JPH0297400A - マウスのｃｄ２抗原に対するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、マウスＣＤ２抗原（以下、ｍ　ＣＤ　２と略
称することもある。）に対して特異的に反応するモノク
ローナル抗体およびその活性フラグメントに関するもの
である。

〔従来の技術〕

ＣＤ２は、ヒトＴ細胞の羊赤血球ロゼツトレセプターと
して見い出され、細胞レベルの研究により抗原非依存性
の細胞間接着分子として働くとともに、Ｔ細胞レセプタ
ー（ＴＣＲ）／ＣＤ３を介したシグナルとの対応として
Ｔ細胞活性化の副次回路（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ　ｐ
ａｔｈｗａｙ）を作動させる機能的レセプターであるこ
とが明らかとなっている。

また、最近の分子レベルの研究から、生体内に広範囲に
存在するＬ　Ｆ　Ａ　（ｌｌｐｈｏｃｙｔｅ　ｆｕｎｃ
ｔｉｏｎａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ａｎｔｉｇｅｎ）　−
３抗原がＣＤ２の本来のリガンド（ｎａｔｕｒａｌ　ｌ
ｉｇａｎｄ）であることが示されるとともに、ＣＤ２の
ｃＤＮＡクローニングによりそのＣＤ２をコードする遺
伝子の塩基配列も決定されている。

しかしながら、Ｔ細胞と抗原提示細胞間、ナチュラルキ
ラー細胞（ＮＫ細胞）と標的細胞間、あるいは胸腺細胞
と胸腺上皮細胞間などのＣＤ２／ＬＦＡ−３依存性の多
くの細胞間相互作用において、ＣＤ２を介したＴ細胞活
性化の副次回路がどのような生理学的役割を担っている
かは未だに不明の点が多く、このため、ＣＤ２とＬＦＡ
−３との相互作用の生理学的機序を解明することは、Ｔ
細胞またはＮＫ細胞の発生・分化とその機能発現の調節
を解明する意味においても極めて注目されていることが
らである。

〔発明が解決しようとする課題〕

従来、ＣＤ２の生理学的機能に関する研究は主にヒトお
よび若干ではあるがラットにおいて行われていた。

一般に、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の発生・分化を研究する
場合には、ヌードマウスまたは重症複合免疫不全マウス
を研究のためのモデル系として用いることが効果的であ
る。このため、マウスとヒトの系を並行して研究を推し
進めることが効率的な研究を進める意味においても大切
なこととされている。さらに、ＣＤ２とＬＦＡ−３との
相互作用を解析するためにはそれぞれの抗原に特異的に
反応するモノクローナル抗体を取得することが必須条件
である。

しかしながら、ヒトのＣＤ２に対するモノクローナル抗
体は取得されているものの（Ｎａｔｕｒｅ、３２９．８
４２　（１９８７））　、マウスのＣＤ２抗原に対する
モノクローナル抗体は取得されておらず、このことがマ
ウスのＣＤ２に関する研究の進展を妨げる原因となって
いた。

したがって、本発明の目的は、マウスＣＤ２抗原に対す
るモノクローナル抗体を提供するものである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、マウスのＣＤ２抗原に対するモノクロー
ナル抗体を取得するために研究を重ねた結果、■マウス
胸腺細胞を免疫抗原として使用することによりマウスＣ
Ｄ２抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗体
を取得することができることおよび■免疫に使用した動
物種と同じ種の繊維芽細胞にＣＤ２のｃＤＮＡを導入し
た細胞を用いることにより、目的のモノクローナル抗体
を分泌するハイブリドーマを効率的に選別することがで
きることを発見して本発明を完成した。

すなわち、本発明は、マウスＣＤ２抗原に対して特異的
に反応するモノクローナル抗体（以下、モノクローナル
抗ｍＣＤ２抗体と略称することもある）およびその活性
フラグメント関するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本明細書において、「マウスＣＤ２抗ｙＸＪとは、マウ
スのＴ細胞上に存在するヒト赤血球ロゼツトレセプター
に相当する分子を意味するものであり、より具体的には
、本発明者らがすでに報告しているマウスＣＤ２をコー
トする遺伝子の全塩基配列（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　
１４０．１３２１　（１９８８）参照）またはその塩基
配列の任意の一部分に対応するタンパク質を意味する。

「活性フラグメント」とは抗原抗体反応活性を有するフ
ラグメントを指称し、具体的には（Ｆａｂ’　）２、Ｆ
ａｂ’　、Ｆａｂなどを例示することができる。

本発明のモノクローナル抗ｍ　ＣＤ　２抗体は、公知の
細胞融合法、トランスフオーメーシ嶌ン法など応用して
調製することができる。抗体の大量生産には細胞融合法
が適しており、以下、細胞融合法を例にあげ本発明のモ
ノクローナル抗体の製造について説明する。

１）抗体産生細胞の調製 動物に免疫する抗原（免疫抗＊）としてはマウスの胸腺
細胞を用いればよい。マウスの胸腺細胞はその由来によ
り制限されず、通常はＢＡＬＢ／Ｃマウスから調製した
ものを用いることができる。

胸腺細胞の調製は、常法に従って行うことができる。た
とえば、マウスをエーテル麻酔または頚椎脱臼にて死亡
させ、開胸により取り出した胸腺をスライドガラスでこ
すりながら被膜から遊離させた後、ナイロンメツシュを
通して試験管内に集め、最後に遠心洗浄する方法により
胸腺細胞を調製することができる。

胸腺細胞を免疫するための免疫動物としては、マウス以
外のラット、モルモット、ウサギなど通常免疫動物とし
て使用されているものを挙げることができる。

免疫方法は、完全フロインドアジュバント、不完全フロ
インドアジュバント、ミョウバンアジュバント、水酸化
アルミニウムアジュバントなどの各種アジュバントと胸
腺細胞との懸濁液を調製し、これを上記の免疫動物に静
脈、腹腔内、皮下または皮内注射することにより実施す
ることができる・。

投与量は］−回の投与当りＩ　Ｘ　１０７〜１０９個程
度の細胞数が好適である。

このようにして免疫を獲得した動物から、常法により牌
細胞、リンパ節細胞または末梢血細胞を取得して、これ
を抗体産生細胞として使用する。

２）ミエローマ細胞の調製 ミエローマ細胞としては、マウス、ラット、ウサギ、ヒ
トなどの種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能
な株化細胞を使用することができ、抗体産生細胞に応し
て適宜選択して使用する。使用する細胞株としては、薬
剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地で生存でき
ず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質
を有するものが好ましい。通常、８−アザグアニン耐性
株が用いられ、この細胞株はヒポキサンチン−ホスホリ
ボシル１−ランスフェラーゼ（Ｈｙｐｏｘａｎ　ｔｈｉ
ｎｅｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒ
ａｓｅ）　を欠損し、ヒボキサンチン・アミノプリン・
チミジン（ＨＡ　Ｔ　）培地に生育できない。また細胞
の性質として免疫グロブリンを分泌しない、いわゆる非
分泌型の細胞株であることが好ましい。

ミエローマ細胞株の具体例としては、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８
　（ＡＴＣＣＴ　Ｉ　Ｂ−９）　　（Ｎａｔｕｒｅ。

２５６、ｐｐ４９５−４９７　（１９７５））、Ｐ３Ｘ
６３Ａｇ８　　Ｕ、１　（Ｐ３Ｕ１）（ＡＴＣＣＣＲＬ
　−１５９７）（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ
　Ｍｅｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、
ｏｇ！／＋　ｓｔ、　ｐｐｌ−７（１９７Ｂ）　）、Ｐ
３Ｘ６３Ａｇ８．６５３　（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８０
）　　（Ｊ、１：ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　１２３　、　
ｐｐｌ　５４８−１５５０　（１９７９）　）　、Ｐ３
／ＮＳ　Ｉ／１−Ａｇ４−１　（ＡＴＣＣＴＩＢ−１８
）　　（ＥｕｒｏｐｅａｎＪ。

Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　６．　ｐｐ５１１−５１９　
（１９７６））、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣＣＲ
Ｌ−１５８１）　　（Ｎａｔｕｒｅ、　２７６、　ｐｐ
２６９−２７０　（１９７８））などのマウスミエロー
マ細胞株、２１０゜ＲＣＹ、Ａｇ１．２．３　（Ｙ３−
Ａｇ１．２．３）（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６３１）（Ｎａ
ｔｕｒｅ、２７７゜ｐｐ１３１−１３３　（１９７９）
）などのラットミエローマ細胞株、Ｕ　−２６６−Ａ　
Ｒ１（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、　　Ｓ、　　Ａ、、　　７二７
．５４２９　　（１９８０））　、０Ｍ１５００　　（
Ｎａｔｕｒｅ、２８８，４８８（１９８０）　、ＫＲ−
４（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、□、　６６５１　（１９８２）　）
などのヒトミエローマ細胞株を例示することができる。

３）細胞融合 細胞融合にあたっては、抗体産生細胞に適合したミエロ
ーマ細胞を選定する。細胞融合は、イーグル最少基本培
地（ＭＥＭ）　、ダルベツコ変法イークル培地（ＤＭＥ
Ｍ）、ＲＰＭＩ　１６４０培地などの動物細胞培養用培
地中で１０７〜１０ｇのミエローマ細胞と抗体産生細胞
を混合比１：４〜１０に混合することにより行うことが
できる。細胞融合を促進させるために、平均分子量１０
００〜６０００のポリエチレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ
）、ポリビニールアルコール、センダイウィルスなどの
融合促進剤を使用することができる。

また、電気パルスを利用した市販の細胞融合装置を用い
て抗体産生細胞とミエローマ細胞を融合させることもで
きる。

４）選択培地におけるハイブリドーマの選別細胞融合処
理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する手
段としては、選択的培地における細胞の選択的増殖を利
用する方法を用いることができる。たとえば、細胞液を
１０％ウシ胎児血清（ＦＣ８）含有ＲＰＭ１１６４．０
培地などで適当に希釈後、マイクロプレート上に１０’
〜１０６／ウ工ル程度まき、各ウェルに選択培地（たと
えば、ＨＡＴ培地など）を加え、以後適当に選択培地を
交換して培養を行う。ミエローマ細胞として８−アザグ
アニン耐性株、選択培地としてＨＡ　Ｔ培地を用いた場
合は、未融合のミエローマ細胞は培養１０日目ぐらいま
でに死滅し、正常細胞である抗体産生細胞もインビトロ
（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）では長期間成育できないので、培
養１０〜１４日目から成育してくる細胞をハイブリドー
マとして取得することができる。

５）モノクローナル抗ｍ　ＣＤ　２抗体を産生ずるハイ
ブリドーマの選別 モノクローナル抗ｍＣＤ２抗体を産生ずるハイブリドー
マの選別は、マウスＣＤ２のｃＤＮＡをトランスフェク
ションすることにより発現させた繊維芽細胞とトランス
フェクションしない細胞（対照細胞）を選別のための抗
原として用いることにより行うことができる。この時使
用する繊維芽細胞は、免疫動物と同種の動物由来の細胞
を用いることが肝要である。すなわち、免疫動物と同じ
種の繊維芽細胞を選別のための抗原として用いれば、繊
維芽細胞表面上の全ての抗原に対しては異種のものとは
認識しないために、ハイブリドーマから産生されるモノ
クローナル抗体は全く反応しない。しかし、マウスＣＤ
２のｃＤＮＡをトランスフェクションすることにより発
現させた繊維芽細胞を選別のための抗原として用いた場
合には、発現したマウスＣＤ２だけが異種由来のタンパ
ク質であるため、ハイブリトーマが産生ずる七ツクロー
ナル抗体がモノクローナル抗ｍ　ＣＤ　２抗体である場
合に限り反応し、それ以外の抗原に反応するモノクロー
ナル抗体である場合には上記の理由により全く反応しな
い。この原理を利用して、モノクローナル抗ｍＣＤ２抗
体を産生するハイブリドーマを効率的に選別することが
できる。

選別に使用する繊維芽細胞は、免疫動物と同種由来の細
胞であればいずれのものであってもよい。

具体的には、ハムスター繊維芽細胞ｔｋ−ｔｓｌ　３　
（ＡＴＣＣＣＲＬ１６３２）、ＢＨＫ−２１（ＡＴＣＣ
ｃｃｒ＝１ｏ）、ラット繊維芽細胞３Ｙ１（Ｉｎｔ、Ｊ
、Ｃａｎｃｅｒ、　１５．６９４　（１９７５）　）マ
ウス繊維芽細胞　ＮＩＨ−３７３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６
５８）、Ｌｔｋ−（ＡＴＣＣＣＣＬｌ、３）などが例示
される。

繊維芽細胞にトランスフェクションするマウスＣＤ２の
ｃＤＮＡは、マウスのＴ細胞からｍＲＮＡを単離し、こ
れに相補的なりＮＡのライブラリー（ｃＤＮＡライブラ
リー）を調製し、このｃＤＮＡライブラリーからプロー
ブを用いて目的のＤＮＡを単離精製する通常の組換えＤ
ＮＡ手法（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、、１４０．１３２１　　（１９８１）
）またはすでに明らかとなっているマウスＣＤ２の塩基
配列をもとにリン酸トリエステル法、フォスファイト法
などの公知の化学的合成方法を適宜応用することにより
調製することができる。

マウスＣＤ２のｃＤＮＡをトランスフェクションするた
めに使用するベクターとしては、たとえばシミアンウィ
ルス４０　（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウィルス（Ｒ８Ｖ
）、アデノウィルス２、ウシ乳頭腫瘍ウィルス（ＢＰＶ
）、パポバウイルスＢＫ変異株（ＢＫＶ）、サイ１ヘメ
ガロウイルス（ＣＭＶ）などのウィルス由来の真核細胞
の転写制御配列と大腸菌中で増殖するための複製開始点
および抗生物質耐性などの選択マーカーを含有するもの
を使用する。このようなベクターはすでに種々造成され
ており、具体的には、Ｂ　Ｍ　Ｇ　Ｎｅｏ　（Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、、　１８．９７　（１９８８）
　）、ｐ、ＢＰＶ６７Ｔ　（Ｍｏｌｅｃ、Ｃｅｌ］、Ｂ
ｊｏｌ、　１．４８６　（１９Ｋ　ＣＲ（Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、、Ｕ　Ｓ　Ａ　、　　７８
　、　１５２７　　（１９８１）　　）　　、　　ｐｃ
ＤＶｌ　　（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、、３，２８０　（１９８３））などを挙げる
ことができる。

このようなベクターにマウスＣＤ２のｃＤＮＡを常法に
より発現可能な状態で導入し、これをリン酸カルシウム
共沈法、マイクロインジェクション、電気穿孔法などの
常法〔日本生化学金線「続生化学実験講座」第１巻、■
（細胞工学的技術）、第１０１〜１９４頁、１９８７年
銖東京化学同人発行など参照〕により繊維芽細胞にトラ
ンスフェクションする。

このようにして得られたマウスＣＤ２のｃＤＮＡをトラ
ンスフェクションした繊維芽細胞を用いてハイブリドー
マの選別を行う。

選別の方法は酵素標識免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）、放射
性同位元素免疫定量法（ＲＩ　Ａ）などによって行うこ
とができる。たとえば、前述のマウスＣＤ２のｃＤＮＡ
をトランスフェクションした繊維芽細胞とそのような処
理を施さない細胞をそれぞれ付着させた９６ウエルＥＬ
ＩＳＡ用マイクロプレー１〜を用意し、これにモノクロ
ーナル抗体を含むハイブリドーマの培養上清を添加して
抗原抗体反応を行わせ、次いで結合した特異抗体に対し
て酵素標識抗免疫グロブリン抗体を反応させるか、抗免
疫グロブリン抗体を反応させたのち酵素結合プロティン
Ａを反応させ、各ウェルに酵素基質を加えて発色させる
。発色の有無により使用した培養上清がマウスＣＤ２抗
原と特異的に反応する抗体を産生ずるハイブリドーマを
含むかどうかを判別することができ、目的のハイブリド
ーマを選別することができる。

６）ハイブリドーマのクローニング ハイブリドーマのクローニングは、限界希釈法、軟寒天
法、フィブリンゲル法、蛍光励起セルソーター法などの
常法より行うことができる。

７）モノクローナル抗ｍＣＤ２抗体の生産このようにし
て取得したハイブリトーマからモノクローナル抗ｍ　Ｃ
Ｄ　２抗体を生産する方法としては、通常の細胞培養法
や腹水形成法などが採用されうる。

細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０〜５０％
ＦＣ８含有ＲＰＭＩ　１６４０培地、無血清培地などの
動物細胞培養用培地中で培養し、その培養土清液から抗
体を取得することができる。

腹水から回収する方法では、ハイブリドーマと主要組織
適合性が一致する動物又はヌードマウス、ヌードラット
などに、ブリスタン（２，６，１０゜１４−テトラメチ
ルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内に投与した後、
ハイブリドーマを約１０７側腹腔内投与する。ハイブリ
ドーマは１０〜１８日はどで腹水腫瘍を形成し、血清お
よび腹水中に高濃度に抗体を生産する。

抗体の精製が必要とされる場合には、硫安塩析法、ＤＥ
ＡＥセルロースなどの陰イオン交換体を利用するイオン
交換クロマトグラフィー、プロティンＡ−セファロース
などを用いるアフィニティークロマトグラフィー、分子
ふるいクロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選
択し、組合せることにより精製することができる。

〔実施例〕

以下、実施例を示し、本発明のモノクローナル抗体およ
びその製造法について具体的に説明する。

実施例　１ １、ハイブリドーマの調製 Ｂ　Ａ　ＬＢ　／　ｃマウスをエーテル麻酔にて死亡さ
せたのち、解剖して胸腺を摘出した。摘出した胸腺はＭ
ＥＭ培地に入れ、スライドグラスでこすりながら被膜か
ら胸腺細胞を遊離させ、ナイロンメツシュを通し、ＭＥ
Ｍ培地に懸濁させた。

次に、胸腺細胞を完全フロインドアジュバントと懸濁さ
せ、ＳＤクラット約１０′１個の胸腺細胞を皮内に投与
し、さらに２〜４週問おきに３回腹腔内投与して追加免
疫した。最後の免疫後、同様の細胞数を静注して免疫を
完了した。

最終免疫から３日後にラットの肺臓を摘出し、ナイロン
メツシュに通してＭＥＭ培地で洗浄して抗体産生細胞を
得た。

抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１を１０＝
１の割合で混合後、遠心分離して細胞のペレットを得、
このペレットに５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ
）含有ＭＥＭ培地１＋＋＋Ｑを徐々に加えて細胞融合を
行った。

細胞融合後、さらにＭＥＭ培地を加え、全量を１０ｍＱ
とし、遠心分離して、得られたベレットを１０％ウシ胎
児血清含有ＲＰＭ１１６４０培地にＰ３Ｕ１細胞として
３　Ｘ　１０’個１０．１ｍ１ｌｌとなるように懸濁し
、この懸濁液を９６穴マイクロプレートに各ウェル当り
０．１ｍＱずつ分注して３７℃で培養を開始した。

培養開始１日後、ＨＡＴ培地を各ウェルに０゜１ｍＱ添
加し、その後３〜４日ごとに培地の半分量を新しいＨＡ
Ｔ培地で交換した。その結果培養開始−週間後にはすべ
てのウェルにおいてハイブリドーマの成育が認められた
。

２、モノクローナルＩＥＩＩ抗ｍＣＤ２抗体を産生ずる
ハイブリドーマのスクリーニング フィシャーラットの胚（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌＡｓｓｏｃｊａｔｅｓ　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍ　ｄ
　、　、　Ｕ　Ｓ　Ａから入手可能）から樹立したラッ
ト繊維芽細胞３Ｙ１（Ｉｎｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、↓５
，６９４　（１９７５））に以下のようにして作製した
マウスＣＤ２のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含有する発現ベクター
をトランスフエフＩ〜した。

マウスＣＤ２のｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片（１、２Ｋｂ
、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４０．１３２１　（１９８
８））１０μｇを反応液１００ＩＩＡ［６７ｍＭリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）　、６．７ｍＭ塩化マグ
ネシウム、１ｍＭメルカプトエタノール含有〕中、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩラージフラグメント（全酒造■製）２
単位、０．２ｍＭＮＴＰ　（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、
ＴＴＰの混合物）を用いて２５℃、３０分間反応させＥ
　ｃ　ｏ　ＲＩ断片を平滑末端とした。

次に、プラスミドＢ　Ｍ　Ｇ　Ｎｅｏ　（Ｅｕｒ、Ｊ、
Ｉｍｍｕｎｏｌ。

１８．９７　（１９８８））Ｌｏｇを反応液２００μｎ
ｉ：５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７、５）　、１０ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭ塩化マンガン、１ｍＭジチオ
スレイトール含有〕中、制限酵素Ｘｈｏ１２０単位を用
いて３７℃、１時間反応させてＢＭＧＮｅｏのＸｈｏＩ
切断部位を切断して開環した。ＸｈｏＩ切断後、マウス
ＣＤ２のｃＤＮＡと同様にしてＢＭ、ＧＮｅｏのＸｈｏ
Ｉ切断部を平滑末端とし、これと先の平滑末端化したマ
ウスＣＤ２のｃＤＮＡ各５Ｉ１ｇを５０鴻の反応液〔６
６ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）　、６．６ｍＭ
塩化マグネシウム、１ｍＭジチオスレイトール、０．１
ｍＭＡＴＰ含有〕中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ３０単位を用
いて１６℃、４時間反応させてマウスＣＤ２のｃ　Ｄ　
Ｎ　Ａを保有するプラスミド（Ｂ　Ｍ　Ｇ　Ｎｅｏ　−
ｍ　ＣＤ　２　）を作成した。

作成したプラスミドＢＭＧＮｅｏ−ｍＣＤ２　５μｇを
リン酸カルシウム共沈法〔続生化学実験講座、遺伝子研
究法■、第１０１〜１１６頁（＠東京化学同人発行）な
ど参照〕によりラット繊維芽細胞３Ｙ１にトランスフェ
クションした。得られた形質転換体は１０％牛脂児血清
を含むダルベツコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培
養し、Ｇ４１８（アミノグルコシド抗生物質）を１■／
ｐｆｌの濃度になるように添加し、安定な形質転換体を
スクリニングした。さらに、安定な形質転換体は限界希
釈法にてクローニングを行った。

このようにして得られたマウスＣＤ２のｃＤＮＡでトラ
ンスフェクションしたラット繊維芽細胞を用いてモノク
ローナル抗ｍ　ＣＤ　２抗体を産生ずるハイブリドーマ
を選別した。

すなわち、マウスＣＤ２のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａでトランスフ
ェクションした繊維芽細胞とトランスフェクションしな
い繊維芽細胞をそれぞれ９６六マイクロプレートで培養
したものに、各ハイブリトーマの培養上清を５０ｍずつ
添加し、ウサギ抗ラットイムノグロブリン抗体（ダコ社
製）を添加した後、ペルオキシダーゼ結合プロティンＡ
（オリンパス光学工業■製）、基質および発色剤として
過酸化水素とオルトフェニレンジアミンを用いたＥＬＩ
ＳＡ法によりモノクローナル抗ｍＣＤ２抗体を産生ずる
ハイブリドーマ５株を選別した。

選別したハイブリドーマは限界希釈法によりクローニン
グを２回行い、安定なハイプリドーマ株５株（ＲＭ２−
２．２Ｅ６Ａ１．３Ｂ１０Ａ１．３Ｃ１２Ａ１．３Ｃ１
１Ａ４）を樹立するとともに、産生ずるモノクローナル
抗体のサブクラスと一２Ｏ＝ マウス胸腺細胞との反応性を検討した。

サブクラスの決定は、９６六マイクロプレートにウサギ
またはヤギ抗ラットサブクラス抗体（ノルデック社製）
をコートし、３％ゼラチン溶液でブロッキング処理を施
し、ハイブリドーマの培養上清を５０越加えた後、ペル
オキシダーゼ結合ヤギ抗ラットイムノグロブリン抗体（
ジャクソン社製）、基質（過酸化水素）溶液、発色剤（
４−アミノアンチピリン）を順次加えてい＜ＥＬＩＳＡ
法により行った。

各ハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体の
サブクラスは第１表に示すとおりであった。

第１表 マウス胸腺細胞との反応性は、常法により調製したＢ　
Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスの胸腺細胞に本発明のモノク
ローナル抗体を含むハイブリドーマの培養土清を反応さ
せ、次に、フルオレセインインチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）標識抗ラットイムノグロブリン抗体（オリンパス光
学工業■Ｎ）を反応させたあと、Ｆ　Ａ　ＣＳ　（Ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ＡｃｔｉｒａｔｅｄＣｅｌ、ｌ
　５ｏｒｔｅｒ、ベクトン・デツキンソン社製）を用い
て各細胞を解析した。

ＦＡＣ８の解析により得られた本発明のモノクローナル
抗体とマウス胸腺細胞との反応性の結果を第１図〜第５
図に示す。

第１図〜第５図に示されているように、ハイブリドーマ
の培養上清を胸腺細胞に反応させた時っていない）して
おり、このため作製した５株（ＲＭ２−２．２Ｅ６Ａ１
．３Ｂ１０Ａ１．３Ｃ１２Ａ１．３Ｅ１１Ａ４）から生
産されるモノクローナル抗体は、全て、胸腺細胞と反応
するものであることが明らかとなった。

また、２Ｅ６Ａ１．３Ｂ１０Ａ１．３Ｃ１２Ａ１および
３Ｅ１１Ａの４クローンから産生されるモノクローナル
抗体で胸腺細胞を前処理した後に、ＦＩＴＣ標識したＲ
Ｍ２−２産生の抗体を反応させて結合阻害の有無をＦＡ
Ｃ８により検定した。

競合結合試験の結果を第６図〜第１０図に示す。

第６図は胸腺細胞にＦＩＴＣ標識したＲＭ２−２産生抗
体を反応させた時（実線）とＲＭ２−２産生抗体と反応
させた後さらにＦＩＴＣで標準したＲＭ２−２産生抗体
を反応させた時（点線）の結果を示したものである。ま
た第７図〜第１０図は胸腺細胞に２Ｅ６Ａ１．３Ｂ１０
Ａ１．３Ｃ１２Ａ１および３Ｅ１１Ａ４の各ハイブリド
ーマから産生される抗体を反応させた後、さらにＦＩＴ
Ｃ標識したＲＭ２−２産生抗体を反応させた時（図中の
実線）と胸腺細胞にＦＩＴＣ標識したＲＭ２２産生抗体
のみを反応させた時（図中点線）の結果を示したもので
ある。第９図に示されているように、胸腺細胞に３Ｃ１
２Ａ１産生抗体を反応させた後、ＦＩＴＣ標識したＲＭ
２−２産生抗体を反応させても反応しないことから、３
Ｃ１２Ａ１産生のモノクローナル抗体はＲＭ２−２産生
のモノクローナル抗体と競合していることが明らかとな
り、逆に第７図、第８図および第１０図に示されている
ように、胸腺細胞に２Ｅ６Ａ１．３Ｂ１０Ａ１および３
Ｅ１１Ａ４の各ハイブリドーマ産生の抗体を反応させた
後でもＦＩＴＣ標準したＲＭ２−２産生抗体が反応する
ことから、この３株由来のモノクローナル抗体はＲＭ２
−２産生のモノクローナル抗体と競合しないことか明ら
かとなった。これらのことより、３Ｃ１２Ａ１産生抗体
はＲＭ２−２産生抗体の認識する抗原決定基と反応する
が、２Ｅ６Ａ１．３Ｂ１０Ａ１および３Ｅ１１Ａ４産生
抗体は産生法−２産生抗体とは異なる抗原決定基を認識
する抗体であることが示された。

さらに、胸腺細胞表面蛋白質をラクトペルオキシダーゼ
法により１２５■標識した後に、Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−
４０を用いて可溶化し、本発明の抗体と反応させ、生じ
た抗原−抗体複合体を抗うットＩｇ抗体を結合させたプ
ロティンＡセファロースを用いて回収した。回収した免
疫沈降物を５ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法（Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて解析した時のオートラジオグ
ラムを第１１図に示す。第１１図に示されているように
本発明の抗体はすべて分子量５５−７０ＫＤの膜蛋白と
反応することが明らかとなった。また、第１２図に示す
ように、ＲＭ２−２産生抗体と反応するマウスＣＤ２分
子を抽出物中から除去すれば、２Ｅ６Ａ１．３Ｂ１０Ａ
１および３Ｅ１１Ａ４産生抗体に産生法降する分子も消
失することより、これらの４つのハイブリドーマが産生
ずる抗体は、ＲＭ２−２の産生ずる抗体により認識され
るマウスＣＤ２分子と同一の分子に反応していることが
確認された。

以上の結果から明らかなように、本発明のモノクローナ
ル抗体は、マウスの胸腺細胞の表面抗原であるマウスＣ
Ｄ２と反応するものであることが明らかとなり、マウス
ＣＤ２の生理学的機能を解明するための試薬として使用
できることが明らかとなった。

〔発明の効果〕

本発明のモノクローナル抗体は、実施例に示したごとく
、マウスのＣＤ２抗原と特異的に反応するため、マウス
のＣＤ２を生理学的に研究するための試薬として有用で
ある。

また、本発明のモノクローナル抗体を調製する際に使用
した目的の抗体を産生ずるハイブリドーマか否かを選別
するための方法は、ＣＤ２に限らず、そのｃ　Ｄ　Ｎ　
Ａが単離されている抗原であれば広く応用できる極めて
優れた選別方法である。

【図面の簡単な説明】

第１−図〜第５図は本発明のモノクローナル抗体とマウ
ス胸腺細胞との反応性をＦＡＣ８により解析した時の結
果を示すものである。たて軸は細胞数、よこ軸はケイ光
強度を示す。また第１図、第２図、第３図、第４図およ
び第５図はそれぞれＲＭ２−２．２Ｅ６Ａ１．３Ｂ１０
Ａ１．３Ｃ１２Ａ１および３Ｈ２Ａ１の各ハイブリドー
マから分泌されるモノクローナル抗体を使用した時の反
応性を示したものである。 第６図〜第１０図は、ＲＭ２−２から分泌されるモノク
ローナル抗体と、他のハイブリドーマから分泌されるモ
ノクローナル抗体の胸腺細胞との反応の相同性を競合結
合試験により調べた結果を示すものである。たて軸は細
胞数、よこ軸は蛍光強度を示し、第６図〜第１０図はそ
れぞれＲＭ２−２．２Ｅ６Ａ１．３Ｂ１０Ａ１．３Ｃ１
２Ａ１および３Ｈ２Ａ１の各ハイブリドーマから分泌さ
れるモノクローナル抗体を使用したときのものである。 第１１および１２図は５ＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析し
た時のオートラジオグラムを示す。 特許出願人　（６７７）ヤマサ醤油株式会社第３１！ｌ げ ィＬ　１１！、慶 薯 図 げ イ ｆ−低度 第５図 グ イ 尤 強 浅 第 ろ 囚 グ イ 蹟 度 １、’７１！１ η ８図 第９回 グ イ 尤 孜 度 第１０圓 手 続 補 正 書 （方式） １、事件の表示 昭和６３年特許願第２４８７３１号 ２、発明の名称 マウスのＣＤ２抗原に対するモノクローナル抗体 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　　２８８ 住所　千葉県銚子市新生町２丁目１０番地の１電話　０
４７９−２２−００９５　（代表）４、補正命令の日付 （発送臼） ５、補正の対象 図面 ６、補正の内容 願書に最初に添付した図面の浄書・別紙のとおり　（内
容に変更なし）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １）マウスのＣＤ２抗原に対して特異的に反応するモノ
   クローナル抗体またはその活性フラグメント。