JP2969017B2 - 感染防御剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、エンテロコッカス（En
terococcus）属に属する微生物の菌体又はその処理物を
含有する感染防御剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ヒトの腸管内には１００種類、１００兆
個といわれる腸内菌が生息している。腸内菌の存在は一
つのエコシステム（生態系）として把握することができ
る。すなわち、腸内菌叢（フローラ）の構成微生物の種
類と量は、微生物相互間及び宿主生体との間の相互依
存、拮抗などの相互作用等の複雑な関係を維持しながら
存在している。この腸内菌叢は、あたかも一つの臓器で
あるとみることができ、その宿主生体における役割の重
要性がますます広く認識されつつある。その役割の範囲
は、発生分化、免疫活性、栄養（消化吸収）、癌、心臓
病、脳疾患をはじめとする成人病や消化器疾患などの各
種疾患、ひいては老化、寿命にいたるまで、直接的又は
間接的に関連することが認められている。エンテロコッ
カス属の微生物は腸管内に存在する代表的な微生物であ
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】カンジダ菌のような日
和見感染菌の感染・発症は、原因菌の病原性と宿主の感
染抵抗性とのバランス障害によって発現し、宿主の感染
抵抗性と大きな関係がある。すなわち、癌や糖尿病等多
くの患者では感染抵抗力の低下喪失は顕著であり、一般
的に感染抵抗力の弱い小児や老人に発症しやすく、又、
栄養状態との関わりもあると考えられている。更に、成
人病をはじめとする疾患の増加にともなって様々の薬剤
の使用が増大している状況にあって、特に抗癌剤、抗生
物質、ステロイド、その他の免疫抑制剤の繁用は真菌感
染防御能の著しい低下をもたらし、深刻な臨床上の問題
となっている。

【０００４】特にカンジダ（Candida)は、ヒトの口腔、
咽頭、腸管、腟及び皮膚などの常在菌叢を構成する真菌
の一種であり、通常は病原性を発揮しないが、宿主生体
の感染抵抗性が低下した場合に、組織に侵入して重度の
病態を現出する、いわゆる日和見感染菌であり、カンジ
ダ・アルビカンス（Candida albicans）は、カンジダ感
染症の代表的病原菌である。カンジダ感染症は、大きく
分けると皮膚・粘膜（表在性）カンジダ症と内臓（深在
性）カンジダ症があるが、内臓カンジダ症は肺臓、腎
臓、心臓、肝臓、脾臓、脳にまで病変が及ぶ重症型真菌
症である。

【０００５】本発明は、真菌症、特に上記のような背景
において出現するカンジダ症、とりわけ免疫不全による
感染防御能の低下に基づく医学的に治療の困難な内臓カ
ンジダ症の予防及び／又は治療に有用であって、毒性が
なく、特に、経口投与によってその効果が認められる感
染防御剤を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、研究の結
果、ヒトの腸管由来（ヒトの腸内常在性）のエンテロコ
ッカス属に属する微生物が真菌及び／又は糸状菌感染に
対して防御効果を有することを見い出した。更に、本菌
はヒトの腸管内の常在菌の一種であるところから、経口
摂取による毒性は実質上全く認められないことより、本
発明をするに至ったものである。

【０００７】本発明に用いられるエンテロコッカス属に
属する微生物としては、エンテロコッカス・フェカリス
（Enterococcus faecalis)やエンテロコッカス・フェシ
ウム（Enterococcus faecium）があげられるが、特に有
用な菌株は、本発明者により健常者の糞便から分離され
た新菌株のエンテロコッカス・フェカリス（Enterococc
us faecalis)ＮＦ−１０１１である。該菌株は工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１２５６４号と
して寄託されている。

【０００８】以下にエンテロコッカス・フェカリスＮＦ
−１０１１の分離手段及び同菌株の菌学的及び生理学的
性質を示す。

【０００９】（１）分離手段 健常者の糞便の加熱滅菌水による１０倍希釈物を、適切
な選択培地（ＫＭＮ寒天平板及びＳＦ寒天平板）に塗抹
し、好気条件下３７℃で、４８〜７２時間培養し、菌集
落を出現させた。この菌集落を別の同種平板培地に画線
塗抹し、同様に培養して菌集落を再び出現させた。同じ
操作を数回繰り返し、単一の菌種だけからなる単一集落
を分離した。この新分離菌株について、菌学的（形態
的、生化学的及び血清学的）性状を調べ、エンテロコッ
カス・フェカリス（Enterococcus faecalis)に属すると
分類同定した。

【００１０】 （２）菌学的及び生理学的性質 ───────────────────────── 性状 判定 ───────────────────────── グラム染色性 ＋ 菌形態 球形 カタラーゼ − 溶血性 α 血清群 Ｄ 増殖性 １０℃ ＋ ４５℃ ＋ ５０℃ ＋ 熱耐性 ６０℃ ３０分 ＋ 胆汁エスクリン添加培地での生育 ＋ pH９．６培地での生育 ＋ ６．５％食塩添加培地での生育 ＋ メチレンブルー還元性 ＋ ゼラチン液化 − ０．０１％ＴＴＣ添加培地での生育 ＋ テルライト添加培地での生育 ＋ 酸生成の有無 グリセロール ＋ Ｌ−アラビノース − Ｄ−リボース ＋ Ｄ−キシロース − Ｄ−グルコース ＋ Ｄ−ガラクトース ＋ Ｄ−フラクトース ＋ Ｄ−マンノース ＋ マルトース ＋ マンニトール ＋ シュクロース ＋ Ｌ−ソルボース − Ｄ−ソルビトール ＋ Ｌ−ラムノース − ラクトース ＋ アミグダリン ＋ エスクリン ＋ セロビオース ＋ メリビオース − イヌリン − メレジトース ＋ ＋；陽性、−；陰性 ＴＴＣ；２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロ
リド

【００１１】（培地）本発明に用いられる微生物培養用
の代表的培地としては、以下に示す組成のロゴサ液体培
地を用いることができる。 トリプチケース １０ g 酵母エキス ５ g トリプトース ３ g リン酸一カリウム ３ g リン酸二カリウム ３ g クエン酸三アンモニウム ２ g ツイーン８０（界面活性剤） １ g グルコース ２０ g システイン塩酸塩 ０．２ g 塩類溶液（１） ５ ml 蒸留水 １，０００ ml （pHを水酸化ナトリウム溶液で７．０に調整、１２１℃１５分間加熱滅菌） （１）塩類溶液；ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ １１．５ g ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．６８g ＭｎＳＯ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ ２．４ g 蒸留水 １００ ml

【００１２】（培養法）エンテロコッカス属に属する微
生物をロゴサ液体培地１０mlに接種し、３７℃にて１０
〜１６時間好気的に静置培養（前培養）し、約１０⁹ 個
／mlの培養液（シード）を得る。これを１０リットルの
滅菌ロゴサ液体培地に加え、同様に静置培養する。

【００１３】（集菌、洗浄及び乾燥法）上述のようにし
て得られた培養液を８，０００〜１２，０００rpm にて
遠心分離操作を行い、生菌体（沈殿物）を得る。生菌体
を生理食塩水（０．８５％ＮａＣｌ水溶液）で２回洗浄
し同様に遠心分離操作をした後、蒸留水に懸濁して菌液
（約１０¹¹個／ml）１００mlを得る。

【００１４】得られた生菌体懸濁液を１１０℃で１０分
間加熱して死菌体懸濁液を得る。次に、熱風乾燥法ある
いは凍結乾燥法など適宜な方法で乾燥処理し、乾燥死菌
体を得る。

【００１５】本発明の感染防御剤は、上記のようにして
得られた生菌体又は死菌体或いはこれらの磨砕物、水抽
出物を用いることができる。これらを製剤するにはでん
ぷん、乳糖、大豆たんぱく等の担体、賦形剤、結合剤、
崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯具剤等の添加剤を用い
て周知の方法で錠剤や顆粒剤に製剤される。

【００１６】使用量は、症状、年令等により異なるが、
有効成分として１日０．００２〜０．１g/kg体重を通常
成人に対して１日１回又は数回に分けて投与することが
できる。

【００１７】

【発明の効果】本発明のエンテロコッカス属菌は腸内菌
であるので毒性がなく、副作用もなく、カンジダ症など
の真菌症及び糸状菌による各種疾患、とりわけ免疫不全
による感染防御能の低下に対して予防又は治療効果があ
る。

【００１８】

【実施例】

実施例１．（菌体の調製）Enterococcus faecalis ＮＦ−１０１１をロゴサ液体培
地１０リットルに接種（菌数；１０⁶ 個／ml）し、３７
℃にて１６時間静置培養し、生菌数約１０⁹ 個／mlの培
養液を得た。得られた培養液を１２，０００rpm で遠心
分離して集菌し、これを生理食塩水（０．８５％ＮａＣ
ｌ水溶液）で２回洗浄して、１００ml蒸留水に懸濁し、
菌液を得た。この菌液を１１０℃で１０分間加熱後、凍
結乾燥により死菌体菌末を得た。

【００１９】実施例２．（感染防御効果：経口投与、正
常モデル動物での実験例） 実施例１で得た死菌体菌末をカンジダ症発症モデルマウ
スに投与し、カンジダ感染防御効果を観察した。

【００２０】Ｃｒｊ：ＣＤ−１（ＩＣＲ）系ＳＰＦマウ
ス、４週令、雄性、１群５〜６匹を用いた。マウス用固
形飼料（ＭＦ：オリエンタル酵母工業（株））及び蒸留
水を与え、室温２４±２℃で１週間予備飼育後、同実験
条件下で実験した。実験開始時のマウスの体重は２３±
１g であった。

【００２１】各々のマウスに、実施例１で得た死菌体菌
末を３回経口投与した。１回目は菌接種３日前、２回
目、３回目はそれぞれ２４時間後に胃ゾンデで経口投与
した。１回の投与量は０．６３、１．２５、２．５、５
及び１０mg／匹で行った。対照動物群には同量の生理食
塩水を同様に投与した。次にCandida albicans TIMM１
７６８株の菌液を死菌体菌末投与１回目の３日後に経尾
静脈注入した。接種菌量は、予備実験により確実に全身
感染が成立して２週間以内に全てのマウスを死亡させる
量として、１×１０⁶ 個とした。以後３週間にわたって
マウスの生存数を対照動物群と比較した。

【００２２】結果は表１に示すように、対照動物群に比
較して、１．２５mg／匹以上の死菌体菌末投与群で６匹
中１〜２匹が生存し、平均生存日数が約２８〜４４％増
大した。

【００２３】

【表１】

【００２４】実施例３．（感染防御効果：経口投与、抵
抗力減弱化モデル動物での実験例） Ｃｒｊ：ＣＤ−１（ＩＣＲ）系ＳＰＦマウス、４週令、
雄性、１群５〜６匹を用いた。マウス用固形飼料（Ｍ
Ｆ：オリエンタル酵母工業（株））及び蒸留水を与え、
室温２４±２℃で１週間予備飼育後、同実験条件下で実
験した。実験開始時のマウスの体重は２３±１g であっ
た。

【００２５】マウスの抵抗力減弱化のため、サイクロホ
スファミド（エンドキサン注射液：シオノギ製薬
（株））２００mg／体重、あるいはプレドニゾロン（三
鷹製薬（株））２mg／匹を、サイクロホスファミドは菌
接種の４日前に腹腔内投与、プレドニゾロンは４日前及
び２日前の２回皮下注射した。

【００２６】各々のマウスに、実施例１で得た死菌体菌
末を３回経口投与した。１回目は菌接種３日前、２回
目、３回目はそれぞれ２４時間後に胃ゾンデで経口投与
した。１回の投与量は０．６３、１．２５、２．５、５
及び１０mg／匹で行った。対照動物群には同量の生理食
塩水を同様に投与した。次にCandida albicansTIMM１７
６８株の菌液を死菌体菌末投与１回目の３日後に経尾静
脈注入した。接種菌量は、予備実験により確実に全身感
染が成立して２週間以内に全てのマウスを死亡させる量
として４×１０⁴ 個とした。以後３週間にわたってマウ
スの生存数を対照動物群と比較した。

【００２７】結果は表２に示すように、対照動物群では
２群とも６匹中６匹とも死亡したが、サイクロホスファ
ミドを投与して抵抗力が減弱したマウス群では、死菌体
菌末の０．６３mg／匹／回以上の投与によって６匹中１
〜２匹が生存し、平均生存日数は４．４〜７．６倍に増
大した。更に、プレドニゾロンを投与して抵抗力が減弱
したマウス群では、死菌体菌末の０．６３mg／匹／回以
上の投与によって２週間経過後も６匹中６匹とも生存
し、平均生存日数は対照動物群の１．６〜１．８倍に増
大した（３週間生存した動物の生存日数は２１日として
計算した）。感染３週間後の生存率も６匹中３〜６匹が
生存し、顕著なガンジダ感染防御効果を示した。

【００２８】

【表２】

【００２９】実施例４．（感染防御効果：腹腔内投与、
正常モデル及び抵抗力減弱化モデル動物での実験例） Ｃｒｊ：ＣＤ−１（ＩＣＲ）系ＳＰＦマウス、４週令、
雄性、１群５〜６匹を用いた。マウス用固形飼料（Ｍ
Ｆ：オリエンタル酵母工業（株））及び蒸留水を与え、
室温２４±２℃で１週間予備飼育後、同実験条件下で実
験した。実験開始時のマウスの体重は２３±１g であっ
た。

【００３０】マウスの抵抗力減弱化のため、サイクロホ
スファミド（エンドキサン注射液：シオノギ製薬
（株））２００mg／体重、あるいはプレドニゾロン（三
鷹製薬（株））２mg／匹を、サイクロホスファミドは菌
接種の４日前に腹腔内投与、プレドニゾロンは４日前及
び２日前の２回皮下注射した。

【００３１】各々のマウスに、実施例１で得た死菌体菌
末を３回経口投与した。１回目は菌接種３日前、２回
目、３回目はそれぞれ２４時間後に注射針にて腹腔内投
与した。１回の投与量は１mg／匹で行った。対照動物群
には同量の生理食塩水を同様に投与した。次にCandida
albicansTIMM１７６８株の菌液を死菌体菌末投与１回目
の３日後に経尾静脈注入した。接種菌量は、予備実験に
より確実に全身感染が成立して２週間以内に全てのマウ
スを死亡させる量として、正常マウスは１×１０⁶ 個、
抵抗力減弱マウスは４×１０⁴ 個とした。以後３週間に
わたってマウスの生存数を対照動物群と比較した。

【００３２】結果は表３に示すように、感染２週間後の
生存率は、対照動物群では、正常モデル群、サイクロホ
スファミド投与群、プレドニゾロン投与群共に５匹中５
匹とも死亡した。これに比較して、１mg／匹の死菌体菌
末投与群では、正常モデル群で５匹中３匹が生存し、平
均生存日数が約３３％増大した。サイクロホスファミド
投与群で５匹中２匹が生存し、平均生存日数が７．６倍
に増大した。更に、プレドニゾロン投与群で５匹中５匹
が生存し、平均生存日数が１．９倍に増大した。カンジ
ダ感染３週間後の生存率は、対照動物群では３群とも各
々５匹中５匹が死亡したのに対し、死菌体菌末投与群で
は５匹中各々０匹、２匹、４匹が生存した。このよう
に、死菌体菌末の腹腔内投与においても、経口投与の場
合と同様に、死菌体菌末は顕著なカンジダ感染防御効果
を有した。

【００３３】

【表３】

【００３４】実施例６．（製剤例） （１）実施例１で得た死菌体菌末１５０mgを精製でんぷ
ん末１５０mg及び乳糖７００mgと混合して錠剤／又は顆
粒剤にする。

【００３５】（２）実施例１で得た死菌体菌末３００mg
を大豆タンパク３００mg及び乳糖４００mgと混合して錠
剤／又は顆粒剤にする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 医学と生物学，第118巻，第１号 （1989），ｐ．27−31 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 35/74 C12N 1/20 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 有効成分としてエンテロコッカス属に属
   する微生物の菌体又はその処理物を含有するカンジダ症
   の予防および治療剤。