JP3043629B2 - 抗体１０３ｂ２ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、細胞の表面上におけるピーナツアグルチニン
（peanut agglutinin:ＰＮＡ）結合糖タンパク質に対す
る抗体に関する。
（peanut agglutinin:ＰＮＡ）結合糖タンパク質に対す
る抗体に関する。
【０００２】背景技術 いくつかのヒト腫瘍における悪性細胞は、それらの表面
にピーナツアグルチニン（ＰＮＡ）結合糖タンパク質を
有している。これらのＰＮＡ結合糖タンパク質は、検出
試薬および／または治療上有効な試薬を、対応する細胞
に直接向かわせて、これら試薬を細胞に結合させる可能
性を与える。近時導入されたＭＵＣ命名法に従い、名付
けられた糖タンパク質ＭＵＣ１、ＭＵＣ２およびＭＵＣ
３は、何年も前から知られている。最近同定された細胞
表面糖タンパク質はタンパク質ＭＧＣ‐２４であり、そ
のアミノ酸配列および対応ヌクレオチド配列はMasuzawa
et al.,J.BIOCHEM.,112,609-615(1992)において詳しく
特定されている。よって、この糖タンパク質ＭＧＣ‐２
４は、ある種の細胞診断または治療に向けたターゲット
ポイントとして理想的なものである。
にピーナツアグルチニン（ＰＮＡ）結合糖タンパク質を
有している。これらのＰＮＡ結合糖タンパク質は、検出
試薬および／または治療上有効な試薬を、対応する細胞
に直接向かわせて、これら試薬を細胞に結合させる可能
性を与える。近時導入されたＭＵＣ命名法に従い、名付
けられた糖タンパク質ＭＵＣ１、ＭＵＣ２およびＭＵＣ
３は、何年も前から知られている。最近同定された細胞
表面糖タンパク質はタンパク質ＭＧＣ‐２４であり、そ
のアミノ酸配列および対応ヌクレオチド配列はMasuzawa
et al.,J.BIOCHEM.,112,609-615(1992)において詳しく
特定されている。よって、この糖タンパク質ＭＧＣ‐２
４は、ある種の細胞診断または治療に向けたターゲット
ポイントとして理想的なものである。
【０００３】この糖タンパク質ＭＧＣ‐２４と特異的に
結合する抗体は、対応標的特異性細胞診断または治療剤
にとり有用な媒介物質となり得る。
結合する抗体は、対応標的特異性細胞診断または治療剤
にとり有用な媒介物質となり得る。
【０００４】このような抗体は、蛍光色素または放射性
物質のような簡単な検出試薬と、特別な治療上有効な試
薬の双方とに結合させることができる。
物質のような簡単な検出試薬と、特別な治療上有効な試
薬の双方とに結合させることができる。
【０００５】しかしながら、これまでは、利用の可能性
において限定された、同一には再現できないポリクロー
ナル抗体だけが知られていた。更に、これは修飾され
た、即ち脱グリコシル化形のＭＧＣ‐２４タンパク質に
対するものである。
において限定された、同一には再現できないポリクロー
ナル抗体だけが知られていた。更に、これは修飾され
た、即ち脱グリコシル化形のＭＧＣ‐２４タンパク質に
対するものである。
【０００６】このため、特に生きた生体におけるＭＧＣ
‐２４保有細胞の特異的な治療および同定は、このよう
な抗体によっては不可能である。
‐２４保有細胞の特異的な治療および同定は、このよう
な抗体によっては不可能である。
【０００７】
【発明の概要】従って、本発明の目的は、天然未修飾ピ
ーナツアグルチニン（ＰＮＡ）結合細胞表面糖タンパク
質ＭＧＣ‐２４と特異的に結合して、実際上限定されな
い量で入手可能な抗体を提供することである。
ーナツアグルチニン（ＰＮＡ）結合細胞表面糖タンパク
質ＭＧＣ‐２４と特異的に結合して、実際上限定されな
い量で入手可能な抗体を提供することである。
【０００８】この目的は、天然未修飾ピーナツアグルチ
ニン（ＰＮＡ）結合細胞表面糖タンパク質ＭＧＣ‐２４
と特異的に結合するモノクローナル抗体の提供により達
成される。このようなモノクローナル抗体は、寄託番号
ＤＳＭ ＡＣＣ ２２２１のもとGerman Collection of
Microorganisms and Cell Cultures GmbH,DSMZ にブダ
ペスト条約に従い寄託されたハイブリドーマ細胞により
産生および放出される。この抗体は１０３Ｂ２と呼ばれ
る。寄託日は１９９５年８月１日である。
ニン（ＰＮＡ）結合細胞表面糖タンパク質ＭＧＣ‐２４
と特異的に結合するモノクローナル抗体の提供により達
成される。このようなモノクローナル抗体は、寄託番号
ＤＳＭ ＡＣＣ ２２２１のもとGerman Collection of
Microorganisms and Cell Cultures GmbH,DSMZ にブダ
ペスト条約に従い寄託されたハイブリドーマ細胞により
産生および放出される。この抗体は１０３Ｂ２と呼ばれ
る。寄託日は１９９５年８月１日である。
【０００９】天然未修飾ピーナツアグルチニン（ＰＮ
Ａ）結合細胞表面糖タンパク質ＭＧＣ‐２４と特異的に
結合する更なる別なモノクローナル抗体は、異なるエピ
トープとであるが、寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２２２
のもとGerman Collection of Microorganisms and Cell
Cultures GmbH,DSMZ に寄託されたハイブリドーマ細胞
により産生および放出される。この抗体は１０５Ａ５と
呼ばれる。この抗体は、並行して継続しているドイツ特
許出願ＤＥ １９５ ３０ ２７３．７“抗体１０５Ａ
５”の主題である。
Ａ）結合細胞表面糖タンパク質ＭＧＣ‐２４と特異的に
結合する更なる別なモノクローナル抗体は、異なるエピ
トープとであるが、寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２２２
のもとGerman Collection of Microorganisms and Cell
Cultures GmbH,DSMZ に寄託されたハイブリドーマ細胞
により産生および放出される。この抗体は１０５Ａ５と
呼ばれる。この抗体は、並行して継続しているドイツ特
許出願ＤＥ １９５ ３０ ２７３．７“抗体１０５Ａ
５”の主題である。
【００１０】本発明による抗体および並行して継続する
前記特許出願の各抗体により、標準的な手法により再現
でき、よって限定されない量で製造できる、細胞表面糖
タンパク質ＭＧＣ‐２４上の特定エピトープと特異的に
結合するモノクローナル抗体が初めて提供された。
前記特許出願の各抗体により、標準的な手法により再現
でき、よって限定されない量で製造できる、細胞表面糖
タンパク質ＭＧＣ‐２４上の特定エピトープと特異的に
結合するモノクローナル抗体が初めて提供された。
【００１１】
【発明の具体的説明】本発明による抗体は、タンパク質
ＭＧＣ‐２４の細胞外ドメインを発現する細胞を特異的
に同定でき、かつそれに影響を及ぼす。このため、それ
は、抗体自体またはこの抗体に結合された特別な試薬を
介して、細胞培養物および患者生体の双方で、一方では
このような細胞を同定し、他方では可能ならばこれら細
胞を操作する上で、医者および科学者にとり独特な多用
的手段となる。
ＭＧＣ‐２４の細胞外ドメインを発現する細胞を特異的
に同定でき、かつそれに影響を及ぼす。このため、それ
は、抗体自体またはこの抗体に結合された特別な試薬を
介して、細胞培養物および患者生体の双方で、一方では
このような細胞を同定し、他方では可能ならばこれら細
胞を操作する上で、医者および科学者にとり独特な多用
的手段となる。
【００１２】本発明は、タンパク質ＭＧＣ‐２４に対す
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に
更に関する。これらには、特に、寄託番号ＤＳＭ ＡＣ
Ｃ２２２１のもとGerman Collection of Microorganism
s and Cell Cultures GmbH,DSMZ にブダペスト条約に従
い寄託されて、１０３Ｂ２と呼ばれる抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞がある。
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に
更に関する。これらには、特に、寄託番号ＤＳＭ ＡＣ
Ｃ２２２１のもとGerman Collection of Microorganism
s and Cell Cultures GmbH,DSMZ にブダペスト条約に従
い寄託されて、１０３Ｂ２と呼ばれる抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞がある。
【００１３】加えて、本発明は天然未修飾細胞表面糖タ
ンパク質ＭＧＣ‐２４に対する抗体を合成および放出す
るハイブリドーマ細胞の産生方法に関する。この方法
は、例えばBuhring et al.,Hybridoma,1991,Volume 10,
No.1,p.77-78に記載されたような、以下の本質的によく
知られた工程からなる： １．抗原または免疫原による動物、好ましくはＢａｌｂ
／ｃストックからのマウス、を免疫または感作し、 ２．この動物の抗体産生細胞、好ましくは脾臓リンパ
球、を抽出し、 ３．これらの抗体産生細胞と安定な不死化細胞系、好ま
しくは骨髄腫細胞系、とを融合させ、ハイブリドーマ細
胞とし、そして ４．抗原と結合する抗体を分泌するこのようなハイブリ
ドーマ細胞を単離および増殖（クローニング）する。
ンパク質ＭＧＣ‐２４に対する抗体を合成および放出す
るハイブリドーマ細胞の産生方法に関する。この方法
は、例えばBuhring et al.,Hybridoma,1991,Volume 10,
No.1,p.77-78に記載されたような、以下の本質的によく
知られた工程からなる： １．抗原または免疫原による動物、好ましくはＢａｌｂ
／ｃストックからのマウス、を免疫または感作し、 ２．この動物の抗体産生細胞、好ましくは脾臓リンパ
球、を抽出し、 ３．これらの抗体産生細胞と安定な不死化細胞系、好ま
しくは骨髄腫細胞系、とを融合させ、ハイブリドーマ細
胞とし、そして ４．抗原と結合する抗体を分泌するこのようなハイブリ
ドーマ細胞を単離および増殖（クローニング）する。
【００１４】本発明による方法は、前記動物が未分化巨
核芽球様細胞系（undifferentiated, megakaryoblastoi
d cell line）ＭＯＬＭ‐１からの細胞により免疫され
る点によって特徴付けられる。
核芽球様細胞系（undifferentiated, megakaryoblastoi
d cell line）ＭＯＬＭ‐１からの細胞により免疫され
る点によって特徴付けられる。
【００１５】これによる利点は、試験中に抗体１０３Ｂ
２を誘導することで示されたように、この細胞系がＭＧ
Ｃ‐２４の強い発現を示すことである。
２を誘導することで示されたように、この細胞系がＭＧ
Ｃ‐２４の強い発現を示すことである。
【００１６】幹細胞特異性抗体を産生するハイブリドー
マ細胞をスクリーニングするとき、ハイブリドーマ細胞
の単離に際して骨髄細胞に対する特異性のある抗体を産
生するハイブリドーマ細胞が選択されることが好まし
い。さらに、ハイブリドーマ細胞であってそれらの抗体
が末梢血細胞と弱いまたは好ましくは陰性の反応だけを
有することが既にわかっているハイブリドーマ細胞だけ
が、骨髄細胞に対して産生する抗体の特異性について試
験されるのであれば更に好ましい。
マ細胞をスクリーニングするとき、ハイブリドーマ細胞
の単離に際して骨髄細胞に対する特異性のある抗体を産
生するハイブリドーマ細胞が選択されることが好まし
い。さらに、ハイブリドーマ細胞であってそれらの抗体
が末梢血細胞と弱いまたは好ましくは陰性の反応だけを
有することが既にわかっているハイブリドーマ細胞だけ
が、骨髄細胞に対して産生する抗体の特異性について試
験されるのであれば更に好ましい。
【００１７】これによる利点は、いくつかの細胞が無駄
に試験されることなく、速やかにスクリーニングできる
ことである。ＭＧＣ‐２４は幹細胞でも発現されること
が意外にも発見され、そのため抗体で認識される抗原を
発現する造血幹細胞を含んだ多数の未分化細胞が骨髄中
に存在しているという事実がスクリーニングに際して活
用できる。よって、骨髄細胞上の抗原と選択的に結合し
て、末梢血細胞と結合しないかまたは弱く結合するだけ
である抗体は、末梢血細胞との反応に関する予備試験を
介して容易に単離できる。換言すれば、それによって選
択に際する特異性は簡単な手段でかなり増加される。
に試験されることなく、速やかにスクリーニングできる
ことである。ＭＧＣ‐２４は幹細胞でも発現されること
が意外にも発見され、そのため抗体で認識される抗原を
発現する造血幹細胞を含んだ多数の未分化細胞が骨髄中
に存在しているという事実がスクリーニングに際して活
用できる。よって、骨髄細胞上の抗原と選択的に結合し
て、末梢血細胞と結合しないかまたは弱く結合するだけ
である抗体は、末梢血細胞との反応に関する予備試験を
介して容易に単離できる。換言すれば、それによって選
択に際する特異性は簡単な手段でかなり増加される。
【００１８】本発明は、腫瘍、特に胃および結腸癌の診
断および／または治療のための、細胞表面糖タンパク質
ＭＧＣ‐２４にするモノクローナル抗体の使用にも関す
る。腫瘍細胞、特に胃および結腸癌細胞は、比較的高い
含有率で細胞表面糖タンパク質ＭＧＣ‐２４を有するこ
とで特徴付けられる。指示薬、例えば放射性マーカー、
と複合化された本発明による抗体は、この指示薬をこれ
らの細胞に間接的に結合させ、こうして例えばＸ線診断
またはシンチグラムによりこれら細胞の直接同定を可能
にする。これにより、ある場合には非常に迅速にin viv
o 腫瘍診断を行うことができる。
断および／または治療のための、細胞表面糖タンパク質
ＭＧＣ‐２４にするモノクローナル抗体の使用にも関す
る。腫瘍細胞、特に胃および結腸癌細胞は、比較的高い
含有率で細胞表面糖タンパク質ＭＧＣ‐２４を有するこ
とで特徴付けられる。指示薬、例えば放射性マーカー、
と複合化された本発明による抗体は、この指示薬をこれ
らの細胞に間接的に結合させ、こうして例えばＸ線診断
またはシンチグラムによりこれら細胞の直接同定を可能
にする。これにより、ある場合には非常に迅速にin viv
o 腫瘍診断を行うことができる。
【００１９】抗体は適切な手法で治療上有効な剤と複合
化でき、こうしてＭＧＣ‐２４保有細胞、特に腫瘍細
胞、に直接的かつ特異的に影響を与えるか、または更に
はその排除さえも行うことができる。
化でき、こうしてＭＧＣ‐２４保有細胞、特に腫瘍細
胞、に直接的かつ特異的に影響を与えるか、または更に
はその排除さえも行うことができる。
【００２０】好ましい態様において、寄託番号ＤＳＭ
ＡＣＣ ２２２１のもとGerman Collection of Microor
ganisms and Cell Cultures GmbH,DSMZ に寄託されたハ
イブリドーマ細胞により産生および放出された抗体は、
このような診断および／または治療に用いられる。
ＡＣＣ ２２２１のもとGerman Collection of Microor
ganisms and Cell Cultures GmbH,DSMZ に寄託されたハ
イブリドーマ細胞により産生および放出された抗体は、
このような診断および／または治療に用いられる。
【００２１】本発明による抗体の治療および／または診
断のための適用を容易にするため、その抗体は医薬製剤
を得る上で適切な補助成分と混合することができる。こ
のように、本発明は、細胞表面糖タンパク質ＭＧＣ‐２
４と結合する本発明による抗体を含有した、腫瘍の診断
および／または治療用の薬剤にも関する。この薬剤は、
寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２２１のもとGerman Colle
ction of Microorganisms and Cell Cultures GmbH,DSM
Z に寄託されたハイブリドーマ細胞により産生および放
出される抗体を含有していることが好ましい。
断のための適用を容易にするため、その抗体は医薬製剤
を得る上で適切な補助成分と混合することができる。こ
のように、本発明は、細胞表面糖タンパク質ＭＧＣ‐２
４と結合する本発明による抗体を含有した、腫瘍の診断
および／または治療用の薬剤にも関する。この薬剤は、
寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２２１のもとGerman Colle
ction of Microorganisms and Cell Cultures GmbH,DSM
Z に寄託されたハイブリドーマ細胞により産生および放
出される抗体を含有していることが好ましい。
【００２２】本発明による抗体を用いて、ＭＧＣ‐２４
保有細胞はよく知られた現行の試験法、例えば酵素結合
イムノソルベントアッセイ、即ち略称ＥＬＩＳＡ、また
はラジオイムノアッセイ、ＲＩＡを用いて様々な細胞の
懸濁液で同定することができる。このように、本発明は
天然糖タンパク質ＭＧＣ‐２４と特異的に結合するモノ
クローナル抗体を含んでなる、ピーナツアグルチニン
（ＰＮＡ）結合細胞表面糖タンパク質を同定するための
キットにも関する。
保有細胞はよく知られた現行の試験法、例えば酵素結合
イムノソルベントアッセイ、即ち略称ＥＬＩＳＡ、また
はラジオイムノアッセイ、ＲＩＡを用いて様々な細胞の
懸濁液で同定することができる。このように、本発明は
天然糖タンパク質ＭＧＣ‐２４と特異的に結合するモノ
クローナル抗体を含んでなる、ピーナツアグルチニン
（ＰＮＡ）結合細胞表面糖タンパク質を同定するための
キットにも関する。
【００２３】このキットの好ましい態様は、そのキット
が寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２２１のもとGerman Col
lection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH,D
SMZに寄託されたハイブリドーマ細胞により産生される
抗体を含んでいる、という事実により特徴付けられる。
が寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２２１のもとGerman Col
lection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH,D
SMZに寄託されたハイブリドーマ細胞により産生される
抗体を含んでいる、という事実により特徴付けられる。
【００２４】本発明に関連して、前記のように、寄託番
号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２２１のもとGerman Collection
of Microorganisms and Cell Cultures GmbH,DSMZ に寄
託されたハイブリドーマ細胞により産生される１０３Ｂ
２と呼ばれるモノクローナル抗体が幹細胞と結合するこ
とが、意外にも示された。
号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２２１のもとGerman Collection
of Microorganisms and Cell Cultures GmbH,DSMZ に寄
託されたハイブリドーマ細胞により産生される１０３Ｂ
２と呼ばれるモノクローナル抗体が幹細胞と結合するこ
とが、意外にも示された。
【００２５】このように、本発明は造血細胞を同定する
ための本発明による抗体好ましくは抗体１０３Ｂ２の使
用と、本発明による抗体好ましくは抗体１０３Ｂ２を含
有した造血細胞を同定するためのキットにも関する。未
分化ＣＤ３４＋サブ集団を分別することと、機能分析の
ため赤血球系または骨髄からの細胞を選択および精製す
ることが、それにより可能となる。
ための本発明による抗体好ましくは抗体１０３Ｂ２の使
用と、本発明による抗体好ましくは抗体１０３Ｂ２を含
有した造血細胞を同定するためのキットにも関する。未
分化ＣＤ３４＋サブ集団を分別することと、機能分析の
ため赤血球系または骨髄からの細胞を選択および精製す
ることが、それにより可能となる。
【００２６】更に意外な効果は、未成熟赤血球細胞への
モノクローナル抗体１０３Ｂ２の添加がin vitro造血を
阻害することである。このように、本発明は、造血を阻
害する本発明による抗体、好ましくは抗体１０３Ｂ２の
用途にも関する。
モノクローナル抗体１０３Ｂ２の添加がin vitro造血を
阻害することである。このように、本発明は、造血を阻
害する本発明による抗体、好ましくは抗体１０３Ｂ２の
用途にも関する。
【００２７】
【実施例】更なる利点は、以下の記載から見出すことが
できる。前記特徴と以下で説明される特徴は、特定され
た組合せだけでなく、本発明の範囲を越えずに他の組合
せまたは単独でも用いうる、と理解される。本発明を、
図面を参考にして、適用例および態様に基づき、以下で
更に詳細に説明する。
できる。前記特徴と以下で説明される特徴は、特定され
た組合せだけでなく、本発明の範囲を越えずに他の組合
せまたは単独でも用いうる、と理解される。本発明を、
図面を参考にして、適用例および態様に基づき、以下で
更に詳細に説明する。
【００２８】例１：細胞表面糖タンパク質ＭＧＣ‐２４
に対するモノクローナル抗体の産生および特徴 未分化巨核芽球様細胞系ＭＯＬＭ‐１からの細胞を抗原
として用いる（MatsuoY,Adachi T,Tsubota T,Imanishi
J,Minowada J.,Establishment and characterisation o
f a novel megakaryoblastoid cell line,MOLM-1,from
a patient with chronic myelogenous leukaemia,Human
Cell,1991,4:261-264 ）。
に対するモノクローナル抗体の産生および特徴 未分化巨核芽球様細胞系ＭＯＬＭ‐１からの細胞を抗原
として用いる（MatsuoY,Adachi T,Tsubota T,Imanishi
J,Minowada J.,Establishment and characterisation o
f a novel megakaryoblastoid cell line,MOLM-1,from
a patient with chronic myelogenous leukaemia,Human
Cell,1991,4:261-264 ）。
【００２９】８週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスに、免疫のため
細胞系ＭＯＬＭ‐１からの１０7細胞で１０日間隔で腹
腔内注射した。融合の４日前、５×１０5細胞を脾臓中
に直接適用して、免疫反応を増強させた。
細胞系ＭＯＬＭ‐１からの１０7細胞で１０日間隔で腹
腔内注射した。融合の４日前、５×１０5細胞を脾臓中
に直接適用して、免疫反応を増強させた。
【００３０】マウス生体における抗体の産生は、当業者
によく知られたＥＬＩＳＡ試験を用いて、抗原との結合
性質に関して処理動物の血清をスクリーニングすること
により試験した。
によく知られたＥＬＩＳＡ試験を用いて、抗原との結合
性質に関して処理動物の血清をスクリーニングすること
により試験した。
【００３１】約３週間後、免疫された動物のリンパ球は
脾臓を外科的に摘出して、これを細胞懸濁物に摩砕する
ことにより集めた。
脾臓を外科的に摘出して、これを細胞懸濁物に摩砕する
ことにより集めた。
【００３２】懸濁された脾臓細胞は、ポリエチレングリ
コールの存在下で公知株ＳＰ２／０からの骨髄腫細胞と
融合させた。融合培養物をヒポキサンチン、アミノプテ
リンおよびチミジン含有培地（ＨＡＴ培地）、この場合
にはＨＡＴ‐ＲＰＭＩ‐１６４０で培養したところ、ハ
イブリッド細胞だけが増殖できたが、その理由はこれら
がＨＡＴ含有培地で増殖する上で骨髄細胞の未制限分裂
性質と抗体を産生するリンパ球の性質との双方を有して
いるからである。
コールの存在下で公知株ＳＰ２／０からの骨髄腫細胞と
融合させた。融合培養物をヒポキサンチン、アミノプテ
リンおよびチミジン含有培地（ＨＡＴ培地）、この場合
にはＨＡＴ‐ＲＰＭＩ‐１６４０で培養したところ、ハ
イブリッド細胞だけが増殖できたが、その理由はこれら
がＨＡＴ含有培地で増殖する上で骨髄細胞の未制限分裂
性質と抗体を産生するリンパ球の性質との双方を有して
いるからである。
【００３３】融合後に細胞を微量滴定プレートに塗布し
て、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。
て、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。
【００３４】培養上澄をフローサイトメーターによりＭ
ＯＬＭ‐１細胞系で１０〜１４日後にスクリーニングし
た。第二段階では、上澄を末梢血細胞との反応について
試験したが、その理由はこれらが特異的幹細胞抗原を発
現しないからである。末梢血細胞と陰性のまたは弱い反
応を示した上澄は、その後で骨髄細胞との反応について
試験した。骨髄細胞に特異的な抗体を産生するハイブリ
ドーマを選択、単離および培養、即ち公知の限界希釈法
に従いクローニングした。
ＯＬＭ‐１細胞系で１０〜１４日後にスクリーニングし
た。第二段階では、上澄を末梢血細胞との反応について
試験したが、その理由はこれらが特異的幹細胞抗原を発
現しないからである。末梢血細胞と陰性のまたは弱い反
応を示した上澄は、その後で骨髄細胞との反応について
試験した。骨髄細胞に特異的な抗体を産生するハイブリ
ドーマを選択、単離および培養、即ち公知の限界希釈法
に従いクローニングした。
【００３５】このスクリーニング法は、造血幹細胞を含
めた多数の未分化細胞が骨髄で生じるという事実に基づ
いていた。
めた多数の未分化細胞が骨髄で生じるという事実に基づ
いていた。
【００３６】陽性反応を示したハイブリドーマ細胞培養
物を更に培養し、抗体を濃縮、精製および特徴付けし
た。
物を更に培養し、抗体を濃縮、精製および特徴付けし
た。
【００３７】モノクローナル抗体１０３Ｂ２を前記スク
リーニング法の最後に得た。ＰＥ複合化抗‐イソタイプ
‐特異的抗血清の場合、イソタイプは直接免疫蛍光法に
よりＩｇＧ３として決定された。
リーニング法の最後に得た。ＰＥ複合化抗‐イソタイプ
‐特異的抗血清の場合、イソタイプは直接免疫蛍光法に
よりＩｇＧ３として決定された。
【００３８】抗体の産生、精製および特徴付けは、当業
者によく知られた方法を用いて行った。
者によく知られた方法を用いて行った。
【００３９】寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２２１のもと
German Collection of Microorganisms and Cell Cultu
res GmbH,DSMZ に寄託されたハイブリドーマ細胞により
産生される抗体１０３Ｂ２は、下記特徴を示す： 免疫グロブリンクラス：ＩｇＧ３ 特異的結合親和性：ＭＧＣ‐２４。
German Collection of Microorganisms and Cell Cultu
res GmbH,DSMZ に寄託されたハイブリドーマ細胞により
産生される抗体１０３Ｂ２は、下記特徴を示す： 免疫グロブリンクラス：ＩｇＧ３ 特異的結合親和性：ＭＧＣ‐２４。
【００４０】例２：モノクローナル抗体１０３Ｂ２によ
り認識される抗原の同定 抗原をストロマ発現ライブラリーで同定した。
り認識される抗原の同定 抗原をストロマ発現ライブラリーで同定した。
【００４１】レトロウイルス発現ライブラリーをRayner
and Gonda,Mol.Cell.Biol.,1994,Volume 14,page 880
に記載された方法に従い作り、モノクローナル抗体１０
３Ｂ２により認識される抗原についてコードする遺伝子
を単離した。ヒト骨髄の培養ストロマ細胞からのｍＲＮ
Ａをこの方法で用いた。
and Gonda,Mol.Cell.Biol.,1994,Volume 14,page 880
に記載された方法に従い作り、モノクローナル抗体１０
３Ｂ２により認識される抗原についてコードする遺伝子
を単離した。ヒト骨髄の培養ストロマ細胞からのｍＲＮ
Ａをこの方法で用いた。
【００４２】ｃＤＮＡ転写物をレトロウイルスプラスミ
ドベクターｐＲＵＦ．Ｎｅｏに方向付けしてクローニン
グした。ライブラリーからのＤＮＡを用いてアンホトロ
ピックパッケージング細胞系（ＰＡ３１７）をトランス
フェクトした。一時的生成レトロウイルス粒子を収集し
て、エコトロピックパッケージング細胞系の安定的感染
に用いた。次いでこれらの細胞から産生されたウイルス
を用いて、因子依存性ネズミ造血細胞系ＦＤＣ‐Ｐ１に
感染させた。
ドベクターｐＲＵＦ．Ｎｅｏに方向付けしてクローニン
グした。ライブラリーからのＤＮＡを用いてアンホトロ
ピックパッケージング細胞系（ＰＡ３１７）をトランス
フェクトした。一時的生成レトロウイルス粒子を収集し
て、エコトロピックパッケージング細胞系の安定的感染
に用いた。次いでこれらの細胞から産生されたウイルス
を用いて、因子依存性ネズミ造血細胞系ＦＤＣ‐Ｐ１に
感染させた。
【００４３】感染ＦＤＣ‐Ｐ１細胞をＧ４１８耐性につ
いて選択し、抗体１０３Ｂ２により認識される抗原を発
現する細胞を単離および集積した。その抗体により認識
される細胞の集積は、多数回の免疫磁気細胞選別(Dynab
eads) を用いて行った。このＦＡＣＳ選別後、トランス
フェクトされた細胞のクローン集団を確立した。
いて選択し、抗体１０３Ｂ２により認識される抗原を発
現する細胞を単離および集積した。その抗体により認識
される細胞の集積は、多数回の免疫磁気細胞選別(Dynab
eads) を用いて行った。このＦＡＣＳ選別後、トランス
フェクトされた細胞のクローン集団を確立した。
【００４４】次いでプロウイルスｃＤＮＡインサートを
感染細胞のゲノムＤＮＡから回収した。ＰＣＲ増幅をこ
の目的のために行ったが、それによればプラスミドベク
ターでクローニング部位に隣接する特異的レトロウイル
スプライマーを用いた。こうして、約３ｋＢｐのｃＤＮ
Ａインサートを単離することができた。
感染細胞のゲノムＤＮＡから回収した。ＰＣＲ増幅をこ
の目的のために行ったが、それによればプラスミドベク
ターでクローニング部位に隣接する特異的レトロウイル
スプライマーを用いた。こうして、約３ｋＢｐのｃＤＮ
Ａインサートを単離することができた。
【００４５】配列分析では、このインサートがMasuzawa
et al.,J.Biochem.,112,609-615(1992)で詳しく特定さ
れたムチンファミリー、即ちＭＧＣ‐２４から既にクロ
ーニングされた遺伝子を同定できることを示した。
et al.,J.Biochem.,112,609-615(1992)で詳しく特定さ
れたムチンファミリー、即ちＭＧＣ‐２４から既にクロ
ーニングされた遺伝子を同定できることを示した。
【００４６】例３：in vitro造血を抑制するためのモノ
クローナル抗体１０３Ｂ２の使用 造血細胞成長を妨げる抗体能力を、モノクローナル抗体
１０３Ｂ２により同定される抗原の機能を調べることで
試験した。
クローナル抗体１０３Ｂ２の使用 造血細胞成長を妨げる抗体能力を、モノクローナル抗体
１０３Ｂ２により同定される抗原の機能を調べることで
試験した。
【００４７】最初の試験では、精製されたモノクローナ
ル抗体をヒト造血始原細胞の半固体クロノジェンアッセ
イに０．０１〜３０μg/mlから漸増濃度で加えた。これ
らのアッセイはＣＤ‐３４抗原を発現する正常ヒト骨髄
細胞を用いて行った。この細胞集団の純度はすべての試
験で９５〜９８．５％であった。
ル抗体をヒト造血始原細胞の半固体クロノジェンアッセ
イに０．０１〜３０μg/mlから漸増濃度で加えた。これ
らのアッセイはＣＤ‐３４抗原を発現する正常ヒト骨髄
細胞を用いて行った。この細胞集団の純度はすべての試
験で９５〜９８．５％であった。
【００４８】ＣＤ３４＋細胞を、Ｌ‐グルタミン、ペニ
シリン、ストレプトマイシン、β‐メルカプトエタノー
ル、０．９％（重量／容量）メチルセルロース、１％牛
血清アルブミン、３０％（容量／容量）胎児牛血清およ
び１０ng/ml の下記：精製組換えヒトサイトカイン：Ｉ
Ｌ‐１、ＩＬ‐３、ＩＬ‐６、Ｇ‐ＣＳＦ、ＧＭ‐ＣＳ
Ｆ、ＳＣＦおよびエリトロポエチンで補充されたＩＭＤ
Ｍ中、１０００細胞／ｍｌの初期濃度で１４日間培養し
た。
シリン、ストレプトマイシン、β‐メルカプトエタノー
ル、０．９％（重量／容量）メチルセルロース、１％牛
血清アルブミン、３０％（容量／容量）胎児牛血清およ
び１０ng/ml の下記：精製組換えヒトサイトカイン：Ｉ
Ｌ‐１、ＩＬ‐３、ＩＬ‐６、Ｇ‐ＣＳＦ、ＧＭ‐ＣＳ
Ｆ、ＳＣＦおよびエリトロポエチンで補充されたＩＭＤ
Ｍ中、１０００細胞／ｍｌの初期濃度で１４日間培養し
た。
【００４９】１４日後、培養物を標準的基準に従い骨髄
細胞（ＣＦＵ‐ＧＭ）または赤血球細胞（ＢＦＵ‐Ｅ）
の始原細胞に由来するコロニーの存在について計測し
た。同一濃度で加えられた同イソタイプＩｇＧ３の結合
（Ｐ４Ｃ２）および非結合（ＡＡ６）コントロール抗体
と比較して、抗体１０３Ｂ２はＣＦＵ‐ＧＭおよびＢＦ
Ｕ‐Ｅの双方でコロニー形成の用量依存性阻害を起こし
た。図１の黒棒グラフでは、初期濃度と比較して３μg/
ml抗体１０３Ｂ２の濃度で赤血球コロニーの数が約５０
％、１０μg/mlの濃度で約６５％減少したことを示して
いる。
細胞（ＣＦＵ‐ＧＭ）または赤血球細胞（ＢＦＵ‐Ｅ）
の始原細胞に由来するコロニーの存在について計測し
た。同一濃度で加えられた同イソタイプＩｇＧ３の結合
（Ｐ４Ｃ２）および非結合（ＡＡ６）コントロール抗体
と比較して、抗体１０３Ｂ２はＣＦＵ‐ＧＭおよびＢＦ
Ｕ‐Ｅの双方でコロニー形成の用量依存性阻害を起こし
た。図１の黒棒グラフでは、初期濃度と比較して３μg/
ml抗体１０３Ｂ２の濃度で赤血球コロニーの数が約５０
％、１０μg/mlの濃度で約６５％減少したことを示して
いる。
【００５０】第二に、抗体をストロマ細胞依存性長期培
養物で造血を妨げる能力について試験した。抗体１０３
Ｂ２またはコントロール抗体を骨髄ストロマ細胞の培養
物に加えた。これらの培養物は正常ドナーから得られた
骨髄から樹立させた。培養ストロマ細胞には実験開始の
１週間前に放射線（１５００ｒａｄ）照射して、造血細
胞を殺した。それから長期培養物を、１０μg/mlの濃度
で前記抗体の存在下で培養物当たり３×１０4ＣＤ３４
＋細胞を加えることにより確立した。
養物で造血を妨げる能力について試験した。抗体１０３
Ｂ２またはコントロール抗体を骨髄ストロマ細胞の培養
物に加えた。これらの培養物は正常ドナーから得られた
骨髄から樹立させた。培養ストロマ細胞には実験開始の
１週間前に放射線（１５００ｒａｄ）照射して、造血細
胞を殺した。それから長期培養物を、１０μg/mlの濃度
で前記抗体の存在下で培養物当たり３×１０4ＣＤ３４
＋細胞を加えることにより確立した。
【００５１】抗体を加えてから１週間後に、検出しうる
造血始原細胞の完全不在とストロマ細胞の死により、こ
の系で造血の完全抑制が観察できた。
造血始原細胞の完全不在とストロマ細胞の死により、こ
の系で造血の完全抑制が観察できた。
【図１】抗体１０３Ｂ２による造血の抑制について示し
た棒グラフである。
た棒グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ハンス‐イエルク、ビューリング ドイツ連邦共和国テュービンゲン、オッ トフライト‐ミューラー‐シュトラー セ、10、エベルハルト‐カルルス‐ウニ ベアジテート、テュービンゲン、エフア ツェーエス‐ラボーア、メディツィーニ シェ、ウニベアジテートスクリニク内 (72)発明者 アンドリュー、ツァンネティーノ オーストラリア国サウス、オーストラリ ア州、ハイベリー（番地なし) (72)発明者 ポール、ジェイ．シモンズ オーストラリア国サウス、オーストラリ ア州、アデレイド、ハイド、パーク、ビ ーコンスフィールド、ストリート、11 (56)参考文献 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，112［５ ］（1992）ｐ．609−615 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (7)
- 【請求項１】寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２２１のもと
German Collection of Microorganisms and Cell Cultu
res GmbH,DSMZ にブダペスト条約に従い寄託されたハイ
ブリドーマ細胞より産生および放出された、モノクロー
ナル抗体。 - 【請求項２】請求項１に記載された抗体を産生しうる能
力を有することで特徴付けられる、ハイブリドーマ細
胞。 - 【請求項３】寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ ２２２１のもと
German Collection of Microorganisms and Cell Cultu
res GmbH,DSMZ にブダペスト条約に従い寄託された、請
求項２に記載のハイブリドーマ細胞。 - 【請求項４】請求項１に記載された抗体を含んでなるこ
とを特徴とする、ピーナツアグルチニン（ＰＮＡ）結合
細胞表面糖タンパク質を同定するためのキット。 - 【請求項５】造血細胞を同定するための、請求項１に記
載された抗体の使用。 - 【請求項６】請求項１に記載された抗体を含有している
ことを特徴とする、造血細胞を同定するためのキット。 - 【請求項７】造血を阻害するための、請求項１に記載さ
れた抗体の使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19530272.9 | 1995-08-17 | ||
| DE19530272A DE19530272C1 (de) | 1995-08-17 | 1995-08-17 | Antikörper 103 B2 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09188700A JPH09188700A (ja) | 1997-07-22 |
| JP3043629B2 true JP3043629B2 (ja) | 2000-05-22 |
Family
ID=7769717
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8217277A Expired - Fee Related JP3043629B2 (ja) | 1995-08-17 | 1996-08-19 | 抗体１０３ｂ２ |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5763274A (ja) |
| EP (1) | EP0761814A1 (ja) |
| JP (1) | JP3043629B2 (ja) |
| DE (1) | DE19530272C1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19727813C1 (de) * | 1997-06-30 | 1998-06-18 | Univ Eberhard Karls | Antikörper 67D2 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5030559A (en) * | 1986-04-01 | 1991-07-09 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions for the identification of metastatic human tumors |
-
1995
- 1995-08-17 DE DE19530272A patent/DE19530272C1/de not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-08-07 EP EP96112689A patent/EP0761814A1/de not_active Withdrawn
- 1996-08-16 US US08/689,941 patent/US5763274A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-08-19 JP JP8217277A patent/JP3043629B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１２［５］（１９９２）ｐ．６０９−６１５ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE19530272C1 (de) | 1996-11-21 |
| JPH09188700A (ja) | 1997-07-22 |
| EP0761814A1 (de) | 1997-03-12 |
| US5763274A (en) | 1998-06-09 |
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