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WO2005077390A1 - 血糖値低下剤、糖尿病治療・予防剤及びその製造方法 - Google Patents

血糖値低下剤、糖尿病治療・予防剤及びその製造方法 Download PDF

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WO2005077390A1
WO2005077390A1 PCT/JP2005/002309 JP2005002309W WO2005077390A1 WO 2005077390 A1 WO2005077390 A1 WO 2005077390A1 JP 2005002309 W JP2005002309 W JP 2005002309W WO 2005077390 A1 WO2005077390 A1 WO 2005077390A1
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WO
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enterococcus
cells
microorganism
agent
culture
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/002309
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yasuo Kawai
Original Assignee
Yasuo Kawai
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Publication date
Application filed by Yasuo Kawai filed Critical Yasuo Kawai
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    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions

Definitions

  • the present invention relates to a blood sugar lowering agent, an agent for treating and preventing diabetes, and a method for producing the same, comprising lactic acid bacteria as an active ingredient.
  • diabetes which is one of lifestyle-related diseases and adult diseases, has been widespread due to excessive intake of calories through meals and the like.
  • the number of people with diabetes is said to exceed 6.5 million in Japan alone.
  • the reserve army of glucose-impaired diabetics exceeds 1 in 10 people, or more than 10 million.
  • An object of the present invention is to provide a blood sugar lowering agent and a therapeutic / prophylactic agent for diabetes that are highly safe and effective.
  • the inventor of the present application has found that various microorganisms (lactic acid bacteria) belonging to the genus Enterococcus have an action of extremely effectively lowering blood sugar levels. Furthermore, the present inventor has found that those microorganisms whose origin is so-called intestinal bacteria are substantially non-toxic orally and have extremely high pharmacological activity. As a result, the present inventors reduced the microorganisms belonging to the genus Enterococcus to various blood sugar lowering agents and various symptoms of diabetes. It does not cause various side effects such as those of diabetic drugs, but does not cause problems when swallowed even if taken in combination with other drugs, and has a blood sugar lowering effect and a therapeutic and preventive effect for diabetes. The present inventors have found that they can be effectively used as drugs having the same, and completed the present invention as follows.
  • the present invention relates to a genus consisting of a bacterium of the genus consisting of Enterococcus ficharis, Enterococcus fezicum, Enterococcus ebevim, Enterococcus durans, Enterococcus salino cliius, Enterococcus miteisu, and a selected group of Enterococcus' equinoccus.
  • the present invention relates to a blood sugar lowering agent containing one or more microorganisms as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a genus of the genus consisting of Enterococcus fusecharis, Enterococcus fezicum, Enterococcus ebevim, Enterococcus durans, Enterococcus salivarius, Enterococcus.
  • the present invention also relates to an agent for treating or preventing diabetes, comprising two or more kinds of microorganisms as active ingredients.
  • the present invention also provides a blood sugar lowering agent or diabetes comprising a microorganism belonging to the genus Enterococcus as an active ingredient, comprising preparing a culture by culturing a microorganism belonging to the genus Enterococcus in a Rogosa liquid medium.
  • the present invention also relates to a method for producing a therapeutic 'prophylactic agent.
  • the microorganism is aerobically cultured in a Rogosa liquid medium under the conditions of pH 6.5-8.0 and a temperature of 36 to 38 ° C (for example, without limitation). Culture).
  • the above-mentioned production method further comprises the step of collecting and washing the viable cells prepared as described above.
  • the washed bacterial cells may be suspended in a solvent such as physiological saline to prepare a bacterial suspension.
  • a method for producing a blood sugar lowering agent or an agent for treating or preventing diabetes comprising a microorganism belonging to the genus Enterococcus as an active ingredient, comprising the following steps (a) to (e) is particularly preferred:
  • the manufacturing method may further include the following (f)-(h):
  • step (f) heating the bacterial suspension obtained in step (e) at 110-120 ° C for 5-10 minutes,
  • the microorganism belonging to the genus Enterococcus preferably includes Enterococcus fusecharis, Enterococcus 'Fescium, Enterococcus' Ebim, Enterococcus.
  • Bacterial community is one or more selected microorganisms.
  • the blood sugar lowering agent and the diabetes treatment / prevention agent according to the present invention have a medicinal component of intestinal bacteria, and therefore can be swallowed even when taken in combination with other drugs that do not cause side effects. Lowering blood sugar without causing problems with combination, and treating diabetes and Extremely effective in prevention.
  • microorganism lactic acid bacterium
  • the method for treating cells the pharmacological effect, and the like used in the present invention will be described in detail.
  • microorganisms belonging to the genus Enterococcus include bacteria belonging to the genus Enterococcus fusecharis, Enterococcus 'Feusumum, Enterococcus' Ebbim, Enterococcus.
  • These microorganisms belonging to the genus Enterococcus can be obtained not only as commercial products, but also can be provided with various biological depositary institutions. Examples of such a biological depositary institution include the Patent Organism Depositary Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Japan) and ATCC (American Type Culture Collection; USA). For example, Enterococcus faecalis bacteria have been deposited with ATCC (American Type Culture Collection; U.S.A.) under the accession number ATCC Number 700802 listed in Table 1 below. . In the present invention, Enterococcus faecalis KRI-68 strain can be obtained from ATCC based on this accession number and can be suitably used.
  • Table 1 shows specific strains that are particularly useful in the present invention.
  • numbers marked with "KRI" are reference numbers for identifying strains.
  • strains can be obtained from Kawai Lactococci Laboratories, Inc. (Tokyo, Japan).
  • Table 2 shows the bacteriological properties of the strains exemplified in Table 1.
  • the microorganism belonging to the genus Enterococcus used in the present invention is not limited. However, it is preferable to culture in a Rogosa liquid medium as described below.
  • a blood sugar lowering agent and an agent for treating and preventing diabetes can be produced using the microorganism belonging to the genus Enterococcus.
  • microorganisms belonging to the genus Enterococcus preferably cultured (proliferated) in a Rogosa liquid medium, can be used for producing a blood sugar lowering agent and an agent for treating and preventing diabetes.
  • the culture of the microorganism belonging to the genus Enterococcus obtained as described above may be directly used for the production of a blood sugar lowering agent and an agent for treating and preventing diabetes.
  • the culture supernatant separated from the culture (including a small amount of bacterial cells, a part of the bacterial cells, secretions of viable cells, etc.) is also used for the production of a blood sugar lowering agent and an agent for treating and preventing diabetes. be able to.
  • the cells isolated from the culture for the production of a blood sugar lowering agent and a therapeutic / prophylactic agent for diabetes.
  • the microorganism belonging to the genus Enterococcus is cultured, for example, in a Rogosa liquid medium (for example, aerobically static culture under conditions of pH 6.5 to 8.0 and a temperature of 36 to 38 ° C). ) And centrifuge the resulting culture The cells obtained by separating and collecting the precipitate are used for the production of a blood sugar lowering agent and an agent for treating diabetes.
  • the cells thus obtained may be used directly for the production of a drug.However, the cells are washed with an isotonic solution such as physiological saline, and then suspended in an isotonic solution such as physiological saline. You can use it after it becomes cloudy.
  • the obtained bacterial cells are subjected to any treatment including cell destruction treatment such as, for example, heat treatment, ultrasonic treatment, freeze-thaw treatment, and the like to prepare a treated bacterial cell product.
  • cell destruction treatment such as, for example, heat treatment, ultrasonic treatment, freeze-thaw treatment, and the like to prepare a treated bacterial cell product.
  • the treated bacterial cells may contain live cells, but are preferably substantially dead cells (for example, a composition containing dead cells such as a dead cell suspension).
  • the dead cells include disrupted cells obtained by destroying the cells obtained above by ultrasonic treatment or the like, heat-treated cells obtained by heating the cells obtained above, and the like.
  • the killed cells contained in the treated cells used for the production of the blood sugar lowering agent and the agent for treating and preventing diabetes may be whole cells or a part of the cells.
  • the microorganism belonging to the genus Enterococcus used in the production of the blood sugar lowering agent and the agent for treating and preventing diabetes of the present invention may be prepared, for example, as the following cells or treated cells.
  • a microorganism belonging to the genus Enterococcus is inoculated into 5 liters of the aforementioned Rogosa liquid medium, and aerobically for 5 hours at a temperature of 37 ° C (36-38 ° C) in the range of 6.5-8.0. to stationary culture to prepare the viable cell number 10 9 / ml of culture.
  • the resulting culture was subjected to continuous centrifugation at 120 OO rpm to collect viable bacteria, washed twice with physiological saline, suspended in physiological saline, and suspended in 50 ml of bacterial suspension (10 11 Pcs / ml).
  • a microorganism belonging to the genus Enterococcus preferably, a culture, a microorganism or a treated product of the microorganism
  • the blood glucose level can be reduced by 10% to 40% as compared with the non-administration group.
  • the acute toxicity of the microorganism of the present invention is extremely low.
  • the LD value 50% lethal dose
  • a drug containing the microorganism according to the present invention preferably, a culture, a microbial cell, or a processed product of the microbial cell
  • a drug containing the microorganism according to the present invention preferably, a culture, a microbial cell, or a processed product of the microbial cell
  • a diabetic therapeutic agent and a diabetic preventive agent closely related to the blood sugar lowering effect are very effective as a diabetic therapeutic agent and a diabetic preventive agent closely related to the blood sugar lowering effect.
  • the blood sugar lowering agent and the diabetes treatment / prevention agent of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier or additive.
  • pharmaceutically acceptable carrier or additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, carboxybutyl polymer, sodium alginate, pectin, xanthan gum, gum arabic, casein, Examples include gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, sorbitol, ratatose and the like.
  • the added caroten used is selected appropriately or in combination according to the dosage form of the drug.
  • the blood sugar lowering agent and the preventive agent for treating diabetes include other extenders, diluents, binders, lubricants, disintegrators, disintegrants, wetting agents, stabilizers, buffers, and flavoring agents commonly used in pharmacy. It may further contain additives such as a preservative and a coloring agent.
  • the blood sugar lowering agent and the diabetes treatment / prevention agent of the present invention can be, but not limited to, administered orally or by intravenous injection.
  • the blood sugar lowering agent and the prophylactic agent for treating diabetes mellitus of the present invention include solid preparations including powders including tablets, granules, pills, capsules, and lyophilized powders, diels, and physiological saline. Ordinary dosage forms such as liquid preparations, suspensions, syrups and other liquid preparations dissolved in water.
  • Subjects to which the blood sugar lowering agent and the anti-diabetic agent of the present invention are administered are mammals including humans, domestic animals, pet animals, experimental (test) animals, and the like. In particular, it is preferable for mammals such as humans having a high blood sugar level or humans having a predisposition to diabetes easily.
  • the dosage of the blood sugar lowering agent and the diabetes treatment / prevention agent of the present invention varies depending on the animal species to be administered, age and body weight, administration route, number of administrations, and the like, and is widely changed by those skilled in the art. be able to.
  • the oral dose of a microorganism as an active ingredient preferably, a culture, a microbial cell, or a processed product of the microbial cell
  • the blood sugar lowering agent and anti-diabetic agent of the present invention are preferably, but not limited to, administered at least once a day and continuously (eg, for one month or more).
  • the present invention includes administering a microorganism belonging to the above-described genus Enterococcus (preferably a culture, a bacterial body or a processed product of the microorganism) or a pharmaceutical composition containing the same as described above. It also relates to methods for lowering blood glucose levels, and methods for treating and preventing or preventing diabetes.
  • a microorganism belonging to the above-described genus Enterococcus preferably a culture, a bacterial body or a processed product of the microorganism
  • a pharmaceutical composition containing the same as described above preferably a culture, a bacterial body or a processed product of the microorganism
  • diabetic mice ⁇ Ay male were obtained from Clea Japan, Inc. at the age of 4 weeks, and used for experiments after pre-breeding for 2 weeks.
  • Seven animals were housed in one cage at a room temperature of 22 ⁇ 1 ° C, a humidity of 55.0 ⁇ 10%, and a light cycle of 12 hours.
  • tap water passed through a solid feed was placed in a water bottle and allowed to be freely taken.
  • an advantage test strip S was set in Advantage II, which is commercially available from Roche's D.A. Sticky Co., Ltd., and the collected blood was poured thereinto to measure the blood glucose level.
  • Urine collection was performed once every 5 days. A net was set between the stick bottle and the transparent cup, a mouse was placed on the stick bottle side, and urine was collected in the transparent cup. The collected urine was impregnated into the per-par IIG, pH purchased from Eiken-Danigaku Co., Ltd., and judged on a 6-point scale of 1, ⁇ , +, + +, + + + and + + + + . + The urine judged to be above was judged to have diabetes.
  • Enterococcus faecium KRI-622 strain was inoculated into Rogosa liquid medium according to the above-described example of preparing viable cells, and aerobically at pH 6.5-8.0 and a temperature of 36-38 ° C. After static culture, a bacterial suspension (live cells) was prepared in physiological saline. From this bacterial suspension, heat-treated dead cells (dead cell suspension) were prepared in accordance with the above-described example of preparing dead cells.
  • the prepared viable cell suspension (cells: 10 11 cells Z days) or the heat-killed cells (80 mg / 0.5 ml Z days) was added to the diabetic mouse KK Ay (male 6 Weekly breeding, average body weight 31 g, 7 animals per group) were orally administered daily, and bred for 85 days.
  • blood was collected from the tail artery of the mouse once every five days. Table 4 shows the results of measuring the blood glucose level in blood by the above method.
  • the experiment was carried out in the same manner as in Example 1, except that Enterococcus faecalis KRI-68 strain was used instead of the Enterococcus faecium KRI-622 strain.
  • the prepared viable cell suspension (cells: 10 11 cells / day) or the heat-killed cells (80 mgZ 0.5 mlZ day) was treated with the above diabetic mouse KK Ay (male bred 6 weeks old, average weight 31 g, (7 animals per group) were orally administered daily and kept for 85 days.
  • blood was collected from the tail artery of the mouse once every five days. Table 5 shows the results of measuring blood glucose in the blood using the above method.
  • the microorganism Enterococcus' Feucharis KRI-68 showed a remarkable reduction in blood sugar level of dead cells at 39% on day 80 and 36% on day 85. Live cells also showed a 16% and 17% reduction on days 80 and 85, respectively.
  • Example 2 An experiment was carried out in the same manner as in Example 1, except that Enterococcus aebium KRI-1223 was used instead of the Enterococcus fezium KRI-622 strain. It was.
  • the prepared viable cell suspension (cells: 10 11 cells Z day) or the heat-killed cells (80 mg Z 0.5 ml Z day) was treated with the above diabetic mouse KK Ay (male bred 6 weeks old, average weight 31 g, (7 animals per group) were orally administered daily and kept for 85 days.
  • blood was collected from the tail artery of the mouse once every five days. Table 6 shows the results of measuring the blood glucose level in blood using the above method.
  • the microorganism Enterococcus' ebium KRI-1223 showed a blood glucose reduction rate of 11% on day 80 and 12% on day 85 in dead cells. For live cells, the reduction rate was 1.8% on day 80 and 8% on day 85.
  • Enterococcus durans Enterococcus durans (Enterococcus) An experiment was performed in the same procedure as in Example 1.
  • the prepared viable cell suspension (cells: 10 11 cells Z days) or the heat-killed cells (80 mgZ 0.5 mlZ days) was treated with the above diabetic mouse KK Ay (male bred 6 weeks old, average weight 31 g, (7 animals per group) were orally administered daily and kept for 85 days.
  • blood was collected from the mouse tail artery once every five days. Table 7 shows the results of measuring the blood glucose level in blood by the above method.
  • Viable cells 238 265 344 365 378 379 Heat treated cells 238 263 347 353 357 359 [0055] As shown in Table 7, the microorganism Enterococcus' durans KRI-614 showed a 14% reduction in blood glucose level on the dead cells on days 80 and 85, respectively. The viable cells showed a 9% reduction on day 80 and day 85, respectively.
  • Enterococcus Fetsumum KRI-622 strains, instead of Enterococcus miteis (Enterococcus mitis) KRI-814 strains, Enterococcus 'salivarius (Enterococcus s alivarius) KRI-1216 strain, and Enterococcus' equinus (usoc 120 n) enteroccus An experiment was carried out in the same manner as in Example 1, except that each was used.
  • the prepared viable cell suspension (cells: 10 11 cells / day) or heat-killed cells (80 mg / 0.5 ml Z-day) was treated with the above-mentioned diabetic mouse KK Ay (male 6 weeks old, average (Body weight: 31 g, 7 animals in each group) was orally administered daily and kept for 85 days.
  • blood was collected from the tail artery of the mouse once every five days. Table 8 shows the results of measuring the blood glucose level in blood by the above method.
  • Example 2 Using ICR mice (male, 6 weeks old, average body weight, 30 g ⁇ 0.7 g), the acute toxicity of the cells or the treated cells according to the present invention was examined.
  • a live cell suspension of each strain was prepared according to the above-mentioned preparation example of live cells. From the obtained raw cell suspension, one animal per 9 X 10 9 pieces mice, 9 X 10 8 cells, saline suspension to contain viable bacteria dose of 9 X 10 7 cells of three stages was administered intraperitoneally to ICR mice, and the survival of the mice was observed for 14 days (10 mice per group). Table 9 shows LD values measured according to the BEHRENS-KARBER method.
  • Example 2 80 mg of the freeze-dried product of Enterococcus' Fescium KRI-622 obtained according to Example 1 (corresponding to 3 x 10 11 dead cells) is uniformly mixed with 920 mg of purified starch powder, and tableted for oral administration. Tablets. This tablet corresponds to a dead cell dose 6 X 1 0 9 pieces / kg body weight in an adult weighing 60 kg.
  • the blood sugar lowering agent and the diabetes preventive agent of the present invention are thus obtained by mixing the cells with a pharmaceutically acceptable carrier based on the above standard dose and the like, to obtain the desired drug having the above-mentioned medicinal effect. It can be in dosage form.
  • the blood sugar lowering agent and the anti-diabetic agent comprising the Enterobacter genus bacterium (preferably a culture of the bacterium, a cell or a processed product of the cell) of the present invention as an active ingredient have a high blood sugar lowering action and For safety, it can be suitably used, for example, for administration to diabetic patients. Further, their production methods can be advantageously used for producing a drug having a high blood glucose lowering effect.

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Abstract

　本発明は、エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・エビウム、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・サリバリウス、エンテロコッカス・ミティス及びエンテロコッカス・イクイヌスより成るエンテロコッカス属細菌群から選択される１種又は２種以上の微生物を有効成分として含有する、血糖値低下剤及び糖尿病治療・予防剤、並びにその製造方法に関する。

Description

明 細 書
血糖値低下剤、糖尿病治療 ·予防剤及びその製造方法
技術分野
[0001] 本発明は、乳酸菌を有効成分とする血糖値低下剤及び糖尿病治療 ·予防剤及び その製造方法に関する。
背景技術
[0002] 近年において、特に先進各国においては、食事によるカロリー摂取の過多等により 生活習慣病、成人病の一つである糖尿病が蔓延するに至っている。糖尿病の患者 数は、日本国内だけでも 650万人を超えると言われている。さらに、耐糖能障害を患 う糖尿病患者の予備軍は人口の 10人に 1人、つまり、 1000万人を超えていると言わ れている。
[0003] 現在においては、多くの種類の血糖値低下剤や糖尿病治療剤が実用に供されて いる。しかし、これらの多くは、薬理効果及び副作用等の点において必ずしも満足し 得るものとは云い難ぐより効果的な薬剤の希求が高まるに至っている。
[0004] 安全性の高い血糖値低下剤としては、乳酸桿菌菌体の水抽出物が知られている（ 特開平 06-116156号公報)。し力し安全性が高く効果のより優れた薬剤はなおも求め られている。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 本発明は、安全性が高く効果の優れた血糖値低下剤及び糖尿病治療 ·予防剤を 提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0006] 本願の発明者は、ェンテロコッカス属に属する各種微生物 (乳酸菌）が血糖値を極 めて効果的に低下せしめる作用を有することを見出した。さらに本発明者は、その起 源が所謂腸内細菌であるそれら微生物が、経口的には実質的に無毒性であること、 且つ薬理活性も極めて高いことを見出した。その結果、本発明者は、ェンテロコッカ ス属に属する微生物を、これまでの種々の血糖値低下剤や糖尿病の各種症状を軽 減する糖尿病薬剤が有していたような種々の副作用を生じさせることなぐ他の薬剤 と重複して服用しても飲み合わせによる問題が生じない、血糖値低下効果と糖尿病 の治療及び予防効果を有する薬剤として有効に使用できることを見出し、以下の通り 本発明を完成した。
[0007] 本発明は、ェンテロコッカス ·フエカリス、ェンテロコッカス ·フエシゥム、ェンテロコッ カス.ェビゥム、ェンテロコッカス.デュランス、ェンテロコッカス.サリノくリウス、ェンテロ コッカス ·ミテイス及びェンテロコッカス'イクィヌスより成るェンテロコッカス属細菌群か ら選択される 1種又は 2種以上の微生物を有効成分として含有する、血糖値低下剤 に関する。
[0008] 本発明はまた、ェンテロコッカス ·フエカリス、ェンテロコッカス ·フエシゥム、ェンテロ コッカス.ェビゥム、ェンテロコッカス.デュランス、ェンテロコッカス.サリバリウス、ェン テロコッカス .ミテイス及びェンテロコッカス'イクィヌスより成るェンテロコッカス属細菌 群から選択される 1種又は 2種以上の微生物を有効成分として含有する、糖尿病治 療'予防剤にも関する。
[0009] ここで上記の微生物（ェンテロコッカス属に属する細菌）は、その微生物の培養物、 菌体、又は菌体処理物のいずれの形態であってもよい。また菌体又は菌体処理物は 、生菌体でも死菌体でもよぐその混合物であってもよいが、死菌体であることがなお 好ましい。
[0010] また本発明は、ェンテロコッカス属に属する微生物をロゴサ液体培地にて培養する ことにより培養物を調製することを含む、ェンテロコッカス属に属する微生物を有効成 分として含有する血糖値低下剤又は糖尿病治療'予防剤の製造方法にも関する。
[0011] この製造方法では、限定するものではないが、上記微生物をロゴサ液体培地にて p H6. 5-8. 0、温度 36— 38°Cの条件下で好気的に培養 (例えば静置培養)すること が好ましい。
[0012] 本発明ではまた、上記製造方法にお!、て、上記のように調製した培養物力 菌体 を回収し、それを洗浄することをさらに含むことが好ましい。洗浄した菌体は、生理食 塩水等の溶媒中に懸濁して菌懸濁液として調製してもよ 、。
[0013] さらに本発明では、上記製造方法において、洗浄した菌体 (又は菌懸濁液)を加熱 し、洗浄することをさらに含むことが好ましい。洗浄した菌体は、さらに懸濁液として調 製してもよい。ここで上記の洗浄した菌体 (又は菌懸濁液）の加熱は、 110— 120°C で 5— 10分間にわたって行うことが好ましい。
[0014] 本発明においては、下記（a)—（e)のステップを含む、ェンテロコッカス属に属する 微生物を有効成分として含有する血糖値低下剤又は糖尿病治療 ·予防剤の製造方 法が特に好ましい：
(a)ェンテロコッカス属に属する微生物の生菌体をロゴサ液体培地に接種するステ ップ、
(b)接種した培地を、 pH6. 5-8. 0、温度 36— 38°Cの条件下で好気的に静置培 養することにより培養物を調製するステップ、
(c)調製した培養物を遠心分離することにより菌体を回収するステップ、
(d)回収した菌体を生理食塩水で洗浄するステップ、及び
(e)洗浄した菌体を生理食塩水に懸濁することにより菌懸濁液を得るステップ。
[0015] さらにこの製造方法では、下記 (f)一（h)のステップをさらに含んでもよい：
(f)ステップ（e)で得られた菌懸濁液を 110— 120°Cで 5— 10分間加熱するステツ プ、
(g)加熱した菌液中の菌体を生理食塩水で洗浄するステップ、及び
(h)洗浄された菌体を生理食塩水に懸濁させることにより前記ェンテロコッカス属に 属する微生物の死菌体を含有する菌懸濁液を調製するステップ。
[0016] 上記製造方法において、前記ェンテロコッカス属に属する微生物とは、好ましくは、 ェンテロコッカス ·フエカリス、ェンテロコッカス'フエシゥム、ェンテロコッカス 'ェビゥム 、ェンテロコッカス.デュランス、ェンテロコッカス.サリバリウス、ェンテロコッカス.ミティ ス及びェンテロコッカス ·イクィヌスより成る細菌群力も選択される 1種又は 2種以上の 微生物である。
発明の効果
[0017] 本発明に係る血糖値低下剤、糖尿病治療 ·予防剤は、その薬効成分が腸内細菌 であることから、副作用を生じさせることがなぐ他の薬剤と重複して服用しても飲み 合わせによる問題が生じさせることがなぐ血糖値低下に、そして糖尿病の治療及び 予防に極めて有効である。
[0018] 本明細書は、本願の優先権の基礎となる日本国特願 2002— 190616号の明細書 に記載された内容を包含する。
発明を実施するための最良の形態
[0019] 以下、本発明に用いる微生物 (乳酸菌）、菌体処理方法、薬理効果等についてそ れぞれ詳しく説明する。
[0020] 1.微牛.物
本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療'予防剤の製造には、ェンテロコッカス属 に属する微生物（乳酸菌）のうち 1種又は 2種以上の微生物を用いることが好ま U、。 ェンテロコッカス属に属する微生物とは、ェンテロコッカス.フエカリス、ェンテロコッカ ス 'フエシゥム、ェンテロコッカス 'ェビゥム、ェンテロコッカス.デュランス、ェンテロコッ カス ·サリバリウス、ェンテロコッカス ·ミテイス及びェンテロコッカス ·イクィヌス等に分類 されるェンテロコッカス属細菌群に含まれる微生物を意味する。
[0021] これらのェンテロコッカス属に属する微生物は、市販品として入手できるだけでなく 、様々な生物寄託機関力も分与を受けることもできる。そのような生物寄託機関として は、例えば、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本)や ATCC (American Type Culture Collection;米国）等が挙げられる。例えば、ェンテロ コッカス ·フエカリス菌としては、後述の表 1に挙げたェンテロコッカス ·フエカリス菌 KR 1—68株力 ATCC (American Type Culture Collection;米国）に受託番号「ATCC Number 700802」として寄託されて 、る。本発明にお 、ては、この受託番号に基 いてェンテロコッカス.フエカリス菌 KRI— 68株を ATCCから入手し、好適に使用する ことができる。
[0022] 本発明にお 、て特に有用である具体的な菌株を表 1に例示する。
[0023] 尚、表中にぉ 、て、「KRI」を付した番号は、菌株を特定するための整理番号である
。これらの菌株は、株式会社 河合乳酸球菌研究所（日本、東京都)から入手するこ とがでさる。
[表 1] Enterococcus faecium KRI- 622
Enterococcus faecalis KRI- 68
Enterococcus abium RI- 1223
Enterococcus durans KRI- 614
Enterococcus mitis KRI— -814
Enterococcus salivarius RI- 1216
Enterococcus equinus KRI— 120 表 1に例示された菌株の菌学的性質を表 2に示す。
[表 2]
Figure imgf000006_0001
2. ^ i ^m^
本発明にお 、て用いるェンテロコッカス属に属する微生物は、限定するものではな 、が、下記のようなロゴサ (Rogosa)液体培地にて培養することが好ま 、。
[表 3] ロゴサ液体培地の
蒸留水 1リットル中に
ド Jプチケース 10g
酵母エキス 5g
トリブト一ス 3g
Figure imgf000007_0001
H2PO4 3g
クェン酸三アンモ-ゥム 2g
ツイーン 80 lg
グルコース 20g
システィ »塩 0. 2g
※塩類溶液 5ml
(pH7、 121。C、 15分間加熱滅菌）
※塩類溶液蒸留水 100ミリリットル中に
MgS04*7HaO 11. 5g
FeSOi- 7H20 0. 68g
Figure imgf000007_0002
[0026] 本発明においては、上記ェンテロコッカス属に属する微生物を用いて、血糖値低下 剤及び糖尿病治療'予防剤を製造することができる。本発明では、好ましくはロゴサ（ Rogosa)液体培地にて、培養した (増殖させた)ェンテロコッカス属に属する微生物 を、血糖値低下剤及び糖尿病治療 ·予防剤の製造に用いることができる。本発明で は、そのようにして得たェンテロコッカス属に属する微生物の培養物を、血糖値低下 剤及び糖尿病治療 ·予防剤の製造に直接用いてもよい。本発明では、培養物から分 離した培養上清 (少量の菌体、菌体の一部、菌体力もの分泌物等を含む)も、血糖値 低下剤及び糖尿病治療 ·予防剤の製造に用いることができる。
[0027] また本発明では、該培養物から単離した菌体を、血糖値低下剤及び糖尿病治療 · 予防剤の製造に用いることがより好ましい。特に好ましくは、上記ェンテロコッカス属 に属する微生物を、例えばロゴサ (Rogosa)液体培地にて培養 (例えば、 pH6. 5— 8. 0、温度 36— 38°Cの条件下で好気的に静置培養）し、得られた培養物を遠心分 離し、沈殿物を回収することによって得られる菌体を、血糖値低下剤及び糖尿病治 療 '予防剤の製造に用いる。こうして得られた菌体 (主として生菌体)を、直接薬剤の 製造に使用してもよいが、生理食塩水等の等張液で洗浄し、次いで生理食塩水等の 等張液中に懸濁してから使用してもょ 、。
[0028] さらに本発明では、得られた菌体に、例えば加熱処理、超音波処理、凍結解凍処 理などの細胞破壊処理を含む任意の処理を施して、菌体処理物を調製し、それを血 糖値低下剤又は糖尿病治療 ·予防剤の製造に用いてもよい。菌体処理物は、生菌 体を含んでいてもよいが、実質的に死菌体 (例えば、死菌体懸濁液などの、死菌体を 含む組成物）であることが好ましい。死菌体としては、例えば、上記で得られた菌体を 超音波処理等によって破壊した破壊菌体や、上記で得られた菌体を加熱処理した 加熱処理菌体などが挙げられる。血糖値低下剤及び糖尿病治療 ·予防剤の製造に 用いる菌体処理物に含まれる死菌体は、全菌体であっても菌体の一部分であっても よい。
[0029] 本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療'予防剤の製造に用いる上記ェンテロコッ カス属に属する微生物は、例えば以下のようにしての菌体又は菌体処理物として調 製してちょい。
[0030] 1) ^ ^ (^ ^mmm)の 列
ェンテロコッカス属に属する微生物を前述のロゴサ液体培地 5リットルに接種し、 Ρ Η6. 5-8. 0の範囲で温度条件を中心値 37°C (36— 38°C)として、 5時間にわたり 好気的に静置培養し、生菌数 109/mlの培養物を調製する。得られた培養物を 120 OOrpmの連続遠心分離に付し、生菌を集菌し、それを生理食塩水で二度洗浄した 後、生理食塩水に懸濁して菌懸濁液 50ml (1011個/ ml)を得る。
[0031] 2)死菌体 (加熱処理菌体)の調製例
上記 1)の調製例に従って得られた菌懸濁液 50ml (1011個 Zml)を 115°Cで 10分 間加熱する。こうして加熱処理した菌体 80mgを 0. 5mlの生理食塩水で洗浄後、生 理食塩水に懸濁して死菌体懸濁液を得る。
[0032] 3.ェンテロコッカス腫に腫する微牛.物の 糖値低下作用 びに血糖値低下剤及び » 治療'チ防剤における ) ¾ 以上のようにして調製したェンテロコッカス属に属する微生物 (好ましくは該微生物 の培養物、菌体又は菌体処理物）は、良好な血糖値低下作用を示す。これらの微生 物 (好ましくはその培養物、菌体又は菌体処理物）のもつ血糖値低下作用は、例えば 後述の実施例に記載されているような、当業者に公知の血糖値測定法を利用して確 認することができる。本発明にお 、て用いるェンテロコッカス属に属する微生物 (好ま しくは該微生物の培養物、菌体又は菌体処理物）は、効果的に血糖値を低下させる ことができ、限定するものではないが、例えば未投与群と比較して血糖値を 10%— 4 0%低下させることができる。
[0033] また本発明の微生物 (好ましくは該微生物の培養物、菌体又は菌体処理物）のもつ 急性毒性は非常に低い。例えば後述の実施例に示されている LD 値（50%致死量
50
)は、生菌体懸濁液の場合、 9. 9 X 108— 1. 3 X 101Q個/マウス (腹腔内投与)、死 菌体懸濁液の場合はいずれの菌にあっても 5400mgZkg体重 (経口投与）、 920m gZkg体重 (腹腔内)である。特に経口投与の場合、生菌体懸濁液でも死菌体懸濁 液でも、実質的に急性毒性が認められない。
[0034] 従って、本願発明に係る微生物 (好ましくは該微生物の培養物、菌体又は菌体処 理物)を有効成分として含有する薬剤は、血糖値低下剤として非常に有効であり、さ らに、血糖値低下効果と密接に関連する糖尿病治療剤及び糖尿病予防剤として有 効に用いることができる。
[0035] 本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療 ·予防剤は、薬学上許容される担体又は 添加物を含有していてもよい。このような担体及び添加物の例として、水、薬学上許 容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビュルアルコール、ポリビュルピロリドン、カルボ キシビュルポリマー、アルギン酸ナトリウム、ぺクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、 カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、パラフィン、ステアリルァ ルコール、ステアリン酸、ソルビトール、ラタトースなどが挙げられる。使用される添カロ 物は、薬剤の剤形に応じて適宜又は組み合わせて選択される。本発明の血糖値低 下剤及び糖尿病治療'予防剤は、その他の薬学上一般に使用される増量剤、希釈 剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、湿潤剤、安定剤、緩衝剤、矯味剤、保存剤、着色剤な どの添加剤をさらに含有してもよい。 [0036] 本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療 ·予防剤は、限定するものではな ヽが、経 口的に、又は静脈注射により、投与することができる。本発明の血糖値低下剤及び糖 尿病治療'予防剤は、錠剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤、凍結乾燥粉末などを含む 粉剤をはじめとする固形製剤、ジエル剤、あるいは生理食塩水等に溶解した液剤、懸 濁剤、シロップ剤をはじめとする液体製剤などの通常の剤形であってよ 、。
[0037] 本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療'予防剤を投与する対象は、ヒト、家畜、 愛玩動物、実験 (試験)動物等を含む哺乳動物である。特に、血糖値が高めのヒトな どの哺乳動物、又は糖尿病に罹り易い素因を有するヒトなどの哺乳動物力 投与対 象として好ましい。
[0038] 本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療，予防剤の投与量は、投与対象の動物種 、年齢及び体重、投与経路、投与回数などにより異なり、当業者の裁量によって広範 囲に変更することができる。例えば、有効成分である微生物 (好ましくは該微生物の 培養物、菌体又は菌体処理物）の経口投与量は、好ましくは 1日あたり 80— 900mg Zkg体重程度とすることができる。本発明の血糖値低下剤及び糖尿病治療'予防剤 は、限定するものではないが、 1日 1回以上、 «続的に（例えば 1ヶ月以上)投与する ことが好ましい。
[0039] 本発明は、上記のェンテロコッカス属に属する微生物 (好ましくは該微生物の培養 物、菌体又は菌体処理物）又はそれを含有する医薬組成物を上記のようにして投与 することを含む、血糖値を低下させる方法、並びに糖尿病を治療及び Z又は予防す る方法にも関する。
実施例
[0040] 以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的 範囲はこれら実施例によって限定されるものではない。
[0041] [実施例 1]
1· ,験動物の^ I音、妝びに ΙΐΠ.糖彼及び尿糖彼の沏 I定
後述の全ての実施例にぉ 、て、実験動物を用いた実験は以下のように行った。
[0042] 実験動物は、糖尿病マウス ΚΚ Ay (雄)を日本クレア社より 4週令で入手し、 2週間 の予備飼育の後、実験に使用した。 [0043] (1)飼育条件
室温 22± 1°C、湿度 55. 0± 10%、照明周期 12時間にして、 1ケージに 7匹ずつ 飼育した。飼料は、固形飼料を通した水道水を給水瓶に入れ、自由摂取させた。
[0044] (2)採血方法
採血は 5日間に 1回ずつ行い、マウスの尾動脈より採血した。
[0045] (3)血糖値の測定
血糖値の測定にっ 、ては、ロシュ'ダイァクッスティック株式会社より市販されて 、る アドバンテージ IIにアドバンテージテストストリップ Sをセットし、採血した血液を流し込 んで血糖値を測定した。
[0046] (4)採尿及び尿糖値の測定
採尿は 5日に 1回行った。棒瓶と透明カップの間に網をセットし、棒瓶側の方にはマ ウスを入れ、透明カップの方に尿を回収した。栄研ィ匕学株式会社より購入したゥロぺ 一パー IIG、 pHに、回収した尿をしみ込ませ、一、 ±、 +、 + +、 + + +及び + + + +の 6段階で判定した。 +以上と判定された尿について糖尿病の発症と判断した。
[0047] 2. 菌体縣漸夜の調製及びマウスへの ^^菜
上述の生菌体の調製例に従い、ェンテロコッカス'フエシゥム（Enterococcus fae cium)KRI— 622株をロゴサ液体培地に接種し、 PH6. 5—8. 0、温度 36— 38°Cに て好気的に静置培養し、次いで生理食塩水中に菌懸濁液 (生菌体)を調製した。ま たこの菌懸濁液から、上述の死菌体の調製例に従って加熱処理死菌体 (死菌体懸 濁液)を調製した。
[0048] 次に、調製した生菌体懸濁液 (菌体： 1011個 Z日）、又は加熱処理死菌体 (80mg /0. 5mlZ日）を、上記の糖尿病マウス KK Ay (雄性 6週令飼育、平均体重 31g、 各群 7匹）に経口的に毎日投与し、 85日間飼育を続けた。飼育期間中、 5日に 1回、 マウスの尾動脈より採血した。血液中の血糖値を上記の方法で測定した結果を表 4 に示す。
[表 4] 実験日数 0 20 40 60 80 85 血糖値 mg/dl
248 286 409 385 420 425 対照群
ェンテロコッカス 'フエシゥム KR1- 622
生菌体 250 290 355 355 350 352 加熟処理死菡体 245 290 321 302 263 266
[0049] 表 4に示すように、微生物ェンテロコッカス'フエシゥム KRI— 622は、死菌体では 80 曰目で 37. 4%、 85日目で 37. 5%の血糖値の著しい低下率を示した。生菌体でも 80曰目、 85曰目でそれぞれ 16. 6%、 17. 1 %の低下力 S見られた。
[0050] [実施例 2]
ェンテロコッカス .フエシゥム KRI— 622株の代わりにェンテロコッカス ·フエカリス（E nterococcus faecalis) KRI— 68株を用いて、実施例 1と同様の手順で実験を行つ た。調製した生菌体懸濁液 (菌体： 1011個/日）、又は加熱処理死菌体 (80mgZ0. 5mlZ日）を、上記の糖尿病マウス KK Ay (雄性 6週令飼育、平均体重 31g、各群 7 匹）に経口的に毎日投与し、 85日間飼育を続けた。飼育期間中、 5日に 1回、マウス の尾動脈より採血した。血液中の血糖値を上記の方法で測定した結果を表 5に示す
[¾5]
Figure imgf000012_0001
[0051] 表 5に示すように、微生物ェンテロコッカス'フエカリス KRI— 68は、死菌体では 80 日目で 39%、 85日目で 36%の血糖値の著しい低下率を示した。生菌体でも 80日 目、 85日目でそれぞれ 16%、 17%の低下が見られた。
[0052] [実施例 3]
ェンテロコッカス .フエシゥム KRI— 622株の代わりにェンテロコッカス ·ェビゥム（Ent erococcus abium) KRI— 1223株を用いて、実施例 1と同様の手順で実験を行つ た。調製した生菌体懸濁液 (菌体： 1011個 Z日）、又は加熱処理死菌体 (80mgZ0. 5mlZ日）を、上記の糖尿病マウス KK Ay (雄性 6週令飼育、平均体重 31g、各群 7 匹）に経口的に毎日投与し、 85日間飼育を続けた。飼育期間中、 5日に 1回、マウス の尾動脈より採血した。血液中の血糖値を上記の方法で測定した結果を表 6に示す
[表 6]
Figure imgf000013_0002
[0053] 表 6に示すように、微生物ェンテロコッカス'ェビゥム KRI— 1223は、死菌体では 80 日目で 11%、 85日目で 12%の血糖値の低下率を示した。生菌体では 80日目で 1. 8%、 85日目で 8%の低下率であった。
[0054] [実施例 4]
ェンテロコッカス .フエシゥム KRI— 622株の代わりに、ェンテロコッカス ·デュランス ( Enterococcus
Figure imgf000013_0001
実施例 1と同様の手順で実験を行 つた。調製した生菌体懸濁液 (菌体： 1011個 Z日）、又は加熱処理死菌体 (80mgZ0 . 5mlZ日）を、上記の糖尿病マウス KK Ay (雄性 6週令飼育、平均体重 31g、各群 7匹）に経口的に毎日投与し、 85日間飼育を続けた。飼育期間中、 5日に 1回、マウ スの尾動脈より採血した。血液中の血糖値を上記の方法で測定した結果を表 7に示 す。
[表 7] 実験瞻 0 20 40 60 80 85 血糖値 mg/dl
233 269 366 392 415 417 対照群
ェンテロコッカス ·デュランス KRI-614
生菌体 238 265 344 365 378 379 加熱処舰菌体 238 263 347 353 357 359 [0055] 表 7に示すように、微生物ェンテロコッカス'デュランス KRI— 614は、死菌体では 80 日目、 85日目でそれぞれ 14%の血糖値の低下率を示した。生菌体では 80日目、 8 5日目でそれぞれ 9%の低下率を示した。
[0056] [実施例 5]
ェンテロコッカス .フエシゥム KRI— 622株の代わりに、ェンテロコッカス ·ミテイス（En terococcus mitis) KRI— 814株、ェンテロコッカス 'サリバリウス（Enterococcus s alivarius)KRI— 1216株、及びェンテロコッカス'イクィヌス（Enterococcus equin us) KRI— 120株をそれぞれ個別に用いて、実施例 1と同様の手順で実験を行った。 調製した生菌体懸濁液 (菌体： 1011個/日）、又は加熱処理死菌体 (80mg/0. 5ml Z日）を、上記の糖尿病マウス KK Ay (雄性 6週令飼育、平均体重 31g、各群 7匹） に経口的に毎日投与し、 85日間飼育を続けた。飼育期間中、 5日に 1回、マウスの尾 動脈より採血した。血液中の血糖値を上記の方法で測定した結果を表 8に示す。
[¾8]
Figure imgf000014_0001
[0057] 表 8に示すように、微生物ェンテロコッカス'ミテイス KRI— 814、及びェンテロコッカ ス'イクィヌス KRI— 120は、死菌体では 85日目に 8. 1%の血糖値の低下率を示した
[0058] [実施例 6]
ICR系マウス (雄 6週令、平均体重 30g±0. 7g)を使用して、本発明に係る菌体又 は菌体処理物の急性毒性を調べた。 [0059] 実施例 1と同様に、上記の生菌体の調製例に従って各菌株の生菌体懸濁液を調 製した。得られた生菌体懸濁液から、マウス 1匹当り 9 X 109個、 9 X 108個、 9 X 107 個の 3段階の生菌投与量を含むように生理食塩水懸濁液を調製し、その生理食塩水 懸濁液 0. 5mlを、 ICR系マウスに腹腔内投与し、 14日間マウスの生死を観察した（ 各群 10匹）。 BEHRENS— KARBER法に従って測定した LD 値を表 9に示す。
50
[表 9]
Figure imgf000015_0001
[0060] 尚、死菌体の場合はいずれの菌にあっても、 LD 値は、 6 X 10"個 Zマウス以上（
50
腹腔内投与)であった。また経口投与では!ヽずれの菌も実質的に無毒性であった。
[0061] [製剤例]
実施例 1に従って得られたェンテロコッカス 'フエシゥム KRI— 622の凍結乾燥物 80 mg (死菌体数 3 X 1011個に相当）を精製でんぷん末 920mgと均一に混合し、打錠し て経口投与用錠剤とした。この錠剤は、体重 60kgの成人における死菌体用量 6 X 1 09個/ kg体重に相当する。
[0062] また、上記凍結乾燥物 500mgを精製でんぷん末 500mgと混合し、打錠して経口 投与用錠剤としたものは、同様に体重 60kgの成人における死菌体用量 3. 3 X 1010 個 Zkgに相当する。
[0063] 本発明の血糖値低下剤及び糖尿病予防剤は、このようにして、上記標準用量等に 基づいて菌体と薬学的に許容され得る担体とを混合して、上記薬効を有する所望の 剤形とすることができる。
[0064] 本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はその全体を参照により 本明細書中に組み入れるものとする。
産業上の利用可能性
本発明のェンテロコッカス属細菌 (好ましくは該細菌の培養物、菌体又は菌体処理 物)を有効成分とする血糖値低下剤及び糖尿病治療 ·予防剤は、高 ヽ血糖値低下作 用及び高 、安全性のために、例えば糖尿病患者に投与する上で好適に使用できる 。またそれらの製造方法は、高い血糖値低下作用を有する薬剤を製造するために有 利に使用できる。

Claims

請求の範囲
[I] ェンテロコッカス ·フエカリス、ェンテロコッカス'フエシゥム、ェンテロコッカス .ェビゥム
、ェンテロコッカス.デュランス、ェンテロコッカス.サリバリウス、ェンテロコッカス.ミティ ス及びェンテロコッカス'イクィヌスより成るェンテロコッカス属細菌群力も選択される 1 種又は 2種以上の微生物を有効成分として含有する、血糖値低下剤。
[2] 前記微生物が、前記微生物の培養物、菌体、又は菌体処理物である、請求項 1に記 載の血糖値低下剤。
[3] 前記菌体又は菌体処理物が、生菌体及び Z又は死菌体である、請求項 2に記載の 血糖値低下剤。
[4] ェンテロコッカス'フエカリス、ェンテロコッカス'フエシゥム、ェンテロコッカス 'ェビゥム 、ェンテロコッカス.デュランス、ェンテロコッカス.サリバリウス、ェンテロコッカス.ミティ ス及びェンテロコッカス'イクィヌスより成るェンテロコッカス属細菌群力も選択される 1 種又は 2種以上の微生物を有効成分として含有する、糖尿病治療'予防剤。
[5] 前記微生物が、前記微生物の培養物、菌体、又は菌体処理物である、請求項 4に記 載の糖尿病治療'予防剤。
[6] 前記菌体又は菌体処理物が、生菌体及び Z又は死菌体である、請求項 5に記載の 糖尿病治療，予防剤。
[7] ェンテロコッカス属に属する微生物をロゴサ液体培地にて培養することにより培養物 を調製することを含む、ェンテロコッカス属に属する微生物を有効成分として含有す る血糖値低下剤又は糖尿病治療 ·予防剤の製造方法。
[8] 前記培養を pH6. 5-8. 0、温度 36— 38°Cの条件下で好気的に行う、請求項 7に記 載の方法。
[9] 前記培養物から菌体を回収し、洗浄することをさらに含む、請求項 7又は 8に記載の 方法。
[10] 前記の洗浄した菌体を加熱し、洗浄することをさらに含む、請求項 9に記載の方法。
[II] 下記ステップ (a)—（h)を含む、ェンテロコッカス属に属する微生物を有効成分として 含有する血糖値低下剤又は糖尿病治療 ·予防剤の製造方法：
(a)ェンテロコッカス属に属する微生物の生菌体をロゴサ液体培地に接種するステ ップ、
(b)接種した培地を、 pH6. 5-8. 0、温度 36— 38°Cの条件下で好気的に静置培 養することにより培養物を調製するステップ、
(c)調製した培養物を遠心分離することにより菌体を回収するステップ、
(d)回収した菌体を生理食塩水で洗浄するステップ、
(e)洗浄した菌体を生理食塩水に懸濁することにより菌懸濁液を得るステップ。
(f)ステップ（e)で得られた菌懸濁液を 110— 120°Cで 5— 10分間加熱するステツ プ、
(g)加熱した菌懸濁液中の菌体を生理食塩水で洗浄するステップ、及び
(h)洗浄された菌体を生理食塩水に懸濁させることにより前記微生物の死菌体を含 有する菌懸濁液を調製するステップ。
前記ェンテロコッカス属に属する微生物力 ェンテロコッカス'フエカリス、ェンテロコッ カス'フエシゥム、ェンテロコッカス 'ェビゥム、ェンテロコッカス'デュランス、ェンテロコ ッカス ·サリバリウス、ェンテロコッカス ·ミテイス及びェンテロコッカス'イクィヌスより成る 細菌群から選択される 1種又は 2種以上の微生物である、請求項 7— 11の 、ずれか 1項に記載の方法。
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