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JPH0249589A - Ｈｌａクラスｉｄｎａおよびｄｎａプローブ並びに形質転換細胞 - Google Patents

Ｈｌａクラスｉｄｎａおよびｄｎａプローブ並びに形質転換細胞

Info

Publication number
JPH0249589A
JPH0249589A JP63200758A JP20075888A JPH0249589A JP H0249589 A JPH0249589 A JP H0249589A JP 63200758 A JP63200758 A JP 63200758A JP 20075888 A JP20075888 A JP 20075888A JP H0249589 A JPH0249589 A JP H0249589A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
dna
hla
hla class
class
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP63200758A
Other languages
English (en)
Inventor
Kyoichi Kano
狩野　恭一
Masafumi Takiguchi
滝口　雅文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Olympus Corp
Original Assignee
Olympus Optical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Olympus Optical Co Ltd filed Critical Olympus Optical Co Ltd
Priority to JP63200758A priority Critical patent/JPH0249589A/ja
Priority to EP19890114857 priority patent/EP0354580A3/en
Publication of JPH0249589A publication Critical patent/JPH0249589A/ja
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes

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  • Analytical Chemistry (AREA)
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  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＨＬＡクラスＩ　ＤＮＡおよびＤＮＡプローブ
並びに形質転換細胞に関し、特にはＨＬ　Ａ　（ｈｕｍ
ａｎ　１ｅｕｋｏｃｙｔｏ　ａｎｔｉｇｅｎ）　−Ｂ抗
原のアロタイプをコードするＤＮＡおよびＤＮＡタイピ
ングで患者のクラスＩ遺伝子そのものを取り出して固定
する際に使用されるＤＮＡプローブ並びに本発明のＤＮ
Ａをヒト以外の真核細胞に導入することによりその細胞
表面上にＨＬＡＢ抗原のアロタイプを発現した形質転換
細胞に関する。ＨＬＡクラスＩ抗原のアロタイプを発現
した細胞は免疫原として動物に投与することが可能であ
るためＨＬＡクラスＩ抗原のアロタイプに特異性を有す
るモノクローナル抗体の開発に有用である。さらに、ヒ
ト以外の真核細胞へ本発明のＤＮＡを導入しＨＬＡクラ
スＩ抗原のアロタイプを発現した細胞は抗血清の特異性
判定に使用されるパネル細胞（ｐａｎｅｌ　ｃｅｌｌ）
として有用である。
〔従来の技術〕
ＨＬＡ抗原はヒトの臓器移植の際、移植片の定着の可否
を決定する抗原として移植免疫に重要な役割を果たして
いる。この中でクラス■抗原は、細胞性免疫において細
胞傷害性Ｔ細胞による抗原認識に関与すると共に、尋常
性乾ｍ＜ｃｗ６）、大海ｆ　（ＡＩＯ）　、口疹ヘルペ
ス（Ａ　２９）　。
ベーチェソト（Ｂ５７）などの疾患との有意な相関が明
らかにされている。（０ｚａｕａ、　Ａ、　、　０ｈｋ
ｉｄｏ。
Ｍ、　＋　Ｔｓｕｊ　ｉ＋　３［、Ｊ、　Ａｍ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、土、　２０５．．１９８１
　）ＨＬＡ抗原は拒絶現象や移植免疫に深く関連するこ
とから主要組織適合抗原とも呼ばれ、それをコードする
遺伝子群は主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）と呼
ばれる。
ＨＬＡはヒトのＭＨＣであり、ＨＬＡクラスＩ抗原は細
胞膜上に存在する膜タンパク質であって、Ａ、Ｂ、Ｃの
３つの遺伝子座に支配されている。クラス夏抗原は分子
量４４ｋｄの糖タンパク（α鎖）が分子量１２ｋｄのタ
ンパク質（β２−ミクログロブリン）と非共有結合によ
って会合した構造を持ち、α鎖は細胞外に位置するＮ末
端側に、α１．α２．α３の３個のドメインがあり、次
いで細胞内に埋め込まれた領域（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒ
ａｎｅ　Ｒｅｇｉｏｎ）　、細胞内に位置する領域（ｃ
ｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ｄｏｍｅｉｎ）が並んでいる。
β２−ミクログロブリンは１つのドメインからなり、α
鎖に結合している。
ＨＬＡ遺伝子領域はヒト第６染色体短腕上に２．５セン
チモルガン（ｃ　Ｍ　）の距離に互って存在し、第４図
に示すようにセントロメアーの側からクラス■領域（１
，ＯｃＭ）、　クラス■ｆ、ｌ域（ＤＲ−Ｂ間−０，７
ｃＭ）、クラスＩ領域（０，８ＣＭ）の順に並んでいる
。
（Ｊｏｒｄａｎ、Ｂ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ
、Ｒｅｖ、、８４，７３．１９８５）ＨＬＡクラス■抗
原を検査する方法は、血清学的方法および組み換えＤＮ
Ａ技術によるＨ　Ｌ　Ａ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　　ｔｙｐｉｎ
ｇがある。
血清学的方法としては、補体依存性細胞障害性試験（Ｔ
ｅｒａｓａｋｉ、Ｐ、１．　ａｎｄ　ＭｃＣｌｅｌｌａ
ｎｄ、Ｊ、Ｄ。
Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　、　２０４．ｐｐ９
９８−１０００．１９６４　）が標準的な手法である。
この方法はアロ抗血清を用い、家兎の血清を補体として
リンパ球細胞毒（ｌｙｍｐｏｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ
　）によりＨＬＡをタイプする方法であるが、抗血清が
多産妊婦のアロ血清であること、および、抗血清は交差
反応性Ｃｃｒｏｓｓ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）を示しＨＬＡ
クラス■アロタイプに単一特異的に反応するものが得難
いことから、アロ血清に替わるよいモノクローナル抗体
の開発が望まれている。１９８４年の国際組織適合性ワ
ークショップで、およそ１５０種のモノクローナル抗体
が提出されている。（Ｆａｕｃｈｅｔ＋Ｒ，＋Ｂｏｎｄ
ｅｒ、Ｊ、Ｇ、、Ｋｅｎｎｅｄｙ、Ｌ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ
、：　ＨＬ　Ａ　−Ａ、　Ｂ、　　Ｃｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、　Ｈｉｓｔｏｃ。
ｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　１９８４　
（Ａｌｂｅｒｔ、Ｅ、Ｄ、、Ｂａｕｒ。
Ｍ、Ｐ、、Ｍａｙｒ、Ｗ、Ｒ，ｅｄ、　　）　、　Ｓｐ
ｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ＋Ｂｅｒｌｉｎ、Ｈｅｉｄ
ｅｌｂｅｒｇ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｔｏｋｙｏ：　２１
Ｌ＋１９８４）抗ＨＬＡモノクローナル抗体の作成は、
一般にヒトのリンパ球をマウスに免疫して得られた肺細
胞とマウス骨髄腫細胞を融合させる方法を用１　〇　− いることができる。（Ｏｉ、Ｖ、Ｔ、、■ｅｒｚｅｎｂ
ｅｒｇ、　Ｌ、＾。
：Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
　　ｈｙｂｒｉｄ　　ｃｅｌｌ　　１ｉｎｅｓ。
５ｅｌｅｃｔｅｄ　　ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ、　　３５１．１９８１）しかしなが
ら、現在まででモノクローナル抗体のうちでＨＬＡタイ
ピングに適した抗体−たとえばＨＬＡ−Ｂ抗原のアロタ
イプに対するモノクローナル抗体を例にとると、Ｂｗ４
．Ｂｗ５゜Ｂ７．Ｂ８．Ｂ１３．Ｂ２７に単一特異的に
結合するモノクローナル抗体しか得られていない状況に
あり、他の多数のアロタイプに単一特異性を有するモノ
クローナル抗体の開発が期待されている。最近さらに抗
ＨＬＡモノクローナル抗体作製方法の改善が成された。
この方法は、ヒトのＴリンパ球優位の末梢リンパ球を免
疫原として用いた抗体産生法では、ヒト由来の抗原が多
数存在するために目的とするＨＬＡアロタイプの抗原以
外の多数の抗原部位に対し反応性を示すモノクローナル
抗体が得られる点を改善したものであり、免疫動物由来
の真核細胞にヒ）ＨＬＡ抗原遺伝子クローンを導入して
形質転換した細胞を免疫動物に投与することで形質転換
細胞上に発現したヒトＨＬＡ抗原に対するモノクローナ
ル抗体を効率良く産生ずる肺細胞を得る方法である。（
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｔｏ　
ＨＬＡ　−Ｄ　Ｐ　−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ　ｍｏｕ
ｓｅ　Ｌ　ｃｅｌｌ：　Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、８３．ｐｐ
　３４１７−３４２１．１９８６）ＨＬＡクラスＩ抗原
アロタイプに特異性を有する抗血清、モノクローナル抗
体が得られていないものについてはＤＮＡタイピングが
有力な検査方法である。尋常性乾塵はＨＬＡクラス■抗
原である０ｗ６，０ｗ７に非常に高い相関を示す疾患と
して知られている。（Ｏｚａｉｙａ　ｅｔ　ａｌ、：Ｓ
ｏｍｅ　　ｒｅｃｅｎｔ　　ａｄｖａｎｃｅｓ　　ｉｎ
　　ＨＬ　　Ａ　　ａｎｄ　　５ｋｉｎｄｉｓｅａｓｅ
ｓ、Ｊ、Ａｍ、Ａｃａｄ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　　４＋
　２０５＋１９８１）そこでＯｚａｗａらはＣ抗原遺伝
子クローンｐ４２（Ｓｏｄｏｙｅｒ、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、
、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅ
ｎｃｅ　ｏｆ　ａ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａ　
ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｈｃ＋ｍａｎ　ｃｌａｓｓ　Ｉ　
ｈｉｓｔｏ　ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ａｎｔｉｇ
ｅｎ（ＨＬＡ−Ｃｗ３）　、　ＥＭＢＯＪ、、３　：８
７９．１９８４）のＰｖｕ　Ｉ［フラグメントをプロー
ブとして０ｗ６゜０ｗ７を有する尋常性転層２１名と健
常人１６名についてＤＮＡタイピングを実施した。（Ｏ
ｚａｗａ。
Ａ、ｅｔ　ａｌ　　：　Ｄ　Ｎ　Ａ　　ｔｙｐｉｎｇ　
ｉｎ　ｐｓｏｒｉａｓｉｓＶｕ１ｇａｒｉｓ＋　Ｉｎ：
Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　　３　ｒｄ　Ａ
ｓ１ａＯｃｅａｎｉａ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉ
ｌｉｔｙ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ａｎｄＣｏｎｆｅｒｅｎ
ｃｅ、　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）その結果、シグナル配列、
α１ドメインα２ドメインの一部に相当するＰｖｕ　ｎ
　　　１．７ｋｂフラグメントをプローブとしたときに
患者に特異的なバンドを検出した。
〔発明が解決しようとする課題〕
従来の技術においては、単離され塩基配列の特定された
ＨＬＡＤＮＡが数多く得られていないため、ＨＬＡ抗原
アロタイプの解析、ＤＮＡタイピングの適用に制限を受
けていた。また、抗ＨＬＡモノクローナル抗体を作成す
るための良い免疫原が少なかった。
本発明はこのような事情に着目してなされたもので、新
規なＨＬＡクラスＩ　ＤＮＡおよびＤＮＡプローブ並び
に形質転換細胞を提供することを目的とする。
〔課題を解決するための手段及び作用〕発明者はＨＬＡ
に関する研究を続けた結果、２つのＨＬＡクラスＩ　Ｄ
ＮＡの単離に成功し、本発明を完成させた。
１つはＨＬＡ−Ｂ５１ＤＮＡであり下記の塩基配列で表
わされるエクソンを有する。
ＡＴＧＣＧＧＧＴＣＡＣＧＧＣＧＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧ
ＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＧＧＧＣＡＧＴ
ＧＧＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＧＣＴ
ＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣ
ＣＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧ
ＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴ
ＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴＴＣＧＴＧＡＧ
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ＡＧＧＡＣＧＧＡＧＣＣＣＣＧＧＧＣＧＣＣＡＴＧＧＡ
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ＧＧＡＣＣＧＧＡＡＣＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧ
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ＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＣＧＡＴＧＴＡＴＧＧＣＴＧＣＧ
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ＣＣＧＣＧＧＧＣＡＴＡＡＣＣＡＧＴＡＣＧＣＣＴＡＣ
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ＧＧＣＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡＣＣ
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ＣＧＧＧＡＴＧＧＣＧＡＧＧＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡＧＧ
ＡＣＡＣＴＧＡＧＣＴＴＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＧＡＣＣ
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ＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＣＡＴＧＣＣＡ
ＴＧＴＡＣＡＧＣＡＴＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＡＡＧ
ＣＣＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴ
ＣＴＴＣＣＣＡＧＴＣＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＴＣＧＴ
ＧＧＧＣＡＴＴＧＴＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＴＣ
ＣＴＡＧＣＡＧＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＧＧＡＧＣＴＧ
ＴＧＧＴＣＧＣＴＡＣＴＧＴＧＡＴＧＴＧＴＡＧＧＡＧ
ＧＡＡＧＡＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧＧＡ
ＧＣＴＡＣＴＣＴ（：ＡＧＧＣＴＧＣＧＣＣＡＧＣＧＡ
ＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＴＧＡＴＧＴＧＴＣＴ
ＣＴＣＡＣＡＣＴＴＧＡ 上記塩基配列およびこの明細書の特許請求の範囲５発明
の詳細な説明に記載した塩基配列では、Ａはアデニン、
Ｃはシトシン、ＧはグアニンＴはチミンを示す。
もう１つはＨＬＡ−８ｗ５２ＤＮＡであり下記の塩基配
列で表わされるエクソンを有する。
ＡＴＧＣＧＧＧＴＣＡＣＧＧＣＧＣＣＣＣＧＡＡＣＣＧ
ＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＧＧＧＣＡＧＴ
ＧＧＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＣＧＣＴ
ＣＣＣＡＣＴＣＣＡＴＧＡＧＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＣ
ＣＧＣＣＡＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧ
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ＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴＴＣＧＴＧＡＧ
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ＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＧ
ＡＣＣＡ　ＡＣＡＣＡＣＡＧＡＣＴＴＡＣＣＧＡＧＡＧ
ＡＡＣＣＴＧＣＧＧＡＴＣＧＣＧＣＴＣＣＧＣＴＡＣＴ
ＡＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＧＧＴＣＴＣＡ
ＣＡＣＴＴＧＧＣＡＧＡＣＧＡＴＧＴＡＴＧＧＣＴＧＣ
ＧＡＣＧＴＧＧＧＧＣＣＧＧＡＣＧＧＧＣＧＣＣＴＣＣ
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ＣＧＧＣＧＧＡＣＡＣＣＧＣＧＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡＣ
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ＧＡＧＧＣＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＧＧＧＣＣＴＡＣＣ
ＴＧＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴ
ＣＣＧＣＡＧＡＣＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＣＧＧＧＡＡＧ
ＧＡＧＡＣＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＧＣＧＧＡＣＣＣＣＣ
ＣＡＡＡＧＡＣＡＣＡＣＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣ
ＣＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＧＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧ
ＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣ
ＣＴＧＣＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＣＡ
ＧＣＧＧＧＡＴＧＧＣＧＡＧＧＡＣＣＡＡＡＣＴＣＡＧ
ＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＴＴＧ　ＴＧＧＡＧ　Ａ　ＣＣＡ
　Ｇ　ＡＣＣＡＧＣＡ　Ｇ　ＧＡ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｇ
　Ａ　Ａ　ＣＣＴＴＣＣＡＧ　Ａ　Ａ　ＧＴＧＧＧＣＡ
ＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡＡＧ
ＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＣＡＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＡ
ＧＣＡＴＧＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＡＡＧＣＣＣＣＴＣ
ＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣ
ＡＧＴＣＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＴＣＣｒＴＧＧＧＣＡ
ＴＴＧＴＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＴＣＣＴＡＧＣ
ＡＧＴＴＧＴＧＧＴＣＡＴＣＧＧＡＧＣＴＧＴＧＧＴＣ
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ＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣＴＡＣ
ＴＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＣＡＧＣＧＡＣＡＧＴＧＣ
ＣＣＡＧＧＧＣＴＣＴＧＡＴＧＴＧＴＣＴＣＴＣＡＣＡ
ＣＴＴＧＡ この２つのＨＬＡクラスＩ　ＤＮＡは、その−部の配列
にマーカー物質を標識してＤＮＡタイピングに使用され
るＤＮＡプローブに応用できる。マーカー物質としては
、ベルオキシターゼ。
鉄ポルフイリン誘導体、ルシフェラーゼ等の発光物質、
蛍光物質、２．３−ブタジオン等のリン光物質および３
！ｐ、３８３等の放射性物質が一般的に使用される。こ
れらのマーカー物質およびマーカー物質を１本鎖ＤＮＡ
に標識する方法は公知である。（Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ
ｉｅｗ　Ｂｉｏｐｈｙｓ。
Ｂｉｏｅｎｇ、ｐｐ１７５−１９５．（１９８１）、　
Ｒｉｇｂｙ　ｅｔａｌ、、Ｊ、Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｌ　、　、　１１３．２３７．　（１９７７））
この２つのクラスＨＬＡクラスｌＤＮＡはＨＬＡ−Ｂ５
１，８ｗ５２をそれぞれコードするのでヒト以外の真核
細胞に導入することによりＨＬＡ　−Ｂ５１．　Ｂ　ｗ
５２抗原をそれぞれ発現する形質転換細胞を得ることが
できる。
〔実施例〕
本発明を実施例に基いて説明する。
ＨＬＡ　　−ス■　　　の 染色体ＤＮＡの分離 ＨＬＡ−Ａ２／２．Ｂ５１１５１．Ｃ−／−のハブロタ
イブをもち、ＥＢウィルス（Ｂｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ
Ｖｉｒｕｓ）で形質転換したヒトＢ細胞株ＬＫＴ−２（
北里大学大谷博士より入手）５×１０？個を１０＋ｄの
リン酸緩衝食塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）に浮遊させ、１５００
ｒｐｍで遠心した。上清を捨て、再び１０１ｄのＰＢＳ
に浮遊させ、１５００ｒｐｍで遠心し、上滑を完全に取
り除いた。
次に、ＬＫＴ−２細胞を２−のＬＳＴ緩衝液（２０＋ｎ
Ｍ　　Ｔｒｉｓ溶液ｐ　Ｈ７，４，１０ｍＭ　ＮａＣ］
、　　３　ｍＭＭｇＣｌｇ　）に浮遊させ１５００ｒｐ
ｍで遠心し上滑を取り除いた。４℃に冷却した５％５ｏ
ｃｏｓｅ、　４％ＮＰ　−４０を含むＬＳＴ緩衝液ＩＷ
ＩＩｌを加えＬＫＴ２細胞を浮遊させ５分間放置した。
その後１５００ｒｐａｍで遠心し上滑を取り除き、冷却
した５艷のＡＣＥ緩衝液（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、　
１０＋ｗＭＥＤＴＡ）を加えて撹拌した。０．５−の１
０％ＳＤＳ溶液を加えた後、５艷のフェノール溶液を加
え４分間振盪した。その後２０００ｒｐｍで１０分間遠
心し、上層を新しい試験管に入れた。この試験管に上層
液と等量のクロロホルム溶液を加え４分間振盪後、２０
００ｒｐｍで１０分間遠心し、上層を新しい試験管に入
れた。上層をとった試験管に２倍量の９９％エタノール
をゆっくり加え混合しヒト染色体ＤＮＡを糸状に分離し
た。分離したヒト染色体ＤＮＡ３０μｇを制限酵素Ｅｃ
　ｏＲＩ９０単位（Ｕ）で３７℃３時間インキュベート
した。Ｅ−ＣＯＲＩで切断したヒト染色体ＤＮＡを０．
８％アガロースゲルの末端に添加し電気泳動し、６．Ｏ
ｋｄから８．５ｋｄの範囲にあるＤＮＡｙｆｒｇをＤＥ
ペーパー分離法で分離し、ＨＬＡクラス１ゲノムＤＮＡ
を得た。
上述した操作をＨＬ　Ａ　−Ａｌｌ／２４．　　Ｂ　ｗ
５２／、０ｗ７／−のハブロタイブをもったヒト正常人
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）に対し行なった結果ＰＢＬ細
胞からＨＬＡクラス■ゲノムＤＮＡを得た。
ゲノムＤＮＡライブラリーの作成 分離したヒトＤＮＡ０．４μｇに対してλファージのア
ーム（ＥｃｏＲＩで処理したＡ　０ＮＧＣ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ社製））２．ｃ＋ｇを加え、Ｔ、リガーゼを
加えて、４℃１８時間インキュベートして結合させた。
このサンプルをパソケー″ジングキット（Ｇｉｇａｐａ
ｃｋ−ｇｏｌｄ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使って
ｉｎ　ｖｉｔｒｏでパッケージングした。パフケージン
グがうまくいっているか確認するためパッケージングし
たファージサンプルの力価を以下の手順で調べた。
（サンプルの力価の測定） Ｌ　Ｅ３９２Ｅ、　ｃｏｌｔを少量とり、４０−のＬＢ
培地（ＮａＣ１５ｇ　、イーストイクストラクト５ｇ。
トリプトン１０ｇを１β　ＨｔＯにとかしたもの。）を
入れである５（ｌｄの遠心管に入れ３７℃−晩振盪培養
した。培養したバクテリア培地１ｄを遠心管に加え、さ
らに３ＷＩｌのＬＢ培地と８０ｄを加えた。こうして得
たバクテリア培地０．２−とパッケージングサンプルの
希釈系列２μ７！（原液。
１０倍希釈液、１００倍希釈液、　１０００倍希釈液）
を６ｉｄの試験管に加え３７℃１５分間インキュベート
した。４５℃保温の２．５ｄの０．７％軟寒天を各試験
管に加えて混ぜた後、直径９０誼の１．５％寒天皿の上
に重層する。３７℃８時間培養しプラーク数をカウント
した。
ＨＬＡクラス■ゲノムＤＮＡのクローニング９０ｍの皿
に約４０００個のプラークができるようにライブラリー
の原液を３Ｍ培地（ＮａＣ１１５，８ｇ、ＭｇＳＯ４７
Ｈｚ０　２ｇ、５０ｄ　　ＩＭＴｒｉｓＣｌ　　ｐ　Ｈ
７，５，５ｍＥ　　２％ｇｅｌａｔｉｎを１１Ｈ，Ｏに
とかしたもの。）で希釈した。−次スクリーニングは上
記のサンプルの力価の測定と同様の手順で操作し９０ｍ
皿にファージプラークを形成した。ニトロセルロースＲ
（ＧｅｌｍａｎＳｃｉｅｎｃｅ社製）を軟寒天層上に載
せ５分間放置した。次に、ニトロセルロース膜をｄｅｎ
ａ　ｔｕｒｅ　溶液（０，ＩＭＮ　ａ　ＯＨ，１，５Ｍ
Ｎ　ａ　ｃ　ｌ　）を含むクロマトグラフィー用紙に、
ファージがついている面を上にして載せ５分間放置した
。次に、２倍のＳＳＣ溶液を含むクロマトグラフィー用
紙にニトロセルロース膜を載せ５分間放置した後、ニト
ロセルロース膜を室温で乾燥させた。
最後に、８０℃の真空乾燥機の中で１２０分間放置しプ
ロッティングを完了した。
ハイブリダイゼーションで使用するＨＬＡ−Ｂ７ＣＤＮ
Ａプローブを以下のように調製した。
ＨＬ　Ａ　−Ｂ　７　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　１３４０ｂｐ　
（Ｏｒｒ　Ｈ，Ｔ、ｅｔａｌ　；　Ｂｉｏｃｈｅｉｉｓ
ｔｒｙ、１８，５７１１．１９７９　）がＰｓｔＩｓｉ
ｔｅでＰＢＲ３２Ｂに入っているプラスミドｐＤｐ００
１　　（ＤｒＪｅｉｓｍａｎ＋Ｙａｌｅ　Ｕｎｔｖｅｒ
ｓｉｔｙより入手）をＰｓｔＩで切断し、アガロースゲ
ルで電気泳動し、ＤＥペーパー法で１３４０ｂｐのＨＬ
Ａ−Ｂ７ｃＤＮＡを分離した。分離したＨＬＡ−Ｂ７ｃ
ＤＮ　Ａ　２００ｎｇをニックトランスレーション法に
より”Ｐ−ｄＣＴＰで標識した。標識したｃＤＮＡと未
結合の３ｔＰ−ｄＣＴＰを分離するためセファデックス
Ｇ５０カラムに流し放射能活性のある第１ピークを集め
た。
以下の手順でＨＬＡクラスＩ遺伝子をクローニングした
。
ファージライブラリーをプロッティングしたニトロセル
ロース膜をハイブリダイゼーションバンクに入れた。プ
レハイブリダイゼーション溶液（５０倍のＤｅｎｈａｒ
ｄｔ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　Ｏ，８＊Ｌ１０ｍｆｆＦ
ｏｒａ＋ａｍｉｄｅ＋　０．２ｄ　１０％　Ｓ　Ｄ　Ｓ
　、０．５−の４■／　サケ精子Ｄ　Ｎ　Ａ、　６．６
ｍｌ！　２０倍ＳＳＣ，１，９ｄｌ　Ｈｔ　Ｏ）を加え
バンクを密封し４２℃２時間インキュベートした。２　
Ｘｌ０ＩｆｆｃｐｓのＨＬＡ−Ｂ７ｃＤＮＡプローブと
４　ｗ　／　ｗｔｌサケ精子ＤＮＡ０．５　ｗｉをガラ
ス試験管に入れ１００℃の水浴で１０分間加熱した後、
氷の中で急冷した。このガラス試験管に０．８ｄ！の５
０倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ’５ｏｌｕｔｉｏｎ。
１０ａｅｌ！　ｆｏｒｍａｍｉｄｅ、０．２ｄｌ　１０
％Ｓ　Ｄ　Ｓ、６．６ｍ　２０倍ＳＳＣ溶液、２ｍの５
０％Ｄｅｘｔｒａｎ　５ｕｌｆａｔｅの混合液を加えて
ハイブリダイゼーション溶液とした。ハイブリダイゼー
ションバックからプレハイブリダイゼーション溶液を捨
て、ハイブリダイゼーション溶液を加えてバンクを密封
し４２℃１８時間インキヱベートした。バンクからニト
ロセルロース膜を取り出し、２倍のＳＳＣ，０，１％Ｓ
ＤＳからなる洗浄溶液で３７℃３０分間×２回、さらに
５２℃３０分間×２回洗った後ニトロセルロース膜を乾
燥させた。乾燥したニトロセルロース膜をＷｈａｔｍａ
ｎ　　３　Ｍ　Ｍ濾紙上に固定しＸ線フィルムのカセッ
トに入れＸ線フィルムに３−１８時間露光した後、フィ
ルムを感光させた。黒いドツトとして現れたポジティブ
プラークを確認した後９０ｆ１皿からポジティブプラー
クをパイピペットで取り１ｄＳＭ緩衝液の入っている１
、５ｄ遠心管に入れ３７℃１時間インキュベートした。
次に、クロロホルムを数滴加えて１５０００ｒｐ＋１１
で数秒遠心した後、上清を２次スクリーニングのファー
ジとした。
９０ｆ１皿に１００−５００個のプラークができるよう
に上清をＳＭ培地で希釈した後、１次スクリーニングと
同様の方法でニトロセルロース膜にブロッティングし、
ＨＬＡ−Ｂ　７　ｃ　ＤＮＡプローブを使用しハイブリ
ダイゼーションを行いポジティブプラークを取った。
２次スクリーニングで得たポジティブプラークをパイピ
ペットで取り１ｄＳＭ培地の入っている１、５−遠心管
に入れ室温１時間インキュベートした後クロロホルムを
数滴加えて１５００ｒｐｍ数秒間遠心する。遠心後の上
清を３次スクリーニングのファージとし、２次スクリー
ニングと同じ方法でスクリーニングを行い、すべてのプ
ラークがポジティブプラークであることをハイブリダイ
ゼーションによって確認し、クローニングを完了した。
ＤＮＡの精製 ３次スクリーニングで得たλファージの力価を上述した
サンプルの力価の測定と同様の手順で行った。３次スク
リーニングで得たファージの力価を上げるため９０ｗ皿
にファージプラークをまき、翌日４ｄＳＭ培地を皿に加
えて１時間インキュベートした。次に上清を１．５−遠
心管に入れ５０１１１２のクロロフォルムを加えて１時
間部合した後１５０００ｒｐＩ１１で１分間遠心し、そ
の上清のファージの力価をスクリーニングと同じ方法で
ハイブリダイゼーションを行い測定した。力価は１．０
　Ｘ　１０’であった。
Ｌ　Ｅ３９２　Ｅ、ｃｏｌｉ　を０．４％マルトースの
入ったＮＺＹＤＥ培地３０−に加え一晩培養した。翌日
、培養液を４００Ｏｒｐｍで５分間遠心した後、上清を
すて３Ｍ培地５ｄを加えて細菌を浮遊させた。この際分
光光度計で６００ｎｍのＯＤ値を測定しながら、ＣＯＤ
値１．０＝　８　ＸＩＯ”個）４Ｘ１０”個１７）Ｅ、
ｃｏｌｉを５ｉａｅＳＭ培地に浮遊するようにした。上
で調製したｌＸｌ０９力価のファージと４×１Ｑ１１１
個のＥ、、ｃｏｌｉを浮遊させた５＋ｄＳＭ培地を試験
管に入れ３７℃２分間インキュベートした。
インキエベートした試験管中の溶液をＩ　ＪＮＺＹＤＥ
培地に加え３７℃８時間振盪培養した。さらに、１０ｄ
クロロフオルムを加え２０分間振盪した後、この培養液
を１１の遠心管に入れ３５００ｒｐＩ１１で３０分間冷
却しながら遠心した。次に、上清を新しい遠心管に入れ
ＤＮａ　ｓ　ｅ、ＲＮａ　ｓｅをそれぞれ１Ｍｇ／−に
最終濃度がなるように加えて室温３０分インキエベート
した。この遠心管に３６ｇＮａＣ１と６４　ｇ　Ｐ　Ｅ
　Ｇ６０００　（シグマ社製）を加えて溶解し４℃−晩
装置した。この遠心管を３５００ｒｐｍで３０分間遠心
し上清を捨てた。６−の３Ｍ培地を加えた後、この遠心
管中の溶液を別の５０−の遠心管に移し、６−クロロフ
ォルムを加えよく混合した。５〇−遠心管を４０００ｒ
ｐｍで遠心した後、上清を別の新しい遠心管に移した。
３Ｍ培地を加えて全体を６−にし３ｇＣ５ｃ１を加えて
よく溶解させた。遠心管を２２００Ｏｒｐｍ　４時間遠
心してＣｓＣ１比重遠心分離法によりファージ層を分離
した。分離したファージ層をとり、１．５　ｇ／ｄ、ｃ
　ｓ　Ｃ１，を含む３Ｍ培地に加えて再び４５０００ｒ
ｐｍ１８時間遠心しファージ層を分離した。このファー
ジ層の溶液を透析膜に入れ０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ、　０．
０５Ｍ　ＮａＣ１，Ｏ，ＯＯＩＭ　ＭｇＣｌ２　の溶液
で１時間透析した。透析後のファージ溶液に１／１０の
量＋７）　０．５）ｊ　ＥＤＴＡ、　　１　／２０（７
）量ノ１０％ＳＤＳ、１／２０の量の２　ｔ＠　／　ｍ
ｆＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋを加え室温３０分間インキ
ュベートした。次に、Ｐｈｅｎｏｌ法によってＤＮＡを
分離し、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　ＴｒｉｓＣｌ、１＋ａ
Ｍ　ＨＤＴＡ　ｐＨ８，ｏ　）で−晩透析してＤＮＡを
精製した。
に　るＨＬＡクースＩ　　　の クローニングしたＨＬＡクラスＩゲノムＤＮＡをｔｋ−
マウスＬ細胞に遺伝子導入しその細胞表面上での発現を
抗ＨＬＡクラスＩ抗体で調べた。
マウスＬ細胞へのＨＬＡクラスＩ遺伝子の導入遺伝子移
入の前日、５×ｌＯ６個のマウスＬ細胞を７５ｃＪの培
養フラスコに入れ１０％ＦＣ３を含むＭＥＭ培地中で培
養した。
Ｃａ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ沈殿法により沈殿物を以下の
手順で作成した。
（ａ）２０ｐｇ　／　１００μＩＩのＨＬＡクラスＩゲ
ノムＤＮＡと、１Ｍｇ／１００μｌのチミジンキナーゼ
遺伝子と、１００μＮ　　ＣａＣ１ｚ　　・２ＨｚＯ溶
液ｐＨ７，０と、７００μｐのＨ，Ｏを濃合し総量を１
ｍｌとした。
（ｂ）Ｈｅ　ｐ　ｅ　ｓ　／Ｎａ　Ｃｌ溶液と　１００
倍のＮ　ａ　ＨＰ　Ｏ４Ｙ’Ｊ液を４９：１で混合し、
その溶液を６艷の試験管に入れた。
（ｃ）　（ａ）で作成した溶液を１滴ずつ（ｂ）の試験
管に入れ混合した１１ｅ２０分間インキュベートしＣａ
−ＤＮＡ沈殿物を作成した。
前日培養したマウスＬ細胞をＣａ非含有ＰＢＳで１回洗
浄した後、Ｃａ−ＤＮＡ沈殿物を加えてフラスコ中で１
５分間インキュベートした。
さらに１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を含むＭＥＭ培地
を１〇−加えて３７℃６時間ＣＯ□インキュベーターで
インキュベートした。次に、ＦＣ３非含有培地を用いて
作成した３４％ＰＥＧ−５％ＤＭＳＯｉ液でフラスコ中
の培地を除いた後、２ｄの３４％ＰＥＧ−５％ＤＭＳＯ
溶液を加えて３分間インキュベートした。ＦＣ３非含有
培地で３回洗浄後、１０％ＦＣ３を含む培地で２回洗浄
した。次に、１０−の１０％ＦＣ３を含む培地を加え一
晩培養した。翌日、ＨＡＴ培地に変え培養した。２〜３
日毎にＨＡＴ培地を交替した。
約１４〜２１日でｔｋ遺伝子導入し細胞が増殖しコロニ
ーを形成するのを確認した。各コロニーをクローニング
リングを使って拾った後、各クローンを培養した。
形質転換細胞上に発現したＨＬＡクラスＩ抗原の確認 クローン化した各コロニー１×ｌＯ６個をＰＢＳで２回
洗い１００μβのＰＢＳに浮遊させた後、５０μｌずつ
２本の試験管に入れた。２本の試験管に５０μｌの抗Ｈ
ＬＡクラスＩモノクローナル抗体Ｗ　６　／３２　（Ｐ
ａｒｈａｍ　Ｐ　ｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｉｎ＋ｍｕｎｏｌ。
（１９７９）、１２３．ｐｐ３４２−３４９）と、５０
μｌの抗ＨＬＡＤＲモノクローナル抗体Ｌ　２４３　（
Ｌａｍｐｓｏｎ　ＬＡｅｔ　ａｌ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ
、（１９８０）、１２５．ｐｐ２９３−２９９）を別々
に加え４℃３０分インキュベートした。各試験管に０．
５艷のＰＢＳを加えて１５００ｒｐｍで５分間遠心し、
上清を取り除いた。これを３回繰り返した。５０倍希釈
のＦＩＴＣ抗マウスＩｇ抗体（５ｉｌｅｎｕｓ社製）を
各試験管に加えて４℃３０分インキュベートした。各試
験管に０．５ｍｌ！　Ｐ　Ｂ　Ｓを加え、１５００ｒｐ
ｍで５分間遠心して、上滑を取り除く作業を３回繰り返
した。最後に１ｍｆｆＰＢＳを各試験管に加えスペクト
ラム■（オルソ−社製）で蛍光強度を測定した。Ｌ細胞
上にＨＬＡクラスＩ抗原を発現している細胞は、Ｗ６／
３２抗体で蛍光強度がＬ２４３抗体より強くなり発現が
確認できる。
以上の方法により、Ｌ　Ｋ　Ｔ　−２細胞から得たゲノ
ムＤＮＡを導入した形質転換細胞がＬＫＴ２−１８．Ｌ
ＫＴ−２−２１の２種類のＨＬＡクラスＩ遺伝子を発現
し、ＰＢＬ細胞から得たゲノムＤＮＡを導入した形質転
換細胞がＡ−２Ａ−１１，Ｌ−１，Ｌ−２，Ｌ−３，Ｉ
−１の６種類のＨＬＡクラスＩ遺伝子を発現しているの
を確認した。
ローニング　−ＨＬＡ　　−スＩ　゛　ムＤＮＡのアロ
　　　の。
ＬＫＴ−２細胞より分離したＨＬＡ−２−１８とＰＢＬ
細胞より分離したＬ−２は制限酵素マツプがきわめて類
似しており、ＨＬＡ−Ｂ５１およびＨＬＡ−Ｂｗ５２抗
原遺伝子であることが強く示唆された。そこでこの遺伝
子を導入したマウスＬ細胞をヒトの抗Ｂ５１血清および
抗Ｂ５血清の吸収試験に使い、そのアロ抗原性を決定し
た。
マウスＬ細胞およびＬＫＴ−２−１８あるいはＬ−２を
遺伝子導入したマウスＬ細胞５Ｘ１０’個を１．５藏の
遠心管に各別に入れ、各遠心管を１５０００ｒｐｍで１
分間遠心し、上滑を取り除いた。
各細胞の入った遠心管を複数本用意した。ＬＫＴ−２−
１８を遺伝子導入したマウスＬ細胞（ＬＫＴ−１−１８
・マウスＬ細胞）の入った２本の遠心管に、抗Ｂ５抗体
および抗Ｂ５１抗体をそれぞれ加え、またＬ−２を遺伝
子導入したマウスＬ細胞（Ｌ−２・マウスＬ細胞）の入
った３本の試験管と、マウスＬ細胞の入った３本の試験
管に抗Ａｌｌ血清、抗Ａ２４血清、抗Ｂ５血清をそれぞ
れ加え、３７℃３０分間、次に４℃３０分間インキュベ
ートした。各試験管を１５０００ｒｐａ＋で５分間遠心
後、その上清を補体依存性細胞障害性試験にて検査した
。結果を表１に示す。
表１ 細胞障害試験結果 下記血清の吸収後の 細胞障害率（％） 吸収細胞　　　　　標的細胞　抗Ａｌｌ抗Ａ２４抗Ｂ５
　　抗Ｂ５１マウスＬ細胞　　　　ＰＢＬ　　　　１０
０　　５０　１００　　　ＮＴＬＫＴ−２ＮＴ　　　Ｎ
Ｔ　　１００　１００Ｌ−２・ｎｘＬＩＩｌ胞　　　　
　　　　ＰＢＬ　　　　　　　　８０　　　　５０　　
　　１０　　　　　ＮＴＬＫＴ−２−１８？？スＬ細胞
　　　　ＩＴ−２ＮＴ　　　　　ＮＴ　　　　＜１０　
　　　３０注）ＰＢＬ細胞はＨＬ　Ａ　−Ａｌｌ／２４
．　Ｂ　ｗ５２／−Ｃｗ７／−である。
ＮＴ、未試験 試験に使用した抗Ａ１１．抗Ａ２４．抗Ｂ５゜抗Ｂ５１
の各ヒト血清は東大病院輸血部十字博士より入手した。
以上の結果よりＬＫＴ−２−１８はＨＬＡ−８５１であ
り、Ｌ−２はＨＬＡ−８ｗ５２であることを確認した。
第１図はヒト第６染色体上のＨＬＡ−Ｂ遺伝子領域の構
成図である。５′端から１〜７のエクソンが並んでいて
、エクソン１から順にシグナルペプチド、α、−ドメイ
ン、α２−ドメイン、α、−ドメイン、ＴＭ６１域をコ
ードしており、エクソン６．７はＣＹＳＮ域のペプチド
をコードしている。ＬＫＴ−２−１８，Ｌ−２のゲノム
ＤＮＡをデオキシ法により全塩基配列を決定した。結果
を第２図に示す。図中、ＬＫＴ−２−１８はＨＬＡ−Ｂ
５１．Ｌ−２はＨＬＡ−８ｗ５２として表示した。
第３図は第２図に示したＢ５１，８ｗ５２の各エクソン
部がコードするペプチドのアミノ酸シークエンスを示す
。アミノ酸は１文字略記で表示してあり、Ａはアラニン
、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパラギン、Ｄはアスパラギ
ン酸、Ｃはシスティン、Ｑはグルタミン、Ｅはグルタミ
ン酸。
Ｇはグリシン、Ｈはヒスチジン、■はイソロイシン、Ｌ
はロイシン、にはリジン、Ｍはメチオニン、Ｆはフェニ
ルアラニン、Ｐはプロリン。
Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｗはトリプトファン、Ｙ
はチロシン、■はバリンを示す。
図中、参考としてＡ２．１．Ａ３．１．Ａ２４゜Ｂ　Ｔ
、１．Ｂ２７．１．Ｂ４０．Ｂ４４．Ｂｗ５８のアロタ
イプのペプチドのアミノ酸配列を並記した。
Ａ２．１はＫｏｌｌｅｒ、　Ｂ、Ｈ，ｅｔ　ａｌ　　：
　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。
（１９８５）、１３４．ｐ２７２７、Ａ３．１は５ｔｒ
ａｃｈａｎ、Ｔ。
ｅｔ　ａｌ　　：　ＥＭＢＯＪ、（１９８４）、３．ｐ
ｐ８８７−８９４　　　Ａ２４はＮ　’　Ｇｕｙｅｎ、
Ｃ，ｅｔ　ａｌ：Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｌｃｓ（１９
８５）、２１゜４７９Ｂ７．１はＯｒｒ　Ｈ，Ｔ、ｅｒ
　ａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）　、　
ＩＦ！、５７１１、Ｂ２７．　１は−ａｎ、＾、Ｍ、ｅ
ｔ　ａｌ：Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、　（１９８６）
　、　１３７．３６７１、Ｂ　４０．　　Ｂ　４４はＷ
ａｙｓ、Ｊ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ：Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ
ｉｃｓ、（１９８７）＋２５゜３２３　　８ｗ５Ｂは！
ｔｒａｙｓ、Ｊ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ：Ｊ、Ｂｉｏｌ、ｃｈ
ｅｍ、＋（１９８５）　、２６０．１１９２４として公
知である。
ＤＮＡ　　ロー　への ＨＬＡ−Ｂ５１，８ｗ５２の塩基配列が上述した実施例
により明らかになったことから、Ｂ５１゜８ｗ５２のア
ロタイプをＤＮＡタイピングによって決定することが強
く期待される。
ＨＬＡ−Ｂ５１と８ｗ５２はα１　ドメインをコードす
るエクソン２で４個のヌクレオチドの置換が認められた
。エクソン２で置換の認められたヌクレオチドを含む領
域がアロタイプに特異的な塩基配列であろう。
プローブに用いるＤＮＡはＨＬＡ−Ｂ５１゜ＢＷ５２の
一部であり、特定された塩基配列は、ＤＮＡ合成機又は
ホスホトリエステル合成法により合成する。合成したＤ
ＮＡにアルカリフォスファターゼ（３，１，３，１）　
、ポリヌクレオチドキナーゼ〔２，７，１，７８〕とα
−”ＰｄＡＴＰを加えて１末鎖ｔ）ＮＡの５′端に３１
ｐを標識することにより、ＤＮＡプローブが得られる。
〔発明の効果〕
本発明はＨＬＡクラスＩアロタイプの研究、検査、診断
に有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図はヒト第６染色体上のＨＬＡ−Ｂ遺伝子領域の構
成図、 第２図（１）、　　（ＩＩ）はＨＬ　Ａ　−Ｂ５１．　
Ｂ５２の塩基配列を示す図、 第３図（１）、（ｎ）、（Ｉ［［）はＨＬＡＢ５１．　
　Ｂ５２がコードするアミノ酸配列を示す図、第４図は
ヒト第６染色体上のＨＬＡ遺伝子領域を示す図である。 ＴＭ領領 域５１ ｗ５２ Ａ２．Ｉ Ａ３．Ｉ Ｂ７．１ Ｂ２７．１ ｗ５８ ｗｌ ０ｗ２ ０ｗ３ ＣＹ領領 域５１ ｗ５２ Ａ２．Ｉ Ａ３．Ｉ Ｂ７．１ ｗ５８ ｗｌ ０ｗ２ ０ｗ３ ２８０　　　　　　　２９０　　　　　　　３００　　
”　　　　　　３１０ＥＰＳＳＱＳＴ１．ＰＩＶＧＩＶ
ＡＧＬＡＶＬＡＶＶＶＩ　　ＧＡＶＶＡＴＶＭＣＲＲＫ
ＳＳ−−−−−Ｐ−−−−−−−１−−−ＶＬＦＧＡ−
ＩＴ　　−−−−−Ａ−−Ｗ−−−一−−Ｌ−−−Ｐ−
−−−−−−１−−−ＶＬ−ＧＡ−ＩＴ　　−−−−−
Ａ−−Ｗ−−−−−−−−−−Ｐ−Ｖ−−−−−１−−
−ＶＬ−ＧＡ−ＩＴ　　−−−−−Ａ−−Ｗ−−Ｎ＝−
−−−−ＰＳＶ−−−−−ｍ−−Ｐ−−−−−−−−−
一−−−Ａ−−−−−−−−−−−−−Ｖ−−−−−−
−−−−−−−−−一−−−−−−Ａ−一−−−−−−
−−−−−Ｖ−−−−−−−−−−一−−−−−−−−
−一−Ａ−−−−−−−−−−−−Ｐ−−−−−−−−
− 一−−−−Ｐ−−−−−−−−−−− −−−−Ｐ−−一−−−−−−−− −ＬＡＶＬ −−−−ＬＡＶＬ −−−−ＬＡＶＬ −−−Ｖ−−−−−　−−− 一−Ｖ−−−−−−−− 一−−Ｖ−−−−−−−− ＧＧにＧＧＳＹＳＱＡＡＳＳＤＳＡＱＧＳＤＶＳＬＴＡ
ＵＤＲ−−−−一−−−−−−−− ＤＲ−−−−−Ｔ−−−−一− ＤＲ−−−−−−−一−−− 一−−−−−−−−−−Ｃ −一一−−−−−−−−Ｃ− 一−−−−−−−−−−Ｃ− ｍ−−−−ＣにＶＬＪ −一−Ｃに■Ｕ ＣＫＶＵ −−−−−−Ｃ−−−−−＝Ｎ−−−−−−Ｅ−−１−
ＣＫＡＵ−−−一−−Ｇ−−−−−”−Ｎ−−−−−−
Ｅ−−１−ＣＫＡＵ−−−−−−Ｃ−−−−−−Ｎ−−
−−−−Ｅ−−１−ＣＫ　ＡＵ第 図（１）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、下記の塩基配列で表わされるエクソンを有するＨＬ
    ＡクラスＩＤＮＡ 【遺伝子配列があります】 上記式中、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン
    、Ｔはチミンを示す。 ２、下記の塩基配列で表わされるエクソンを有するＨＬ
    ＡクラスＩＤＮＡ 【遺伝子配列があります】 上記式中、Ａはアデニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン
    、Ｔはチミンを示す。 ３、下記のアミノ酸配列をコードするＨＬＡクラスＩＤ
    ＮＡ 【アミノ酸配列があります】 上記式中、Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパ
    ラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシステイン、Ｑはグ
    ルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｈはヒス
    チシン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン
    、Ｍはメチオニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリ
    ン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｗはトリプトファン
    、Ｙはチロシン、Ｖはバリンを示す。 ４、下記のアミノ酸配列をコードするＨＬＡクラスＩＤ
    ＮＡ 【アミノ酸配列があります】 上記式中、Ａはアラニン、Ｒはアルギニン、Ｎはアスパ
    ラギン、Ｄはアスパラギン酸、Ｃはシステイン、Ｑはグ
    ルタミン、Ｅはグルタミン酸、Ｇはグリシン、Ｈはヒス
    チジン、Ｉはイソロイシン、Ｌはロイシン、Ｋはリジン
    、Ｍはメチオニン、Ｆはフェニルアラニン、Ｐはプロリ
    ン、Ｓはセリン、Ｔはトレオニン、Ｗはトリプトファン
    、Ｙはチロシン、Ｖはバリンを示す。 ５、請求項１記載のＨＬＡクラスＩＤＮＡの一部と、Ｄ
    ＮＡの一部に結合したマーカー物質とからなるＤＮＡプ
    ローブ。 ６、請求項２記載のＨＬＡクラスＩＤＮＡの一部と、Ｄ
    ＮＡの一部に結合したマーカー物質とからなるＤＮＡプ
    ローブ。 ７、請求項１記載のＨＬＡクラスＩＤＮＡをヒト以外の
    真核細胞に導入して得られＨＬＡＢ５１抗原を発現する
    ことを特徴とする形質転換細胞。 ８、請求項２記載のＨＬＡクラスＩＤＮＡをヒト以外の
    真核細胞に導入して得られＨＬＡＢｗ５２抗原を発現す
    ることを特徴とする形質転換細胞。
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