CN111235004B - 一种基因测序芯片的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因测序芯片的制备方法，包括以下步骤：S1，将半导体激光光源和光波导层集成在同一基底，以易于半导体激光光源出射光与光波导层耦合、传输及用于零模波导外延纳米孔结构阵列荧光分子的激发；S2，在基底表面的光波导层的上方制备纳米尺度环形模板，以方便后续将纳米孔外延凸出于光波导层；S3，采用自组装技术自下而上在纳米尺度环形模板上制备外延凸出于纳米尺度环形模板的外延纳米孔结构阵列，以获得陡直度可控的自组装纳米孔阵列，用于基因测序中单分子荧光激发及检测；S4，对外延纳米孔阵列进行后处理，实现外延纳米孔尺度的调整及表面性质的改进；其纳米孔制作工艺相对简单，信噪比更高且光耦合效率高。

Description

一种基因测序芯片的制备方法

技术领域

本发明涉及DNA测序领域，特别涉及一种基因测序芯片的制备方法。

背景技术

基因测序(Gene sequencing，或译基因定序)是指分析特定基因片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤的(G)排列方式。快速的基因测序方法的出现极大地推动了生物学和医学的研究和发现。

自上世纪70年代起,人们已先后发展了三代DNA测序技术。第一代DNA测序技术基于Sanger法，耗时15年完成了人类基因组计划，直接花费约30亿美元，高昂的时间和经济成本令人望而生畏。第二代DNA测序技术以高通量为特点，仅需一周、花费不到100万美元就能完成人类基因组的测序。近年来，基于固态纳米孔器件的DNA单分子探测分析被认为是最有希望实现第三代快速低成本人类基因测序的技术路线之一，成为目前研究和应用探索的热点，在24小时内花费1000美元以下实现单分子实时测序。

单分子实时测序是Pacific Biosciences(CA,USA)推出的一项专利技术。该方法采用四色荧光标记的dNTP和被称为零模波导(zero-mode waveguides,ZMW)的纳米结构对单个DNA分子进行测序。零模波导结构主要是由石英玻璃衬底及表面带有纳米级别直径通孔的金属层构成，大量的纳米孔可以同时制备在同一个芯片上有效提高零模波导的检测通量，零模波导存在一个截止波长，大于该波长的光不能在波导中传播，而是在纳米孔入口处产生消逝波，在入射光大于该截止波长时，纳米孔中没有光传输模式，将这种波导模式称为零模波导。为降低信号噪声，这种ZMW是直径50-100纳米，深度100nm的孔状纳米光电结构，通过微加工在二氧化硅基质的金属铝薄层上形成微阵列，光线进入ZMW后会呈指数级衰减，仅能照亮靠近底部的约30nm区域，从而使得孔内仅有靠近底部基质的部分被照亮。Φ29DNA聚合酶被固定在ZMW的底部，模板和引物结合之后被加到酶上，再加入四色荧光标记的dNTP(A555-dATP,A568-dTTP,A647-dGTP,A660-dCTP)。当DNA合成进行时，大部分游离的荧光标记dNTP不会被激发，只有结合到DNA聚合酶上的dNTP由于在ZMW底部停留的时间较长(约200ms)，其荧光基团被激光照亮，激发荧光，由于结合到酶上的dNTP停留时间较长，信号呈脉冲式激发，其荧光信号能够与本底噪音区分开来，从而被识别。荧光基团被连接在dNTP的磷酸基团上，因此在延伸下一个碱基时，上一个dNTP的荧光基团被切除，从而保证了检测的连续性，提高了检测速度。

纳米孔目前最重大的应用是测序研究，零模波导纳米孔指的是孔径尺寸在纳米尺度的孔道，通常为50～100纳米。纳米孔因其独特的微观尺寸形貌和孔基材固有的物化属性赋予了它广阔的应用前景，纳米孔技术的开发也是一个广泛研究的领域。

目前的基因测序芯片的纳米孔一般是在基材表面形成的内凹纳米孔，其需要在基材表面通过刻蚀工艺形成内凹纳米孔，工艺复杂，提高了测序成本；

目前基因测序芯片采用的纳米孔的降噪效果不是特别理想，信噪比仍然比较低；

目前单分子测序时采用的激光光源一般外置，体积庞大，成本高，且由于入射光源要激发纳米孔底部的荧光分子才方便确定荧光标记的碱基种类，光源外置的情况下入射光源也不易设置以方便激发纳米孔底部的荧光分子，光耦合效率低；

综上所述，有必要提出一种纳米孔制作工艺相对简单，信噪比更高且光耦合效率高的的基因测序芯片。

发明内容

针对现有技术中存在的不足之处，本发明的主要目的是，提供一种基因测序芯片的制备方法，其纳米孔制作工艺相对简单，信噪比更高且光耦合效率高。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基因测序芯片的制备方法，包括以下步骤：

S1，将半导体激光光源和光波导层集成在同一基底，以易于半导体激光光源出射光与光波导层耦合、传输及用于零模波导外延纳米孔结构阵列荧光分子的激发；

S2，在基底表面的光波导层的上方制备纳米尺度环形模板，以方便后续将纳米孔外延凸出于光波导层；

S3，采用自组装技术自下而上在纳米尺度环形模板上制备外延凸出于纳米尺度环形模板的外延纳米孔结构阵列，以获得陡直度可控的自组装纳米孔阵列，用于基因测序中单分子荧光激发及检测；

S4，对外延纳米孔阵列进行后处理，实现外延纳米孔尺度的调整及表面性质的改进；

通过在步骤S3中所制备的外延纳米孔的孔壁沉积不同厚度的膜层材料实现对外延纳米孔尺度的调整，形成具有零模波导效应的外延纳米孔阵列结构，通过采用与所述膜层材料同质或异质的材料在外延纳米孔表面制备表面涂层实现外延纳米孔表面性质的改进。

进一步地，所述基底包括底层和上层，在底层放置CMOS四色光电探测器，上层为光学透明层。

进一步地，所述步骤S1中将半导体激光光源和光波导层集成在同一基底的的方式为：在上层表面相对设置半导体激光光源和光波导层，光波导层用于接收并传播从半导体激光光源发出的出射光。

进一步地，所述步骤S2中的基底表面的光波导层的上方制备纳米尺度环形模板的方法为电子束光刻法、短波长光刻法、极紫外光刻法或者纳米压印法中的至少一种。

进一步地，所述步骤S3中的采用自组装技术自下而上在纳米尺度环形模板上制备外延凸出于纳米尺度环形模板的外延纳米孔结构阵列的方法为金属化学气相沉积法、化学气相沉积法、分子束外延法、水热法或电化学沉积法中的至少一种。

进一步地，步骤S1中采用的光波导层包括芯层和包层。

进一步地，采用干法或者湿法刻蚀技术在包层表面对应外延纳米孔底部的位置对包层结构进行减薄处理，以便于光波导层中的光波在外延纳米孔底部所对应的位置以消逝场的形式进入纳米孔，从而激发相应的荧光分子。

进一步地，外延纳米孔孔壁可以由至少一层材料构成，该材料可包括导电材料、半导体、绝缘体中的任一个或多个的组合。

进一步地，构成外延纳米孔孔壁的材料包括金属和非金属的交替层。

优选地，所述外延纳米孔为圆形、椭圆形、正方形、矩形或多边形。

上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点或有益效果：

采用自组装技术自上而下在纳米尺度环形模板表面制备外延凸出于纳米尺度环形模板表面的纳米孔阵列结构，无需在芯片表面刻蚀纳米孔，简化了制作工艺；

采用电子束、离子束、紫外光刻或者纳米压印结合自组装等技术方法被应用于纳米孔的加工中，可以有效地控制孔径的范围，得到合适孔径的纳米孔，并加工出的纳米孔可以满足单分子荧光基因测序的需求；

采用自组装技术制备的外延纳米孔与基底表层光波导层的角度可达90度陡直度，具有模板诱导下严格的取向性，表面容易形成原子级光滑终结面，用于单分子测序具有较低的光子散射性，其信噪比更高；

将半导体激光光源，光波导及外延纳米孔集成在同一个基底上，采用出射光直接耦合激发，减少了光波损失，耦合效率高，更容易高效激发激光光源，且无需外置激光装置，节省设备，节约成本；采用干法或者湿法刻蚀技术在包层表面对应于外延纳米孔底部的位置对包层进行减薄处理，以便于光波导层中的光波在外延纳米孔底部所对应的位置以消逝场的形式进入纳米孔，从而激发相应的荧光分子，并通过刻蚀图形化技术在光波导层的包层对应外延纳米孔底部的位置设置微孔阵列结构，便于半导体激光光源的出射光照亮进入外延纳米孔激发外延纳米孔底部的标记核苷酸的荧光分子，进一步降低单分子测序噪音；由于自组装的外延纳米孔结构是一种陡直度可控的完美的光波导结构，具有优越的光子传输方向性，有效避免了光子的随机散射，探测光可以从纳米孔直接进行探测，因此具有高效激发及探测、探测信噪比高的特点；通过将外延纳米孔的底部靠近光波导层设置，使得外延纳米孔内发出的大部分的荧光朝向CMOS四色光电检测器被向下引导。

附图说明

图1为根据本发明一个实施方式提出的基因测序芯片的示意图。

附图标记说明：1、半导体激光光源；2、外延纳米孔；3、光波导层；31、芯层；32、包层；4、上层；5、底层。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

在附图中，为清晰起见，可对形状和尺寸进行放大，并将在所有图中使用相同的附图标记来指示相同或相似的部件。

根据本发明的一实施方式参见图1，本发明提供一种基因测序芯片的制备方法，包括以下步骤：

S1，将半导体激光光源1和光波导层3集成在同一基底，以易于激光光源出射光与光波导层耦合、传输及用于零模波导纳米孔阵列荧光分子的激发；

基底包括底层5和上层4，在底层放置CMOS四色光电探测器，上层4为光学透明层，以便激发能量和发射能量；在上层4表面相对设置半导体激光光源1和光波导层3，光波导层3用于接收并传播从半导体激光光源1发出的出射光，从而将半导体激光光源1和光波导层3集成在同一基底上，即在同一基底上制备激光芯片，光波导层3包括芯层31和包层32，芯层采用的材料包括但不限于氮化硅，包层采用的材料包括但不限于二氧化硅；结合光刻手段，采用干法或者湿法刻蚀技术在包层32表面对应于纳米孔2底部的位置对包层进行减薄处理，减薄处理后光波导层无法有效的约束光波在光波导中传输，有一部分光波在包层32减薄处形成光渗透，产生消逝场，以便于光波导层中的光波在外延纳米孔底部所对应的位置以消逝场的形式进入纳米孔，从而激发相应的荧光分子；然后通过刻蚀图形化技术在包层32表面对应零模波导外延纳米孔2底部的位置设置孔径大于或相当于零模波导外延纳米孔2孔径尺寸的微孔阵列结构，从而方便半导体激光光源的出射光经光波导层3的包层31表面以消逝场的形式进入纳米孔，从而激发相应的荧光分子。半导体激光光源的出射光通过该消逝场后呈指数级衰减，进入零模波导纳米孔的入射光仅能够照亮激发纳米孔底部的与DNA模板单链发生互补反应的荧光分子，通常可以实现0-50纳米深度荧光分子的有效激发，从而避免激发没有与DNA模板单链发生互补反应的背景荧光分子，进一步降低测序噪音；半导体激光光源1为薄膜层，其更易与光波导层3精密耦合，且耦合效率高，通过将半导体激光光源薄膜层和光波导层3集成在同一基底上，无需外置激光光源装置，节省设备，节约成本。所述半导体激光光源1和光波导层3的耦合方式可以采用端面耦合、棱镜耦合、光栅耦合等方式。

S2，在基底表面的光波导层3的上方制备纳米尺度环形模板，以方便后续将纳米孔外延凸出于光波导层3；

纳米尺度环形模板具体可采用但不限于电子束光刻法、短波长光刻法、极紫外光刻法或者纳米压印法等方法中的至少一种在基底表面的光波导层上实现。采用电子束光刻技术可以实现数个纳米及几百纳米尺度任意结构电子束光刻胶的小批量制备，采用极紫外或者短波长光刻技术可以批量实现几十到几百纳米光刻胶层的图形化，采用紫外/热纳米压印手段可以几十纳米到几百纳米压印胶的图形化，采用以上手段制备的纳米结构均满足用于零模波导检测原理的基因测序纳米孔结构。

S3，采用自组装技术自下而上在纳米尺度环形模板上制备外延凸出于纳米尺度环形模板的外延纳米孔2结构阵列(附图1示出)，以获得陡直度可控的自组装纳米孔阵列，用于基因测序中单分子荧光激发及检测，由于该自组装纳米孔阵列具有较高陡直度，有效避免了光子的随机散射，因此提高探测信噪比；

外延纳米孔2的尺度、形状可以依据设计要求进行制作及加工，具体可以采用但不限于金属化学气相沉积(MOCVD)法、化学气相沉积(CVD)法、分子束外延(MBE)法、水热(HT)法、电化学沉积(EL)法等方法中的至少一种在上述步骤中制备的模板上采用自下而上的手段自组装纳米孔结构，纳米孔2的高度优选为50-500纳米。纳米孔2孔壁和基底层材料可以是同质或者异质材料，最终实现纳米孔阵列结构的制备。

采用自组装技术制备的外延纳米孔2与基底表层光波导层3的角度可达90度陡直度，具有模板诱导下严格的取向性，表面容易形成原子级光滑终结面，用于单分子测序具有较低的光子散射性，其信噪比更高；通过将外延纳米孔的底部靠近光波导层设置，使得纳米孔内发出的大部分的荧光朝向CMOS四色光电检测器被向下引导。

外延纳米孔2可具有任意合适的形状，例如圆形、椭圆形、正方形、矩形、多边形等。在一些实施方式中，纳米孔的侧壁可以是大体上平直且垂直的。

外延纳米孔2孔壁可以由至少一层的材料构成，该材料可包括导电材料、半导体、和绝缘体中的任一个或组合。在一些实施方式中，外延纳米孔孔壁材料可包括高导电金属层，例如金、银、铝、铜。在一些实施方式中，外延纳米孔孔壁材料可包括包含金、银、铝、铜、钛、氮化钛、和铬中的任一个或组合的多层堆。在一些实施例中，此外或可替代地，可使用其它金属。根据一些实施方式，外延纳米孔孔壁材料可包含合金，例如AlCu或AlSi。在一些实施方式中，多层的不同的金属或合金可用于形成纳米孔孔壁。在一些实施例中，其中构成外延纳米孔孔壁的材料可包括金属和非金属的交替层，例如金属与一种或多种介电体的交替层。在一些实施方式中，非金属可包括聚合物，例如聚乙烯基膦酸或者聚乙二醇(PEG)-巯基。

S4，对外延纳米孔2阵列进行后处理，实现外延纳米孔尺度的调整及表面性质的改进；

通过在步骤S3中所制备的纳米孔2的孔壁沉积不同厚度的膜层材料实现对纳米孔尺度的调整，所述膜层材料包括但不限于透明的二氧化硅、氮化铝、氮化硅、氧化铝等材料，通过采用与所述膜层材料同质或异质的材料制备表面涂层，以达到孔壁及孔底部表面亲疏水不同的效果，以满足零模波导检测原理的基因测序纳米孔结构的制备。

DNA测序时需要采用移液枪等移液装置把待测DNA模板单链、DNA聚合酶及4色荧光分子标记的核苷酸加入入到制备的外延纳米孔2中，然后借助半导体激光光源和光波导层、CMOS四色光电探测器等元器件采用零模波导原理进行检测。

如上所述，本实施例基于微纳工艺实现外延纳米孔的设计及制备，开发出用于基因测序的高通量纳米孔芯片；采用电子束法、离子束法、紫外光刻法或者纳米压印法结合自组装等技术方法被应用于外延纳米孔的加工中，这类加工方法依赖于高精度的设备仪器，可以有效地控制孔径的范围，得到合适孔径的外延纳米孔。以上所采用的微纳加工方法应用范围广，通过自主设计加工外延纳米孔结构阵列，探究加工不同外延纳米孔的模式，从而完成外延纳米孔加工的优化，且加工出的外延纳米孔可以满足单分子荧光基因测序的需求。

通过上述步骤将半导体激光光源1，光波导层3及外延纳米孔2集成在同一个基底上，采用出射光直接耦合激发，减少了光波损失，由于自组装的纳米孔结构是一种完美的光波导结构，具有优越的光子传输方向性，且外延纳米孔凸出于光波导层设置，探测光可以从纳米孔直接进行探测，因此具有高效激发及探测的特点。

通过上述方法制备的基因测序芯片，包括设置有CMOS四色光电探测器的底层5，设于底层5上方的上层4，在上层4表面相对设置的半导体激光光源1和光波导层3，凸出于光波导层3设置的外延纳米孔2结构阵列。

工作原理：通过上述步骤制备的具有外延纳米孔阵列的基因测序芯片满足零模波导检测原理，从而实现单分子荧光基因测序，单分子基因测序是基于边合成边测序的原理，被不同颜色荧光标记磷酸基团的核苷酸在聚合酶活性位点上和模板结合，不同核苷酸加入配对时会发出不同光，核苷酸类型可由光的波长和峰值来判断；

来自半导体激光光源1的出射光耦合到光波导层3，耦合方式包括但不限于端面耦合、棱镜耦合、光栅耦合等现有技术中比较成熟的耦合技术，光波导层3中的光波在外延纳米孔2底部所对应的位置以消逝场的形式进入外延纳米孔2底部激发核苷酸标记的荧光分子；外延纳米孔2底部荧光分子发射的荧光通过光波导层3、上层4进入底层5内设置的CMOS四色光电探测器进行接收，CMOS四色光电检测器根据接收到的光信号判断纳米孔内发出荧光的核苷酸的碱基种类。

如上所述，采用上述步骤制备的基因测序芯片，其纳米孔制作工艺相对简单，信噪比提高且光耦合效率高，对于单分子测序技术的应用具有深远的意义。

这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的基因测序芯片的制备方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (6)

1.一种基因测序芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，将半导体激光光源和光波导层集成在同一基底，以易于半导体激光光源出射光与光波导层耦合、传输及用于零模波导外延纳米孔结构阵列荧光分子的激发；所述光波导层为芯层和包层，采用干法或者湿法刻蚀技术在包层表面对应外延纳米孔底部的位置对包层结构进行减薄处理，以便于光波导层中的光波在外延纳米孔底部所对应的位置以消逝场的形式进入纳米孔，从而激发相应的荧光分子；所述基底包括底层和上层，在底层放置CMOS四色光电探测器，上层为光学透明层；

将半导体激光光源和光波导层集成在同一基底的的方式为：在上层表面相对设置半导体激光光源和光波导层，光波导层用于接收并传播从半导体激光光源发出的出射光；

S2，在基底表面的光波导层的上方制备纳米尺度环形模板，以方便后续将纳米孔外延凸出于光波导层；

S3，采用自组装技术自下而上在纳米尺度环形模板上制备外延凸出于纳米尺度环形模板的外延纳米孔结构阵列，以获得陡直度可控的自组装纳米孔阵列，用于基因测序中单分子荧光激发及检测；

S4，对外延纳米孔阵列进行后处理，实现外延纳米孔尺度的调整及表面性质的改进；通过将外延纳米孔的底部靠近光波导层设置，使得纳米孔内发出的大部分的荧光朝向CMOS四色光电检测器被向下引导；

通过在步骤S3中所制备的外延纳米孔的孔壁沉积不同厚度的膜层材料实现对外延纳米孔尺度的调整，形成具有零模波导效应的外延纳米孔阵列结构，通过采用与所述膜层材料同质或异质的材料在外延纳米孔表面制备表面涂层实现外延纳米孔表面性质的改进。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S2中的基底表面的光波导层的上方制备纳米尺度环形模板的方法为电子束光刻法、短波长光刻法、极紫外光刻法或者纳米压印法中的至少一种。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤S3中的采用自组装技术自下而上在纳米尺度环形模板上制备外延凸出于纳米尺度环形模板的外延纳米孔结构阵列的方法为金属化学气相沉积法、化学气相沉积法、分子束外延法、水热法或电化学沉积法中的至少一种。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：外延纳米孔孔壁由至少一层材料构成，该材料为导电材料、半导体、绝缘体中的任一个或多个的组合。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：构成外延纳米孔孔壁的材料为金属和非金属的交替层。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述外延纳米孔为圆形、椭圆形、正方形、矩形或多边形。