JP3112637B2 - 骨強化剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、骨強化剤及び骨強化飲
食品に関する。本発明の骨強化剤及び骨強化飲食品は、
これを摂取すると骨芽細胞を増殖させ、また破骨細胞の
骨に対する吸収を抑制する作用を有するので、骨粗鬆
症、骨折治療、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の
予防や治療に有用である。

【０００２】

【従来の技術】近年、人口の高齢化に伴い骨粗鬆症、骨
折あるいは腰痛などの種々の骨疾患を患う人が増加する
傾向にある。これは、カルシウムの摂取不足、カルシウ
ム吸収能力の低下及び閉経後のホルモン・アンバランス
などが原因であるとされている。このような高齢化に伴
う骨粗鬆症、骨折及び腰痛などの種々の骨疾患を予防す
るためには、体内の骨量をできるだけ増加させて、最大
骨量(peak bone mass)を高めることが有効であるとされ
ている。そして、最大骨量を高めるということは、まさ
しく骨を強化することに他ならない。また、骨粗鬆症を
予防する方法としては、骨吸収を抑制することも考えら
れる。骨はバランスのとれた吸収と形成を絶えず繰り返
している（リモデリング）が、閉経後ホルモンなどのバ
ランス変化により、骨吸収が骨形成を上回り、これが骨
粗鬆症の原因となる。したがって、骨吸収を抑制し骨量
を一定に保つことにより、結果的に骨を強化することが
可能である。

【０００３】このような現状から、骨を強化する目的
で、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、乳酸カルシウ
ムなどのカルシウム塩や乳清カルシウム、牛骨粉、卵殻
などの天然カルシウム剤を単独に摂取したりあるいはこ
れらのカルシウム類をカゼインホスホペプチドなどのカ
ルシウム吸収促進効果を有する材料と共に飲食品に添加
して摂取したりしている。しかしながら、これらのカル
シウム塩や天然カルシウム剤を飲食品に添加して摂取し
た場合、カルシウムの吸収率は50％以下であり、半分以
上のカルシウムが吸収されず体外に排出されてしまうと
いわれている。また、体内に吸収されたカルシウムも、
その形態や同時に摂取される他の栄養成分の種類によっ
て骨への親和性が異なるので、骨代謝の改善や骨強化の
作用を示さないこともある。その他、骨粗鬆症治療や骨
強化のための医薬として、ビタミンＤ₃ やカルシトニン
製剤、エストロゲン製剤などが知られており、また、ビ
スホスホネート製剤などの新薬開発が進められている。
しかし、これらの医薬を用いた場合、耳鳴り、頭痛、食
欲不振などの副作用を伴うことがある。さらに、これら
の物質は安全性及びコストなどの面から、現在のところ
飲食品に添加することができない状況にある。したがっ
て、骨粗鬆症という疾病の性質上、長期的に経口摂取す
ることができ、直接的に骨に骨形成促進的あるいは骨吸
収抑制的に作用し、その予防または治療効果が期待でき
るような骨強化剤や骨強化剤を含有する飲食品の開発が
望まれている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、カルシ
ウム摂取におけるこれらの問題点を鑑み、広く食品素材
に含まれている骨強化作用を示す物質について、鋭意、
探索を進めていたところ、乳由来の塩基性タンパク質画
分あるいはその塩基性タンパク質画分をペプシンやパン
クレアチンなどのタンパク質分解酵素で分解して得られ
る塩基性ペプチド画分が、骨芽細胞増殖活性及び破骨細
胞骨吸収抑制活性を示し、経口的投与により骨を強化す
ることができることを見出した。そして、この塩基性タ
ンパク質画分や塩基性ペプチド画分を骨強化剤や骨強化
飲食品の有効成分として利用できることを見出し、本発
明を完成するに至った。したがって、本発明は、この骨
芽細胞増殖活性及び破骨細胞骨吸収抑制活性を有する乳
由来の塩基性タンパク質画分あるいは塩基性ペプチド画
分を有効成分とする骨強化剤を提供することを課題とす
る。また、本発明は、これらの画分を配合した骨強化飲
食品を提供することを課題とする。

【０００５】

【課題を解決するめの手段】本発明の骨強化剤の特徴
は、乳由来の塩基性タンパク質画分あるいはその塩基性
タンパク質画分をタンパク質分解酵素で分解して得られ
る塩基性ペプチド画分を有効成分とすることにある。こ
の乳由来の塩基性タンパク質画分は、牛乳、人乳、山羊
乳、羊乳など哺乳類の乳から得られるものであり、ま
た、この塩基性ペプチド画分は、乳由来の塩基性タンパ
ク質画分にタンパク質分解酵素を作用させて得ることが
できるものであって、直接的に骨に作用することによ
り、骨形成の促進作用及び骨吸収の抑制作用を示し、こ
れらの作用に基づいて骨を強化することができる。

【０００６】この乳由来の塩基性タンパク質画分は、後
述する試験例１〜４に示したように次の性質を有してい
る。 1) ソジウムドデシルサルフェート−ポリアクリルアミ
ドゲル(SDS-PAGE)電気泳動によると分子量 3,000〜80,0
00の範囲の数種のタンパク質よりなる。 2) 95重量％以上がタンパク質であって、その他少量の
脂肪、灰分を含む。 3) タンパク質は主としてラクトフェリン及びラクトパ
ーオキシダーゼよりなる。 4) タンパク質のアミノ酸組成は、リジン、ヒスチジ
ン、アルギニン等の塩基性アミノ酸を15重量％以上含有
する。このような塩基性タンパク質画分は、例えば、脱
脂乳や乳清などの乳原料を陽イオン交換樹脂と接触させ
て塩基性タンパク質を吸着させ、この樹脂に吸着した塩
基性タンパク質画分を0.1M〜1.0Mの塩濃度の溶出液で溶
出、この溶出画分を回収し、逆浸透(RO)膜や電気透析(E
D)法などにより脱塩及び濃縮し、必要に応じて乾燥する
ことにより得ることができる。

【０００７】また、乳由来の塩基性タンパク質画分を得
る方法としては、乳または乳由来の原料を陽イオン交換
体に接触させて塩基性タンパク質を吸着させた後、この
陽イオン交換体に吸着した塩基性タンパク質画分を、pH
５を越え、イオン強度 0.5を越える溶出液で溶出して得
る方法〔特開平5-202098号公報〕、アルギン酸ゲルを用
いて得る方法〔特開昭 61-246198号公報〕、無機の多孔
性粒子を用いて乳清から得る方法〔特開平 1-86839号公
報〕、硫酸化エステル化合物を用いて乳から得る方法
〔特開昭 63-255300号公報〕などが知られており、本発
明では、このような方法で得られた塩基性タンパク質画
分を用いることができる。

【０００８】また、乳由来の塩基性ペプチド画分は、塩
基性タンパク質画分と同様のアミノ酸組成を有してお
り、例えば、上記の方法で得られた乳由来の塩基性タン
パク質画分にペプシン、トリプシン、キモトリプシンな
どのタンパク質分解酵素を作用させ、さらに必要に応
じ、パンクレアチンなどのタンパク質分解酵素を作用さ
せることにより、平均分子量 4,000以下のペプチド組成
物として得ることができる。

【０００９】本発明の骨強化剤を投与するに際しては、
有効成分の乳由来の塩基性タンパク質画分あるいは塩基
性ペプチド画分をそのままの状態で用いることもできる
が、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、
ドリンク剤などに製剤化して用いることもできる。さら
には、これらの塩基性タンパク質画分や塩基性ペプチド
画分をそのままあるいは製剤化した後、これを栄養剤や
飲食品などに配合して、骨形成促進や骨吸収抑制による
骨強化を図ることも可能である。なお、乳由来の塩基性
タンパク質画分あるいは塩基性ペプチド画分は、比較的
熱に対して安定なので、乳由来の塩基性タンパク質画分
あるいは塩基性ペプチド画分を含む原料を通常行われる
ような条件で加熱殺菌することも可能である。

【００１０】本発明の骨強化剤の投与量は、年齢、治療
効果及び病態などにより異なるが、ラットを用いた動物
実験の結果によると、骨強化作用を示すために必要な塩
基性タンパク質画分あるいは塩基性ペプチド画分を飼料
中に 0.1重量％以上含有する必要があることが判った。
したがって、通常、成人一人当たり一日乾燥重量で500g
の飲食品を摂取することから、 0.5g/日以上の塩基性タ
ンパク質画分あるいは塩基性ペプチド画分を摂取すれば
効果が期待できるので、この必要量を確保できるよう飲
食品に配合したり、医薬として服用すれば良い。

【００１１】次に、実施例及び試験例を示して本発明を
詳細に説明する。

【実施例１】陽イオン交換樹脂のスルホン化キトパール
（富士紡績株式会社製）400gを充填したカラム（直径５
cm×高さ30cm）を脱イオン水で十分洗浄した後、このカ
ラムに未殺菌脱脂乳40リットル(pH 6.7)を流速25ml/min
で通液した。通液後、このカラムを脱イオン水で十分洗
浄し、 0.98M塩化ナトリウムを含む 0.02M炭酸緩衝液(p
H 7.0)で樹脂に吸着した塩基性タンパク質画分を溶出し
た。そして、この溶出液を逆浸透(RO)膜により脱塩し
て、濃縮した後、凍結乾燥して粉末状の塩基性タンパク
質画分 21gを得た。

【００１２】

【試験例１】実施例１で得られた塩基性タンパク質画分
について、ソジウムドデシルサルフェート−ポリアクリ
ルアミド(SDS-PAGE)電気泳動により測定したところ、分
子量は 3,000〜80,000の範囲に分布していた。この結果
を図６に示す。

【００１３】

【試験例２】実施例１で得られた塩基性タンパク質画分
について、成分組成を分析した。その結果を表１に示
す。この表に示すとおり、この画分のほとんどはタンパ
ク質である。

【表１】 ─────────────────── 水分 1.06（重量％） タンパク質 96.50 脂肪 0.56 灰分 0.27 その他 1.61 ───────────────────

【００１４】

【試験例３】実施例１で得られた塩基性タンパク質画分
について、そのタンパク質組成を分析した。その結果を
表２に示す。この塩基性タンパク質画分には、40重量％
以上のラクトフェリン及びラクトパーオキシダーゼが含
まれている。

【表２】 ──────────────────────── ラクトフェリン 42.5（重量％） ラクトパーオキシダーゼ 45.6 インスリン様増殖因子−１ 0.005その他 11.895

【００１５】

【試験例４】実施例１で得られた塩基性タンパク質画分
について、6N塩酸で 110℃、24時間加水分解した後、ア
ミノ酸分析装置（L-8500型、日立製作所製) でそのアミ
ノ酸組成を分析した。その結果を表３に示す。この塩基
性タンパク質画分には、アミノ酸組成中15重量％以上の
塩基性アミノ酸が含まれている。

【表３】 ─────────────────── アスパラギン酸 10.1（重量％） セリン 5.3 グルタミン酸 12.3 プロリン 4.7 アラニン 5.7 ロイシン 10.2 リジン 8.4 ヒスチジン 2.5 アルギニン 7.2 その他 33.6 ───────────────────

【００１６】

【実施例２】陽イオン交換樹脂のＳＰトーヨーパール
（東ソー株式会社製）30kgを充填したカラム (直径 100
cm×高さ10cm）を脱イオン水で十分洗浄した後、このカ
ラムに121℃で30秒間加熱殺菌したチーズホエー3t(pH
6.2)を流速10リットル/minで通液した。通液後、このカ
ラムを脱イオン水で十分洗浄し、0.9M塩化ナトリウムを
含む0.1Mクエン酸緩衝液(pH 5.7)で樹脂に吸着した塩基
性タンパク質画分を溶出した。そして、この溶出液を電
気透析(ED)法により脱塩し、濃縮した後、凍結乾燥して
粉末状の塩基性タンパク質画分183gを得た。

【００１７】

【試験例５】実施例１及び２で得られた塩基性タンパク
質画分について、骨芽細胞増殖効果を調べた。培養骨芽
細胞様株(MC3T3-E1)を96穴の平底細胞培養プレートに撒
き込み、 0.2重量％ウシ血清を含むα−ＭＥＭ培地(Flo
w Laboratories社製）で18時間培養した。なお、培養に
際しては、培地 100μl に対し、塩基性タンパク質画分
を 0.5重量％濃度となるように溶解した溶液２μl を添
加した。培養後、トリチウムでラベルしたチミジンを添
加し、２時間後に細胞に取り込まれたチミジンの放射活
性を測定することにより骨芽細胞増殖活性を求めた（東
大医科学研究所制癌研究部編，新細胞工学実験プロトコ
ール，pp.319-320, 1993による）。その結果を図１に示
す。図１では、培地に塩基性タンパク質画分を添加しな
かった群の放射活性を 100％とし、放射活性の相対値で
塩基性タンパク質画分を添加した群 (対照) の骨芽細胞
増殖活性を表した。これによると、実施例１及び２で得
られた塩基性タンパク質画分を添加した群は、塩基性タ
ンパク質画分を添加しなかった群に比べ、２倍程度の骨
芽細胞増殖活性を示した。

【００１８】

【試験例６】実施例２で得られた塩基性タンパク質画
分、実施例１で得られた塩基性タンパク質画分をペプシ
ンで分解して得られた塩基性ペプチド画分、実施例１で
得られた塩基性タンパク質画分をペプシン及びパンクレ
アチンで分解して得られた塩基性ペプチド画分につい
て、反転腸管法（五島孜郎ら，「小動物を用いる栄養学
実験」，pp83-85, 1980 による）により骨芽細胞増殖活
性及び破骨細胞骨吸収抑制効果を調べた。

【００１９】すなわち、一晩絶食させた成熟ラットの腸
管を摘出し、胃幽門部から７cmの十二指腸部を反転さ
せ、この反転腸管内部にリンゲル液を入れて結紮した。
この反転腸管外部に、リンゲル液のみ (対照) 、(a) リ
ンゲル液＋１％濃度の実施例２で得られた塩基性タンパ
ク質画分、(b) リンゲル液＋１％濃度の実施例１で得ら
れた塩基性タンパク質画分をペプシンで分解して得られ
た塩基性ペプチド画分、(c) リンゲル液＋１％濃度の実
施例１で得られた塩基性タンパク質画分をペプシン及び
パンクレアチンで分解して得られた塩基性ペプチド画分
をそれぞれ入れて酸素ガスを通気しながら37℃で保持し
た。そして、１時間後に反転腸管内部の液を採取し、試
験例５と同様の方法により骨芽細胞増殖活性を調べた。

【００２０】また、10日齡のウサギの大腿骨を摘出し、
軟組織を除去した後、５％ＦＢＳを含む培地中で機械的
に細切した破骨細胞を含む全骨髄細胞を200,000 cells/
mlになるよう象牙片上に撒き込み、上記の反転腸管法に
より得られた反転腸管内部の液を３倍希釈したものを10
％添加して２日間培養した。そして、この象牙片上にで
きた骨吸収窩（ピット）をヘマトキシリン染色し、その
数をカウントすることにより破骨細胞骨吸収抑制効果を
調べた（瀬野悍二ら，研究テーマ別動物培養細胞マニュ
アル，pp.199-200, 1993) 。

【００２１】これらの結果を図２及び図３に示す。な
お、図２では、培地に反転腸管外部の液としてリンゲル
液のみを用い、１時間保持した反転腸管内部の液を添加
した群の放射活性を 100％とし、放射活性の相対値でそ
れぞれの骨芽細胞増殖活性を表した。また、図３では、
図２と同様、培地に反転腸管外部の液としてリンゲル液
のみを用い、１時間保持した反転腸管内部の液を添加し
た群のピット数を対照とし、それぞれの破骨細胞骨吸収
抑制効果をピットの数で表した。

【００２２】(a) 塩基性タンパク質画分、(b) 塩基性タ
ンパク質画分をペプシンで分解して得られた塩基性ペプ
チド画分、(c) 塩基性タンパク質画分をペプシン及びパ
ンクレアチンで分解して得られた塩基性ペプチド画分の
いずれの画分ともにこれを反転腸管外部の液として用い
た群は、リンゲル液のみを反転腸管外部の液として用い
た群と比べ、高い骨芽細胞増殖活性及び破骨細胞骨吸収
抑制効果を示した。したがって、本発明の骨強化剤の有
効成分であるこれらの画分が、腸管を通過することが確
認できた。

【００２３】

【試験例７】実施例２で得られた塩基性タンパク質画分
について、動物実験により骨強化作用を調べた。動物実
験には４週齢のＳＤ系雌ラットを用いた。１週間の予備
飼育後、卵巣摘出手術を施し、その後、カルシウム欠乏
食で５週間飼育して動物実験に供した。なお、卵巣を摘
出し、カルシウム欠乏食で５週間飼育したラットは、明
らかに骨粗鬆症状態にあった。この骨粗鬆症状態を惹起
したラットを１群６匹ずつ、対照群（Ａ群）、塩基性タ
ンパク質画分 0.1重量％投与群（Ｂ群）、塩基性タンパ
ク質画分 0.5重量％投与群（Ｃ群）、塩基性タンパク質
画分 1.0重量％投与群（Ｄ群）の４試験群に分け、それ
ぞれ表４に示す試験飼料で４週間飼育した。なお、各試
験飼料の窒素含量(17.06％) が同様となるようカゼイン
で調整した。また、各試験飼料については、100g当た
り、カルシウム 300mg、リン 230mg及びマグネシウム50
mgを配合した。

【００２４】

【表４】 ─────────────────────────────────── Ａ群 Ｂ群 Ｃ群 Ｄ群 ─────────────────────────────────── カゼイン 20.0 19.9 19.4 18.9 (重量％) コーンスターチ 15.0 15.0 15.0 15.0 セルロース 5.0 5.0 5.0 5.0 コーン油 5.0 5.0 5.0 5.0 ビタミン混合 1.0 1.0 1.0 1.0 ミネラル混合 2.65 2.65 2.65 2.65 蔗糖 51.05 51.05 51.15 51.15 ＤＬ−メチオニン 0.3 0.3 0.3 0.3 塩基性タンパク質画分粉末 − 0.1 0.5 1.0 ───────────────────────────────────

【００２５】４週間後、各試験群のラットの両側大腿骨
及び脛骨を摘出し、大腿骨については骨破断力測定装置
（レオメータ・マックス RX-1600型、アイテクノ製) で
骨強度を測定し、脛骨については脛骨の組織標本測定法
に従い、脛骨を電気脱灰後、Ｈ−Ｅ染色して組織標本を
作成し、骨端の成長板の長さを測定した。その結果を図
４及び図５に示す。これによると、大腿骨破断応力は、
対照群（Ａ群）に比べ、塩基性タンパク質画分投与群
（Ｂ〜Ｄ群）で高い値を示した。また、大腿骨破断力
は、塩基性タンパク質画分の濃度が増加するに従い高い
値を示した。さらに、脛骨の骨端成長板の長さも対照群
（Ａ群）に比べ、塩基性タンパク質画分投与群（Ｂ〜Ｄ
群）で塩基性タンパク質の濃度依存的に有意に長くなっ
た。

【００２６】

【実施例３】表５に示す組成の骨強化飲料を製造した。

【表５】 ──────────────────────────── 混合異性化糖 15.0（重量％） 果汁 10.0 クエン酸 0.5 塩基性タンパク質画分粉末（実施例１） 0.5 香料 0.1 カルシウム 0.1 水 73.5 ────────────────────────────

【００２７】

【実施例４】表６に示す組成のドウを作成し、成形した
後、焙焼して骨強化ビスケットを製造した。

【００２８】

【表６】 ─────────────────────────── 小麦粉 50.0（重量％） 砂糖 20.0 食塩 0.5 マーガリン 12.5 卵 12.5 水 2.5 炭酸水素ナトリウム 0.15 重炭酸アンモニウム 0.2 炭酸カルシウム 0.45 塩基性タンパク質画分粉末（実施例１） 1.2 ───────────────────────────

【００２９】

【実施例５】表７に示す組成の骨強化錠剤を製造した。

【００３０】

【表７】 ──────────────────────────── 含水結晶ぶどう糖 73.5（重量％） 塩基性タンパク質画分粉末（実施例２） 20.0 カルシウム 5.0 シュガーエステル 1.0 香料 0.5 ────────────────────────────

【００３１】

【発明の効果】本発明の骨強化剤や骨強化飲食品は、骨
形成を促進し、しかも骨吸収を抑制する作用を有するの
でこれを摂取すると骨を強化する効果を奏する。従っ
て、骨粗鬆症、骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨
関節疾患、特に、骨粗鬆症の予防や治療に有用である。
また、成長期に本発明の骨強化剤や骨強化飲食品を摂取
することにより、最大骨量を増加させることもできる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の塩基性タンパク質画分の試験例５によ
る骨芽細胞増殖活性を示す。

【図２】本発明の塩基性タンパク質画分及び塩基性ペプ
チド画分の試験例６による骨芽細胞増殖活性を示す。

【図３】本発明の塩基性タンパク質画分及び塩基性ペプ
チド画分の試験例６による破骨細胞骨吸収抑制効果を示
す。

【図４】本発明の塩基性タンパク質画分の試験例７によ
る大腿骨骨強度増強効果を示す。

【図５】本発明の塩基性タンパク質画分の試験例７によ
る脛骨骨端成長板成長効果を示す。

【図６】本発明の塩基性タンパク質画分の試験例１によ
るSDS-PAGE電気泳動のパターンを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/48 Ｃ１２Ｎ 9/94 9/76 Ｃ１２Ｐ 21/06 9/94 Ａ６１Ｋ 37/18 Ｃ１２Ｐ 21/06 Ａ２３Ｌ 2/00 Ｆ (56)参考文献 特開 平５−202098（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 38/17 A23L 1/305 A23L 2/52 A61P 19/08 C12N 9/48 C12N 9/76 C12N 9/94 C12P 21/06 ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 乳由来の塩基性タンパク質画分を有効成
   分とする骨強化剤。
2. 【請求項２】 乳由来の塩基性タンパク質画分が、その
   アミノ酸組成中に塩基性アミノ酸を15重量％以上含有し
   ている画分である請求項１記載の骨強化剤。
3. 【請求項３】 乳由来の塩基性タンパク質画分が、乳ま
   たは乳由来の原料を陽イオン交換樹脂に接触させて塩基
   性タンパク質を吸着させ、この樹脂に吸着した画分を塩
   濃度0.1M〜1.0Mの溶出液で溶出して得られる画分である
   請求項１記載の骨強化剤。
4. 【請求項４】 請求項１乃至３のいずれかに記載の乳由
   来の塩基性タンパク質画分をタンパク質分解酵素で分解
   して得られる塩基性ペプチド画分を有効成分とする骨強
   化剤。
5. 【請求項５】 タンパク質分解酵素がペプシン、トリプ
   シン及びキモトリプシンよりなる群から選択される少な
   くとも１種のタンパク質分解酵素である請求項４記載の
   骨強化剤。
6. 【請求項６】 タンパク質分解酵素がペプシン、トリプ
   シン及びキモトリプシンよりなる群から選択される少な
   くとも１種のタンパク質分解酵素とパンクレアチンであ
   る請求項４の骨強化剤。
7. 【請求項７】 請求項１乃至６のいずれかに記載の乳由
   来の塩基性タンパク質画分または塩基性ペプチド画分を
   配合した骨強化飲食品。