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JP2021019609A - Ｈａｏ１（ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ））遺伝子の発現の阻害のための組成物および方法 - Google Patents

Ｈａｏ１（ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（グリコール酸オキシダーゼ））遺伝子の発現の阻害のための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

【課題】ヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ＨＡＯ１）を標的とするＲＮＡｉ剤の提供。【解決手段】細胞でのＨＡＯ１の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、GACUUUCAUCCUGGAAAUAUAのヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、UAUAUUUCCAGGAUGAAAGUCCAのヌクレオチド配列と３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含み；前記センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドであり、かつ前記センス鎖が、３’末端に付着したリガンドにコンジュゲートされている、二本鎖ＲＮＡｉ剤。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれ参照によりそれらの全開示内容が本明細書に組み入れられる、２０１４年１０月１０日出願の米国仮特許出願第６２／０６２，７５１号明細書、２０１５年４月１５日出願の同第６２／１４７，９７６号明細書、および２０１５年９月４日出願の同第６２／２１４，６０２号明細書の利益を請求するものである。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、この配列表は、参照によりその全てが本明細書に組み入れられるものとする。２０１５年１０月８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、３０８６４ＰＣＴ＿ＣＲＦ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔという名称が付され、そのサイズは、７３５，７０５バイトである。
発明の背景
原発性シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）は、グリオキシル酸代謝の常染色体劣性障害である。肝臓グリオキシル酸の解毒が、ＡＧＸＴ遺伝子の変異によって妨げられ、このＡＧＸＴ遺伝子は、肝臓ペルオキシソームアラニン−グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）酵素をコードする。ＡＧＴ１は、ヒドロキシプロリンの代謝分解における最終酵素である。中間代謝産物グリオキシル酸をグリシンに変換するＡＧＴ機能の喪失により、グリオキシル酸が蓄積し、グリオキシル酸は、ヒドロキシ酸オキシダーゼ（ＨＡＯ１）としても知られる酵素グリコール酸オキシダーゼ（ＧＯ）によってシュウ酸塩に酸化されるグリコール酸に還元される。
グリオキシル酸塩、シュウ酸塩の重要な前駆体の調節が、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、およびサイトゾルを含む多数の細胞内の部位で生じる。ＰＨ１患者における過剰なシュウ酸塩は、腎臓によって十分に排出することができないため、シュウ酸カルシウム結晶が形成され、腎臓および尿路に蓄積する。シュウ酸による尿細管毒性、腎石灰沈着、および石による腎臓の閉塞の組み合わせによって腎障害が引き起こされる。３０％を超える患者が、末期腎不全（ＥＳＲＤ）に進行する。
ＨＡＯ１遺伝子は、グリコール酸オキシダーゼ（「ＧＯ」）としても知られる酵素ヒドロキシ酸オキシダーゼ１をコードする。ＨＡＯ１タンパク質は、主に肝臓で発現され、かつグリコール酸に対して最も活性が高い２−ヒドロキシ酸オキシダーゼである。
ＡＧＴ１遺伝子が欠失されたＰＨ１のマウスモデルでは、ＨＡＯ１遺伝子が欠失された場合に尿中シュウ酸塩のレベルが低下する。
ＰＨ１、ＡＧＸＴ、およびＨＡＯ１は、非特許文献１〜４に記載されている。
Ａｎｇｅｌ Ｌ．Ｐｅｙ，Ａｒｍａｎｄｏ Ａｌｂｅｒｔ， ａｎｄ Ｅｄｕａｒｄｏ Ｓａｌｉｄｏ，"Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ Ｄｅｆｅｃｔｓ ｏｆ Ａｌａｎｉｎｅ−Ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ Ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：Ｎｅｗ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｈｙｐｅｒｏｘａｌｕｒｉａ Ｔｙｐｅ Ｉ，"ＢｉｏＭｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ｖｏｌ． ２０１３，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ６８７６５８，１５ ｐａｇｅｓ，２０１３．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１３／６８７６５８ Ｃｏｃｈａｔ ａｎｄ Ｒｕｍｓｂｙ（２０１３）ＮＥＪＭ ３６９：７ Ｓａｌｉｄｏ ｅｔ ａｌ（２００６）ＰＮＡＳ １０３：１８２４９ Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ（２００４）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ − Ｈｅａｒｔ ａｎｄ Ｃｉｒｃｕｌａｔｏｒｙ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ １ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００４Ｖｏｌ．２８７ｎｏ．４，Ｈ１７７１−Ｈ１７７９ＤＯＩ：１０．１１５２／ａｊｐｈｅａｒｔ．００２３４．２００４
発明の概要
本発明は、ＨＡＯ１を標的とするＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ｉＲＮＡ剤を含む組成物を提供する。本発明はまた、ＨＡＯ１の発現を阻害するためおよびＨＡＯ１関連疾患、例えば、ＰＨ１を処置するために本発明の組成物を使用する方法も提供する。
図１は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＨＡＯ１ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示している。 図２は、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＨＡＯ１ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号２）を示している。 図３Ａは、初代カニクイザル肝細胞でのＧＯ（ＨＡＯ）ＧａｌＮａｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニングの結果を示すグラフである。 図３Ｂは、初代カニクイザル肝細胞でのＧＯ（ＨＡＯ）ＧａｌＮａｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの用量反応曲線を示すグラフである。 図４Ａは、単回投与後のＣ５７Ｂ６マウスでのＧＯ（ＨＡＯ）ＧａｌＮａｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ評価の結果を示すグラフである。 図４Ｂは、単回投与後のＣ５７Ｂ６マウスでのＧＯ（ＨＡＯ）ＧａｌＮａｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ評価の結果を示すグラフである。 図５Ａは、ＧＯ（ＨＡＯ）ＧａｌＮａｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートで処置した後のＡＧＸＴノックアウト（ＫＯ）マウスでの尿中シュウ酸塩のレベルを示すグラフである。 図５Ｂは、ＧＯ（ＨＡＯ）ＧａｌＮａｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートで処置した後のＡＧＸＴ ＫＯマウスでの尿中グリコール酸塩のレベルを示すグラフである。 図６Ａは、ＡＧＸＴ ｓｉＲＮＡの単回投与の７２時間後のＰＨ１のラットモデルでのＡＧＸＴ ｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。 図６Ｂは、ＧＯ（ＨＡＯ）ＧａｌＮａｃ−ｓｉＲＮＡコンジュゲートでの処置の７２時間後のＰＨ１のラットモデルでの尿中シュウ酸塩のレベルを示すグラフである。 図６Ｃは、図示されているように、ＡＦ−０１１−６３１０２およびＡＤ−６２９９４の両方の１４日目および２１日目の継続した毎週の投与および２４時間の尿の収集での４９日間後のＰＨ１のラットモデルでの尿中シュウ酸塩のレベルを示すグラフである。 図６Ｄは、ラットにおけるＨＡＯ１ノックダウンの期間を示すグラフである。ＰＢＳで処置されたラットに見られるレベル対して表された、４回の投与の最後から１週間後または４週間後（図６Ｃの２８日目および４９日目に対応する）のｍＲＮＡのレベルが示されている。 図７は、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＨＡＯ１ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列の逆相補配列（配列番号３）を示している。 ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＨＡＯ１ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列の逆相補配列（配列番号４）を示している。 図９は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＨＡＯ１ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号５）を示している。 図１０は、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＨＡＯ１ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号６）を示している。 図１１は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＨＡＯ１ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列の逆相補配列（配列番号７）を示している。 図１２は、ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＨＡＯ１ ｍＲＮＡのヌクレオチド配列の逆相補配列（配列番号８）を示している。 図１３は、ＧＯ ＧａｌＮＡｃコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングを示している。 図１４は、マウスでのＧＯ ＧａｌＮＡｃコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ評価を示すグラフである。 図１５は、マウスでのＧＯ ＧａｌＮＡｃコンジュゲートの用量反応評価を示すグラフである。 図１６は、マウスでのＧＯ ＧａｌＮＡｃコンジュゲートの用量反応評価を示すグラフである。 図１７は、マウスでの用量反応評価を示すグラフである。 図１８は、マウスでのｍＲＮＡノックダウンと血清中グリコール酸塩のレベルとの関係を示す２つのグラフである。 図１９は、ラットでのｍＲＮＡノックダウンと血清中グリコール酸塩のレベルとの関係を示す２つのグラフである。 図２０は、初代カニクイザル肝細胞でのＡＬＮ−６５５８５によるＨＡＯ１ ｍＲＮＡの用量依存性阻害を示すグラフである。 図２１は、マウスにおけるＡＬＮ−ＧＯ１での単回投与処置後のＨＡＯ１ ｍＲＮＡおよび血清中グリコール酸塩のレベルを示す２つのグラフである。 図２２は、マウスにおけるＡＬＮ−ＧＯ１での単回投与処置後のＨＡＯ１ ｍＲＮＡサイレンシングの期間を示すグラフである。 図２３は、ラットにおけるＡＬＮ−ＧＯ１での単回投与処置後のＨＡＯ１ ｍＲＮＡおよび血清中グリコール酸塩のレベルを示すグラフである。 図２４は、ＡＬＮ−ＧＯ１の単回投与後の原発性シュウ酸尿症Ｉ型のマウスモデルでの尿中シュウ酸塩およびグリコール酸塩のレベルを示す２つのグラフである。 図２５Ａは、ＡＬＮ−ＧＯ１の単回投与後の原発性シュウ酸尿症Ｉ型のラットモデルでのＨＡＯ１ ｍＲＮＡのレベルを示すグラフである。 図２５Ｂは、ＡＬＮ−ＧＯ１の単回投与後の原発性シュウ酸尿症Ｉ型のラットモデルでの尿中シュウ酸塩のレベルを示すグラフである。 図２６は、ＡＬＮ−ＧＯ１の反復投与後の原発性シュウ酸尿症Ｉ型のラットモデルでのＨＡＯ１ ｍＲＮＡおよび尿中シュウ酸塩のレベルを示す２つのグラフである。 図２７は、非ヒト霊長類での反復投与後のＨＡＯ１ ｍＲＮＡおよび尿中グリコール酸塩のレベルを示す２つのグラフである。
発明の詳細な説明
本発明は、ＨＡＯ１を標的とするＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む組成物を提供する。本発明はまた、ＨＡＯ１の発現を阻害するため、およびＨＡＯ１関連障害を処置するために本発明の組成物を使用する方法も提供する。
Ｉ．定義
本発明をより容易に理解できるようにするために、まず特定の用語を定義する。加えて、パラメーターの数値または数値範囲が述べられる場合は必ず、述べられる値に対する中間の値および範囲も本発明の一部であるものとすることに留意されたい。
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、１つまたは２つ以上の（即ち、少なくとも１つの）文法的な目的語である物品を指すために本明細書で使用される。例として、「１つの要素」は、１つの要素または２つ以上の要素、例えば、複数の要素を意味する。
「含む」という語は、「限定されるものではないが、〜を含む」という句を意味し、この句と互換的に本明細書で使用される。
「または」という語は、本明細書では、明確に否定する記載がない限り、「および／または」という語を意味し、かつ「および／または」と互換的に使用される。
本明細書で使用される「ＨＡＯ１」は、酵素ヒドロキシ酸オキシダーゼ１をコードする遺伝子を指す。他の遺伝子名としては、ＧＯ、ＧＯＸ、ＧＯＸ１、およびＨＡＯＸ１が挙げられる。このタンパク質は、グリコール酸オキシダーゼおよび（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼとしても知られている。ヒトＨＡＯ１ ｍＲＮＡのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号は、ＮＭ＿０１７５４５．２であり；カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＨＡＯ１ ｍＲＮＡは、ＸＭ＿００５５６８３８１．１であり；ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＨＡＯ１ ｍＲＮＡは、ＮＭ＿０１０４０３．２であり；ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＨＡＯ１ ｍＲＮＡは、ＸＭ＿００６２３５０９６．１である。
本明細書で使用される「ＨＡＯ１」という語は、自然に存在するＨＡＯ１遺伝子のＤＮＡ配列変異体、例えば、ＨＡＯ１遺伝子における一塩基多型（ＳＮＰ）も指す。例示的なＳＮＰは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ＳＮＰで利用可能なＮＣＢＩ ｄｂＳＮＰ Ｓｈｏｒｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎｓデータベースで確認することができる。
本明細書で使用される「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、ＨＡＯ１遺伝子の転写の際に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列の連続した部分を指す。
本明細書で使用される「配列を含む鎖」という語は、標準的なヌクレオチド命名法を用いて参照されるこの配列によって示されるヌクレオチド鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、および「Ｕ」はそれぞれ、一般に、塩基としてグアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを含むヌクレオチドの略号である。「Ｔ」および「ｄＴ」は、本明細書では互換的に使用され、核酸塩基がチミジン、例えば、デオキシリボチミン、２’−デオキシチミジン、またはチミジンであるデオキシリボヌクレオチドを指す。しかしながら、「リボヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、または「デオキシリボヌクレオチド」という語は、詳細が後述される修飾ヌクレオチド、または代理置換部分（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｍｏｉｅｔｙ）も指すことがあることを理解されたい。当業者であれば、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルを、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対の特性を実質的に変更することなく、他の部分によって置換できることを十分に認識している。例えば、限定されるものではないが、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対を形成し得る。従って、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、例えば、イノシンを含むヌクレオチドによって本発明のヌクレオチド配列において置換することができる。このような置換部分を含む配列は、本発明の実施形態である。
本明細書で互換的に使用される「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ剤」、「ｉＲＮＡ剤」、「ＲＮＡ干渉剤」という語は、本明細書で定義されるＲＮＡを含む作用剤を指し、かつＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路によってＲＮＡ転写物の標的の切断を媒介する。ｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）としてのプロセスによってｍＲＮＡの配列特異的分解を誘導する。ｉＲＮＡは、細胞、例えば、対象の細胞、例えば、哺乳動物対象の細胞におけるＨＡＯ１の発現を調節、例えば、阻害する。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して標的ＲＮＡの切断を誘導する一本鎖ＲＮＡを含む。理論に拘束されることを望むものではないが、細胞内に導入される長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして知られているＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解されると考えられている（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。Ｄｉｃｅｒ、リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、ｄｓＲＮＡを処理して、２塩基３’オーバーハングを特徴とする１９〜２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次いで、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれ、そこで、１つ以上のヘリカーゼが、ｓｉＲＮＡ二重鎖を巻き戻し、相補的なアンチセンス鎖が、標的の認識をガイドできるようになる（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つ以上のエンドヌクレアーゼが、標的を切断してサイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。従って、一態様では、本発明は、細胞内で生成されて、ＲＩＳＣ複合体の形成を促進して標的遺伝子、例えば、ＨＡＯ１遺伝子のサイレンシングを行う一本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に関する。従って、「ｓｉＲＮＡ」という語は、本明細書では、上記のＲＮＡｉを指すためにも使用される。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞または器官に導入される一本鎖ｓｉＲＮＡであっても良い。一本鎖ＲＮＡｉ剤は、後に標的ｍＲＮＡを切断するＲＩＳＣエンドヌクレアーゼＡｒｇｏｎａｕｔｅ ２に結合する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、一般に、１５〜３０のヌクレオチドであり、化学修飾されている。一本鎖ｓｉＲＮＡのデザインおよび試験は、それぞれが参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，１０１，３４８号明細書およびＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２） Ｃｅｌｌ １５０：８８３−８９４に記載されている。本明細書に記載されるいずれのアンチセンスヌクレオチド配列も、本明細書に記載される一本鎖ｓｉＲＮＡとして使用する、またはＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２） Ｃｅｌｌ １５０；：８８３−８９４に記載されている方法によって化学修飾することができる。
なお別の実施形態では、本発明は、ＨＡＯ１を標的とする一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子を提供する。「一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子」は、標的ｍＲＮＡ（即ち、ＨＡＯ１）内の配列に相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、ｍＲＮＡに塩基対合して翻訳機構を物理的に妨害することによって化学量論的に翻訳を阻害することができる。Ｄｉａｓ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １：３４７−３５５を参照されたい。あるいは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、標的にハイブリダイズして、ＲＮａｓｅＨ切断事象によって標的を切断することによって標的ｍＲＮＡを阻害する。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、約１０〜約３０ヌクレオチド長であり得、かつ標的配列に相補的な配列を有する。例えば、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、本明細書に記載のいずれか１つのアンチセンスヌクレオチド配列、例えば、表１または表２のいずれか１つに示される配列の少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０以上の連続したヌクレオチドである配列を含むことができる、または本明細書に記載の任意の標的部位に結合することができる。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド分子は、修飾ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはこれらの組み合わせを含み得る。
別の実施形態では、本発明の組成物、使用、および方法に使用される「ｉＲＮＡ」は、二本鎖ＲＮＡであり、本明細書では、「二本鎖ＲＮＡｉ剤」、「二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子」、「ｄｓＲＮＡ剤」、または「ｄｓＲＮＡ」と呼ばれる。「ｄｓＲＮＡ」という語は、標的ＲＮＡ、即ち、ＨＡＯ１遺伝子に対して「センス」および「アンチセンス」の向きを有するとされる、２つの逆平行および実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有する、リボ核酸分子の複合体を指す。本発明の一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が、本明細書ではＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉと呼ばれる転写後遺伝子サイレンシング機構によって標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの分解を引き起こす。
一般に、ｄｓＲＮＡ分子の各鎖のヌクレオチドの大部分は、リボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に説明されるように、それぞれの鎖または両方の鎖が、１つ以上の非リボヌクレオチド、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドも含み得る。加えて、本明細書で使用される「ＲＮＡｉ剤」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含み得；ＲＮＡｉ剤は、多数のヌクレオチドの実質的な修飾を含み得る。このような修飾は、本明細書に開示されるまたは当分野で公知のあらゆるタイプの修飾を含み得る。ｓｉＲＮＡ型分子で使用されるこのような修飾はいずれも、本明細書および特許請求の範囲において「ＲＮＡｉ剤」に包含される。
二重鎖構造を形成する２本の鎖は、１つの大きいＲＮＡ分子の異なる部分でも良いし、または別個のＲＮＡ分子でも良い。２本の鎖が、１つの大きい分子の一部であり、従って、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖によって接続されている場合、接続するＲＮＡ鎖は、「ヘアピンループ」と呼ばれる。２本の鎖が、二重鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端と他方の鎖の５’末端との間のヌクレオチドの連続した鎖以外の手段によって共有結合で接続されている場合、この接続構造は「リンカー」と呼ばれる。ＲＮＡ鎖は、同数または異なる数のヌクレオチドを有し得る。塩基対の最大数は、ｄｓＲＮＡの最も短い鎖のヌクレオチドの数から二重鎖に存在する全てのオーバーハングを減じた値である。二重鎖構造に加えて、ＲＮＡｉ剤は、１つの以上のヌクレオチドオーバーハングを含み得る。本明細書で使用される「ｓｉＲＮＡ」という語も、上記のようなＲＮＡｉ剤を指す。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、標的ＲＮＡ配列、例えば、ＨＡＯ１標的ｍＲＮＡ配列と相互作用して標的ＲＮＡの切断を誘導する２４〜３０ヌクレオチドのｄｓＲＮＡである。理論に拘束されることを望むものではないが、細胞内に導入される長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして知られているＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによってｓｉＲＮＡに分解される（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：４８５）。Ｄｉｃｅｒ、リボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、ｄｓＲＮＡを処理して、２つの塩基３’オーバーハングを特徴とする１９〜２３塩基対の短い干渉ＲＮＡにする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３）。次いで、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれ、そこで、１つ以上のヘリカーゼが、ｓｉＲＮＡ二重鎖を巻き戻し、相補的なアンチセンス鎖が、標的の認識をガイドできるようになる（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の１つ以上のエンドヌクレアーゼが、標的を切断してサイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。
本明細書で使用される「ヌクレオチドオーバーハング」は、ＲＮＡｉ剤の一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端を越えて延びている場合またはその逆の場合に、塩基対を形成していないヌクレオチド、またはＲＮＡｉ剤の二重鎖構造から突き出たヌクレオチドを指す。「平滑」または「平滑末端」とは、二本鎖ＲＮＡｉ剤の端部に塩基対を形成していないヌクレオチドが存在しない、即ち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。「平滑末端」ＲＮＡｉ剤とは、その全長に亘って二本鎖である、即ち、分子のいずれの端部にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないｄｓＲＮＡのことである。本発明のＲＮＡｉ剤は、一端にヌクレオチドオーバーハング（即ち、一端がオーバーハングで、他端が平滑末端）を有する、または両端にヌクレオチドオーバーハングを有するＲＮＡｉ剤を含む。
「アンチセンス鎖」という語は、標的配列（例えば、ヒトＨＡＯ１ ｍＲＮＡ）に実質的に相補的な領域を含む二本鎖ＲＮＡｉ剤の鎖を指す。本明細書で使用される「ＨＡＯ１をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域」という語は、ＨＡＯ１ ｍＲＮＡ配列の一部に実質的に相補的なアンチセンス鎖の領域を指す。相補性の領域が、標的配列に完全には相補的でない場合、ミスマッチは、末端領域で最も許容され、存在する場合は、一般に末端領域、または、例えば、５’および／または３’末端の６、５、４、３、もしくは２ヌクレオチド以内の領域である。
本明細書で使用される「センス鎖」という語は、アンチセンス鎖の領域に実質的に相補的な領域を含むｄｓＲＮＡの鎖を指す。
本明細書で使用される「切断領域」という語は、切断部位のすぐ近傍に位置する領域を指す。切断部位は、切断が起こる標的上の部位である。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの端部およびこの切断部位のすぐ近傍の３つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断領域は、切断部位のいずれかの端部およびこの切断部位のすぐ近傍の２つの塩基を含む。一部の実施形態では、切断部位は、アンチセンス鎖のヌクレオチド１０および１１によって結合された部位に特異的に存在し、切断領域は、ヌクレオチド１１、１２、および１３を含む。
特段の記載がない限り、本明細書で使用される「相補的な」という語は、第２のヌクレオチド配列に対する第１のヌクレオチド配列を説明するために使用される場合、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定の条件下で、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして二重鎖構造を形成する能力を指し、当業者には理解される。このような条件は、例えば、ストリンジェント条件とすることができ、このストリンジェント条件は：４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｏＣまたは７０ｏＣで１２〜１６時間、これに続く洗浄を含み得る。他の条件、例えば、生物体内で遭遇し得る生理的に適切な条件を適用することができる。例えば、相補的な配列は、例えば、ＲＮＡｉになるために核酸の関連機能を果たすのに十分である。当業者であれば、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終的な適用に従った２つの配列の相補性の試験に最も適切な一連の条件を決定することができる。
第１および第２のヌクレオチド配列の全長に亘って、第１のヌクレオチド配列のヌクレオチドと第２のヌクレオチド配列のヌクレオチドとの塩基対合が存在する場合、配列は、互いに対して「完全に相補的」であり得る。しかしながら、本明細書では、第１の配列が、第２の配列に対して「実質的に相補的」であると述べられる場合、２つの配列が、完全に相補的であり得る、または２つの配列が、最終的な適用に対して最も適した条件下でハイブリダイズする能力を維持したまま、ハイブリダイゼーション時に４つ、３つ、または２つを超えない、１つ以上のミスマッチの塩基対を形成し得る。しかしながら、２つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーション時に１つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するようにデザインされている場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に係るミスマッチとは見なされるべきではない。例えば、２１ヌクレオチド長さの１つのオリゴヌクレオチドと、２３ヌクレオチド長さの別のオリゴヌクレオチドを含み、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含むｄｓＲＮＡはなお、本明細書に記載される目的のために「完全に相補的」であると言うことができる。
本明細書で使用される「相補的な」配列は、相補的な配列のハイブリダイズする能力についての上記の要件が満たされるのであれば、非ワトソン・クリック塩基対および／または非天然の修飾ヌクレオチドから形成された塩基対も含んでも良いし、またはワトソン・クリック塩基対および／または非天然の修飾ヌクレオチドから形成された塩基対から完全に形成されても良い。このような、非ワトソン・クリック塩基対としては、限定されるものではないが、Ｇ：Ｕゆらぎ塩基対形成またはフーグスタイン塩基対形成（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ）が挙げられる。
本明細書の「相補的な」、「完全に相補的な」、および「実質的に相補的な」という語は、これらの使用の文脈から分かるように、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間の塩基のマッチ、またはｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖と標的配列との間の塩基のマッチに対して使用することができる。
本明細書で使用される、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の「少なくとも一部に実質的に相補的な」ポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、または３’ＵＴＲを含む目的のｍＲＮＡ（例えば、ＨＡＯ１をコードするｍＲＮＡ）の連続した部分に実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、その配列が、ＨＡＯ１をコードするｍＲＮＡの連続した部分に実質的に相補的である場合、ＨＡＯ１ ｍＲＮＡの少なくとも一部に相補的である。
本明細書で使用される「阻害する」という語は、「減少させる」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、「抑制する」、および他の同様の語と互換的に使用され、あらゆるレベルの阻害を含む。
本明細書で使用される「ＨＡＯ１の発現を阻害する」という句は、あらゆるＨＡＯ１遺伝子（例えば、マウスＨＡＯ１遺伝子、ラットＨＡＯ１遺伝子、サルＨＡＯ１遺伝子、またはヒトＨＡＯ１遺伝子など）およびＨＡＯ１遺伝子の変異体（例えば、自然に存在する変異体）または突然変異体の発現の阻害を含む。従って、ＨＡＯ１遺伝子は、野生型ＨＡＯ１遺伝子、突然変異ＨＡＯ１遺伝子、または遺伝子操作された細胞、細胞群、もしくは生物の文脈における遺伝子組換えＨＡＯ１遺伝子であっても良い。
「ＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害する」は、ＨＡＯ１遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、ＨＡＯ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の阻害を含む。
ＨＡＯ１遺伝子の発現を、ＨＡＯ１遺伝子の発現に関連した任意の変数のレベル、例えば、組織でのＨＡＯ１ ｍＲＮＡのレベルまたはＨＡＯ１タンパク質のレベル、および／または尿中シュウ酸塩のレベルなどに基づいて評価することができる。阻害は、対照レベルと比較した１つ以上のこれらの変数の絶対レベルまたは相対レベルの低下によって評価することができる。対照レベルは、当分野で利用されているあらゆるタイプの対照レベル、例えば、投薬前ベースラインレベル、または未処置もしくは対照（例えば、緩衝液のみの対照もしくは不活性剤の対照）で処置された類似の対象、細胞、もしくはサンプルから決定されるレベルであり得る。
本明細書で使用される「細胞に二本鎖ＲＮＡｉ剤を接触させる」という句は、任意の可能な手段によって細胞に接触させることを含む。細胞に二本鎖ＲＮＡｉ剤を接触させるは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞にＲＮＡｉ剤を接触させること、またはｉｎ ｖｉｖｏで細胞にＲＮＡｉ剤を接触させることを含む。このような接触は、直接的または間接的に行うことができる。従って、例えば、ＲＮＡｉ剤を、方法を行う個人によって細胞に物理的に接触させることができる、あるいは、ＲＮＡｉ剤を、後に細胞への接触を可能にするまたは接触させる状況に置くことができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の接触は、例えば、細胞をＲＮＡｉ剤と共にインキュベートすることによって行うことができる。ｉｎ ｖｉｖｏでの細胞の接触は、例えば、細胞が位置する組織もしくはその近傍にＲＮＡｉ剤を注入することによって、または接触させられる細胞が位置する組織にＲＮＡｉ剤が後に到達するように別の領域、血流もしくは皮下腔にＲＮＡｉ剤を注入することによって行うことができる。例えば、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤を目的の部位、例えば、肝臓に誘導するリガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃ３リガンドを含んでも良いし、かつ／またはリガンドに結合しても良い。接触させるｉｎ ｖｉｔｒｏ法とｉｎ ｖｉｖｏ法の組み合わせも可能である。本発明の方法に関連して、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡｉ剤に接触させて、後に対象に移植することができる。
本明細書で使用される「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物を含む。対象は、トランスジェニック生物を含み得る。最も好ましくは、対象は、ヒト、例えば、ＨＡＯ１関連障害に罹患しているまたはこの障害を発症しやすいヒトである。
本明細書で使用される「患者」または「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、例えば、ヒトまたはサルを含むものとする。最も好ましくは、対象または患者はヒトである。
本明細書で使用される「ＨＡＯ１関連障害」は、ＨＡＯ１の発現を阻害することによって、処置もしくは防止することができるあらゆる障害、または緩和することができる症状を含むものとする。例としては、限定されるものではないが、原発性シュウ酸尿症１型（ＰＨ１）が挙げられる。
本明細書で使用される「治療有効量」は、ＨＡＯ１関連疾患を治療するために患者に投与されたときに、この疾患を治療する（例えば、既存の疾患または疾患の１つ以上の症状を軽減する、改善する、または維持する）のに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むものとする。「治療有効量」は、ＲＮＡｉ剤、ＲＮＡｉ剤が投与される方法、疾患およびその重症度と病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、ＨＡＯ１発現によって媒介される病的過程の段階、以前の治療または併用療法の種類（存在する場合）、および治療される患者の他の個人的な特徴によって異なり得る。
本明細書で使用される「予防有効量」は、ＨＡＯ１関連疾患に罹患していない、またはその症状を示していないがこの疾患に罹患する可能性がある患者に投与されたときに、この疾患またはその１つ以上の症状を防止または改善するのに十分なＲＮＡｉ剤の量を含むものとする。この疾患を改善することは、疾患の進行を遅延させること、または後に発症する疾患の重症度を軽減することを含む。「予防有効量」は、ＲＮＡｉ剤、ＲＮＡｉ剤が投与される方法、疾患のリスクの程度、および病歴、年齢、体重、家族歴、遺伝子構造、以前の治療または併用療法の種類（存在する場合）、および治療される患者の他の個人的な特徴によって異なり得る。
「治療有効量」または「予防有効量」はまた、あらゆる治療に適用可能な妥当な効果／リスク比である程度の望ましい局所効果または全身効果が得られるＲＮＡｉ剤の量も含む。本発明の方法に利用されるＲＮＡｉ剤は、このような治療に適用可能な妥当な効果／リスク比をもたらす十分な量を投与することができる。
本明細書で使用される「サンプル」という語は、対象から単離される同様の液体、細胞、または組織の採取物、および対象の体内に存在する液体、細胞、または組織を含む。生体液の例として、血液、血清、および漿膜液、血漿、脳脊髄液、眼液、リンパ液、尿、および唾液などが挙げられる。組織サンプルとしては、組織、器官、または局所領域からのサンプルを挙げることができる。例えば、サンプルは、特定の器官、器官の一部、またはこれらの器官内の液体もしくは細胞に由来し得る。特定の実施形態では、サンプルは、肝臓（例えば、全肝臓、肝臓の特定の部分、もしくは肝臓の特定の種類の細胞、例えば、肝細胞）に由来し得る。一部の実施形態では、「対象に由来するサンプル」は、対象から採取された血液または血漿を指す。さらなる実施形態では、「対象に由来するサンプル」は、対象に由来する肝組織（もしくはその小成分）を指す。
ＩＩ．本発明のｄｓＲＮＡ ｉＲＮＡ剤
細胞、例えば、対象、例えば、哺乳動物、例えば、ＨＡＯ１関連障害を有するヒトの細胞でのＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害する二本鎖ＲＮＡｉ剤、およびこのような二本鎖ＲＮＡｉ剤の使用が、本明細書に記載されている。
従って、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏでの標的遺伝子（即ち、ＨＡＯ１遺伝子）の発現を阻害することができる化学修飾を有する二本鎖ＲＮＡｉ剤を提供する。
以下により詳細に示されているように、本発明の特定の態様では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている。本発明の他の実施形態では、本発明のｉＲＮＡのヌクレオチドの全てが修飾されている。「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている」本発明のｉＲＮＡは、大部分が修飾されているが全てが修飾されているのではなく、５つ以下、４つ以下、３つ以下、２つ以下、または１つ以下の非修飾ヌクレオチドを含み得る。
ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、１２〜３０ヌクレオチド長の範囲であり得る。例えば、各鎖は、１４〜３０ヌクレオチド長、１７〜３０ヌクレオチド長、１９〜３０ヌクレオチド長、２５〜３０ヌクレオチド長、２７〜３０ヌクレオチド長、１７〜２３ヌクレオチド長、１７〜２１ヌクレオチド長、１７〜１９ヌクレオチド長、１９〜２５ヌクレオチド長、１９〜２３ヌクレオチド長、１９〜２１ヌクレオチド長、２１〜２５ヌクレオチド長、または２１〜２３ヌクレオチド長であり得る。
各鎖は、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、２９ヌクレオチド長、または３０ヌクレオチド長であり得る。ＲＮＡｉ剤の各鎖は、同じ長さであっても良いし、または異なる長さであっても良い。
センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的には二重鎖の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を形成し、本明細書ではＲＮＡｉ剤とも呼ばれる。ＲＮＡｉ剤の二重鎖領域は、１２〜３０ヌクレオチド対の長さであり得る。例えば、二重鎖領域は、１４〜３０ヌクレオチド対の長さ、１７〜３０ヌクレオチド対の長さ、２７〜３０ヌクレオチド対の長さ、１７〜２３ヌクレオチド対の長さ、１７〜２１ヌクレオチド対の長さ、１７〜１９ヌクレオチド対の長さ、１９〜２５ヌクレオチド対の長さ、１９〜２３ヌクレオチド対の長さ、１９〜２１ヌクレオチド対の長さ、２１〜２５ヌクレオチド対の長さ、または２１〜２３ヌクレオチド対の長さであり得る。別の例では、二重鎖領域は、１５ヌクレオチド対の長さ、１６ヌクレオチド対の長さ、１７ヌクレオチド対の長さ、１８ヌクレオチド対の長さ、１９ヌクレオチド対の長さ、２０ヌクレオチド対の長さ、２１ヌクレオチド対の長さ、２２ヌクレオチド対の長さ、２３ヌクレオチド対の長さ、２４ヌクレオチド対の長さ、２５ヌクレオチド対の長さ、２６ヌクレオチド対の長さ、および２７ヌクレオチド対の長さから選択される。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、一方または両方の鎖の３’末端、５’末端、または両末端に１つ以上のオーバーハング領域および／またはキャッピング基を含み得る。オーバーハングは、１〜６ヌクレオチド長、例えば、２〜６ヌクレオチド長、１〜５ヌクレオチド長、２〜５ヌクレオチド長、１〜４ヌクレオチド長、２〜４ヌクレオチド長、１〜３ヌクレオチド長、２〜３ヌクレオチド長、または１〜２ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、一方の鎖が他方の鎖よりも長いこと、または同じ長さの２本の鎖がずれていることで生じ得る。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとミスマッチを形成し得る、またはオーバーハングは、標的である遺伝子配列に相補的であり得る、または別の配列であり得る。第１の鎖および第２の鎖は、例えば、追加の塩基によって連結してヘアピンを形成しても良いし、または他の非塩基リンカーによって連結しても良い。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のオーバーハング領域におけるヌクレオチドはそれぞれ独立して、限定されるものではないが、２’−糖修飾、例えば、２−Ｆ、２’−Ｏ−メチル、チミジン（Ｔ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（Ｔｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチルアデノシン（Ａｅｏ）、２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルシチジン（ｍ５Ｃｅｏ）、およびこれらの任意の組み合わせを含め、修飾されたヌクレオチドであっても良いし、または非修飾ヌクレオチドであっても良い。例えば、ＴＴは、いずれかの鎖のいずれかの末端のオーバーハング配列とすることができる。オーバーハングは、標的ｍＲＮＡとのミスマッチを形成し得る、またはオーバーハングは、標的とされる遺伝子配列に相補的であっても良いし、もしくは別の配列であっても良い。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖における５’または３’オーバーハングは、リン酸化されても良い。一部の実施形態では、オーバーハング領域は、間にホスホロチオエートを有する２つのヌクレオチドを含み、この２つのヌクレオチドは、同じヌクレオチドでも良いし、異なるヌクレオチドでも良い。一実施形態では、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の３’末端に存在する。一実施形態では、この３’オーバーハングは、アンチセンス鎖に存在する。一実施形態では、この３’オーバーハングは、センス鎖に存在する。
ＲＮＡｉ剤は、その全体的な安定性に影響を与えることなく、ＲＮＡｉの干渉活性を強めることができる１つのオーバーハングのみを含み得る。例えば、一本鎖オーバーハングは、センス鎖の３’末端、あるいはアンチセンス鎖の３’末端に位置し得る。ＲＮＡｉは、アンチセンス鎖の５’末端（またはセンス鎖の３’末端）（あるいはその逆）に位置する平滑末端も有し得る。一般に、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖は、３’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、５’末端が平滑である。理論に拘束されることを望むものではないが、アンチセンス鎖の５’末端の非対称平滑末端およびアンチセンス鎖の３’末端オーバーハングは、ＲＩＳＣプロセスに付加されるガイド鎖を好む。
合成および修飾
本発明で取り上げられる任意の核酸、例えば、ＲＮＡｉは、当分野で十分に確立された方法、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，” Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されているような方法によって合成および／または修飾することができる。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、結合、逆連結）または３’末端修飾（結合、ＤＮＡヌクレオチド、逆連結など）；塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基、もしくは幅広いレパートリーのパートナーと塩基対合する塩基での置換、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、または共役塩基；ホスホジエステル結合の修飾もしくは置換を含む糖修飾（例えば、２’位置もしくは４’位置）または糖の置換；および／または主鎖の修飾が挙げられる。本明細書に記載の実施形態に有用なｉＲＮＡ化合物の特定の例としては、限定されるものではないが、修飾主鎖または非天然ヌクレオシド間結合を含むＲＮＡが挙げられる。修飾主鎖を有するＲＮＡとしては、特に、主鎖にリン原子を有していないＲＮＡが挙げられる。本明細書においては、当分野で時々言及されるように、そのヌクレオシド間主鎖にリン原子を有していない修飾ＲＮＡは、オリゴヌクレオシドと見なすこともできる。一部の実施形態では、修飾ｉＲＮＡは、そのヌクレオシド間主鎖にリン原子を有する。
修飾ＲＮＡ主鎖としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および直鎖状の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、およびヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’に結合されている逆の極性を有するものが挙げられる。様々な塩、混合塩、および遊離酸型も含まれる。
上記のリン含有結合の形成を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，４６９，８６３号明細書；同第４，４７６，３０１号明細書；同第５，０２３，２４３号明細書；同第５，１７７，１９５号明細書；同第５，１８８，８９７号明細書；同第５，２６４，４２３号明細書；同第５，２７６，０１９号明細書；同第５，２７８，３０２号明細書；同第５，２８６，７１７号明細書；同第５，３２１，１３１号明細書；同第５，３９９，６７６号明細書；同第５，４０５，９３９号明細書；同第５，４５３，４９６号明細書；同第５，４５５，２３３号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７６，９２５号明細書；同第５，５１９，１２６号明細書；同第５，５３６，８２１号明細書；同第５，５４１，３１６号明細書；同第５，５５０，１１１号明細書；同第５，５６３，２５３号明細書；同第５，５７１，７９９号明細書；同第５，５８７，３６１号明細書；同第５，６２５，０５０号明細書；同第６，０２８，１８８号明細書；同第６，１２４，４４５号明細書；同第６，１６０，１０９号明細書；同第６，１６９，１７０号明細書；同第６，１７２，２０９号明細書；同第６，２３９，２６５号明細書；同第６，２７７，６０３号明細書；同第６，３２６，１９９号明細書；同第６，３４６，６１４号明細書；同第６，４４４，４２３号明細書；同第６，５３１，５９０号明細書；同第６，５３４，６３９号明細書；同第６，６０８，０３５号明細書；同第６，６８３，１６７号明細書；同第６，８５８，７１５号明細書；同第６，８６７，２９４号明細書；同第６，８７８，８０５号明細書；同第７，０１５，３１５号明細書；同第７，０４１，８１６号明細書；同第７，２７３，９３３号明細書；同第７，３２１，０２９号明細書；米国再特許第３９４６４号明細書が挙げられる。
リン原子を含んでいない修飾ＲＮＡ主鎖は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合されたヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成される主鎖を有する。これらの修飾ＲＮＡ主鎖としては、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有する主鎖；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド、およびスルホン主鎖；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖；スルホネートおよびスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；ならびに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２構成成分を有する他の主鎖が挙げられる。
上記のオリゴヌクレオシドの形成を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第５，０３４，５０６号明細書；同第５，１６６，３１５号明細書；同第５，１８５，４４４号明細書；同第５，２１４，１３４号明細書；同第５，２１６，１４１号明細書；同第５，２３５，０３３号明細書；同第５，６４，５６２号明細書；同第５，２６４，５６４号明細書；同第５，４０５，９３８号明細書；同第５，４３４，２５７号明細書；同第５，４６６，６７７号明細書；同第５，４７０，９６７号明細書；同第５，４８９，６７７号明細書；同第５，５４１，３０７号明細書；同第５，５６１，２２５号明細書；同第５，５９６，０８６号明細書；同第５，６０２，２４０号明細書；同第５，６０８，０４６号明細書；同第５，６１０，２８９号明細書；同第５，６１８，７０４号明細書；同第５，６２３，０７０号明細書；同第５，６６３，３１２号明細書；同第５，６３３，３６０号明細書；同第５，６７７，４３７号明細書；および同第５，６７７，４３９号明細書が挙げられる。
他の実施形態では、ｉＲＮＡに使用されるように企図され、このように使用される場合、適切なＲＮＡ模倣物が、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間結合、即ち、主鎖の両方が新規な基で置換される。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。１つのこのようなオリゴマー化合物、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているＲＮＡ模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物では、ＲＮＡの糖主鎖が、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は、維持され、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合されている。ＰＮＡ化合物の形成を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第５，５３９，０８２号明細書；同第５，７１４，３３１号明細書；および同第５，７１９，２６２号明細書が挙げられる。本発明のｉＲＮＡに使用するのに適したさらなるＰＮＡ化合物は、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００に記載されている。
本発明で取り上げられる一部の実施形態は、ホスホロチオエート主鎖を有するＲＮＡ、ならびにヘテロ原子主鎖、特に、上記参照した米国特許第５，４８９，６７７号明細書の−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られている］、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−およびＮ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−［天然ホスホジエステル主鎖は、−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２−として表される］、および上記参照した米国特許第５，６０２，２４０号明細書のアミド主鎖を有するオリゴヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、本明細書で取り上げられるＲＮＡは、上記参照した米国特許第５，０３４，５０６号明細書のモルホリノ主鎖構造を有する。
修飾ＲＮＡは、１つ以上の置換糖部分も含み得る。本発明で取り上げられるｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位置に以下の１つを含み得る：ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキル、ここで、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的かつ適切な修飾は、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）．ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２を含み、式中、ｎおよびｍは、１〜約１０である。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位置に以下の１つを含む：Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、またはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、ｉＲＮＡの薬理学的特性を改善するための基、またはｉＲＮＡの薬理学的特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基を含む。一部の実施形態では、修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６−５０４）、即ち、アルコキシ−アルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、以下の本明細書の実施例で説明される、２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当分野では２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、即ち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ２）２である。
他の修飾は、２’−メトキシ（２’−ＯＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、および２’−フルオロ（２’−Ｆ）を含む。同様の修飾を、ｉＲＮＡのＲＮＡにおける他の位置、特に、３’末端ヌクレオチドの糖の３’位置または２’−５’結合ｄｓＲＮＡ、および５’末端ヌクレオチドの５’位置にも設けることができる。ｉＲＮＡは、例えば、ペントフラノシル糖の代わりに糖模倣物、例えば、シクロブチル部分を有することもできる。このような修飾糖構造の形成を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、米国特許第４，９８１，９５７号明細書；同第５，１１８，８００号明細書；同第５，３１９，０８０号明細書；同第５，３５９，０４４号明細書；同第５，３９３，８７８号明細書；同第５，４４６，１３７号明細書；同第５，４６６，７８６号明細書；同第５，５１４，７８５号明細書；同第５，５１９，１３４号明細書；同第５，５６７，８１１号明細書；同第５，５７６，４２７号明細書；同第５，５９１，７２２号明細書；同第５，５９７，９０９号明細書；同第５，６１０，３００号明細書；同第５，６２７，０５３号明細書；同第５，６３９，８７３号明細書；同第５，６４６，２６５号明細書；同第５，６５８，８７３号明細書；同第５，６７０，６３３号明細書；および同第５，７００，９２０号明細書が挙げられ、これらの一部は、所有者が本出願人である。これらの各特許の全開示内容は、参照により本明細書に組み入れられる。
ｉＲＮＡは、核酸塩基（当分野では単純に「塩基」と呼ばれることが多い）修飾または置換も含み得る。本明細書で使用される「非修飾」または「天然」核酸塩基は、プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）を含む。修飾核酸塩基は、他の合成および天然核酸塩基、例えば、デオキシ−チミン（ｄＴ）、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、および６−アゾチミン、５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンを含む。さらなる核酸塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されている核酸塩基、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００８に開示されている核酸塩基；Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されている核酸塩基、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されている核酸塩基、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されている核酸塩基を含む。これらの特定の核酸塩基は、本発明で取り上げられるオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに特に有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、および５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６、および０−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃高めることが示され（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせられると、さらに例示的な塩基置換である。
上記の特定の修飾核酸塩基および他の修飾核酸塩基の形成を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる、上記の米国特許第３，６８７，８０８号明細書；同第４，８４５，２０５号明細書；同第５，１３０，３０号明細書；同第５，１３４，０６６号明細書；同第５，１７５，２７３号明細書；同第５，３６７，０６６号明細書；同第５，４３２，２７２号明細書；同第５，４５７，１８７号明細書；同第５，４５９，２５５号明細書；同第５，４８４，９０８号明細書；同第５，５０２，１７７号明細書；同第５，５２５，７１１号明細書；同第５，５５２，５４０号明細書；同第５，５８７，４６９号明細書；同第５，５９４，１２１号明細書；同第５，５９６，０９１号明細書；同第５，６１４，６１７号明細書；同第５，６８１，９４１号明細書；同第５，７５０，６９２号明細書；同第６，０１５，８８６号明細書；同第６，１４７，２００号明細書；同第６，１６６，１９７号明細書；同第６，２２２，０２５号明細書；同第６，２３５，８８７号明細書；同第６，３８０，３６８号明細書；同第６，５２８，６４０号明細書；同第６，６３９，０６２号明細書；同第６，６１７，４３８号明細書；同第７，０４５，６１０号明細書；同第７，４２７，６７２号明細書；および同第７，４９５，０８８号明細書が挙げられる。
ｉＲＮＡのＲＮＡは、１つ以上のロックド核酸（ＬＮＡ）を含むように修飾することもできる。ロックド核酸は、修飾リボース部分を有するヌクレオチドであり、このリボース部分は、２’と４’炭素を結合するさらなる架橋を含む。この構造は、リボースを３’内部構造の立体構造に効果的に「ロック」する。ロックド核酸のｓｉＲＮＡへの付加は、血清中でのｓｉＲＮＡの安定性を高め、かつ標的外の影響を低減することが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９−４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３−８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５−３１９３）。
ロックド核酸ヌクレオチドの形成を教示する代表的な米国特許としては、限定されるものではないが、以下が挙げられる：参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第６，２６８，４９０号明細書；同第６，６７０，４６１号明細書；同第６，７９４，４９９号明細書；同第６，９９８，４８４号明細書；同第７，０５３，２０７号明細書；同第７，０８４，１２５号明細書；および同第７，３９９，８４５号明細書。
潜在的に安定させるＲＮＡ分子の末端の修飾は、Ｎ−（アセチルアミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−ＮＨＡｃ）、Ｎ−（カプロイル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６）、Ｎ−アセチル−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−ＮＨＡｃ）、チミジン−２’−０−デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ−（アミノカプロイル）−４−ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ−Ｃ６−アミノ）、２−ドコサノイル−ウリジン−３’’−ホスフェート、および逆塩基ｄＴ（ｉｄＴ）などを含み得る。この修飾の開示は、ＰＣＴ国際公開特許第２０１１／００５８６１号パンフレットで確認することができる。
本発明のモチーフを含む修飾ｉＲＮＡ
本発明の特定の態様では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、例えば、参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる、２０１１年１１月１８日に出願の米国仮特許出願第６１／５６１，７１０号明細書、または２０１２年１１月１６日に出願され、国際公開第２０１３０７５０３５ Ａ１号パンフレットとして公開された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０６５６９１号明細書に開示されているような化学修飾を有する作用剤を含む。
本明細書および米国仮特許出願第６１／５６１，７１０号明細書に示されているように、３つの連続したヌクレオチドの３つの同一の修飾の１つ以上のモチーフをＲＮＡｉ剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖、特に切断部位またはその近傍に導入することによって優れた結果を得ることができる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、別の方法で完全に修飾することができる。これらのモチーフの導入により、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の修飾パターンが存在する場合は、これを中断することができる。ＲＮＡｉ剤は、任意選択により、例えばセンス鎖にあるＧａｌＮＡｃ誘導体リガンドにコンジュゲートされ得る。得られるＲＮＡｉ剤は、優れた遺伝子サイレンシング活性を示す。
より詳細には、驚くべきことに、二本鎖ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、ＲＮＡｉ剤の少なくとも一方の鎖の切断部位またはその近傍における３つの連続したヌクレオチドの３つの同一の修飾の１つ以上のモチーフを有するように修飾された場合、ＲＮＡｉ剤の遺伝子サイレンシング活性が最高に高められることが見出された。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、１９のヌクレオチド長さの平滑末端二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｄｅｄ ｂｌｕｎｔｍｅｒ）であり、センス鎖は、５’末端の７位、８位、９位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端の１１位、１２位、１３位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２０のヌクレオチド長さの平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端の８位、９位、１０位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端の１１位、１２位、１３位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。
また別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２１のヌクレオチド長さの平滑末端二本鎖であり、センス鎖は、５’末端の９位、１０位、１１位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｆ修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。アンチセンス鎖は、５’末端の１１位、１２位、１３位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含む。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２１ヌクレオチドのセンス鎖および２３ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、このセンス鎖は、５’末端の９位、１０位、１１位における３つの連続したヌクレオチドの３つの２’−Ｆ修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み；このアンチセンス鎖は、５’末端の１１位、１２位、１３位における３つの連続したヌクレオチドの３つの２’−Ｏ−メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み、ＲＮＡｉ剤の一端は平滑であるが、他端は、２ヌクレオチドのオーバーハングを含む。好ましくは、２ヌクレオチドのオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にある。２ヌクレオチドのオーバーハングが、アンチセンス鎖の３’末端にある場合は、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在し得、３つのヌクレオチドのうちの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドに隣接した対合ヌクレオチドである。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方における末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに有する。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、モチーフの一部であるヌクレオチドを含め、修飾ヌクレオチドである。一実施形態では、各残基は、例えば交互モチーフにおいて、２’−Ｏ−メチルまたは３’−フルオロで独立に修飾されている。任意選択により、ＲＮＡｉ剤は、リガンド（好ましくはＧａｌＮＡｃ３）をさらに含む。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、ＲＮＡｉ剤は、少なくとも２５、最大で２９のヌクレオチド長さを有する第１の鎖、および５’末端から１１位、１２位、１３位にある３つの連続したヌクレオチドにおける３つの２’−Ｏ−メチル修飾からなる少なくとも１つのモチーフを有する、最大で３０のヌクレオチド長さを有する第２の鎖を含み；第１の鎖の３’末端および第２の鎖の５’末端は、平滑末端を形成し、第２の鎖は、３’末端で第１の鎖よりも１〜４ヌクレオチド長く、二重鎖領域は、少なくとも２５のヌクレオチド長さであり、第２の鎖は、ＲＮＡｉ剤が哺乳動物の細胞に導入されたときに標的遺伝子の発現を低減するように、第２の鎖の長さの少なくとも１９のヌクレオチドに沿って標的ｍＲＮＡに十分に相補的であり、ＲＮＡｉ剤のダイサー切断（ｄｉｃｅｒ ｃｌｅａｖａｇｅ）が、優先的に第２の鎖の３’末端を含むｓｉＲＮＡをもたらし、これにより、哺乳動物における標的遺伝子の発現が低減する。任意選択で、ＲＮＡｉ剤は、リガンドをさらに含む。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含み、モチーフの１つは、センス鎖の切断部位に存在する。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖も、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含んでも良く、モチーフの１つは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。
１７〜２３のヌクレオチド長さの二重鎖領域を有するＲＮＡｉ剤では、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的には、５’末端から１０位、１１位、および１２位の付近である。従って、３つの同一の修飾からなるモチーフは、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；１３位、１４位、１５位に存在しても良く、この位置は、アンチセンス鎖の５’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められる、またはアンチセンス鎖の５’末端の二重鎖領域内の最初の対を形成したヌクレオチドから数え始められる。アンチセンス鎖の切断部位はまた、５’末端のＲＮＡｉ剤の二重鎖領域の長さに従って変更され得る。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、その鎖の切断部位の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを含むことができ；アンチセンス鎖は、その鎖の切断部位またはその近傍の３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる少なくとも１つのモチーフを有し得る。センス鎖とアンチセンス鎖がｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する場合は、センス鎖とアンチセンス鎖は、センス鎖の３つのヌクレオチドからなる１つのモチーフおよびアンチセンス鎖の３つのヌクレオチドからなる１つのモチーフが、少なくとも１つのヌクレオチドのオーバーラップ、即ち、センス鎖のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、アンチセンス鎖のモチーフの３つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つと塩基対を形成するように整列させることができる。あるいは、少なくとも２つのヌクレオチドがオーバーラップする、または３つ全てのヌクレオチドがオーバーラップしても良い。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドの３つの同一の修飾からなる２つ以上のモチーフを含むことができる。第１のモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在することがあり、他方のモチーフは、ウィング修飾（ｗｉｎｇ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）であっても良い。本明細書の「ウィング修飾」という語は、鎖の切断部位またはその近傍のモチーフから離れた同じ鎖の別の部分に存在するモチーフを指す。ウィング修飾は、第１のモチーフの近傍であるか、または少なくとも１つ以上のヌクレオチドによって離隔している。モチーフが、その性質化学的よりも互いに接近している場合は、モチーフは互いに異なり、モチーフが、その化学的性質よりも１つ以上のヌクレオチドによって離隔している場合は、モチーフは、同じであるか、または異なることもある。２つ以上のウィング修飾が存在しても良い。例えば、２つのウィング修飾が存在する場合、各ウィング修飾は、切断部位もしくはその近傍の第１のモチーフに対する一端に、またはリードモチーフ（ｌｅａｄ ｍｏｔｉｆ）のいずれかの側に存在し得る。
センス鎖と同様に、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、３つの連続したヌクレオチドの３つの同一の修飾からなる２つ以上のモチーフを含み得、少なくとも１つのモチーフは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖に存在し得るウィング修飾と同様の配列で１つ以上のウィング修飾も含み得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖のウィング修飾は、典型的には、鎖の３’末端、５’末端、または両方の末端の最初の１つまたは２つの末端ヌクレオチドを含まない。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖のウィング修飾は、典型的には、鎖の３’末端、５’末端、または両方の末端の二重鎖領域内の最初の１つまたは２つの塩基対形成ヌクレオチドを含まない。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも１つのウィング修飾を含む場合、このウィング修飾は、二重鎖領域の同じ末端に存在しても良く、１つ、２つ、または３つのヌクレオチドのオーバーラップを有する。
ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖がそれぞれ、少なくとも２つのウィング修飾を含む場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、１つの鎖の２つの修飾がそれぞれ、二重鎖領域の一端に位置して１つ、２つ、または３つのヌクレオチドのオーバーラップを有する；１つの鎖の２つの修飾がそれぞれ、二重鎖領域の他端に位置して１つ、２つ、または３つのヌクレオチドのオーバーラップを有する；１つの鎖の２つの修飾が、リードモチーフの各側に位置して、二重鎖領域に１つ、２つ、または３つのヌクレオチドのオーバーラップを有する、ように整列させることができる。
一実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含む、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖における各ヌクレオチドを修飾しても良い。各ヌクレオチドは、同じまたは異なる修飾で修飾しても良く、この修飾は、非結合リン酸酸素および／または１つ以上の結合リン酸酸素の一方または両方の１つ以上の変更；リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの変更；リン酸部分の「脱リン酸」リンカー（“ｄｅｐｈｏｓｐｈｏ”ｌｉｎｋｅｒ）での大量の置換；天然の塩基の修飾または置換；およびリボース−リン酸骨格の置換または修飾を含み得る。
核酸がサブユニットの重合体であるため、多くの修飾、例えば、塩基、リン酸部分、またはリン酸部分の非結合Ｏの修飾は、核酸内の繰り返される位置に存在する。場合によっては、修飾は、核酸内の全ての目的の位置に存在するが、多くの場合はそうではない。一例として、修飾は、３’または５’末端位置のみに存在しても良く、末端領域、例えば、末端ヌクレオチドの位置または鎖の最後の２つ、３つ、４つ、５つ、または１０のヌクレオチドのみに存在しても良い。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、または両方に存在し得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域のみに存在しても良いし、またはＲＮＡの一本鎖領域のみに存在しても良い。例えば、非結合酸素位置でのホスホロチオエート修飾は、一方もしくは両方の末端のみに存在しても良いし、末端領域、例えば、末端ヌクレオチドのある位置、または鎖の最後の２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは１０のヌクレオチドのみに存在しても良いし、あるいは二本鎖領域および一本鎖領域、特に末端に存在しても良い。５’末端または両末端は、リン酸化されても良い。
例えば、安定性を高めること、オーバーハングに特定の塩基を含めること、あるいは一本鎖オーバーハング、例えば、５’もしくは３’オーバーハング、または両方のオーバーハングに修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代用物を含めることが可能であろう。例えば、オーバーハングにプリンヌクレオチドを含めることが望ましい場合もある。一部の実施形態では、３’または５’オーバーハングの全てまたは一部の塩基を、例えば、本明細書に記載される修飾で修飾しても良い。修飾は、例えば、当分野で公知の修飾を用いたリボース糖の２’位での修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖ではなくデオキシリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）、または２’−Ｏ−メチル修飾の使用、およびリン酸基の修飾、例えば、ホスホチオエート修飾を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は独立して、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−デオキシ、２’−ヒドロキシル、または２’−フルオロで修飾される。センス鎖およびアンチセンス鎖は、２つ以上の修飾を含み得る。一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は独立して、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロで修飾される。
少なくとも２つの異なる修飾が、典型的には、センス鎖およびアンチセンス鎖に存在する。これらの２つの修飾は、２’−Ｏ−メチルもしくは２’−フルオロ、または他のものであっても良い。
一実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。本明細書で使用される「交互モチーフ」という語は、各修飾が１つの鎖の交互ヌクレオチドに存在する１つ以上の修飾を有するモチーフを指す。交互ヌクレオチドは、１つおきのヌクレオチドに１つ、３つおきのヌクレオチドに１つ、または同様のパターンを指し得る。例えば、Ａ、Ｂ、およびＣがそれぞれ、ヌクレオチドに対する１種類の修飾を表す場合、交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ．．．」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ．．．」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ．．．」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ．．．」、または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ．．．」などであり得る。
交互モチーフに含まれる修飾の種類は、同じであっても良いし、または異なっていても良い。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄがそれぞれ、ヌクレオチドの１種類の修飾を表す場合、交互パターン、即ち、１つおきのヌクレオチドの修飾は、同じでも良いが、センス鎖またはアンチセンス鎖はそれぞれ、交互モチーフ、例えば、「ＡＢＡＢＡＢ．．．」、「ＡＣＡＣＡＣ．．．」、「ＢＤＢＤＢＤ．．．」、または「ＣＤＣＤＣＤ．．．」などの内部の修飾のいくつかの可能性から選択することができる。
一実施形態では、本発明のＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖における交互モチーフの修飾パターンに対してシフトしている、センス鎖における交互モチーフの修飾パターンを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なる修飾基に対応するようなシフトであっても良いし、この逆のシフトでも良い。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二重鎖におけるアンチセンス鎖と塩基対を形成した場合、センス鎖における交互モチーフが、センス鎖の５’から３’へ「ＡＢＡＢＡＢ」で始まり、アンチセンス鎖における交互モチーフが、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の５’から３’へ「ＢＡＢＡＢＡ」で始まり得る。別の例として、センス鎖における交互モチーフは、センス鎖の５’から３’へ「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で始まり、アンチセンス鎖における交互モチーフは、二重鎖領域内のアンチセンス鎖の５’から３’へ「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で始まり得るため、センス鎖とアンチセンス鎖との間の修飾パターンの完全な、または部分的なシフトが存在する。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、最初に、センス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾と２’−Ｆ修飾との交互モチーフのパターンを有し、このパターンは、最初に、アンチセンス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾と２’−Ｆ修飾との交互モチーフのパターンに対してシフトを有する、即ち、センス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドは、アンチセンス鎖における２’−Ｆ修飾ヌクレオチドと塩基対を形成し、逆の場合も同様である。センス鎖の１位は、２’−Ｆ修飾で始まることができ、アンチセンス鎖の１位は、２’−Ｏ−メチル修飾で始まることができる。
３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つ以上のモチーフのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖への導入は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖に存在する最初の修飾パターンを中断する。３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つ以上のモチーフのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖への導入による、センス鎖および／またはアンチセンス鎖に存在する最初の修飾パターンのこの中断は、標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング活性を驚くほど高める。
一実施形態では、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなるモチーフが、いずれの鎖に導入される場合も、モチーフの次のヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾とは異なる修飾である。例えば、モチーフを含む配列の一部は、「．．．ＮａＹＹＹＮｂ．．．」であり、「Ｙ」は、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなるモチーフの修飾を表し、「Ｎａ」および「Ｎｂ」は、Ｙの修飾とは異なる、モチーフ「ＹＹＹ」の次のヌクレオチドの修飾を表し、ＮａおよびＮｂは、同じ修飾でも異なる修飾でも良い。あるいは、Ｎａおよび／またはＮｂは、ウィング修飾が存在する場合は、存在しても存在しなくても良い。
ＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合をさらに含み得る。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖および／もしくはアンチセンス鎖、または両鎖のいずれかの位置のどのヌクレオチドにも存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖およびアンチセンス鎖のどのヌクレオチドにも存在し得る；各ヌクレオチド間結合の修飾は、センス鎖および／もしくはアンチセンス鎖における交互パターンに存在し得る；あるいはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、交互パターンにおける両方のヌクレオチド間結合の修飾を含み得る。センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同じでも異なっても良く、センス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド間結合の修飾の交互パターンに対してシフトを有しても良い。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、オーバーハング領域にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合の修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、２つのヌクレオチド間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合を有する２つのヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチド間結合の修飾は、オーバーハングヌクレオチドを二重鎖領域内の末端の塩基対形成ヌクレオチドに結合させるために形成することもできる。例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、または全てのオーバーハングヌクレオチドを、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合によって結合することができ、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドをその次の塩基対形成ヌクレオチドに結合する追加的なホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間結合が存在しても良い。例えば、末端の３つのヌクレオチド間に少なくとも２つのホスホチオエートのヌクレオチド間結合が存在しても良く、この末端の３つのヌクレオチドのうちの２つは、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドの次の塩基対形成ヌクレオチドである。これらの末端の３つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端、センス鎖の３’末端、アンチセンス鎖の５’末端、および／またはアンチセンス鎖の５’末端であり得る。
一実施形態では、２ヌクレオチドのオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端にあり、末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合が存在し、３つのヌクレオチドのうちの２つが、オーバーハングヌクレオチドであり、第３のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドに隣接した対合ヌクレオチドである。任意選択により、ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の５’末端の両方における末端の３つのヌクレオチド間に２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに有し得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、標的とのミスマッチ、二重鎖内のミスマッチ、またはこれらの組み合わせを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域、または二重鎖領域で生じ得る。塩基対は、解離または融解（例えば、特定の対合の結合または解離の自由エネルギーに対してであり、最も単純なアプローチは、個々の塩基対ベースで塩基対を評価することであるが、類縁または同様の分析を用いることもできる）を促進する傾向に基づいてランク付けしてもよい。解離の促進に関しては、Ａ：Ｕは、Ｇ：Ｃよりも好ましく；Ｇ：ＵはＧ：Ｃよりも好ましく；Ｉ：ＣはＧ：Ｃよりも好ましい（Ｉ＝イノシンである）。ミスマッチ、例えば、非正準な対合または正準以外の対合（本明細書の他の部分に記載）は、正準な対合（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）よりも好ましく；ユニバーサル塩基を含む塩基対は、正準な対合よりも好ましい。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から選択されるアンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の最初の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの塩基対の少なくとも１つ、および二重鎖の５’末端におけるアンチセンス鎖の解離を促進するためのミスマッチ対合、例えば、非正準な対合もしくは正準以外の対合、またはユニバーサル塩基を含む対合を含む。
一実施形態では、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の１位にあるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、Ｕ、およびｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の最初の１つ、２つ、または３つの塩基対の少なくとも１つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの二重鎖領域内の最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
一実施形態では、センス鎖配列は、式（Ｉ）で表すことができる：
５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’ （Ｉ）
式中、
ｉおよびｊはそれぞれ独立して、０または１であり；
ｐおよびｑはそれぞれ独立して、０〜６であり；
各Ｎａは独立して、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各Ｎｂは独立して、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐおよびｎｑは独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
ＮｂおよびＹは、同じ修飾を有しておらず；かつ
ＸＸＸ、ＹＹＹ、およびＺＺＺはそれぞれ独立して、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表している。好ましくは、ＹＹＹは、２’−Ｆ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。
一実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７〜２３のヌクレオチド長さの二重鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍に存在し得（例えば、６位、７位、８位；７位、８位、９位；８位、９位、１０位；９位、１０位、１１位；１０位、１１位，１２位；または１１位、１２位、１３位に存在し得）、この位置は、５’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められる；または任意選択で、５’末端から、二重鎖領域内の最初の塩基対形成ヌクレオチドから数え始められる。
一実施形態では、ｉが１でｊが０である、ｉが０でｊが１である、またはｉとｊの両方が１である。従って、センス鎖は、以下の式で表すことができる：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’ （Ｉｂ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’ （Ｉｃ）；または
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’ （Ｉｄ）。
センス鎖が、式（Ｉｂ）で表される場合、Ｎｂは、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Ｎａは独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。
センス鎖が、式（Ｉｃ）で表される場合、Ｎｂは、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜５、０〜４、０〜２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Ｎａは独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。
センス鎖が、式（Ｉｄ）で表される場合、各Ｎｂは独立して、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、または６である。各Ｎａは独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すことができる。
Ｘ、Ｙ、およびＺはそれぞれ、互いに同じであっても良いし、または異なっていても良い。
他の実施形態では、ｉは０であり、ｊは０であり、かつセンス鎖は、式で表すことができる：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’ （Ｉａ）。
センス鎖が、式（Ｉａ）で表される場合、各Ｎａは独立に、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖配列は、式（ＩＩ）によって表すことができる：
５’ｎｑ’−Ｎａ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ−Ｎ’ａ−ｎｐ’３’ （ＩＩ）
式中、
ｋおよびｌはそれぞれ独立して、０または１であり；
ｐ’およびｑ’はそれぞれ独立して、０〜６であり；
各Ｎａ’は独立して、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なって修飾されたヌクレオチドを含み；
各Ｎｂ’は独立して、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’およびｎｑ’は独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し；
Ｎｂ’およびＹ’は、同じ修飾を有しておらず；かつ
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ独立して、３つの連続したヌクレオチドにおける３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表している。
一実施形態では、Ｎａ’および／またはＮｂ’は、交互パターンの修飾を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。例えば、ＲＮＡｉ剤は、１７〜２３のヌクレオチド長さの二重鎖領域を有し、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の９位、１０位、１１位；１０位、１１位、１２位；１１位、１２位、１３位；１２位、１３位、１４位；または１３位、１４位、１５位に存在し得、この位置は、５’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められる；または任意選択で、５’末端から、二重鎖領域内の最初の塩基対形成ヌクレオチドから数え始められる。好ましくは、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１位、１２位、１３位に存在する。
一実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、２’−ＯＭｅ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、ｋが１でｌが０である、ｋが０でｌがｌである、またはｋとｌの両方が１である。
従って、アンチセンス鎖は、以下の式で表すことができる：
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｐ’３’ （ＩＩｂ）；
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−ｎｐ’３’ （ＩＩｃ）；または
５’ｎｑ’−Ｎａ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎａ’−ｎｐ’３’ （ＩＩｄ）。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｂ）で表される場合、Ｎｂ’は、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｃ）で表される場合、Ｎｂ’は、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩｄ）で表される場合、各Ｎｂ’は独立に、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。好ましくは、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、または６である。
他の実施形態では、ｋは０であり、１は０であり、かつアンチセンス鎖は、式で表すことができる：
５’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’３’ （Ｉａ）。
アンチセンス鎖が、式（ＩＩａ）で表される場合、各Ｎａ’は独立に、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’はそれぞれ、互いに同じであっても良いし、または異なっていても良い。
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは独立して、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−ヒドロキシル、または２’−フルオロで修飾され得る。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは独立して、２’−Ｏ−メチルまたは２’−フルオロで修飾される。特に、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’、およびＺ’はそれぞれ、２’−Ｏ−メチル修飾または２’−フルオロ修飾を表すことができる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二重鎖領域が２１のヌクレオチドである場合にセンス鎖の９位、１０位、および１１位に存在するＹＹＹモチーフを含むことができ、この位置は、５’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められ、または任意選択で、５’末端から、二重鎖領域内の最初の塩基対形成ヌクレオチドから数え始められ；かつＹは、２’−Ｆ修飾を表している。センス鎖は、二重鎖領域の反対の末端におけるウィング修飾としてＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフを追加的に含むことができ；かつＸＸＸおよびＺＺＺはそれぞれ独立して、２’−ＯＭｅ修飾または２’−Ｆ修飾を表している。
一実施形態では、アンチセンス鎖は、このセンス鎖の１１位、１２位、および１３位に存在するＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含むことができ、この位置は、５’末端から、最初のヌクレオチドから数え始められる、または任意選択で、５’末端から、二重鎖領域内の最初の塩基対形成ヌクレオチドから数え始められ；かつＹ’は、２’−Ｏ−メチル修飾を表している。アンチセンス鎖は、二重鎖領域の反対の末端におけるウィング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフを追加的に含むことができ；かつＸ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ独立して、２’−ＯＭｅ修飾または２’−Ｆ修飾を表している。
上記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、および（Ｉｄ）の何れか１つによって表されるセンス鎖はそれぞれ、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、および（ＩＩｄ）の何れか１つによって表されるアンチセンス鎖と二重鎖を形成する。
従って、本発明の方法に使用されるＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み得、各鎖は、１４〜３０のヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二重鎖は、式（ＩＩＩ）で表される：
センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’
（ＩＩＩ）
式中：
ｉ、ｊ、ｋ、およびｌは、それぞれ独立に０または１であり；
ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’は、それぞれ独立に０〜６であり；
各ＮａおよびＮａ’は独立に、０〜２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオチドを含み；
各ＮｂおよびＮｂ’は独立に、０〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’、およびｎｑは、それぞれ存在しても存在しなくても良く、独立にオーバーハングヌクレオチドを表し；かつ
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、Ｚ’Ｚ’Ｚ’はそれぞれ独立に、３つの連続したヌクレオチドの３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表す。
一実施形態では、ｉは０であり、ｊは０である；またはｉは１であり、ｊは０である；またはｉは０であり、ｊは１である；またはｉおよびｊの両方が０である；またはｉおよびｊの両方が１である。別の実施形態では、ｋは０であり、ｌは０である；またはｋは１であり、ｌは０である；ｋは０であり、ｌは１である；またはｋおよびｌの両方が０である；またはｋおよびｌの両方が１である。
ＲＮＡｉ二重鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖の例示的な組み合わせは、以下の式を含む：
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩａ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ’ｎｑ’５’
（ＩＩＩｂ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’
（ＩＩＩｃ）
５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ−ｎｑ’５’
（ＩＩＩｄ）
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）で表される場合、各Ｎａは独立に、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）で表される場合、各Ｎｂは独立に、１〜１０、１〜７、１〜５、または１〜４の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは独立に、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）で表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Ｎａは独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）で表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立して、０〜１０、０〜７、０〜１０、０〜７、０〜５、０〜４、０〜２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。各Ｎａ、Ｎａ’は独立して、２〜２０、２〜１５、または２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表している。それぞれのＮａ、Ｎａ’、Ｎｂ、Ｎｂ’は独立して、交互パターンの修飾を含む。
式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）におけるＸ、Ｙ、およびＺはそれぞれ、互いに同じであっても良いし、または異なっていても良い。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｙヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｙ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｙヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＹヌクレオチドの３つ全てが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｂ）または（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｚヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｚ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｚヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＺヌクレオチドの３つ全てが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｃ）または（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｘヌクレオチドの少なくとも１つが、Ｘ’ヌクレオチドの１つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｘヌクレオチドの少なくとも２つが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する；またはＸヌクレオチドの３つ全てが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
一実施形態では、Ｙヌクレオチドの修飾は、Ｙ’ヌクレオチドの修飾とは異なり、Ｚヌクレオチドの修飾は、Ｚ’ヌクレオチドの修飾とは異なり、かつ／またはＸヌクレオチドの修飾は、Ｘ’ヌクレオチドの修飾とは異なる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル修飾または２’−フルオロ修飾である。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル修飾または２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに連結される。なお別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル修飾または２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに連結され、センス鎖が、二価または三価の分岐リンカーによって付着された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩｄ）で表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル修飾または２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに連結され、センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖が、二価または三価の分岐リンカーによって付着された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩａ）で表される場合、Ｎａ修飾は、２’−Ｏ−メチル修飾または２’−フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに連結され、センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み、センス鎖が、二価または三価の分岐リンカーによって付着された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされる。
一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）で表される少なくとも２つの二重鎖を含む多量体であり、この二重鎖はリンカーによって結合されている。このリンカーは、切断可能であっても良いし、または切断不可能であっても良い。任意選択で、この多量体は、リガンドをさらに含む。二重鎖はそれぞれ、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的としても良いし；あるいは二重鎖はそれぞれ、２つの異なる標的部位における同じ遺伝子を標的としても良い。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）で表される３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上の二重鎖を含む多量体であり、この二重鎖は、リンカーによって結合されている。このリンカーは、切断可能であっても良いし、または切断不可能であっても良い。任意選択で、この多量体は、リガンドをさらに含む。二重鎖はそれぞれ、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的としても良いし；あるいは二重鎖はそれぞれ、２つの異なる標的部位における同じ遺伝子を標的としても良い。
一実施形態では、式（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｃ）、および（ＩＩＩｄ）で表される２つのＲＮＡｉ剤は、５’末端で互いに結合され、３’末端の一方または両方が、任意選択で、リガンドによってコンジュゲートされる。ＲＮＡｉ剤はそれぞれ、同じ遺伝子または２つの異なる遺伝子を標的としても良いし；あるいはＲＮＡｉ剤はそれぞれ、２つの異なる標的部位における同じ遺伝子を標的としても良い。
様々な刊行物が、多量体ＲＮＡｉ剤について記載しており、本発明の方法に使用することができる。このような刊行物としては、参照によりそれらの全開示内容がそれぞれ本明細書に組み入れられる、国際公開第２００７／０９１２６９号パンフレット、米国特許第７８５８７６９号明細書、国際公開第２０１０／１４１５１１号パンフレット、同第２００７／１１７６８６号パンフレット、同第２００９／０１４８８７号パンフレット、および同第２０１１／０３１５２０号パンフレットが挙げられる。
１つ以上の糖質部分のＲＮＡｉ剤に対するコンジュゲーションを含むＲＮＡｉ剤は、このＲＮＡｉ剤の１つ以上の特性を最適化し得る。多くの場合、糖質部分は、ＲＮＡｉ剤の修飾サブユニットに付着する。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の１つ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖を、別の部分、例えば、糖質リガンドが付着する非糖質担体（好ましくは環状）で置換することができる。サブユニットのリボース糖がこのように置換されたリボヌクレオチドサブユニットは、本明細書では、リボース置換修飾サブユニット（ＲＲＭＳ）と呼ばれる。環状担体は、炭素環系、即ち全ての環原子が炭素原子である環系であっても良いし、または複素環系、即ち１つ以上の環原子が、ヘテロ原子、例えば、窒素、酸素、硫黄であり得る環系であっても良い。環状担体は、単環系であっても良いし、または２つ以上の環、例えば、融合環を含んでも良い。環状担体は、完全に飽和した環系であっても良いし、または１つ以上の二重結合を含んでも良い。
リガンドは、担体によってポリヌクレオチドに付着することができる。担体は、（ｉ）少なくとも１つの「骨格付着点（ｂａｃｋｂｏｎｅ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｏｉｎｔ）」、好ましくは２つの「骨格付着点」、および（ｉｉ）少なくとも１つの「テザー付着点（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｏｉｎｔ）」を含む。本明細書で使用される「骨格付着点」は、官能基、例えば、ヒドロキシル基、または一般に、リボ核酸の骨格、例えば、リン酸塩の骨格、もしくは、例えば、硫黄を含有する修飾リン酸塩の骨格への担体の組み込みに利用可能であり、かつ適した結合を指す。「テザー付着点」（ＴＡＰ）は、一部の実施形態では、選択された部分を接続する環状担体の構成環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子（骨格付着点を提供する原子とは異なる）を指す。この選択された部分は、例えば、糖質、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、および多糖であり得る。任意選択で、選択された部分は、介在テザー（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｔｅｔｈｅｒ）によって環状担体に接続される。従って、環状担体は、しばしば、官能基、例えば、アミノ基を含む、または、一般に、別の化学物質、例えば、リガンドの構成環への組み込みまたは連結（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）に適した結合を可能にする。
ＲＮＡｉ剤は、担体によってリガンドにコンジュゲートすることができ、この担体は、環状基または非環状基であり；好ましくは、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびデカリンから選択され；好ましくは、非環状基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
ある特定の実施形態では、本発明の方法に使用されるＲＮＡｉ剤は、表１および表２のいずれか一方に列記されている作用剤の群から選択される作用剤である。一実施形態では、作用剤が、表１に列記されている作用剤である場合、作用剤は、末端ｄＴを欠失し得る。
本発明は、アンチセンス鎖に５’リン酸塩またはリン酸塩模倣物を含む、表１または表２のいずれか一方に列記された配列のいずれか１つを含む二本鎖ＲＮＡｉ剤をさらに含む（例えば、ＰＣＴ国際公開特許第２０１１００５８６０号パンフレットを参照されたい）。さらに、本発明は、センス鎖の５’末端の２’−ＯＭｅ基の代わりに２’フルオロ基を含む、表１または表２のいずれか一方に列記されているいずれか１つの配列を含む二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む。
さらなるモチーフ
特定の態様では、本明細書に記載される二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖およびアンチセンス鎖は、１１未満、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、または５未満の２’−デオキシフルオロを含む。
特定の態様では、本明細書に記載される二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖およびアンチセンス鎖は、１０未満、９未満、８未満、７未満、６未満、５未満、４未満のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
特定の態様では、本明細書に記載される二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖およびアンチセンス鎖は、１０未満の２’−デオキシフルオロおよび６未満のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
特定の態様では、本明細書に記載される二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖およびアンチセンス鎖は、８未満の２’−デオキシフルオロおよび６未満のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
特定の態様では、本明細書に記載される二本鎖ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖およびアンチセンス鎖は、９未満の２’−デオキシフルオロおよび６未満のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。
リガンド
本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、任意選択により、１つ以上のリガンドにコンジュゲートされ得る。リガンドは、３’末端、５’末端、または両末端でセンス鎖、アンチセンス鎖、または両鎖に付着され得る。例えば、リガンドは、センス鎖にコンジュゲートされ得る。一部の実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。一実施形態では、リガンドは、ＧａｌＮＡｃリガンドである。特定の一部の実施形態では、リガンドはＧａｌＮＡｃ３である。このリガンドは、介在テザーを介して直接的または間接的に結合される、好ましくは共有結合される。
一部の実施形態では、リガンドは、このリガンドが取り込まれる分子の分布、標的化、または寿命を変更する。一部の実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない種と比較して、選択される標的、例えば、分子、細胞もしくは細胞型、区画、受容体、例えば、細胞もしくは器官の区画、組織、器官、または体の領域に対する親和性を高める。選択される標的に対する親和性を高めるリガンドは、標的化リガンドとも呼ばれる。
一部のリガンドは、エンドソーム溶解特性を有し得る。エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームの溶解、および／または本発明の組成物もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解リガンドは、ｐＨ依存性の膜活性および融合性を示すポリアニオン性ペプチドまたはペプチド模倣体であっても良い。一実施形態では、エンドソーム溶解リガンドは、エンドソームのｐＨでその活性型立体構造をとると推定される。「活性型」立体構造とは、エンドソーム溶解リガンドが、エンドソームの溶解、および／または本発明の組成物もしくはその成分のエンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する立体構造のことである。例示的なエンドソーム溶解リガンドとしては、ＧＡＬＡペプチド（Ｓｕｂｂａｒａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：２９６４−２９７２）、ＥＡＬＡペプチド（Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９６，１１８：１５８１−１５８６）、およびこれらの誘導体（Ｔｕｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，２００２，１５５９：５６−６８）が挙げられる。一実施形態では、エンドソーム溶解成分は、ｐＨの変化に応じて電荷またはプロトン化の変化を起こす化学基（例えば、アミノ酸）を含み得る。エンドソーム溶解成分は、直鎖であっても、分岐鎖であっても良い。
リガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性の特性を向上させることができ、結果として得られる天然オリゴリボヌクレオチドもしくは修飾オリゴリボヌクレオチド、または本明細書に記載されるモノマーおよび／もしくは天然リボヌクレオチドもしくは修飾リボヌクレオチドの任意の組み合わせを含むポリマー分子のヌクレアーゼ耐性も向上させることができる。
リガンドは、一般に、例えば、取り込みを増強するための治療用修飾因子；例えば、分布を監視するための診断化合物またはレポーター基；架橋剤；およびヌクレアーゼ耐性を付与する部分を含み得る。一般的な例として、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣体が挙げられる。
リガンドとしては、天然に存在する物質、例えば、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、もしくはグロブリン）；糖質（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、もしくはヒアルロン酸）；または脂質を挙げることができる。リガンドは、組換え分子または合成分子、例えば、合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド（例えば、アプタマー）であっても良い。ポリアミノ酸を含むポリアミノ酸としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ−アスパラギン酸、ポリＬ−グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリエド（ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））コポリマー、ジビニルエーテル無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマー、またはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例として、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはアルファへリックスペプチドが挙げられる。
リガンドとして、標的化基、例えば、細胞標的化剤または組織標的化剤、例えば、腎臓細胞などの特定の細胞型に結合するレクチン、糖タンパク質、脂質、もしくはタンパク質、例えば、抗体も挙げることができる。標的化基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤タンパク質Ａ、ムチン糖質、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン（ｇｕｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ）、多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸塩、ポリアスパラギン酸塩、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸塩、ビタミンＢ１２、ビオチン、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤペプチド模倣体、またはアプタマーであっても良い。
リガンドの他の例として、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼまたはキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、もしくはフェノキサジン）およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロ環のＥｕ３＋複合体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰ、またはＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチド、例えば、共リガンドに対して特異的な親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内皮細胞、もしくは骨細胞などの特定の細胞型に結合する抗体であっても良い。リガンドとして、ホルモンおよびホルモン受容体も挙げることができる。リガンドとして、非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン、糖質、ビタミン、コファクター、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノース、多価フコース、またはアプタマーも挙げることができる。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ ＭＡＰキナーゼの活性化因子、またはＮＦ−κＢの活性化因子であっても良い。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、マイクロフィラメント、および／または中間径フィラメントを破壊することによって、ｉＲＮＡ剤の細胞内への取り込みを増大させることができる物質、例えば、薬物であっても良い。薬物は、例えば、タクソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド（ｊａｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であっても良い。
リガンドは、例えば、炎症反応を活性化することによって、オリゴヌクレオチドの細胞への取り込みを増加させることができる。このような効果を有し得る例示的なリガンドとしては、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１β、またはγインターフェロンが挙げられる。
一態様では、リガンドは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡ結合リガンドは、コンジュゲートが、標的組織、例えば、体の非腎臓標的組織に分布するのを可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であっても良い。ＨＳＡに結合し得る他の分子もリガンドとして使用することができる。例えば、ナプロキセンまたはアスピリンを使用することができる。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大させ、（ｂ）標的細胞または細胞膜への標的化または輸送を増大させることができ、かつ／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡに対する結合を調節するために使用することができる。
脂質ベースのリガンドは、標的組織に対するコンジュゲートの結合を調節、例えば、制御するために使用することができる。例えば、ＨＳＡにより強く結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓を標的とする可能性が低く、従って、体内から除去される可能性が低い。ＨＳＡにそれほど強く結合しない脂質または脂質ベースのリガンドは、コンジュゲートが腎臓を標的にするように使用することができる。
一実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、脂質ベースのリガンドは、このコンジュゲートが、好ましくは非腎臓組織に分散するように十分な親和性でＨＳＡに結合する。一実施形態では、この親和性は、ＨＳＡ−リガンド結合が反転され得るような親和性である。別の実施形態では、脂質ベースのリガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか、または全く結合しないため、このコンジュゲートは、好ましくは腎臓に分散される。腎臓細胞を標的とする他の部分も、脂質ベースのリガンドの代わりに、またはこれに加えて使用することができる。
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖細胞によって取り込まれる部分、例えば、ビタミンである。これらは、例えば、悪性型または非悪性型、例えば、癌細胞の望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するのに特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、およびＫが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、または癌細胞によって取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。また、ＨＡＳ、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）もが挙げられる。
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはヘリックス型の細胞透過剤である。好ましくは、作用剤は両親媒性である。例示的な作用剤は、ペプチド、例えば、ｔａｔまたはアンテナペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）である。作用剤がペプチドである場合、ペプチジル模倣体、反転異性体、非ペプチド結合または偽ペプチド結合、およびＤ−アミノ酸の使用を含む修飾を施すことができる。好ましくは、このヘリックス型の細胞透過剤は、好ましくは親油性相および疎油性相を有するアルファヘリックス型の作用剤である。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であっても良い。ペプチド模倣体（本明細書ではオリゴペプチド模倣体とも呼ばれる）は、天然ペプチドと同様の定められた３次元構造に折り畳むことができる分子である。ペプチド部分またはペプチド模倣体部分は、約５〜５０のアミノ酸長さ、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０のアミノ酸長さであっても良い。ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、Ｔｒｐ、もしくはＰｈｅから構成される）であっても良い。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束ペプチド、または架橋ペプチドであっても良い。別の代替では、ペプチド部分は、疎水性の膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号：９）を有するＲＦＧＦである。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号：１０））も標的化部分であっても良い。ペプチド部分は、「送達」ペプチドであっても良く、この送達ペプチドは、ペプチド、オリゴヌクレオチド、およびタンパク質を含む大きな極性分子を、細胞膜を通過して運搬することができる。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質由来の配列（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）（配列番号：１１）およびショウジョウバエアンテナペディアタンパク質由来の配列（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）（配列番号：１２）は、送達ペプチドとして機能できることが分かっている。ペプチドまたはペプチド模倣体、例えば、ファージディスプレイライブラリー、または１ビーズ１化合物（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドは、ＤＮＡのランダム配列によってコードされても良い（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２−８４，１９９１）。好ましくは、組み込まれたモノマー単位を介してｉＲＮＡ剤に連結されたペプチドまたはペプチド模倣体は、細胞標的化ペプチド、例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチドまたはＲＧＤ模倣体である。ペプチド部分は、約５つのアミノ酸長さ〜約４０のアミノ酸長さの範囲とすることができる。ペプチド部分は、例えば、安定性または直接的な立体構造特性を高めるための、構造変化を有し得る。下記の構造変化のいずれも利用することができる。ＲＧＤペプチド部分は、内皮腫瘍細胞または乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするために使用することができる（Ｚｉｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：５１３９−４３，２００２）。ＲＧＤペプチドは、肺、腎臓、脾臓、または肝臓を含む種々の他の組織の腫瘍に対するｉＲＮＡ剤の標的化を促進することができる（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：７８３−７８７，２００１）。好ましくは、ＲＧＤペプチドは、腎臓に対するｉＲＮＡ剤の標的化を促進する。ＲＧＤペプチドは、直鎖または環状であっても良く、特定の組織に対する標的化を促進するために修飾する、例えば、グリコシル化またはメチル化することができる。例えば、グリコシル化ＲＧＤペプチドは、αｖβ３を発現する腫瘍細胞にｉＲＮＡ剤を送達することができる（Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６−３３６，２００１）。増殖細胞に豊富なマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、ＲＧＤ含有ペプチドおよびＲＧＤ含有ペプチド模倣体は、癌細胞、特に、インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。従って、ＲＧＤペプチド、ＲＧＤを含有する環状ペプチド、Ｄ−アミノ酸を含むＲＧＤペプチド、および合成ＲＧＤ模倣体を使用することができる。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することもできる。一般に、このようなリガンドは、増殖細胞および血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｉｓ）を制御するために使用することができる。この種のリガンドの一部のコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ−１、ＶＥＧＦ、または他の癌遺伝子、例えば、本明細書に記載される癌遺伝子を標的とする。
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、微生物細胞、例えば、細菌細胞もしくは真菌細胞、または哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞を透過することができる。微生物細胞を透過するペプチドは、例えば、α−ヘリックス直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ−３７もしくはセロピンＰ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α−ディフェンシン、β−ディフェンシン、もしくはバクテネシン）、または１種もしくは２種の優勢なアミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ−３９もしくはインドリシジン）であっても良い。細胞透過ペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）も含み得る。例えば、細胞透過ペプチドは、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１の融合ペプチドドメインおよびＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳに由来する二部両親媒性ペプチド、例えば、ＭＰＧであっても良い（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７−２７２４，２００３）。
一実施形態では、標的化ペプチドは、両親媒性α−ヘリックスペプチドであっても良い。例示的な両親媒性α−ヘリックスペプチドとしては、限定されるものではないが、セクロピン、リコトキシン（ｌｙｃｏｔｏｘｉｎ）、パラダキシン（ｐａｒａｄａｘｉｎ）、ブフォリン、ＣＰＦ、ボンビニン−様ペプチド（ＢＬＰ）、カテリシジン、セラトトキシン（ｃｅｒａｔｏｔｏｘｉｎ）、エボヤ（Ｓ．ｃｌａｖａ）ペプチド、メクラウナギ腸抗菌ペプチド（ＨＦＩＡＰ）、マガイニン、ブレビニン−２、デルマセプチン、メリチン、プレウロシジン、Ｈ２Ａペプチド、アフリカツメガエルペプチド、エスクレンチニス−１（ｅｓｃｕｌｅｎｔｉｎｉｓ−１）、およびカエリンが挙げられる。好ましくは、多数の因子が、ヘリックス安定性の完全性を維持すると見なされる。例えば、最大数のヘリックス安定化残基（例えばｌｅｕ、ａｌａ、またはｌｙｓ）を利用し、最小数のヘリックス不安定化残基（例えばプロリン、または環状モノマー単位を利用する。キャッピング残基も考慮される（例えば、Ｇｌｙは、例示的なＮ−キャッピング残基であり、かつ／またはＣ末端アミド化は、追加的な水素結合を実現してヘリックスを安定させるために使用することができる。ｉ±３位、またはｉ±４位離間した、反対の電荷を有する残基間の塩架橋の形成によって安定させることができる。カチオン性残基、例えば、リジン、アルギニン、ホモ−アルギニン、オルニチン、またはヒスチジンは、アニオン性残基であるグルタミン酸またはアスパラギン酸と塩架橋を形成し得る。
ペプチドリガンドおよびペプチド模倣体リガンドとしては、天然ペプチドまたは修飾ペプチド、例えば、ＤペプチドもしくはＬペプチド；αペプチド、βペプチド、もしくはγペプチド；Ｎ−メチルペプチド；アザペプチド；１つ以上の尿素結合、チオ尿素結合、カルバミン酸結合、もしくはスルホニル尿素結合で置換された１つ以上のアミド結合、即ち、ペプチ結合を有するペプチド；または環状ペプチドを有するリガンドが挙げられる。
標的化リガンドは、特定の受容体を標的とすることができるあらゆるリガンドであっても良い。例として、葉酸塩、ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース、マンノース、マンノース−６Ｐ、糖クラスター、例えば、ＧａｌＮＡｃクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスター、またはアプタマーが挙げられる。クラスターは、２つ以上の糖単位の組み合わせである。標的化リガンドは、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、ＰＳＭＡ、エンドセリン、ＧＣＰＩＩ、ソマトスタチン、ＬＤＬリガンド、およびＨＤＬリガンドも含む。リガンドは、核酸、例えば、アプタマーをベースにしても良い。アプタマーは、未修飾でも良いし、または本明細書に開示される修飾の任意の組み合わせを有しても良い。
エンドソーム放出剤としては、イミダゾール、ポリまたはオリゴイミダゾール、ＰＥＩ、ペプチド、融合性ペプチド、ポリカーボキシレート（ｐｏｌｙｃａｂｏｘｙｌａｔｅ）、ポリカチオン（ｐｏｌｙａｃａｔｉｏｎ）、マスクオリゴまたはポリカチオンまたはアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール／ポリケチアル（ｐｏｌｙｋｅｔｙａｌ）、オルトエステル、マスクまたは非マスクカチオンまたはアニオン電荷を有するポリマー、マスクまたは非マスクカチオンまたはアニオン電荷を有するデンドリマーが挙げられる。
ＰＫモジュレーターとは、薬物動態学的モジュレーターのことである。ＰＫモジュレーターとしては、脂肪親和物、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫモジュレーターとしては、限定されるものではないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。多数のホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドも、血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、骨格に多数のホスホロチオエート連結を含む短鎖オリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基、または２０塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンドとして（例えば、ＰＫ調節リガンドとして）本発明に適用可能である。
加えて、血清成分（例えば、血清タンパク質）に結合するアプタマーも、ＰＫ調節リガンドとして本発明に適用可能である。
本発明に適用可能な他のリガンドコンジュゲートは、参照によりそれらの全開示内容が本明細書に組み入れられる、２００４年８月１０日出願の米国特許出願第１０／９１６，１８５号明細書；２００４年９月２１日出願の同第１０／９４６，８７３号明細書；２００７年８月３日出願の同第１０／８３３，９３４号明細書；２００５年４月２７日出願の同第１１／１１５，９８９号明細書、および２００７年１１月２１日出願の同第１１／９４４，２２７号明細書に記載されている。
２つ以上のリガンドが存在する場合、リガンドは、全て同じ特性を有しても良いし、全てが異なる特性を有しても良く、または一部のリガンドが、同じ特性を有する一方、他のリガンドが異なる特性を有しても良い。例えば、リガンドは、標的化特性を有しても良いし、エンドソーム的活性を有して良いし、またはＰＫ調節特性を有しても良い。一実施形態では、全てのリガンドが異なる特性を有する。
リガンドは、様々な位置、例えば３’末端、５’末端、および／または内部位置で、オリゴヌクレオチドに結合することができる。一部の実施形態では、リガンドは、介在テザー、例えば、本明細書に記載される担体を介してオリゴヌクレオチドに結合している。モノマーが成長している鎖に組み込まれる場合、リガンドまたはテザーリガンドは、このモノマーに存在しても良い。一部の実施形態では、リガンドは、「前駆体」モノマーが、成長している鎖に組み込まれた後で、この「前駆体」モノマーへの結合によって組み込むことができる。例えば、末端がアミノであるテザー（即ち、リガンドが結合されていない）、例えば、ＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２を有するモノマーを、成長しているオリゴヌクレオチド鎖に組み込むことができる。これに続く作業、即ち、前駆体モノマーが鎖に組み込まれた後で、リガンドの求電子基と前駆体モノマーのテザーの末端求核基との結合によって、求電子基、例えば、ペンタフルオロフェニルエステルまたはアルデヒド基を有するリガンドを、その後、前駆体モノマーに結合させることができる。
別の例では、クリック化学反応に参加するのに適した化学基を有するモノマーを、例えば、末端がアジドまたはアルキンのテザー／リンカーに組み込むことができる。これに続く作業、即ち、前駆体モノマーが鎖に組み込まれた後で、相補的な化学基、例えば、アルキンまたはアジドを有するリガンドを、アルキンおよびアジドを共に結合することによって前駆体モノマーに結合することができる。
一部の実施形態では、リガンドは、核酸分子の核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合にコンジュゲートすることができる。プリン核酸塩基またはその誘導体に対するコンジュゲーションは、環内原子および環外原子を含む任意の位置に生じ得る。一部の実施形態では、プリン核酸塩基の２位、６位、７位、または８位が、コンジュゲート部分に結合している。また、ピリミジン核酸塩基またはその誘導体に対するコンジュゲーションは、どの位置で生じても良い。一部の実施形態では、ピリミジン核酸塩基の２位、５位、および６位を、コンジュゲート部分と置換することができる。ヌクレオシドの糖部分に対するコンジュゲーションは、どの炭素原子で生じても良い。コンジュゲート部分に結合することができる糖部分の炭素原子の例には、２’、３’、および５’炭素原子が挙げられる。１’位も、コンジュゲート部分、例えば、脱塩基残基に結合することができる。ヌクレオシド間結合も、コンジュゲート部分を保持することができる。リン含有結合（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏｔａｔｅ）、およびホスホロアミデートなど）の場合、コンジュゲート部分は、リン原子に直接結合する、またはリン原子に結合しているＯ、Ｎ、またはＳ原子に結合することができる。アミンまたはアミドを含有するヌクレオシド間結合（例えば、ＰＮＡ）の場合、コンジュゲート部分は、アミンまたはアミドの窒素原子に、または隣接する炭素原子に結合することができる。
ＧａｌＮＡｃリガンドおよびリンカー
一部の実施形態では、ＨＡＯ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、炭水化物、例えば、単糖（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、二糖、三糖、四糖、多糖にコンジュゲートされる。一部の実施形態では、ｓｉＲＮＡは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）リガンドにコンジュゲートされる。これは、皮下投与後の肝細胞への効率的な送達を促進する。炭水化物、例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミンの、例えば、ｓｉＲＮＡへの結合の方法は、当業者に周知である。例は、米国特許第８，１０６，０２２号明細書および国際公開第２０１４／０２５８０５号パンフレットで確認することができる。
一部の実施形態では、ＨＡＯ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、リンカーを介してリガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされる。例えば、リガンドは、二価または三価の分岐リンカーによって付着された１つ以上のＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）誘導体であり得る。
一実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡは、次の式（Ｖ）〜（ＶＩＩ）の何れかに示されている構造を含む二価および三価の分岐リンカーにコンジュゲートする：
Figure 2021019609
 式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂ、およびｑ５Ｃは存在ごとに独立して、０〜２０を表し、反復単位は、同じであっても良いし、異なっていても良く；
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃはそれぞれ存在ごとに独立して、存在しないか、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２Ｏを表し；
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは存在ごとに独立して、存在しないか、アルキレン、置換アルキレンを表し、１つ以上のメチレンは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡Ｃ、またはＣ（Ｏ）の１つ以上によって中断または終了させることができ；
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃはそれぞれ存在ごとに独立して、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ（Ｒａ）−ＮＨ−、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ−Ｏ、
Figure 2021019609
 、またはヘテロシクリルを表し；
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、リガンドを表す；即ち、それぞれ存在ごとに独立して、単糖（例えば、ＧａｌＮＡｃ）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖を表し；かつ
Ｒａは、Ｈまたはアミノ酸側鎖である。
三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体、例えば、式（ＶＩＩ）のような誘導体は、標的遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤と共に使用すると特に有用である：
Figure 2021019609
 式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、単糖、例えば、ＧａｌＮＡｃ誘導体を表している。
適切な二価および三価分岐リンカー基コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、限定されるものではないが、以下の化合物：
適切な二価および三価分岐リンカー基コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、限定されるものではないが、以下の化合物：
Figure 2021019609
Figure 2021019609
Figure 2021019609
さらなるリガンド
一部の実施形態では、リガンドは、以下の１つから選択される：
Figure 2021019609
Figure 2021019609
ＩＩＩ．本発明のｉＲＮＡの送達
本発明のｉＲＮＡ剤の細胞、例えば、対象の細胞、例えば、ヒト対象（例えば、ｉＲＮＡ剤の送達を必要とする対象、例えば、ＨＡＯ１関連障害を有する対象）の細胞への送達は、様々な方法で達成することができる。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで本発明のｉＲＮＡを細胞に接触させることによって送達を行うことができる。ｉｎ ｖｉｖｏ送達は、ｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡを含む組成物を対象に投与することによって直接行うこともできる。あるいは、ｉｎ ｖｉｖｏ送達は、ｉＲＮＡをコードし、かつｉＲＮＡの発現を誘導する１つ以上のベクターを投与することによって間接的に行うことができる。これらの代替案を以下にさらに説明する。
一般に、核酸分子を（ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ）送達するあらゆる方法は、本発明のｉＲＮＡに使用するために適合させることができる（例えば、参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる、Ａｋｈｔａｒ Ｓ． ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ． （１９９２） Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ２（５）：１３９−１４４および国際公開第９４／０２５９５号パンフレットを参照されたい）。ｉｎ ｖｉｖｏ送達では、ｉＲＮＡ分子を送達するために考慮する因子としては、例えば、送達される分子の生物学的安定性、非特異的な影響の防止、および標的組織への送達分子の蓄積が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的な影響は、局所投与によって、例えば、組織への直接注入もしくは植え込み、または製剤の局所的な投与によって最小限にすることができる。処置部位への局所投与は、作用剤の局所濃度を最大にし、通常なら作用剤によって傷つけられ得るまたは作用剤を劣化させ得る、全身組織への作用剤の曝露を制限し、かつ投与されるべきｉＲＮＡ分子の総用量を低減することができる。いくつかの研究は、ｉＲＮＡが局所投与されたときの遺伝子産物のノックダウンの成功を示した。例えば、カニクイザルでの硝子体内注入（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．， ｅｔ ａｌ（２００４）Ｒｅｔｉｎａ ２４：１３２−１３８）およびマウスでの網膜下注入（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０−２１６）によるＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼内送達は共に、加齢黄斑変性の実験モデルで新血管形成を防止することを示した。加えて、マウスでのｄｓＲＮＡの直接腫瘍内注入は、腫瘍の体積を減少させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７−２７４）、そして腫瘍を有するマウスの生存期間を延ばすことができる（Ｋｉｍ，ＷＪ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３−３５０；Ｌｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５−５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注入によるＣＮＳへの局所送達（Ｄｏｒｎ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５９−６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（２００２）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１−５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ， ＥＲ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０−１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４−６０２）、および鼻腔内投与による肺への送達（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６−４８４；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７−１０６８４；Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０−５５）にも成功したことを示している。疾患の処置のためにｉＲＮＡを全身投与する場合、ＲＮＡを修飾する、あるいは薬物送達システムを用いて送達することができ；これらの両方の方法は、ｉｎ ｖｉｖｏでのエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによるｄｓＲＮＡの迅速な分解を防止するように作用する。ＲＮＡまたは薬学的担体の修飾は、ｉＲＮＡ組成物の標的組織への標的化を可能にすると共に、不所望の標的外の影響を回避することもできる。ｉＲＮＡ分子は、細胞内取り込みを促進して分解を防止するために、親油性基、例えば、コレステロールへの化学的結合によって修飾することができる。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートしたＡｐｏＢに向けられるｉＲＮＡをマウスに全身注射し、その結果として、肝臓および空腸の両方でａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンが起きた（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３−１７８）。ｉＲＮＡのアプタマーへの結合は、前立腺癌のマウスモデルにおいて腫瘍の成長を阻害して腫瘍退縮を媒介することを示した（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５−１０１５）。代替の一実施形態では、ｉＲＮＡは、薬物送達システム、例えば、ナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、または陽イオン送達システムを用いて送達することができる。正電荷陽イオン送達システムは、ｉＲＮＡ分子（負に帯電した）の結合を促進すると共に、負に帯電した細胞膜での相互作用も促進して細胞によるｉＲＮＡの効率的な取り込みも可能にする。陽イオン性の脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合する、または誘導されてｉＲＮＡを包囲する小胞もしくはミセルを形成することができる（例えば、Ｋｉｍ ＳＨ．，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７−１１６を参照されたい）。小胞またはミセルの形成は、全身投与されるときのｉＲＮＡの分解をさらに防止する。陽イオン−ｉＲＮＡ複合体の形成および投与の方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えば、参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１−７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１−１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７−２０５を参照されたい）。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬物送達システムのいくつかの非限定の例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３），前記；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ ａｌ（２００３），前記）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、「固体核酸脂質粒子」（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１−１１４），ｃａｒｄｉｏｌｉｐｉｎ （Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１−３２８；Ｐａｌ，Ａ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７−１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ．，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ａｕｇ １６ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２−４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ．，ｅｔ ａｌ（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１−６７；Ｙｏｏ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９−１８０４）が挙げられる。一部の実施形態では、ｉＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。ｉＲＮＡおよびシクロデキストリンの投与方法および医薬組成物は、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる、米国特許第７，４２７，６０５号明細書で確認することができる。
本発明のｉＲＮＡをコードするベクター
ＨＡＯ１遺伝子を標的とするｉＲＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターに挿入される転写単位から発現させることができる（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５−１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ国際公開特許第００／２２１１３号パンフレット、Ｃｏｎｒａｄ， ＰＣＴ国際公開特許第００／２２１１４パンフレット、およびＣｏｎｒａｄ，米国特許第６，０５４，２９９号明細書を参照されたい）。発現は、使用される特定の構築物および標的組織または細胞型によって一過性（数時間から数週間の範囲）または持続性（数週間から数か月以上）であり得る。これらの導入遺伝子は、線形構築物、円形プラスミド、または組込み型もしくは非組み込み型ベクターであり得るウイルスベクターとして導入することができる。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして遺伝することを可能にするように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
ｉＲＮＡの個々の鎖または複数の鎖を、発現ベクターのプロモーターから転写することができる。例えば、ｄｓＲＮＡを形成するために２つの別個の鎖が発現される場合、２つの別個の発現ベクターを、標的細胞に（例えば、トランスフェクションまたは注入によって）同時に導入することができる。あるいは、ｄｓＲＮＡのそれぞれの個々の鎖を、共に同じ発現プラスミドに位置するプロモーターによって転写することができる。一実施形態では、ｄｓＲＮＡは、このｄｓＲＮＡがステムおよびループ構造を有するようにリンカーポリヌクレオチド配列によって連結された逆方向反復ポリヌクレオチドとして発現される。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、一般に、ＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核細胞に適合した発現ベクター、好ましくは脊椎動物細胞に適合した発現ベクターを使用して、本明細書に記載されるｉＲＮＡの発現用の組換え構築物を作製することができる。真核細胞発現ベクターは、当分野で周知であり、多数の商業的供給源から入手可能である。典型的には、所望の核酸セグメントの挿入に便利な制限部位を含むこのようなベクターが提供される。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、例えば、静脈内もしくは筋内投与によって、患者から取り出された標的細胞への投与およびこれに続く患者への再導入によって、または所望の標的細胞への導入を可能にするその他の手段によって全身送達にすることができる。
ｉＲＮＡ発現プラスミドは、陽イオン性脂質担体（例えば、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）または非陽イオン性脂質ベースの担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標））との複合体として標的細胞にトランスフェクトすることができる。１週間以上の期間に亘って標的ＲＮＡの異なる領域を標的とするｉＲＮＡ媒介ノックダウンのための複数の脂質トランスフェクションも、本発明によって企図される。宿主細胞へのベクターの導入の達成は、様々な既知の方法を用いて監視することができる。例えば、一過性のトランスフェクションは、レポーター、例えば、蛍光マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）によって知らせることができる。ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞の安定したトランスフェクションは、特定の環境因子（例えば、抗生物質および薬物）に対する耐性、例えば、ハイグロマイシンＢ耐性を有するトランスフェクト細胞を提供するマーカーを用いて確認することができる。
本明細書に記載される方法および組成物と共に利用することができるウイルスベクター系としては、限定されるものではないが、（ａ）アデノウイルスベクター；（ｂ）限定されるものではないが、レンチウイルスベクター、ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルスなどを含むレトロウイルスベクター；（ｃ）アデノ関連ウイルスベクター；（ｄ）ヘルペス単純ウイルスベクター；（ｅ）ＳＶ４０ベクター；（ｆ）ポリオーマウイルスベクター；（ｇ）パピローマウイルスベクター；（ｈ）ピコルナウイルスベクター；（ｉ）オルソポックスウイルスなどのポックスウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルスベクターまたはアビポックス、例えば、カナリア痘または鶏痘；および（ｊ）ヘルパー依存性またはガットレスアデノウイルスが挙げられる。複製欠損ウイルスも有利であり得る。様々なベクターが、細胞のゲノムに組み込まれる、または組み込まれない。構築物は、所望に応じて、トランスフェクションのためのウイルス配列を含み得る。あるいは、構築物を、エピソームの複製を可能にするベクター、例えば、ＥＰＶおよびＥＢＶベクターに組み込むことができる。ｉＲＮＡの組換え発現のための構築物は、一般に、標的細胞でのｉＲＮＡの発現を確実にするために調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサーなどを必要とする。ベクターおよび構築物を考察するための他の態様を、以下にさらに説明する。
ｉＲＮＡの送達に有用なベクターには、所望の標的細胞または組織でのｉＲＮＡの発現に十分な調節要素（プロモーター、エンハンサーなど）が含まれる。調節要素は、構成的または調節／誘導発現を提供するために選択することができる。
ｉＲＮＡの発現は、例えば、特定の生理的調節因子、例えば、循環血糖値またはホルモンに感受性が高い誘導性調節配列を用いることによって正確に調節することができる（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０−２４）。細胞または哺乳動物でのｄｓＲＮＡ発現の調節に適したこのような誘導発現系は、例えば、エクジソンによる調節、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、化学誘導物質の二量体化、およびイソプロピル−β−Ｄ１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節を含む。当業者であれば、ｉＲＮＡ導入遺伝子の意図する使用に基づいて適切な調節／プロモーター配列を選択することができるであろう。
ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含むウイルスベクターを使用することができる。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９（１９９３）を参照されたい）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正確なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な構成要素を含む。ｉＲＮＡをコードする核酸配列が、核酸の患者への送達を促進する１つ以上のベクターにクローニングされる。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、例えば、Ｂｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１−３０２（１９９４）で確認することができ、この文献は、幹細胞の化学療法に対する耐性を高めるためのレトロウイルスベクターを使用したｍｄｒ１遺伝子の造血幹細胞への送達を説明している。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を例示する他の参照文献としては：Ｃｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７−１４７３ （１９９４）；Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９−１４１（１９９３）；およびＧｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４（１９９３）が挙げられる。使用が企図されるレンチウイルスベクターとしては、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第６，１４３，５２０号明細書；同第５，６６５，５５７号明細書；および同第５，９８１，２７６号明細書に記載されているＨＩＶベースのベクターが挙げられる。
アデノウイルスも、本発明のｉＲＮＡの送達での使用に企図される。アデノウイルスは、例えば、遺伝子の気道上皮への送達で特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、軽度の疾患を引き起こす気道上皮に自然感染する。アデノウイルスベースの送達システムの他の標的は、肝臓、中枢神経、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染できるという利点を有する。Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子療法の概説を述べている。Ｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１９９４）は、アデノウイルスベクターを使用したアカゲザルの気道上皮への遺伝子の導入を実証した。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９９３）；ＰＣＴ国際公開特許第９４／１２６４９号パンフレット；およびＷａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３ （１９９５）で確認することができる。本発明で取り上げられるｉＲＮＡを発現するための適切なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターの標的細胞への送達の方法は、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６−１０１０に記載されている。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターも、本発明のｉＲＮＡを送達するために使用することができる（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号明細書）。一実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６またはＨ１ ＲＮＡプロモーターまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを有する組換えＡＡＶベクターから２つの別個の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡを発現するための適切なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築する方法、およびベクターの標的細胞への送達の方法は、参照によりそれぞれの全開示内容が本明細書に組み入れられる、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６−３１０１；Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７０：５２０−５３２；Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２６；米国特許第５，２５２，４７９号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書；国際特許出願の国際公開第９４／１３７８８号パンフレット；および国際特許出願の国際公開第９３／２４６４１号パンフレットに記載されている。
本発明のｉＲＮＡの送達に適した別のウイルスベクターは、ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス、例えば、減弱ワクシニア、例えば、改変ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣ、アビポックス、例えば、カナリア痘または鶏痘である。
ウイルスベクターの親和性は、適宜、他のウイルスからのエンベロープタンパク質もしくは他の表面抗原でベクターを偽型にすることによって、または様々なウイルスカプシドタンパク質を置換することによって変更することができる。例えば、レンチウイルスベクターは、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、およびＭｏｋｏｌａなどからの表面タンパク質で偽型にすることができる。ＡＡＶベクターは、様々なカプシドタンパク質血清型を発現するベクターをエンジニアリングすることによって様々な細胞を標的にするように作製することができる：例えば、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１−８０１を参照されたい。
ベクターの医薬品は、許容され得る希釈剤中のベクターを含み得る、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターを、組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから無傷で作製できる場合、医薬品は、遺伝子送達システムを形成する１つ以上の細胞を含み得る。
ＩＶ．本発明の医薬組成物
本発明は、本発明のｉＲＮＡを含む医薬組成物および医薬製剤も含む。一実施形態では、本明細書で記載されるｉＲＮＡおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物が本明細書で提供される。ｉＲＮＡを含む医薬組成物は、ＨＡＯ１関連疾患または障害の処置に有用である。このような医薬組成物は、送達の方式に基づいて製剤することができる。
本発明のＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物は、例えば、緩衝剤を含むもしくは含まない溶液、または薬学的に許容され得る担体を含む組成物とすることができる。このような組成物としては、例えば、水溶性または結晶性組成物、リポソーム製剤、ミセル製剤、エマルション、および遺伝子治療ベクターが挙げられる。
本発明の方法では、ＲＮＡｉ剤は、溶液に溶解して投与することができる。遊離ＲＮＡｉ剤を、非緩衝液、例えば、生理食塩水または水に溶解して投与することができる。あるいは、遊離ｓｉＲＮＡは、適切な緩衝液に溶解して投与しても良い。緩衝液としては、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、リン酸塩、またはこれらの任意の組み合わせを挙げることができる。一実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。ＲＮＡｉ剤を含む緩衝液のｐＨおよびオスモル濃度は、対象に投与するのに適するように調整することができる。
一部の実施形態では、緩衝液は、オスモル濃度が、所望の値、例えば、ヒト血漿の生理値に維持されるように、溶液のオスモル濃度を制御するための作用剤をさらに含む。オスモル濃度を制御するために緩衝液に添加することができる溶質としては、限定されるものではないが、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、非代謝性ポリマー、ビタミン、イオン、糖、代謝産物、有機酸、脂質、または塩が挙げられる。一部の実施形態では、溶液のオスモル濃度を制御するための作用剤は塩である。特定の実施形態では、溶液のオスモル濃度を制御するための作用剤は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
本発明の医薬組成物は、ＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害するのに十分な用量で投与することができる。
用量
一般に、本発明のｉＲＮＡの適切な用量は、１日にレシピエントの体重１ｋｇ当たり約０．００１〜約２００．０ｍｇの範囲であり、一般的には１日に体重１ｋｇ当たり約０．１〜１０ｍｇまたは１〜５０ｍｇの範囲である。例えば、ｄｓＲＮＡは、１回の投与で約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇを投与することができる。
別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤、例えば、ｄｓＲＮＡは、約０．１〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約５０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約５０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約４５〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４５ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約４５ｍｇ／ｋｂ、約２〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約４０〜約４５ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約４０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約４０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３０〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約３５〜約４０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約３０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約３０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約１５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２０〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約２５〜約３０ｍｇ／ｋｇ、約０．１〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜約２０ｍｇ／ｍｇ、約１．５〜約２０ｍｇ／ｋｂ、約２〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約２．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約３．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約４．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約７．５〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０〜約２０ｍｇ／ｋｇ、または約１５〜約２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。列挙された値に対する中間の値および範囲も、本発明の一部であるものとする。
例えば、ＲＮＡｉ剤、例えば、ｄｓＲＮＡは、０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８ｍｇ／ｋｇ、０．９ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．１ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．３ｍｇ／ｋｇ、１．４ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、１．６ｍｇ／ｋｇ、１．７ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．１ｍｇ／ｋｇ、２．２ｍｇ／ｋｇ、２．３ｍｇ／ｋｇ、２．４ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、２．６ｍｇ／ｋｇ、２．７ｍｇ／ｋｇ、２．８ｍｇ／ｋｇ、２．９ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．１ｍｇ／ｋｇ、３．２ｍｇ／ｋｇ、３．３ｍｇ／ｋｇ、３．４ｍｇ／ｋｇ、３．５ｍｇ／ｋｇ、３．６ｍｇ／ｋｇ、３．７ｍｇ／ｋｇ、３．８ｍｇ／ｋｇ、３．９ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、４．１ｍｇ／ｋｇ、４．２ｍｇ／ｋｇ、４．３ｍｇ／ｋｇ、４．４ｍｇ／ｋｇ、４．５ｍｇ／ｋｇ、４．６ｍｇ／ｋｇ、４．７ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、４．９ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、５．１ｍｇ／ｋｇ、５．２ｍｇ／ｋｇ、５．３ｍｇ／ｋｇ、５．４ｍｇ／ｋｇ、５．５ｍｇ／ｋｇ、５．６ｍｇ／ｋｇ、５．７ｍｇ／ｋｇ、５．８ｍｇ／ｋｇ、５．９ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、６．１ｍｇ／ｋｇ、６．２ｍｇ／ｋｇ、６．３ｍｇ／ｋｇ、６．４ｍｇ／ｋｇ、６．５ｍｇ／ｋｇ、６．６ｍｇ／ｋｇ、６．７ｍｇ／ｋｇ、６．８ｍｇ／ｋｇ、６．９ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、７．１ｍｇ／ｋｇ、７．２ｍｇ／ｋｇ、７．３ｍｇ／ｋｇ、７．４ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、７．６ｍｇ／ｋｇ、７．７ｍｇ／ｋｇ、７．８ｍｇ／ｋｇ、７．９ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、８．１ｍｇ／ｋｇ、８．２ｍｇ／ｋｇ、８．３ｍｇ／ｋｇ、８．４ｍｇ／ｋｇ、８．５ｍｇ／ｋｇ、８．６ｍｇ／ｋｇ、８．７ｍｇ／ｋｇ、８．８ｍｇ／ｋｇ、８．９ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、９．１ｍｇ／ｋｇ、９．２ｍｇ／ｋｇ、９．３ｍｇ／ｋｇ、９．４ｍｇ／ｋｇ、９．５ｍｇ／ｋｇ、９．６ｍｇ／ｋｇ、９．７ｍｇ／ｋｇ、９．８ｍｇ／ｋｇ、９．９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１０．５ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１１．５ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１３．５ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１４．５ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１５．５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１６．５ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１７．５ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１８．５ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、１９．５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２０．５ｍｇ／ｋｇ、２１ｍｇ／ｋｇ、２１．５ｍｇ／ｋｇ、２２ｍｇ／ｋｇ、２２．５ｍｇ／ｋｇ、２３ｍｇ／ｋｇ、２３．５ｍｇ／ｋｇ、２４ｍｇ／ｋｇ、２４．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２５．５ｍｇ／ｋｇ、２６ｍｇ／ｋｇ、２６．５ｍｇ／ｋｇ、２７ｍｇ／ｋｇ、２７．５ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、２８．５ｍｇ／ｋｇ、２９ｍｇ／ｋｇ、２９．５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３１ｍｇ／ｋｇ、３２ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３４ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、３６ｍｇ／ｋｇ、３７ｍｇ／ｋｇ、３８ｍｇ／ｋｇ、３９ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、４１ｍｇ／ｋｇ、４２ｍｇ／ｋｇ、４３ｍｇ／ｋｇ、４４ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、４６ｍｇ／ｋｇ、４７ｍｇ／ｋｇ、４８ｍｇ／ｋｇ、４９ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。列挙された値に対する中間の値および範囲も、本発明の一部であるものとする。
本発明の特定の実施形態では、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤が、修飾（例えば、３つの連続したヌクレオチドの３つの同一の修飾からなる１つ以上のモチーフであって、作用剤の切断部位またはその近傍にこのような１つのモチーフを含む）、６つのホスホロチオエート結合、およびリガンドを含む場合は、このような作用剤は、０．０１〜０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３〜０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０４〜０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ〜０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．０８ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．０７ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。前述の列挙された値に対する中間の値および範囲も、本発明の一部であるものとし、例えば、ＲＮＡｉ剤は、約０．０１５ｍｇ／ｋｇ〜約０．４５ｍｇ／ｍｇの用量で対象に投与することができる。
例えば、ＲＮＡｉ剤、例えば、医薬組成物中のＲＮＡｉ剤は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０１２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１５ｍｇ／ｋｇ、０．０１７５ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０２２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０２７５ｍｇ／ｋｇ、０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．０３２５ｍｇ／ｋｇ、０．０３５ｍｇ／ｋｇ、０．０３７５ｍｇ／ｋｇ、０．０４ｍｇ／ｋｇ、０．０４２５ｍｇ／ｋｇ、０．０４５ｍｇ／ｋｇ、０．０４７５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．０５２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５５ｍｇ／ｋｇ、０．０５７５ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．０６２５ｍｇ／ｋｇ、０．０６５ｍｇ／ｋｇ、０．０６７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７ｍｇ／ｋｇ、０．０７２５ｍｇ／ｋｇ、０．０７５ｍｇ／ｋｇ、０．０７７５ｍｇ／ｋｇ、０．０８ｍｇ／ｋｇ、０．０８２５ｍｇ／ｋｇ、０．０８５ｍｇ／ｋｇ、０．０８７５ｍｇ／ｋｇ、０．０９ｍｇ／ｋｇ、０．０９２５ｍｇ／ｋｇ、０．０９５ｍｇ／ｋｇ、０．０９７５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．１２５ｍｇ／ｋｇ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．１７５ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．２２５ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．２７５ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．３２５ｍｇ／ｋｇ、０．３５ｍｇ／ｋｇ、０．３７５ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．４２５ｍｇ／ｋｇ、０．４５ｍｇ／ｋｇ、０．４７５ｍｇ／ｋｇ、または約０．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与することができる。前述の列挙された値に対する中間の値も、本発明の一部であるものとする。
処置計画
医薬組成物は、１日に１回投与しても良いし、またはｉＲＮＡは、１日の間に適切な間隔で２回または３回以上の部分用量を投与しても良いし、または放出制御製剤によって連続注入もしくは連続送達を用いても良い。この場合、各部分用量中に含まれるｉＲＮＡは、１日の総用量を達成するために相応に少なくしなければならない。用量単位は、例えば、数日の期間に亘ってｉＲＮＡの持続放出を提供する従来の持続放出製剤を用いて、数日間に亘る送達のために調合することもできる。持続放出製剤は、当分野で周知であり、かつ特定の部位での作用剤の送達に特に有用であり、例えば、本発明の作用剤と共に使用することができる。この実施形態では、用量単位は、対応する複数の日用量を含む。
他の実施形態では、医薬組成物の単回投与は、持続し得るため、次の投与は、３日間以下、４日間以下、もしくは５日間以下の間隔で、または１週間以下、２週間以下、３週間以下、もしくは４週間以下の間隔で行われる。本発明の一部の実施形態では、本発明の医薬組成物の単回投与は、１週間に１回行われる。本発明の他の実施形態では、本発明の医薬組成物の単回投与は、１カ月おきに行われる。
当業者であれば、限定されるものではないが、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の全体的な健康および／または年齢、および存在する他の疾患を含む特定の因子が、対象を効果的に処置するために必要な用量およびタイミングに影響を与え得ることが理解されよう。さらに、治療効果のある量の組成物での対象の処置は、１回の処置または一連の処置を含み得る。本発明に包含される個々のｉＲＮＡの有効量およびｉｎ ｖｉｖｏ半減期の推定は、従来の方法論を用いて行うことができる。
本発明に包含される個々のｉＲＮＡの有効量およびｉｎ ｖｉｖｏ半減期の推定は、適切な動物モデルを用いるｉｎ ｖｉｖｏ試験に基づいて行うこともできる。例えば、マウス遺伝学の進展により、様々なヒトの疾患、例えば、ＨＡＯ１の発現に関連した障害の研究のために多数のマウスモデルが作製されるようになった。このようなモデルは、ｉＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏ試験および治療有効量の決定に使用することができる。適切なマウスモデルは、当分野で公知であり、例えば、本明細書に記載される動物モデルを含む。
投与方法
本発明の医薬組成物は、局所投与もしくは全身処置が望まれるかどうかによって、および処置されるべき領域によって様々な方法で投与することができる。投与は、局所（例えば、経皮パッチ）、例えば粉末もしくはエアロゾルの噴霧機によるものを含む吸入または注入による経肺；気管内、鼻腔内、表皮および経皮、経口、または非経口であり得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹膜内もしくは筋肉内注射もしくは注入；例えば、植え込み装置による皮下；または、例えば、実質内、クモ膜下腔内、もしくは脳室内による頭蓋内の投与が含まれる。
ｉＲＮＡは、特定の組織、例えば、肝臓を標的とする方式で送達することができる。
製剤
本発明の医薬組成物としては、限定されるものではないが、溶液、エマルション、および製剤を含むリポソームが挙げられる。これらの組成物は、限定されるものではないが、既製の液体、自己乳化型固体、および自己乳化型半固体を含む様々な成分から調製することができる。
単位剤形で便利に提供することができる本発明の医薬製剤は、医薬産業で周知の従来の技術によって調製することができる。このような技術は、活性成分を医薬担体または賦形剤に結合させるステップを含む。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または微細化固体担体、または両方に均一かつ均密に結合させ、そして必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
本発明の組成物は、様々な可能な剤形、例えば、限定されるものではないが、タブレット、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、ソフトゲル、座薬、および浣腸剤のいずれかに製剤することができる。本発明の組成物は、水性、非水性、または混合媒体中での懸濁液として製剤することもできる。水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘度を高める物質をさらに含み得る。懸濁液は、安定剤も含み得る。
本発明の組成物は、経口投与用；非経口用、実質内（脳内）用、クモ膜下腔内用、脳室内もしくは肝臓内投与用、および／または局所投与用に製剤することができる。
経口投与用の組成物および製剤としては、粉末もしくは顆粒、微粒子、ナノ粒子、水もしくは非水性媒体中の懸濁液もしくは溶液、カプセル、ゲルカプセル、小袋、タブレット、またはミニタブレットが挙げられる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、または結合剤が望ましいであろう。一部の実施形態では、経口製剤は、本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡが１つ以上の浸透促進界面活性剤およびキレート剤と共に投与される経口製剤である。適切な界面活性剤としては、脂肪酸および／またはエステルまたはその塩、胆汁酸および／またはその塩が挙げられる。適切な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ−２４，２５−ジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。適切な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸塩、トリカプリン酸塩、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、またはこれらの薬学的に許容される塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。一部の実施形態では、浸透促進剤の組み合わせ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせられた脂肪酸／塩が使用される。例示的な１つの組み合わせは、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。さらなる浸透促進剤としては、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる。本発明で取り上げられるｄｓＲＮＡは、噴霧乾燥粒子を含む顆粒形態で、または微粒子もしくはナノ粒子を形成するために複合体化して、経口送達することができる。ｄｓＲＮＡ複合体形成剤としては、ポリアミノ酸；ポリイミン；ポリアクリレート；ポリアルキルアクリレート、ポリオキセタン（ｐｏｌｙｏｘｅｔｈａｎｅ）、ポリアルキルシアノアクリレート；カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびデンプン；ポリアルキルシアノアクリレート；ＤＥＡＥ誘導体化ポリイミン、プルラン、セルロース、およびデンプンが挙げられる。適切な複合体形成剤としては、キトサン、Ｎ−トリメチルキトサン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ−アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ−メタクリレート、ＤＥＡＥ−ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ−アクリルアミド、ＤＥＡＥ−アルブミン、およびＤＥＡＥ−デキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ、Ｌ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸−コ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤およびその調製は、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第６，８８７，９０６号明細書、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号明細書、および米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載されている。
非経口投与用、実質内（脳内）投与用、クモ膜下腔内投与用、脳室内投与用、または肝臓内投与用の組成物および製剤は、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加剤、例えば、限定されるものではないが、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容され得る担体または賦形剤も含み得る滅菌水溶液を含み得る。
局所投与用の医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液体、および粉末を含み得る。従来の医薬担体、水性、粉末、または油性基剤、および増粘剤などが、必要または望ましいであろう。被覆コンドームおよび手袋なども有用であり得る。適切な局所製剤としては、本発明で取り上げられるｉＲＮＡが、局所送達剤、例えば、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート剤、および界面活性剤と混合されている局所製剤が挙げられる。適切な脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロリフォスファチジルコリン（ｄｉｓｔｅａｒｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｃｈｏｌｉｎｅ）、陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、および陽イオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本発明で取り上げられるｉＲＮＡは、リポソーム内に封入しても良いし、またはリポソーム、特に陽イオン性リポソームと複合体を形成しても良い。あるいは、ｉＲＮＡは、脂質、特に陽イオン性脂質と複合体を形成することができる。適切な脂肪酸およびエステルとしては、限定されるものではないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸塩、トリカプリン酸塩、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１−モノカプリン酸、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１−２０アルキルエステル（例えば、ミリスチン酸イソプロピルＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、またはこれらの薬学的に許容される塩）が挙げられる。局所製剤は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，７４７，０１４号明細書に詳細に記載されている。
膜状分子集合体を含むｉＲＮＡ製剤
本発明の組成物および方法に使用されるｉＲＮＡは、膜状分子集合体、例えば、リポソームまたはミセルで送達するために製剤することができる。本明細書で使用される「リポソーム」という語は、少なくとも１つの二重層、例えば、１つの二重層または複数の二重層で構成された両親媒性脂質からなる小胞を指す。リポソームは、親油性材料および水性内部から形成される膜を有する単層小胞および多層小胞を含む。水性部分は、ＲＮＡｉ組成物を含む。親油性材料は、水性内部を水性外部から隔離し、この水性外部は、典型的にはＲＮＡｉ組成物を含まないが、一部の例では含むこともある。リポソームは、活性成分の作用部位への移送および送達に有用である。リポソーム膜は、生体膜に構造的に類似しているため、リポソームが組織に接触すると、リポソーム二重層が、細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞との一体化が進むと、ＲＮＡｉを含む内部水性成分が、細胞内に送達され、そこで、ＲＮＡｉは、標的ＲＮＡに特異的に結合して、ＲＮＡｉを媒介することができる。場合によって、リポソームは、特異的に標的化され、例えば、ＲＮＡｉを特定の細胞型に誘導する。
ＲＮＡｉ剤を含むリポソームは、様々な方法で調製することができる。一例では、リポソームの脂質成分は、洗剤に溶解され、これにより、ミセルが脂質成分で形成される。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン脂質または脂質コンジュゲートとすることができる。洗剤は、高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。例示的な洗剤としては、コール酸塩、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。次いで、ＲＮＡｉ剤調製物が、脂質成分を含むミセルに添加される。脂質上のカチオン基が、ＲＮＡｉ剤と相互作用して、ＲＮＡｉ剤の周りに凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、洗剤が、例えば、透析によって除去され、ＲＮＡｉ剤のリポソーム調製物が得られる。
必要に応じて、凝縮を補助する担体化合物を、例えば、制御された添加によって、凝縮反応中に添加することができる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）とすることができる。ｐＨを、凝縮に適するように調整することもできる。
送達ビヒクルの構造成分としてポリヌクレオチド／カチオン脂質複合体を包含する安定なポリヌクレオチド送達ビヒクルを形成するための方法が、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる国際公開第９６／３７１９４号パンフレットにさらに記載されている。リポソームの形成は、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３−７４１７，１９８７；米国特許第４，８９７，３５５号明細書；同第５，１７１，６７８号明細書；Ｂａｎｇｈａｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８，１９６５；Ｏｌｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ５５７：９，１９７９；Ｓｚｏｋａ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４，１９７８；Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４；Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７２８：３３９，１９８３；およびＦｕｋｕｎａｇａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７，１９８４に記載されている例示的な方法の１つ以上の態様も含み得る。送達ビヒクルとして使用するのに適切なサイズの脂質凝集体を調製するために一般的に使用される技術は、超音波処理および凍結融解と押し出しを含む（例えば、Ｍａｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ８５８：１６１，１９８６を参照されたい）。一貫して小さく（５０〜２００ｎｍ）比較的均一な凝集体が望ましい場合は、微小流動化を使用することができる（Ｍａｙｈｅｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７７５：１６９，１９８４）。このような方法は、ＲＮＡｉ剤調製物をリポソームの中にパッケージングするために容易に適合される。
リポソームは、大きく２つに分類される。陽イオン性リポソームは、負に帯電した核酸分子と相互作用して安定した複合体を形成する正に帯電したリポソームである。正に帯電した核酸／リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合して、エンドソーム内に取り込まれる。エンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームが破裂して、それらの内容物が細胞質内に放出される（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
ｐＨ感受性または負に帯電したリポソームは、核酸と複合体を形成するのではなく核酸を取り込む。核酸および脂質の両方が同じように帯電しているため、複合体の形成ではなく反発が起こる。とはいえ、一部の核酸が、これらのリポソームの水性内部に取り込まれる。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を培養中の細胞単層に送達するために使用されている。外来遺伝子の発現が標的細胞で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。
１つの重要な種類のリポソーム組成物は、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成することができる。アニオン性リポソーム組成物は、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、アニオン性融合性リポソームは、主として、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別の種類のリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば、大豆ＰＣおよび卵ＰＣなどから形成される。別の種類は、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
リポソームをｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで細胞に導入する他の方法の例として、米国特許第５，２８３，１８５号明細書；同第５，１７１，６７８号明細書；国際公開第９４／００５６９号パンフレット；同第９３／２４６４０号パンフレット；同第９１／１６０２４号パンフレット；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０，１９９４；Ｎａｂｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７，１９９３；Ｎａｂｅｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９，１９９２；Ｇｅｒｓｈｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３，１９９３；およびＳｔｒａｕｓｓ ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７，１９９２が挙げられる。
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系も、薬物の皮膚への送達におけるその有用性を決定するために試験された。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、シクロスポリンＡをマウスの皮膚の真皮に送達した。結果は、このような非イオン性リポソーム系が、シクロスポリンＡの皮膚の様々な層への堆積の促進に有効であることを示した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４（６）４６６）。
リポソームは、「立体的に安定した」リポソームも含み、本明細書で使用されるこの語は、リポソーム内に取り込まれると、特殊な脂質が欠如したリポソームと比較して循環寿命が長い、１つ以上のこのような特殊な脂質を含むリポソームを指す。立体的に安定したリポソームの例としては、（Ａ）リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、１つ以上の糖脂質、例えば、モノシアロガングリオシドＧＭ１を含むリポソーム、または（Ｂ）１つ以上の親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で誘導体化されるリポソームが挙げられる。いかなる特定の理論に拘束されることを望むものではないが、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含む立体的に安定したリポソームでは、これらの立体的に安定したリポソームの循環半減期の改善が、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取り込みの減少によるものであると当分野では考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
１つ以上の糖脂質を含む様々なリポソームは、当分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）が、モノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸、およびホスファチジルイノシトールのリポソームの血中半減期を改善する能力を報告した。これらの発見は、Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８，８５，６９４９）によって詳述された。共にＡｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．らに付与された国際公開第８８／０４９２４号パンフレットおよび米国特許第４，８３７，０２８号明細書は、（１）スフィンゴミエリンおよび（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号明細書（Ｗｅｂｂ ｅｔ ａｌ．）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームが、国際公開第９７／１３４９９号パンフレット（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ）に開示されている。
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合できるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、効率的には原形質膜と効率的に融合することができないが、ｉｎ ｖｉｖｏでマクロファージによって取り込まれるため、ＲＮＡｉ剤をマクロファージに送達するために使用することができる。
リポソームのさらなる利点としては：天然リン脂質から得られるリポソームが、生体適合性かつ生体分解性であること；リポソームが、種々の水溶性および脂溶性薬物を取り込むことができること；リポソームが、内部区画内に取り込まれたＲＮＡｉ剤を代謝および分解から保護できること（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ＲｉｅｇｅｒおよびＢａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）が挙げられる。リポソーム製剤の調製における重要な考慮すべき事項は、脂質表面の電荷、小胞サイズ、およびリポソームの水中体積である。
正に帯電した合成カチオン性脂質、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）を使用して、核酸と自然に相互作用して脂質−核酸複合体を形成する小型リポソームを形成することができ、この脂質−核酸複合体は、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合し、結果としてＲＮＡｉ剤を送達することができる（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８：７４１３−７４１７，１９８７、ならびにＤＯＴＭＡおよびそのＤＮＡとの使用が記載されている米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照されたい）。
ＤＯＴＭＡ類似体、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用して、ＤＮＡと複合体を形成する小胞を形成することができる。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、高度にアニオン性の核酸を生きた組織培養細胞に送達するための有効な作用剤であり、この組織培養細胞は、負に帯電したポリヌクレオチドと自然に相互作用して複合体を形成する正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む。十分に正に帯電したリポソームが使用されると、得られる複合体の正味荷電も正である。このように調製される正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自然に付着し、原形質膜に融合し、そして機能性核酸を、例えば、組織培養細胞に有効に送達する。別の市販のカチオン性脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３，３−（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄｉａｎａ）は、オレオイル部分が、エーテル結合ではなくエステルによって結合されているという点でＤＯＴＭＡとは異なる。
他の報告されているカチオン性脂質化合物は、例えば、２種類のうちの１種類の脂質にコンジュゲートして、化合物、例えば、５−カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５−カルボキシスペルミル−アミド（「ＤＰＰＥＳ」）を含むカルボキシスペルミンを含め、様々な部分にコンジュゲートしたものを含む（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号明細書を参照されたい）。
別のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソーム内に含められて製剤されたコレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）による脂質の誘導体を含む（Ｇａｏ， Ｘ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０，１９９１を参照されたい）。ポリリシンをＤＯＰＥにコンジュゲートさせることによって形成されたリポポリリジンは、血清の存在下でのトランスフェクションに有効であることが報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １０６５：８，１９９１）。特定の細胞株では、コンジュゲートカチオン性脂質を含むこのようなリポソームは、ＤＯＴＭＡ含有組成物よりも低い毒性を示し、かつより効率的なトランスフェクションを実現すると言われている。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥおよびＤＭＲＩＥ−ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適した他のカチオン性脂質は、国際公開第９８／３９３５９号明細書および同第９６／３７１９４号明細書に記載されている。
リポソーム製剤は、局所投与に特に適しており、リポソームには、他の製剤よりもいくつかの利点が存在する。このような利点は、投与された薬物の高い全身吸収に関連した副作用の低下、所望の標的における投与された薬物の蓄積の増加、およびＲＮＡｉ剤を皮膚に投与する能力が挙げられる。一部の実施では、リポソームは、ＲＮＡｉ剤を上皮細胞に送達するために、そしてＲＮＡｉ剤の皮膚組織、例えば、皮膚への浸透を促進するためにも使用される。例えば、リポソームは、局所的に適用することができる。リポソームとして製剤された薬物の皮膚への局所送達は実証されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，ｖｏｌ．２，４０５−４１０ ａｎｄ ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１９９２，２５９−２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２−６９０，１９８８；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ ５６：２６７−２７６．１９８７；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７−１７６，１９８７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１０１：５１２−５２７，１９８３；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１−７８５５，１９８７を参照されたい）。
非イオン性リポソーム系もまた、特に、非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系において、薬物の皮膚への送達における実用性を決定するために試験された。Ｎｏｖａｓｏｍｅ Ｉ（ジラウリル酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮に薬物を送達するために使用された。ＲＮＡｉ剤を含むこのような製剤は、皮膚障害を治療するのに有用である。
ＲＮＡｉを含むリポソームは、高度に変形可能に形成することができる。このような変形性は、リポソームの平均半径よりも小さい孔にリポソームが進入するのを可能にし得る。例えば、トランスファーソームは、変形可能なリポソームの１種である。トランスファーソームは、表面縁活性化因子、通常は界面活性剤を標準的なリポソーム組成物に添加することによって作製することができる。ＲＮＡｉ剤を含むトランスファーソームは、ＲＮＡｉ剤を皮膚内のケラチノサイトに送達するために、例えば、皮下注射によって送達することができる。無傷の哺乳動物の皮膚を通過するためには、脂質小胞は、適当な経皮勾配の影響下で、直径がそれぞれ５０ｎｍ未満の一連の微孔を通って通過しなければならない。加えて、脂質の特性により、このようなトランスファーソームは、自己最適化性（例えば、皮膚の孔の形状に適応すること）、自己修復性であり得ると共に、多くの場合、断片化されずに標的に到達することができ、しばしば自己負荷性（ｓｅｌｆ−ｌｏａｄｉｎｇ）であり得る。
本発明に適用可能な他の製剤は、２００８年１月２日出願の米国仮特許出願第６１／０１８，６１６号明細書；２００８年１月２日出願の同第６１／０１８，６１１号明細書；２００８年３月２６日出願の同第６１／０３９，７４８号明細書；２００８年４月２２日出願の同第６１／０４７，０８７号明細書；および２００８年５月８日出願の同第６１／０５１，５２８号明細書に記載されている。２００７年１０月３日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８０３３１号パンフレットにも、本発明に適用可能な製剤が記載されている。
トランスフェロソームは、さらに別のタイプのリポソームであり、かつ薬物送達ビヒクルの魅力的な候補である高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスフェロソームは、脂質小滴よりも小さい孔を容易に貫通できるほど高度に変形可能である液体小滴として説明することができる。トランスフェロソームは、トランスフェロソームが使用される環境、例えば、トランスフェロソームが自己最適化する（皮膚の孔の形状に適合する）、自己修復する、断片化することなく頻繁に標的に到達する、および多くの場合自己付加する環境に適応可能である。トランスフェロソームを形成するために、表面縁−活性化剤、通常は界面活性剤を標準的なリポソーム組成物に付加することが可能である。トランスフェロソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するために使用されている。血清アルブミンのトランスフェロソーム媒介送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注射として有効であることが示されている。
界面活性剤は、製剤、例えば、エマルション（マイクロエマルションを含む）およびリポソームにおいて広範な適用例が見出される。天然および合成の両方の多数の異なるタイプの界面活性剤の特性の分類および等級付けの最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（「頭部」としても知られている）の性質は、製剤に使用される異なる界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、この界面活性剤分子は、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、薬学的製品および化粧製品において幅広い用途が見出されており、広範囲のｐＨ値に対して使用可能である。一般に、これらのＨＬＢ値は、その構造によって２〜約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル、例えば、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーもこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスのうち最も一般的なメンバーである。
界面活性剤分子が、水に溶解または分散されたときに負の電荷を有する場合、この界面活性剤分子は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤としては、カルボン酸塩、例えば、石鹸、アシル乳酸塩、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル、例えば、硫酸アルキルおよび硫酸エトキシル化アルキル、スルホン酸塩、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アシルイセチオン酸塩、アシルタウレート、およびスルホコハク酸塩、ならびにリン酸塩が挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスのうち最も重要なメンバーは、硫酸アルキルおよび石鹸である。
界面活性剤分子が、水に溶解または分散されたときに正の電荷を有する場合、この界面活性剤分子は、カチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩およびエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩は、このクラスのうちで最も使用されるメンバーである。
界面活性剤分子が、正または負のいずれの電荷も有する能力がある場合、この界面活性剤分子は、両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびホスファチドが挙げられる。
薬物製品、製剤、およびエマルションにおける界面活性剤の使用が概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ”，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
本明細書で使用されるＲＮＡｉは、ミセル製剤としても提供することができる。「ミセル」は、本明細書では、特定の種類の分子集合体として定義され、この分子集合体では、両親媒性分子の全ての疎水性部分が内側を向き、親水性部分が周囲の水相に接触するように両親媒性分子が球体構造に構成されている。環境が疎水性である場合は、反対の構成で存在する。
経皮膜を通る送達に適した混合ミセル製剤は、ｓｉＲＮＡ組成物の水溶液とアルカリ金属Ｃ８〜Ｃ２２アルキル硫酸塩とミセル形成化合物との混合によって調製することができる。例示的なミセル形成化合物としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容され得る塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウレート、ルリヂサ油、月見草油、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンおよびその薬学的に許容され得る塩、グリセリン、ポリグリセリン、リジン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸塩、デオキシコール酸塩、およびこれらの混合物が挙げられる。ミセル形成化合物は、アルカリ金属アルキル硫酸塩と同時または添加後に、添加することができる。混合ミセルは、実質的にあらゆる種類の成分の混合で形成されるが、より小さいサイズのミセルを提供するためには激しい混合が行われる。
一方法では、ｓｉＲＮＡ組成物および少なくともアルカリ金属アルキル硫酸塩を含有する第１のミセル組成物が調製される。次いで、第１のミセル組成物が、少なくとも３種類のミセル形成化合物と混合されて混合ミセル組成物が形成される。別の方法では、ミセル組成物は、ｓｉＲＮＡ組成物とアルカリ金属アルキル硫酸塩と少なくとも１種類のミセル形成化合物と混合され、次いで、残りのミセル形成化合物を添加して激しく混合することによって調製される。
フェノールおよび／またはｍ−クレゾールを混合ミセル組成物に添加して、製剤を安定させて、細菌の増殖から保護することができる。あるいは、フェノールおよび／またはｍ−クレゾールは、ミセル形成成分と共に添加しても良い。等張剤、例えば、グリセリンを、混合ミセル組成物の形成後に添加しても良い。
ミセル製剤を噴霧として送達するために、製剤をエアロゾルディスペンサーに入れることができ、このディスペンサーに噴霧剤を充填する。加圧下の噴霧剤は、ディスペンサー内で液体の形態である。水相と噴霧剤相とが１つになる、即ち、１つの相のみが存在するように、成分比が調整される。２つの相が存在する場合、内容物の一部を、例えば、計量弁によってディスペンスする前にディスペンサーを振盪する必要がある。医薬品のディスペンス量が、計量弁から微細な霧状で噴霧される。
噴霧剤としては、水素含有クロロフルオロカーボン、水素含有フルオロカーボン、ジメチルエーテル、およびジエチルエーテルを挙げることができる。特定の実施形態では、ＨＦＡ １３４ａ（１，１，１，２テトラフルオロエタン）を使用しても良い。
必須成分の特定濃度を、比較的簡単な実験によって決定することができる。口腔からの吸収では、多くの場合、注射による投与または胃腸管を介した投与の投与量を、例えば、少なくとも２倍または３倍に増量するのが望ましい。
脂質粒子
本発明のｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、脂質製剤、例えば、ＬＮＰまたは他の核酸−脂質粒子内に完全に封入することができる。
本明細書で使用される「ＬＮＰ」という語は、安定した核酸−脂質粒子を指す。ＬＮＰは、陽イオン性脂質、非陽イオン性脂質、および粒子の凝集を防止する脂質（例えば、ＰＥＧ−脂質コンジュゲート）を含む。ＬＮＰは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に長い循環寿命を示し、かつ遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するため、全身適用例に非常に有用である。ＬＮＰは、ＰＣＴ国際公開特許第００／０３６８３号パンフレットに記載されている、封入された縮合剤−核酸複合体を含む「ｐＳＰＬＰ」を含む。本発明の粒子は、典型的には約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ〜約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に非毒性である。加えて、本発明の核酸−脂質粒子中に存在するときの核酸は、水溶液中でヌクレアーゼによる分解に対して耐性がある。核酸−脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号明細書；同第５，９８１，５０１号明細書；同第６，５３４，４８４号明細書；同第６，５８６，４１０号明細書；同第６，８１５，４３２号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書、およびＰＣＴ国際公開特許第９６／４０９６４号パンフレットに開示されている。
一実施形態では、脂質と薬物の比（質量／質量比（例えば、脂質とｄｓＲＮＡの比）は、約１：１〜約５０：１、約１：１〜約２５：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１の範囲である。上記の列挙された範囲に対する中間の範囲も、本発明の一部であると考えられる。
陽イオン性脂質は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（Ｉ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルカルバモイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｃ−ＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパンクロライド塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、または３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）またはその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル１−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエニル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）１，１’−（２−（４−（２−（（２−（ビス（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２−ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン−１−イル）エチルアザンジイル）ジドデカン−２−オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、またはこれらの混合物であり得る。陽イオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％、または約４０ｍｏｌ％を含み得る。
別の実施形態では、化合物２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランを使用して、脂質−ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製することができる。２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソランの合成は、参照により本明細書に組み入れられる、国際公開第２０１０／０４８５３６号パンフレットとして公開された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０６１８９７号明細書に記載されている。
一実施形態では、脂質−ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％ ２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン：１０％ ＤＳＰＣ：４０％ コレステロール：１０％ ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ（モルパーセント）を含み、粒径が６３．０±２０ｎｍであり、０．０２７のｓｉＲＮＡ／脂質である。
イオン化／非陽イオン性脂質は、限定されるものではないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはこれらの混合物を含む陰イオン性脂質または中性脂肪であり得る。非陽イオン性脂質は、コレステロールが含まれている場合、粒子中に存在する総脂質の約５ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％、または約５８ｍｏｌ％であり得る。
粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、限定されるものではないが、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、またはこれらの混合物を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質であり得る。ＰＥＧ−ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル（Ｃｉ４）、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）であり得る。粒子の凝集を防止するコンジュゲート脂質は、粒子中に存在する総脂質の０ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％、または約２ｍｏｌ％であり得る。
一部の実施形態では、核酸−脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０ｍｏｌ％〜約６０ｍｏｌ％、または約４８ｍｏｌ％のコレステロールをさらに含む。
一実施形態では、リピドイドＮＤ９８・４ＨＣｌ（ＭＷ １４８７）（参照により本明細書に組み入れられる、２００８年３月２６日出願の米国特許出願第１２／０５６，２３０号明細書を参照されたい）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、脂質−ｄｓＲＮＡナノ粒子（即ち、ＬＮＰ０１粒子）を調製することができる。それぞれエタノール中、ストック溶液を次のように調製することができる：ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ−セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。次いで、ＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ−セラミドＣ１６ストック溶液を、例えば、４２：４８：１０のモル比で混合することができる。混合脂質溶液を、最終エタノール濃度が約３５〜４５％、かつ最終酢酸ナトリウム濃度が約１００〜３００ｍＭとなるように（例えば、ｐＨ５の酢酸ナトリウム中で）水性ｄｓＲＮＡと混合することができる。脂質−ｄｓＲＮＡナノ粒子は、典型的には混合時に自然に生じる。所望の粒径分布によって、得られるナノ粒子混合物を、サーモバレル押出し機（ｔｈｅｒｍｏｂａｒｒｅｌ ｅｘｔｒｕｄｅｒ）、例えば、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）を用いてポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍのカットオフ）を通して押し出すことができる。場合によっては、押出しステップを省略することができる。エタノール除去および同時の緩衝液交換は、例えば、透析または接線流濾過によって達成することができる。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換することができる。ＬＮＰ０１製剤は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、国際公開第２００８／０４２９７３号パンフレットに記載されている。
さらなる例示的な脂質−ｄｓＲＮＡ製剤が表Ａに示されている。
Figure 2021019609
Figure 2021019609
表Ａの省略形は以下を含む：ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン；ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン；ＰＥＧ−ＤＭＧ：ＰＥＧ−ジジミリストイルグリセロール（Ｃ１４−ＰＥＧ、またはＰＥＧ−Ｃ１４）（平均２０００分子量のＰＥＧ）；ＰＥＧ−ＤＳＧ：ＰＥＧ−ジスチリルグリセロール（Ｃ１８−ＰＥＧ、またはＰＥＧ−Ｃ１８）（平均２０００分子量のＰＥＧ）；ＰＥＧ−ｃＤＭＡ：ＰＥＧ−カルバモイル−１，２−ジミリスチルオキシプロピルアミン（平均２０００分子量のＰＥＧ）。
製剤を含むＤＬｉｎＤＭＡ（１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロパン）は、参照により本明細書に組み入れられる、２００９年４月１５日出願の国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレットに記載されている。
製剤を含むＸＴＣは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、２００９年１月２９日出願の米国仮特許出願第６１／１４８，３６６号明細書、２００９年３月２日出願の同第６１／１５６，８５１号明細書、２００９年６月１０日出願の米国仮特許出願、２００９年７月２４日出願の同第６１／２２８，３７３号明細書、２００９年９月３日出願の同第６１／２３９，６８６明細書、２０１０年１月２９日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４号明細書に記載されている。
製剤を含むＭＣ３は、例えば、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる、２０１０年６月１０日出願の米国特許出願公開第２０１０／０３２４１２０号明細書に記載されている。
製剤を含むＡＬＮＹ−１００は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる、２００９年１１月１０日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号明細書に記載されている。
製剤を含むＣ１２−２００は、参照により本明細書に組み入れられる、２００９年５月５日出願の米国仮特許出願第６１／１７５，７７０号明細書および２０１０年５月５日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７号明細書に記載されている。
さらなる製剤
ｉ．エマルション
本発明の組成物は、エマルションとして調製し、製剤することができる。エマルションは、典型的には、一方の液体が、通常は直径が０．１μｍを超える小滴の形態で他方の液体に分散されたの不均一系である（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照されたい）。エマルションは、均密に混合されて互いに分散された２つの不混和液体相を含む二相系の場合が多い。一般に、エマルションは、油中水（ｗ／ｏ）型または水中油（ｏ／ｗ）型であり得る。水相が微細化されて、微小滴として大量の油相に分散される場合は、得られる組成物は、油中水（ｗ／ｏ）型エマルションと呼ばれる。あるいは、油相が微細化されて、大量の水相に微小滴として分散される場合は、得られる組成物は、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと呼ばれる。エマルションは、分散相に加えてさらなる成分、および活性剤を含み得、この活性剤は、水相、油相中に溶液として、またはそれ自体が別個の相として存在し得る。医薬賦形剤、例えば、乳化剤、安定剤、染料、および酸化防止剤が、必要に応じてエマルション中に存在しても良い。医薬エマルションは、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）型および水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）型エマルションなどの場合に、３つ以上の相から構成される多重エマルションでもあり得る。このような複合体製剤は、単純な二相エマルションにはない特定の利点を提供する場合が多い。ｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小さい水滴を包囲する多重エマルションは、ｗ／ｏ／ｗエマルションを構成する。同様に、油性連続相で安定化された水の小球に包囲された油滴の系は、ｏ／ｗ／ｏエマルションとなる。
エマルションは、熱力学的安定性が殆どまたは全くないことによって特徴付けられる。多くの場合、エマルションの分散または不連続相は、外部または連続相の中で十分に分散され、乳化剤または製剤の粘度によってこの形態に維持される。エマルションのいずれかの相は、エマルション型軟膏基剤およびクリームの場合のように半固体または固体であり得る。エマルションを安定化させる他の手段は、エマルションのいずれかの相に含めることができる乳化剤の使用を伴う。乳化剤は、大きく４つの種類に分類することができる：合成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収性基剤、および微細分散固体（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。
表面活性剤としても知られている合成界面活性剤は、エマルションの製剤において広範な適用例が見出され、文献で考察されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。界面活性剤は、典型的には両親媒性であり、かつ親水性タンパク質および疎水性タンパク質を含む。界面活性剤の親水性の疎水性に対する比率は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と呼ばれ、製剤の調製における界面活性剤の分類および選択において有益な手段である。界面活性剤は、親水性基の性質：非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、および両性に基づいて異なるクラスに分類することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ａｌｌｅｎ， ＬＶ．， Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．， ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．， ２００４， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ （８ｔｈ ｅｄ．）， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ， ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ， Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．）， １９８８， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｖｏｌｕｍｅ １， ｐ． ２８５を参照されたい）。
エマルション製剤に使用される天然に存在する乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン、およびアカシアが挙げられる。吸収性基剤、例えば、脱水ラノリンおよび親水性ワセリンは、親水性を有するため、水を吸収してｗ／ｏエマルションを形成し、なお半固体の硬度を維持することができる。微細化された固体は、特に界面活性剤と組み合わせて、粘稠製剤において良好な乳化剤としても使用されている。これらの例としては、極性無機固体、例えば、重金属水酸化物、非膨張性粘土、例えば、ベントナイト、アタパルガイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウム、顔料、および非極性固体、例えば、炭素またはグリセリルトリステアレートが挙げられる。
多種多様な非乳化材料も、エマルション製剤に含められ、エマルションの特性に寄与している。これらの例としては、脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、湿潤剤、親水性コロイド、防腐剤、および酸化防止剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
親水性コロイドまたは親水コロイドとしては、天然に存在するゴムおよび合成ポリマー、例えば、多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これらは、水中で分散または膨張して、分散相の小滴の周りに強い界面膜を形成して、外部相の粘度を高めることによってエマルションを安定させるコロイド溶液を形成する。
エマルションは、多くの場合、微生物の成長を容易に支え得る多数の成分、例えば、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびホスファチドを含むため、これらの製剤は、防腐剤を含む場合が多い。エマルション製剤に含められる、一般的に使用される防腐剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。酸化防止剤も、製剤の劣化を防止するためにエマルション製剤に一般的に添加される。使用される酸化防止剤は、フリーラジカルスカベンジャー、例えば、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、または還元剤、例えば、アスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウム、および抗酸化相乗剤、例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチンであり得る。
皮膚、経口、および非経口経路によるエマルション製剤の適用、ならびにそれらの製造の方法が、文献で考察されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。経口送達用のエマルション製剤は、製剤の容易さならびに吸収およびバイオアベイラビリティーの観点からの有効性のために、非常に広範に使用されている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照されたい）。ミネラルオイルベースの下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養剤は、特に、ｏ／ｗエマルションとして一般的に経口投与されている材料である。
ｉｉ．マイクロエマルション
本発明の一実施形態では、ｉＲＮＡおよび核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤される。マイクロエマルションは、単一光学的等方性および熱力学的に安定な溶液である水、油、および両親媒性物質の系として定義することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５を参照されたい）。典型的には、マイクロエマルションは、まず水性界面活性剤溶液中に油を分散させ、次いで十分な量の第４の成分、一般的には中間鎖長アルコールを添加して透明な系を形成することによって調製される系である。従って、マイクロエマルションは、表面活性分子の界面膜によって安定化される２つの不混和液体の熱力学的に安定した等方的に透明な分散液であるとしても説明されている（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，ｉｎ：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １８５−２１５）。マイクロエマルションは、３〜５の成分の組み合わせによって一般的に調製され、これらの成分としては、油、水、界面活性剤、補助界面活性剤、および電解質が挙げられる。マイクロエマルションが油中水（ｗ／ｏ）型であるかまたは水中油（ｏ／ｗ）型であるかは、使用される油および界面活性剤の特性ならびに界面活性剤分子の極性頭部および炭化水素尾部の構造および幾何学的パッキングによって決まる（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
相図を利用した現象論的アプローチは、広範に研究されており、どのようにマイクロエマルションを製剤するかという包括的な知識を当業者に与えた（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ （Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５を参照されたい）。従来のエマルションと比較すると、マイクロエマルションは、自発的に形成される、熱力学的に安定な小滴の製剤中に水不溶性薬物を溶解するという利点を提供する。
マイクロエマルションの調製に使用される界面活性剤としては、限定されるものではないが、単独または補助界面活性剤と組み合わせられる、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、脂肪酸ポリグリセロールエステル、モノラウリン酸テトラグリセロール（ＭＬ３１０）、モノオレイン酸テトラグリセロール（ＭＯ３１０）、モノオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ３１０）、ペンタオレイン酸ヘキサグリセロール（ＰＯ５００）、モノカプリン酸デカグリセロール（ＭＣＡ７５０）、モノオレイン酸デカグリセロール（ＭＯ７５０）、セスキオレイン酸デカグリセロールセ（ＳＯ７５０）、デカオレイン酸デカグリセロール（ＤＡＯ７５０）が挙げられる。補助界面活性剤、通常は、短鎖アルコール、例えば、エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノールは、界面活性剤分子間に形成された間隙空間により、界面活性剤膜に浸透し、結果として不規則な膜を形成することによって界面の流動性を高めるように作用する。しかしながら、マイクロエマルションは、補助界面活性剤を使用せずに調製することができ、アルコールフリーの自己乳化マイクロエマルション系は、当分野で公知である。水相は、典型的には、限定されるものではないが、水、薬物の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得る。油相は、限定されるものではないが、材料、例えば、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリド、ポリオキシエチレン化脂肪酸グリセリルエステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコーン油を含み得る。
マイクロエマルションは、薬物可溶化および薬物吸収の増大の観点から特に重要である。脂質ベースのマイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏの両方）は、ペプチドを含む、薬物の経口バイオアベイラビリティーを高めるために提案されている（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号明細書；同第７，０６３，８６０号明細書；同第７，０７０，８０２号明細書；同第７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３， １３，２０５を参照されたい）。マイクロエマルションは、改善された薬物可溶化、酵素的加水分解による薬物の保護、界面活性剤による膜流動性および透過性の変化に起因する薬物吸収の促進の可能性、調製の容易さ、固形用量形態よりも容易な経口投与、改善された臨床的有効性、および毒性の低減（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号明細書；同第７，０６３，８６０号明細書；同第７，０７０，８０２号明細書；同第７，１５７，０９９号明細書；Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３を参照されたい）の利点を提供する。多くの場合、マイクロエマルションは、それらの成分が周囲温度で混合されたときに自然に形成され得る。これは、熱不安定性の薬物、ペプチド、またはｉＲＮＡを製剤する際に特に有利であり得る。マイクロエマルションはまた、化粧品および医薬の適用例の双方において活性成分の経皮送達に有効である。本発明のマイクロエマルション組成物および製剤は、胃腸管からのｉＲＮＡおよび核酸の全身吸収の増大を促進すると共に、ｉＲＮＡおよび核酸の局所細胞の取り込みを改善することが期待されている。
本発明のマイクロエマルションはまた、製剤の特性を改善して本発明のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を増大するために、添加成分および添加剤、例えば、ソルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ ３）、ラブラゾール、および浸透促進剤も含み得る。本発明のマイクロエマルションで使用される浸透促進剤は、５つの広い分類−界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の１つに属するとして分類することができる（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらクラスのそれぞれは上述されている。
ｉｉｉ．微粒子
本発明のＲＮＡｉ剤は、粒子、例えば、微粒子内に含めることができる。微粒子は、噴霧乾燥によって形成することができるが、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの技術の組み合わせを含む他の方法によって形成することもできる。
ｉｖ．浸透促進剤
一実施形態では、本発明は、核酸、特にｉＲＮＡの動物の皮膚への効率的な送達を行うために様々な浸透促進剤を利用する。殆どの薬物は、イオン化形態および非イオン化形態の両方で溶液中に存在する。しかしながら、通常は、脂溶性薬物または親油性薬物のみが、細胞膜を容易に通過する。非親油性薬物でも、通過されるべき細胞膜が浸透促進剤で処置されると、細胞膜を通過できることが見出された。非親油性薬物の細胞膜を通過する拡散の手助けに加えて、浸透促進剤は、親油性薬物の透過性も促進する。
浸透促進剤は、５つの広い分類、即ち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤の１つに属するとして分類することができる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照されたい）。浸透促進剤の上述のクラスのそれぞれは、以下に詳細に説明される。
界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液に溶解されると、この水溶液の表面張力またはこの水溶液と別の液体との間の界面張力を減少させ、その結果、粘膜を通るｉＲＮＡの吸収を促進する化学物質である。胆汁酸塩および脂肪酸に加えて、これらの浸透促進剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）：および ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ，ｓｕｃｈ ａｓ ＦＣ−４３．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２を参照されたい）。
浸透促進剤として作用する様々な脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸塩、トリカプリン酸、塩モノオレイン（１−モノオレイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ１−２０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、およびｔ−ブチル）、ならびにそれらのモノおよびジグリセリド（例えば、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩など）が挙げられる（例えば、Ｔｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４を参照されたい）。
胆汁の生理学的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５を参照されたい）。様々な天然の胆汁塩およびその合成の誘導体は、浸透促進剤として作用する。従って、「胆汁塩」という語は、自然に存在する胆汁の任意の成分、およびそれらの任意の合成誘導体を含む。適切な胆汁塩としては、例えば、コール酸（またはその薬学的に許容され得るナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）が挙げられる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ， Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３を参照されたい）。
本発明に関連して使用されるキレート剤は、金属イオンと錯体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、結果として粘膜を介したｉＲＮＡの吸収を促進する化合物として定義することができる。本発明における浸透促進剤としてのキレート剤の使用に関して、キレート剤は、最も特徴付けられたＤＮＡヌクレアーゼが、触媒のための二価の金属イオンを必要とし、従って、キレート剤によって阻害されるため、ＤＮａｓｅ阻害剤としても作用するというさらなる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。適切なキレート剤としては、限定されるものではないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）二ナトリウム、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸、およびホモバニリン酸塩）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９、およびβ−ジケトンのＮ−アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（例えば、Ｋａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１を参照されたい）。
本明細書中で使用される非キレート性非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート剤または界面活性剤として僅かな活性しか示さないが、それでも消化器粘膜を通るｉＲＮＡの吸収を促進する化合物として定義することができる（例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３を参照されたい）。このクラスの浸透促進剤としては、例えば、不飽和環式尿素、１−アルキル−アルカノン誘導体および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）；ならびに非ステロイド抗炎症剤、例えば、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾンが挙げられる（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９， ６２１−６２６）。
細胞レベルでｉＲＮＡの取り込みを促進する作用剤も、本発明の医薬組成物および他の組成物に添加することができる。例えば、陽イオン性脂質、例えば、リポフェクチン（Ｊｕｎｉｃｈｉらによる米国特許第５，７０５，１８８号明細書）、陽イオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子、例えば、ポリリジン（ＬｏｌｌｏらによるＰＣＴ国際特許ＷＯ９７／３０７３１）も、ｄｓＲＮＡの細胞取り込みを促進することが知られている。市販のトランスフェクション試薬の例としては、例えば、特に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ； Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰリポソームトランスフェクション試薬（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲリポソームトランスフェクション試薬（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−２０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）−５０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＴｒａｎｓＰａｓｓａ Ｄ１トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２トランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、Ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）トランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ−Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。
グリコール、例えば、エチレングリコールおよびプロピレングリコール、ピロール、例えば、２−ピロール、アゾン、ならびにテルペン、例えば、リモネンおよびメントンを含む他の試薬を、投与される核酸の浸透を促進するために利用することができる。
ｖ．担体
本発明の特定の組成物は、製剤中に担体化合物も含む。本明細書中で使用される担体化合物」または「担体」は、核酸またはそれらの類似体を指すことがあり、これらは、不活性である（即ち、それ自体生物活性を有していない）が、例えば、生物学的に活性な核酸の分解または循環からのその除去の促進によって生物学的活性を有する核酸のバイオアベイラビリティーを低下させるｉｎ ｖｉｖｏプロセスにより核酸として認識される。核酸と担体化合物の同時投与は、典型的には後者の物質が過剰であり、恐らく共通の受容体に対する担体化合物と核酸との間の競合により、肝臓、腎臓、または他の体外循環貯蔵部で回収される核酸の量が実質的に減少し得る。例えば、肝臓組織における部分的にホスホロチオエートのｄｓＲＮＡの回収率は、ポリイノシン酸、硫酸デキストラン、ポリシチジン酸、または４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と同時投与されると低下し得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ＆Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３）。
ｖｉ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、「医薬担体」または「賦形剤」は、薬学的に許容され得る溶媒、懸濁剤、または動物に１つ以上の核酸を送達するためのその他の薬理学的に不活性なビヒクルである。賦形剤は、液体でも固体でも良く、核酸および所与の医薬組成物の他の成分と組み合わされる場合は、所望の嵩、粘稠度などを提供するように考慮した、計画された投与方式で選択される。典型的な医薬担体としては、限定されるものではないが、結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶性セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウムなど）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属、水素化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
核酸と有害に反応しない、非経口投与に適切な薬学的に許容され得る有機または無機賦形剤も、本発明の組成物の製剤に使用することができる。適切な薬学的に許容され得る担体としては、限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
核酸の局所投与用の製剤としては、限定されるものではないが、滅菌および非滅菌水溶液、一般的な溶媒、アルコール中の非水溶液、または液体もしくは固体油ベース中の核酸溶液を挙げることができる。これらの溶液は、緩衝剤、希釈剤、および他の適切な添加剤も含み得る。核酸と有害に反応しない、非経口投与に適切な薬学的に許容され得る有機または無機賦形剤を使用することができる。
適切な薬学的に許容され得る賦形剤としては、限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
ｖｉｉ．他の成分
本発明の組成物は、医薬組成物中に従来見られる他のアジュバント成分を、当分野で確立された使用レベルでさらに含み得る。従って、例えば、この組成物は、さらなる適合性の薬学的に活性な物質、例えば、痒み止め、収斂薬、局所麻酔剤、もしくは抗炎症剤を含み得るか、または本発明の組成物の様々な剤形の物理的な製剤に有用なさらなる物質、例えば、染料、香味剤、防腐剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤を含み得る。しかしながら、このような物質は、添加されたときに本発明の組成物の成分の生物学的活性を過度に阻害するべきではない。これらの製剤は、安定化させることができ、所望に応じて、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤、例えば、滑沢剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝剤、着色料、香味剤、および／または芳香物質などと混合することができる。
水性懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む、懸濁液の粘性を増加させる物質を含み得る。懸濁液は、安定剤も含み得る。
一部の実施形態では、（ａ）１つ以上のｉＲＮＡ化合物、および（ｂ）非ＲＮＡｉ機構によって機能し、かつ処置、例えば、ＰＨ１に有用である１つ以上の作用剤を含む、本発明で取り上げられる医薬成物が提供される。
組成物の試験
このような化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が致死する用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療効果のある用量）を決定するために、細胞培養または実験動物での標準的な薬学的な手順によって決定することができる。毒作用と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、これは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトに使用される用量の範囲の処方に使用することができる。本発明における、本明細書で取り上げられる組成物の用量は、一般的に、殆どまたは全く毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。用量は、利用される剤形および利用される投与経路によってこの範囲内で様々であり得る。本発明で取り上げられる方法で使用される任意の化合物では、治療効果のある用量を細胞培養アッセイからまず推定することができる。用量は、細胞培養で決定されるＩＣ５０（即ち、症状の半数最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を有する化合物、または適切である場合はこのＩＣ５０を有する標的配列（例えば、ポリペプチドの濃度の低下を達成する）のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルで処方することができる。このような情報は、ヒトに有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
これらの投与に加えて、上記のように、本発明で取り上げられるｉＲＮＡを、鉄過剰負荷によって媒介され、かつＨＡＯ１の発現の阻害によって処置することができる病理学的プロセスの処置に有効な他の既知の作用剤と組み合わせて投与することができる。いずれの場合も、投与する医師は、当分野で公知のまたは本明細書に記載の有効性の標準的な測定を用いて観察された結果に基づいてｉＲＮＡの投与の量およびタイミングを調整することができる。
Ｖ．ＨＡＯ１の発現を阻害する方法
本発明は、細胞でのＨＡＯ１（ヒドロキシ酸オキシダーゼ１）の発現を阻害する方法を提供する。この方法は、細胞でのＨＡＯ１の発現を阻害するのに有効な量のＲＮＡｉ剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤を細胞に接触させ、これにより細胞でのＨＡＯ１の発現を阻害するステップを含む。
細胞への二本鎖ＲＮＡｉ剤の接触を、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができる。ｉｎ ｖｉｖｏで細胞にＲＮＡｉ剤を接触させるステップは、対象、例えば、ヒト対象の体内の細胞または細胞群にＲＮＡｉ剤を接触させるステップを含む。ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの接触させる方法の組み合わせも可能である。接触は、上述のように直接的または間接的に行うことができる。さらに、細胞を接触させるステップは、本明細書に記載のまたは当分野で公知の任意のリガンドを含む標的リガンドによって達成することができる。一部の実施形態では、標的リガンドは、炭水化物部分、例えば、ＧａｌＮＡｃ３リガンド、またはＲＮＡｉ剤を目的の部位、例えば、対象の肝臓に誘導するその他のリガンドである。
本明細書で使用される「阻害する」という語は、「低下させる」、「サイレンシングする」、「下方制御する」、および他の同様の語と互換的に使用され、任意のレベルの阻害を含む。
「ＨＡＯ１の発現を阻害する」という句は、任意のＨＡＯ１遺伝子（例えば、マウスＨＡＯ１遺伝子、ラットＨＡＯ１遺伝子、サルＨＡＯ１遺伝子、またはヒトＨＡＯ１遺伝子）およびＨＡＯ１遺伝子の変異体または突然変異体の発現を阻害することを指すものとする。従って、ＨＡＯ１遺伝子は、遺伝子操作された細胞、細胞群、または生物との関連における野生型ＨＡＯ１遺伝子、突然変異体ＨＡＯ１遺伝子、またはトランスジェニックＨＡＯ１遺伝子であり得る。
「ＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害する」は、ＨＡＯ１遺伝子の任意のレベルの阻害、例えば、ＨＡＯ１遺伝子の発現の少なくとも部分的な抑制を含む。ＨＡＯ１遺伝子の発現は、ＨＡＯ１遺伝子の発現に関連した任意の変数のレベル、例えば、ＨＡＯ１ ｍＲＮＡのレベル、ＨＡＯ１タンパク質のレベル、またはこのレベルの変化に基づいて評価することができる。このレベルは、例えば、対象に由来するサンプルを含む、個々の細胞または細胞群で評価することができる。
阻害は、ＨＡＯ１の発現に関連した１つ以上の変数のコントロールレベルに対する絶対または相対レベルの低下によって評価することができる。コントロールレベルは、当分野で利用されるあらゆる種類のコントロールレベル、例えば、投薬前基準レベル、または未処置もしくはコントロール（例えば、緩衝液のみのコントロールまたは不活性剤のコントロール）で処置された類似の対象、細胞、もしくはサンプルから決定されるレベルであっても良い。
本発明の方法の一部の実施形態では、ＨＡＯ１遺伝子の発現は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％阻害される。
ＨＡＯ１遺伝子の発現の阻害は、第１の細胞または細胞群（このような細胞は、例えば、対象に由来するサンプル中に存在し得る）によって発現されるｍＲＮＡの量の減少によって示すことができる。この第１の細胞または細胞群は、ＨＡＯ１遺伝子が記述され、かつＨＡＯ１遺伝子の発現が、第１の細胞または細胞群と実質的に同一であるが処置されていない第２の細胞または細胞群（コントロール細胞）と比較して阻害されるように処置されている（例えば、１つまたは複数の細胞に本発明のＲＮＡｉ剤を接触させることによって、または本発明のＲＮＡｉ剤を、この細胞が存在する、もしくは存在した対象に投与することによって）。一部の実施形態では、この阻害は、以下の式を用いて、コントロール細胞におけるｍＲＮＡのレベルのパーセンテージとして、処置された細胞におけるｍＲＮＡのレベルを表すことによって評価される：
Figure 2021019609
あるいは、ＨＡＯ１遺伝子の発現の阻害は、ＨＡＯ１遺伝子の発現に機能的に連結されたパラメーター、例えば、ＨＡＯ１タンパク質の発現の低下に関して評価することができる。ＨＡＯ１遺伝子サイレンシングは、構成的にまたはゲノム操作によりＨＡＯ１を発現する任意の細胞で、当分野で公知の任意のアッセイによって決定することができる。肝臓が、ＨＡＯ１の発現の主な部位である。発現の他の重要な部位には、腎臓および子宮が含まれる。
ＨＡＯ１タンパク質の発現の阻害は、細胞または細胞群によって発現されるＨＡＯ１タンパク質のレベル（例えば、対象に由来するサンプルで発現されるタンパク質のレベル）の低下によって示すことができる。ｍＲＮＡの抑制の評価について上記説明されたように、処置された細胞または細胞群におけるタンパク質の発現レベルの阻害は、コントロール細胞またはコントロール細胞群におけるタンパク質のレベルのパーセンテージとして同様に表すことができる。
ＨＡＯ１遺伝子の発現の阻害を評価するために使用できるコントロール細胞またはコントロール細胞群は、本発明のＲＮＡｉ剤に接触されていない細胞または細胞群を含む。例えば、コントロール細胞またはコントロール細胞群は、対象がＲＮＡｉ剤で処置される前の個々の対象（例えば、ヒトまたは動物対象）に由来し得る。
細胞または細胞群によって発現されるＨＡＯ１ ｍＲＮＡのレベルを、ｍＲＮＡの発現を評価するために当分野で公知の任意の方法を用いて決定することができる。一実施形態では、サンプルにおけるＨＡＯ１の発現レベルは、転写されたポリヌクレオチド、例えば、ＨＡＯ１遺伝子のｍＲＮＡ、またはその一部を検出することによって決定される。ＲＮＡは、ＲＮＡ抽出技術、例えば、酸性フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ； Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）、またはＰＡＸｇｅｎｅ （ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて細胞から抽出することができる。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイ形式としては、核ランオンアッセイ（ｎｕｃｌｅａｒ ｒｕｎ−ｏｎ ａｓｓａｙ）、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ分解酵素保護アッセイ（Ｍｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：７０３５）、ノーザンブロット法、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、およびマイクロアッセイ分析が挙げられる。
一実施形態では、ＨＡＯ１の発現レベルは、核酸プローブを用いて決定される。本明細書で使用される「プローブ」という語は、特定のＨＡＯ１に選択的に結合することができるあらゆる分子を指す。プローブは、当業者が合成しても良いし、または適切な生物学的標本に由来しても良い。プローブは、標識されるように特別にデザインしても良い。プローブとして利用することができる分子の例として、限定されるものではないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機分子が挙げられる。
単離ｍＲＮＡを、限定されるものではないが、サザン分析、ノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析、およびプローブアッセイを含むハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイに使用することができる。ｍＲＮＡレベルの決定のための１つの方法では、単離ｍＲＮＡを、ＨＡＯ１ ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸分子（プローブ）に接触させる。一実施形態では、ｍＲＮＡを、固体表面に固定し、例えば、単離ｍＲＮＡをアガロースゲル上を移動させてｍＲＮＡをゲルから膜、例えば、ニトロセルロースに移すことによってプローブに接触させる。代替の実施形態では、プローブを固体表面に固定し、ｍＲＮＡを、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイのプローブに接触させる。当業者であれば、ＨＡＯ１ ｍＲＮＡのレベルの決定に使用するために公知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適応させることができる。
サンプルにおけるＨＡＯ１の発現レベルを決定するための代替の方法では、サンプルにおける、例えば、ｍＲＮＡの核酸増幅および／または逆転写酵素（ｃＤＮＡを調製するため）のプロセスが、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７，米国特許第４，６８３，２０２号明細書に記載されている実験の実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ （１９９１） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９−１９３）、自立的配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−Ｂｅｔａ Ｒｅｐｌｉｃａｓｅ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号明細書）、または任意の他の核酸増幅法によって行われ、続いて、当業者に周知の技術を用いて増幅された分子の検出が行われる。これらの検出スキームは、このような分子の存在数が非常に少ない場合は、核酸分子の検出に特に有用である。本発明の特定の態様では、ＨＡＯ１の発現レベルは、定量蛍光ＲＴ−ＰＣＲ（即ち、ＴａｑＭａｎ（商標）システム）によって決定される。
ＨＡＯ１ ｍＲＮＡの発現レベルは、膜ブロット（ハイブリダイゼーション分析に使用されるようなもの、例えば、ノーザン、サザン、およびドット）、またはマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズ、もしくはファイバー（または結合した核酸を含む任意の固体支持体）を用いて監視することができる。参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，７７０，７２２号明細書、同第５，８７４，２１９号明細書、同第５，７４４，３０５号明細書、同第５，６７７，１９５号明細書、および同第５，４４５，９３４号明細書を参照されたい。ＨＡＯ１の発現レベルの決定は、溶液中の核酸プローブを使用することも含み得る。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡの発現レベルは、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイまたはリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて評価される。このような方法の使用は、本明細書に記載される実施例で説明され、例示される。
ＨＡＯ１タンパク質の発現レベルは、タンパク質レベルの測定用の当分野で公知の任意の方法を用いて決定することができる。このような方法としては、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散クロマトグラフィー、液体またはゲル沈降反応、吸光分光法、比色分析、分光学的定量法、フローサイトメトリー、免疫拡散法（一元または二重）、免疫電気泳動法、ウェスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光分析、および電気化学発光分析などが挙げられる。
本明細書で使用される「サンプル」という語は、対象から単離された同様の液体、細胞、または組織の集合体、および対象の体内に存在する液体、細胞、または組織を指す。生体液の例としては、血液、血清および漿膜液、血漿、リンパ液、尿、脳脊髄液、唾液、および眼液などが挙げられる。組織サンプルは、組織、器官、または局所領域からのサンプルを含み得る。例えば、サンプルは、特定の器官、器官の一部、またはこれらの器官内の液体もしくは細胞に由来し得る。特定の実施形態では、サンプルは、肝臓（例えば、全肝または肝臓の特定の部分、または肝臓の特定のタイプの細胞、例えば、肝細胞など）に由来し得る。一部の実施形態では、「対象に由来するサンプル」は、対象から得られた血液または血漿を指す。さらなる実施形態では、「対象に由来するサンプル」は、対象に由来する肝組織を指す。
本発明の方法の一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、このＲＮＡｉ剤が対象の体内の特定の部位に送達されるように対象に投与される。ＨＡＯ１の発現の阻害は、対象の体内の特定の部位からの液体または組織に由来するサンプル中のＨＡＯ１ ｍＲＮＡまたはＨＡＯ１タンパク質のレベルの測定またはレベルの変化を用いて評価することができる。一部の実施形態では、この部位は肝臓である。この部位はまた、前述の部位のいずれか１つからの細胞の小区分又は小群であり得る。この部位は、特定のタイプの受容体を発現する細胞も含み得る。
ＶＩ．ＨＡＯ１関連障害を治療または防止するための方法
本発明は、ＨＡＯ１遺伝子の発現によって調節することができる疾患および状態を処置または防止するための方法も提供する。例えば、本明細書に記載される組成物を使用して、ＰＨ１に関連したあらゆる障害を処置することができる。
疾患の処置または予防の有効性は、例えば、疾患の進行、疾患の緩解、症状の重症度、傷みの軽減、生活の質、治療効果を維持するために必要な薬剤の用量、疾患マーカーのレベル、または予防のために処置されるもしくは標的とされる所与の疾患に適切なその他の測定可能なパラメーターの測定によって評価することができる。このようなパラメーターのいずれか１つまたはパラメーターの任意の組み合わせの測定によって処置または予防の有効性を監視することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
処置または予防の効果は、疾患状態の１つ以上のパラメーターにおける統計的に有意な改善が存在する場合に、または通常であれば予想され得る症状の悪化もしくは発症が起きないことによって明らかになる。一例として、疾患の測定可能なパラメーターにおける少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％以上の有利な変化は、有効な処置であることを示唆し得る。所与のｉＲＮＡ薬物の有効性またはこの薬物の処方も、当分野で公知の所与の疾患の実験動物モデルを用いて評価することができる。実験動物モデルを用いる場合、処置の有効性は、マーカーまたは症状における統計的に有意な減少が観察された場合に明らかになる。
あるいは、有効性は、臨床的に許容される疾患の重症度の評価尺度に基づいた診断である、当業者によって決定される疾患の重症度の低下によって測定することができる。
本発明の方法の一部の実施形態では、ＨＡＯ１の発現は、長期間、例えば、少なくとも１週間、２週間、３週間、または４週間、またはそれ以上に亘って減少する。例えば、特定の場合には、ＨＡＯ１遺伝子の発現は、本明細書に記載されるｉＲＮＡ剤の投与によって少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または１００％抑制される。一部の実施形態では、ＨＡＯ１遺伝子は、ｉＲＮＡ剤の投与によって少なくとも約６０％、７０％、または８０％抑制される。一部の実施形態では、ＨＡＯ１遺伝子は、二本鎖オリゴヌクレオチドの投与によって少なくとも約８５％、９０％、または９５％抑制される。別の実施形態では、ＨＡＯ１遺伝子は、投与後７日間、１０日間、２０日間、または３０日間以上に亘って抑制されたままである。
投与
本発明のＲＮＡｉ剤は、例えば、限定されるものではないが、皮下投与、静脈内投与、筋肉内投与、眼内投与、気管支内投与、胸膜内投与、腹腔内投与、動脈内投与、リンパ管投与、脳脊髄投与、およびこれらの任意の組み合わせを含む、当分野で公知の任意の投与方式で投与することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、皮下投与される。
一部の実施形態では、投与は蓄積注射によって行われる。蓄積注射は、長期間に亘ってＲＮＡｉ剤を一貫して放出することができる。従って、蓄積注射は、所望の効果、例えば、ＨＡＯ１の所望の阻害、または治療効果もしくは予防効果を得るために必要な投与の頻度を下げることができる。蓄積注射は、より一定の血清濃度を実現することもできる。蓄積注射としては、皮下注射または筋肉注射を挙げることができる。一部の実施形態では、蓄積注射は、皮下注射である。
一部の実施形態では、投与は、ポンプによって行われる。ポンプは、外部ポンプであっても良いし、または外科的に移植されたポンプであっても良い。特定の実施形態では、ポンプは、皮下移植された浸透圧ポンプである。他の実施形態では、ポンプは輸液ポンプである。輸液ポンプは、静脈内注射、皮下注射、動脈注射、または硬膜外注射に使用することができる。一部の実施形態では、輸液ポンプは、皮下注入ポンプである。他の実施形態では、ポンプは、ＲＮＡｉ剤を肝臓に送達する、外科的に移植されたポンプである。
他の投与方式としては、硬膜外投与、脳内投与、脳室内投与、経鼻投与、動脈内投与、心臓内投与、骨内注入、くも膜下腔投与、硝子体内投与、および肺内投与が挙げられる。投与方式は、局所治療または全身治療が望ましいか、および治療される領域に基づいて選択することができる。投与の経路および部位は、標的化を向上させるために選択することができる。
この方法は、ｉＲＮＡ剤を投与する、例えば、少なくとも５日間、好ましくは７日間、１０日間、１４日間、２１日間、２５日間、３０日間、または４０日間に亘ってＨＡＯ１ ｍＲＮＡのレベルを抑制するのに十分な用量投与するステップ；および、任意選択により、第２の１回量のｄｓＲＮＡを投与するステップを含み、この第２の１回量は、第１の１回量が投与されてから少なくとも５日後、好ましくは７日後、１０日後、１４日後、２１日後、２５日後、３０日後、または４０日後に投与され、これにより対象におけるＨＡＯ１遺伝子の発現が阻害される。
一実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤の用量は、４週間に１回以下、３週間に１回以下、２週間に１回以下、または１週間に１回以下で投与される。別の実施形態では、投与は、１カ月、２カ月、３カ月、または６か月、または１年以上に亘って継続することができる。別の実施形態では、本発明のｉＲＮＡ剤の用量は、３週間に亘って１週間に１回投与される。
一般に、ｉＲＮＡ剤は、免疫系を活性化させない、例えば、サイトカインレベル、例えば、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−αのレベルを上昇させない。例えば、アッセイ、例えば、本明細書に記載されているようなｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＢＭＣアッセイによって測定すると、ＴＮＦ−αまたはＩＦＮ−αのレベルの上昇は、対照ｄｓＲＮＡ、例えば、ＨＡＯ１を標的としないｄｓＲＮＡで処置された対照細胞の３０％未満、２０％未満、または１０％未満である。
例えば、対象に、治療量のｉＲＮＡ剤、例えば、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、または３ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡを投与することができる。ｉＲＮＡ剤は、一定期間に亘って、例えば、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、または２５分間の期間に亘って静脈内注射によって投与することができる。投与は、例えば、定期的に、例えば、１か月、２カ月、３カ月、または４カ月以上の間に隔週で（即ち、２週間ごとに）繰り返される。最初の処置計画後は、処置は、少ない頻度で施すことができる。例えば、３か月間の隔週の投与後は、投与を、６か月間または１年間以上の間、１か月に１回繰り返すことができる。ｉＲＮＡ剤の投与は、例えば、患者の細胞、組織、血液、尿、または他の区画のＨＡＯ１のレベルを、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％以上低下させることができる。
全用量のｉＲＮＡ剤の投与前に、患者は、少量、例えば、５％未満の注入反応となる量を投与し、悪影響、例えば、アレルギー反応、または脂質レベルもしくは血圧の上昇を監視することができる。別の例では、患者は、不所望の免疫活性化作用、例えば、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−αまたはＩＮＦ−α）のレベルの上昇を監視することができる。
ＨＡＯ１ ＲＮＡｉ剤を必要とする患者を、家族歴を聴取することによって特定することができる。医療提供者、例えば、医師、看護師、または家族の一員が、ＨＡＯ１ ｄｓＲＮＡを処方または投与する前に家族歴を聴取することができる。ＨＡＯ１ ＲＮＡｉ剤が患者に投与される前に、ＤＮＡ試験も患者に対して行って、ＡＧＴ１遺伝子における突然変異を同定することができる。ＰＨ１の診断は、当業者に周知の任意の試験によって確定することができる。
治療効果または予防効果は、疾患状態の１つ以上のパラメーターに統計的に有意な改善が存在する場合に、または通常であれば予想され得る症状の悪化もしくは発症が起きないことによって明らかになる。一例として、疾患の測定可能なパラメーターにおける少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％以上の有利な変化は、有効な処置であることを示唆し得る。本発明の所与のｉＲＮＡ剤の有効性またはこのｉＲＮＡ剤の処方も、当分野で公知の所与の疾患の実験動物モデルを用いて評価することができる。実験動物モデルを用いる場合、処置の有効性は、マーカーまたは症状における統計的に有意な減少が観察された場合に明らかになる。
対象に投与されるＲＮＡｉ剤の用量は、例えば、ＨＡＯ１遺伝子抑制の所望のレベル（例えば、ＨＡＯ１ ｍＲＮＡ抑制、ＨＡＯ１タンパク質の発現、またはシュウ酸塩レベルの低下に基づいて評価される）または所望の治療効果または予防効果を達成すると同時に不所望の副作用を回避するために、特定の用量のリスクと利益をバランスさせるように調整することができる。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、２回以上に分けて投与される。反復的または頻繁な注入を容易にしたい場合は、送達装置、例えば、ポンプ、半永久ステントの植え込み（例えば、静脈内、腹腔内、脳槽内、または嚢内）、またはレザバーが望ましいであろう。一部の実施形態では、続く投与の回数または量は、所望の効果、例えば、ＨＡＯ１遺伝子の抑制の達成、または治療もしくは予防効果、例えば、鉄過剰負荷の低減の達成によって決まる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、スケジュールに従って投与される。例えば、ＲＮＡｉ剤は、１週間に１回、１週間に２回、１週間に３回、１週間に４回、または１週間に５回投与することができる。一部の実施形態では、スケジュールは、規則的な間隔での投与、例えば、１時間ごと、４時間ごと、６時間ごと、８時間ごと、１２時間ごと、毎日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、毎週、２週間ごと、または毎月の投与を含む。他の実施形態では、スケジュールは、短い間隔での投与、およびこれに続く作用剤が投与されていないより長い期間を含む。例えば、スケジュールは、比較的短い期間（例えば、約６時間ごと、約１２時間ごと、約２４時間ごと、約４８時間ごと、または約７２時間ごと）で投与される最初の投与セット、およびこれに続くＲＮＡｉ剤が投与されないより長い期間（例えば、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、または約８週間）を含み得る。一実施形態では、ＲＮＡｉ剤が、最初は１時間ごとに投与され、後により長い間隔（例えば、１日１回、１週間に１回、２週間に１回、または１か月に１回）で投与される。別の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、最初は毎日投与され、後により長い間隔（例えば、１週間に１回、２週間に１回、または１か月に１回）で投与される。特定の実施形態では、より長い期間は、時間と共に長くなる、または所望の効果の達成に基づいて決定される。特定の一実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、最初の１週間は１日１回投与され、続いて投与の８日目から１週間に１回の投与が始まる。別の特定の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、最初の１週間は１日おきに投与され、続いて投与の８日目から１週間に１回の投与が始まる。
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、投与計画に基づいて投与され、この投与計画は、短い投与間隔の「負荷相」を含み、この負荷相の後に、ＲＮＡｉ剤がより長い間隔で投与される「持続相」が続いても良い。一実施形態では、負荷相は、最初の１週間におけるＲＮＡｉ剤の１日５回の投与を含む。別の実施形態では、持続相は、１週間に１回または２回のＲＮＡｉ剤の投与を含む。さらなる実施形態では、持続相は、５週間続く。
これらの任意のスケジュールは、任意選択により、１回以上の反復で繰り返すことができる。反復の回数は、所望の効果、例えば、ＨＡＯ１遺伝子の抑制の達成、および／または治療効果もしくは予防効果、例えば、シュウ酸塩のレベルの低下もしくはＰＨ１の症状の軽減の達成によって決めることができる。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のｉＲＮＡ剤をどのように投与するかを最終使用者、例えば、介護士または対象を指導するための方法を取り上げる。この方法は、任意選択により、１回量以上のｉＲＮＡ剤を最終使用者に提供するステップ、およびｉＲＮＡ剤を本明細書に記載の計画で投与するように最終使用者を指導し、これにより最終使用者を指導するステップを含む。
ＶＩＩ．キット
本発明は、任意のｉＲＮＡ剤を使用するため、および／または本発明の任意の方法を行うためのキットも提供する。このようなキットは、１つ以上のＲＮＡｉ剤および使用説明書、例えば、ＨＡＯ１の発現を阻害するのに有効な量のＲＮＡｉ剤を細胞に接触させることによって細胞でのＨＡＯ１の発現を阻害するための取扱説明書を含む。キットは、任意選択により、細胞にＲＮＡｉ剤を接触させるための手段（例えば、注入装置）、またはＨＡＯ１の阻害を測定するための手段（例えば、ＨＡＯ１ ｍＲＮＡまたはタンパク質の阻害を測定するための手段）をさらに含み得る。ＨＡＯ１の阻害を測定するためのこのような手段は、対象からのサンプル、例えば、血漿サンプルを得るための手段を含み得る。本発明のキットは、任意選択により、ＲＮＡｉ剤を対象に投与するための手段、または治療有効量もしくは予防有効量を決定するための手段をさらに含み得る。
ＶＩＩ．ＰＨ１および関連した状態の診断マーカー
本明細書には、シュウ酸塩の過剰産生によって引き起こされる疾患状態、特にＰＨ１および関連した状態の診断のためのマーカーおよび方法、ならびに前記状態の処置のための作用剤も記載されている。
別の態様によると、本発明は、対象のＰＨ１の状態（結石症、特にＰＨ１）の処置のための方法に関する。診断方法は、（ａ）対象におけるＨＡＯ１の発現をノックダウンするステップ、（ｂ）前記対象から生物学的血清を得るステップ；および（ｂ）前記血清中のグリコール酸塩のレベルを決定するステップを含む。陰性対照と比較した、血清中のグリコール酸塩のレベルの上昇は、ＰＨ１の状態によって引き起こされるシュウ酸塩の産生を防止するグリコール酸オキシダーゼ酵素の阻害を示唆することを理解されたい。
一実施形態では、ＰＨ１の状態の診断のためのキットが本明細書に記載され、前記キットは、以下を含む：（ａ）血清中の目的の分析物の存在を決定するための作用剤であって、前記目的の分析物がグリコール酸塩の１つである、作用剤；および（ｂ）較正手段。例えば、前記目的の分析物はグリコール酸塩であり、前記作用剤は、ＨＡＯ１を標的とするｓｉＲＮＡである。
特段の記載がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明の属する分野の一般的な技術者が一般に理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料と同様または同等の方法および材料は、本発明で取り上げられるｉＲＮＡおよび方法の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料は以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全開示内容が本明細書に組み入れられる。対立する場合は、定義を含む本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および例は、単に例示目的であり、限定を意図するものではない。
材料および方法
以下の材料および方法は、実施例で使用された。本明細書で使用される「ＨＡＯ」および「ＧＯ」は互換的に使用される。
ｓｉＲＮＡの合成
一本鎖ＲＮＡを、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｅｒａ Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ ＧｍｂＨ，Ｄａｒｍ−ｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および固体支持体としての細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ，５００Å，Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた１μｍｏｌｅのスケールでの固相合成によって作製した。ＲＮＡ、および２’−Ｏ−メチルヌクレオチドを含むＲＮＡをそれぞれ、対応するホスホラミダイトおよび２’−Ｏ−メチルホスホラミダイトを利用する固相合成によって作製した（Ｐｒｏｌｉｇｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。これらのビルディングブロックを、核酸化学の現在のプロトコル、Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されているような標準的なヌクレオシドホスホラミダイト化学を用いてオリゴリボヌクレオチド鎖の配列内の選択された部位に含めた。ホスホロチオエート結合を、アセトニトリル（１％）中、Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（Ｃｈｒｕａｃｈｅｍ Ｌｔｄ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）の溶液でヨウ素酸化剤溶液を交換することによって導入した。さらなる補助試薬をＭａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ Ｂａｋｅｒ（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。
陰イオン交換ＨＰＬＣによる粗オリゴリボヌクレオチドの脱保護および精製を、確立された手順に従って行った。収率および濃度を、分光光度計（ＤＵ ６４０Ｂ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＧｍｂＨ，Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉｓｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２６０ｎｍの波長でのそれぞれのＲＮＡの溶液のＵＶ吸光度によって決定した。
二本鎖ＲＮＡを、アニーリング緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭ 塩化ナトリウム）中、相補鎖の等モル溶液を混合し、８５〜９５℃の水槽で３分間加熱し、そして３〜４時間かけて室温に冷却して作製した。アニールされたＲＮＡ溶液を、使用するまで−２０℃で保存した。
場合によっては、二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を２回以上合成した。異なるバッチには、異なる拡張子を付した。例えば、ＡＤ−６２９３３．１およびＡＤ−６２９３３．２が、同じ二重鎖の異なるバッチである。
細胞培養およびトランスフェクション
初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）および初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）を使用した。ＰＣＨ（Ｃｅｌｓｉｓ ＃Ｍ００３０５５，ｌｏｔ ＣＢＴ）またはＰＭＨ（新鮮分離）を、９６ウェルプレートの１ウェルに付き５μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖に対して１ウェルに付き１４．８μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．ｃａｔ ＃１３７７８−１５０）を添加し、そして室温で１５分間インキュベートすることによってトランスフェクトした。次いで、約２×１０４のＰＣＨまたはＰＭＨ細胞を含む８０μｌのＩｎＶｉｔｒｏＧＲＯ ＣＰ Ｒａｔ培地（ＩｎＶｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をｓｉＲＮＡ混合物に加えた。ＲＮＡの精製の前に、細胞を２４時間インキュベートした。単回投与実験を、１０または２０ｎＭおよび０．１または０．２ｎＭの最終二重鎖濃度で行い、用量反応実験を、８、６倍希釈で、１０ｎＭ〜３６ｆＭの最終二重鎖濃度の用量範囲で行った。
全ＲＮＡの単離
全ＲＮＡを、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｐａｒｔ ＃：６１０−１２）を用いて単離した。細胞を収集し、１５０μｌの溶解／結合緩衝液で溶解し、次いでＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒを用いて８５０ｒｐｍで５分間混合した（混合速度は、プロセスの間同一とした）。１０μｌの磁気ビーズと８０μｌの溶解／結合緩衝液の混合物を丸底プレートに加えて、１分間混合した。磁気ビーズを磁気スタンドで捕捉し、そして上清を、ビーズを乱さずに除去した。上清の除去後、溶解細胞を残りのビーズに添加して、５分間混合した。上清を除去後、磁気ビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ａで２回洗浄して、１分間混合した。ビーズを再び捕捉して、上清を除去した。次いで、ビーズを１５０μｌの洗浄緩衝液Ｂで洗浄し、捕捉し、そして上清を除去した。次に、ビーズを１５０μｌの溶出緩衝液で洗浄し、捕捉し、そして上清を除去した。ビーズを２分間乾燥させた。乾燥後、５０μｌの溶出緩衝液を添加して、７０℃で５分間混合した。ビーズを、磁石上で５分間捕捉した。４０μｌの上清を取り出し、別の９６ウェルプレートに添加した。
ｃＤＮＡの合成
ｃＤＮＡの合成を、ＡＢＩ高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｃａｔ ＃４３６８８１３）を用いて行った。
１反応当たり、２μｌの１０×緩衝液、０．８μｌの２５×ｄＮＴＰ、２μｌのランダムプライマー、１μｌの逆転写酵素、１μｌのＲＮＡ分解酵素阻害剤、および３．２μｌのＨ２Ｏのマスターミックスを１０μｌの全ＲＮＡに添加した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｃ−１０００またはＳ−１０００サーマルサイクラー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）を用いて、次のステップによってｃＤＮＡを作製した：２５℃で１０分間、３７℃で１２０分間、８５℃で５秒、４℃での保持。
リアルタイムＰＣＲ
２μｌのｃＤＮＡを、３８４ウェル５０プレート（Ｒｏｃｈｅ ｃａｔ ＃ ０４８８７３０１００１）における各ウェルのマスターミックス（０．５μｌのマウスＧＡＰＤＨ（ｃａｔ ＃ ４３５２３３９Ｅ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）または特注設計のカニクイザルＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ：（Ｆ−ＧＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＡＣＴＧＡ（配列番号１３）、Ｒ−ＴＧＧＧＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣ（配列番号１４）、プローブ−ＣＣＡＧＧＴＧＧＴＣＴＣＣＴＣＣ（配列番号１５））、０．５μｌのヒトまたはマウスＨＡＯ１（カニクイザルＨＯＡ１と交差反応性のＨＳ００２１３９０９＿Ｍ１、マウスのアッセイ用のＭｍ ００４３９２４９＿ｍｌ、ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ ＃０４８８７３０１００１）を含む）に添加した。リアルタイムＰＣＲを、ΔΔＣｔ（ＲＱ）アッセイを用いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）で行った。要約表に特段の記載がない限り、各二重鎖を、２つの独立したトランスフェクションで試験し、各トランスフェクションを２連でアッセイした。
相対的倍数変化を計算するために、リアルタイムデータを、ΔΔＣｔ法を用いて分析し、１０ｎＭ ＡＤ−１９５５でトランスフェクトされた細胞または模擬トランスフェクト細胞で行ったアッセイに対して正規化した。ＩＣ５０を、ＸＬ Ｆｉｔを用いる４パラメーターフィットモデルで計算し、ＡＤ−１９５５でトランスフェクトされた細胞またはナイーブ細胞に対して正規化した。
ＡＤ−１９５５のセンス配列およびアンチセンス配列は：ＳＥＮＳＥ：５’−ｃｕｕＡｃＧｃｕＧＡＧｕＡｃｕｕｃＧＡｄＴｓｄＴ−３’（配列番号１６）；およびＡＮＴＩＳＥＮＳＥ：５’−ＵＣＧＡＡＧｕＡＣＵｃＡＧＣＧｕＡＡＧｄＴｓｄＴ−３’（配列番号１７）である。
Figure 2021019609
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実施例１．ｓｉＲＮＡの設計、特異性、および有効性の予測
ｓｉＲＮＡの設計を、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｅ／）で注釈が付けられたヒト、カニクイザル、マウス、およびラットＨＡＯ１転写物を標的とするｓｉＲＮＡを特定するために行った。
設計には、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑコレクションからの以下の転写物を使用した：ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＨＡＯ１ ｍＲＮＡはＮＭ＿０１７５４５．２である；カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＨＡＯ１ ｍＲＮＡはＸＭ＿００５５６８３８１．１である；ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＨＡＯ１ ｍＲＮＡはＮＭ＿０１０４０３．２である；ドブネズミ（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）ＨＡＯ１ ｍＲＮＡはＸＭ＿００６２３５０９６．１である。
高等霊長類／げっ歯類の配列の多様性のため、ｓｉＲＮＡ二重鎖を、限定されるものではないが、ヒトおよびカニクイザル転写物のみ；ヒト、カニクイザル、マウス、およびラット転写物のみ；ならびにマウスおよびラット転写物のみに一致する二重鎖を含むバッチを含む、いくつかの別個のバッチで設計した。列記されたヒト転写物およびそれぞれの設計バッチ（上記）で考えられる他の種の転写物と１００％の同一性を共有する全てのｓｉＲＮＡ二重鎖を設計した。
全ての可能な１９量体の特異性を各配列から予測した。次いで、７ヌクレオチドよりも長い反復を欠いた候補１９量体を選択した。これらの１０６９の候補ヒト／カニクイザル、１８４のヒト／カニクイザル／マウス／ラット、および５７９のマウス／ラットのｓｉＲＮＡを、ｐｙｔｈｏｎスクリプト「ＢｒｕｔｅＦｏｒｃｅ．ｐｙ」で実施される徹底的「ｂｒｕｔｅ−ｆｏｒｃｅ」アルゴリズムを用いて適切なトランスクリプトーム（ヒト、カニクイザル、マウス、またはラットのＮＣＢＩ Ｒｅｆｓｅｑセット内のＮＭ＿およびＸＭ＿記録のセットとして定義される）に対する包括的検索に使用した。次に、このスクリプトは、ｓｉＲＮＡと任意の潜在的な「標的外」転写物との間のミスマッチの位置および数に基づいて転写物−オリゴアライメントを解析してスコアを作成した。標的外スコアは、分子の５’末端の２〜９位におけるｓｉＲＮＡの「ｓｅｅｄ」領域の差異を強調するために重み付けされる。ｂｒｕｔｅ−ｆｏｒｃｅ検索からの各オリゴ−転写物対には、それぞれのミスマッチスコアを加算することによってミスマッチスコアが与えられ；２〜９位におけるミスマッチは、２．８としてカウントされ、切断部位１０〜１１におけるミスマッチは、１．２としてカウントされ、そして領域１２〜１９におけるミスマッチは１．０としてカウントされた。さらなる標的外予測を、各オリゴの３つの異なるｓｅｅｄ由来六量体に由来する七量体と八量体の頻度を比較することによって行った。５’開始部位に対する２〜７位の六量体を使用して、２つの七量体と１つの八量体を作製した。七量体１は、六量体に３’Ａを付加することによって作製し；七量体２は、六量体に５’Ａを付加することによって作製し；八量体は、六量体の５’末端および３’末端にＡを付加することによって作製した。ヒト、カニクイザル、マウス、またはラットの３’ＵＴＲｏｍｅ（コード領域の末端、「ＣＤＳ」が明確に定義されるＮＣＢＩのＲｅｆｓｅｑデータベースからのトランスクリプトームの部分配列として定義される）における八量体および七量体の頻度を事前に計算した。八量体の頻度を、八量体の頻度の範囲の平均値を用いて七量体の頻度に対して正規化した。次いで、「ｍｉｒＳｅｅｄＳｃｏｒｅ」を、（（３×正規化八量体のカウント）＋（２×七量体２のカウント）＋（１×七量体１のカウント））の合計を計算することによって求めた。
両方のｓｉＲＮＡ鎖を、計算スコアに従って特異性のカテゴリーに割り当てた：３を超えるスコアを、高い特異性であると認定し、３に等しいスコアを特異性であると認定し、そして２．２〜２．８のスコアを、中程度の特異性であると認定した。ｓｉＲＮＡを、アンチセンス鎖の特異性によって分類した。アンチセンスオリゴが、第１位でＧＣを欠き、１３位および１４位の両方でＧを欠き、そしてｓｅｅｄ領域に３つ以上のＵまたはＡを有する（有効性が高いと予測される二重鎖の特徴）ヒト／カニクイザルのセットおよびマウス／ラットのセットからの二重鎖を選択した。同様に、ｓｅｅｄ領域に３つ以上のＵまたはＡを有する、ヒト／カニクイザル／マウスのセットおよびヒト／カニクイザル／マウス／ラットのセットからの二重鎖を選択した。
センス鎖およびアンチセンス鎖のそれぞれにおける２１および２３ヌクレオチド長の候補ＧａｌＮＡｃコンジュゲート二重鎖を、アンチセンス１９量体を３’方向に４つの追加のヌクレオチドで伸長させることによって設計した（標的転写物との完全な相補性を維持する）。センス鎖を、アンチセンス２３量体の最初の２１ヌクレオチドの逆相補体として指定した。２３のヌクレオチドの全てにおいて、選択された種の転写物の全てに対して完全な一致を維持した二重鎖を選択した。
最初の５’位置にＣまたはＧを含むアンチセンス鎖を、改変により一連の４つ以上の連続したＵ（５’→３’）の導入とならない場合は、最初の５’位置にＵを有するように改変し、改変により一連の４つ以上の連続したＵの導入となる場合は、最初の５’位置にＡを有するように改変した。これらの「ＵＡ交換」アンチセンス鎖と対合して二重鎖になるセンス鎖を、相補性を維持するために相応に改変した。以下に記載される例は、ＡＤ−６２９８９およびＡＤ−６２９９３を含む。
ヒト／カニクイザルの２１／２３量体オリゴ由来の合計３１のセンスおよび３１のアンチセンス、ヒト／カニクイザル／マウス／ラットの２１／２３量体オリゴ由来の１９のセンスおよび１９のアンチセンス、ならびにマウス／ラットの２１／２３量体オリゴ由来の４８のセンスおよび４８のアンチセンスを合成して、ＧａｌＮＡｃ−コンジュゲート二重鎖を形成した。
改変二重鎖のセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列は表１に示され、非改変二重鎖のセンス鎖およびアンチセンス鎖の配列は表２に示されている。
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実施例２．初代サル肝細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ単回投与スクリーニング
改変されコンジュゲートされたＨＡＯ１ ｓｉＲＮＡ二重鎖を、初代サル肝細胞でのトランスフェクションアッセイによって有効性について評価した。ＨＡＯ１ ｓｉＲＮＡを、２つの用量、１０ｎＭと０．１ｎＭでトランスフェクトした。これらのアッセイの結果が表３に示され、データは、陰性対照ｓｉＲＮＡ、ＡＤ−１９５５±標準偏差（ＳＤ）でトランスフェクトされた細胞に対して、ＨＡＯ１を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞に残存するメッセージの一部として表されている。
結果は、図３Ａにも示されている。図３Ｂは、最初の２回の投与のスクリーニングからの最も活性なコンジュゲート（＃３１）（ＡＤ−６２９３３）の１つを用いた用量反応を例示している：ＩＣ５０は約１９ｐＭであった。
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実施例３．初代マウス肝細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ単回投与スクリーニング
改変されコンジュゲートされたＨＡＯ１ ｓｉＲＮＡ二重鎖を、初代マウス肝細胞でのトランスフェクションアッセイによって有効性について評価した。ＨＡＯ１ ｓｉＲＮＡを、２つの用量、２０ｎＭと０．２ｎＭでトランスフェクトした。これらのアッセイの結果が表４に示され、データは、陰性対照ｓｉＲＮＡ、ＡＤ−１９５５±標準偏差（ＳＤ）でトランスフェクトされた細胞に対して、ＨＡＯ１を標的とするｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞に残存するメッセージの一部として表されている。
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実施例４．初代サル肝細胞における用量反応スクリーニング
改変されコンジュゲートされたＨＡＯ１ ｓｉＲＮＡ二重鎖のＩＣ５０を、初代サル肝細胞で決定した。ＨＡＯ１ ｓｉＲＮＡを、８、６倍希釈で、１０ｎＭ〜３６ｆＭの最終二重鎖濃度の用量範囲でトランスフェクトした。これらのアッセイの結果は、表５に示されている。
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実施例５．初代サル肝細胞における用量反応スクリーニング
改変されコンジュゲートされたＨＡＯ１ ｓｉＲＮＡ二重鎖のＩＣ５０を、初代マウス肝細胞で決定した。ＨＡＯ１ ｓｉＲＮＡを、８、６倍希釈で、１０ｎＭ〜３６ｆＭの最終二重鎖濃度の用量範囲でトランスフェクトした。これらのアッセイの結果は、表６に示されている。
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実施例６．Ｃ５７Ｂ６マウスにおけるＧＯ−ＧａｌＮＡｃコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ評価
ＧＯ−ＧａｌＮＡｃコンジュゲートを、１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、または１．２５ｍｇ／ｋｇでＣ５７Ｂ６マウスに皮下投与し、肝臓におけるｍＲＮＡのノックダウンを、投与の７２時間後にｑＰＣＲで評価した。単回投与ＥＤ５０は、化合物Ａ（ＡＤ−６２９９４）で約１．２５ｍｇ／ｋｇ、化合物Ｂ（ＡＤ−６２９３３）で約２．５ｍｇ／ｋｇであった。反復投与試験において、コンジュゲートを４週間に亘って毎週（ＱＷ）皮下投与し、肝臓のＧＯ ｍＲＮＡレベルを、４回目の投与の７２時間後に評価した。反復投与ＥＤ５０は、両方の化合物で約０．３ｍｇ／ｋｇであった。結果は図４に示されている。
実施例７．ＡＧＸＴ ＫＯマウスにおけるＧＯノックダウンおよびシュウ酸塩レベルに対する影響のｉｎ ｖｉｖｏ評価
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）におけるＧＯ ｓｉＲＮＡ（ＡＤ−４０２５７）を、１ｍｇ／ｋｇでＡＧＸＴ ＫＯマウス（Ｓａｌｉｄｏ ｅｔ ａｌ （２００６）ＰＮＡＳ １０３：１８２４９）に静脈内投与した。尿中シュウ酸塩またはグリコール酸塩のレベルを、１５日目にイオンクロマトグラフィー／質量分析を用いて測定した。結果は図５に示されている。データは、投薬前の値に対して表され、尿の希釈を調節するためにクレアチニン（Ｃｒ）に対して正規化した。マウスは１群当たりＮ＝４とし、エラーバーは標準偏差である。
実施例８．ラットＡＧＸＴノックダウンモデルにおけるＧＯ−ＧａｌＮＡｃコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ評価
ラットＰＨ１モデルを作製するために、ＬＮＰ（ＡＦ−０１１−６３１０２）におけるＡＧＸＴ ｓｉＲＮＡ（ＡＤ−６３１０２）を、ラット肝臓におけるＡＧＸＴのノックダウンを維持するために１日目および７日目に雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに１ｍｇ／ｋｇで静脈内投与し、１％ エチレングリコールを飲料水に添加して、シュウ酸塩の産生をさらにシミュレーションした。０日目および７日目に、一部のラットに、ＧＯ ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ（ＡＤ−６２９９４）コンジュゲートまたはＰＢＳ対照も投与した。結果は図６に示されている。図６Ａは、ＬＮＰ中、１ｍｇ／ｋｇのＡＧＸＴ ｓｉＲＮＡの単回投与の７２時間後の肝臓ＡＧＸＴ ｍＲＮＡのレベルの定量化を示している。図６Ｂでは、尿中シュウ酸塩のレベルを、前日から０日目、３日目から４日目、５日目から６日目、および７日目から８日目までの２４時間に収集された尿から定量化した。データを、尿の希釈の調節のためにクレアチニンに対して正規化した。ＡＧＸＴ群ではＮ＝３とし、ＰＢＳ対照群ではＮ＝２とした。図６Ｃでは、これらの同じラット（図６Ｂに示されている）に対して、図示されているように４９日目までＡＦ−０１１−６３１０２およびＡＤ−６２９９４の両方の１４日目および２１日目の毎週の投与および２４時間の尿の収集を行った。エチレングリコールは、２８日目まで飲料水中に残存した。図６Ｄでは、ラットにおけるＨＡＯ１ノックダウンの期間は、４回の投与の最後の投与から１週間後または４週間後（図６Ｃの２８日目および４９日目に対応する）のｍＲＮＡのレベルを測定することによって示され、ＰＢＳで処置されたラットに見られるレベルに対して表される。エラーバーは、全体の標準偏差を示す。
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実施例９．ＧＯ−ＧａｌＮＡｃコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ評価
６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、表７のＧＯ ｓｉＲＮＡ−ＧａｌＮａｃコンジュゲートを単回皮下投与した。７２時間後にマウスを屠殺し、肝臓を、ｂＤＮＡ分析によってＨＡＯ ｍＲＮＡについてアッセイした。結果は図１３に示されている。
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実施例１０．マウスにおけるＧＯ−ＧａｌＮＡｃコンジュゲートのｉｎ ｖｉｖｏ評価
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、本明細書に記載の多数のＧＯ ｓｉＲＮＡ−ＧａｌＮａｃコンジュゲートまたはＰＢＳ対照を３ｍｇ／Ｋｇで単回皮下投与した。７２時間後にマウスを屠殺し、肝臓のＨＡＯ１ ｍＲＮＡのノックダウンを、ｑＰＣＲを用いて評価した。結果は、図１４に示され、ＰＢＳ対照に対して表されている。
実施例１１．マウスにおけるＧＯ−ＧａｌＮＡｃコンジュゲートの用量反応評価
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＧＯ ｓｉＲＮＡ−ＧａｌＮＡｃコンジュゲート化合物Ａ（ＡＤ−６２９９４）、化合物Ｂ（ＡＤ−６２９３３）、化合物Ｃ（ＡＤ−６５６４４）、化合物Ｄ（ＡＤ−６５６２６）、化合物Ｅ（ＡＤ−６５５９０）、化合物Ｆ（ＡＤ−６５５８５）、またはＰＢＳ対照の１つを１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇで単回皮下投与した。１０日後にマウスを屠殺し、肝臓のＨＡＯ１ ｍＲＮＡのノックダウンを、ｑＰＣＲを用いて評価した。反復投与試験において、化合物Ｃ、Ｄ、Ｆ、またはＰＢＳ対照を、４週間に亘って毎週（ＱＷ）皮下投与し、肝臓のＨＡＯ１ ｍＲＮＡレベルを、最後の投与の１０日後に評価した。単回投与の結果は、図１５に示され、反復投与試験は、図１６に示され、ＰＢＳ対照に対して表されている。これらのデータは、化合物ＡＤ−６５６４４およびＡＤ−６５６２６のＡＤ−６２９３３に対する改善された効力、ならびに化合物ＡＤ−６５５９０およびＡＤ−６５５８５のＡＤ−６２９９４に対する改善された効力を示した。
実施例１２．マウスにおける化合物Ｄの用量反応評価
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのＡＤ−６５６２６またはＰＢＳ対照を単回皮下投与した。１０日後にマウスを屠殺し、肝臓のＨＡＯ１ ｍＲＮＡのノックダウンを、ｑＰＣＲを用いて評価し、ＰＢＳ対照に対して表された結果が、図１７に示されている。これらの結果は、化合物ＡＤ−６２９３３と比較して３倍を超える効力の改善を実証している。
実施例１３．マウスにおけるｍＲＮＡのノックダウンと血清中グリコール酸塩のレベルとの関係
雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのＡＤ−６５５８５またはＰＢＳ対照を単回皮下投与した。１０日後にマウスを屠殺し、肝臓のＨＡＯ１ ｍＲＮＡのノックダウンを、ｑＰＣＲを用いて評価し、結果が、ＰＢＳ対照に対して表されている。これらの同じマウスからの血清サンプル中のグリコール酸塩のレベルを、前述の質量分析と共にイオンクロマトグラフィーを用いて定量化した（Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １；４２１（１）：１２１-１２４）。これらの実験の結果は、図１８に示されている。
これらの結果は、ＡＤ−６５５８５が、ＡＤ−６５６２６との同じ効力であることを実証し、両方が、ＷＴマウスで約０．３ｍｇ／ｋｇの単回投与ＥＤ５０を有する。加えて、ＨＡＯ１ ｍＲＮＡのサイレンシングにより、用量反応血清中グリコール酸塩が、最も高い２つの用量で４倍（約２００μＭ）まで上昇する。
実施例１４．ラットにおけるｍＲＮＡのノックダウンと血清中グリコール酸塩のレベルとの関係
雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットに、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇのＡＤ−６５６２６またはＰＢＳ対照を単回皮下投与した。１４日後にラットを屠殺し、肝臓のＨＡＯ１ ｍＲＮＡのノックダウンを、ｑＰＣＲを用いて評価し、結果を、ＰＢＳ対照に対して表した。投与前および１４日目に収集された、これらの同じラットからの血清サンプル中のグリコール酸塩のレベルを、同様に前述の質量分析と共にイオンクロマトグラフィーを用いて定量化した（Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １；４２１（１）：１２１-１２４）。これらの実験の結果は、図１９に示されている。
野生型マウスで観察されるように、これらの結果は、Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットにおけるＨＡＯ１ ｍＲＮＡサイレンシングにより、用量反応血清中グリコール酸塩が、最も高い用量で１２倍（約１４０μＭ）まで上昇することを実証している。
実施例１５．ＡＬＮ−６５５８５を用いた薬理学的試験
初代カニクイザル肝細胞を、ＲＮＡｉｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて段階希釈ＡＤ−６５５８５（ＡＬＮ−６５５８５、「ＡＬＮ−ＧＯ１」）または非標的ｍＲＮＡ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ対照（ＡＤ１９５５）で、１０ｎＭでトランスフェクトした。ＨＡＯ１ ｍＲＮＡの相対レベルを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化されたＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡレベルに対して正規化することによって決定した。データをプロットして、１０ｐＭのＩＣ５０値を計算した。この結果は、図２０に示されている。
ＡＤ−６５５８５のｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションは、初代カニクイザル肝細胞での約１０ｐＭのＥＤ５０を実証している。
マウスにおける単回投与の薬理
ＡＬＮ−ＧＯ１の薬理を、肝臓のＨＡＯ１ ｍＲＮＡおよび血清中グリコール酸塩のレベルを定量化することによってマウスで評価した（図２１）。ＡＬＮ−ＧＯ１の単回ＳＣ投与により、１０ｍｇ／ｋｇの用量でのＨＡＯ１ ｍＲＮＡの用量依存性抑制が、ＥＤ９０サイレンシングとなる。マウスにおけるＧＯ１サイレンシングのＥＤ５０用量は、０．３ｍｇ／ｋｇと推定された。血清中グリコール酸塩のレベルは、ベースラインレベルの約４倍を超える最大レベルで用量反応式に増加した。この結果は、図２１に示され、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＡＬＮ−６５５８５の単回皮下投与の１０日後の肝臓のＨＡＯ１ ｍＲＮＡおよび血清中グリコール酸塩のレベルを例示している。バーは、３匹または４匹の動物の平均を表し、エラーバーは、標準偏差を示している。
マウスにおける単回投与の期間
ＧＯ１サイレンシングは、持続的であり、単回ＳＣ投与後に可逆的であった（図２２）。マウスにおけるＡＬＮ−ＧＯ１の３ｍｇ／ｋｇでの単回ＳＣ投与により、約６週間に亘って７０％以上のｍＲＮＡサイレンシングが続き、その後、投与から１２週間でｍＲＮＡレベルがベースラインレベルに戻った。この結果は、図２２に示されている：Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのＡＬＮ−６５５８５の単回皮下投与後の複数の時点での肝臓のＨＡＯ１ ｍＲＮＡのレベル。各データ点は、３匹の動物の平均を表し、エラーバーは、標準偏差を示している。
ラットにおける単回投与の薬理
ＡＬＮ−ＧＯ１の薬理を、肝臓のＨＡＯ１ ｍＲＮＡのレベルを定量化することによってラットでも評価した（図２３）。雄Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットへのＡＬＮ−ＧＯ１の単回ＳＣ投与により、３ｍｇ／ｋｇ以上でのＨＡＯ１ ｍＲＮＡの用量依存性抑制が、ＥＤ９０サイレンシングとなる。この結果は、図２３に示されている：Ｓｐｒａｇｕｅ ＤａｗｌｅｙラットへのＡＬＮ−６５５８５の単回皮下投与の１０日後の肝臓でのＨＡＯ１ ｍＲＮＡのレベル。バーは、３匹の動物の平均を表し、エラーバーは、標準偏差を示している。ラットにおけるＧＯ１サイレンシングのＥＤ５０用量は、０．３ｍｇ／ｋｇと推定された。
ＡＧＸＴ ＫＯマウスにおける単回投与の薬理
シュウ酸塩のレベルに対するＡＬＮ−ＧＯ１の影響を、ＰＨ１のＡＧＸＴ ＫＯマウスモデルで評価した。この結果は、図２４に示されている：ＡＬＮ−６５５８５の単回皮下投与後のＡｇｘｔ ＫＯマウスの２４時間の尿中のシュウ酸塩（上部）およびグリコール酸塩（底部）の排泄量。異なる文字は、それぞれの特定の週における３つの投与群（１投与に付きｎ＝３）間の有意差を意味する。尿中排泄量は、ＰＢＳ対照動物（ｎ＝１）では時間が経過しても有意には変化しなかった。
尿中シュウ酸塩のレベルは、ＡＬＮ−ＧＯ１の単回投与後に用量依存性の低下を示し、３ｍｇ／ｋｇの用量で最大約５０％のシュウ酸塩の低下であり、この低下は、投薬前のレベルに戻るまで３週間以上かかった。尿中グリコール酸塩のレベルは、ＡＬＮ−ＧＯ１の単回投与後に用量依存性の増加を示し、３ｍｇ／ｋｇの用量で最大約５倍の増加であり、この増加は、４週間以上続いた。
ＰＨ１誘発ラットモデルにおける単回投与の薬理
肝臓ＡＧＸＴをｓｉＲＮＡを用いてラットで阻害し、シュウ酸塩のレベルをエチレングリコールで刺激して、第２のＰＨ１げっ歯類モデルでＡＬＮ−ＧＯ１を評価した（図２５Ａおよび図２５Ｂ）。肝臓ＨＡＯ１ ｍＲＮＡおよび２４時間の尿中シュウ酸塩を定量化して、最大のシュウ酸塩の低下に必要なＨＡＯ１低下の程度を決定した。この結果は、図２５Ａおよび図２５Ｂに示されている：ＡＬＮ−６５５８５の単回皮下投与の１４日後およびＡＦ−０１１ ＡＧＸＴ ｓｉＲＮＡの毎週の投与（１ｍｇ／ｋｇの２回の投与）後のＰＨ１のラット誘発モデルにおける肝臓のＨＡＯ１ ｍＲＮＡのレベル。２４時間の尿中シュウ酸塩を尿中クレアチニンに対して正規化した。バーは、３匹の動物の平均を表し、エラーバーは、標準偏差を示している。ｍＲＮＡとシュウ酸塩の低下の相関プロットは、複数の実験の個々の動物を表している。
このモデルにおけるＡＬＮ−ＧＯ１の単回投与は、用量反応性のｍＲＮＡおよび尿中シュウ酸塩の低下を実証し、ＡＬＮ−ＧＯ１の最大の用量で、約８５％の最大ｍＲＮＡの低下および約９０％の最大尿中シュウ酸塩の低下が観察された（図２５Ａおよび図２５Ｂ）。このＰＨ１の誘発ラットモデルでは、ｍＲＮＡおよび尿中シュウ酸塩の低下は、１：１の相関となった。
ＰＨ１誘発ラットモデルにおける複数回投与の薬理
ＡＬＮ−ＧＯ１の効力を、肝臓のＨＡＯ１ ｍＲＮＡおよび２４時間の尿中シュウ酸塩の定量化によって、ＡＧＸＴの活性およびエチレングリコールが阻害された正常なラット（ＰＨ１の誘発モデル）における試験で評価した。この結果は、図２６に示されている：ＡＬＮ−６５５８５の反復皮下投与およびＡＦ−０１１−ＡＧＸＴ ｓｉＲＮＡの反復ＩＶ投与（１ｍｇ／ｋｇの４回の投与）の２８日後のＰＨ１のラット誘発モデルにおける肝臓のＨＡＯ１ ｍＲＮＡのレベル。２４時間の尿中シュウ酸塩を、尿中クレアチニンに対して正規化した。バーは、２匹または３匹の動物の平均を表し、エラーバーは、標準偏差を示している。
ＡＬＮ−ＧＯ１での処置により、約３週間に亘って全ての処置群で尿中シュウ酸塩の低下が持続された。ＡＬＮ−ＧＯ１の反復投与（およびＡＦ−０１１−ＡＧＸＴの４回の投与）の２８日後に、全ての群が、９５％を超えるｍＲＮＡＮの低下、８５％を超える尿中シュウ酸塩の低下を示した。
ＮＨＰにおける複数回投与の薬理
ＡＬＮ−ＧＯ１の薬理を、肝生検でのＨＡＯ１ ｍＲＮＡの定量化および血清中グリコール酸塩のレベルによってカニクイザル（非ヒト霊長類（ＮＨＰ））で評価した。以下の表は、投与レベルおよび投与計画を詳述するＮＨＰ薬理学的試験の概要を示している。
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この結果は、図２７に示されている。全ての群におけるＮＨＰの血清中グリコール酸塩のレベルを８５日目まで出し、データは、１群当たり３匹の動物の群平均を表し、線は標準偏差を示している。２９日目の肝生検でのＨＡＯ１ ｍＲＮＡであり、線は群の平均を表し、記号は、２９日目のＰＢＳ対照に対する個々の動物のｍＲＮＡのレベルを表している。
最初の１か月の投与後（２９日目）に、用量反応性ｍＲＮＡサイレンシングが全ての群で観察され、毎月４ｍｇ／ｋｇまたは毎週２ｍｇ／ｋｇで投与された群６および７で最大９９％のｍＲＮＡサイレンシングであった。約７０μＭの最大に上昇した血清中グリコール酸塩のレベルが、毎月４ｍｇ／ｋｇで投与された群６で少なくとも３週間持続した。中間の血清中グリコール酸塩
実施例１６：さらなるｓｉＲＮＡ配列
ＨＡＯ１ ＮＭ＿０１７５４５．２を標的とするｓｉＲＮＡを特定するためにさらなるｓｉＲＮＡの設計を行った。
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Claims (90)

  1. 細胞でのＨＡＯ１の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、または配列番号６のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号３、配列番号４、配列番号７、または配列番号８のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含み；
    前記センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドであり、かつ
    前記センス鎖が、３’末端に付着したリガンドにコンジュゲートされている、二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  2. 前記センス鎖の全てのヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  3. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、表２に列記されたアンチセンス配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含む相補性領域を含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  4. 前記修飾ヌクレオチドの少なくとも１つが、３’末端デオキシ−チミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’−フルオロ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ−修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ−修飾ヌクレオチド、２’−アルキル−修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミデート、ヌクレオチドを含む非天然塩基、５’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、５’リン酸塩または５’リン酸塩模倣物を含むヌクレオチド、およびコレステロール誘導体またはドデンカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  5. 少なくとも１つの鎖が、少なくとも１つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  6. 少なくとも１つの鎖が、少なくとも２つのヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  7. 細胞でのＨＡＯ１（ヒドロキシ酸オキシダーゼ１）の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＨＡＯ１をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）で表され：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
    式中：
    ｉ、ｊ、ｋ、およびｌが、それぞれ独立に０または１であり；
    ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’が、それぞれ独立に０〜６であり；
    各ＮａおよびＮａ’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである０〜２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
    各ＮｂおよびＮｂ’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである０〜１０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’が、それぞれ存在しても存在しなくても良く、独立にオーバーハングヌクレオチドを表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ独立に、３つの連続したヌクレオチドの３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表し；
    Ｎｂの修飾が、Ｙの修飾とは異なり、Ｎｂ’の修飾が、Ｙ’の修飾とは異なり；かつ
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされている、二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  8. ｉが０である；ｊが０である；ｉが１である；ｊが１である；ｉおよびｊの両方が０である；またはｉおよびｊの両方が１である、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  9. ｋが０である；ｌが０である；ｋが１である；ｌが１である；ｋおよびｌの両方が０である；またはｋおよびｌの両方が１である、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  10. ＸＸＸがＸ’Ｘ’Ｘ’に相補的であり、ＹＹＹがＹ’Ｙ’Ｙ’に相補的であり、かつＺＺＺがＺ’Ｚ’Ｚ’に相補的である、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  11. ＹＹＹモチーフが、前記センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  12. Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフが、前記アンチセンス鎖の５’末端の１１位、１２位、および１３位に存在する、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  13. Ｙ’が２’−Ｏ−メチルである、請求項１２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  14. 式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩａ）で表される：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ ’−Ｎａ ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’ （ＩＩＩａ）、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  15. 式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｂ）で表される：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ’ｎｑ’５’ （ＩＩＩｂ）、
    各ＮｂおよびＮｂ ’が独立に、１〜５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  16. 式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｃ）で表される：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’ （ＩＩＩｃ）、
    各ＮｂおよびＮｂ ’が独立に、１〜５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  17. 式（ＩＩＩ）が、式（ＩＩＩｄ）で表される：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−ＸＸＸ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−ＺＺＺ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｘ’Ｘ’Ｘ’−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−Ｚ’Ｚ’Ｚ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’ （ＩＩＩｄ）、
    各ＮｂおよびＮｂ ’が独立に、１〜５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、かつ各ＮａおよびＮａ ’が独立に、２〜１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  18. 前記二本鎖領域が、１５〜３０ヌクレオチド対の長さである、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  19. 前記二本鎖領域が、１７〜２３ヌクレオチド対の長さである、請求項１８に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  20. 前記二本鎖領域が、１７〜２５ヌクレオチド対の長さである、請求項１８に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  21. 前記二本鎖領域が、２３〜２７ヌクレオチド対の長さである、請求項１８に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  22. 前記二本鎖領域が、１９〜２１ヌクレオチド対の長さである、請求項１８に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  23. 前記二本鎖領域が、２１〜２３ヌクレオチド対の長さである、請求項１８に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  24. 各鎖が、１５〜３０ヌクレオチドを有する、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  25. 各鎖が、１９〜３０ヌクレオチドを有する、請求項１または７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  26. 前記ヌクレオチドの前記修飾が、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’−メトキシエチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−デオキシ、２’−ヒドロキシル、およびこられの組み合わせからなる群から選択される、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  27. 前記ヌクレオチドの前記修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾または２’−フルオロ修飾である、請求項２６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  28. 前記リガンドが、二価または三価の分岐リンカーによって付着された１つ以上のＧａｌＮａｃ誘導体である、請求項１または７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  29. 前記リガンドが、
    Figure 2021019609
     である、請求項１または７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  30. 前記リガンドが、前記センス鎖の３’末端に付着されている、請求項１または７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  31. 次の略図で示されているようにリガンドにコンジュゲートされており、
    Figure 2021019609
     式中、ＸがＯまたはＳである、請求項３０に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  32. 少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項１または７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  33. ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、１つの鎖の３’末端に存在する、請求項３２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  34. 前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項３３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  35. 前記鎖が、前記センス鎖である、請求項３３に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  36. ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、１つの鎖の５’末端に存在する、請求項３２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  37. 前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項３６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  38. 前記鎖が、前記センス鎖である、請求項３６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  39. ホスホロチオエートヌクレオチド間結合またはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、１つの鎖の５’末端および３’末端の両方に存在する、請求項３２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  40. 前記鎖が、前記アンチセンス鎖である、請求項３９に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  41. ６〜８のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項３２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  42. 前記アンチセンス鎖が、５’末端の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３’末端の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、前記センス鎖が、５’末端または３’末端のいずれかの少なくとも２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項４１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  43. 二重鎖の前記アンチセンス鎖の５’末端の１位における塩基対がＡＵ塩基対である、請求項１または７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  44. 前記Ｙヌクレオチドが、２’−フルオロ修飾を含む、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  45. 前記Ｙ’ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾を含む、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  46. ｐ’＞０である、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  47. ｐ’＝２である、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  48. ｑ’＝０であり、ｐ＝０であり、ｑ＝０であり、かつｐ’オーバーハングヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡに相補的である、請求項４７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  49. ｑ’＝０であり、ｐ＝０であり、ｑ＝０であり、かつｐ’オーバーハングヌクレオチドが、標的ｍＲＮＡに非相補的である、請求項４７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  50. 前記センス鎖が、合計２１のヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が、合計２３のヌクレオチドを有する、請求項４１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  51. 少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに結合されている、請求項４６〜５０のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  52. 全てのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに結合されている、請求項５１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  53. 表１または表２のいずれか一方に列記されているＲＮＡｉ剤の群から選択される、請求項１または７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  54. ＡＤ−６２９９４およびＡＤ−６２９３３からなる群から選択される、請求項１に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  55. ＡＤ−６２９９４およびＡＤ−６２９３３である、請求項７に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  56. 細胞でのＨＡＯ１の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、
    二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、または配列番号６のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号３、配列番号４、配列番号７、または配列番号８のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含み、
    前記センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾および２’−フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、
    前記センス鎖が、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、
    前記アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾および２’−フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、
    前記アンチセンス鎖が、５’末端の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３’末端の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、かつ
    前記センス鎖が、前記３’末端で二価または三価の分岐リンカーによって付着された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされている、二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  57. 前記センス鎖の全てのヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾を含む、請求項５６に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  58. 細胞でのＨＡＯ１（ヒドロキシ酸オキシダーゼ１）の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＨＡＯ１をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）で表され：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
    式中：
    ｉ、ｊ、ｋ、およびｌが、それぞれ独立に０または１であり；
    ｐ、ｐ’、ｑ、およびｑ’が、それぞれ独立に０〜６であり；
    各ＮａおよびＮａ’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである０〜２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
    各ＮｂおよびＮｂ’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである０〜１０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    各ｎｐ、ｎｐ’、ｎｑ、およびｎｑ’が、それぞれ存在しても存在しなくても良く、独立にオーバーハングヌクレオチドを表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ独立に、３つの連続したヌクレオチドの３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表し、前記修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾または２’−フルオロ修飾であり；
    Ｎｂの修飾が、Ｙの修飾とは異なり、Ｎｂ’の修飾が、Ｙ’の修飾とは異なり；かつ
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされている、二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  59. 細胞でのＨＡＯ１（ヒドロキシ酸オキシダーゼ１）の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＨＡＯ１をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）で表され：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
    式中：
    ｉ、ｊ、ｋ、およびｌが、それぞれ独立に０または１であり；
    各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’が、それぞれ存在しても存在しなくても良く、独立にオーバーハングヌクレオチドを表し；
    ｐ、ｑ、およびｑ’が、それぞれ独立に０〜６であり；
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに結合され；
    各ＮａおよびＮａ’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである０〜２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
    各ＮｂおよびＮｂ’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである０〜１０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ独立に、３つの連続したヌクレオチドの３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表し、前記修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾または２’−フルオロ修飾であり；
    Ｎｂの修飾が、Ｙの修飾とは異なり、Ｎｂ’の修飾が、Ｙ’の修飾とは異なり；かつ
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされている、二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  60. 細胞でのＨＡＯ１（ヒドロキシ酸オキシダーゼ１）の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＨＡＯ１をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）で表され：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
    式中：
    ｉ、ｊ、ｋ、およびｌが、それぞれ独立に０または１であり；
    各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’が、それぞれ存在しても存在しなくても良く、独立にオーバーハングヌクレオチドを表し；
    ｐ、ｑ、およびｑ’が、それぞれ独立に０〜６であり；
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに結合され；
    各ＮａおよびＮａ’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである０〜２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
    各ＮｂおよびＮｂ’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである０〜１０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ独立に、３つの連続したヌクレオチドの３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表し、前記修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾または２’−フルオロ修飾であり；
    Ｎｂの修飾が、Ｙの修飾とは異なり、Ｎｂ’の修飾が、Ｙ’の修飾とは異なり；かつ
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、前記リガンドが、二価または三価の分岐リンカーによって付着された１つ以上のＧａｌＮａｃ誘導体である、二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  61. 細胞でのＨＡＯ１（ヒドロキシ酸オキシダーゼ１）の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＨＡＯ１をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）で表され：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−（ＸＸＸ）ｉ−Ｎｂ−ＹＹＹ−Ｎｂ−（ＺＺＺ）ｊ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ−Ｎｂ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎｂ’−（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ−Ｎａ’−ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
    式中：
    ｉ、ｊ、ｋ、およびｌが、それぞれ独立に０または１であり；
    各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’が、それぞれ存在しても存在しなくても良く、独立にオーバーハングヌクレオチドを表し；
    ｐ、ｑ、およびｑ’が、それぞれ独立に０〜６であり；
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに結合され；
    各ＮａおよびＮａ’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである０〜２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
    各ＮｂおよびＮｂ’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである０〜１０のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し；
    ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’がそれぞれ独立に、３つの連続したヌクレオチドの３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表し、前記修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾または２’−フルオロ修飾であり；
    Ｎｂの修飾が、Ｙの修飾とは異なり、Ｎｂ’の修飾が、Ｙ’の修飾とは異なり；
    前記センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；かつ
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、前記リガンドが、二価または三価の分岐リンカーによって付着された１つ以上のＧａｌＮａｃ誘導体である、二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  62. 細胞でのＨＡＯ１（ヒドロキシ酸オキシダーゼ１）の発現を阻害することができる二本鎖ＲＮＡｉ剤であって、アンチセンス鎖に相補的なセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、ＨＡＯ１をコードするｍＲＮＡの一部に相補的な領域を含み、各鎖が、約１４〜約３０ヌクレオチド長であり、前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、式（ＩＩＩ）で表され：
    センス：５’ｎｐ−Ｎａ−ＹＹＹ−Ｎａ−ｎｑ３’
    アンチセンス：３’ｎｐ’−Ｎａ’−Ｙ’Ｙ’Ｙ’−Ｎａ’−ｎｑ’５’ （ＩＩＩ）
    式中：
    各ｎｐ、ｎｑ、およびｎｑ’が、それぞれ存在しても存在しなくても良く、独立にオーバーハングヌクレオチドを表し；
    ｐ、ｑ、およびｑ’が、それぞれ独立に０〜６であり；
    ｎｐ’＞０であり、少なくとも１つのｎｐ’が、ホスホロチオエート結合によって隣接ヌクレオチドに結合され；
    各ＮａおよびＮａ’が独立に、修飾された、または修飾されていない、またはこれらの組み合わせである０〜２５のヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列が、少なくとも２つの異なる修飾のヌクレオチドを含み；
    ＹＹＹおよびＹ’Ｙ’Ｙ’がそれぞれ独立に、３つの連続したヌクレオチドの３つの同一の修飾からなる１つのモチーフを表し、前記修飾が、２’−Ｏ−メチル修飾または２’−フルオロ修飾であり；
    前記センス鎖が、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含み；かつ
    前記センス鎖が、少なくとも１つのリガンドにコンジュゲートされ、前記リガンドが、二価または三価の分岐リンカーによって付着された１つ以上のＧａｌＮａｃ誘導体である、二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  63. 表１または表２に列記されているＲＮＡｉ剤の群から選択されるＲＮＡｉ剤。
  64. ＡＤ−６２９９４およびＡＤ−６２９３３からなる群から選択される、請求項５２に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤。
  65. 細胞でのＨＡＯ１の発現を阻害することができる改変アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物であって、前記作用剤が、表１または表２のいずれか一方に列記されている配列の群から選択されるセンス配列に相補的な配列を含み、前記ポリヌクレオチドが、約１４〜約３０のヌクレオチド長である、組成物。
  66. 請求項１、７、５６、および５８〜６４のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含むベクター。
  67. 請求項１、７、５６、および５８〜６４のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤を含む細胞。
  68. 請求項１、７、５６、および５８〜６４のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤、または請求項６５に記載の改変アンチセンスポリヌクレオチド剤、または請求項６６に記載のベクターを含む医薬組成物。
  69. ＲＮＡｉ剤が、非緩衝液中で投与される、請求項６８に記載の医薬組成物。
  70. 前記非緩衝液が、生理食塩水または水である、請求項６９に記載の医薬組成物。
  71. 前記ｓｉＲＮＡが、緩衝液と共に投与される、請求項６８に記載の医薬組成物。
  72. 前記緩衝液が、酢酸塩、クエン酸塩、プロラミン、炭酸塩、またはリン酸塩、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項７１に記載の医薬組成物。
  73. 前記緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、請求項７２に記載の医薬組成物。
  74. 細胞でのＨＡＯ１の発現を阻害する方法であって：
    （ａ）請求項１、７、５６、および５８〜６４のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤、または請求項６５に記載の改変アンチセンスポリヌクレオチド剤、または請求項６６に記載のベクター、または請求項６８〜７３のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記細胞に接触させるステップ；および
    （ｂ）ステップ（ａ）で得られた細胞を、ＨＡＯ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の分解を得えるのに十分な時間維持し、これにより前記細胞でのＨＡＯ１遺伝子の発現を阻害するステップを含む、方法。
  75. 前記細胞が、対象の体内にある、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記対象がヒトである、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記ＨＡＯ１の発現が、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、または約１００％阻害される、請求項７４〜７６のいずれか１項に記載の方法。
  78. ＨＡＯ１関連障害を有する対象を処置する方法であって、治療有効量の、請求項１、７、５６、および５８〜６４のいずれか１項に記載の二本鎖ＲＮＡｉ剤、または請求項６５に記載の改変アンチセンスポリヌクレオチド剤、または請求項６６に記載のベクター、または請求項６８〜７３のいずれか１項に記載の医薬組成物を前記対象に投与し、これにより前記対象を処置するステップを含む、方法。
  79. ＨＡＯ１関連障害を有する対象を処置する方法であって、
    治療有効量の二本鎖ＲＮＡｉ剤を前記対象に皮下投与するステップを含み、
    前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
    前記センス鎖が、配列番号１、配列番号２、配列番号５、または配列番号６のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖が、配列番号３、配列番号４、配列番号７、または配列番号８のヌクレオチド配列のいずれか１つと３つ以下のヌクレオチドが異なる少なくとも１５の連続したヌクレオチドを含み、
    前記アンチセンス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾および２’−フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、
    前記アンチセンス鎖が、５’末端の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および３’末端の２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、
    前記センス鎖の実質的に全てのヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチル修飾および２’−フルオロ修飾からなる群から選択される修飾を含み、
    前記センス鎖が、５’末端における２つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、かつ
    前記センス鎖が、前記３’末端で二価または三価の分岐リンカーによって付着された１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体にコンジュゲートされ、これにより前記対象が処置される、方法。
  80. 前記センス鎖の全てのヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾を含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 前記対象がヒトである、請求項７８または７９に記載の方法。
  82. 前記ヒトがＰＨ１を有する、請求項８１に記載の方法。
  83. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇまたは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項７８または７９に記載の方法。
  84. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、または約３．０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項８３に記載の方法。
  86. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が皮下投与される、請求項８３に記載の方法。
  87. 前記二本鎖ＲＮＡｉ剤が静脈内投与される、請求項８３に記載の方法。
  88. 前記ＲＮＡｉ剤が、２回以上で投与される、請求項８３に記載の方法。
  89. 前記ＲＮＡｉ剤が、約１２時間に１回、約２４時間に１回、約４８時間に１回、約７２時間に１回、および約９６時間に１回からなる群から選択される間隔で投与される、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記ＲＮＡｉ剤が、２週間まで、３週間まで、４週間まで、５週間まで、またはそれ以上まで週に１回投与される、請求項８８に記載の方法。
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