JPH04505401A - 主要組織適合抗原に会合したペプチドを認識するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ム　にムムしたペプチドを！−るモノクロ本発明は主要組織適合抗原に会合した ペプチドを認識する制限モノクローナル抗体に係る０本発明は更に、所定の病気 の診断と治療、場合により予防へのこれらの抗体の適用に係る。

主要組織適合遺伝子複合体分子（ＭＨＣ分子）が免疫系に非自己から自己を識別 させる認識膜楕遣として有用であることは知られている。ＭＭＣ分子の主要機能 はＴリンパ球に抗原を与えることである。

ＭＨＣ分子がクラスＩに属するかクラス■に属するかに従って、ＭＭＣ分子と抗 原とにより形成される複合体は夫々細胞毒性Ｔ細胞又はＢリンパ球により抗体の 合成を活性化させることが可能な補助Ｔ細胞により認識される。

種々の研究により、ＭＨＣ分子に会合した抗原を認識する抗体の存在が既に立証 されている０例えば、Ｖａｎ　Ｌｅｕｖｅｅｎ他（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、（１９ ７９＞　１且、１０７５−１０８３）は、ＨＬＡ−Ａ２型のＭｌ″″ＩＣ分子に 会合したＨ−Ｙ抗原を有するリンパ球を特異的に溶解させることが可能な抗体を 含むポリクローナル血清が貧血罹患患者に存在することを記載した。

しかしながら、現在までに知られている研究結果によると、制限モノクローナル 抗体、即ち所定の抗原と、この抗原の同様に所定の特異的ＭＨＣ分子とにより形 成される複合体に特異的なモノクローナル抗体を製造することも同定することも できなかった。

このことに関しては、制限モノクローナル抗体の製造を目的として実験モデルを 作成しようとした複数のチームが否定的な結果を報告している。

例えばＡ型インフルエンザウィルス、８３Ｎ２　（Ｘ−３１）株を抗原として使 用したＴａｍｍ１ｎｅｎ他のチーム（Ｔａｍｍｉｎｅｎ他、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍ ｏｎｏｌ。

（１９８７）　１７．　９９９−１００６）及び抗原としてインシュリンを使用 したＲｕｂｉｎ、Ｍａｌｉｓｓｅｎ、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ及びＺｅｕｔｈｅｎの チーム（Ｒｕ　ｂ　ｉ　ｎ他、Ｒｅｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８９）１４０、 、、、）は否定的な結果を報告しており、即ち制限抗体を製造することができな かったと報告している。

Ｋｌｉｎｍａｎのチームは肯定的な結果を記載している（Ｗｙｌｉｅ他、Ｊ、Ｅ ｘｐ、Ｍｅｄ、（１９８２）　１５５、　４０３−４１４；　Ｆｒｅｓｃｈｅｒ 及びＫｌｉｎｍａｎ、　Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、（１９８６）　１６４゜１９６ −２１０＞、Ｉ、かじながら、Ｋｌｉｎｍａｎ他の研究は、製造されるモノクロ ーナル抗体が腫瘍ウィルスＳＶ４０により形質転換された細胞を認識すると示し ているものの、認識される抗原も該当ＭＭＣ分子も同定されていない。

本発明の制限モノクローナル抗体の製造に伴う困難は、種々の要因、特に具体的 な抗体製造方法を完成し、スクリーニング感度の高い方法を得るという点に帰着 し得る。

本発明者らは種々の病気の診断及び治療に制限モノクローナル抗体が果たし得る 役割に着目した。

本発明者らは従来の困難を解消し、抗原とこの抗原を特異的に認識するＭＨＣ分 子との会合により構成される複合体に特徴的な制限モノクローナル抗体を得た。

従って、本発明はＭＨＣの分子に会合した抗原を認識する制限モノクローナル抗 体に係る。制限モノクローナル抗体産生性のハイプリドーマ株も本発明の範囲に 含まれる。

、本発明は更に、感染又は腫瘍症状もしくは自己免疫病、患を発生し得る細胞障 害の存在の診断用組成物にも係る。

本発明は更に、感染又は上記のような細胞障害の治療用組成物にも係る。

本発明は更に、本発明の制限モノクローナル抗体の製造方法にも係る。

本発明の制限抗体により認識される複合体の２成分の一方を構成する上記抗原は 、感染もしくは病原物質に由来するタンパク質の分解から得られるようなペプチ ド、又は細胞障害から得られるペプチド、又は自己分解したタンパク質である。

これらのペプチドは例えばリゾソーム又はゴルジ装置の酵素による酵素切断によ り得られる。

複合体を形成するためには更に、ペプチドとＭＭＣ分子℃が相互に結合できるこ とが必要である。

制限モノクローナル抗体を製造するためには、これらのペプチドは有利には従来 のペプチド合成方法に従って化学的合成経路により得られる。

ペプチドは同様に、病原物質のタンパク質又は腫瘍型もしくは自己免疫型の細胞 障害に関与するタンパク質、特に突然変異タンパク質のような天然タンパク質か ら製造され得る。

本発明のモノクローナル抗体は、病原物質の抗原の特徴を有するペプチド又は細 胞障害の特徴を有するペプチドと、このペプチドを認識及び固定する能力を有す る主要組織適合抗原複合体（ＭＭＣ’）の分子とにより形成される複合体を特異 的に認識することができることを特徴とし、該抗体はペプチドを固定しない（ペ プチドに非特異的）ノ１プロタイプＭＨＣ分子と会合する該ペプチドを認識しな いことから、制限モノクローナル抗体である。

ペプチド−クラスＩのＭＨＣ分子の結合の特異性を決定するためには、ＢＯＵＩ 　ＬＬＯＴ他（Ｎａｔｕｒｅ、１９８９、ｖｏｌ、３３９．　ｐ、４７３　４７ ５）により記載されているような試験を実施することができる。

この試験によると、ＭＭＣ分子に対する特異性をめるペプチドを、クロム５１の ような放射性同位体で標識した細胞上で既知のＭＨＣ分子と共にインキュベート する。このインキュベーション後、懸濁液をペプチドの特異的細胞毒性リンパ球 （ＣＴＬ）の存在下にお（、ＣＴＬ細胞がペプチド及びＭＨＣ細胞の存在下にお いた細胞を溶解するとき、ＭＭＣ細胞はペプチドに対する特異的親和性を有する と推測することができる。

同様に、ペプチドとクラス■のＭＨＣ抗原との機能的且つ特異的会合を測定する ことが可能な種々の試験が存在する０例えば５ｅｔｔｅ他（Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、（ １９８９）。

Ｖｏｌ、８６．　ｐ３２９６−３３００）の試験を実施することができる。

上記抗体は制限モノクローナル抗体なる用語により表される。

本発明の一実施態様によると、制限モノクローナル抗体は更に、該抗体が特異的 でありながら分離状態で存在するペプチドに対して全く又は実質的に反応しない こと、及び／又は単独ＭＨＣ分子を僅かに認識するが又は全く認識しないことを 特徴とする。

単独ペプチドを認識する能力を実質的にもたない抗体は、本発明によると、バッ クグラウンドノイズに対応する信号の２分の１未満の反応をこのペプチドとの間 に示す抗体である。

単独ＭＨＣ分子を僅かに認識する抗体は、ペプチド−特異的ＭＨＣ複合体との間 に同一条件で存在する反応の約１／１０〜１１５の反応に従ってこのＭＨＣ分子 を認識する。

得られるモノクローナル抗体が本発明の定義に合致するか否かを決定するために は、例示として以下に説明するようなＥＬＩＳＡ型の酵素抗体反応を実施するこ とができる。

酵素抗体反応はまず、ハイブリドーマ培養上清上でウレアーゼ又はアルカリホス ファターゼに結合した抗マウスエを複合抗体をベースとする試薬により実施され る。次に例えばアルカリホスファターゼに結合した抗マウスＩｇ複合抗体により 反応を確認する。標的として使用される細胞は、例えば形成が所望される抗体に 対応するペプチドと共に（細胞１０７個あたり５〜５０μｇ　／　ｍ　１の割合 で３７℃で１〜２時間）予めインキュベートした牌細胞である。Ｔｅｒｎｙｎｃ ｋ及びＡｖｒａｍｅａｓ　（Ｔｅｒｎｙｎｃｋ及びＡｖｒａｍｅａｓ：　Ｔｅｃ ｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｍａｔｉｑｕｅｓ　−Ｌｅｓ　６ｄｉｔ ｉ。

ｎｓ　ＩＮＳＥＲＭ、１９８７）により記載の方法に従ってポリ−し−リシンを 介してポリビニルプレートに細胞を固定する。

制限モノクローナル抗体が本発明に属するが否がを立証するために使用され、従 って本発明の制限モノクローナル抗体との間に陽性の反応を与えてはならない対 照は、別々に採用される成分の一方又は他方（即ち形成が所望される制限モノク ローナル抗体に対応するペプチド又は該ペプチドなしに対応する単独ＭＭＣ分子 を含む細胞〉と、結合しない即ち非特異的なパートナ−と会合したこれらの成分 の一方又は他方（形成が所望される制限モノクローナル抗体に対応し、調査下の ＭＨＣ分子に会合したペプチド以外のペプチド又は製造が所望される制限モノク ローナル抗体に対応し、非特異的ＭＭＣ分子に会合したペプチド）とから構成さ れる。

上記陽性反応は、制限抗体以外の全反応成分を含むウェルに観察される光学密度 （ＯＤ）の少なくとも２倍の光学密度により表される。

本発明の制限モノクローナル抗体は高い選択性を有するという利点があり、従っ て、診断、治療及び場合によりワクチン接種に適用すると特に有利である。

本発明の抗体により認識されるペプチドは、ウィルス、細菌、寄生虫（例えばマ ラリア原虫）又は真菌類、特に病原性酵母のような病原物質の特徴を示し得る。

副組織適合抗原を表すペプチド、腫瘍もしくは癌型又は自己免疫型の細胞障害の 特徴を有するペプチドも認識される。

本発明の好適実施態様によると制限モノクローナル抗体は、認識されるペプチド が７〜２５、好ましくは１０個のアミノ酸を有することを特徴とする。

ＭＨＣ分子により所定の抗原を与えるためには、上記に近いアミノ成長を有する ペプチドが存在すれば、ＭＨＣ分子との固定反応及び本発明の抗体による認識反 応に十分であり得る。

本発明の制限モノクローナル抗体を製造及び決定するためには、所与の種につい て同様に特異的なＭＨＣ分子の可溶化及び／又は可溶性形態に会合したペプチド により構成される抗原を使用することもできる。可溶化形態を使用する場合、ｔ ｒｉｔｏｎ　Ｘ１００もしくはＮＰ４０のようなイオン性洗剤又はオクチル−β Ｄ−グリコピラノシドのような非イオン性洗剤で可溶化することにより製造され 、可溶化後、アフィニティークロマトグラフィーにかける。

可溶化形態の分子を製造するためには、５ＴＡＬＬＣＵＰＫ他（Ｊ、ｏｆ　Ｉｍ ｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９８１゜ｖｏｌ、　１２７．　ｐａｇｅ　９２３＞に記載 の方法を参照されたい。

Ｍ　ＨＣの可溶性分子を使用する場合、このような分子は遺伝子工学によりトラ ンスメンブラン部分を欠失させることにより得られる。

この可溶性分子は、発現が所望されるＭＨＣ分子をコードする遺伝子の挿入によ り修飾された細胞宿主により作成され得、この遺伝子は分子のトランスメンブラ ン部分をコードする配列を欠失する。この配列の抑圧を考慮してＭＨＣ分子のＨ ｇとＬｆｆｉをＧＧＧＳ型のポリリンカーに結合する。遺伝子は調節成分が細胞 宿主により認識されるような条件下で宿主に取り込まれる。適切な細胞宿主は例 えば昆虫４Ｉ胞である。

特定の制限モノクローナル抗体は、認識されるペプチドがヒトＨＩＶレトロウィ ルスの特性を示し、特にｇａｇタンパク質のペプチド、例えばペプチドｇａｇ５ 　（ＧＨＱＡＡＭＥＭＬＫＥ）もしくはＮｅｏｓｙｓｔｅｍ　（Ｓｔｒａｓｂｏ ｕｒｇ、　リファレンス５Ｐ８９−１５８）により合成されたペプチドｇａｇ　 ｐ２５（配列２６３−２７７）、又は内部タンパク質ｐ１４（核タンパク質）の ペプチド、特にＣ１ａｖｅｒｉｅ　ＪＭ他によりＥｕｒ　ｊｏｕｒＩｍｍ　１９ ８８　ｖｏｌ　１８　Ｐ　１５４７−１５５３に記載されているペプチドに１６ Ｆであることを特徴とする。

本発明の他の制限モノクローナル抗体は、Ｗ　ｒ　ａ　ｉ　ｔ　ｈ　。

Ｄ他（Ｃｅｌｌ　１９８８　ｖｏｌ、５９　ｐ２４７−２５５）により記載され ているミニリンＭＰＢ１〜１１の塩基性タンパク質の自己抗原のペプチド、Ｍｏ ｚｅｓ他（ＥＭＢＯｊｏｕｒｎａｌ　１９８９　ｖｏｌ　８　Ｐ４Ｏ１０−４０ ５２）により記載されているアセチルコリンのレセプターのαサブユニットのペ プチド、Ｇｒａｄｅｈａｎｄｔ他（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ ｓ、　（１９８８）　ｖｏｌ、　１０６．　ｐ５９−７５）により記載されてい るインシュリンのα鎖のペプチド、Ｃｈｉｓａｒｉ他（Ｃｅｌｌ　１９８９　ｖ ｏｌ　５９　Ｐ　１１４５−１１５６）により記載されているＢ型肝炎ウィルス のエンベロー１のペプチドのようなペプチドに対して特異的である。

本発明の抗体は更に、認識されるヒトＭＨＯ分子がクラス■（例えばＨＬＡ−Ｄ Ｒ２、ＨＬＡ−ＤＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ５）と同様にクラス■の 種々のハブロタイブ（例えば）ＩＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ｂ７、Ｈ ＬＡ−Ｂ１２、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−ＣＷ３）であること を特徴とし得る。

本発明の特定の制限モノクローナル抗体は、ハブロタイブＨＬＡ−Ｂ２７又はＨ ＬＡ−Ａｌｌの分子に会合したＨＩＶのタンパク質ｐ２５　（ｇａｇ）のペプチ ド、特にペプチドｇａｇ５を認識する抗体である。

本発明は更に、本発明の制限モノクローナル抗体の製造方法にも係る。これらの 制限モノクローナル抗体の製造に適した第１の方法は、 −所定のペプチドで被覆された同一遺伝子の肺細胞で予め免疫感作した動物の肺 細胞を、肺細胞がミエローマ細胞に対して過剰、例えば約１０：ｌの割合となる ように、融合プロモーター（例えばポリエチレングリコール）の存在下でミエロ ーマ細胞と融合させ、 −例えば酵素（例えばウレアーゼ又はアルカリホスファターゼ又はペルオキシダ ーゼ）に結合した抗マウスＩｇ複合抗体をベースとする試薬を用いてＥＬＩＳＡ 法を実施することにより、制限モノクローナル抗体を産生ずることが可能なハイ ブリドーマを選択するためにスクリーニングを行い、 −こうして選択されたハイブリドーマを回収及びクローニングすることを特徴と する。

細胞毒性法のような別の方法をスクリーニングに使用してもよい。

上記制限モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマも本発明の範囲に含まれ る。これらのハイブリドーマは、形成する抗体に対応する抗原がＭＭＣ分子に会 合した上記ペプチドを含む複合体により構成されるような条件下で、ミエローマ 細胞と、ペプチド−抗原で予め免疫感作した動物の肺細胞との融合産物である。

好ましくは、ハイブリドーマは上記肺細胞をＨＧＰＲＴ−型のミエローマ、例え ばＸ６３−Ａｇ３、Ｎ５−１又は５Ｐ２１０と融合することにより得られる。

ハイブリドーマの製造はＫｏｈｌｅｒ及びＭｉ　１５ｔｅｎ（Ｎａｔｕｒｅ、１ ９７４．　２５６＋４９５−４９７）のプロトコルに従って行った。

ＭＭＣ分子を与えるリンパ球又は非リンパ球、正常又は腫瘍性細胞は、好ましく はマウスのハブロタイブＨ−２６、Ｈ−２’、Ｈ−２”、Ｈ−２＠又はＨ−２１ であるが、（同一のヒトＭＨＣを発現する）トランスジェニック又は非トランス ジェニックマウスでヒト（又は他の種の）ＭＨＣ分子を発現する細胞でもよい。

本発明は更に、製造が所望される制限モノクローナル抗体に対応する好ましくは 免疫性のペプチド又はポリペプチドで被覆されたヒト又は動物〈例えばマウス） のリンパ球又は非リンパ球細胞にも係る。

本発明の制限モノクローナル抗体の第２の製造方法は、エプスタイン−バールウ ィルスで不死化した血液のＢ細胞と、形成が所望される制限モノクローナル抗体 に対応するペプチドに予め接触させたヒトＢリンパ球とを融合させることからな る。

形成が所望されるモノクローナル抗体に対応するペプチドと予め接触させたＢ細 胞は、ペプチドで予め免疫した供与体に対して非毒性であるとき、この供与体の 末梢血から採取され得る。これらのリンパ球Ｂは、ペプチドと１ｎｖｉｔｒｏで 接触培養することによっても得られ、ペプチドで被覆されたＢ細胞を回収する前 に１又は複数の刺激サイクルを実施する。

最後に、制限抗体、又はこれらの抗体のＦａｂ部分のような類似分子、又はＭＨ Ｃ−ペプチド複合体を認識する能力を有するＴ細胞のレセプターの類似体は、Ｈ ｕｓｅ池（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　（１９８９）、　２４６．　１２７５）、Ｗａｒ ｄ他（Ｎａｔｕｒｅ、（１９８９）。

３４１、　５４４＞、ｌ３ｊｒｄ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ。

（１９８８）、２４２．　４２３）等の方法に従って大腸菌又は他の微生物で得 られる。

これらの方法に従うと、ＰＣＲ技術により増幅され且つ制限モノクローナル抗体 をコードする遺伝子、又はマウスもしくはヒトもしくは他の種の特異的Ｔ細胞の レセプターをコードする遺伝子を、それらの発現を可能にする条件下で適切なベ クターを介して大腸菌に導入する０次に、ペプチド−ＭＭＣ分子複合体の認識に 必要な特異性を示す発現分子を決定するためにスクリーニングを行う６スクリー ニングは上記方法に従って実施され得る。

上記方法は同様に、制限抗体もしくは特異的Ｔ細胞レセプターをコードする遺伝 子配列、又はこれらの配列の突然変異体を導入することによっても実施され得る 。

制限モノクローナル抗体をコードする遺伝子又は遺伝子フラグメントは、上述の ように製造される免疫細胞がらＤＮＡを抽出することにより得られる。

従って、本発明は大腸菌又は他の微生物で産生される抗体又は類似体、ヒト又は （例えば上記に類似の方法によりマウスもしくはハムスターで得られるか、又は Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ他、Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、（１９８８）、ｖｏｌ、８５．　ｐ 、３９９５−３９９９の方法に従って得られる）他の種の制限モノクローナル抗 体に係る。

本発明の抗体は、種々の用途に非常に有利である。本発明の抗体は例えば感染の 診断、又は所定の癌もしくは自己免疫疾患で出現するような細胞障害の診断に使 用される。

本発明はこのために、試験される生物サンプル中でＭＨＣ分子に会合したペプチ ドの存在を診断するための組成物に係り、該組成物は上記のような制限モノクロ ーナル抗体され得る。

この最後の適用によると、医療作像で実施される診断方法を利用する。

このように仮定すると、制限モノクローナル抗体は放射性物質又は蛍光染色もし くはＬＡＳＥＲ法により可視化され得る物質により標識される。

上記のような抗原が関与する所定の病気を診断するためには、検出される患者の 体内に存在するＭＨＣ分子のハブｎ　ｖｉｔｒｏ診断するため、又は癌、自己免 疫疾患もしくは他の細胞障害を診断するためのキットに係り、該キットは、実施 すべき診断に鑑みて必要とされる特異性を有する本発明の制限モノクローナル抗 体と、抗体に結合した（抗原−分子又はペプチド−ＭＨＣ分子）複合体型の結合 体の存在を検出するための手段とを備えることを特徴とする。

使用される生物サンプルは有利には血清又は他の任意の生物流体である。

生物サンプルを本発明の抗体と接触させる段階と、抗体−（抗原−分子又はペプ チド−ＭＭＣ分子）複合体型の結合体の存在を検出する段階とを含む、感染又は 細胞障害のｉｎ　ｖｉｔｒｏ検出用試験も本発明の範囲に含まれる。

本発明の抗体の診断への適用は、ＡＩＤＳのＨＩＶウィルスのようなウィルスを 検出するため、又は腫瘍もしくは自己免疫障害を検出するために使用され得る。

本発明の一実施態様によると、制限モノクローナル抗体を細胞毒性にすることも できる。

この場合、本発明の抗体は特に細胞毒性でない場合、例えば競合により上記感染 又は障害の治療用医薬組成物に有効成分として含有され得る。この場合、抗体は 許容可能な医薬ビヒクルと混合される。

抗体を細胞毒性にすることが可能な物質は毒素、抗生物質、放射性同位体である 。

このような抗体は免疫治療で使用され得る。

本発明は更に、本発明の制限モノクローナル抗体を有効成分として含有すること を特徴とする医薬組成物にも係る。

医薬組成物に配合されるこのような抗体は、特に自己免疫疾患で特異的Ｔ細胞の 作用を阻止するために競合剤として特に使用され得る。

更に、特に自己免疫疾患の場合に抗イデイオタイプ抗体の産生を刺激するための ワクチンとしての制限モノクローナル抗体の適用も本発明の範囲に含まれる。

従って、本発明のワクチン組成物は有効成分として上記制限ＡｃＭを含有する。

制限ＡｃＭの注入により産生される抗イデイオタイプ抗体は、自己反応性Ｔ細胞 を認識及び除去する。

本発明の他の特徴及び利点は以下の実施例に明示される。

Ｋ胤］ １の　゛るバイブ１ドーマの　！ た交Ｉ韮 ペプチドで被覆した同−遺伝子牌細胞の腹腔内注射によりＢＡＬＢ／ｃ　（Ｈ− ２’）系マウスを免疫感作した。この場合、インフルエンザウィルスの核タンパ ク質のペプチドＮＰ１４７−１５８Ｒ−を使用した。培養培地（ＤＭＥＭ＋２％ ウシ胎児血清）１ｍｌの容量中にペプチド１００μｇあたり細胞１０７個の割合 で肺細胞をペプチドと共に予めインキュベートした。インキュベーションはＣｏ ２（５％）炉内で１時間実施した。１週間に１回の割合でマウスに３回腹腔内注 射した。３回目の注射から３週間後に４回目の注射を行い、その後、マウスを殺 して膵臓を抽出した。

膵臓の抽出は４回目の注射から３日後に行った。４回目の注射は２経路で行ない 、懸濁液０．５ｍｌを腹腔内径路で注射すると共に、０．５ｍｌを静脈内に注射 した。

１１土涜 ＤＭＥＭ＋５％ウシ胎児血清培地で解離後にｐＩｍから肺細胞を得た。赤血球を ０．８３％塩化アンモニウム（ＮＨ、ＣＩ　）により溶解させ、次にリンパ球を ＤＭＥＭ＋５％ウシ胎児血清で３回洗った。

融合パートナ−は３種類のＨＧＰＲＴ−ミエローマ、即ちＸ６３−Ａｇ３、Ｎ５ −１及び５Ｐ２１０により構成した。換言するなら、リンパ球をミエローマＸ６ ３、Ｎ５−１又は５Ｐ２１０に別々に融合した。融合はＭＥＲＣＫ社のポリエチ レングリコール（ＰＥＧ１５００）を用いてミエローマ細胞１個につきリンパ球 １０個の割合で行った。

プロトコルは以下に記載するに６ｈ　ｌ　ｅ　ｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔ ｕｒｅ、　１９７４．　２５６：４９５−４９７）のプロトコルに基づき、リン パ球とミエローマ細胞（Ｘ６３、Ｎ５−１及びＳ　Ｐ　２１０　）を上記割合で 融合した。３種の調合物（リンパ球とＸ６３又はＮ５−１又は５Ｐ２１０との調 合物）を２５０ｇ及び４℃で１０分間遠心分離した。細胞残渣の上に液体膜を残 しながら上清を除去した。試験管を水浴中で３７℃にした。細胞残渣にポリエチ レングリコール１５００溶液（ｐＨ７のＲＰＭＩ中５０％ＰＥＧ１５００溶液） １ｍｌを滴下した。１分間の操作後、ＤＭＥＭ±１０％ウシ胎児血清２０ｍ１を 加えた。

全体を３７℃水浴に更に３分間放置し、次に試験管を２５０ｇ及び＋４℃で１５ 分間遠心分離した。上清を除去し、細胞をＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清２０ｍ １で１回洗った０次に、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清にＨＡＴ培地（母溶液Ｈ ＡＴ　１００Ｘ：　ヒボキサンチン１．３６ｍｇ／ｍｌ、アミノプテリン０．０ １．８ｍｇ／ｍｌ及びチミジン０．７６ｍｇ／ｍｌ＞を加えた溶液に細胞をとっ た。細胞懸濁液をプラスチック製培養プレート（ＮＵＮＣＬＯＮ、９６ウエル） のウェルにウェル当たり細胞１００００個を含むように２００μｌの割合で分配 した。次に５００００個の正常肺細胞、又は好ましくは３００ｒａｄの放射線照 射した正常肺細胞を各ウェルに「充填細胞」として加えた。

こうして細胞をＣｏ２（５％）炉で３７℃で７〜１０日間７〜１０日後、各ウェ ルの上清を除去し、ＥＬＩＳＡ酵素抗体反応によりスクリーニングした。スクリ ーニングはまずウレアーゼに結合した抗マウスＩｇ複合抗体をペースとする試薬 を用いて行い、次にアルカリホスファターゼに結合した抗マウスＩｇ複合抗体に より確認した。標的として使用した細胞はペプチドＮＰ　１４７−１５８Ｒ−（ 細胞１０７個につき５〜５０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で１〜２時間予めインキ ュベートした肺細胞である。Ｔｅｒｎｙｎｃｋ及びＡｖｒａｍｅａｓ　（Ｔｅｒ ｎｙｎｃｋ及びＡｖｒａｍｅａｓ：　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｉｍｍｕｎ。

−ｅｙｚｙｍａｔｉｑｕｅｓ−Ｌｅｓ　４ｄｉｔｉｏｎｓ　ＩＮＳＥＲＭ、１９ ８７）に記載の方法に従ってポリーＬ−リシンを使用してポリビニルプレート（ Ｄｙｎａｔｅｃｈ）に肺細胞を固定した。

陰性対照（標的細胞と培養上清なしの複合抗体との反応）の少なくとも２倍の光 学密度（ＯＤ）値を与えたウェルを選択した。観察される反応が「自己抗体」に よるものでないようにするために、同一ウェルの上清をペプチド及び同一ハブロ タイブで被覆しない細胞でも同様に試験した。更に、単独（細胞なし）でプレー トに直接固定した該当ペプチドについても試験し、選択された上滑がペプチドで 覆われた細胞のみと反応することを確認した。

選択を行い、ウェルを３〜４回クローニング及びサブクローニングした。各クロ ーニング及びサブクローニング毎に上清を上記同一基準で繰り返し試験した。同 時に、ハイブリドーマのイソタイプを決定するために酵素抗体反応を適用した。

この段階では同時に制限を決定するための反応、換言するなら、所望のハブロタ イブ、この場合Ｈ−２６との間でのみ観察されるべき反応を実施した。

ペプチド（ＮＰ　１４７−１５８Ｒ−）で被覆した特定のハブロタイブ（Ｈ−２ ’）の肺細胞のみと反応するという意味で所謂制限型の抗体の特徴を有する３種 のハイブリドーマが得られた。これらの３種のクローンを夫々イソタイプＩ　ｇ 　Ｇ　ｚｂ、　Ｋ　、　Ｉ　ｇ　Ｇ　３．　Ｋ及びＩ　ｇ　Ｇ　２１＋、　Ｋの Ｎ６゜６、Ｓ、２．２及びＫ５．３と命名した。

この実験の目的は、抗ペプチド制限抗体が、特異的ペプチドと接触した腫瘍細胞 のｉｎ　ｖｉｖｏ増殖を阻害する能力を試験することである。

Ｋ１１ユ上旦丑 ＤＢＡ／２　（Ｈ−２’）マウスを各４匹からなる４群に分けた。肥満細胞腫Ｐ ８１５（同系宿主（マウスＤＢＡ／２）に一旦注射すると致死性腫瘍を増殖する 移植可能な腫瘍細胞）の細胞懸濁液を皮下注射によりマウスに投与した。

第１群ではＰ８１５細胞単独をマウスＤＢＡ／２に注射し、この群は同系宿主に おけるＰ８１５細胞の増殖対照として使用した。

第２群のマウスには５μｇ／１０’細胞の割合でＰ８１５１ｓ胞と制限抗体との 混合物（抗体Ｘ５．３のサブクローンＸ、５．３．７．Ｔ）を投与した。これら のマウスは細胞と単独抗体とを投与した対照として使用した。

第３群のマウスには、１０μｇ／１０’細胞の割合でインフルエンザウィルスの 核タンパク質のペプチドＮＰＲ−と共に３７℃で１時間インキュベートした細胞 Ｐ８１５を投与した。この群は細胞と単独ペプチドとを投与した対照として使用 した。

第４群のマウスには、ペプチドと共にインキュベートしてから制限抗体Ｘ、５． ３．７．Ｔの存在下においた細胞Ｐ８１５を対照群２及び３と同−条件及び割合 で投与した。

同一数の細胞Ｐ８１５（１０５個／匹）を各マウスに注射し、皮下腫瘍の増殖を 個々に追跡調査した。結果を各群の腫瘍の平均直径、可視腫瘍を有するマウスの 百分率及び致死性腫瘍の百分率で表した。

１）　Ｐ８１５を゛　・した筒、　主における　の種々の調合物を注射したマウ スＤＢＡ／２における腫瘍の増殖を、時間の関数として各群の腫瘍の平均直径の 曲線により表したく図１）。

特に細胞注射後２４日目に、３つの対照群（Ｐ８１５細胞単独、細胞Ｐ８１５＋ 単独抗体、細胞Ｐ８１５＋単独ペプチド）の各々の４匹のマウスに、夫々７．５ ．１０．２５及び７．７５ｍｍの平均直径を有する４個の腫瘍の存在が検出され 、実験群（細胞Ｐ８１５＋ペプチド士抗体）の４匹のマウスに平均直径４．５ｍ ｍの２つの腫瘍の存在が検出された。

２）の 実験に用いた各群の致死性腫瘍の数は群１（細胞Ｐ８１５単独）３／４、群２（ 細胞Ｐ８１５＋抗体単独）４／４、群３（細胞Ｐ８１５＋ペプチド単独）４／４ 、群４（細胞Ｐ８１５＋ペプチド＋抗体）２／４であった。

対照全体く群１＋２＋３＞では１２個中上１個即ち９２％が致死性腫瘍であり、 これに対して実験群では４個中の２個即ち５０％であった。

Ｈ−２Ｋ”ｌ、：ムムしｔ・アルブミンＯＶＡ　）−７３Ｅ　ｊ２０にのｒペプ チド　を　ｉするハイブリドーマこのペプチドＯＶ　Ａ　ｚｓｚ−ｚｙ＊、より 簡単には組成ＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳＳＮＶＭＥＥＲＫを有するアミノ酸数２ ０のｒ　２ＯＫは、特異的細胞毒性Ｔリンパ球によりクラス■のＭＭＣ分子（Ｈ −２Ｋｂ）と会合した状態で認識される（Ｃａｒｂｏｎｅ及びＢｅｖａｎ、Ｊ、 Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、、１９８９．　１６９：６０３；　Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、　１９９０ ．　１７１：３７７）。

インフルエンザウィルスＮＰＲ−のペプチドについて記載したと同一の方法を使 用することにより、ＥＬＩＳＡ試験及び補体依存細胞毒性試験でＨ−２に’を発 現するリンパ球の存在下にペプチドＩ　２０Ｋを認識するハイブリドーマ（９， ３，２）を得た。ペプチドの不在下にＨ−２にゝを発現する細胞から構成した対 照又は別のハブロタイブ（Ｈ−２に’）を有する細胞と共にペプチド（Ｉ２０Ｋ ）をインキュベートした調合物から構成した対照は認識されなかった。

これらの抗ＯＶ　Ａ　２　Ｓ　３−２１３ペプチド制限モノクローナル抗体に関 する調査は、抗ＮＰＲ−ペプチド制限抗体の調査に適用したと同一の実験図式を 再現した。更に、分子に１′の場合、Ｃ５７Ｂ１／６系のマウスに由来する突然 変異分子Ｋｂ（Ｋｂ”）と会合したペプチドの認識を調査することができれば特 に有利である。

の・　で　Ｊｌ」Ｊ記」［外」２）Ｌ法１）５１Ｃｒで　−シｔ・　る 細胞仲介細胞溶解即ちＣＭＣの研究でＣｅｒｏｔｔｉｎｉ他により使用された方 法を参考とする方法を適用した（Ｃｅｒｏｔｔｉｎｉ他、１９７４．　Ｊ、Ｅｘ ｐ。

Ｍｅｄ、、　１４０：　７０３＞、要約すると、標的細胞（所定のハブロタイブ のＭＨＣ細胞＋ペプチド）をクロム酸ナトリウム（Ｎ　ａ　ｚ”Ｃｒ　Ｏ４）と しての放射性クロム５１により標識した。標的細胞（又はペプチドなしの対照細 胞）を特異的モノクローナル抗体の存在下でインキュベートした。上滑中に遊離 した放射性クロムを測定することにより特異的溶解百分率を推定した。制限モノ クローナル抗体Ｘ５．３を用いる試験の場合、二次抗体、この場合ウサギ抗マウ スイムノグロブリンの抗体を加えることにより、方法を変形した１次にウサギ補 体を加えた。抗体Ｘ５．３を認識した二次抗体は補体を活性化させて溶解させた ０例えば本方法の場合、制限抗体Ｘ５．３、サブクローンＸ５゜５．７／Ｔは特 異的標的（細胞Ｐ８１５−Ｈ−２’＋ペプチド）の３０％を溶解させ、細胞Ｐ８ １５を予めペプチドと接触させない場合は０％であった。

２）　・　ヨウ　１２５に　二　の　゛ラクトペルオキシダーゼ酵素を使用する 方法（Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ、Ｊ、Ｊ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、。

１９６９、　１１３：　２９１）により、標的細胞（細胞＋ペプチド）又は対照 （ペプチドなしの細胞）を放射性ヨウ素１２５で標識した。標識後、細胞を酵素 阻害剤の存在下に洗剤Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００により溶解させた。

溶解物をセファロースビーズ−プロティンＡの存在下に非結合抗体（対照抗体） と共にインキュベートした。遠心分離後、溶解物を特異的抗体（制限抗体）と共 にインキュベートシた。複合体をセファロースビーズ−プロティンＡに吸着させ 、洗浄し、回収し、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） により分析した。

この結果、対応するハブロタイブを有する細胞をペプチドと共にインキュベート すると、制限抗体はオートラジオグラフィーにより沈降バンドを与えることが判 明した。（ペプチドの不在下ではこの実験の結果は極めて弱いが、全く陰性では ないように思われた）。

３）　−工　に　′６　れ　つ　のペプ　ド　六　を　、した０’　Ｈ−２の 遺伝子工学により得られた（トランスメンプラン部分を欠失する）可溶性分子Ｈ −２を作成し、その内在ペプチドを除去した。該分子を使用して、インフルエン ザウィルスの核タンパク質のペプチドを内側に入れた。この分子は、例えばヨー ド１２５で標識したプロティンＡを使用するＥＬｒＳＡ又はラジオイムノアッセ イ（ＲＩＡ）における制限抗体の標的として使用した。

ｉ豊１ 病原物質の抗原の特徴を有するペプチド又は細胞障害の特徴を有するペプチドと 、このペプチドを認識及び固定する能力を有する主要組織適合遺伝子複合体（Ｍ ＭＣ）分子とにより形成される複合体を特異的に認識する能力を有することを特 徴とする（該ペプチドに非特異的なハブロタイブのＭＭＣ分子と会合した該ペプ チドを認識しないという意味での）制限モノクローナル抗体、これらの抗体は病 原生物による感染の診断、又は例えば癌もしくは自己免疫疾患に見られる細胞障 害の診断に使用可能である。

国際調査報告 国際調査報告 ＦＲ９１００１２１ Ｓ＾　４５４６３

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．病原物質の抗原の特徴を有するペプチド又は細胞障害の特徴を有するペプチ ドと、このペプチドを認識及び固定する能力を有する主要組織適合遺伝子複合体 （ＭＨＣ）分子とにより形成される複合体を特異的に認識する能力を有すること を特徴とする（該ペプチドに非特異的なハプロタイプのＭＨＣ分子と会合した該 ペプチドを認識しないという意味での）制限モノクローナル抗体。
2. ２．単独ペプチドに対して全く又は実質的に反応せず、及び／又は単独ＭＨＣ分 子を僅かに認識するか又は全く認識しないことを特徴とする請求項１に記載の制 限モノクローナル抗体。
3. ３．認識されるペプチドがウイルス、細菌、寄生虫（例えばマラリア原虫）、真 菌類、特に病原性酵母のような病原物質、又は副組織適合抗原、腫瘍の特異的抗 原もしくは自己免疫障害の特異的抗原を表すペプチドの特徴を示すことを特徴と する請求項１又は２に記載の制限モノクローナル抗体。
4. ４．認識されるペプチドが７〜２５、好ましくは１０個のアミノ酸を有すること を特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の制限モノクローナル抗体。
5. ５．認識されるペプチドがヒトＨＩＶレトロウイルスの特性を示し、特にｇａｇ タンパク質のペプチド、核タンパク質のペプチド又はペプチドＫ１６Ｆであるこ とを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の制限モノクローナル抗体 。
6. ６．認識されるＭＨＣ分子がクラスＩＩと同様にクラスＩの種々のハプロタイプ であることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の制限モノクロー ナル抗体。
7. ７．請求項１から６のいずれか一項に記載の制限モノクローナル抗体の製造方法 であって、 −所定のペプチドで被覆された同一遺伝子の脾細胞で予め免疫感作した動物の脾 細胞を、脾細胞がミエローマ細胞に対して過剰、例えば約１０：１の割合となる ように、融合プロモーター（例えばポリエチレングリコール）の存在下でミエロ ーマ細胞と融合させ、 −例えは酵素（例えばウレアーゼ又はアルカリホスファターゼ又はペルオキシダ ーゼ）に結合した抗マウスＩｇ複合抗体をベースとする試薬を用いてＥＬＩＳＡ 法を実施することにより、制限モノクローナル抗体を産生することが可能なハイ ブリドーマを選択するためにスクリーニングを行い、 −こうして選択されたハイブリドーマを回収及びクローニングすることを特徴と する方法。
8. ８．形成される抗体に対応する抗原が製造を所望される制限モノクローナル抗体 に対応するペプチドを特異的に認識するＭＨＣ分子に会合した該ペプチドを含む 複合体により構成されるという条件下で、ミエローマ細胞と、該ペプチドで予め 免疫感作した動物の脾細胞との融合により得られるようなハイブリドーマ。
9. ９．生物サンプル又は生存生物体でＭＨＣ分子に会合したペプチドの存在を診断 するための組成物であって、請求項１から６のいずれか一項に記載の制限モノク ローナル抗体を含有することを特徴とする組成物。
10. １０．病原物質、特にウイルスによる感染を検出できることを特徴とする請求項 ９に記載の診断用組成物。
11. １１．腫瘍を検出できることを特徴とする請求項９に記載の診断用組成物。
12. １２．自己免疫障害を検出できることを特徴とする請求項９に記載の診断用組成 物。
13. １３．細胞毒性にすることが可能な物質、例えば毒素、抗生物質又は放射性同位 体に結合されていることを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載のモ ノクローナル抗体。
14. １４．請求項１３に記載の制限モノクローナル抗体を有効成分として含有するこ とを特徴とする医薬組成物。
15. １５．病原生物による感染を生物サンプルでｉｎｖｉｔｒｏ診断するため、又は 癌、自己免疫疾患もしくは他の細胞障害を診断するためのキットであって、−実 施すべき診断に鑑みて必要とされる特異性を有する請求項１から６のいずれか一 項に記載の制限モノクローナル抗体と、 −抗体に結合した（抗原−ＭＨＣ分子）複合体型の結合体の存在を検出するため の手段 とを備えることを特徴とするキット。
16. １６．特に自己免疫病におけるＴ細胞の作用の変調のために、請求項１から６の いずれか一項に記載の制限モノクローナル抗体を有効成分として含有することを 特徴とする医薬組成物。
17. １７．請求項１から６のいずれか一項に記載の制限モノクローナル抗体を有効成 分として含有することを特徴とするワクチン組成物。