[go: up one dir, main page]

CN102047122B - 用于检测生物分子的相互作用的方法和单元 - Google Patents

用于检测生物分子的相互作用的方法和单元 Download PDF

Info

Publication number
CN102047122B
CN102047122B CN200980119720.7A CN200980119720A CN102047122B CN 102047122 B CN102047122 B CN 102047122B CN 200980119720 A CN200980119720 A CN 200980119720A CN 102047122 B CN102047122 B CN 102047122B
Authority
CN
China
Prior art keywords
carrier
supported member
carrier supported
hollow stent
biomolecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200980119720.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102047122A (zh
Inventor
山野博文
龟井修一
丹花通文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toyo Kohan Co Ltd
Original Assignee
Toyo Kohan Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyo Kohan Co Ltd filed Critical Toyo Kohan Co Ltd
Publication of CN102047122A publication Critical patent/CN102047122A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102047122B publication Critical patent/CN102047122B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above
    • B01L3/5082—Test tubes per se
    • B01L3/50825—Closing or opening means, corks, bungs
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/14—Process control and prevention of errors
    • B01L2200/142—Preventing evaporation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/04—Closures and closing means
    • B01L2300/041—Connecting closures to device or container
    • B01L2300/042—Caps; Plugs
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/04—Closures and closing means
    • B01L2300/046—Function or devices integrated in the closure
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0627—Sensor or part of a sensor is integrated
    • B01L2300/0636—Integrated biosensor, microarrays

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

本发明涉及一种单元，所述单元是用于在使用固定有生物分子的载体检测生物分子的相互作用中使用的单元，其具备一端具有开口部另一端封闭的中空支架和固定有载体的可插入中空支架的载体支撑构件，所述载体固定有生物分子，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，载体支撑构件的后端部和中空支架开口部的边缘咬合，由此中空支架被密封，同时，载体支撑构件和中空支架被定位，在以定位姿势沿包括中空支架轴心的面切开的剖面图中，由中空支架的内侧和固定有载体的载体支撑构件的外侧所构成的面积在载体支撑构件的自载体固定部至前端部的区域，在轴心的左右是大致相同的。

Description

用于检测生物分子的相互作用的方法和单元
技术领域
本发明涉及使用固定有生物分子(生体関連分子)的载体检测生物分子的相互作用的方法以及用于在该方法中使用的单元。
背景技术
随着基因组解析的发展，参与各种生物的生理反应的生物分子被明确。这些生物分子包括DNA、蛋白质、糖链、细胞等，功能和结构等已明确的分子被用于药物开发或临床检验、食品检验、环境检测等各种产业用途中。
在以临床检验为首的检验中，通常采用以下的方法。即，如果使检体与载体上固定有与要检测的生物分子(以下称为分析物)特异性结合的探针分子(以下称为配体)的器件接触，当检体上存在分析物时，由于和配体结合，分析物在载体上被捕获，从而该被捕获的分析物被检测到。
如上所述的检验方法近年来也要求高速化、自动化，从而迫切希望研究出同时综合地计测几百～几万的生物分子的检测方法，使用固定生物分子的集成技术、所谓的MEMS技术的器件设计成为可能，其是作为所谓的微阵列用于药物开发研究和生物研究中的综合解析。
作为器件的微阵列根据被固定在载体上的探针分子的种类，包括DNA微阵列(也称之为DNA芯片)、蛋白质微阵列(也称之为蛋白质芯片)、细胞微阵列(也称之为细胞芯片)等。
解析是使预先用例如荧光物质进行了荧光标记的检体接触微阵列上，然后洗涤微阵列，然后检测测定荧光物质发出的荧光信号，从而鉴定或定量检体中所含的分析物(特表2006-515065号公报)。
DNA芯片等的微阵列通常被制成载玻片那样的大小，专门在其上滴上检体，用标本覆盖使之反应。今后，根据用途大量自动处理微阵列是必要的。这种情况下希望将微阵列小型化，并且希望开发出用于自动处理小型化微阵列的有效的手段。
发明概述
本发明人等为了自动处理小型化了的微阵列，而将微阵列固定在支撑构件上，将其插入容纳有检体的中空支架(holder)中，使之反应，结果发现由于检体的容积为微量(几μ～几百μ)，所以受表面张力影响，检体与微阵列的接触进行得不充分，导致反应不充分。
因而，本发明的课题是提供一种在小型化微阵列的自动处理中，用于使微量的检体与微阵列的接触充分进行的手段。
本发明人通过在将微阵列固定在支撑构件上后将其插入容纳有反应液的中空支架中使之反应之际，进行定位，使支撑构件不偏斜地插入到中空支架内，发现检体与微阵列的接触得以充分进行，从而完成了本发明。
即，本发明包含以下的发明。
(1)单元，所述单元是使用固定有生物分子的载体检测生物分子的相互作用中使用的单元，其具备一端具有开口部另一端封闭的中空支架和固定有载体的可插入中空支架的载体支撑构件，所述载体固定有生物分子，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，载体支撑构件的后端部和中空支架开口部的边缘咬合，由此中空支架被密封，同时，载体支撑构件和中空支架被定位，在以定位姿势沿包括中空支架轴心的面切开的剖面图中，由中空支架的内侧和固定有载体的载体支撑构件的外侧所构成的面积在载体支撑构件的自载体固定部至前端部的区域，在轴心的左右是大致相同的。
(2)(1)所述的单元，载体支撑构件中的载体固定部是具有底面和侧面的凹部，载体被配置于凹部的底面。
(3)(2)所述的单元，载体支撑构件凹部的至少后端部一侧的侧面是倾斜面。
(4)(3)所述的单元，倾斜面的表面粗糙度在10μm以下，倾斜面与底面所成的角度在75°以下。
(5)(2)～(4)任一项所述的单元，在载体支撑构件凹部的自前端部一侧的侧面至前端部形成有排液槽。
(6)(1)～(5)任一项所述的单元，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，在载体支撑构件的自载体固定部至前端部一侧的区域，载体支撑构件的体积占中空支架容积的比例为60％以上。
(7)(1)～(6)任一项所述的单元，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，载体支撑构件的体积占中空支架容积的比例为25～70％。
(8)(1)～(7)任一项所述的单元，具有分别固定有载体的多个载体支撑构件，载体支撑构件的后端部分别被固定于表面材料，具有对应于各个支撑构件的多个中空支架。
(9)使用固定有生物分子的载体检测生物分子的相互作用的方法，包括：将固定有生物分子的载体固定于载体支撑构件，将该载体支撑构件插入到一端具有开口另一端封闭的容纳有反应液的中空支架中，由此使载体上生物分子与反应液中已被荧光标记的生物分子进行相互作用的相互作用工序；通过洗涤载体除去没有和载体上固定的生物分子发生相互作用的生物分子的洗涤工序和对载体照射激发光，通过检测器检测荧光的检测工序；在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，载体支撑构件的后端部和中空支架开口部的边缘咬合，由此中空支架被密封，同时，载体支撑构件和中空支架被定位，在以上述定位姿势沿包括中空支架轴心的面切开的剖面图中，由中空支架的内侧与固定有载体的载体支撑构件的外侧所构成的面积在载体支撑构件的自载体固定部至前端部的区域，在轴心的左右是大致相同的。
(10)(9)所述的方法，载体支撑构件中的载体固定部是具有底面和侧面的凹部，载体被配置于凹部的底面。
(11)(10)所述的方法，载体支撑构件凹部的至少后端部一侧的侧面是倾斜面。
(12)(11)所述的方法，倾斜面的表面粗糙度在10μm以下，倾斜面与底面所成的角度在75°以下。
(13)(10)～(12)任一项所述的方法，在载体支撑构件凹部的自前端部一侧的侧面至前端部形成排液槽。
(14)(9)～(13)任一项所述的方法，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，在载体支撑构件的自载体固定部至前端部一侧的区域，载体支撑构件的体积占中空支架容积的比例为60％以上。
(15)(9)～(14)任一项所述的方法，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，载体支撑构件的体积占中空支架容积的比例为25～70％。
(16)(9)～(15)任一项所述的方法，具有分别固定有载体的多个载体支撑构件，载体支撑构件的后端部分别被固定于表面材料，具有对应于各个支撑构件的多个中空支架。
根据本发明，可提供一种在小型化微阵列的自动处理中，用于使微量的检体与微阵列的接触充分进行的手段。
本说明书包含作为本申请优先权基础的特愿2008-141155号的说明书、权利要求书和附图中记载的内容。
附图说明
图1给出了本发明的一个实施方式。
图2给出了本发明的一个实施方式。
图3给出了本发明的一个实施方式。
图4给出了本发明的一个实施方式。
图5给出了本发明的一个实施方式。
图6给出了载体支撑构件的后端部和中空支架开口部的边缘咬合的情况(a)和不咬合的情况(b)的比较结果。
图7给出了具有排液槽的载体支撑构件(a)、不具有排液槽的载体支撑构件(b)和中空支架(c)的一个实施方式。
图8给出了使用具有排液槽的载体支撑构件和不具有排液槽的载体支撑构件时的检测结果。
图9给出了在插入到中空支架的姿势下，载体支撑构件的体积占中空支架的容积的比例为80％的载体支撑构件(a)和50％的载体支撑构件(b)分别插入到容纳有反应液的中空支架中的结果。
具体实施方式
本发明中，生物分子包括DNA和RNA等核酸、肽、糖链和细胞、它们的复合体以及它们与其他分子的复合体等。本发明中，肽包括寡肽、多肽和蛋白质。载体上固定的生物分子是肽时，通常1～1000kDa、优选1～200kDa的肽是理想的。此外，载体上固定的生物分子是核酸时，通常3～5000碱基、优选10～1000碱基的核酸是理想的。此外，载体上固定的生物分子是糖链时、通常1～100糖、优选1～30糖的糖链是理想的。本发明中，生物分子优选是核酸、更优选是DNA。
生物分子的相互作用优选是指生物分子之间的特异性相互作用，包括例如，蛋白质之间的相互作用、蛋白质和肽的相互作用、核酸之间的相互作用、蛋白质和核酸的相互作用、蛋白质和化合物的相互作用等。更具体而言，可举出：核酸互补链之间的杂交、抗原与抗体或其片断的反应、酶与基质或抑制剂的结合反应、配体和受体的结合反应、亲和素和生物素的结合反应、核酸和转录因子的结合反应、细胞粘附因子的结合反应、糖链和蛋白质的结合反应、脂肪链和蛋白质的结合反应、磷酸基和蛋白质的结合反应、辅助因子和蛋白质的结合反应等。
本发明使用固定有生物分子的载体(有时也称之为微阵列)检测生物分子的相互作用，其特征在于，在该检测中，使用具备一端具有开口部另一端封闭的中空支架和固定有微阵列且可插入中空支架的载体支撑构件的单元；通过将载体支撑构件插入到容纳有反应液的中空支架中，使微阵列和反应液接触，使生物分子相互作用。
一端具有开口部另一端封闭的中空支架只要是能容纳反应液，则无特殊限制。中空支架可以是单独的支架，也可以使用多个连结得到的支架。中空支架可举出本技术领域中通常使用的微型管和微滴板(例如，96孔板)等。中空支架尺寸是本领域技术人员根据用途可适当设定的，但可使用例如开口部的直径在6～12mm的范围，长度在15～35mm的管状物。
中空支架中可容纳含被荧光标记了的生物分子的检体作为反应液，通过向其中插入载体支撑构件，使载体和反应液接触，使载体上的生物分子与反应液中被荧光标记了的生物分子相互作用。反应液也可容纳核酸扩增产物。在通过洗涤载体除去和载体上固定的生物分子未发生相互作用的生物分子的洗涤工序中，也可在将洗涤液容纳于中空支架、发生相互作用后再将载体支撑构件插入其中进行洗涤。也可分别使用容纳检体作为反应液的中空支架和容纳洗涤液作为反应液的中空支架。
在使载体上的生物分子与反应液中的被荧光标记了的生物分子发生相互作用的相互作用工序中，优选通过加热中空支架来加热反应液。本发明中，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，通过载体支撑构件的后端部和中空支架开口部的边缘相咬合，中空支架被密封，因而可在抑制反应液蒸发的同时，有效加热。有时，在加热之际，一部分蒸发的反应液会在密封中空支架的载体支撑构件后端部冷却，从而形成液滴。因而，在相互作用工序中，通过对载体支撑构件后端部也一起加热，可抑制液滴的形成，防止微量的反应液减少导致反应液中生物分子的浓度发生变化。相互作用工序中的加热温度为30～60℃，优选为35～55℃，载体支撑构件后端部的加热温度也是一样的。
本发明中，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，载体支撑构件的后端部和中空支架开口部的边缘咬合，载体支撑构件和中空支架被定位。例如，如图1所示，通过载体支撑构件12的后端部13和中空支架11的开口部的边缘15咬合，载体支撑构件在中空支架内被定位在规定的位置上(图1a)，如果载体支撑构件12的后端部13和中空支架11的开口部的边缘15没有咬合，每次把载体支撑构件插入中空支架，中空支架内的载体支撑构件的位置都会发生变化，不能定位在规定的位置上(图16)。
本发明中，载体支撑构件和中空支架构成如下：在以载体支撑构件被插入到中空支架的上述定位姿势下，沿包括中空支架轴心的面切开的剖面图中，由中空支架的内侧和固定有载体的载体支撑构件的外侧所构成的面积，在载体支撑构件的自载体固定部至前端部的区域，在轴心的左右是大致相同的。
例如，图2给出了以载体支撑构件被插入到中空支架的上述定位姿势下，沿包括中空支架轴心21的面切开的剖面图的一个例子。在该剖面图中，中空支架的内侧和固定有载体的载体支撑构件的外侧所构成的面积中，载体支撑构件的自载体固定部至前端部24的区域的面积包括轴心左侧22表示的部分的面积和轴心右侧23表示的部分的面积。通过以该22的面积和23的面积大致相同的方式构成载体支撑构件和中空支架，使左右的表面张力相等，从而可使载体14和反应液充分接触，而不会发生反应液的液面偏斜。图2a中，22的面积和23的面积并非大致相同，所以反应液如虚线所示发生偏斜。而图2b中，22的面积和23的面积大致相同，所以反应液变为水性。所谓大致相同是指相差在20％以下、优选在10％以下、更优选在5％以下。图2给出了沿着包括中空支架轴心21的面切开的剖面图中将载体14切断的剖面图，因而，虽然并不是相对于中空支架的轴心成左右对称，但对于相对于中空支架的轴心成左右对称的界面也是同样的。即，对于任意包括中空支架轴心的截面上述左右的面积都是大致相同。
在优选的实施方式中，例如如图3所示，载体支撑构件的载体固定部31是具有底面32和侧面33(33a和33b)的凹部，载体14配置于凹部的底面32。更优选载体支撑构件凹部31的至少后端部13侧的侧面33a是倾斜面。优选载体支撑构件凹部31的前端部24侧的侧面33b也是倾斜面。通过使后端部一侧的侧面33a为倾斜面，在将载体支撑构件插入到中空支架内的反应液时可能混入的气泡容易逃逸到上部。此外，通过使该倾斜面的表面粗糙度在10μm以下、优选在1μm以下，使倾斜面与底面所成的角度(图3的34)在75°以下、优选在45°以下，气泡更容易逃逸。如果气泡不能顺利逃逸，则载体和反应液的接触将受到阻碍，也可能导致生物分子的相互作用在载体的一部分上受到阻碍，但通过使之成为气泡可顺利逃逸的上述构成，载体和反应液可达到良好的接触。
优选在载体支撑构件上从凹部前端部一侧的侧面到前端部形成排液槽。例如如图4所示，通过在凹部前端部一侧的侧面33b至前端部24形成排液槽41，可有效地将从中空支架内的反应液中提拉载体支撑构件时可能残留在凹部的反应液排液。拉出载体支撑构件后，通过使载体支撑构件的前端部24和滤纸接触，可更有效地排液。本发明中，在生物分子相互作用后，在除去和载体上固定的生物分子未发生相互作用的生物分子的洗涤工序中，通过使用含易潮解物质的洗涤液，可不干燥载体而直接对载体照射激发光，通过检测器检测荧光。在生物分子的相互作用和洗涤中，由于使用了含盐的溶液，所以如果干燥载体，则会产生盐导致的干燥不均现象，存在干燥不均导致的散射光强，难于正确检测的情况。特别是在成像光学系的检测器中，干燥不均导致的散射光强，和扫描型检测器相比，存在很难正确检测的情况，但如果使用含易潮解物质的洗涤液不进行干燥就进行检测，就可抑制干燥不均导致的光散射的发生。在不干燥载体就进行检测的方式中，载体支撑构件的凹部如果积存液体，则也有可能产生检测误差，但通过设置排液槽，可迅速地将凹部残留的多余洗涤液排液，可降低检测误差。
易潮解物质只要是不妨碍生物分子的相互作用，则无特殊限制，但例如可举出氯化镁、氯化钙、氢氧化镁等碱土金属盐、碳酸钾、溴化钠等碱金属盐等。洗涤液中易潮解物质的浓度通常为0.01～3.0mol/l、优选为0.05～1.0mol/l、更优选为0.2～0.5mol/l。
在本发明优选的方式中，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，在载体支撑构件的自载体固定部到前端部24侧的区域，载体支撑构件的体积占中空支架的容积的比例为60％以上，优选为80％以上，更优选为90～95％。例如在图5中，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，在载体支撑构件12的自载体固定部至前端部一侧的区域(虚线以下的区域)、即载体固定部的前端部一侧末端处沿与中空支架11的轴心垂直的面切开的情况下，在不含载体固定部的一侧，载体支撑构件的体积占中空支架的容积的比例为上述值。通过将载体支撑构件的自载体固定部至前端部一侧设计得稍大，可在将载体支撑构件插入到中空支架时，中空支架中容纳的反应液为微量的情况下也可使液面上升而与载体充分接触。因而，可使操作之际的液体的量减少。
此外，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，载体支撑构件的体积占中空支架的容积的比例优选为25～70％，更优选为40～50％。通过使载体支撑构件的体积的比例为一定的值以下，可防止载体支撑构件插入时液体溢出。
本发明中使用的单元也可具有多个载体支撑构件和对应于各个支撑构件的多个中空支架。多个载体支撑构件上分别固定有载体，优选载体支撑构件的后端部分别被固定于表面材料，可作为整体进行工作。所谓具有对应于各个载体支撑构件的多个中空支架是指载体支撑构件分别插入到多个中空支架上而构成的。通过使用分别固定有载体的多个载体支撑构件和多个中空支架，可有效实施大量的试验。
本发明的检测方法中，在通过洗涤载体除去与载体上固定的生物分子未发生相互作用的生物分子的洗涤工序之后，实施对载体照射激发光，通过检测器检测荧光的检测工序。
本发明中，作为检测器优选使用成像光学系的检测器。成像光学系的检测器是对载体照射激发光，检测得到的荧光的强度的检测器。成像光学系的检测器通常具备用于照射激发光的激光器、仅使目标波长的荧光通过的荧光过滤器、用于检测通过荧光过滤器的荧光的光检测部(例如、CCD照相机)。本发明中，通常，通过激光器向整个载体倾斜地照射一次激发光，从载体的正面检测荧光。所谓向载体倾斜地照射激发光是指载体表面和激光所成的角度小于90°，通常采用30～70°，优选采用40～60°的角度进行照射。在成像光学系的检测器中，没有必要激光扫描载体的整个表面，可在短时间内实施检测。由于向载体一次照射激发光，所以固定生物分子的载体使用尺寸比较小的载体、例如尺寸在10mm以下、优选在5mm以下、更优选在3mm以下的载体、最优选在1～5mm的四方载体。
固定生物分子的载体材料可使用本领域公知的材料，无特殊限制。例如可举出铂、铂黑、金、钯、铑、银、汞、钨和它们的化合物等贵金属；石墨、碳纤维为代表的碳等的导电体材料；单晶硅、非晶硅、碳化硅、氧化硅、氮化硅等为代表的硅材料、SOI(绝缘体上的硅)等为代表的所述硅材料的复合材料；玻璃、石英玻璃、氧化铝、蓝宝石、陶瓷、镁橄榄石、光敏玻璃等无机材料；聚乙烯、乙烯、聚丙烯、环状聚烯烃、聚异丁烯、聚对苯二甲酸乙二酯、不饱和聚酯、含氟树脂、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩醛、丙烯酸树脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚醛树脂、脲醛树脂、环氧树脂、密胺树脂、苯乙烯·丙烯腈共聚物、丙烯腈·丁二烯苯乙烯共聚物、聚苯醚和聚砜等有机材料等。
本发明中，载体优选使用表面具有碳层和化学修饰基团的载体。表面具有碳层和化学修饰基团的载体包括衬底表面具有碳层和化学修饰基团的载体和包括碳层的衬底表面具有化学修饰基团的载体。衬底材料可使用本领域公知的材料，无特殊限制，可使用和上述载体材料和同样的材料。
本发明适合使用具有微细平板状结构的载体。具有微细平板状结构的载体容易制造，所以优选使用包含硅材料或树脂材料的衬底，特别是更优选包括单晶硅的衬底表面具有碳层和化学修饰基团的载体。单晶硅包括部分结晶轴的方向发生极小变化的衬底(有时也被称之为镶嵌晶体)、包含原子尺寸水平的混乱(晶格缺陷)的衬底。
衬底上形成的碳层无特殊限制，但优选使用合成金刚石、高压合成金刚石、天然金刚石、软金刚石(例如类金刚石碳)、非晶态碳、碳类物质(例如石墨、富勒烯、碳纳米管)中的任一个、它们的混合物、或它们层合而成的物质。此外，还可使用碳化铪、碳化铌、碳化硅、碳化钽、碳化钍、碳化钛、碳化铀、碳化钨、碳化锆、碳化钼、碳化铬、碳化钒等碳化物。此处，所谓软金刚石是所谓类金刚石碳(DLC：Diamondlike Carbon)等作为金刚石和碳的混合体的不完全金刚石结构体的总称，其混合比例无特殊限制。碳层从化学稳定性优异，能够耐受其后的化学修饰基团的导入和生物分子的结合反应这一点，以及可借助静电结合和生物分子结合所以其键具有柔软性这一点来看，是有利的。此外，在和生物分子的结合反应中，非特异性吸附少，从这一点看也是有利的。如前所述，衬底自身也可使用包括碳层的载体。
本发明中，碳层的形成可采用公知的方法进行。例如可举出微波等离子体CVD(化学气相沉积)法、ECRCVD(电子回旋共振化学气象沉积)法、ICP(电感耦合等离子体)法、直流溅射法、ECR(电子回旋共振)溅射法、离子化蒸镀法、电弧式蒸镀法、激光蒸镀法、EB(电子束)蒸镀法、电阻加热蒸镀法等。
高频等离子CVD法利用因高频而在电极间产生的辉光放电来分解原料气体(甲烷)，在衬底上合成DLC(类金刚石碳)层。离子化蒸镀法利用钨丝生成的热电子分解并离子化原料气体(苯)，根据偏压在衬底上形成碳层。也可在1～99体积％的氢气和其余为99～1体积％的甲烷气体构成的混合气体中采用离子化蒸镀法形成DLC层。
电弧式蒸镀法通过在固体石墨材料(阴极蒸发源)和真空容器(阳极)之间施加直流电压在真空中引发电弧放电，以从阴极产生碳原子的等离子体，对衬底施加比蒸发源更负的偏压，可使等离子体中的碳离子向衬底加速，形成碳层。
激光蒸镀法通过向石墨靶板照射例如Nd:YAG激光(脉冲震荡)使之熔融，在玻璃衬底上堆积碳原子，可形成碳层。
在衬底的表面形成碳层的情况下，碳层的厚度通常是单分子层～100μm左右，过薄则底层衬底的表面有可能局部露出，相反如果过厚将导致生产性变差，所以优选2nm～1μm，更优选5nm～500nm。
通过向形成有碳层的衬底的表面导入化学修饰基团，可将生物分子牢固地固定在载体上。导入的化学修饰基团本领域技术人员可适当选择，无特殊限制，但例如可举出氨基、羧基、环氧基、甲酰基、羟基、金属螯合物和活性酯基。
氨基的导入例如可通过将碳层置于氨气中照射紫外线或通过进行等离子体处理来实施。或者，可通过将碳层置于氯气中照射紫外线以进行氯化，再在氨气中照射紫外线来实施。或者，也可通过在亚甲二胺、乙二胺等多元胺类气体中使之和氯化了的碳层反应来实施。
羧基的导入例如可通过使如前所述氨基化的碳层与适当的化合物反应来实施。为导入羧基而使用的化合物可举出式：X-R1-COOH(式中、X表示卤原子、R1表示碳数10～12的2价的烃基。)表示的卤代羧酸、例如氯代醋酸、氟代醋酸、溴代醋酸、碘代醋酸、2-氯丙酸、3-氯丙酸、3-氯丙烯酸、4-氯苯甲酸；式：HOOC-R2-COOH(式中、R2表示单键或碳数1～12的2价的烃基。)表示的二羧酸、例如草酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、邻苯二甲酸；聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、偏苯三酸、丁烷四羧酸等的多元羧酸；式：R3-CO-R4-COOH(式中、R3表示氢原子或碳数1～12的2价的烃基，R4表示碳数1～12的2价的烃基。)所示的酮酸或醛酸；式：X-OC-R5-COOH(式中、X表示卤原子，R5表示单键或碳数1～12的2价的烃基。)所示的二羧酸的单酰卤、例如琥珀酸单酰氯、丙二酸单酰氯；邻苯二甲酸酐、琥珀酸酐、草酸酐、马来酸酐、丁烷四羧酸酐等酸酐。
环氧基的导入例如可通过使如上所述氨基化的碳层与适当的多元环氧化合物反应来实施。或者，可通过使碳层含有的碳碳双键和有机过酸反应来得到。有机过酸可举出过氧乙酸、过氧苯甲酸、二过氧化苯二甲酸、过氧甲酸、三氟过氧乙酸等。
甲酰基的导入例如可通过使如前所述氨基化的碳层和戊二醛反应来实施。
羟基的导入例如可通过使如前所述氯化的碳层和水反应来实施。
活性酯基是指在酯基的醇一侧具有酸度高的吸电子基以活化亲核反应的酯组、即反应活性高的酯基。其在酯基的醇一侧具有吸电子基，是与烷基酯相比被进一步活化的酯基。活性酯基对氨基、巯基、羟基等基团具有反应性。更具体而言，苯酚酯类、硫酚酯类、N-羟基胺酯类、氰基甲基酯、杂环羟基化合物的酯类等是已知具有比烷基酯等远高的活性的活性酯基。更具体而言，活性酯基例如可举出对硝基苯基、N-羟基琥珀酰亚氨基、琥珀酰亚氨基、邻苯二甲酰亚氨基、5-降冰片烯-2，3-二羧基酰亚氨基等，特别优选使用N-羟基琥珀酰亚氨基。
活性酯基的导入例如可通过采用氰胺或碳二亚胺(例如、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺)等脱水缩合剂和N-羟基琥珀酰亚胺等化合物对如前所述导入的羧基进行活性酯化来实施。通过该处理可介由酰胺键在烃基的末端形成结合有N-羟基琥珀酰亚氨基等活性酯基的基团(特开2001-139532)。
在将DNA和RNA等核酸固定的情况下，优选导入氨基、环氧基、碳二亚氨基、甲酰基或活性酯基。在将多肽固定的情况下，优选导入氨基、碳二亚氨基、环氧基、甲酰基、金属螯合物或活性酯基。使用导入了金属螯合物的载体，可有效且稳定地将聚组氨酸序列等的金属离子和亲和性的具有标记的多肽固定。
本发明的在载体上固定生物分子的方法无特殊限制。例如可通过将生物分子溶解到缓冲液中配制溶液，在其中浸渍如上所述的载体，由此在载体表面固定生物分子。浸渍通常在0～98℃、优选4℃～50℃下一般进行1分～24小时、优选10分～1小时。此时，通过在浸渍一定时间后洗涤载体，可除去没有被固定的生物分子。此外，通过使用被称为点样器(spotter)的装置，可将多种生物分子固定在载体的表面。在使用点样器的情况下，例如使用点样器将生物分子溶液点样到载体上后，在加热的烘箱中烘烤一定时间，然后洗涤除去没有固定的分子。通过使用点样器装置可将其他种类的生物分子固定到载体上的不同位置上，所以可一次实施多个试验。
实施例
下面，使用实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术范围不受下述实施例的限制。
实施例1
将图1的a和b所示的载体支撑构件插入到装有反应液的中空支架中。结果分别如图6的a和b所示。图6a中，通过载体支撑构件的后端部和中空支架开口部的边缘咬合，定位成载体支撑构件被插入到中空支架的中央部，结果，反应液的液面水平，载体和反应液接触。图6b中，由于载体支撑构件的后端部和中空支架开口部的边缘没有咬合，所以载体支撑构件以在中空支架内偏右侧的方式被插入，结果由于表面张力导致反应液的液面倾斜，产生载体和反应液不接触的部分。
实施例2
在3mm见方的硅衬底上使用离子化蒸镀法按下述条件进行2层的DLC层的制膜。
                     第1层        第2层
原料气体    CH4       4.75        47.5      (sscm)
            H2        0.25        2.5       (sscm)
工作压力              3.0         8.0       (Pa)
基板偏压    直流电压  500         500       (V)
            高频输出  100         -         (W)
阳极电压              50          50        (V)
灯丝       电压       7           7         (V)
           电流       22          22        (A)
在得到的表面上具有DLC层的硅衬底上按照下述条件使用氨等离子导入氨基。
原料气体    NH3      30     (sscm)
工作压力             8.0    (sscm)
基板偏压  直流电压   500    (Pa)
          高频输出   -      (W)
阳极电压             50     (V)
灯丝      电压       7      (V)
          电流       22     (A)
在含有140mM琥珀酸酐和0.1M硼酸钠的1-甲基-2-吡咯烷酮溶液中浸渍30分钟，导入羧基。在含有0.1M磷酸钙缓冲液、0.1M 1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺、20mM N-羟基琥珀酰亚胺的溶液中浸渍30分钟，进行活化，得到在硅衬底表面上具有DLC层和作为化学修饰基团的N-羟基琥珀酰亚氨基的载体。
将DNA探针用So1.6(东洋钢板制)溶解成10μM，点样在载体上。在80℃烘烤1小时，用2×SSC/0.2％SDS洗涤后，用超纯水洗涤，离心干燥，从而将DNA探针固定到载体上。和上述探针杂交的区域用PCR扩增。标记使用CyDye进行。PCR溶液的组成如下。将得到的PCR产物30μl溶解到杂交溶液(4×SSC/0.2％SDS溶液)30μl中，配制试样。将试样50μl加入到图7c所示的中空支架中。在图7a和b所示的载体支撑构件上分别固定上述得到的固定有DNA探针的载体，分别插入到装有试样的中空支架中。图7a所示的载体支撑构件具有排液槽，而图7b所示的载体支撑构件不具有排液槽。插入载体支撑构件后，在55℃反应2分钟，用2×SSC/0.2％SDS洗涤1次，用1N醋酸钠/0.5％吐温20洗涤1次，用1N MgCl2/0.5％吐温20洗涤1次。使用冷却CCD照相机，介由荧光过滤器(Cy5用、エドモンド公司制)检测载体上相互作用了的生物分子的荧光标记。使用φ5mm的激光(640nm波长)对载体表面以50°的角度照射激发光。结果如图8所示。
使用具有排液槽的载体支撑构件(图7a)时，液体不能在载体固定部积存，可良好地进行检测(图8a)。而使用不具有排液槽的载体支撑构件(图7b)时，可观察到一部分的液体积存(图8b)。
实施例3
以被插入至中空支架的姿势，将载体支撑构件的体积占中空支架的容积的比例为80％的载体支撑构件(图9a)和50％的载体支撑构件(图9b)分别插入到容纳有反应液的中空支架中。可知，在图9a的情况下，插入时有气泡生成，而在图9b的情况下，插入时不生成气泡，反应液和载体的接触良好。
本说明书中引用的全部的出版物、专利和专利申请全都作为参考直接引入本说明书中。
符号说明
11：中空支架、12：载体支撑构件、13：载体支撑构件的后端部、14：载体、15：中空支架开口部、21：中空支架轴心、24：载体支撑构件的前端部、31：载体固定部、32：载体固定部的底面、33：载体固定部的侧面(倾斜面)、34：底面与侧面(倾斜面)所成的角度、41：排液槽

Claims (12)

1.单元，所述单元是在使用固定有生物分子的载体检测生物分子的相互作用中使用的单元，其特征在于，
具备一端具有开口部另一端封闭的中空支架和固定有载体的可插入中空支架的载体支撑构件，所述载体固定有生物分子，
在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，载体支撑构件的后端部和中空支架开口部的边缘咬合，由此中空支架被密封，同时，载体支撑构件和中空支架被定位，
在以定位姿势沿包括中空支架轴心的面切开的剖面图中，由中空支架的内侧和固定有载体的载体支撑构件的外侧所构成的面积在载体支撑构件的自载体固定部至前端部的区域，在轴心的左右是大致相同的，
其中，载体支撑构件中的载体固定部是具有底面和侧面的凹部，载体被配置于凹部的底面，
载体支撑构件凹部的至少后端部一侧的侧面是倾斜面。
2.权利要求1所述的单元，其中，倾斜面的表面粗糙度在10μm以下，倾斜面与底面所成的角度在75°以下。
3.权利要求1～2任一项所述的单元，其中，在载体支撑构件凹部的自前端部一侧的侧面至前端部形成有排液槽。
4.权利要求1～2任一项所述的单元，其中，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，在载体支撑构件的自载体固定部至前端部一侧的区域，载体支撑构件的体积占中空支架容积的比例为60％以上。
5.权利要求1～2任一项所述的单元，其中，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，载体支撑构件的体积占中空支架容积的比例为25～70％。
6.权利要求1～2任一项所述的单元，其中，具有分别固定有载体的多个载体支撑构件，载体支撑构件的后端部分别被固定于表面材料，具有对应于各个支撑构件的多个中空支架。
7.使用固定有生物分子的载体检测生物分子的相互作用的方法，其特征在于，包括下述工序：
将固定有生物分子的载体固定于载体支撑构件，将该载体支撑构件插入到一端具有开口另一端封闭的容纳有反应液的中空支架中，由此使载体上生物分子与反应液中已被荧光标记的生物分子进行相互作用的相互作用工序；
通过洗涤载体除去没有和载体上固定的生物分子发生相互作用的生物分子的工序；
对载体照射激发光，通过检测器检测荧光的检测工序；
在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，载体支撑构件的后端部和中空支架开口部的边缘咬合，由此中空支架被密封，同时，载体支撑构件和中空支架被定位，
在以所述定位姿势沿包括中空支架轴心的面切开的剖面图中，由中空支架的内侧和固定有载体的载体支撑构件的外侧所构成的面积在载体支撑构件的自载体固定部至前端部的区域，在轴心的左右是大致相同的，
其中，载体支撑构件中的载体固定部是具有底面和侧面的凹部，载体被配置于凹部的底面，
载体支撑构件凹部的至少后端部一侧的侧面是倾斜面。
8.权利要求7所述的方法，其中，倾斜面的表面粗糙度在10μm以下，倾斜面与底面所成的角度在75°以下。
9.权利要求7～8任一项所述的方法，其中，在载体支撑构件凹部的自前端部一侧的侧面至前端部形成排液槽。
10.权利要求7～8任一项所述的方法，其中，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，在载体支撑构件的自载体固定部至前端部一侧的区域，载体支撑构件的体积占中空支架容积的比例为60％以上。
11.权利要求7～8任一项所述的方法，其中，在载体支撑构件被插入至中空支架的姿势下，载体支撑构件的体积占中空支架容积的比例为25～70％。
12.权利要求7～8任一项所述的方法，其中，具有分别固定有载体的多个载体支撑构件，载体支撑构件的后端部分别被固定于表面材料，具有对应于各个支撑构件的多个中空支架。
CN200980119720.7A 2008-05-29 2009-05-26 用于检测生物分子的相互作用的方法和单元 Active CN102047122B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008-141155 2008-05-29
JP2008141155 2008-05-29
PCT/JP2009/059931 WO2009145333A1 (ja) 2008-05-29 2009-05-26 生体関連分子の相互作用を検出するための方法およびユニット

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102047122A CN102047122A (zh) 2011-05-04
CN102047122B true CN102047122B (zh) 2013-10-16

Family

ID=41377200

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200980119720.7A Active CN102047122B (zh) 2008-05-29 2009-05-26 用于检测生物分子的相互作用的方法和单元

Country Status (4)

Country Link
US (1) US8778667B2 (zh)
JP (2) JP4950336B2 (zh)
CN (1) CN102047122B (zh)
WO (1) WO2009145333A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5540980B2 (ja) * 2010-08-06 2014-07-02 東洋製罐グループホールディングス株式会社 生体関連分子の検出方法、検出用キット、及び検出システム
JP6127520B2 (ja) 2013-01-09 2017-05-17 日本軽金属株式会社 バイオチップ用基板及びその製造方法
JP6334251B2 (ja) * 2014-05-09 2018-05-30 東洋鋼鈑株式会社 遺伝子検査装置
JP2016034247A (ja) * 2014-08-01 2016-03-17 東洋鋼鈑株式会社 ハイブリダイズ反応装置及び核酸マイクロアレイ並びにそれらを用いた遺伝子検査方法
CN114653415B (zh) * 2022-03-31 2024-11-15 深圳市曙芯生物科技有限公司 脱氧核糖核酸合成芯片及其合成方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5418171A (en) * 1991-03-28 1995-05-23 Meiji Seika Kabushiki Kaisha Method for detecting a target analyte in a sample
US20030064386A1 (en) * 2001-09-28 2003-04-03 Olympus Optical Co., Ltd. Probe array for detecting a target material using stereo-substrate
CN1617925A (zh) * 2002-01-17 2005-05-18 准确系统科学株式会社 载体存放处理装置及载体存放处理方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4985631A (en) * 1988-02-16 1991-01-15 Wannlund Jon C Luminescence exposure apparatus
US5578446A (en) 1994-07-08 1996-11-26 Becton Dickinson And Company Analytical dipstick for improved mixing and reduced reagent volume
US6486947B2 (en) * 1998-07-22 2002-11-26 Ljl Biosystems, Inc. Devices and methods for sample analysis
US6022700A (en) * 1998-03-12 2000-02-08 Intelligent Imaging Innovations, Inc. High throughput biological sample preparation device and methods for use thereof
AU779835B2 (en) * 1999-05-20 2005-02-10 Illumina, Inc. Method and apparatus for retaining and presenting at least one microsphere array to solutions and/or to optical imaging systems
US6905816B2 (en) * 2000-11-27 2005-06-14 Intelligent Medical Devices, Inc. Clinically intelligent diagnostic devices and methods
WO2003022421A2 (en) * 2001-09-07 2003-03-20 Corning Incorporated Microcolumn-platform based array for high-throughput analysis
US7402279B2 (en) * 2002-10-31 2008-07-22 Agilent Technologies, Inc. Device with integrated microfluidic and electronic components
JP4627455B2 (ja) * 2004-05-18 2011-02-09 三菱レイヨン株式会社 Ｄｎａマイクロアレイ処理装置

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5418171A (en) * 1991-03-28 1995-05-23 Meiji Seika Kabushiki Kaisha Method for detecting a target analyte in a sample
US20030064386A1 (en) * 2001-09-28 2003-04-03 Olympus Optical Co., Ltd. Probe array for detecting a target material using stereo-substrate
CN1617925A (zh) * 2002-01-17 2005-05-18 准确系统科学株式会社 载体存放处理装置及载体存放处理方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JP特开2006-3349A 2006.01.05
JP特表平10-501069A 1998.01.27

Also Published As

Publication number Publication date
CN102047122A (zh) 2011-05-04
JPWO2009145333A1 (ja) 2011-10-20
US20110111531A1 (en) 2011-05-12
JP2012123012A (ja) 2012-06-28
WO2009145333A1 (ja) 2009-12-03
JP5462293B2 (ja) 2014-04-02
US8778667B2 (en) 2014-07-15
JP4950336B2 (ja) 2012-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102047122B (zh) 用于检测生物分子的相互作用的方法和单元
CN102459641B (zh) 微阵列中的探针定位方法
JPWO2016136033A1 (ja) 標的核酸検出法、アッセイキットおよびプローブ固定基体
JP7108988B2 (ja) 骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キット
JP6260940B2 (ja) バイオチップ保持具、バイオチップ保持具の製造方法、バイオチップ押さえ具、およびバイオチップ保持具キット
JP2010014620A (ja) 生体関連分子の相互作用を検出するための方法及びそれに用いる担体支持部材
US20070111250A1 (en) Probe carrier, method of producing the probe carrier, method of evaluating the probe carrier and method of detecting a target nucleic acid using the same
JP7248982B2 (ja) 遺伝子変異評価方法、遺伝子変異評価用キット
JP2016192939A (ja) Ｃｙｐ２ｃ１９＊２検出用プローブ及びｃｙｐ２ｃ１９＊３検出用プローブ
WO2020067388A1 (ja) 甲状腺乳頭癌の予後予測に関連する遺伝子変異評価用キット
WO2019182103A1 (ja) マイクロサテライト検出マイクロアレイ及びこれを用いたマイクロサテライト検出方法
JP2016192940A (ja) ＣＹＰ３Ａ４＊１ｂ検出用プローブ及びＣＹＰ３Ａ５＊３検出用プローブ
US8481461B2 (en) Detection method for microarray
JPWO2009130797A1 (ja) Ａｂｏ式血液型を判定するためのプローブセット
US20220282314A1 (en) Kit for evaluating a gene mutation related to myeloproliferative neoplasms
JP6995604B2 (ja) 一塩基多型検出用プローブの設計方法及びプローブセット
JP6028300B2 (ja) Ａｂｏ式血液型を判定するためのプライマーセット及びプローブ
JP6028299B2 (ja) 人獣判定するためのプライマーセット及びプローブ
JP7456739B2 (ja) 骨髄増殖性腫瘍に関連する遺伝子変異評価用キット
JP5188228B2 (ja) 蛍光標識された生体関連分子の検出方法
JP2020162503A (ja) ＣｐＧアイランドにおけるメチル化判別方法及びメチル化判別キット
JP2007044033A (ja) 担体上に固定化された生体分子の相互作用を分析する方法およびそのための装置
JP2016192941A (ja) Ｃｙｐ２ｃ９＊３検出用プローブ
JP2015198581A (ja) Ｉｌ２８ｂ遺伝子における多型検出用プローブ、当該多型検出用プローブを有するｄｎａチップ、当該多型検出用プローブを用いたｃ型慢性肝炎の治療効果を予測するためのデータ取得方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant