はこれらのベクターでトランスホ
ームした宿主細胞ならびにこれらのDNAを発現させて細
胞内または細胞外にカルボニルヒドロラーゼ変異体を産
生し得る宿主細胞を提供することにある。
ームした宿主細胞ならびにこれらのDNAを発現させて細
胞内または細胞外にカルボニルヒドロラーゼ変異体を産
生し得る宿主細胞を提供することにある。
（発明の概要） 本発明は変異体のアミノ酸配列を誘導する前駆体カル
ボニルヒドロラーゼと比較して異なるたんぱく質分解活
性、安定性および、または性能特性を有する非天然のカ
ルボニルヒドロラーゼ変異体に関する。前駆体カルボニ
ルヒドロラーゼは天然のカルボニルヒドロラーゼまたは
組換えヒドロラーゼである。特にこれらのカルボニルヒ
ドロラーゼ変異体は天然では見られないアミノ酸配列を
有しており、前駆体がカルボニルヒドロラーゼの１つ以
上のアミノ酸を１つ以上の別のアミノ酸で置換すること
により誘導される。前駆体酵素の１つ以上のアミノ酸は
バチルス アミロリクエファシエンス（Bacillus amylo
liqvefaciens）のズブチリシンのAsn＋123および、また
はAla＋274、または他のカルボニルヒドロラーゼまたは
ズブチリシンの同等のアミノ酸残基に対応している。ま
た本発明はこのようなカルボニルヒドロラーゼまたはズ
ブチリシン変異体をコードする変異DNA配列に関する。
ボニルヒドロラーゼと比較して異なるたんぱく質分解活
性、安定性および、または性能特性を有する非天然のカ
ルボニルヒドロラーゼ変異体に関する。前駆体カルボニ
ルヒドロラーゼは天然のカルボニルヒドロラーゼまたは
組換えヒドロラーゼである。特にこれらのカルボニルヒ
ドロラーゼ変異体は天然では見られないアミノ酸配列を
有しており、前駆体がカルボニルヒドロラーゼの１つ以
上のアミノ酸を１つ以上の別のアミノ酸で置換すること
により誘導される。前駆体酵素の１つ以上のアミノ酸は
バチルス アミロリクエファシエンス（Bacillus amylo
liqvefaciens）のズブチリシンのAsn＋123および、また
はAla＋274、または他のカルボニルヒドロラーゼまたは
ズブチリシンの同等のアミノ酸残基に対応している。ま
た本発明はこのようなカルボニルヒドロラーゼまたはズ
ブチリシン変異体をコードする変異DNA配列に関する。
これらの変異DNA配列は天然または組換え前駆体酵素
をコードする前駆体DNA配列から誘導する。変異体DNA配
列バチルス アミロリクエファシエンス（Bacillus amy
loliqvefaciens）のズブチリシン中＋123および、また
は＋274に対応する前駆体DNA配列によってコードされる
１つ以上の特異的アミノ酸残基を置換するよう前駆体DN
A配列を修正することにより誘導される。これらの組換
えDNA配列は新しいアミノ酸配列、および一般には前駆
体カルボニルヒドロラーゼDNA配列によりコードされる
酵素の性質とは実質的に異なる少なくとも１つの性質を
有するカルボニルヒドロラーゼ変異体をコードしてい
る。これらの性質にはたんぱく質分解活性、安定性およ
び、または性能特性の増加などが含まれる。
をコードする前駆体DNA配列から誘導する。変異体DNA配
列バチルス アミロリクエファシエンス（Bacillus amy
loliqvefaciens）のズブチリシン中＋123および、また
は＋274に対応する前駆体DNA配列によってコードされる
１つ以上の特異的アミノ酸残基を置換するよう前駆体DN
A配列を修正することにより誘導される。これらの組換
えDNA配列は新しいアミノ酸配列、および一般には前駆
体カルボニルヒドロラーゼDNA配列によりコードされる
酵素の性質とは実質的に異なる少なくとも１つの性質を
有するカルボニルヒドロラーゼ変異体をコードしてい
る。これらの性質にはたんぱく質分解活性、安定性およ
び、または性能特性の増加などが含まれる。
また本発明にはバチルス アミロリクエファシエンス
（Bacillus amyloliqvefaciens）のズブチリシン中のAs
n＋123と等価な部位にセリンなど異なるアミノ酸残基を
有する原核性および真核性のズブチリシンおよびバチル
ス アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvef
aciens）中の部位274と等価な部位に異なるアミノ酸残
基を有するズブチリシンが含まれる。
（Bacillus amyloliqvefaciens）のズブチリシン中のAs
n＋123と等価な部位にセリンなど異なるアミノ酸残基を
有する原核性および真核性のズブチリシンおよびバチル
ス アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvef
aciens）中の部位274と等価な部位に異なるアミノ酸残
基を有するズブチリシンが含まれる。
さらに本発明にはカルボニルヒドロラーゼ変異体のDN
A配列を含む発現ベクターならびに該ベクターでトラン
スホームしそのような変異体を産生し得る宿主が含まれ
る。また本発明は本発明のカルボニルヒドロラーゼ変異
体を含む洗剤組成物に関する。
A配列を含む発現ベクターならびに該ベクターでトラン
スホームしそのような変異体を産生し得る宿主が含まれ
る。また本発明は本発明のカルボニルヒドロラーゼ変異
体を含む洗剤組成物に関する。
（図面の簡単な説明） 第１図はバチルス アミロリクエファシエンス（Baci
llus amyloliqvefaciens）のズブチリシンのDNAおよび
アミノ酸配列およびこの遺伝子の制限地図の一部を示し
ている。
llus amyloliqvefaciens）のズブチリシンのDNAおよび
アミノ酸配列およびこの遺伝子の制限地図の一部を示し
ている。
第２図はバチルス アミロリクエファシエンス（Baci
llus amyloliqvefaciens）枯草菌（Bacillus subtili
s）var I168およびバチルス リチェニホルミス（Bacil
lus lichrnifirmis）由来のズブチリシン間に保存され
ているアミノ酸残基を示してきる（カールスバーゲンシ
ス（Garlsbergensis））。
llus amyloliqvefaciens）枯草菌（Bacillus subtili
s）var I168およびバチルス リチェニホルミス（Bacil
lus lichrnifirmis）由来のズブチリシン間に保存され
ているアミノ酸残基を示してきる（カールスバーゲンシ
ス（Garlsbergensis））。
第3A図および第3B図はバチルス アミロリクエファシ
エンス（Bacillus amyloliqvefaciens）、枯草菌（Baci
llus subtilis）var I168およびバチルス リチェニホ
ルミス（Bacillus licheniformis）由来のズブチリシン
のアミノ酸配列を示している。
エンス（Bacillus amyloliqvefaciens）、枯草菌（Baci
llus subtilis）var I168およびバチルス リチェニホ
ルミス（Bacillus licheniformis）由来のズブチリシン
のアミノ酸配列を示している。
第４図は３つのズブチリシンのアミノ酸配列を示して
いる。上はバチルス アミロリクエファシエンス（Baci
llus amyloliqvefaciens）由来のズブチリシン（時には
ズブチリシンBPN′と呼ばれる）のアミノ酸配列を示し
ている。中央はバチルス レンタス（Bacillus lentu
s）由来のズブチリシン（PCT刊行No.WO 89/06276におけ
るズブチリシン309）のアミノ酸配列を示している。下
はGG−RYSAと命名した本発明の好ましい態様のアミノ酸
配列を示している。記号＊はズブチリシンBPN′と比較
して特定のアミノ酸残基が無いことを示している。
いる。上はバチルス アミロリクエファシエンス（Baci
llus amyloliqvefaciens）由来のズブチリシン（時には
ズブチリシンBPN′と呼ばれる）のアミノ酸配列を示し
ている。中央はバチルス レンタス（Bacillus lentu
s）由来のズブチリシン（PCT刊行No.WO 89/06276におけ
るズブチリシン309）のアミノ酸配列を示している。下
はGG−RYSAと命名した本発明の好ましい態様のアミノ酸
配列を示している。記号＊はズブチリシンBPN′と比較
して特定のアミノ酸残基が無いことを示している。
第５図はプラスミドpGG A274の構築を示している。
第６図はプラスミドpGG−RYSAへの中間体であるpGG−
KVNAの構築を示している。
KVNAの構築を示している。
第７図は合成バチルス レンタス（Bacillus lentu
s）ズブチリシン遺伝子の構築に用いたオリゴヌクレオ
チド二重鎖法を示している。
s）ズブチリシン遺伝子の構築に用いたオリゴヌクレオ
チド二重鎖法を示している。
第８図はバチルス レンタス（Bacillus lentus）ズ
ブチリシンをコードする合成遺伝子を構築するための戦
略を示している。
ブチリシンをコードする合成遺伝子を構築するための戦
略を示している。
第９図はカセット突然変異誘発によるコドン部位＋12
3におけるDNAの置換に用いたカセットを示している。XX
Xは部位＋123のアミノ酸置換をコードするよう修正した
コドンを表わしている。
3におけるDNAの置換に用いたカセットを示している。XX
Xは部位＋123のアミノ酸置換をコードするよう修正した
コドンを表わしている。
第10図は本発明の好ましい態様のDNAおよびアミノ酸
配列を示している。このDNA配列は合成DNAの配列であ
る。この図中のDNAは部位27がアルギニン、部位78がセ
リン、部位104がチロシン、部位123がセリンおよび部位
274がアラニンをコードするよう修正されている。
配列を示している。このDNA配列は合成DNAの配列であ
る。この図中のDNAは部位27がアルギニン、部位78がセ
リン、部位104がチロシン、部位123がセリンおよび部位
274がアラニンをコードするよう修正されている。
（本発明の詳細な説明） バチルス アミロリクエファシエンス（Bacillus amy
loliqvefaciens）ズブチリシンの＋123に対応するアミ
ノ酸残基にカルボニルヒドロラーゼズブチリシンのイン
ビトロ突然変異が起こると前駆体ズブチリシン以上のタ
ンパク質分解活性を示すズブチリシン異変体が生成する
ことが発見された。
loliqvefaciens）ズブチリシンの＋123に対応するアミ
ノ酸残基にカルボニルヒドロラーゼズブチリシンのイン
ビトロ突然変異が起こると前駆体ズブチリシン以上のタ
ンパク質分解活性を示すズブチリシン異変体が生成する
ことが発見された。
またバチルス アミロリクエファシエンス（Bacillus
amyloliqvefaciens）ズブチリシン中の＋274に対応す
る残基にインビトロ突然変異が起こると安定性が変化し
た、たとえば自己たんぱく質分解安定性が変化したズブ
チリシン変異体が生成することが発見された。ある場合
には後者の変異体を洗剤組成物に用いたとき優れた性能
を示す。
amyloliqvefaciens）ズブチリシン中の＋274に対応す
る残基にインビトロ突然変異が起こると安定性が変化し
た、たとえば自己たんぱく質分解安定性が変化したズブ
チリシン変異体が生成することが発見された。ある場合
には後者の変異体を洗剤組成物に用いたとき優れた性能
を示す。
カルボニルヒドロラーゼは以下の化学式： （式中Ｘは酸素または窒素である。） で表わされる結合を含む化合物を加水分解する酵素であ
る。それらには天然のカルボニルヒドロラーゼおよび組
換えカルボニルヒドロラーゼが含まれる。原則として天
然のカルボニルヒドロラーゼにはズブチリシンまたはメ
タロプロテアーゼなどのヒドロラーゼ、たとえばペプチ
ドヒドロラーゼが含まれる。ペプチドヒドロラーゼには
α−アミノアシルペプチドヒドロラーゼ、ペプチジルア
ミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリ
ンカルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダ
ーゼ、チオールプロティナーゼ、カルボキシプロティナ
ーゼおよびメタロプロティナーゼが含まれる。セリン、
メタロ、チオールおよび酸プロテアーゼにはエンドおよ
びエクソプロテアーゼが含まれる。
る。それらには天然のカルボニルヒドロラーゼおよび組
換えカルボニルヒドロラーゼが含まれる。原則として天
然のカルボニルヒドロラーゼにはズブチリシンまたはメ
タロプロテアーゼなどのヒドロラーゼ、たとえばペプチ
ドヒドロラーゼが含まれる。ペプチドヒドロラーゼには
α−アミノアシルペプチドヒドロラーゼ、ペプチジルア
ミノ酸ヒドロラーゼ、アシルアミノヒドロラーゼ、セリ
ンカルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダ
ーゼ、チオールプロティナーゼ、カルボキシプロティナ
ーゼおよびメタロプロティナーゼが含まれる。セリン、
メタロ、チオールおよび酸プロテアーゼにはエンドおよ
びエクソプロテアーゼが含まれる。
“組換えカルボニルヒドロラーゼ”とは天然のカルボ
ニルヒドロラーゼをコードするDNA配列がカルボニルヒ
ドロラーゼアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸の置
換、挿入または欠失をコードする変異体DNA配列を生ず
るよう修正されたカルボニルヒドロラーゼを意味する。
適当な修正法は本明細書、1985年１月９日に刊行された
EPO刊行物No.0 130 756および1988年１月７日刊行され
たEPO公開No.0 251 446に公開されている。
ニルヒドロラーゼをコードするDNA配列がカルボニルヒ
ドロラーゼアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸の置
換、挿入または欠失をコードする変異体DNA配列を生ず
るよう修正されたカルボニルヒドロラーゼを意味する。
適当な修正法は本明細書、1985年１月９日に刊行された
EPO刊行物No.0 130 756および1988年１月７日刊行され
たEPO公開No.0 251 446に公開されている。
“ズブチリシン”とはバクテリアまたは菌類カルボニ
ルヒドロラーゼであり一般にはたんぱく質またはペプチ
ドのペプチド結合を切断するよう作用する。ここで使用
されているように“ズブチリシン”とは天然ズブチリシ
ンまたは組換えズブチリシンを意味している。一連の天
然ズブチリシンは種々の微生物種によって生産され、し
ばしば分泌されることが知られている。このシリーズの
アミノ酸配列は全てが相同的ではない。しかし、このシ
リーズのズブチリシンは同じまたは同様のたんぱく質分
解活性を示す。このクラスのセリンプロテアーゼはキモ
トリプシン関連のセリンプロテアーゼと区別される触媒
性三つ組を規定する共通のアミノ酸配列を共有してい
る。ズブチリシンおよびキモトリプシン関連セリンプロ
テアーゼの両方はアスパラギン酸ヒスチジンおよびセリ
ンを含む触媒性三つ組を有している。ズブチリシン関連
プロテアーゼの場合、アミノ末端からカルボキシ末端の
方向でこれらのアミノ酸の相対的順番はアスパラギン酸
−ヒスチジン−セリンの順である。しかしキモトリプシ
ン関連プロテアーゼの場合この相対的順番はヒスチジン
−アスパラギン酸−セリンの順である。したがって本明
細書のズブチリシンはズブチリシン関連プロテアーゼの
触媒性三つ組を有するセリンプロテアーゼを意味する。
例としては本明細書の第３図に示したズブチリシンおよ
びPCT公開No.WO 89/06276およびEPO公開No.0 283 075に
報告されているズブチリシンが含まれる。
ルヒドロラーゼであり一般にはたんぱく質またはペプチ
ドのペプチド結合を切断するよう作用する。ここで使用
されているように“ズブチリシン”とは天然ズブチリシ
ンまたは組換えズブチリシンを意味している。一連の天
然ズブチリシンは種々の微生物種によって生産され、し
ばしば分泌されることが知られている。このシリーズの
アミノ酸配列は全てが相同的ではない。しかし、このシ
リーズのズブチリシンは同じまたは同様のたんぱく質分
解活性を示す。このクラスのセリンプロテアーゼはキモ
トリプシン関連のセリンプロテアーゼと区別される触媒
性三つ組を規定する共通のアミノ酸配列を共有してい
る。ズブチリシンおよびキモトリプシン関連セリンプロ
テアーゼの両方はアスパラギン酸ヒスチジンおよびセリ
ンを含む触媒性三つ組を有している。ズブチリシン関連
プロテアーゼの場合、アミノ末端からカルボキシ末端の
方向でこれらのアミノ酸の相対的順番はアスパラギン酸
−ヒスチジン−セリンの順である。しかしキモトリプシ
ン関連プロテアーゼの場合この相対的順番はヒスチジン
−アスパラギン酸−セリンの順である。したがって本明
細書のズブチリシンはズブチリシン関連プロテアーゼの
触媒性三つ組を有するセリンプロテアーゼを意味する。
例としては本明細書の第３図に示したズブチリシンおよ
びPCT公開No.WO 89/06276およびEPO公開No.0 283 075に
報告されているズブチリシンが含まれる。
“組換えズブチリシン”とはズブチリシンをコードす
るDNA配列を修正し、天然のズブチリシンアミノ酸配列
中の１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入をコー
ドする変異DNA配列を産生するズブチリシンを意味す
る。このような修正を行う適当な方法および本明細書に
公開されている方法と組合せ得る適当な方法にはEPO公
開No.0 130 756および0 251 446およびPCT公開No.WO 89
/06279、WO 89/09830およびWO 89/09819に開示されてい
る方法が含まれる。
るDNA配列を修正し、天然のズブチリシンアミノ酸配列
中の１又は２以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入をコー
ドする変異DNA配列を産生するズブチリシンを意味す
る。このような修正を行う適当な方法および本明細書に
公開されている方法と組合せ得る適当な方法にはEPO公
開No.0 130 756および0 251 446およびPCT公開No.WO 89
/06279、WO 89/09830およびWO 89/09819に開示されてい
る方法が含まれる。
“非ヒトカルボニルヒドロラーゼ”およびこれをコー
ドするDNAは多くの原核性および真核性生物から入手し
得る。原核性生物の適当な例には大腸菌またはシュード
モナス（Pseudomonas）などのグラム陰性菌およびマイ
クロコッカス（Micrococcus）またはバチルス（Bacillu
s）などのグラム陽性菌が含まれる。カルボニルヒドロ
ラーゼおよびそれらの遺伝子を入手する真核性生物の例
にはサッカロミセスセレビシエ（Saccaromycees cerevi
siae）などのイースト、アスペルギルス（Aspergillu
s）種などの菌類およびたとえばカルボニルヒドロラー
ゼキモシンをコードする遺伝子を入手し得るウシ（bovi
ne）種などの非ヒト哺乳類が含まれる。ズブチリシンと
同様に一連のカルボニルヒドロラーゼはそれらのシリー
ズ間では全く相同的ではないが同じまたは同様の生物学
的活性を示すアミノ酸配列を有する種々の関連種から入
手し得る。したがって本明細書に述べられたている非ヒ
トカルボニルヒドロラーゼは直接的または間接的に原核
生物および真核生物に関連するカルボニルヒドロラーゼ
に関する機能を有している。
ドするDNAは多くの原核性および真核性生物から入手し
得る。原核性生物の適当な例には大腸菌またはシュード
モナス（Pseudomonas）などのグラム陰性菌およびマイ
クロコッカス（Micrococcus）またはバチルス（Bacillu
s）などのグラム陽性菌が含まれる。カルボニルヒドロ
ラーゼおよびそれらの遺伝子を入手する真核性生物の例
にはサッカロミセスセレビシエ（Saccaromycees cerevi
siae）などのイースト、アスペルギルス（Aspergillu
s）種などの菌類およびたとえばカルボニルヒドロラー
ゼキモシンをコードする遺伝子を入手し得るウシ（bovi
ne）種などの非ヒト哺乳類が含まれる。ズブチリシンと
同様に一連のカルボニルヒドロラーゼはそれらのシリー
ズ間では全く相同的ではないが同じまたは同様の生物学
的活性を示すアミノ酸配列を有する種々の関連種から入
手し得る。したがって本明細書に述べられたている非ヒ
トカルボニルヒドロラーゼは直接的または間接的に原核
生物および真核生物に関連するカルボニルヒドロラーゼ
に関する機能を有している。
“カルボニルヒドロラーゼ変異体”は“前駆体カルボ
ニルヒドロラーゼ”のアミン酸配列から誘導されるアミ
ノ酸配列を有している。前駆体カルボニルヒドロラーゼ
には天然カルボニルヒドロラーゼおよび組換えカルボニ
ルヒドロラーゼが含まれる。カルボニルヒドロラーゼ変
異体のアミノ酸配列は前駆体アミノ酸配列の１つ以上の
アミノ酸の置換、欠失または挿入により前駆体ヒドロラ
ーゼアミノ酸配列から“誘導”される。このような修正
は前駆体カルボニルヒドロラーゼ酵素自体の取扱いとい
うよりはむしろ前駆体カルボニルヒドロラーゼのアミノ
酸配列をコードする“前駆体DNA配列”に関する。前駆
体DNA配列の取扱いに適した方法には本発明書およびEPO
刊行No.0 130 756および0 251 446に公開されている方
法が含まれる。
ニルヒドロラーゼ”のアミン酸配列から誘導されるアミ
ノ酸配列を有している。前駆体カルボニルヒドロラーゼ
には天然カルボニルヒドロラーゼおよび組換えカルボニ
ルヒドロラーゼが含まれる。カルボニルヒドロラーゼ変
異体のアミノ酸配列は前駆体アミノ酸配列の１つ以上の
アミノ酸の置換、欠失または挿入により前駆体ヒドロラ
ーゼアミノ酸配列から“誘導”される。このような修正
は前駆体カルボニルヒドロラーゼ酵素自体の取扱いとい
うよりはむしろ前駆体カルボニルヒドロラーゼのアミノ
酸配列をコードする“前駆体DNA配列”に関する。前駆
体DNA配列の取扱いに適した方法には本発明書およびEPO
刊行No.0 130 756および0 251 446に公開されている方
法が含まれる。
バチルス アミロリクエファシエンス（Bacillus amy
loliqvefaciens）ズブチリシンの部位＋123および＋274
に対応する特定の残基の置換について同定する。これら
のアミノ酸部位番号は第１図の成熟バチルス アミロリ
クエファシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブ
チリシン配列に割当てられた番号である。しかし本発明
はこの特定のズブチリシンの変異に限定される訳ではな
く、バチルス アミロリクエファシエンス（Bacillus a
myloliqvefaciens）ズブチリシンにおける特定の残基を
等価な“部位のアミノ酸残基を含む前駆体カルボニルヒ
ドロラーゼに拡張される。
loliqvefaciens）ズブチリシンの部位＋123および＋274
に対応する特定の残基の置換について同定する。これら
のアミノ酸部位番号は第１図の成熟バチルス アミロリ
クエファシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブ
チリシン配列に割当てられた番号である。しかし本発明
はこの特定のズブチリシンの変異に限定される訳ではな
く、バチルス アミロリクエファシエンス（Bacillus a
myloliqvefaciens）ズブチリシンにおける特定の残基を
等価な“部位のアミノ酸残基を含む前駆体カルボニルヒ
ドロラーゼに拡張される。
前駆体カルボニルヒドロラーゼの残基（アミノ酸）は
バチルスアミロリクエファシエンス（Bacillus amyloli
qvefaciens）ズブチリシン中の特定の残基またはその残
基の一部に相同的な（すなわち一次または三次構造中の
部位に関して）または類似する（すなわち化学的に結
合、反応または相互作用する同じ、または同様の機能を
有する）場合バチルス アミロリクエファシエンス（Ba
cillus amyloliqvefaciens）の残基と等価である。
バチルスアミロリクエファシエンス（Bacillus amyloli
qvefaciens）ズブチリシン中の特定の残基またはその残
基の一部に相同的な（すなわち一次または三次構造中の
部位に関して）または類似する（すなわち化学的に結
合、反応または相互作用する同じ、または同様の機能を
有する）場合バチルス アミロリクエファシエンス（Ba
cillus amyloliqvefaciens）の残基と等価である。
一次構造のホモロジーを確認するための前駆体カルボ
キシルヒドロラーゼのアミノ酸配列をバチルス アミロ
リクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズ
ブチリシンの一次配列、特に配列が分っている全てのズ
ブチリシンに共通することが分っている一連の残基と直
接比較した（第２図）。保存的残基が整列するよう必要
な挿入および欠失を考慮すると（すなわち任意の挿入お
よび欠失により保存的残基の除外を回避して）バチルス
アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefac
iens）ズブチリシンの一次配列中の特定のアミノ酸に相
当する残基が限定される。おそらく保存的残基の整列は
そのような残基の100％を保存している。しかし、75％
以上または50％程の保存的残基を整列させても等価な残
基を限定することができる。触媒性三つ組ＡSP32/His64
/Ser221の保存は維持されている。
キシルヒドロラーゼのアミノ酸配列をバチルス アミロ
リクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズ
ブチリシンの一次配列、特に配列が分っている全てのズ
ブチリシンに共通することが分っている一連の残基と直
接比較した（第２図）。保存的残基が整列するよう必要
な挿入および欠失を考慮すると（すなわち任意の挿入お
よび欠失により保存的残基の除外を回避して）バチルス
アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefac
iens）ズブチリシンの一次配列中の特定のアミノ酸に相
当する残基が限定される。おそらく保存的残基の整列は
そのような残基の100％を保存している。しかし、75％
以上または50％程の保存的残基を整列させても等価な残
基を限定することができる。触媒性三つ組ＡSP32/His64
/Ser221の保存は維持されている。
たとえば第３図でバチルス アミロリクエファシエン
ス（Bacillus amyloliqvefaciens）、枯草菌（Bacillus
subtilis）変異体I168およびバチルス リチェニホル
ミル（Bacillus lichemformis）のズブチリシンのアミ
ノ酸配列（カールスバーゲンシス）を各アミノ酸配列間
で最高のホモロジーを示すように整列させている。これ
らの配列の比較で各配列中に多くの保存的残基が含まれ
ていることが示された。これらは第２図で同定された残
基である。
ス（Bacillus amyloliqvefaciens）、枯草菌（Bacillus
subtilis）変異体I168およびバチルス リチェニホル
ミル（Bacillus lichemformis）のズブチリシンのアミ
ノ酸配列（カールスバーゲンシス）を各アミノ酸配列間
で最高のホモロジーを示すように整列させている。これ
らの配列の比較で各配列中に多くの保存的残基が含まれ
ていることが示された。これらは第２図で同定された残
基である。
したがってこれらの保存的残基を用いてバチルス レ
ンタス（Bacillus lentus）由来のズブチリシン（1989
年７月13日刊行のPCT刊行No.WO 89/06279）や本発明の
好ましいズブチリシン変異体など他のカルボニルヒドロ
ラーゼにおいてバチルス アミロリクエファシエンス
（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシンの対応す
るアミノ酸残基を限定することができる。これらの特定
のアミノ酸配列を第４図に保存的残基とホモロジーが最
大となるようバチルス アミロリクエファシエンス（Ba
cillus amyloliqvefaciens）の配列と整列させてある。
ここから分るようにバチルス アミロリクエファシエン
ス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシンと比べ
てバチルス レンタス（Bacillus lentus）ズブチリシ
ンおよび本発明の好ましいズブチリシン変異体の配列中
には多くの欠失がある。バチルス アミロリクエファシ
エンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシン中
のVal−165と等価な他のズブチリシン中のアミノ酸はVa
l−165の下に示されている特定のイソロイシンである。
ンタス（Bacillus lentus）由来のズブチリシン（1989
年７月13日刊行のPCT刊行No.WO 89/06279）や本発明の
好ましいズブチリシン変異体など他のカルボニルヒドロ
ラーゼにおいてバチルス アミロリクエファシエンス
（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシンの対応す
るアミノ酸残基を限定することができる。これらの特定
のアミノ酸配列を第４図に保存的残基とホモロジーが最
大となるようバチルス アミロリクエファシエンス（Ba
cillus amyloliqvefaciens）の配列と整列させてある。
ここから分るようにバチルス アミロリクエファシエン
ス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシンと比べ
てバチルス レンタス（Bacillus lentus）ズブチリシ
ンおよび本発明の好ましいズブチリシン変異体の配列中
には多くの欠失がある。バチルス アミロリクエファシ
エンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシン中
のVal−165と等価な他のズブチリシン中のアミノ酸はVa
l−165の下に示されている特定のイソロイシンである。
第４図において、部位123のアミノ酸はバチルス ア
ミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefacien
s）ズブチリシン中のアスパラギンである。バチルス
レンタス（Bacillus lentus）ズブチリシンにおける等
価な残基は特定のアスパラギンであることが示されてい
る。しかし本発明の好ましいズブチリシンの場合バチル
ス アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvef
aciens）ズブチリシンの＋123に相当するアミノ酸はア
スパラギンというような第４図に示されているセリンと
した方が良いであろう。同様に第４図においてバチルス
アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefac
iens）ズブチリシン＋274のアミノ酸はアラニンであ
る。ここから分るようにバチルス レンタス（Bacillus
lentus）ズブチリシンにおけるこれらと等価なアミノ
酸は第４図に示されている特定のスレオニンである。本
発明の特定の好ましいズブチリシン変異体の場合、部位
274の等価なアミノ酸は第４図に示されているようにア
ラニンである。
ミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefacien
s）ズブチリシン中のアスパラギンである。バチルス
レンタス（Bacillus lentus）ズブチリシンにおける等
価な残基は特定のアスパラギンであることが示されてい
る。しかし本発明の好ましいズブチリシンの場合バチル
ス アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvef
aciens）ズブチリシンの＋123に相当するアミノ酸はア
スパラギンというような第４図に示されているセリンと
した方が良いであろう。同様に第４図においてバチルス
アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefac
iens）ズブチリシン＋274のアミノ酸はアラニンであ
る。ここから分るようにバチルス レンタス（Bacillus
lentus）ズブチリシンにおけるこれらと等価なアミノ
酸は第４図に示されている特定のスレオニンである。本
発明の特定の好ましいズブチリシン変異体の場合、部位
274の等価なアミノ酸は第４図に示されているようにア
ラニンである。
このようにバチルス レンタス（Bacillus lentus）
ズブチリシンおよび本発明の好ましい態様のズブチリシ
ンに関する部位＋123と＋274のアミノ酸は第４図の一次
アミノ酸配列から同定される。しかし、バチルス アミ
ロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）
ズブチリシン中の特定のアミノ酸と等価な他の種々のア
ミノ酸残基も変化している可能性がある。好ましい態様
において、バチルス アミロリクエファシエンス（Baci
llus amyloliqvefaciens）ズブチリシン中部位27のアミ
ノ酸リジンはバチルス レンタス（Bacillus lentus）
ズブチリシン中部位27に等価なリジンを有している。実
施例に示されているように、本発明の好ましい態様の１
つを含むズブチリシンはバチルス レンタス（Bacillus
lentus）ズブチリシンをコードするDNA配列を修正する
ことにより誘導した。このDNAに対するこのような修正
にはバチルス アミロリクエファシエンス（Bacillus a
myloliqvefaciens）ズブチリシンの部位123および274に
等価なコドンの修正も含んでいる。しかし、他の２つの
修正はバチルス アミロリクエファシエンス（Bacillus
amyloliqvefaciens）ズブチリシン中の残基27および10
4と等価なバチルス レンタス（Bacillus lentus）のア
ミノ酸配列中の部位に行なわれた。このように第４図か
ら分るようにバチルス レンタス（Bacillus lentus）
中の等価な残基27にあるリジンは好ましい態様中アルギ
ニンをコードするよう修正した。同様にバチルス アミ
ロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）
ズブチリシン中のチロシン104と等価なバチルス レン
タス（Bacillus lentus）の部位104のバリン残渣もチロ
シンをコードするよう修正した。このように第４図に示
した好ましい態様にはバチルス アミロリクエファシエ
ンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシンの部
位27、104、123および274と等価なバチルス レンタス
（Bacillus lentus）ズブチリシンの残基を修正するこ
とにより該ズブチリシンから誘導されるアミノ酸配列を
含んでいる。
ズブチリシンおよび本発明の好ましい態様のズブチリシ
ンに関する部位＋123と＋274のアミノ酸は第４図の一次
アミノ酸配列から同定される。しかし、バチルス アミ
ロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）
ズブチリシン中の特定のアミノ酸と等価な他の種々のア
ミノ酸残基も変化している可能性がある。好ましい態様
において、バチルス アミロリクエファシエンス（Baci
llus amyloliqvefaciens）ズブチリシン中部位27のアミ
ノ酸リジンはバチルス レンタス（Bacillus lentus）
ズブチリシン中部位27に等価なリジンを有している。実
施例に示されているように、本発明の好ましい態様の１
つを含むズブチリシンはバチルス レンタス（Bacillus
lentus）ズブチリシンをコードするDNA配列を修正する
ことにより誘導した。このDNAに対するこのような修正
にはバチルス アミロリクエファシエンス（Bacillus a
myloliqvefaciens）ズブチリシンの部位123および274に
等価なコドンの修正も含んでいる。しかし、他の２つの
修正はバチルス アミロリクエファシエンス（Bacillus
amyloliqvefaciens）ズブチリシン中の残基27および10
4と等価なバチルス レンタス（Bacillus lentus）のア
ミノ酸配列中の部位に行なわれた。このように第４図か
ら分るようにバチルス レンタス（Bacillus lentus）
中の等価な残基27にあるリジンは好ましい態様中アルギ
ニンをコードするよう修正した。同様にバチルス アミ
ロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）
ズブチリシン中のチロシン104と等価なバチルス レン
タス（Bacillus lentus）の部位104のバリン残渣もチロ
シンをコードするよう修正した。このように第４図に示
した好ましい態様にはバチルス アミロリクエファシエ
ンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシンの部
位27、104、123および274と等価なバチルス レンタス
（Bacillus lentus）ズブチリシンの残基を修正するこ
とにより該ズブチリシンから誘導されるアミノ酸配列を
含んでいる。
またＸ線結晶学により三次構造が測定されている前駆
体カルボニルヒドロラーゼの三次構造レベルでのホモロ
ジーを測定することにより等価残基を限定し得る。等価
残基とは前駆体カルボニルヒドロラーゼおよびバチルス
アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefac
iens）ズブチリシンの特定のアミノ酸の２つ以上の主鎖
原子（ＮとＮ、CAとCA、ＣとＣ、およびＯとＯ）の原子
座標が整列後0.13nm、好ましくは0.1nm以内にある残基
と定義する。整列はバチルス アミロリクエファシエン
ス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシンに対し
問題のカルボニルヒドロラーゼの水素以外のたんぱく質
原子の原子座礁が最も重なるように最良のモデルを配向
させることにより達成させる。この最良のモデルは入手
し得る最も高い分解能の実験的回析データに関し最も低
いＲ因子を与える結晶学的モデルである。
体カルボニルヒドロラーゼの三次構造レベルでのホモロ
ジーを測定することにより等価残基を限定し得る。等価
残基とは前駆体カルボニルヒドロラーゼおよびバチルス
アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefac
iens）ズブチリシンの特定のアミノ酸の２つ以上の主鎖
原子（ＮとＮ、CAとCA、ＣとＣ、およびＯとＯ）の原子
座標が整列後0.13nm、好ましくは0.1nm以内にある残基
と定義する。整列はバチルス アミロリクエファシエン
ス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシンに対し
問題のカルボニルヒドロラーゼの水素以外のたんぱく質
原子の原子座礁が最も重なるように最良のモデルを配向
させることにより達成させる。この最良のモデルは入手
し得る最も高い分解能の実験的回析データに関し最も低
いＲ因子を与える結晶学的モデルである。
バチルス アミロリクエファシエンス（Bacillus amy
loliqvefaciens）ズブチリシンの特定の残基と機能的に
類似する等価残基とはバチルス アミロリクエファシエ
ンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシンの特
定の残基に限定されかつ寄因する様式でたんぱく質構
造、気質結合または触媒性を変化、修正またはそれらに
寄与するよう構造を適用させ得る前駆体カルボニルヒド
ロラーゼのアミノ酸と定義される。さらにこれらは所定
の残基の主鎖原子は相同的部位の占有に基づき等価性の
基準を満足しない場合でもそのい残基の側鎖原子の少な
くとも２つの原子座標がバチルス アミロリクエファシ
エンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシンの
対応する側鎖原子の0.13nm以内に存在する程度に類似部
位を占有する前駆体カルボニルヒドロラーゼ（この三次
構造がＸ線結晶学から判明している）の残基である。バ
チルス アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloli
qvefaciens）ズブチリシンの三次元構造の座標はEPO刊
行No.0 251 446に報告されており、先に概説したように
これらを用いて三次構造レベルで等価残基を決定し得
る。
loliqvefaciens）ズブチリシンの特定の残基と機能的に
類似する等価残基とはバチルス アミロリクエファシエ
ンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシンの特
定の残基に限定されかつ寄因する様式でたんぱく質構
造、気質結合または触媒性を変化、修正またはそれらに
寄与するよう構造を適用させ得る前駆体カルボニルヒド
ロラーゼのアミノ酸と定義される。さらにこれらは所定
の残基の主鎖原子は相同的部位の占有に基づき等価性の
基準を満足しない場合でもそのい残基の側鎖原子の少な
くとも２つの原子座標がバチルス アミロリクエファシ
エンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシンの
対応する側鎖原子の0.13nm以内に存在する程度に類似部
位を占有する前駆体カルボニルヒドロラーゼ（この三次
構造がＸ線結晶学から判明している）の残基である。バ
チルス アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloli
qvefaciens）ズブチリシンの三次元構造の座標はEPO刊
行No.0 251 446に報告されており、先に概説したように
これらを用いて三次構造レベルで等価残基を決定し得
る。
置換、挿入または欠失についても同定される残基には
保存的残基が含まれるがその他のものは保存的残基では
ない。
保存的残基が含まれるがその他のものは保存的残基では
ない。
保存されない残基の場合１つ以上のアミノ酸の置換は
天然に存在するもので相当しないアミノ酸配列を有する
変異体を生ずる置換に限定される。保存的残基の場合、
これらの置換で天然の配列は生じない。本発明のカルボ
ニルヒドロラーゼ変異体にはカルボニルヒドロラーゼ変
異体の成熟型および該ヒドロラーゼ変異体のプロ型およ
びプレプロ型が含まれる。プレプロ型はカルボニルヒド
ロラーゼ変異体の発現、分泌および成熟を容易にするこ
とから好ましい構築物である。
天然に存在するもので相当しないアミノ酸配列を有する
変異体を生ずる置換に限定される。保存的残基の場合、
これらの置換で天然の配列は生じない。本発明のカルボ
ニルヒドロラーゼ変異体にはカルボニルヒドロラーゼ変
異体の成熟型および該ヒドロラーゼ変異体のプロ型およ
びプレプロ型が含まれる。プレプロ型はカルボニルヒド
ロラーゼ変異体の発現、分泌および成熟を容易にするこ
とから好ましい構築物である。
“プロ配列”とは除去されたときカルボニルヒドロラ
ーゼ“成熟”型となるカルボニルヒドロラーゼ成熟型の
Ｎ末端部分に結合するアミノ酸配列である。多くのたん
ぱく質分解酵素が翻訳性プロ酵素産物として天然に存在
し、また翻訳後プロセシングがない場合もこの様式で発
現される。別のズブチリシンプロ配列も使用できるがカ
ルボニルヒドロラーゼ変異体、特にズブチリシン変異体
を産生するための好ましいプロ配列はバチルス アミロ
リクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズ
ブチリシンの推定上のプロ配列である。実施例において
はバチルスレンタス（ATCC 21536）由来のズブチリシ
ンの推定上のプロ配列を用いた。
ーゼ“成熟”型となるカルボニルヒドロラーゼ成熟型の
Ｎ末端部分に結合するアミノ酸配列である。多くのたん
ぱく質分解酵素が翻訳性プロ酵素産物として天然に存在
し、また翻訳後プロセシングがない場合もこの様式で発
現される。別のズブチリシンプロ配列も使用できるがカ
ルボニルヒドロラーゼ変異体、特にズブチリシン変異体
を産生するための好ましいプロ配列はバチルス アミロ
リクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズ
ブチリシンの推定上のプロ配列である。実施例において
はバチルスレンタス（ATCC 21536）由来のズブチリシ
ンの推定上のプロ配列を用いた。
“シグナル配列”または“プレ配列”とはヒドロラー
ゼの成熟型またはプロ型の分泌に関係するカルボニルヒ
ドロラーゼのＮ末端部分またはプロヒドロラーゼのＮ末
端部分に結合するアミノ酸配列を意味する。
ゼの成熟型またはプロ型の分泌に関係するカルボニルヒ
ドロラーゼのＮ末端部分またはプロヒドロラーゼのＮ末
端部分に結合するアミノ酸配列を意味する。
このシグナル配列の定義は天然条件下ズブチリシンま
たは他のカルボニルヒドロラーゼの分泌の達成に関与す
るズブチリシン遺伝子または他の分泌可能なカルボニル
ヒドロラーゼのＮ末端部分によってコードされているこ
れら全てのアミノ酸配列を含む機能的配列である。本発
明はこれらの配列を利用し、本明細書で定義されている
カルボニルヒドロラーゼ変異体の分泌を達成している。
実施例で使用している好ましいシグナル配列には枯草菌
（Bacillus subtilis）ズブチリシン由来のシグナル配
列の最初の７個のアミノ酸残基をバチルス レンタス
（Bacillus lentus）（ATCC 21536）ズブチリシンのシ
グナル配列の残り部分に融合したものが含まれる。
たは他のカルボニルヒドロラーゼの分泌の達成に関与す
るズブチリシン遺伝子または他の分泌可能なカルボニル
ヒドロラーゼのＮ末端部分によってコードされているこ
れら全てのアミノ酸配列を含む機能的配列である。本発
明はこれらの配列を利用し、本明細書で定義されている
カルボニルヒドロラーゼ変異体の分泌を達成している。
実施例で使用している好ましいシグナル配列には枯草菌
（Bacillus subtilis）ズブチリシン由来のシグナル配
列の最初の７個のアミノ酸残基をバチルス レンタス
（Bacillus lentus）（ATCC 21536）ズブチリシンのシ
グナル配列の残り部分に融合したものが含まれる。
“プレプロ”型のカルボニルヒドロラーゼ変異体はヒ
ドロラーゼのアミノ末端に機能的に結合するプロ配列を
有する成熟型のヒドロラーゼおよびそのプロ配列のアミ
ノ末端に機能的に結合する“プレ”または“シグナル”
配列を含む。
ドロラーゼのアミノ末端に機能的に結合するプロ配列を
有する成熟型のヒドロラーゼおよびそのプロ配列のアミ
ノ末端に機能的に結合する“プレ”または“シグナル”
配列を含む。
発現ベクターとは適当な宿主中DNA発現が可能な適当
なコントロール配列と機能的に結合するDNA配列を含むD
NA構築物を意味する。このようなコントロール配列には
転写を行うプロモーター、このような転写をコントロー
ルするオペレーター、適当なmRNAのリボゾーム結合部位
をコードする配列および転写および翻訳の停止をコント
ロールする配列が含まれる。これらのベクターにはプラ
スミド、ファージ粒子または単に潜在的ゲノム挿入物が
ある。適当な宿主にトランスホームされればこのベクタ
ーは宿主ゲノムとは独立して複製および機能するか、ま
たはある場合にはゲノム自体に組込まれる。本明細書で
はプラスミドは現在最も一般的に用いられているベクタ
ーであることから“プラスミド”と“ベクター”はしば
しば同義的に使われている。しかし、本発明には等価な
機能を示し、当分野で知られている他の発現ベクターも
含まれる。
なコントロール配列と機能的に結合するDNA配列を含むD
NA構築物を意味する。このようなコントロール配列には
転写を行うプロモーター、このような転写をコントロー
ルするオペレーター、適当なmRNAのリボゾーム結合部位
をコードする配列および転写および翻訳の停止をコント
ロールする配列が含まれる。これらのベクターにはプラ
スミド、ファージ粒子または単に潜在的ゲノム挿入物が
ある。適当な宿主にトランスホームされればこのベクタ
ーは宿主ゲノムとは独立して複製および機能するか、ま
たはある場合にはゲノム自体に組込まれる。本明細書で
はプラスミドは現在最も一般的に用いられているベクタ
ーであることから“プラスミド”と“ベクター”はしば
しば同義的に使われている。しかし、本発明には等価な
機能を示し、当分野で知られている他の発現ベクターも
含まれる。
一般に本発明で使用されている“宿主細胞”は好まし
くはEPO公開No.0 130 756で公開されている方法により
酵素的に活性なエンドプロテアーゼを分泌し得ないよう
にした原核性および真核性宿主である。ズブチリシンを
発現する好ましい宿主細胞は酵素的に活性な中性プロテ
アーゼやアルカリプロテアーゼ（ズブチリシン）を欠損
するバチルス（Bacillus）BG2036株である。
くはEPO公開No.0 130 756で公開されている方法により
酵素的に活性なエンドプロテアーゼを分泌し得ないよう
にした原核性および真核性宿主である。ズブチリシンを
発現する好ましい宿主細胞は酵素的に活性な中性プロテ
アーゼやアルカリプロテアーゼ（ズブチリシン）を欠損
するバチルス（Bacillus）BG2036株である。
BG2036株の構築はEPO刊行No.0 130 756に詳しく報告
されており、さらにヤン（Yang）、M.Y.等（1984）、J.
Bacteriol.,160、15−21に報告されている。ズブチリシ
ンを発現する他の宿主細胞には枯草菌I168が含まれる
（EPO刊行No.0 130 756）。
されており、さらにヤン（Yang）、M.Y.等（1984）、J.
Bacteriol.,160、15−21に報告されている。ズブチリシ
ンを発現する他の宿主細胞には枯草菌I168が含まれる
（EPO刊行No.0 130 756）。
宿主細胞は組換えDNA技術を用いて構築したベクター
でトランスホームまたはトランスフェクションされる。
これらのトランスホーム宿主細胞はカルボニルヒドロラ
ーゼ変異体をコードするベクターの複製または望ましい
カルボニルヒドロラーゼ変異体の発現が可能である。プ
レまたはプレプロ型のカルボニルヒドロラーゼ変異体を
コードするベクターの場合、発現されたこれらの変異体
は宿主細胞から宿主細胞培地へ分泌される。
でトランスホームまたはトランスフェクションされる。
これらのトランスホーム宿主細胞はカルボニルヒドロラ
ーゼ変異体をコードするベクターの複製または望ましい
カルボニルヒドロラーゼ変異体の発現が可能である。プ
レまたはプレプロ型のカルボニルヒドロラーゼ変異体を
コードするベクターの場合、発現されたこれらの変異体
は宿主細胞から宿主細胞培地へ分泌される。
２つのDNA領域間の関係について使用される“機能的
に結合する”という語句は単にそれらが互いに機能的に
関連することを意味する。たとえばプレ配列はそれがシ
グナル配列の切断を伴った成熟型のタンパク質の分泌に
関与するシグナル配列として機能する場合ペプチドに機
能的に結合している。プロモーターは配列の転写をコン
トロールする場合コード配列に機能的に結合している。
リボソーム結合部位は翻訳を可能とする位置に存在する
場合コード配列に機能的に結合している。
に結合する”という語句は単にそれらが互いに機能的に
関連することを意味する。たとえばプレ配列はそれがシ
グナル配列の切断を伴った成熟型のタンパク質の分泌に
関与するシグナル配列として機能する場合ペプチドに機
能的に結合している。プロモーターは配列の転写をコン
トロールする場合コード配列に機能的に結合している。
リボソーム結合部位は翻訳を可能とする位置に存在する
場合コード配列に機能的に結合している。
天然の前駆体カルボニルヒドロラーゼをコードする遺
伝子はEPO刊行No.0 130 756および0 251 446に報告され
ている一般的方法で得られる。本明細書で公開されてい
る実施例から分るように一般的にこれらの方法には目的
のヒドロラーゼの推定上の配列コード領域を有するラベ
ル化プローブの合成、該ヒドロラーゼを発現する生物由
来のゲノムライブラリーの調製およびプローブのハイブ
リダイゼーションによるライブラリーからの目的遺伝子
のスクリーニングが含まれる。それからハイブリダイズ
したポジティブクローンのマッピングおよびシーケンシ
ングを行う。
伝子はEPO刊行No.0 130 756および0 251 446に報告され
ている一般的方法で得られる。本明細書で公開されてい
る実施例から分るように一般的にこれらの方法には目的
のヒドロラーゼの推定上の配列コード領域を有するラベ
ル化プローブの合成、該ヒドロラーゼを発現する生物由
来のゲノムライブラリーの調製およびプローブのハイブ
リダイゼーションによるライブラリーからの目的遺伝子
のスクリーニングが含まれる。それからハイブリダイズ
したポジティブクローンのマッピングおよびシーケンシ
ングを行う。
このクローン化したカルボニルヒドロラーゼを宿主細
胞のトランスホームに用いてヒドロラーゼを発現させ
る。このヒドロラーゼ遺伝子は高コピー数のプラスミド
中に連結する。このプラスミドは複製に必要な要素：問
題の遺伝子に機能的に結合するプロモーター（もし認識
されるならばその遺伝子の自分自身の相同的プロモータ
ーとして供給され得る、すなわち宿主によって転写され
る）、外来の、またはヒドロラーゼ遺伝子の内在性ター
ミネーター領域によって供給される転写終止およびポリ
アデニレーション領域（特定の真核性宿主細胞中のヒド
ロラーゼ遺伝子由来の宿主により転写されるmRNAの安定
性に必要なもの）および望ましくは抗生物質含有培地中
での増殖によりプラスミド感染宿主細胞の連続的培養を
可能にする抗生物質耐性遺伝子などの選択遺伝子を含む
という意味で宿主中で複製する。また高コピー数のプラ
スミドは宿主の複製オリジンが含まれ、これにより染色
体に制限されることなしに多数のプラスミドが細胞質中
に生成し得る。しかし、多数のヒドロラーゼ遺伝子が宿
主ゲノム中に組込まれることも本発明の範囲内に含まれ
る。このことは特に相同組換えを起こす原核性および真
核性生物で容易に起こる。
胞のトランスホームに用いてヒドロラーゼを発現させ
る。このヒドロラーゼ遺伝子は高コピー数のプラスミド
中に連結する。このプラスミドは複製に必要な要素：問
題の遺伝子に機能的に結合するプロモーター（もし認識
されるならばその遺伝子の自分自身の相同的プロモータ
ーとして供給され得る、すなわち宿主によって転写され
る）、外来の、またはヒドロラーゼ遺伝子の内在性ター
ミネーター領域によって供給される転写終止およびポリ
アデニレーション領域（特定の真核性宿主細胞中のヒド
ロラーゼ遺伝子由来の宿主により転写されるmRNAの安定
性に必要なもの）および望ましくは抗生物質含有培地中
での増殖によりプラスミド感染宿主細胞の連続的培養を
可能にする抗生物質耐性遺伝子などの選択遺伝子を含む
という意味で宿主中で複製する。また高コピー数のプラ
スミドは宿主の複製オリジンが含まれ、これにより染色
体に制限されることなしに多数のプラスミドが細胞質中
に生成し得る。しかし、多数のヒドロラーゼ遺伝子が宿
主ゲノム中に組込まれることも本発明の範囲内に含まれ
る。このことは特に相同組換えを起こす原核性および真
核性生物で容易に起こる。
別に、天然または変異した前駆体カルボニルヒドロラ
ーゼをコードする合成遺伝子を生成し得る。このような
方法においては前駆体ヒドロラーゼのDNAおよびアミノ
酸配列が決定される。その後多重重復合成一本鎖DNAフ
ラグメイトを合成し、ハイブリダイゼーションによりラ
イゲーションで前駆体ヒドロラーゼをコードする合成DN
Aを構築する。この方法はカルボニルヒドロラーゼ変異
体を作るための修正を容易にするためコードされている
アミノ酸配列を変化させることなく制限部位をそのDNA
に配置しなければならない天然の遺伝子のクローニング
を越えていくつかの利点は提供する。さらに、この合成
法は合成遺伝子のコドン採用の調整に関して使用する特
定の発現宿主のコドンの偏りを満足させ得る。合成遺伝
子構築の例を実施例に示す。
ーゼをコードする合成遺伝子を生成し得る。このような
方法においては前駆体ヒドロラーゼのDNAおよびアミノ
酸配列が決定される。その後多重重復合成一本鎖DNAフ
ラグメイトを合成し、ハイブリダイゼーションによりラ
イゲーションで前駆体ヒドロラーゼをコードする合成DN
Aを構築する。この方法はカルボニルヒドロラーゼ変異
体を作るための修正を容易にするためコードされている
アミノ酸配列を変化させることなく制限部位をそのDNA
に配置しなければならない天然の遺伝子のクローニング
を越えていくつかの利点は提供する。さらに、この合成
法は合成遺伝子のコドン採用の調整に関して使用する特
定の発現宿主のコドンの偏りを満足させ得る。合成遺伝
子構築の例を実施例に示す。
一度天然または合成前駆体カルボニルヒドロラーゼが
クローン化されれば多くの修正を加えて天然の前駆体カ
ルボニルヒドロラーゼの合成の範囲を越えたその遺伝子
の使用を促進させることができる。このような修正には
EPO刊行No.10 130 756および0 251 446に公開されてい
る組換えカルボニルヒドロラーゼの生産および本明細書
に述べられているカルボニルヒドロラーゼ変異体の生産
を含まれる。
クローン化されれば多くの修正を加えて天然の前駆体カ
ルボニルヒドロラーゼの合成の範囲を越えたその遺伝子
の使用を促進させることができる。このような修正には
EPO刊行No.10 130 756および0 251 446に公開されてい
る組換えカルボニルヒドロラーゼの生産および本明細書
に述べられているカルボニルヒドロラーゼ変異体の生産
を含まれる。
部位指定突然変異誘発を含む他の方法も使用できるが
以下に示すカセット突然変異誘発法は本発明のカルボニ
ルヒドロラーゼ変異体の構築および同定に使用し得る。
第１にヒドロラーゼをコードする天然の遺伝子を入手
し、全部またはその一部をシーケンシングする。それか
らこの配列をコードされる酵素中の１つ以上のアミノ酸
に変異（欠失、挿入または置換）を起こすのに望ましい
点についてスキャンする。この点に隣接する配列を発現
された時、種々の変異体をコードする遺伝子の短かいセ
グメントを置換するため制限部位の有無を評価する。こ
れらの制限部位とその遺伝子セグメントの置換が可能な
ようにヒドロラーゼ遺伝子内に唯一存在することが望ま
しい。しかし、もし制限消化により生成する遺伝子セグ
メントが適当な配列に再構成されるならばヒドロラーゼ
遺伝子中に豊富に存在しない簡便な制限部位ならどれで
も使用し得る。もし制限部位が選択した点から簡便な距
離（10〜15ヌクレオチド）内に存在しないならばこれら
の部位は最終構築物中読み枠およびコードされるアミノ
酸のいずれも変化させない様にその遺伝子中のヌクレオ
チドを置換することにより作成する。望ましい配列を満
足させるようにその配列を変化させる遺伝子の突然変異
は従来法に従ったM13プロイマー伸長により達成され
る。適当な隣接領域を設けたりまた２つの簡便な制限部
位配列を作るために必要な変化を評価する仕事は遺伝子
コードの縮退、その遺伝子の制限地図および多種類の制
限酵素によりルーチンに行なわれている。もし簡便な隣
接制限部位が入手できれば上記方法はその部位を含まな
い隣接領域と合せてのみ用いる必要があることに注意せ
よ。
以下に示すカセット突然変異誘発法は本発明のカルボニ
ルヒドロラーゼ変異体の構築および同定に使用し得る。
第１にヒドロラーゼをコードする天然の遺伝子を入手
し、全部またはその一部をシーケンシングする。それか
らこの配列をコードされる酵素中の１つ以上のアミノ酸
に変異（欠失、挿入または置換）を起こすのに望ましい
点についてスキャンする。この点に隣接する配列を発現
された時、種々の変異体をコードする遺伝子の短かいセ
グメントを置換するため制限部位の有無を評価する。こ
れらの制限部位とその遺伝子セグメントの置換が可能な
ようにヒドロラーゼ遺伝子内に唯一存在することが望ま
しい。しかし、もし制限消化により生成する遺伝子セグ
メントが適当な配列に再構成されるならばヒドロラーゼ
遺伝子中に豊富に存在しない簡便な制限部位ならどれで
も使用し得る。もし制限部位が選択した点から簡便な距
離（10〜15ヌクレオチド）内に存在しないならばこれら
の部位は最終構築物中読み枠およびコードされるアミノ
酸のいずれも変化させない様にその遺伝子中のヌクレオ
チドを置換することにより作成する。望ましい配列を満
足させるようにその配列を変化させる遺伝子の突然変異
は従来法に従ったM13プロイマー伸長により達成され
る。適当な隣接領域を設けたりまた２つの簡便な制限部
位配列を作るために必要な変化を評価する仕事は遺伝子
コードの縮退、その遺伝子の制限地図および多種類の制
限酵素によりルーチンに行なわれている。もし簡便な隣
接制限部位が入手できれば上記方法はその部位を含まな
い隣接領域と合せてのみ用いる必要があることに注意せ
よ。
一度天然DNAまたは合成DNAがクローン化されれば変異
させる部位に隣接する制限部位を同種の制限酵素で消化
し、多くの末端相補的オリゴヌクレオチドカセットをそ
の遺伝子中にライゲーションできる。全てのオリゴヌク
レオチドは同じ制限部位を持つよう合成でき、かつ合成
リンカーは制限部位を作る必要がないので突然変異誘発
はこの方法により著しく簡素化される。本明細書で用い
られるようにたんぱく質分解活性とは活性酵素ミリグラ
ム当りのペプチド結合の加水分解速度と定義される。た
んぱく質分解活性を測定する多くの方法が知られている
（K.M.カリス（Kalisz）、“微生物プロテイナーゼ”、
Advances in Biochemicao Engineering/Biotechnology,
A.フィークター（Fiechter）編、1988）。
させる部位に隣接する制限部位を同種の制限酵素で消化
し、多くの末端相補的オリゴヌクレオチドカセットをそ
の遺伝子中にライゲーションできる。全てのオリゴヌク
レオチドは同じ制限部位を持つよう合成でき、かつ合成
リンカーは制限部位を作る必要がないので突然変異誘発
はこの方法により著しく簡素化される。本明細書で用い
られるようにたんぱく質分解活性とは活性酵素ミリグラ
ム当りのペプチド結合の加水分解速度と定義される。た
んぱく質分解活性を測定する多くの方法が知られている
（K.M.カリス（Kalisz）、“微生物プロテイナーゼ”、
Advances in Biochemicao Engineering/Biotechnology,
A.フィークター（Fiechter）編、1988）。
本発明の１つの特徴としてその目的は前駆体カルボニ
ルヒドロラーゼと比べてより大きい（数値的に大きい）
たんぱく質分解活性を有するカルボニルヒドロラーゼ変
異体を得、これを使用して標的基質により効率よく作用
させることである。バチルス アミロリクエファシエン
ス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシン中の＋
123に等価な残基部位にあるズブチリシン型カルボニル
ヒドロラーゼにそのような結果をもたらすのに有効な特
定のアミノ酸が実施例に示されている。
ルヒドロラーゼと比べてより大きい（数値的に大きい）
たんぱく質分解活性を有するカルボニルヒドロラーゼ変
異体を得、これを使用して標的基質により効率よく作用
させることである。バチルス アミロリクエファシエン
ス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシン中の＋
123に等価な残基部位にあるズブチリシン型カルボニル
ヒドロラーゼにそのような結果をもたらすのに有効な特
定のアミノ酸が実施例に示されている。
ある場合にはより低いたんぱく質活性が望ましいこと
もある。このような場合、たんぱく質活性の減少はバチ
ルス アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqv
efaciens）ズブチリシン中＋123に等価な残基部位を実
施例で同定されたアミノ酸に置換することにより達成さ
れる。
もある。このような場合、たんぱく質活性の減少はバチ
ルス アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqv
efaciens）ズブチリシン中＋123に等価な残基部位を実
施例で同定されたアミノ酸に置換することにより達成さ
れる。
バチルス アミロリクエファシエンス（Bacillus amy
loliqvefaciens）ズブチリシン＋123に等価な部位の残
基がセリンではない前駆体ズブチリシンの場合、その前
駆体の部位＋123にセリンを用いたとき最高のたんぱく
質分解活性が得られる。さらに、バチルス アミロリク
エファシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチ
リシン中の＋123に等価な部位にセリンを含む天然のバ
チルス（Bacillus）ズブチリシンが存在することは知ら
れていない。この部位のセリンがたんぱく質分解活性を
増加するという発見に基づき、この部位にセリンを含む
天然の変異体を同定かつクローン化するために天然のバ
チルス（Bacillus）ズブチリシンをスクリーニングし得
る。このような天然のバチルス（Bacillus）ズブチリシ
ン変異体も本発明の範囲内にある。
loliqvefaciens）ズブチリシン＋123に等価な部位の残
基がセリンではない前駆体ズブチリシンの場合、その前
駆体の部位＋123にセリンを用いたとき最高のたんぱく
質分解活性が得られる。さらに、バチルス アミロリク
エファシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチ
リシン中の＋123に等価な部位にセリンを含む天然のバ
チルス（Bacillus）ズブチリシンが存在することは知ら
れていない。この部位のセリンがたんぱく質分解活性を
増加するという発見に基づき、この部位にセリンを含む
天然の変異体を同定かつクローン化するために天然のバ
チルス（Bacillus）ズブチリシンをスクリーニングし得
る。このような天然のバチルス（Bacillus）ズブチリシ
ン変異体も本発明の範囲内にある。
カルボニルヒドロラーゼがバチルス（Bacillus）以外
のものに由来し、かつセリンがその前駆体酵素の＋123
よ存在する場合、その置換はたんぱく質分解活性を減少
させるものであり得る。このことはカルボニルヒドロラ
ーゼの合成活性（ペプチド合成に関して）が望まれる場
合に有用である。このような合成の産物を破壊し得るた
んぱく質分解活性が減少することが望まれる。
のものに由来し、かつセリンがその前駆体酵素の＋123
よ存在する場合、その置換はたんぱく質分解活性を減少
させるものであり得る。このことはカルボニルヒドロラ
ーゼの合成活性（ペプチド合成に関して）が望まれる場
合に有用である。このような合成の産物を破壊し得るた
んぱく質分解活性が減少することが望まれる。
本発明のもう１つの特徴として、バチルス アミロリ
クエファシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブ
チリシン中の＋274と等価な残基は洗剤組成物中この酵
素の全体的性能を調節する上で重要であることが分っ
た。実施例に示したように、等価部位＋274におけるバ
チルス レンタス（Bacillus lentus）ズブチリシンの
スレオニンは好ましい態様中アラニンに変異して性能が
増加した変異酵素を提供し得る。また実施例で公開して
いるように、スレオニン以外のアミノ酸、たとえばロイ
シン、セリン、バリンおよびアラニンによるこの残基の
置換はこの変異体の安定性を減少させる。このような安
定性の減少はこの変異体の自己触媒的分解の結果である
と考えられている。このようにバチルス（Bacillus）ズ
ブチリシンの＋274と等価な残基の修正は洗剤組成物中
その酵素の全体的性能を増加し、かつその酵素の全体的
安定性を調節し得る。本発明のこの特徴において、その
目的は洗剤組成物中で用いたとき前駆体カルボニルヒド
ロラーゼに比べて性能の高いカルボニルヒドロラーゼ変
異体を探すことにある。本明細書で用いられているよう
に、洗剤中の性能の増加とは草や血液など特定の酵素感
受性のしみのクリーニング能力の増加と定義される。こ
のクリーニング能は標準的洗浄サイクル後の目視観察で
決定する。
クエファシエンス（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブ
チリシン中の＋274と等価な残基は洗剤組成物中この酵
素の全体的性能を調節する上で重要であることが分っ
た。実施例に示したように、等価部位＋274におけるバ
チルス レンタス（Bacillus lentus）ズブチリシンの
スレオニンは好ましい態様中アラニンに変異して性能が
増加した変異酵素を提供し得る。また実施例で公開して
いるように、スレオニン以外のアミノ酸、たとえばロイ
シン、セリン、バリンおよびアラニンによるこの残基の
置換はこの変異体の安定性を減少させる。このような安
定性の減少はこの変異体の自己触媒的分解の結果である
と考えられている。このようにバチルス（Bacillus）ズ
ブチリシンの＋274と等価な残基の修正は洗剤組成物中
その酵素の全体的性能を増加し、かつその酵素の全体的
安定性を調節し得る。本発明のこの特徴において、その
目的は洗剤組成物中で用いたとき前駆体カルボニルヒド
ロラーゼに比べて性能の高いカルボニルヒドロラーゼ変
異体を探すことにある。本明細書で用いられているよう
に、洗剤中の性能の増加とは草や血液など特定の酵素感
受性のしみのクリーニング能力の増加と定義される。こ
のクリーニング能は標準的洗浄サイクル後の目視観察で
決定する。
本発明の好ましい態様はバチルス レンタス（Bacill
us lentus）ズブチリシンにおいて部位27のリジンがア
ルギンと、部位104のバリンがチロシンと、部位123のア
スパラギンがセリンと、および部位274のスレオニンが
アラニンと置換したものを実施例に示す。この酵素の安
定性は前駆体バチルス レンタス（Bacillus lentus）
ズブチリシンよりもいくぶん低下するが、洗剤組成物中
でのこの酵素の性能は実質的に増加し、未修正のバチル
スレンタス（Bacillus lentus）ズブチリシンと比べた
ときこのバチルスレンタス（Bacillus lentus）ズブチ
リシン変異体は約半分量で同様の性能を示す。
us lentus）ズブチリシンにおいて部位27のリジンがア
ルギンと、部位104のバリンがチロシンと、部位123のア
スパラギンがセリンと、および部位274のスレオニンが
アラニンと置換したものを実施例に示す。この酵素の安
定性は前駆体バチルス レンタス（Bacillus lentus）
ズブチリシンよりもいくぶん低下するが、洗剤組成物中
でのこの酵素の性能は実質的に増加し、未修正のバチル
スレンタス（Bacillus lentus）ズブチリシンと比べた
ときこのバチルスレンタス（Bacillus lentus）ズブチ
リシン変異体は約半分量で同様の性能を示す。
これやこれ以外のズブチリシン変異体を用いて得られ
た結果に基づきバチルス アミロリクエファシエンス
（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシン中の部位
＋123および＋274と等価なカルボニルヒドロラーゼ中の
残基はこれらの酵素のたんぱく質分解活性、性能およ
び、または安定性に重要であることは明白である。
た結果に基づきバチルス アミロリクエファシエンス
（Bacillus amyloliqvefaciens）ズブチリシン中の部位
＋123および＋274と等価なカルボニルヒドロラーゼ中の
残基はこれらの酵素のたんぱく質分解活性、性能およ
び、または安定性に重要であることは明白である。
本発明の多くのカルボニルヒドロラーゼ変異体、特に
ズブチリシンは種々の洗剤組成物を調合するのに有効で
ある。本発明のカルボニルヒドロラーゼ変異体を含む組
成物に適した洗剤は多く知られている。それらには非イ
オン性、アニオン性、カチオン性、または両性イオン性
の洗剤が含まれる（バリー（Barry）、J.アンダーソン
（Anderson）、U.S.4,402,128およびジリ フローラ（J
iri Flora）等、U.S.4,261,868参照）。この分野ではク
リーニング組成物として用い得る種々の成型物が知られ
ている。
ズブチリシンは種々の洗剤組成物を調合するのに有効で
ある。本発明のカルボニルヒドロラーゼ変異体を含む組
成物に適した洗剤は多く知られている。それらには非イ
オン性、アニオン性、カチオン性、または両性イオン性
の洗剤が含まれる（バリー（Barry）、J.アンダーソン
（Anderson）、U.S.4,402,128およびジリ フローラ（J
iri Flora）等、U.S.4,261,868参照）。この分野ではク
リーニング組成物として用い得る種々の成型物が知られ
ている。
本発明のズブチリシンは約0.01乃至約５重量パーセン
ト、好ましくは0.1乃至0.05重量パーセントのレベル
で、6.5乃至12.0のpH値を有する粉末および液体の洗剤
に成型し得る。またこれらのクリーニング組成物には成
型剤や安定剤同様他の酵素も含み得る。
ト、好ましくは0.1乃至0.05重量パーセントのレベル
で、6.5乃至12.0のpH値を有する粉末および液体の洗剤
に成型し得る。またこれらのクリーニング組成物には成
型剤や安定剤同様他の酵素も含み得る。
従来のクリーニング組成物への本発明のズブチリシン
の添加はいかなる特定の使用制限を産まない。他言すれ
ば、その洗剤に適したいかなる温度およびpH値もpH値が
上記範囲内に含まれ、かつ温度が本発明のズブチリシン
変性温度以下であるかぎり本発明の組成物に適してい
る。さらに本発明のズブチリシンはそれ自体または成型
剤および安定化剤と組合せて洗剤を含まないクリーニン
グ組成物に使用し得る。
の添加はいかなる特定の使用制限を産まない。他言すれ
ば、その洗剤に適したいかなる温度およびpH値もpH値が
上記範囲内に含まれ、かつ温度が本発明のズブチリシン
変性温度以下であるかぎり本発明の組成物に適してい
る。さらに本発明のズブチリシンはそれ自体または成型
剤および安定化剤と組合せて洗剤を含まないクリーニン
グ組成物に使用し得る。
以下に実施例を示すが、これらは請求の範囲を制限す
るものではない。
るものではない。
（実施例１） （枯草菌におけるバチルスレンタス（Bacillus lentu
s）ズブチリシン遺伝子発現のための構築物） プラスミドpSAR（第５図）は枯草菌（B.Subrilis）お
よびB.アミロリクエファシエンス（amylolifaciens）の
ズブチリシン遺伝子の７番目/8番目のシグナル配列コド
ンに共通のSan3A制限部位を介して翻訳融合物を有して
いる。第５図に示されているように、EcoR I−BamH I2.
0kbフラグメント上のこの遺伝子をM13mp19にサブクロー
ンし、部位指定突然変異誘発に使用する一本鎖テンプレ
ートDNAを単離するためのpSAR−Q275Rを作製した。突然
変異誘発は基本的にゾラー（Zoller）、M.等の方法（19
83）、Methods Enzymol、100、468−500、（１））を用
い、かつ以下に示す配列： （式中アステリスクは野生型遺伝子の配列からの変化を
示し、また下線はQ275R変化をコードする特定の変異体
遺伝子をスクリーニングするのに使用するため導入した
Pst I制限エンドヌクレアーゼ部位を表わしている） で表わされる合成オリゴヌクレオチドを使用して行っ
た。これらの変化は（１）バチルスレンタス（Bacillus
lentus）ズブチリシンに存在するアミノ酸にこの部位
のアミノ酸を変換するもの、およびバチルス レンタス
（Bacillus lentus）（ATCC21536）由来のpGG36に同様
に導入されたPst部位を介してバチルスレンタス（Bacil
lus lentus）の成熟コード領域にpSAR中のターミネータ
ーを連結させるもの（２）である。
s）ズブチリシン遺伝子発現のための構築物） プラスミドpSAR（第５図）は枯草菌（B.Subrilis）お
よびB.アミロリクエファシエンス（amylolifaciens）の
ズブチリシン遺伝子の７番目/8番目のシグナル配列コド
ンに共通のSan3A制限部位を介して翻訳融合物を有して
いる。第５図に示されているように、EcoR I−BamH I2.
0kbフラグメント上のこの遺伝子をM13mp19にサブクロー
ンし、部位指定突然変異誘発に使用する一本鎖テンプレ
ートDNAを単離するためのpSAR−Q275Rを作製した。突然
変異誘発は基本的にゾラー（Zoller）、M.等の方法（19
83）、Methods Enzymol、100、468−500、（１））を用
い、かつ以下に示す配列： （式中アステリスクは野生型遺伝子の配列からの変化を
示し、また下線はQ275R変化をコードする特定の変異体
遺伝子をスクリーニングするのに使用するため導入した
Pst I制限エンドヌクレアーゼ部位を表わしている） で表わされる合成オリゴヌクレオチドを使用して行っ
た。これらの変化は（１）バチルスレンタス（Bacillus
lentus）ズブチリシンに存在するアミノ酸にこの部位
のアミノ酸を変換するもの、およびバチルス レンタス
（Bacillus lentus）（ATCC21536）由来のpGG36に同様
に導入されたPst部位を介してバチルスレンタス（Bacil
lus lentus）の成熟コード領域にpSAR中のターミネータ
ーを連結させるもの（２）である。
プラスミドpGG36（第５図）にはシャトルベクターpBS
42に標準的方法でクローン化される完全なズブチリシン
遺伝子をコードするバチルス レンタス（Bacillus len
tus）（ATCC21536）由来の2.1kbゲノムDNAフラグメント
が含まれる。バンド（Band）、2.等（1984）、DNA、
３、17−21。
42に標準的方法でクローン化される完全なズブチリシン
遺伝子をコードするバチルス レンタス（Bacillus len
tus）（ATCC21536）由来の2.1kbゲノムDNAフラグメント
が含まれる。バンド（Band）、2.等（1984）、DNA、
３、17−21。
このズブチリシンのアミノ酸配列はPCT刊行No.89/062
79のズブチリシン309に関して公開されているものと同
じである。この遺伝子をpSARに導入した部位に対応する
この遺伝子中の同じ位置にPst I部位を導入するため
１）、および部位274のスレオニンをアラニンに置換し
てpGG36−T274Aを構築するため２）、以下の配列： で表わされるオリゴヌクレオチドを用いた部位指定突然
変異誘発のため上述の方法でM13にサブクローン化し
た。変異体pSAR−Q275RおよびpGG36−T274A遺伝子を各
々Pst I/BamH I消化、フラグメント単離およびライゲー
ションの前pBS42にサブクローンし直して第５図に示し
たプラスミドGG−A274B、amy.term.を作製した（全て標
準法による）。
79のズブチリシン309に関して公開されているものと同
じである。この遺伝子をpSARに導入した部位に対応する
この遺伝子中の同じ位置にPst I部位を導入するため
１）、および部位274のスレオニンをアラニンに置換し
てpGG36−T274Aを構築するため２）、以下の配列： で表わされるオリゴヌクレオチドを用いた部位指定突然
変異誘発のため上述の方法でM13にサブクローン化し
た。変異体pSAR−Q275RおよびpGG36−T274A遺伝子を各
々Pst I/BamH I消化、フラグメント単離およびライゲー
ションの前pBS42にサブクローンし直して第５図に示し
たプラスミドGG−A274B、amy.term.を作製した（全て標
準法による）。
合成DNAリンカーは以下に示す配列： および、 の相補的一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールし第６図
に示した二本鎖DNAフラグメント＃２とすることにより
作製した。この二本鎖リンカーの切断された左および右
側末端は各々フラグメント＃１（pSAR由来）のSau3A末
端およびフラグメント＃３（pGG−A274B、amy、term由
来）のCla I末端に相補的である。これら３つのフラグ
メントを標準法によるプラスミドの制限エンドヌクレア
ーゼ消化、フラグメント単離およびライゲーション後pS
AR−Q275R由来のフラグメント４と合せてプラスミドpGG
−KVNAを生成した。名称GG−KVNAは、このズブチリシン
が部位27にリジン（Ｋ）、部位104にバリン（Ｖ）、部
位123にアスパラギン（Ｎ）および部位274のスレオニン
のアラニン（Ａ）による置換を含むpGG−36によりコー
ドされるズブチリシンを含むことを示している。
に示した二本鎖DNAフラグメント＃２とすることにより
作製した。この二本鎖リンカーの切断された左および右
側末端は各々フラグメント＃１（pSAR由来）のSau3A末
端およびフラグメント＃３（pGG−A274B、amy、term由
来）のCla I末端に相補的である。これら３つのフラグ
メントを標準法によるプラスミドの制限エンドヌクレア
ーゼ消化、フラグメント単離およびライゲーション後pS
AR−Q275R由来のフラグメント４と合せてプラスミドpGG
−KVNAを生成した。名称GG−KVNAは、このズブチリシン
が部位27にリジン（Ｋ）、部位104にバリン（Ｖ）、部
位123にアスパラギン（Ｎ）および部位274のスレオニン
のアラニン（Ａ）による置換を含むpGG−36によりコー
ドされるズブチリシンを含むことを示している。
（実施例２） （pGG−KVNAの修正） 第６図に示されているように、配列： および を有するオリゴヌクレオチドを用いた３回連続の部位指
定突然変異誘発を行うためGG−KVNA遺伝子（2.1kb EcoR
I−BamH Iフラグメント）をM13にサブクローニングし
た。アステリスクは野生型遺伝子からの変化を示してい
る。下線は各々連結されたR27、Y104およびS123変異の
存在に関するスクリーニングに用いるため導入されたXb
a部位（ａ）およびNhe I部位（ｂとｃ）を表わしてい
る。さらに（ｃ）の場合、上線は破壊されたSph I部を
表わしている。最後に枯草菌宿主で発現させるため2.1k
b GG−RYSA遺伝子をpBS42にサブクローニングした。
定突然変異誘発を行うためGG−KVNA遺伝子（2.1kb EcoR
I−BamH Iフラグメント）をM13にサブクローニングし
た。アステリスクは野生型遺伝子からの変化を示してい
る。下線は各々連結されたR27、Y104およびS123変異の
存在に関するスクリーニングに用いるため導入されたXb
a部位（ａ）およびNhe I部位（ｂとｃ）を表わしてい
る。さらに（ｃ）の場合、上線は破壊されたSph I部を
表わしている。最後に枯草菌宿主で発現させるため2.1k
b GG−RYSA遺伝子をpBS42にサブクローニングした。
生成したプラスミドをpGG−RYSAと命名した。この名
称はpGG−KVNAプラスミド４個の残基が変化しているこ
とを示している。部位27のリジン（Ｋ）がアルギニン
（Ｒ）へ、部位104のバリン（Ｖ）がチロシン（Ｙ）
へ、部位103のアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）に。
残基274の先に置換しているアラニンはこの操作では変
化しない。部位27のリジンはズブチリシン309のアミノ
酸シーケンシングに基づくとアルギニンに置換してい
た。PCT刊行No.WO 89/06279に示されているように部位2
7はリジンである。しかし、このズブチリシンたんぱく
質を独立にシーケンシングすると最初のデータはアルギ
ニンが部位27の残基であることを示した。残基104のバ
リンのチロシンによる置換の場合、この置換はバチルス
アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefac
iens）ズブチリシン（しばしばBPN′と呼ばれる）につ
いて先に得られた結果と比べてpH活性プロフィールを低
下させかつ酵素の性能を増加した。部位123のアスパラ
ギンのセリンによる置換は後に得られる結果に基づいて
いる。その結果では部位123のセリンの置換は関連変異
体においてその酵素のタンパク質分解活性を最高のもの
にすることが測定された。
称はpGG−KVNAプラスミド４個の残基が変化しているこ
とを示している。部位27のリジン（Ｋ）がアルギニン
（Ｒ）へ、部位104のバリン（Ｖ）がチロシン（Ｙ）
へ、部位103のアスパラギン（Ｎ）がセリン（Ｓ）に。
残基274の先に置換しているアラニンはこの操作では変
化しない。部位27のリジンはズブチリシン309のアミノ
酸シーケンシングに基づくとアルギニンに置換してい
た。PCT刊行No.WO 89/06279に示されているように部位2
7はリジンである。しかし、このズブチリシンたんぱく
質を独立にシーケンシングすると最初のデータはアルギ
ニンが部位27の残基であることを示した。残基104のバ
リンのチロシンによる置換の場合、この置換はバチルス
アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefac
iens）ズブチリシン（しばしばBPN′と呼ばれる）につ
いて先に得られた結果と比べてpH活性プロフィールを低
下させかつ酵素の性能を増加した。部位123のアスパラ
ギンのセリンによる置換は後に得られる結果に基づいて
いる。その結果では部位123のセリンの置換は関連変異
体においてその酵素のタンパク質分解活性を最高のもの
にすることが測定された。
（実施例３） （合成バチルス レンタスズブチリシン遺伝子の構築） バチルス レンタス（Bacillus lenlt）ズブチリシン
のアミノ酸配列をコードするDNAは合成DNA配列をコード
する遺伝子を構築することによって調製した。
のアミノ酸配列をコードするDNAは合成DNA配列をコード
する遺伝子を構築することによって調製した。
プラスミドpGG36由来の2.1kb Hind IIIゲノムフラグ
メントをシーケンシングした。成熟型遺伝子産物（GG36
ズブチリシン）のアミノ酸配列を誘導して以下の性質を
有する合成熟成コード配列を設計した。（１）一般に、
その遺伝子中都合の良い位置に制限酵素部位を生ずる場
合以外、７種の枯草菌遺伝子（マルヤマ（Maruyama）、
T.、等、（1986）、Nucl.Acids Res,Supplement 14、pp
r151−r197の第２表使用コドン表から）中の各アミノ
酸に対してもっとも高頻度に使用されているコドンを用
いた。（２）〜0.8成熟コード領域の約40〜60p.b.毎に
２または３個の特別に選択したしコドンを組合せること
により非常に均等に間隔をもったユニークな制限部位を
導入した。これらの部位は（ａ）後に行なうカセット突
然変異誘発および（ｂ）１つ以上の変異を含めた構築を
容易にするように選択した。（３）ユニークなPst I制
限部位が同じ３つのコドンを同様に修正したバチルス
アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefacie
ns）のターミネーター配列までの連結を可能にし、かつ
部位274のスレオニンをアラニンで置換したコドン272−
274に含まれるように設計した。（４）ユニークなNru I
部位が合成二本鎖DNAリンカーを介してGC36プレプロコ
ード配列への連結が可能なように成熟コドン残基９−10
をカバーするよう導入した。この設設に基づきオリゴヌ
クレオチド（“オリゴ”）を合成した。この結果所定の
〜60b.p.コード領域にコードおよび非コードオリゴをア
ニーリングすることにより生成した二本鎖DNAフラグメ
ントはその遺伝子の次の二本鎖フラグメントの末端に相
補的な末端一本鎖領域を有することになる（第７図参
照）。
メントをシーケンシングした。成熟型遺伝子産物（GG36
ズブチリシン）のアミノ酸配列を誘導して以下の性質を
有する合成熟成コード配列を設計した。（１）一般に、
その遺伝子中都合の良い位置に制限酵素部位を生ずる場
合以外、７種の枯草菌遺伝子（マルヤマ（Maruyama）、
T.、等、（1986）、Nucl.Acids Res,Supplement 14、pp
r151−r197の第２表使用コドン表から）中の各アミノ
酸に対してもっとも高頻度に使用されているコドンを用
いた。（２）〜0.8成熟コード領域の約40〜60p.b.毎に
２または３個の特別に選択したしコドンを組合せること
により非常に均等に間隔をもったユニークな制限部位を
導入した。これらの部位は（ａ）後に行なうカセット突
然変異誘発および（ｂ）１つ以上の変異を含めた構築を
容易にするように選択した。（３）ユニークなPst I制
限部位が同じ３つのコドンを同様に修正したバチルス
アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliqvefacie
ns）のターミネーター配列までの連結を可能にし、かつ
部位274のスレオニンをアラニンで置換したコドン272−
274に含まれるように設計した。（４）ユニークなNru I
部位が合成二本鎖DNAリンカーを介してGC36プレプロコ
ード配列への連結が可能なように成熟コドン残基９−10
をカバーするよう導入した。この設設に基づきオリゴヌ
クレオチド（“オリゴ”）を合成した。この結果所定の
〜60b.p.コード領域にコードおよび非コードオリゴをア
ニーリングすることにより生成した二本鎖DNAフラグメ
ントはその遺伝子の次の二本鎖フラグメントの末端に相
補的な末端一本鎖領域を有することになる（第７図参
照）。
先に概説したように図中では全部で36個のオリゴ（18
個の二本鎖を含む）を用い、〜0.8kb二本鎖合成成熟コ
ード領域を生成する（第８図フラグメント３）。
個の二本鎖を含む）を用い、〜0.8kb二本鎖合成成熟コ
ード領域を生成する（第８図フラグメント３）。
最後にもう１つのペアまたは合成オリゴを合成する、
これらがアニールすると（第８図フラグメント２を与え
る）その５′末端にNco I部位（成熟コドン５−６のGG3
6Nco I部位に相補的）および３′末端にNru I部位（フ
ラグメント３の５′末端に相補的）が生ずる。
これらがアニールすると（第８図フラグメント２を与え
る）その５′末端にNco I部位（成熟コドン５−６のGG3
6Nco I部位に相補的）および３′末端にNru I部位（フ
ラグメント３の５′末端に相補的）が生ずる。
枯草菌プロモーターおよびシグナル配列の残りの部分
をコードするGG36配列まで連結するシグナル配列の最初
の７個のアミノ酸、完全なプロ配列および最初の６個の
成熟アミノ酸（GG−KVNA由来のフラグメント１）、成熟
残基７〜274をコードする合成遺伝子（フラグメント２
＋３）およびバチルス アミロリクエファシエンス（Ba
cillus amyloliqvefaciens）のターミネーター領域（最
後の成熟遺伝子コドン279）（フラグメント４）を含む
完全な発現ユニットを与える最終的構築は第６図に示し
たフォーウェイライゲーションで行った。
をコードするGG36配列まで連結するシグナル配列の最初
の７個のアミノ酸、完全なプロ配列および最初の６個の
成熟アミノ酸（GG−KVNA由来のフラグメント１）、成熟
残基７〜274をコードする合成遺伝子（フラグメント２
＋３）およびバチルス アミロリクエファシエンス（Ba
cillus amyloliqvefaciens）のターミネーター領域（最
後の成熟遺伝子コドン279）（フラグメント４）を含む
完全な発現ユニットを与える最終的構築は第６図に示し
たフォーウェイライゲーションで行った。
最後に、この全長ハイブリッド遺伝子の成熟コード領
域に別に３つの変異を導入した。最初は部位27のリジン
をアルギニンで置換した。第２は部位104のバリンをチ
ロシンで置換した。第３は部位123のアスパラギンをセ
リンで置換した。生成したプラスミドはpBC3−RYSAと命
名した。以下の実施例は合成遺伝子中の部位123を修正
するのに用いた方法を示している。同様の方法を用いて
この合成遺伝子中の部位27および104も修正した。
域に別に３つの変異を導入した。最初は部位27のリジン
をアルギニンで置換した。第２は部位104のバリンをチ
ロシンで置換した。第３は部位123のアスパラギンをセ
リンで置換した。生成したプラスミドはpBC3−RYSAと命
名した。以下の実施例は合成遺伝子中の部位123を修正
するのに用いた方法を示している。同様の方法を用いて
この合成遺伝子中の部位27および104も修正した。
（実施例４） （部位123変異体の構築） 部位指定突然変異誘発により（M13におけるプライマ
ー伸長突然変異誘発）３つの発現型的サイレント変異を
起こすことで実施例３の合成遺伝子のコドン111/112にX
ho I部位を導入した。生成したプラスミドpX123（第９
図）をXho IおよびAva Iで消化し、より大きいベクター
含有フラグメントをアガロースゲルからの電気溶出で単
離した。相補的合成オリゴヌクレオチドをアニールし、
pX123ラージフラグメントにライゲーションしてから大
腸菌MM294にトランスホームした。これらのカセットは
部位123に各々天然の20種のアミノ酸をコードしてお
り、かつさらにpX123中Xho IおよびAva I部位間に存在
するSph I部位を破壊するサイレント変異を含んでい
た。大腸菌のトランスホーマントから得たプラスミドは
ユニークなSph I部位の欠失に関してスクリーニングし
た。制限分析のポジティブ（すなわちSph Iネガティ
ブ）プラスミドをシーケンシングしてシャトルベクター
にサブクローン化された目的の部位123変異の存在を確
認し、発現のため枯草菌（Bacillus sunbtilis）BG2036
にトランスホームした。
ー伸長突然変異誘発）３つの発現型的サイレント変異を
起こすことで実施例３の合成遺伝子のコドン111/112にX
ho I部位を導入した。生成したプラスミドpX123（第９
図）をXho IおよびAva Iで消化し、より大きいベクター
含有フラグメントをアガロースゲルからの電気溶出で単
離した。相補的合成オリゴヌクレオチドをアニールし、
pX123ラージフラグメントにライゲーションしてから大
腸菌MM294にトランスホームした。これらのカセットは
部位123に各々天然の20種のアミノ酸をコードしてお
り、かつさらにpX123中Xho IおよびAva I部位間に存在
するSph I部位を破壊するサイレント変異を含んでい
た。大腸菌のトランスホーマントから得たプラスミドは
ユニークなSph I部位の欠失に関してスクリーニングし
た。制限分析のポジティブ（すなわちSph Iネガティ
ブ）プラスミドをシーケンシングしてシャトルベクター
にサブクローン化された目的の部位123変異の存在を確
認し、発現のため枯草菌（Bacillus sunbtilis）BG2036
にトランスホームした。
（実施例５） （種々の＋123変異体の活性） 上述の部位＋123修正変異体によってコードされる各
ズブチリシン変異体のたんぱく質分解活性は遠心した培
養培地を0.1Mトリス（pH8.60）中１％w/vカゼイン溶液
0.04mと混合することにより検定した。37℃、20分間
のインキュベーション後、10％のトリクロロ酢酸（TC
A）により沈澱で反応を停めた。10％TCAによる沈澱後上
清の波長280nmでの吸光度から活性を測定した。
ズブチリシン変異体のたんぱく質分解活性は遠心した培
養培地を0.1Mトリス（pH8.60）中１％w/vカゼイン溶液
0.04mと混合することにより検定した。37℃、20分間
のインキュベーション後、10％のトリクロロ酢酸（TC
A）により沈澱で反応を停めた。10％TCAによる沈澱後上
清の波長280nmでの吸光度から活性を測定した。
酵素BC3−RYSAをコードする合成遺伝子のDNA配列を最
終的に確認する過程において、部位78にセリン（バチル
ス レンタス（Bacillus lentus）ズブチリシンにおけ
るこの位置のアミノ酸）の代りにプロリンがあることが
分った。部位123変異の最初の性質はこの酵素、BC3−RP
YA（部位78にプロリン）でテストした。これらの結果を
第１表に示す。その後この遺伝子のこの領域に相当する
合成DNA二本鎖を置き換えることにより部位78のアミノ
酸をセリンに戻し、第10図に示したDNAおよびアミノ酸
配列を作った。これから分るように部位123におけるAsn
のSerによる置換はたんぱく質分解活性を実質的に増加
させた。ここで議論している種々のズブチリシンの関係
は、部位27、78、104、123および274について第２表に
まとめた。
終的に確認する過程において、部位78にセリン（バチル
ス レンタス（Bacillus lentus）ズブチリシンにおけ
るこの位置のアミノ酸）の代りにプロリンがあることが
分った。部位123変異の最初の性質はこの酵素、BC3−RP
YA（部位78にプロリン）でテストした。これらの結果を
第１表に示す。その後この遺伝子のこの領域に相当する
合成DNA二本鎖を置き換えることにより部位78のアミノ
酸をセリンに戻し、第10図に示したDNAおよびアミノ酸
配列を作った。これから分るように部位123におけるAsn
のSerによる置換はたんぱく質分解活性を実質的に増加
させた。ここで議論している種々のズブチリシンの関係
は、部位27、78、104、123および274について第２表に
まとめた。
（実施例６） （部位274変異体の安定性） BC3−RPYにおける（バチルス レンタス（Bacillus l
entus）ズブチリシン）中部位27はアルギニン、部位78
はプロリンおよび部位104はチロシン）部位274変異体の
安定性を第III表に示した。データは50mM EDTA中37
℃、60分間のインキュベーション後に残存する活性パー
セントで示した。
entus）ズブチリシン）中部位27はアルギニン、部位78
はプロリンおよび部位104はチロシン）部位274変異体の
安定性を第III表に示した。データは50mM EDTA中37
℃、60分間のインキュベーション後に残存する活性パー
セントで示した。
明らかにこの部位の変異は酵素の安定性に影響する。
この部位でのアラニン変異はセリンまたはスレオニンほ
ど安定ではないが、この酵素は先に述べた使用条件下で
はバチルス レンタス（Bacillus lentus）ズブチリシ
ンに比べ秀れた性能を提供する。別の応用については部
位274に他のアミノ酸を使用し得る。
この部位でのアラニン変異はセリンまたはスレオニンほ
ど安定ではないが、この酵素は先に述べた使用条件下で
はバチルス レンタス（Bacillus lentus）ズブチリシ
ンに比べ秀れた性能を提供する。別の応用については部
位274に他のアミノ酸を使用し得る。
（実施例７） （洗剤組成物） 以下の組成のリン酸系洗剤スプレードライ顆粒を調製
した。
した。
水中0.1重量パーセントのこの組成物溶液のpHは10.0
であった。本発明のズブチリシン変異体を含む組成物
（第７図）は、硬度６グレインパーガロン（gpg）（3:1
Ca/Mg）、95゜F（35℃）での洗濯において、0.068mg
活性酵素/g、生産物の濃度でバチルス レンタス（Baci
llus lentus）ズブチリシンと比較したとき、酵素感受
性シミに秀れたクリーニング効果を示した。
であった。本発明のズブチリシン変異体を含む組成物
（第７図）は、硬度６グレインパーガロン（gpg）（3:1
Ca/Mg）、95゜F（35℃）での洗濯において、0.068mg
活性酵素/g、生産物の濃度でバチルス レンタス（Baci
llus lentus）ズブチリシンと比較したとき、酵素感受
性シミに秀れたクリーニング効果を示した。
この出願を通じ一般的１文字および３文字コードで種
々のアミノ酸を参照している。これらのコードは“たん
ぱく質：構造および分子プロテアーゼ”、トーマス（Th
o mas）E.クレイトン（Creighton）編、W.N.フリーマン
（Freeman）、N.Y.、N.Y.（1983）、p.3、に示されても
のと同一である。
々のアミノ酸を参照している。これらのコードは“たん
ぱく質：構造および分子プロテアーゼ”、トーマス（Th
o mas）E.クレイトン（Creighton）編、W.N.フリーマン
（Freeman）、N.Y.、N.Y.（1983）、p.3、に示されても
のと同一である。
以上に本発明の好ましいものについて説明してきた
が、本発明は全体的に理解すれば請求の範囲で定義され
ている本発明の範囲を逸脱することなしに種々の変化や
等価な修正を行うことが可能であることは当業者にとっ
て明白であろう。
が、本発明は全体的に理解すれば請求の範囲で定義され
ている本発明の範囲を逸脱することなしに種々の変化や
等価な修正を行うことが可能であることは当業者にとっ
て明白であろう。
本明細書における全ての刊行物は参考として引用して
いる。
いる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 エステル ディヴィッド アーロン アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94043 マウンテン ヴィュー ダイア ブロー アベニュー 250 (72)発明者 グレイカー トーマス ポール アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94044 パシフィカ マンザニータ ド ライヴ1166 (56)参考文献 特開 平１−85075（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−70075（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−502957（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−502396（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 5/28 C07K 14/00 - 14/825 C11D 3/00 - 3/60 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ／Ｌ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ
Claims (11)
- 【請求項１】図１に示されたバチルス アミロリクエフ
ァシエンスズブチリシンの＋123に対応する部位がセリ
ンで置換され、かつ＋274に対応する部位がアラニンで
置換されている、前駆体ズブチリシンから誘導される天
然には存在しないアミノ酸配列を有するズブチリシン変
異体。 - 【請求項２】バチルスズブチリシンから誘導される請求
項１記載のズブチリシン変異体。 - 【請求項３】バチルス アミロリクエファシエンスズブ
チリシンにおける＋123に対応する部位のアミノ酸残基
がセリンに変化した天然もしくは変異前駆体バチルスズ
ブチリシンから誘導されるたんぱく質分解活性が改良さ
れたバチルスズブチリシン変異体。 - 【請求項４】バチルス ズブチリシン変異体で、以下に
示すアミノ酸配列： を有する変異体。 - 【請求項５】請求項１記載のズブチリシン変異体をコー
ドするDNA。 - 【請求項６】請求項５記載のDNAをコードする発現ベク
ター。 - 【請求項７】請求項６記載の発現ベクターでトランスホ
ームした宿主細胞。 - 【請求項８】たんぱく質を分解し得る酵素的クリーニン
グ組成物で、 ａ）界面活性剤、および ｂ）バチルス アミロリクエファシエンスズブチリシン
の＋123に対応する部位がセリンで置換され、かつ＋274
に対応する部位がアラニンで置換されている、該前駆体
ズブチリシンから誘導される天然には存在しないアミノ
酸配列を有するズブチリシン変異体 を含む組成物。 - 【請求項９】前記ズブチリシンが以下のアミノ酸配列： を有する請求項８記載の組成物。
- 【請求項１０】界面活性剤が洗剤を含む請求項８記載の
組成物。 - 【請求項１１】スプレードライ洗剤顆粒を含む請求項８
記載の組成物。
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