JP2019522976A - 分子鎖合成に使用するための組成物 - Google Patents

Abstract

分子鎖を伸長するのに使用するための組成物は、担体基とペイロード基とを含む。担体基は、シグナリング基とブロッキング基とを含む。第１の結合はペイロード基を担体基に結合し、第２の結合はシグナリング基をブロッキング基に結合する。第１の結合および第２の結合は、第１の結合が第２の結合を切断せずに切断可能であるように選択的に切断可能である。ペイロード基は分子鎖に結合され、一方、ブロッキング基は、ペイロード基が結合されると、分子鎖へのさらなる結合を阻止する。シグナリング基は、問い合わせ光子による問い合わせに応答してシグネチャ光子を放出する光子放出体を含む。担体基は、第１の共有結合が切断されると、充填された状態から空の状態に移行する。【選択図】図２

Description

関連出願
本出願は、米国仮出願第６２／３５３，３１８号の２０１６年６月２２日の優先日および米国仮出願第６２／３９８，０４９号の２０１６年９月２２日の優先日の利益を主張し、これらの両方の内容は参照により本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本発明は分子鎖の合成に関し、特に一本鎖ＤＮＡに関する。

ＤＮＡ鎖を取得し、塩基対の配列を同定することは、当該技術分野において公知である。「配列決定」として知られるこのプロセスは、遺伝学の理解を促進するのに役立っている。

天然に存在するＤＮＡにどんな塩基対が存在するかを知るだけでなく、塩基対について独自の選択で新しいＤＮＡ鎖を合成できることが望ましい。そのようにできる能力により、多くの商業的および医学的応用を生じさせる可能性がある。

ヌクレオチドを結合させる公知の方法としては、標準的なホスホロアミダイト固相合成が挙げられる。代替の方法は、エラーの修正を伴うチップベースの化学ＤＮＡ合成を可能にすることに関連して、印刷されたＤＮＡマイクロアレイの使用を含む。これらの方法は両方とも、ホスホロアミダイト化学に依存する。

一態様では、本発明は、分子鎖を伸長するのに使用するための組成物を特徴とする。そのような組成物は、分子鎖に結合されるペイロード基と、ペイロード基を分子鎖にもたらす担体基とを含む。シグナリング基およびブロッキング基はこの担体基を一緒に形成する。第１の結合はペイロード基を担体基に結合し、第２の結合はシグナリング基およびブロッキング基を互いに結合する。これらの結合は、第２の結合を切断せずに、選択的に切断可能であり、第１の結合のみを切断することによって担体基を充填された状態から空の状態に移行することが可能となる。ブロッキング基は、ペイロード基が分子鎖に結合すると、分子鎖へのさらなる結合を阻止する。シグナリング基は、問い合わせ光子による問い合わせに応答してシグネチャ光子を放出する光子放出体を含む。

これらの中には、担体基が、第１の共有結合の電気化学的切断により空の状態に移行する組成物があり、担体基の酸化状態の変化の結果としてそのように移行する組成物、および担体基またはブロッキング基による電子の受容の結果としてそのように移行する組成物がある。これらの実施形態のいくつかにおいて、組成物は、電子を供給するための還元剤、または電子を電子源から担体基に輸送するためのシャトル分子を含む。

また、組成物の実施形態の中には、シグナリング基がフルオロフォアを含むもの、およびシグナリング基が、問い合わせ光子に応答して可視光範囲でシグネチャ光子を放出するように構成される放射基を含むものがある

組成物の他の実施形態は、ペイロード基がヌクレオチドを含むものであり、この場合、分子鎖はＤＮＡの一本鎖であり、また、ペイロード基がアミノ酸を含むものであり、この場合、分子鎖はタンパク質またはペプチドである。

この方法は、多くの種類の分子鎖の構築に適用可能である。例えば、いくつかの実施では、分子鎖はＤＮＡの一本鎖であり、この場合、ペイロードはヌクレオチドである。しかしながら、この方法でタンパク質を構築することもでき、この場合、ペイロードはアミノ酸である。より一般的には、この方法は、モノマーが特定の順序で結合される任意のポリマーの構築に適用可能である。このような場合、各ペイロードはモノマーである。

本発明のこれらおよび他の特徴は、以下の詳細な説明および添付の図面から明らかになる。

モノマーのオリゴマー鎖への結合の間に生じる特定の事象のスナップショットを示す。 図１に示される切断ステップを実施する方法の例である。 図１に示される切断ステップを実施する方法の例である。 図１に示される手順を実施するための合成装置の上面図を示す。 図１に示される手順を実施するための合成装置の側面図を示す。 大量生産で使用するための合成チャンバの複数の事例を有する実施形態を示す。 ヌクレオチドの構築を制御するための制御システムを示す。 合成装置の代替の実施形態の異なる図を示す。 合成装置の代替の実施形態の異なる図を示す。 合成装置の代替の実施形態の異なる図を示す。 図４および図５に示される実施形態の製造に関連して使用されるステップを示す。

本明細書に記載される装置および方法は、各ステップにおいて、所望のヌクレオチドが実際に鎖に付加されたことを確認することを含むように、一度に１ステップずつヌクレオチドの鎖を構築するように構成される。この手順は、ヌクレオチドを伸長鎖に結合するための、ヌクレオチドおよび末端デオキシヌクレオチド転移酵素（ＴｄＴ）などの適切な酵素の微小流体により制御された導入によって実施される。

図１は、単一のヌクレオチド１８を鎖１２に付加して実施されるステップを示す。このように、図１に示されるステップは、付加される各ヌクレオチド１８について繰り返される。

ステップ（ａ）において、図１は、第１の末端１４および第２の末端１６を有するＤＮＡ鎖１２を示し、その一方は表面に連結されている。第１の末端１４と第２の末端１６との間には、ヌクレオチド１８の伸長配列１９がある。

ＤＮＡ鎖１２を合成するプロセスは、所望の配列を有するヌクレオチド配列１９が得られるまで、さらなるヌクレオチド１８を第１の末端１４に繰り返し結合させることを含む。典型的な実施形態において、第１の末端１４は３’末端に対応し、この場合、第２の末端１６は５’末端に対応する。しかしながら、他の実施形態において、第１の末端１４は５’末端に対応し、その場合、第２の末端１６は３’末端に対応する。

典型的なヌクレオチド配列１９は数千のヌクレオチド１８を有することができる。合成手順は一度に１つのヌクレオチド１８を付加することを含むので、ヌクレオチド１８を迅速に付加することができることが重要である。ＤＮＡ鎖１２の機能性は、ヌクレオチド配列１９にいかなるエラーも存在しないことに大きく依存する。小さなエラーでさえ、ＤＮＡ分子の機能性を破壊しないまでも損なうのに十分である。したがって、実用的な合成装置は、高速で、信頼性が高く、エラーが発生したときにエラーを修正することができなければならない。

特定のヌクレオチド１８を第１の末端１４に結合させる手順は、ステップ（ｂ）に示されるように、第１の末端１４を、充填担体２０の多くの分子および酵素２２の多くの分子を含有する溶液に曝露することを含む。好適な酵素２２は、ＴｄＴなどの天然に存在する酵素、またはこのような酵素の修飾型である。

各担体２０は、シグナリング基２８に付加されたブロッキング基２６を含む。本明細書に記載される実施形態において、シグナリング基２８は１つのフルオロフォアを担持する。担体２０は２つの状態で存在する：充填された状態、および空の状態。充填された状態では、担体２０はそのペイロードに共有結合する。空の状態では、担体２０はもはやそのペイロードに結合せず、したがって新しいペイロードを受け入れることができる。例示した実施形態において、ペイロードは、天然に存在するヌクレオチド１８のいずれか１つである。

充填された状態から空の状態へ移行するために、担体２０は、それ自体とそのペイロードとの間の共有結合の切断を受ける。この共有結合は、他の結合を乱さないで残すようにしながら、切断機構がこの結合を切断するように構成される。切断は様々な方法で実施され得る。例えば、適切なエネルギーの光子で担体２０を照射し、それにより光学的切断を促進することができる。さらに、この結合を化学的に切断することも可能である。

適切な切断方法は、図２および３に関連して記載されるような電気化学的方法である。このような電気化学的切断の場合、共有結合は、ブロッキング基２６とシグナリング基２８との間の結合を切断するのに必要とされる還元電位より低い、この共有結合を切断するのに必要とされる還元電位を有することによって他の結合を乱さないままで切断するように構成される。これは、切断機構がペイロードのみを分離し、一方、シグナリング基２８およびブロッキング基２６を依然として互いに結合したままにすることを確実にする。

担体２０は、天然に存在するヌクレオチド１８のいずれかを担持することができる。したがって、例えば、グアニンを伸長するＤＮＡ鎖１２に結合させるために、グアニンを担持する多くの充填担体２０で環境を満たす。次いで、例えば、ＤＮＡ鎖１２のグアニンの上部にシトシンを結合させるために、グアニンを担持するあらゆる充填担体２０を洗い流し、次いで、全く新しい組の充填担体２０（今回は代わりにシトシンを担持する）で環境を満たす。これにより、異なる種類のヌクレオチド１８の伸長するＤＮＡ鎖１２への連続的な結合が可能となる。

ＤＮＡ鎖１２への結合は即座には起こらない。したがって、次のステップは、所定の結合間隔を待つことである。この間隔は、酵素２２の１つおよび充填担体２０の１つが伸長ＤＮＡ鎖１２の第１の末端１４で互いに出合う可能性が高くなるように十分に長い。これが起こると、ステップ（ｃ）に示されるように、酵素２２は、充填担体２０を第１の末端１４に結合させる。

上述したように、充填担体２０はブロッキング基２６を備えている。この時点で、ブロッキング基２６が作用し始める。１つの充填担体２０がＤＮＡ鎖１２に結合すると、その関連するブロッキング基２６は、あらゆるさらなる充填担体２０がそれら自体に結合するのを防ぐ。

完全な結合間隔を待った後でも、第１の末端１４には何も結合することができなかった可能性が存在する。したがって、充填担体２０が実際に第１の末端１４に結合したことを確認することが重要である。

上述のように、担体２０はまた、シグナリング基２８も含む。この時点で、シグナリング基２８が必要となる。

シグナリング基のフルオロフォアは、問い合わせ光子（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｏｒｙ ｐｈｏｔｏｎ）３０による照射に応答してシグネチャ光子（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｐｈｏｔｏｎ）３１を放出する。問い合わせ光子３０でフルオロフォアを照射するプロセスは、本明細書では「問い合わせ（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）」と称する。その結果生じるシグネチャ光子３１の放出は「応答」である。

溶液中の各担体２０は、独自のフルオロフォアを有する独自のシグナリング基２８を有する。疑似シグネチャ光子３１の検出を避けるために、これらは全て問い合わせ前に洗い流されるべきである。結合が成功した場合、１つのシグナリング基２８が残る、すなわち、いずれかの担体２０のシグナリング基２８に属するものが最終的にＤＮＡ鎖１２に結合し、新たに付加されるヌクレオチド１８をそのＤＮＡ鎖１２と一緒にする。

ステップ（ｄ）に示されるように、洗浄（フラッシング）ステップの後、問い合わせが行われる。これは、ステップ（ｅ）に示されるように、ＤＮＡ鎖１２を問い合わせ光子３０で照射して、フルオロフォアにおける電子をより高いエネルギーレベルまで励起し、次いで、この電子がその基底状態まで減衰するにつれて放出されるシグネチャ光子３１の検出を試みることを含む。１つのシグネチャ光子３１のみが放出され得るので、収集効率は非常に重要である。収集効率が高くても、しばしば繰り返し問い合わせる必要がある。

問い合わせを繰り返した後、シグネチャ光子３１が検出されなかった場合、第１の末端１４に何も結合できなかったと推測することができる。したがって、担体２０を結合させるために別の試みがなされなければならない。

他方で、シグネチャ光子３１が検出された場合、担体２０が現在、ＤＮＡ鎖１２の第１の末端１４に結合していると推測することができる。この時点で、シグナリング基２８およびブロッキング基２６の両方がそれらの役割を完了する。これらは、次に、３つの理由のために取り除かなければならない。第１に、完成品中のそれらの存在は、その機能を妨げる可能性がある。第２に、ブロッキング基２６が残っている場合、さらなる結合は起こり得ない。第３に、シグナリング基２８が残っている場合、そのフルオロフォアは、後続の問い合わせ段階の間にシグネチャ光子３１を放出し得る。これは、検出器が、光子がどこから来たかを知る方法がないので、混乱を引き起こす。

したがって、次のステップは、ステップ（ｆ）に示されるように、担体２０を分離することである。これは以下に記載されるように電気化学的に最適に実施される。シグナリング基２８とブロッキング基２６との間の結合の還元電位は、担体２０とそのペイロードであるヌクレオチド１８との間の結合のものとは異なる。これは、シグナリング基２８およびブロッキング基２６がユニットとして一緒に取り除かれることを確実にする。したがって、担体２０を除去すると、ヌクレオチド１８のみがＤＮＡ鎖１２の第１の末端１４に残る。

しかしながら、他の実施形態は、他の方法で担体２０を分離することを意図する。例えば、担体２０を分離するために、純粋に化学的または純粋に光学的な機構を使用することができる。

この電気化学的分離ステップの後、シグナリング基２８およびブロッキング基２６が実際に除去されたことを確認することが有用である。次に、ステップ（ｄ）に関連して上述したものと同じ問い合わせ手順を実施することができる。シグナリング基２８がもはや結合されていない場合、応答はない。したがって、いかなる応答も存在しないことから、鎖１２は現在、次の所望のヌクレオチド１８に対して準備ができていると推測することができる。他方で、シグネチャ光子３１が検出された場合、電気化学的分離ステップを単に繰り返す。以下に記載されるように、シグナリング基２８はブロッキング基２６に共有結合している。したがって、シグナリング基２８が存在しない場合、ブロッキング基２６も、もはや存在しないことを合理的に推測することができる。

空の担体２０にヌクレオチド１８を充填するのに適した機構は、ヌクレオチドの３’ヒドロキシル基を、切断可能な官能基を介してフルオロフォア置換ベンゾキノンに共有結合することである。このような切断可能な官能基の一例はキノンオキシムエーテルである。別のものは、キノンが還元すると、自発的なラクトン化／切断を受けるように設計されたエステルである。

担体２０を非充填するために、電気化学的還元によって３’ヒドロキシル基を非ブロックすることができる。このような電気化学的還元は、電気化学反応において使用される電子についての供給源およびシンクを提供することによって実施され得る。電子についての供給源およびシンクを提供する１つの方法は、適切な媒体と接触する電極を提供することである。いくつかの場合、電極と反応部位との間で電子を移動させるための電子輸送シャトル分子を提供することが有用であり得る。代替法は、溶液中に還元性分子を提供することである。３’ヒドロキシル基が非ブロックされると、還元から生じるフルオロフォアを含有する生成物を洗い流すことが可能となり、その例にはアミノフェノールまたはクロマン−２−オンが挙げられる。

切断可能な基は種々の方法のいずれかで作製され得る。図２に示される一例は、切断可能な基がキノンオキシムエーテルであり、ヌクレオチドが３’位にアミノオキシ置換を有する複合体を特徴とする。示される特定の実施形態において、担体２０は、フルオロフォア２８に付加されたリンカー２４を含むように修飾されたベンゾキノンを導入することによって作製される。適切なリンカー２４は、反復メチレンまたはエチレングリコール単位から作製され、フルオロフォアを含むように容易に修飾され得る官能基で終結されるリンカーである。このような官能基の多くの例の１つは第一級アミンであり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル修飾フルオロフォアと反応させることができる。これに続いて、ベンゾキノンオキシムエーテルを形成する。このようなエーテルは、ベンゾキノンをアミノオキシ基と縮合させることによって形成することができる。

例えば図１のステップ（ｆ）の間にＤＮＡ鎖１２を非ブロックする時間になると、窒素と酸素との間の結合を切断する。これは次に、フルオロフォア置換アミノフェノールを放出し、次いで、このアミノフェノールはシステムから洗い流され得る。いくつかの実施形態において、窒素と酸素との間の結合の実際の切断は、緩衝溶液中で適切な時間、電位差に曝露することによって実施される。いくつかの例では、これは、わずかにアルカリ性のリン酸緩衝溶液、すなわち、ｐＨ７．４に維持される溶液中で、１００ｍＶの電位差に６０秒間曝露することによって実施される。しかしながら、この切断を他の方法で実施することも可能である。１つの方法は、溶液中に適切な還元剤を含むことである。

多くの実施形態の別のものが図３に見られ得る。この特定の実施形態は、切断可能な基が、キノンが還元すると、自発的なラクトン化を受けるように設計された複合体を特徴とする。

この実施形態は、ヌクレオチドの３’ヒドロキシル基をキノンと結合させることを含む。キノンは、還元時に６員環形成を促進するように選択された官能基を有するように修飾されている。この官能基は、３−（２，５−ジメチル−３，６−ジオキソシクロヘキサ−１，４−ジエン−１−イル）−３−メチルブタン酸エステルである。また、キノンは図２に示されるものと同様に、フルオロフォア２８に付加されるリンカー２４を有するようにさらに修飾されている。電気化学的還元は、図２に関連して記載されているように、化学種による電子の受容を含む。この電子は、溶液中の電極または還元剤などのいくつかの電子源によって提供される。本明細書に記載される特定の実施形態において、電子はベンゾキノンを還元する。この結果、ヒドロキノンが形成される。一旦形成されると、ヒドロキノンは自発的にラクトン化してクロマン−２−オンを形成する。そうすることで、それはヌクレオチド１８の遊離３’ヒドロキシル基を表す。

図４を参照すると、図１に関連して説明した手順を実施するのに適した合成装置３２は、微小流体システム３４、励起システム３６、および検出システム３８を特徴とする。これらのシステム３４、３６、３８の各々に接続されたプロセッサ４０は、合成装置３２の動作を制御する。

微小流体システム３４は、シリコン基板などの基板４２からエッチングされる。これは、このような基板４２が硬質であり、高圧に耐えることができるので有益である。高圧の使用は、より高速の液体流を可能にし、したがってより大きなスループットを可能にする。このより大きなスループットは、１日あたり１０^４ヌクレオチドのオーダーの速度で、または１０秒ごとに約１ヌクレオチドの結合で、ＤＮＡ鎖１２の構築を可能にする。このような基板４２の顕著な多孔性が存在しないことは、処理の間に使用される種々の物質、例えばヌクレオチド１８の吸収または捕捉を抑制する可能性が高い。さらに、天然に存在する結晶面はほぼ完全な光学表面の製造を可能にし、それにより、より大きな収集効率を促進する。

エッチングはドライエッチング技術を使用して、例えば、基板を反応性イオンに曝露することによって実施され得る。しかしながら、この方法を使用して傾斜した側壁および平滑な表面を作製することは困難である。

別のエッチング方法は、エッチング速度が結晶の異なる方向に沿って異なるウェットエッチングである。このような異方性エッチングは、水酸化カリウム溶液を使用して実施され得る。この種類のエッチングにおいて、１１１ファセットが、最もエッチングが遅い。シリコンの場合、これにより、側壁７０は５４．７°の角度になる。

別のエッチング方法は、水酸化カリウムの代わりに、特に表面張力を低下させる薬剤である水酸化テトラメチルアンモニウムで置換する。これにより、装置の幾何学的形状に対して良好に制御することが可能となり、特に、結晶１１０の面に関連する表面などの結晶表面を露出させることが可能となる。結晶表面は、それらがほぼ完全な光学表面を形成するので、光子の収集に特に有益である。

微小流体システム３４は、第１の末端１４へのさらなるヌクレオチド２０の結合が行われる合成チャンバ４４を含む。第１のチャネル４６は入ってくる媒体を合成チャンバ４４に運び、第２のチャネル４８は廃棄またはリサイクルのために、出ていく媒体を合成チャンバから取り出す。

第１のチャネル４６は、合成チャンバ４４を複数の媒体供給源５４に接続する。それらは複数の充填担体源５６を含み、その各々は、複数の天然に存在するヌクレオチド１８の対応する１つが充填担体２０を供給する。また、洗浄媒体の供給源に接続する洗浄媒体供給源５８、および遺伝子工学的酵素供給源５９も含まれる。各媒体供給源５４は、その供給源５４を第１のチャネル４６に選択的に接続するための対応する弁５０を有する。

励起システム３６は、シグナリング基２８と光通信するように配置される光源６０を含む。フルオロフォア問い合わせの間、プロセッサ４０は、光源６０に、シグナリング基２８内のフルオロフォアを励起するようにする光のパルスを提供させる。励起パルスが完了すると、検出システム３８が引き継ぎ、フルオロフォアがそのシグネチャ光子３１で応答するのを待つ。

第１の実施形態において、合成チャンバ４４はガラスカバー６４を備えたウェル６２の形態をとる。ウェル６２は、ＤＮＡ鎖１２の第２の末端１６が結合する機能化スポット６８を有する床６６を有する。機能化スポット６８を形成するための適切な手段は、電子ビームまたはイオンビームを使用して、床６６上にナノパターン化カーボンドットを配置し、次いでイオン化アンモニアガスに曝露することによってカーボンドットのアミン官能化を実施することである。

第２の末端１６は機能化スポット６８に連結されており、ヌクレオチド１８が第１の末端１４に付加されているので、シグネチャ光子３１が検出器７４への移動を開始する位置は、付加されたヌクレオチド１８ごとに変化することになる。このことは、検出システム３８が、構築されるＤＮＡ鎖１２全体に適合するのに十分な大きさである体積から単一光子を効率的に検出できなければならないことを意味する。この体積は１立方マイクロメートルのオーダーである。

収集効率を促進するために、機能化スポット６８はウェル６２内の中心に配置されなければならない。しかしながら、ウェル６２が十分に深い場合、収集効率の損失は比較的小さい。例えば、その床６６で５ミクロンの幅である２０マイクロメートルの深さのウェル６２の場合、機能化スポット６８をウェルの床の縁部に配置すると、収集効率が９８％から９５％に低下する。

ガラスカバー６４と床６６との間の距離は、表面流れの影響を回避するのに十分である。ウェル６２を必要以上に深くすることは可能であるが、そのようなさらなる深さには特別な利点はない。幅が５マイクロメートル未満であるウェルについての適切な深さは、少なくとも０．９の開口数を有する集光光学系および５４．７度の側壁を有するデバイスに対して１０マイクロメートルである。ガラスカバー６４と出会う平面におけるウェル６２についての適切な直線寸法は、約５０マイクロメートルである。

側壁７０は放物面に近似しているだけであるが、それにもかかわらず、放物面と同様に機能するように十分に傾斜している。その結果、フルオロフォア２８によって放出された光は、ガラスカバー６４の上方に配置された顕微鏡レンズ７２に向かって反射される傾向がある。次いで顕微鏡レンズ７２は、光を検出器７４に中継する。放出された光を検出器７４に向かって誘導するこの傾向は、非常に効率的な検出システム３８をもたらす。

検出器７４は、単一光子を検出するために最適化されたものである。適切な検出器７４はアバランシェフォトダイオードに基づくものである。例示した実施形態において、顕微鏡レンズ７２は、受け取ったシグネチャ光子３１を検出器７４に向ける。しかしながら、他の実施形態において、ファイバプローブがシグネチャ光子３１を検出器７４に送達する。さらに他の実施形態において、ウェルのすぐ上に配置された単一光子検出器７４の活性領域がシグネチャ光子３１を受け取る。

合成装置３２はまた、ウェル６２を横切る電位を生成するための機構を含む。これは、担体２０の結合を確認した後に、鎖１２からブロッキング基２６を切断するのに役立つ。一実施形態において、床６６における第１の電極７６およびガラスカバー６４における第２の電極７８が電気化学的切断のための電子の供給源およびシンクを提供する。適切な第１の電極７６はアルミニウム接地面である。ガラスカバー６４上のその位置のために、第２の電極７８は透明である。適切な透明な第２の電極７８はインジウムスズ酸化物から作製されたものである。電極は、図２および３に関連して説明される電気化学的切断において使用される電子の豊富な供給を確実にするのに十分な印加電圧に維持される。この電圧は、結合しようとする次のヌクレオチド２０の導入の前に生じる、図１のステップ（ｆ）の間に印加される。それは、電気化学的切断が望まれない場合、止められる。これは、図１のステップ（ａ）〜（ｅ）に対応する。

チャネル４６、４８、ウェル６２、および関連する弁５０は、１つの製造ユニット８０を画定する。この製造ユニット８０はモジュール式であり、図６に示されるように、同じ基板上で複数回繰り返され得る。これにより、ＤＮＡ鎖の大量生産が可能となる。いくつかの実施形態において、各製造ユニット８０に関連する弁５０が独立して制御される。このことは、図６に示される製造ユニット８０のアレイにおいて、異なるウェルがＤＮＡ鎖１２に異なるヌクレオチド配列１９を配置することができることを意味する。

図４および５の合成装置３２は、その第２の末端１６によって連結され、新たなヌクレオチド１８が付加される自由に浮遊する第１の末端１４を有する、ＤＮＡ鎖１２と関連して記載されている。この欠点は、シグナリング基２８の位置が、ＤＮＡ鎖１２がさらに大きく伸長するにつれて変化することである。これは、付加され得るヌクレオチド１８の数に実際的な上限を課す。結局のところ、ある時点で、ＤＮＡ鎖１２の長さはチャンバのサイズのかなりの部分を占める。これは収集効率を損なう傾向がある。

この困難性を回避する１つの方法は、代わりに第１の末端１４を連結し、その基質を実際に放出することなく連続反応を触媒する能力を有する酵素２２を使用することである。この特性を有する酵素２２は、本明細書では「プロセッシブ酵素」と称される。連結した第１の末端１４へのヌクレオチド１８の付加を触媒するためにプロセッシブ酵素２２を使用する場合、たとえＤＮＡ鎖１２が非常に長くなったとしても、シグナリング基２８は常に同じ位置にある。

図７は、異なるウェルにおいて異なるヌクレオチド配列１９を製造するためのビュッフェ法（ｂｕｆｆｅｔ ｍｅｔｈｏｄ）を実施するための装置を示す。図６の場合と同様に、基板は複数の製造ユニット８０を有する。しかしながら、その独自の供給源５４を制御するためのその独自の組の選択弁５０を有する各製造ユニット８０の代わりに、全てのウェル６２は同じ供給源５４を共有する。この場合、制御装置４０は代わりに、各製造ユニット８０において第１の電極７６および第２の電極７８を制御する。

ビュッフェ法において、制御装置４０は１つのコースにつき１つのヌクレオチド１８を供給する。したがって、これは、各ヌクレオチド２０について１つずつ、４つのコースを循環し、次いでこのサイクルを再び繰り返す。特定の製造ユニット８０に関して、供給すべき次のヌクレオチド２０が望まれないならば、制御装置４０は、その製造ユニットに対する第１の電極７６および第２の電極８０に切断電圧を印加することを単に回避する。その場合、ＤＮＡ鎖１２は図１のステップ（ｃ）〜（ｅ）に示される状態のままである。結果として、そのヌクレオチド１８を担持する充填担体２０がその製造ユニット８０に供給される場合、残存するブロッキング基２６は、充填担体２０が結合するのを阻止する。

この方法において、制御装置４０は、所望のヌクレオチド１８を有する充填担体２０をもたらす次のコースの直前の切断時間帯まで切断電圧を印加することを回避する。制御装置４０が、所望のヌクレオチド１８がその途中にあることを認識すると、制御装置４０は第１の電極７６および第２の電極７８に電圧を印加し、それにより担体２０をＤＮＡ鎖１２から取り除くことができ、こうしてそのＤＮＡ鎖１２を露出させ、所望のヌクレオチド１８を担持する充填担体２０を受容する準備をする。

前述の実施は、製造するのがより簡単である。しかしながら、各製造ユニット８０は、次のヌクレオチド１８が到着する間、数回のコースを待たなければならないので、スループットの損失がある。

図８〜１０は、その軸に沿って延在するフォトニック結晶８２を有する基板４２上に形成された合成装置３２の実施形態を示す。いくつかの実施形態において、フォトニック結晶８２に使用される誘電体は、厚さ２００ｎｍの層内に形成される窒化ケイ素である。

窒化ケイ素は、高品質のフィルムを得ることができる容易さのため、および窒化ケイ素を処理する技術が周知であるため、部分的に適切な選択である。さらに、窒化ケイ素は比較的容易に機能化され、水の屈折率よりも大きい屈折率を有し、目的の波長において透過性である。これは、水性媒体と接触する導波路を通して光を導くための良好な選択である。

他方で、窒化ケイ素の屈折率は適切であるが、最も優れているわけではない。さらに、窒化ケイ素は、それ自体が蛍光を発する傾向がある。このバックグラウンド蛍光はシグネチャ光子３１の検出をいくらか妨げ得る。

示した実施形態は一次元フォトニック結晶８２を示す。このような結晶は、フォトニック結晶の軸に対して垂直に配向されたフルオロフォアに対して高い収集効率を有する。しかしながら、フルオロフォアの軸がこの方向から逸脱すると、収集効率は急速に低下する。したがって、一次元フォトニック結晶が使用される場合、フルオロフォアの配向を制御することがいくらか重要である。

フルオロフォアの配向を制御する必要性を回避する１つの方法は、二次元フォトニック結晶８２を使用することである。これは、未知の偏光方向を有する直線的な偏波を確実に捕捉するため、一対の公差双極子を使用することに類似している。このようなフォトニック結晶８２は、フルオロフォアがフォトニック結晶の縦軸に対して正確に垂直でない場合でも、収集効率を維持する傾向がある。

二次元フォトニック結晶８２の使用は材料に制約を課す。特に、屈折率は、一次元フォトニック結晶８２に必要な屈折率よりも大きいことが好ましい。二次元フォトニック結晶８２に適した材料としては、炭化ケイ素、ダイヤモンド、および窒化ガリウムが挙げられる。

しかしながら、フルオロフォアの配向を化学的に制御することも可能であり、それにより一次元フォトニック結晶８２でさえも良好な偏光適合を促進する。

フルオロフォアの配向に対して正確な制御を与える１つの方法は、塩基対が特定の様式で折りたたまれるように選択された別個のＤＮＡ分子を使用して基板を機能化することである。本明細書において「ＤＮＡオリガミ」と称されるこのような折りたたまれたＤＮＡ分子は、図１〜４に記載される装置および方法を使用して構築され得る。

得られたＤＮＡオリガミは基質に結合し、プロセッシブ酵素２２についての結合点を形成する。ＤＮＡオリガミは折りたたまれて、プロセッシブ酵素２２の位置を固定する方法を提供する。プロセッシブ酵素２２は、結合しているヌクレオチド１８と相互作用し、このヌクレオチド１８は、フルオロフォアも有する担体２０に結合しているので、ＤＮＡオリガミはまた、フルオロフォアの位置または配向を固定することができる。

図２および図３に示されるように、リンカー２４は、フルオロフォアを充填担体２０の残りの部分に連結する。このリンカー２４の剛性は、シグナリング基２８、特にその基内のフルオロフォアの配向を制御するための基礎を提供する。リンカーを剛性にすることによって、フルオロフォアを特定の望ましい構造で凍結することが可能となる。より柔軟なリンカー２４は、電磁場などの外部刺激がフルオロフォアの配向に作用することを可能にする。

フォトニック結晶８２は、第１の有孔領域８４および第２の有孔領域８６ならびに無孔領域８８を含み、第１の有孔領域８４は、第２の有孔領域８６と無孔領域８８との間に配置される。無孔領域８８および第２の有孔領域８６は一定の幅を有する誘電材料の長さである。第１の有孔領域８４は、その中心がより広く、その端部に向かって先細になっており、それにより無孔領域８８および第２の有孔領域に滑らかに融合する誘電材料の長さである。第１の有孔領域８４は、その中心において、約７００ｎｍの幅を有する。縁部では、それは約５００ｎｍの幅を有する。先細は、式ｗ＝７００−ｘ^２を有する放物線に従い、ここで、ｘは、無孔領域８８の２０ミクロンの長さに沿って−１から１の範囲に及ぶ。

一列に配置された第１の組の孔９２は第１の有孔領域８４を貫通する。第１の有孔領域８４は、フルオロフォアの自由空間放出範囲と重複する共振周波数を有する空洞を画定するように構成される。同様に、第２の組の孔９４は第２の有孔領域８６を貫通する。孔９２はほぼ楕円形であり、長軸はフォトニック結晶８２を横切って延び、短軸はフォトニック結晶８２の中心に沿って延びる。特定の実施形態において、孔９２の中心は２３０ｎｍ離れており、孔は３２０ｎｍの長軸および１２０ｎｍの短軸を有する楕円形の孔である。

孔９２は、中心孔９６が第１の有孔領域８４の中心に位置するように配置される。この中心穴９６は、ＤＮＡ鎖１２の第１の末端１４が結合する機能化スポット６８を有する床６６を有する。いくつかの実施形態において、機能化スポット６８はカルボキシシラン活性化結合スポットである。

図９および図１０に同様に十分に表されている代替の実施形態は、第１の有孔領域８４を貫通する一列に配置された第１の列のカラム（ｃｏｌｕｍｎ）９２を有する第１のコロネード（ｃｏｌｏｎｎａｄｅ）８４を特徴とする。第１のコロネード８４は、フルオロフォアの自由空間放出範囲と重複する共振周波数を有する空洞を画定するように構成される。同様に、第２のコロネード９４は第２の列のカラム９４を特徴とする。カラム９２はほぼ楕円断面であり、長軸はフォトニック結晶８２を横切って延び、短軸はフォトニック結晶８２の中心に沿って延びる。特定の実施形態において、カラム９２の中心は２３０ｎｍ離れており、各カラムの断面は３２０ｎｍの長軸および１２０ｎｍの短軸を有する。

カラム９２は、一対の隣接するカラム９６が第１のコロネード８４の中心に床領域６６を画定するように配置される。この床領域６６は、ＤＮＡ鎖１２の第１の末端１４が結合する機能化スポット６８を有する。いくつかの実施形態において、機能化スポット６８はカルボキシシラン活性化結合スポットである。

流体がカラムの周りを流れることが比較的容易であるために、そのコロネードを有する代替の実施形態は、機能化スポット６８の周りの床領域６６への、および床領域６６からの流体の流れを促進するという利点を提供する。

第１の実施形態において、それは、機能化スポット６８に結合される第２の末端１６であった。結果として、ヌクレオチド１８はテザー末端（すなわち、第２の末端１６）の反対側の自由末端（すなわち、第１の末端１４）に付加された。ＤＮＡ鎖１２が長くなると、シグネチャ光子３１は、機能化スポット６８から次第に遠くに伸長する点から出現する。

第２の末端１６と機能化スポット６８との間の絶えず増大する距離は、チャンバ４４が非常に大きなＤＮＡ鎖１２を収容するのに十分な大きさであったので、第１の実施形態では重大な問題ではなかった。

しかしながら、第２の実施形態では、チャンバ４４は、これが問題となるほど十分に小さい。この第２の実施形態において、ＤＮＡ鎖１２は約５００ナノメートルを超えて伸長すると、それはチャンバのサイズのかなりの部分を占める。これは収集効率の顕著な低下をもたらす。結果として、ＤＮＡ鎖１２をあまり長くすることはできない。例えば、１０００個より多いヌクレオチド１８を有するＤＮＡ鎖１２は構築することが困難になり得る。

したがって、この第２の実施形態において、第１の末端１４を機能化スポット６８に結合させることが好ましい。結果として、シグネチャ光子３１が検出器７４へのその移動を開始する位置はほぼ同じままである。また、この相違の結果として、第２の実施形態は、ヌクレオチド１８をＤＮＡ鎖１２に結合させるために、ＴｄＴのプロセッシブ型などのプロセッシブ酵素２２の使用を必要とする。いくつかの実施形態において、このような酵素２２は機能化スポット６８に連結される。

第２の実施形態は、第１の実施形態に記載されるものと同様の微小流体システム３４を含む。第２の実施形態における励起システム３６はフォトニック結晶８２に結合した光源６０を含む。検出システム３８は無孔領域８８に結合した検出器７４を含む。これらは、第１の実施形態と同様であるため、示さない。

動作は第１の実施形態に記載されるものと同様に進行するので、詳細に記載する必要はない。相違は、光源６０がフォトニック結晶８２を通して光のパルスを伝送するときに始まる。この時点で、フルオロフォアは、より高いエネルギーレベルに上げられた電子を有する。したがって、検出器７４は、この電子が基底状態に下がるのを待ち、それによりシグネチャ光子３１を検出することができる。

フルオロフォアは、真空からの誘発光子の自然放出に応答してシグネチャ光子３１を放出する。フォトニック結晶８２は、自由空間発光スペクトルと重なる共鳴を有する光共鳴空洞を提供することによって、このような自然放出を促進するように構成される。次いでフルオロフォアがこの空洞内に配置される。

第２の実施形態において、シグネチャ光子３１の自然放出速度を高め、フルオロフォアの退色を抑制する試みがなされる。これは、トリガ波長を有する光子が合成チャンバ４４内にそれ自体で現れやすくなるように、第１の組の孔９２の幾何学的形状を選択することによって実施される。特に、第１の有孔領域８４内の孔の幾何学的形状および先細は、第１の有孔領域８４が自然放出を促進する共振空洞として作用するように選択される。

したがって、第２の実施形態は、自然放出を促すことによって、フルオロフォアの蛍光寿命ではなく、それが退色するまでの時間である寿命を延ばす。これにより、フルオロフォアの励起エネルギー状態が、退色などの非放射経路ではなく、シグネチャ光子３１をもたらすように減衰する可能性がより高くなる。

しかしながら、フルオロフォアがそのシグネチャ光子３１を放出すると、それも検出器に向けられる問題が依然として存在する。結局、放出されると、シグネチャ光子３１は４πステラジアンに相当する進行方向を有し、そのうちのいくつかのみが検出器７４に導かれる。

第１の実施形態において、側壁は放物面に近似するように成形された。したがって、それらはシグネチャ光子３１を適切な方向に反射することができた。類似の機能を実施するために、第２の実施形態は、その第２の有孔領域８６およびフォトニック結晶８２の幾何学的形状に依存する。

シグネチャ光子３１は、放出されると、フォトニック結晶８２に入る。したがって、フォトニック結晶８２は、フォトニック結晶８２の軸に対して横断する方向に移動できないように、シグネチャ光子３１をトラップする。しかしながら、シグネチャ光子３１は依然としてフォトニック結晶８２の軸に沿って自由に移動する可能性がある。検出器７４は無孔領域８８の末端にあるので、シグネチャ光子３１が誤った方向に移動する確率は５０％である。

第２の実施形態において採用される解決策は、第２の有孔領域８６を反射体として機能させることである。これは、第１の有孔領域８４の幅と一致し、第２の組の均一なサイズの孔９２を有する第２の有孔領域８６を提供することによって達成され、その孔９２の各々は、第２の有孔領域８６の始まりに最も近い第１の有孔領域８４における孔のサイズおよび形状と一致する。したがって、この第２の有孔領域８６内を伝播し始める光子は、方向転換し、反対方向、すなわち、最終的に検出器７４に至る無孔領域８８に向かうように促される。したがって、この配置は収集効率を促進する。

次に図１１を参照すると、図４および図５に示される合成装置３２を製造するプロセスは、シリコン基板４２上で二酸化ケイ素層９８を成長させ（ステップ（ａ））、次いで二酸化ケイ素層９８上でフォトレジスト層１００をスピンコーティングする（ステップ（ｂ））ことによって開始する。次いで適切なマスクが、チャネル４６、４８およびウェル６２の将来の位置をマーキングするために作製される（ステップ（ｃ））。次にフォトレジスト１００を露光し、現像する。これに続いて、緩衝酸化物エッチング（フッ化物イオンエッチング）を使用するウェットエッチングステップ（ステップ（ｄ））が行われる。次にフォトレジスト１００が剥離され、二酸化ケイ素層９８が残され、その二酸化ケイ素層９８は選択的にエッチングされて、下にあるシリコン基板４２が露出される（ステップ（ｅ））。

次のステップは、チャネル４６、４８およびウェル６２などの液体を含有する特徴部を実際に形成することである。これは、より深い異方性エッチング、典型的には、水酸化物アニオンおよびテトラメチルアンモニウムカチオンまたはカリウムカチオンのいずれかを有する溶液への曝露に依存するウェットエッチングプロセスを含む。アンダーカットを低減させるために、溶液の表面張力を低下させることが有用である。これを行う１つの方法は界面活性剤を添加することである。好適な界面活性剤は、オクチルフェノールエトキシレートなどの非イオン性界面活性剤である。得られたチャネル４６、４８およびウェル６２は、基板４２の１１１、１１０、および１００平面によって決定づけられる角度で側壁７０を有する（ステップ（ｆ））。基板４２がシリコンであるこれらの実施形態では、このプロセスは、露出された＜１１１＞平面に対して５４．７度の側壁７０、および露出された＜１１０＞平面に対して４５度の側壁７０をもたらす。

このエッチング後、二酸化ケイ素層９８が完全に剥離される。そうすることで、裸基板４２が後に残され、次にその裸基板４２は、チャネル４６、４８およびウェル６２にエッチングされる（ステップ（ｇ））。

最終的に、ウェル６２は、シグネチャ光子３１を検出器に反射することが予想される。裸のシリコン基板４２は特に反射されないので、この時点で、ウェル６２内に反射性金属層１０２を堆積させることが有用である（ステップ（ｈ））。適切な反射性金属層１０２はアルミニウム製のものおよび銅製のものを含む。次に、誘電体スペーサが反射性金属層１０２の上に配置される（ステップ（ｉ））。この誘電体スペーサは、フルオロフォアが金属表面と接触した場合にフルオロフォアの消光を回避するのに有用である。適切な誘電体スペーサはＡｌ_２Ｏ_３である。誘電体スペーサの機能は、反射性金属層１０２によるフルオロフォアの蛍光消光を抑制すること、ならびに反応物および洗浄液による反射性金属層１０２の腐食を抑制することである。

次いで電子ビームまたはイオンビームを使用して、機能化スポット６８をウェルの床６６に配置する（ステップ（ｊ））。炭素は機能化スポット６８に適した材料であるが、二酸化ケイ素などの別の材料を使用することもできる。また、機能化スポット６８は、電子ビームリソグラフィを使用して、水素シルセスキオキサンなどのネガ型材料を直接的にパターン化し、それを機能化することによって、またはポジ型レジストを堆積させ、蒸着またはガス状機能化を使用して機能化を規定することによって、作り出すこともできる。

次のステップは、液体を含有する特徴部が準備されると、流体が漏れるのを防ぎ、汚染物質が入るのを防ぐために、微小流体システム３４を覆うことである。これは、誘電体スペーサ上に接着スポット１０６のパターンを配置し、接着スポット１０６上にカバーガラス６４を配置することによって実施される（ステップ（ｋ））。このプロセスは、マイクロコンタクトリソグラフィまたはエアロゾルジェット印刷を使用して実施され得る。あるいは、陽極接合などのプロセスを使用してデバイスを封止することができる。

本発明およびその好ましい実施形態を説明してきたが、新規で特許により保護されるものは特許請求の範囲に記載される通りである。

Claims (13)

1. 分子鎖を伸長するのに使用するための組成物であって、前記組成物は、担体基およびペイロード基を含み、前記担体基はシグナリング基およびブロッキング基を含み、第１の結合が前記ペイロード基を前記担体基に結合し、第２の結合が前記シグナリング基を前記ブロッキング基に結合し、前記第１の結合および前記第２の結合は、前記第１の結合が前記第２の結合を切断せずに切断可能であるように選択的に切断可能であり、前記ペイロード基は前記分子鎖に結合され、前記ブロッキング基は、前記ペイロード基が前記分子鎖に結合すると、前記分子鎖へのさらなる結合を阻止するように構成され、前記シグナリング基は、問い合わせ光子による問い合わせに応答してシグネチャ光子を放出する光子放出体を含み、前記担体基は、第１の共有結合が切断すると、充填された状態から空の状態に移行するように構成される、組成物。
2. 前記担体基は、前記第１の共有結合の電気化学的切断により前記空の状態に移行するように構成される、請求項１に記載の組成物。
3. 前記担体基は、前記担体基の酸化状態の変化の結果として前記空の状態に移行するように構成される、請求項１に記載の組成物。
4. 前記担体基は、前記ブロッキング基の酸化状態の変化の結果として前記空の状態に移行するように構成される、請求項１に記載の組成物。
5. 前記担体基は、前記担体基による電子の受容の結果として前記空の状態に移行するように構成される、請求項１に記載の組成物。
6. 前記担体基は、前記ブロッキング基による電子の受容の結果として前記空の状態に移行するように構成される、請求項１に記載の組成物。
7. 前記電子を供給するための還元剤をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
8. 電子を電子源から前記担体基に輸送するためのシャトル分子をさらに含む、請求項６に記載の組成物。
9. 前記シグナリング基はフルオロフォアを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
10. 前記シグナリング基は、問い合わせ光子に応答して可視光範囲でシグネチャ光子を放出するように構成される放射基を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
11. 前記ペイロード基はヌクレオチドを含み、前記分子鎖はＤＮＡの一本鎖である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
12. 前記ペイロード基はアミノ酸を含み、前記分子鎖はタンパク質を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
13. 前記第１の結合は前記第２の結合より低い結合エネルギーを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。