JP2804514B2 - 遅効性作用を有するヒルジン誘導体 - Google Patents
遅効性作用を有するヒルジン誘導体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は遅効性作用を有するヒルジン誘導体、その製
法およびその使用に関する。
法およびその使用に関する。
ヒルジンは例えばEP−A142,860、EP−A158,564、EP−
A158,986、EP−A168,342、EP−A171,024、EP−A193,17
5、EP−A200,655、EP−A209,061、EP−227,938、DE3,44
5,517Al、DE3,805,540.6およびchang,FEBS,164、（198
3）307に記載されている。特にchangはヒルジンのＣ−
末端を短縮するとその抗血栓作用が大きく損なわれるこ
とを示している。抗凝血物質療法にとつてのヒルジンの
重要性も十分に記載されている（例えばP.Walsmann他;P
harmazie,36（1981）653）。かくの如くこのものはトロ
ンビンを特異的に阻害するがしかしながらそれ以外では
薬理学的に不活性である、すなわち望ましからぬ副作用
はこれまで確認されていない。
A158,986、EP−A168,342、EP−A171,024、EP−A193,17
5、EP−A200,655、EP−A209,061、EP−227,938、DE3,44
5,517Al、DE3,805,540.6およびchang,FEBS,164、（198
3）307に記載されている。特にchangはヒルジンのＣ−
末端を短縮するとその抗血栓作用が大きく損なわれるこ
とを示している。抗凝血物質療法にとつてのヒルジンの
重要性も十分に記載されている（例えばP.Walsmann他;P
harmazie,36（1981）653）。かくの如くこのものはトロ
ンビンを特異的に阻害するがしかしながらそれ以外では
薬理学的に不活性である、すなわち望ましからぬ副作用
はこれまで確認されていない。
しかしながら動物体または人体中におけるヒルジンの
滞留時間が比較的短いためこのものを血栓症予防剤とし
て医学的に使用するには不都合であると見なされる（Ri
chter他、Haematol.115（1988）64;Markwardt他、Pharm
azie43（1988）202）。
滞留時間が比較的短いためこのものを血栓症予防剤とし
て医学的に使用するには不都合であると見なされる（Ri
chter他、Haematol.115（1988）64;Markwardt他、Pharm
azie43（1988）202）。
それゆえ本発明はより半減期が長いかまたは排除され
難い新規ヒルジン誘導体を見出すという目的に基づくも
のである。
難い新規ヒルジン誘導体を見出すという目的に基づくも
のである。
驚くべきことに、この目的はヒルジンまたはその生理
学的に受容されうる塩および担体から形成されるヒルジ
ン誘導体により達成できた。
学的に受容されうる塩および担体から形成されるヒルジ
ン誘導体により達成できた。
ヒルジンとして適当な例をあげれば、前記文献に記載
された化合物、特にEP−A171,024、EP−A158,986、EP−
A209,061およびDE3,805,540.6に記載された化合物、例
えば である。
された化合物、特にEP−A171,024、EP−A158,986、EP−
A209,061およびDE3,805,540.6に記載された化合物、例
えば である。
これらヒルジンは当業者に一般的に知られているペプ
チド化学的方法例えばHouben−Weyl,Methoden der orga
nischen Chemie（Methods of Organic Chemistry）、vo
lume15/2記載の方法、好ましくは例えばB.Merrifieldの
J.Am.Chem.Soc.85、2149（1963）またはR.C.Sheppardの
Int.J.Peptide Protein Res.21、118（1983）に記載さ
れるような固相合成によるかまたは同等の知られた方法
により調製されうる。あるいはまた前記ヒルジンは当業
者に知られた遺伝子操作法により取得することもでき
る。
チド化学的方法例えばHouben−Weyl,Methoden der orga
nischen Chemie（Methods of Organic Chemistry）、vo
lume15/2記載の方法、好ましくは例えばB.Merrifieldの
J.Am.Chem.Soc.85、2149（1963）またはR.C.Sheppardの
Int.J.Peptide Protein Res.21、118（1983）に記載さ
れるような固相合成によるかまたは同等の知られた方法
により調製されうる。あるいはまた前記ヒルジンは当業
者に知られた遺伝子操作法により取得することもでき
る。
さらに、遺伝子工学的方法により修飾された下記ヒル
ジンも適する。例えば配列中に天然に存在する３個のリ
ジンのうちの２個が天然のアミノ酸好ましくはArgまた
はAsnにより置換された化合物が好都合である。また、
特異的にＮ−末端（好ましくはLys）またはＣ−末端
（好ましくはMet）を延長させることにより修飾された
ヒルジンも好都合である。Ｎ−未端を延長させる場合、
配列の途中に存在するリジンが他の天然のアミノ酸好ま
しくはAsnまたはArgにより置換される。
ジンも適する。例えば配列中に天然に存在する３個のリ
ジンのうちの２個が天然のアミノ酸好ましくはArgまた
はAsnにより置換された化合物が好都合である。また、
特異的にＮ−末端（好ましくはLys）またはＣ−末端
（好ましくはMet）を延長させることにより修飾された
ヒルジンも好都合である。Ｎ−未端を延長させる場合、
配列の途中に存在するリジンが他の天然のアミノ酸好ま
しくはAsnまたはArgにより置換される。
担体として使用されるものをあげれば可溶性担体、特
に例えばデキストラン（MW20000−75000dt）、好ましく
はデキストラン（MW70000dt）、レバン、ヘパリン（MW6
000−20000dt）または低分子量ヘパリン（MW＜6000dt）
のようなポリサツカライド、ポリエチレングリコール
（MW1500−15000dt）またはゼラチン部分水解物例えば
ジイソシアネートで架橋されたゼラチン部分水解物（po
lygeline,Haemaccel）、または不溶性担体例えばCH−セ
フアロース4B（Pharmacia製）のようなセフアロース、
アガロース、セルロース、ヒドロキシメタクリレートが
あるが、特にデキストラン、ヘパリンおよび低分子量ヘ
パリンが好ましく、ここで列記された担体すべては知ら
れた方法により活性化されたものである。
に例えばデキストラン（MW20000−75000dt）、好ましく
はデキストラン（MW70000dt）、レバン、ヘパリン（MW6
000−20000dt）または低分子量ヘパリン（MW＜6000dt）
のようなポリサツカライド、ポリエチレングリコール
（MW1500−15000dt）またはゼラチン部分水解物例えば
ジイソシアネートで架橋されたゼラチン部分水解物（po
lygeline,Haemaccel）、または不溶性担体例えばCH−セ
フアロース4B（Pharmacia製）のようなセフアロース、
アガロース、セルロース、ヒドロキシメタクリレートが
あるが、特にデキストラン、ヘパリンおよび低分子量ヘ
パリンが好ましく、ここで列記された担体すべては知ら
れた方法により活性化されたものである。
ヒルジン誘導体中のヒルジン対担体の比率は非常に大
きく変動できる。これは担体の種類および反応条件の如
何による。
きく変動できる。これは担体の種類および反応条件の如
何による。
本発明はまたヒルジンを活性担体と０〜25℃好ましく
は４℃で反応させることからなるヒルジン誘導体の製法
にも関する。
は４℃で反応させることからなるヒルジン誘導体の製法
にも関する。
本発明によるヒルジン誘導体は特に半減期が長くなつ
ている点で優れており、それゆえ例えば血栓症の予防に
広範囲に使用できる価値あるトロンビンインヒビターで
ある。
ている点で優れており、それゆえ例えば血栓症の予防に
広範囲に使用できる価値あるトロンビンインヒビターで
ある。
従つてヒルジンおよびヒルジン誘導体は例えば心臓弁
（例えばプラスチツク製の）、人口血管、生体適合性医
学装置のカテーテルまたは慣用の血液透析装置のフイル
ター膜および例えばセラミツクのような物質の表面被覆
に好都合に使用される。
（例えばプラスチツク製の）、人口血管、生体適合性医
学装置のカテーテルまたは慣用の血液透析装置のフイル
ター膜および例えばセラミツクのような物質の表面被覆
に好都合に使用される。
血液成分の測定および検出においては検査すべき血液
を予備処理しなければならないという問題がある。この
ことは必然的にかかる検査の確実性に問題を生ずる。ヒ
ルジンで被覆された試験管を用いることで医療従事者に
は新しい可能性が開けることとなる。
を予備処理しなければならないという問題がある。この
ことは必然的にかかる検査の確実性に問題を生ずる。ヒ
ルジンで被覆された試験管を用いることで医療従事者に
は新しい可能性が開けることとなる。
さらにヒルジンおよびヒルジン誘導体は特に活性化合
物の放出を遅延させるのに用いられるインプラント、例
えば浸透性ミニポンプ、生物分解性マイクロカプセル、
ロツド、リポソーム製剤にも用いられる。
物の放出を遅延させるのに用いられるインプラント、例
えば浸透性ミニポンプ、生物分解性マイクロカプセル、
ロツド、リポソーム製剤にも用いられる。
本発明によるヒルジン誘導体はヒルジンが高分子量担
体物質と反応できること、しかもその際驚くべきことに
ヒルジン活性を保持したままであることを示している。
ヒルジンの薬力学的挙動は好都合な様式で変化する。ヒ
ルジンおよびデキストラン−ヒルジンを比較実験するた
めにラツトに注射しそしてトロンビン阻害アツセイによ
り血盪濃度を測定した場合、約10分の一の量のデキスト
ラン−ヒルジンで１時間後にはトロンビン阻害が測定で
きる。さらにもう一つの長所は、驚くべきことに半減期
が延長されることである。半減期はデキストラン−ヒル
ジンで６〜７時間であるが、一方ヒルジンでは１〜２時
間（Marwardt他、Pharmazie43（1988）202）である。
体物質と反応できること、しかもその際驚くべきことに
ヒルジン活性を保持したままであることを示している。
ヒルジンの薬力学的挙動は好都合な様式で変化する。ヒ
ルジンおよびデキストラン−ヒルジンを比較実験するた
めにラツトに注射しそしてトロンビン阻害アツセイによ
り血盪濃度を測定した場合、約10分の一の量のデキスト
ラン−ヒルジンで１時間後にはトロンビン阻害が測定で
きる。さらにもう一つの長所は、驚くべきことに半減期
が延長されることである。半減期はデキストラン−ヒル
ジンで６〜７時間であるが、一方ヒルジンでは１〜２時
間（Marwardt他、Pharmazie43（1988）202）である。
西ドイツ特許出願3,805,406号に記載のイソヒルジン
（Leu−Thr−ヒルジン）を用いる下記実施例により本発
明を説明するが、本発明はそれらに限定されるものでは
ない。用いられるヒルジンと等価であるすべての知られ
たヒルジンおよび本明細書中に前記したヒルジンが担体
と反応できることは当業者にはよく知られている。その
場合反応条件はそれぞれに応じて変動させることができ
る。
（Leu−Thr−ヒルジン）を用いる下記実施例により本発
明を説明するが、本発明はそれらに限定されるものでは
ない。用いられるヒルジンと等価であるすべての知られ
たヒルジンおよび本明細書中に前記したヒルジンが担体
と反応できることは当業者にはよく知られている。その
場合反応条件はそれぞれに応じて変動させることができ
る。
実施例 １ ヒルジンの調製 西ドイツ特許出願P3,805,540.6明細書記載のヒルジン
を分泌する酵母細胞中でヒルジンを合成させた。次にヒ
ルジンをHP20カラムクロマトグラフイー（西ドイツ特許
出願P3,738,541.0）により濃縮した。透析そして次にト
ロンビン−セフアロース（Walsmann,P.:Pharmazie 36
（1981）860−861）でアフイニテイクロマトグラフイー
したのち逆相HPLCにより最終的に精製した。
を分泌する酵母細胞中でヒルジンを合成させた。次にヒ
ルジンをHP20カラムクロマトグラフイー（西ドイツ特許
出願P3,738,541.0）により濃縮した。透析そして次にト
ロンビン−セフアロース（Walsmann,P.:Pharmazie 36
（1981）860−861）でアフイニテイクロマトグラフイー
したのち逆相HPLCにより最終的に精製した。
他の知られた遺伝子操作法またはペプチド化学的方法
により合成することもできる。
により合成することもできる。
実施例 ２ ヒルジンの投与およびそれに続くトロンビン阻害アツセ
イ 体重約300gの雌雄のウイスターラツトをエチルウレタ
ン（1.5g/kg、ip）で麻酔する。これらラツトに1000AT
−U/kgのヒルジン誘導体または真正Leu−Thr−ヒルジン
を生理食塩溶液中に溶解したものを静脈投与した。採血
するには動物の頸動脈にカテーテルを挿入する。アンチ
トロンビン活性を測定するために動物から採血しそして
クエン酸塩処理した。かくして処理された血液0.1mlを
トリス/HCl緩衝液（0.1モル／;pH7.4）の0.2mlと混合
し、そして37℃でプレインキユベートする。トロンビン
溶液（10NIH−U/ml）0.1mlを添加したのちScnitgerおよ
びGrossの凝固計により凝固時間を測定した。この実験
と平行して標準血漿を用いて検量曲線を作成し、このも
のからそれぞれの血漿ヒルジン濃度または血漿ヒルジン
誘導体濃度を読みとる。
イ 体重約300gの雌雄のウイスターラツトをエチルウレタ
ン（1.5g/kg、ip）で麻酔する。これらラツトに1000AT
−U/kgのヒルジン誘導体または真正Leu−Thr−ヒルジン
を生理食塩溶液中に溶解したものを静脈投与した。採血
するには動物の頸動脈にカテーテルを挿入する。アンチ
トロンビン活性を測定するために動物から採血しそして
クエン酸塩処理した。かくして処理された血液0.1mlを
トリス/HCl緩衝液（0.1モル／;pH7.4）の0.2mlと混合
し、そして37℃でプレインキユベートする。トロンビン
溶液（10NIH−U/ml）0.1mlを添加したのちScnitgerおよ
びGrossの凝固計により凝固時間を測定した。この実験
と平行して標準血漿を用いて検量曲線を作成し、このも
のからそれぞれの血漿ヒルジン濃度または血漿ヒルジン
誘導体濃度を読みとる。
実施例 ３ デキストラン−ヒルジン Parikh,J.他のMeth.Enzymol.34（1974）77記載の方法
により、デキストラン（MW 70000dt）へのLeu−Thr−
ヒルジンのカツプリングを行う。この目的にはデキスト
ランをメタ過沃素酸塩と４℃で処理することにより活性
化しそして次に透析および凍結乾燥する。この活性化さ
れたデキストラン2gを次に0.1モル／の燐酸ナトリウ
ム緩衝液（pH8.8）285ml中に室温で溶解させ、この溶液
を４℃に冷却し、20mgのヒルジンを加えそして４℃で14
時間インキユベートする。次に75mlを分離しそして凍結
乾燥する。次に低分子量緩衝塩をゲル過（セフアデツ
クスＧ−25、1cm×100cm）により除去したのち、この溶
液を再び凍結乾燥する。この反応は３個のリジンのうち
の少くとも１個と活性化デキストランとの間で起る。
により、デキストラン（MW 70000dt）へのLeu−Thr−
ヒルジンのカツプリングを行う。この目的にはデキスト
ランをメタ過沃素酸塩と４℃で処理することにより活性
化しそして次に透析および凍結乾燥する。この活性化さ
れたデキストラン2gを次に0.1モル／の燐酸ナトリウ
ム緩衝液（pH8.8）285ml中に室温で溶解させ、この溶液
を４℃に冷却し、20mgのヒルジンを加えそして４℃で14
時間インキユベートする。次に75mlを分離しそして凍結
乾燥する。次に低分子量緩衝塩をゲル過（セフアデツ
クスＧ−25、1cm×100cm）により除去したのち、この溶
液を再び凍結乾燥する。この反応は３個のリジンのうち
の少くとも１個と活性化デキストランとの間で起る。
形成されたシツフ塩基を還元するには、インキユベー
トされた溶液75mlにNaBH475mgを加え、４℃で40分間撹
拌しそして次にこの溶液を４℃で24時間水で透析する
（メンブラン:Servapor Dialysis Tubing;直径10mm、Se
rva Feinbiochemica製）。次にセフアデツクスＧ−25で
ゲル過しそして凍結乾燥する。このデキストラン−ヒ
ルジンを実施例１の記載と同様にしてトロンビン−セフ
アロースアフイニテイクロマトグラフイーにより精製す
る。デキストラン−ヒルジン活性はGriesbachのThrom
b、Res.37（1985）347−350に記載される方法により測
定する。その場合トロンビンにより触媒されたクロモザ
イム（chromozyme）THの開裂に対する阻害が測定され
る。モル基準で測定された活性がヒルジンの活性に相当
する。かくして精製されたデキストラン−ヒルジンを実
施例２の記載におけると同様にしてウイスターラツトに
静脈内投与する。１時間後にラツトの血漿中に検出しう
る濃度が見られる。これは比較実験では約10倍量のヒル
ジンを用いた場合にのみありうる。血漿中のヒルジン濃
度をさらに追跡すると、その物質が排除される半減期は
６〜７時間であることが判明した。これはヒルジン（１
〜３時間）に比較して明らかに延長されている。
トされた溶液75mlにNaBH475mgを加え、４℃で40分間撹
拌しそして次にこの溶液を４℃で24時間水で透析する
（メンブラン:Servapor Dialysis Tubing;直径10mm、Se
rva Feinbiochemica製）。次にセフアデツクスＧ−25で
ゲル過しそして凍結乾燥する。このデキストラン−ヒ
ルジンを実施例１の記載と同様にしてトロンビン−セフ
アロースアフイニテイクロマトグラフイーにより精製す
る。デキストラン−ヒルジン活性はGriesbachのThrom
b、Res.37（1985）347−350に記載される方法により測
定する。その場合トロンビンにより触媒されたクロモザ
イム（chromozyme）THの開裂に対する阻害が測定され
る。モル基準で測定された活性がヒルジンの活性に相当
する。かくして精製されたデキストラン−ヒルジンを実
施例２の記載におけると同様にしてウイスターラツトに
静脈内投与する。１時間後にラツトの血漿中に検出しう
る濃度が見られる。これは比較実験では約10倍量のヒル
ジンを用いた場合にのみありうる。血漿中のヒルジン濃
度をさらに追跡すると、その物質が排除される半減期は
６〜７時間であることが判明した。これはヒルジン（１
〜３時間）に比較して明らかに延長されている。
用いられた実験動物はその健康状態に何ら不利な影響
を受けなかつた。
を受けなかつた。
実施例 ４ セフアロース−ヒルジン ヒルジン8mgを0.1M NaHCO3および0.5M NaCl2ml中にp
H8.0で溶解させる。活性化されたCH−セフアロース4B
（Pharmacia社製）400mgを製造業者の指示に従い膨潤さ
せる。次にタンパク質溶液を担体に加えて23℃で1.5時
間放置した。固定化物を吸引過して残余の結合基を不
活化させるために0.1Mトリス（pH8.0）中に１時間放置
する。次に担体を製造者の指示に従い洗浄する。
H8.0で溶解させる。活性化されたCH−セフアロース4B
（Pharmacia社製）400mgを製造業者の指示に従い膨潤さ
せる。次にタンパク質溶液を担体に加えて23℃で1.5時
間放置した。固定化物を吸引過して残余の結合基を不
活化させるために0.1Mトリス（pH8.0）中に１時間放置
する。次に担体を製造者の指示に従い洗浄する。
タンパク質カツプリング収率は５％である。生物活性
は実施例２におけると同様にしてインビトロで測定す
る。この処置された血漿からセフアロース−ヒルジンを
単離し、１〜1.5M NaCl溶液で洗いそして再び阻害アツ
セイに用いる。測定された活性は第１回の測定の誤差限
界内であつた。
は実施例２におけると同様にしてインビトロで測定す
る。この処置された血漿からセフアロース−ヒルジンを
単離し、１〜1.5M NaCl溶液で洗いそして再び阻害アツ
セイに用いる。測定された活性は第１回の測定の誤差限
界内であつた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 ライナー・オーベルマイアー ドイツ連邦共和国デー‐6234ハツテルス ハイム・アム・マイン．ランゲンハイナ ーヴエーク14 (72)発明者 クラウス・ザウバー ドイツ連邦共和国デー‐6232バートゾー デン・アム・タウヌス．ケーニヒシユタ イナーシユトラーセ144 (72)発明者 ドミニク・トリピーア ドイツ連邦共和国デー‐6239エプシユタ イン／タウヌス．イム・キルシユガルテ ン16 (56)参考文献 特開 昭61−165331（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−22799（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−47198（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−233098（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 17/00 C07K 14/815
Claims (2)
- 【請求項１】下記アミノ酸配列を有するヒルジンまたは
その生理学的に受容されうる塩がセファロースまたはデ
キストランに結合したヒルジン誘導体。 - 【請求項２】請求項１記載のヒルジンまたはその生理学
的に受容されうる塩に活性化されたセファロースまたは
デキストランを０〜25℃で反応させることからなる請求
項１に記載のヒルジン誘導体の製法。
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