JP2015531490A

JP2015531490A - ナノ粒子検出法

Info

Publication number: JP2015531490A
Application number: JP2015535963A
Authority: JP
Inventors: ヤン，シャオメイ; ジュ，シャオビン
Original assignee: ナノエフシーエム，インコーポレイテッド
Priority date: 2012-10-12
Filing date: 2013-09-03
Publication date: 2015-11-02
Also published as: EP2908119A4; US9739700B2; US20150233812A1; WO2014056372A1; CN103728236A; EP2908119A1; CN103728236B; EP2908119B1

Abstract

ナノ粒子検出法が開示されている。この方法は（１）シース流を用いた流体力学的集束により被検試料液を圧縮して試料液流とする工程；（２）前記試料液流に測定光を照射する工程であって、前記試料液流中の単一ナノ粒子が０．１〜１０ミリ秒間にわたって前記測定光により照射されるようにする工程；（３）前記測定光が前記試料液流に照射される領域を検出領域として定義し、前記測定光の照射領域から放出された光信号をレンズ結像系により収集し、前記レンズ結像系により収集された前記光信号を視野絞りに通過させることにより、前記検出領域外の前記光信号をフィルタ除去して、前記検出領域からの前記光信号を増強する工程；および（４）前記視野絞りにより増強された前記光信号を光電信号変換する工程；を含む。この方法によれば、粒径２４〜１，０００ｎｍの低屈折率ナノ粒子ならびに粒径６．７〜１５０ｎｍのナノスケール金粒子の検出が可能になる。
【選択図】図１

Description

本発明は、機器分析の分野、特にナノ粒子を検出する方法に関するものである。

最近、ナノバイオテクノロジーが急速に発展するにつれて、ユニークな構造と機能を有する人工合成ナノ粒子は、標的への薬物送達、高解像度の腫瘍画像形成、疾患診断などのバイオメディカル分野や、タンパク精製、生化学分析、食品安全、環境モニタリングなどの分野で、ますます重要な役割を果たしている。機能性ナノ粒子の粒径分布を測定することは、ナノ粒子の品質制御や実用化を行うえで、非常に重要である。また、自然界には、例えば、細菌、ウイルス、細胞内小器官、分子集合体などの様々な生物学的ナノ粒子が存在する。高速かつ高解像度のナノ粒子検出法は、病原体の同定、ウイルスワクチンの品質制御、遺伝子転写ウイルスベクターの形質導入効率の測定、基礎生命科学の研究などの強力な分析手段を提供する。

ナノ粒子は、高感度フローサイトメトリーを用いて、効率的に分析することができる。例えば、高感度フローサイトメトリーの技術的解決法を開示する文献（非特許文献１および２）が存在する。この解決法は、シース液を用いた流体力学的集束により被検試料液を圧縮して試料液流とし、この試料液流に測定光を照射すること（ここで、測定光を照射する試料液流の体積としては、８００ｆＬや１５０ｆＬ程度である）；試料液流中のナノ粒子から放出された散乱光および／または蛍光を非球面レンズで収集し、信号を得た後、この信号によりナノ粒子を分析することを含む。しかし、これらの技術文献に開示されている技術的解決法は、粒径１００ｎｍ超のポリスチレンナノ粒子を検出できることはできても、より小さい低屈折率ナノ粒子を検出することはできない。ナノ粒子の場合、散乱光の強度は、粒径の６乗に比例して低下する。すなわち、粒径が半分になると、信号強度は１／６４に低下する。それゆえ、粒径のより小さいナノ粒子を検出することは困難である。

アナリティカル・ケミストリー(Anal. Chem.)2009, 81, 2555-2563 ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ(J. Am. Chem. Soc.)2010, 132, 12176-12178

本発明の目的は、粒径のより小さいナノ粒子を検出する方法を提供することにある。

上記目的を達成するために、本発明は、下記工程を含むことを特徴とするナノ粒子検出法を提供する。すなわち、
（１）シース液を用いた流体力学的集束により被検試料液を圧縮して試料液流とする工程であって、前記試料液流が被検ナノ粒子を含み、前記ナノ粒子が前記試料液流中で実質的に互いに分離され、実質的に同じラインを流れるようにする工程；
（２）前記試料液流に測定光を照射する工程であって、前記試料液流中の単一ナノ粒子が０．１〜１０ｍｓ、好ましくは０．２〜２ｍｓ間にわたって、前記測定光により照射されるようにする工程；
（３）前記測定光を照射された前記試料液流の領域を検出領域として定義し、前記測定光の照射領域から放出された光信号をレンズ結像系により収集し、前記レンズ結像系により収集された前記光信号を視野絞りに通過させることにより、前記検出領域外の前記光信号をフィルタ除去して、前記検出領域からの前記光信号を増強するようにする工程；
（４）前記視野絞りにより増強された前記光信号を光電信号変換し、前記試料液流中の各ナノ粒子から放出された散乱光および／または蛍光の電気信号をそれぞれ取得する工程；および
（５）前記電気信号により前記ナノ粒子の定性および／または定量分析を実施する工程。

上記した技術的な解決手段を含むことから、本発明で提供される方法は、粒径２４〜１，０００ｎｍの低屈折率ナノ粒子（例えば、ポリスチレンやシリカのナノ粒子）および粒径６．７〜１５０ｎｍの金ナノ粒子を検出するために用いることができる。

本発明の他の特性および利点については、以下の実施形態で、さらに詳しく説明する。

添付の図面は、本発明をさらに良く理解するために提供されるものであり、本明細書の一部を構成するものでもある。それらは、本発明を説明するために、以下の実施形態と共に用いられるが、本発明を限定するものであると理解すべきではない。
図１は本発明の好ましい実施形態における光路の概略図である。図２は検出領域の概略図である。図３は本発明の好ましい実施形態における液流系の概略図である。図４は実施例１の４４ｎｍポリスチレンナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。図５は金ナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。Ａは実施例６の６．７ｎｍ金ナノ粒子のＴＥＭ画像、Ｂは実施例３および７の１０ｎｍ金ナノ粒子のＴＥＭ画像である。図６は実施例１〜４の試料の検出結果を示す。Ａ〜Ｄは、それぞれ、４４ｎｍポリスチレンナノ粒子、４０ｎｍシリカ球状ナノ粒子、１０ｎｍ金ナノ粒子およびＴ７バクテリオファージ試料の検出結果を示す。Ａ１〜Ｄ１は散乱光チャネルの信号波形図、Ａ２〜Ｄ２は散乱光のピーク面積の周波数分布ヒストグラムである。図７は実施例２および５の４０ｎｍシリカ球状ナノ粒子、実施例５の５０ｎｍ、６４ｎｍ、７８ｎｍおよび９０ｎｍシリカ球状ナノ粒子のＴＥＭ画像、ならびに、それぞれ、ナノ粒子１５０個の粒径について統計処理を行って得られる各種ナノ粒子の平均粒径および粒径分布図を示す。図８は実施例５の４０ｎｍ、５０ｎｍ、６４ｎｍ、７８ｎｍおよび９０ｎｍシリカ球状ナノ粒子の混合試料の検出結果を示す。Ａは混合試料の散乱光のピーク面積の分布ヒストグラム、Ｂは散乱光のガウシアンフィットピーク面積の中央値とＴＥＭにより測定される平均粒径との関係を示す図、Ｃは散乱光ピーク面積を粒径に変換した後の混合試料の粒径分布ヒストグラムである。図９は実施例８の２４ｎｍシリカ球状ナノ粒子および実施例９の２９ｎｍシリカ球状ナノ粒子のＴＥＭ画像を示す。図１０は実施例６〜９の試料の検出結果を示す。Ａ〜Ｄは、それぞれ、６．７ｎｍ金ナノ粒子、１０ｎｍ金ナノ粒子、２４ｎｍシリカ球状ナノ粒子および２９ｎｍシリカ球状ナノ粒子の検出結果を示す。Ａ１〜Ｄ１は散乱光チャネルの信号波形図、Ａ２〜Ｄ２は散乱光のピーク面積の周波数分布ヒストグラムである。

以下、本発明の実施形態について、添付の図面を参照しながら、詳細に説明する。本明細書に記載する実施形態は、本発明を記載して説明するために提供されるにすぎず、本発明を限定するものと見なさないと理解すべきである。

本発明は、下記工程を含むことを特徴とするナノ粒子検出法を提供する。すなわち、
（１）シース液を用いた流体力学的集束により被検試料液を圧縮して試料液流とする工程であって、前記試料液流が被検ナノ粒子を含み、前記ナノ粒子が前記試料液流中で実質的に互いに分離され、実質的に同じラインを流れるようにする工程；
（２）前記試料液流に測定光を照射する工程であって、前記試料液流中の単一ナノ粒子が０．１〜１０ｍｓ、好ましくは０．２〜２ｍｓ間にわたって、前記測定光により照射されるようにする工程；
（３）前記測定光を照射された前記試料液流の領域を検出領域として定義し、前記測定光の照射領域から放出された光信号をレンズ結像系により収集し、前記レンズ結像系により収集された前記光信号を視野絞りに通過させることにより、前記検出領域外の前記光信号をフィルタ除去して、前記検出領域からの前記光信号を増強するようにする工程；
（４）前記視野絞りにより増強された前記光信号を光電信号変換し、前記試料液流中の各ナノ粒子から放出された散乱光および／または蛍光の電気信号をそれぞれ取得する工程；および
（５）前記電気信号により前記ナノ粒子の定性および／または定量分析を実施する工程。

シース液は、フローサイトメトリーに用いられる一般的なシース液、例えば、水、生理食塩水およびリン酸緩衝液の少なくとも１種である。好ましくは、水がシース液として用いられ、より好ましくは、シース液として用いられる水は脱イオン水である。

流体力学的集束は、フローサイトメトリーにおいて、標準的に定義されており、特に、シース液が試料液の周囲を流れることにより、試料液がシース液の作用下で液流、すなわち、試料液流を形成することを意味する。

試料液のナノ粒子濃度は、フローサイトメトリー分野における従来の制御方法により、ナノ粒子が試料液流中で実質的に互いに分離され、実質的に同じラインを流れるように制御すればよい。

測定光を照射される試料液流の領域は、検出領域として定義される。具体的には、図２に示すように、測定光の光ビームが試料液流と重なる領域が検出領域である。検出領域の体積は、フローサイトメーターに用いる従来法、例えば「アナリティカル・ケミストリー(Anal. Chem.)1987, 59, 846-850」に記載されている測定および計算法で測定して算出することができる。

具体的には、試料液流の半径Ｒｓは、下記式Ｉで表すことができる。
式Ｉ
式Ｉにおいて、Ｑ_sheathはシース液の体積流量、Ｑ_sampleは試料液流の体積流量、Ｒはフローセルの等価断面半径である。例えば、フローセルの中心開口部が一辺２５０μｍの正方形である場合、同じ断面積の等価円形チャネルは半径１４１μｍである。シース液の流速は２．１ｃｍ／ｓｅｃであり、試料液流の体積流量は５ｎＬ／ｍｉｎに制御される。それゆえ、試料液流の算出された断面半径は、約１．１μｍ、すなわち、Ｒｓ＝１．１μｍである。

レーザスポットの半径ωが試料液流の断面半径Ｒより大きい場合、検出領域は縦方向に実質的に円筒形であり、その体積は２πＲ^２ωとして算出される。例えば、レーザビームが半径１６μｍ、すなわち、ω＝８μｍの光点に集束される場合、試料液流の断面半径Ｒは、Ｒ＝１．１μｍとなる。レーザ検出領域は、体積が約６１ｆＬ（２π×１．１^２×８μｍ^３）の縦型円筒形となる。

本発明で提供される方法によれば、検出領域の体積は、１〜１，０００ｆＬ、好ましくは１０〜１００ｆＬ、より好ましくは１０〜３０ｆＬである。検出領域の体積が１０〜３０ｆＬである場合、本発明で提供される方法の検出感度および精度をさらに向上することができる。

本発明で提供される方法によれば、試料液流の流径は、０．１〜２０μｍ、好ましくは０．５〜５μｍ、より好ましくは１〜３μｍである。試料液流の流径が１〜３μｍである場合、本発明で提供される方法の検出感度および精度をさらに向上することできる。

本発明で提供される方法によれば、試料液流の体積流量は、０．１〜１００ｎＬ／ｍｉｎ、好ましくは０．５〜３０ｎＬ／ｍｉｎ、より好ましくは１〜５ｎＬ／ｍｉｎである。試料液流の体積流量が１〜５ｎＬ／ｍｉｎである場合、本発明で提供される方法の検出感度および精度をさらに向上することできる。

本発明で提供される方法によれば、シース液の流速は０．５〜１０ｃｍ／ｓｅｃ、好ましくは１〜３ｃｍ／ｓｅｃ、より好ましくは１．２〜２．５ｃｍ／ｓｅｃである。シース液の流速が１．２〜２．５ｃｍ／ｓｅｃである場合、本発明で提供される方法の検出感度および精度をさらに向上することができる。

本発明で提供される方法によれば、測定光のビーム径は、試料液流径の１〜１５０倍、好ましくは２〜５０倍、より好ましくは５〜２０倍である。測定光のビーム径が試料液流径の５〜２０倍である場合、本発明で提供される方法の検出感度および精度をさらに向上することができる。

本発明で提供される方法によれば、測定光は、フローサイトメトリー分野で用いられる通常の測定光でよい。すなわち、当業者は、適当な波長を有するレーザを測定光として選択することができる。例えば、金ナノ粒子の場合、通常、波長５３０〜５５０ｎｍのレーザが測定光として用いられる。測定時のＳＮ比（信号対ノイズ比）をさらに向上させ、非常に高いレーザ出力により生じる加熱効果を避けるために、測定光の強度は、好ましくは０．０５〜８，０００ｋＷ／ｃｍ^２、より好ましくは０．５〜５，０００ｋＷ／ｃｍ^２、さらにより好ましくは１０〜１，０００ｋＷ／ｃｍ^２または０．０５〜１，０００ｋＷ／ｃｍ^２である。

本発明で提供される方法によれば、レンズ結像系は、無限補正光学系または有限補正光学系とすることができる。無限補正光学系は無限対物レンズおよび結像レンズを含むことができる。これに対し、有限補正光学系は有限対物レンズを含むことができる。無限補正光学系の無限対物レンズは、例えば、オリンパス製の対物レンズ、Olympus ULWD MSPlan 50×（開口数０．５５）などの市販品である。無限補正光学系の結像レンズは、例えば、ソーラボ(Thorlabs)製のレンズ、C240TM-A（焦点距離８ｍｍ）などの市販品である。有限光学結像系の対物レンズは、例えば、対物レンズ、南京冀飛科技有限公司(Nanjing Yifei Technology)製の対物レンズ、LPL 40×/0.65 160/1.5などの市販品である。結像光路系に光学素子をより簡便に追加するには、レンズ結像系は無限補正光学系であることが好ましい。

無限対物レンズまたは有限対物レンズの倍率は１０〜１５０倍、好ましくは３０〜１００倍、より好ましくは５０〜１００倍である。結像レンズの焦点距離は１〜１，０００ｍｍ、好ましくは５〜２５０ｍｍ、より好ましくは７．５〜２００ｍｍである。

実像は適当な方向に形成することができる。好ましくは、実像は測定光の方向および試料液流の方向に対して実質的に垂直な方向に形成する。像は散乱光により形成してもよいし、散乱光および蛍光により形成してもよい。

本発明で提供される方法によれば、測定光を照射する領域は、測定光を照射する試料液流の領域または測定光を照射するシース液の領域を含むことができる。レンズ結像系により収集された光信号は、検出領域内の光信号を含むが、検出領域外の光信号を含むこともある。検出領域外の光信号をフィルタ除去し、視野絞りにより検出領域からの光信号を増強する目的は、光学的な空間フィルタリングを行うことである。これは、視野絞りを用いて、光学系の検出領域を制限し、それにより、光電子信号変換の領域を限定することと等価である。

視野絞りは、光電子検出器の光感応領域または光電子検出器の前方に取り付けた開口絞りとすることができる。

光感応領域の面積または開口絞りの開口面積は、好ましくは５０〜５×１０^６μｍ^２、より好ましくは２×１０^３〜２×１０^５μｍ^２、さらに好ましくは８×１０^３〜８×１０^４μｍ^２である。

本発明で提供される方法によれば、光電子信号変換は、様々な光電子検出器を用いて行うことができる。光電子検出器としては、例えば、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、シリコンフォトダイオード、電荷結合素子または相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）デバイスなどが挙げられるが、これらに限定されない。光電子信号変換は、好ましくはアバランシェフォトダイオードを用いて行われる。

光電子倍増管（ＰＭＴ）は、高利得（利得係数１０^６〜１０^７）、大きい光感応領域、低い暗電流などの利点を有する。ただし、量子効率は低い。例えば、浜松電子ホトニクス製のＰＭＴ R928は、通常、等価入力雑音（ＥＮＩ）が１．３×１０^−１６Ｗである。

アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）は、内部増幅機能を有するフォトダイオードであり、直径が約１８０μｍの非常に小さい光感応領域を有する。キャリアのアバランシェ増倍現象は入射フォトンが吸収された後に生じる。ＡＰＤの利得係数は、通常、１０^２〜１０^３である。例えば、パーキンエルマー製のＡＰＤ SPCM-AQR-12およびSPCM-AQRH-14である。

本発明で提供される方法によれば、電気信号が得られた後、この電気信号に基づいて、ナノ粒子の定性および／または定量分析を行うが、その方法は、例えば、ブランク試料および／または標準試料（内部標準、外部標準など）の電気信号を被検試料の電気信号と比較する従来法でもよい。

本発明で提供される方法によれば、ナノ粒子の粒径は１〜１，０００ｎｍ、好ましくは５〜２００ｎｍ、より好ましくは６．７〜１００ｎｍである。

本発明で提供される方法によれば、ナノ粒子は人工合成または天然ナノ粒子であり、天然ナノ粒子は、好ましくは原核細胞、細胞内小器官、ウイルスなどの生物学的ナノ粒子の少なくとも１種である。

以下、実施例により、本発明をさらに詳しく説明する。下記実施例において、粒径４４ｎｍのポリスチレン球状ナノ粒子は、スフェロテック(Spherotech)(USA)から購入する。それらのＴＥＭ画像を図４に示す。粒径６．７ｎｍおよび１０ｎｍの金ナノ粒子は、ナノコンポシックス(nanoComposix)(USA)から購入する。それらのＴＥＭ画像を図５に示す。粒径２４ｎｍ、２９ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７８ｎｍおよび９０ｎｍのシリカ球状ナノ粒子は「ラングミューア(Langmuir)2008,24, 1714-1720」に開示されている方法で合成する。それらのＴＥＭ画像を図７および図９に示す。粒径が既知のナノ粒子の具体的な粒径値は、ＴＥＭ法で測定された統計学的な平均値である。粒径４４ｎｍのポリスチレン球状ナノ粒子ならびに粒径６．７ｎｍおよび１０ｎｍの金ナノ粒子の濃度は製造業者から提供される。粒径２４ｎｍ、２９ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７８ｎｍおよび９０ｎｍの合成されたシリカ球状ナノ粒子の濃度は、単一粒子計測法で測定された値である。この方法の詳細については、非特許文献２を参照されたい。Ｔ７バクテリオファージ（頭径およそ６０ｎｍ）は「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)2006, 34, e137」に開示されている方法で培養して精製する。粒径４４ｎｍのポリスチレン球状ナノ粒子、粒径の異なる粒径２４ｎｍ、２９ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７８ｎｍおよび９０ｎｍのシリカ球状ナノ粒子、粒径６．７ｎｍおよび１０ｎｍの金ナノ粒子、ならびにＴ７バクテリオファージを、それぞれ、超純水で希釈して、濃度２×１０^９個／ｍＬの懸濁液とし、これらの懸濁液を被検試料液として用いる。

実施例１
図１に示す光路系および図３に示す液流系を参照して、被検試料液（粒径４４ｎｍのポリスチレン球状ナノ粒子を濃度２×１０^９個／ｍＬで含む懸濁液）を、圧力１５０ｋＰａの窒素により耐圧試料管２に圧入する。窒素の圧力は、試料液の体積流量が２ｎＬ／ｍｉｎとなるように制御する。試料管が内径４０μｍ、外径２４０μｍの石英製毛細管である場合、毛細管の端部は、約１２°の先細形状に加工される。試料管をシース液キャビティに軸平行状態で上から下まで挿入する。シース液キャビティは、断面積２５０μｍ×２５０μｍ、軸長２０ｍｍの直方体形状を有する石英ガラス製のキャビティである。試料管の端部は、シース液キャビティの最上部から軸方向に８ｍｍ上方に位置する。シース液１３は、シース液キャビティ内を、流速２ｃｍ／ｓｅｃで、上から下まで流れる。

「アナリティカル・ケミストリー(Anal. Chem.)1987, 59, 846-850」に開示されている計算法（式Ｉに示す）で算出して、シース液の流速が２ｃｍ／ｓｅｃであり、試料液の体積流量が２ｎＬ／ｍｉｎである場合、試料管の端部より上方における試料液流１４の断面半径は、約０．７３μｍである。波長５３２ｎｍのレーザを色消し二重レンズ１（ソーラボ製のAC050-010-A1）により集束させて、ビームウエスト径１６μｍのレーザビーム１２とする。照射強度は、ビームウエストの位置で、８ｋＷ／ｃｍ^２である。レーザビーム１２のビームウエストの位置で、レーザービーム１２の軸は、試料液流１４の軸に対して、垂直に交差している。レーザビーム１２は、試料管の端部から１５０μｍ下方の位置に照射される。図２を参照されたい。Ｒを０．７３μｍ、ωを８μｍとして、検出領域（すなわち、測定光（すなわち、レーザビーム１２）を照射された試料液流１４の領域）の体積を算出すると、２６．８ｆＬとなる。試料液流中の単一ナノ粒子に測定光を照射する時間は、０．８ｍｓである。

測定光を照射された領域から放出された光信号は、無限補正光学系を用いて収集する。無限補正光学系は、対物レンズ３、レンズ６およびレンズ１０を有する。対物レンズ３は、オリンパス製のOlympus ULWDMSPlan50×（開口数０．５５）である。レンズ６およびレンズ１０は、ソーラボ製のC240TM-Aである。無限補正光学系において、対物レンズ３の軸は、レーザビーム１２の軸および試料液流１４の軸に対して垂直である。無限補正光学系において、対物レンズ３およびレンズ１０は同軸であり、レンズ６の軸は、対物レンズ３およびレンズ１０の軸に対して垂直に交差し、その交差点は対物レンズ３とレンズ１０との間に位置する。ダイクロイックフィルタ４であるセムロック(Semrock)(USA)製のダイクロイックフィルタFF555-Dio2-25×36は、その交差点に配置され、対物レンズ３を透過した光信号を２つに分岐する。波長５５５ｎｍ未満の光（この波長範囲を有する光信号は粒径４４ｎｍの被検ポリスチレン球状ナノ粒子からの散乱光である）がレンズ６に反射されるのに対し、波長５５５ｎｍ超の光（この波長範囲を有する光信号は粒径４４ｎｍの被検ポリスチレン球状ナノ粒子からの蛍光信号である）はレンズ１０に透過される。バンドパスフィルタ５（セムロック製のFF01-524/24-25）は、レンズ６とダイクロイックフィルタ４との間に配置し、波長が５１２〜５３６ｎｍを超える散乱光をフィルタ除去するために用いられる。エッジフィルタ８（セムロック製のLP03-532RS）は、レンズ１０とダイクロイックフィルタ４との間に配置され、励起光により生じる散乱バックグラウンドを除去する（すなわち、波長５３２ｎｍの光および波長５３２ｎｍ超の透過光を除去する）ために用いられる。フィルタ９（セムロック製のFF01-579/34-25）は、レンズ１０とフィルタ８との間に配置され、波長が５６２〜５９６ｎｍを超える蛍光をフィルタ除去するために用いられる。

ダイクロイックフィルタにより反射された波長５５５ｎｍ未満の光は、バンドパスフィルタ５およびレンズ６を通過した後、光電検出器７により検出される。シース液および光学的ウィンドウからの迷光からなる光信号は、Ｒ＝０．７３μｍおよびω＝８μｍである検出領域の実像の周囲に存在する。直径１８０μｍの光感応領域を有するＡＰＤ（SPCM-AQRF-14）は、光電検出器７として選択され、ＡＰＤの光感応領域は、視野絞りとして機能し、対物レンズ３から試料液流１４までの距離および光感応領域の空間的な位置に対する光学的校正を行うことにより、検出領域外の光信号をフィルタ除去して、検出領域の光信号を増強する。光学的な収集の後、ＡＰＤの光感応領域に受光された光信号は、視野絞りにより増強された光信号である。最後に、ＡＰＤの上記光感応領域で受光した光信号は、光電変換を受ける。

光キャリブレーション過程では、ＡＰＤからの出力信号が、ナノ粒子からの散乱光の強度が最大であり、ＳＮ比が最良であることを示している場合、対物レンズ３から試料液流１４までの距離およびＡＰＤの光感応領域の空間的な位置が最適であること、すなわち、光キャリブレーションの目的は達成されていると考えられ、光キャリブレーション過程は完了する。レンズ結像系を経た検出領域の倍率は、対物レンズ３およびレンズ６の焦点距離に依存し、検出領域のサイズに結像系の倍率を掛けた数値は、焦平面における光点サイズ、すなわち、最小の光点サイズに等しい。検出領域の光信号は、レンズ６により焦点に集められる。レンズ６の焦平面に平行な平面上において、検出領域の光点サイズは、この平面からレンズ６までの距離により連続的に変化する。ＡＰＤの空間的な位置を調整することにより、検出領域の光点サイズは、ＡＰＤの光感応領域のサイズと調和する。検出領域の光点の中心は、ＡＰＤの光感応領域の中心と重なる。それゆえ、ナノ粒子からの散乱光の強度は最大であり、ＳＮ比も最大となる。

ＡＰＤ（光電検出器７として利用）を用いた変換により得られた電気信号と時間との関係図を図６Ａ１に示す。ＳＮ比は、バックグラウンド信号の標準偏差に対するバックグラウンド信号除去後の散乱光のピーク高さの比であり、４８と算出される。図６Ａ１の結果から、粒径４４ｎｍの単一ポリスチレンナノ粒子の散乱光を高ＳＮ比で検出できることがわかる。

ＡＰＤ（光電検出器７として利用）を用いた変換により得られた散乱光のピーク面積の周波数分布ヒストグラムを図６Ａ２に示す。散乱光のピークは、電気信号と時間との関係図におけるピークを意味する。変動係数（ＣＶ）は、散乱光のピーク面積の平均値に対する散乱光のピーク面積の標準偏差の比であり、９０％と算出される。ミー(Mie)の散乱理論に基づいて、粒径が励起光の波長よりはるかに小さい場合、ナノ粒子からの散乱光は、粒径の６乗に比例する。それゆえ、粒径分布のＣＶが得られる。すなわち、ＣＶ＝（（１＋９０％）^１／６−１）×１００％＝１１．３％である。この値は、ＴＥＭ試験法で得られたＣＶ値（９．１％）と実質的に同じである。それゆえ、本発明で提供される方法は、４４ｎｍポリスチレン球状ナノ粒子の粒径分布を検出するのに用いることができ、信頼できる検出結果が得られることがわかる。

比較例１
実施例１に記載した方法で測定するが、その相違点は、試料管２中の試料液の体積流量が２０ｎＬ／ｍｉｎであること、シース液１３の流速が２０ｃｍ／ｓｅｃであること、すなわち、試料液流１４の断面半径が約０．７３μｍであること、推定Ｒが０．７３μｍ、ωが８μｍであること、検出領域の体積が２６．８ｆＬであること、ならびに、試料液流中の単一ナノ粒子に測定光を照射する時間が０．０８ｍｓであることである。

ＡＰＤ（光電検出器７として利用）を用いた変換により得られた電気信号と時間との相関図において、信号をバックグラウンドノイズから区別することはできない。

比較例２
実施例１に記載した方法で測定するが、その相違点は、光感応領域８×２４ｍｍのＰＭＴ（浜松ホトニクス製のR928）が光電検出器７として選択されること、ならびに、ＰＭＴの光感応領域が実施例１のＡＰＤの光感応領域と同じ位置に配置されることである。ＰＭＴの光感応領域の面積は１．９２×１０^８μｍ^２である。迷光は除去することができない、すなわち、光学的な空間フィルタリングは行わない。

ＰＭＴ（光電検出器７として利用）を用いた変換により得られた電気信号と時間との相関図において、信号をバックグラウンドノイズから区別することはできない。

実施例１および比較例１〜２の結果は、本発明で提供される方法が、試料液流中の単一ナノ粒子に対する測定光の照射時間を０．１〜１０ｍｓに制御し、検出領域外の光信号をフィルタ除去することにより、単一ナノ粒子からの散乱光を高感度で検出できることを示している。

実施例２
実施例１に記載した方法で測定するが、その相違点は、被検試料液が粒径４０ｎｍのシリカ球状ナノ粒子を濃度２×１０^９個／ｍＬで含む懸濁液であることである。

ＡＰＤ（光電検出器７として利用）を用いた変換により得られた電気信号と時間との相関図を図６Ｂ１に示す。算出されたＳＮ比は１０である。図６Ｂ１に示す結果から、粒径４０ｎｍの単一シリカ球状ナノ粒子からの散乱光をバックグラウンドから明確に区別できることがわかる。

ＡＰＤ（光電検出器７として利用）を用いた変換により得られた散乱光のピーク面積の周波数分布ヒストグラムを図６Ｂ２に示す。算出されたＣＶは４０％である。ミー散乱理論に基づいて、粒径分布のＣＶを得ることができる。すなわち、ＣＶ＝（（１＋４０％）^１／６−１）×１００％＝５．８％である。その値は、ＴＥＭ試験法で得られたＣＶ（４．８％）と実質的に同じである。それゆえ、本発明で提供される方法は、４０ｎｍシリカ球状ナノ粒子の粒径分布を検出するのに用いることができ、信頼できる検出結果が得られることがわかる。

実施例３
実施例１に記載した方法で測定するが、その相違点は、被検試料液が粒径１０ｎｍの金ナノ粒子を濃度２×１０^９個／ｍＬで含む懸濁液であることである。

ＡＰＤ（光電検出器７として利用）を用いた変換により得られた電気信号と時間との相関図を図６Ｃ１に示す。算出されたＳＮ比は１０である。図６Ｃ１に示す結果から、粒径１０ｎｍの単一金ナノ粒子からの散乱光をバックグラウンドから明確に区別できることがわかる。

ＡＰＤ（光電検出器７として利用）を用いた変換により得られた散乱光のピーク面積の周波数分布ヒストグラムを図６Ｃ２に示す。算出されたＣＶは５５％である。ミー散乱理論に基づいて、粒径分布のＣＶを得ることができる。すなわち、ＣＶ＝（（１＋５５％）^１／６−１）×１００％＝７．６％である。その値は、製造業者により規定されたＴＥＭ試験法で得られたＣＶ（７．１％）と実質的に同じである。それゆえ、本発明で提供される方法は、１０ｎｍ金ナノ粒子の粒径分布を検出するのに用いることができ、信頼できる検出結果が得られることがわかる。

実施例４
実施例１に記載した方法で測定するが、その相違点は、被検試料液がＴ７バクテリオファージを濃度２×１０^９個／ｍＬで含む懸濁液であることである。

ＡＰＤ（光電検出器７として利用）を用いた変換により得られた電気信号と時間との相関図を図６Ｄ１に示す。算出されたＳＮ比は１０５である。図６Ｄ１に示す結果から、単一Ｔ７バクテリオファージからの散乱光を高ＳＮ比で検出できることがわかる。

ＡＰＤ（光電検出器７として利用）を用いた変換により得られた散乱光のピーク面積の周波数分布ヒストグラムを図６Ｄ２に示す。算出されたＣＶは１２％である。ミー散乱理論に基づいて、粒径分布のＣＶを得ることができる。すなわち、ＣＶ＝（（１＋１２％）^１／６−１）×１００％＝１．９％である。天然Ｔ７バクテリオファージの粒径と差異がないとすると、粒径検出に関する本発明で提供される方法の系統誤差は、１．９％である。

実施例５
粒径４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７８ｎｍおよび９０ｎｍのシリカ球状ナノ粒子を濃度２×１０^９個／ｍＬ、同体積で混合して、混合シリカナノ粒子試料を得る。実施例１に記載した方法で測定するが、その相違点は、被検試料液が上記した混合シリカ球状ナノ粒子試料であることである。

ＡＰＤ（光電検出器７として利用）を用いた変換により得られた散乱光のフォトンバーストピーク面積の周波数分布ヒストグラムを図８Ａに示す。散乱光のフォトンバーストピーク面積が５つのピークを示し、これらが粒径の異なる５種類のシリカ球状ナノ粒子に対応していることがわかる。

図８Ｂに示すように、シリカ球状ナノ粒子からの散乱光のピーク面積の中央値と各シリカ球状ナノ粒子の粒径との関係を示す曲線は、粒径の異なる５種類のシリカ球状ナノ粒子に適合する。曲線の式は、ｙ＝３．７５Ｅ-８ｘ^６．１５である。ここで、ｙは散乱光のピーク面積、ｘは粒径を表す。Ｒ^２は、０．９９９７程度であり、これは散乱光のピーク面積がシリカ球状ナノ粒子の粒径の６．１５乗に比例することを示し、これはミー散乱理論で示された６乗とよく一致する。

式：ｙ＝３．７５Ｅ-８ｘ^６．１５を用いれば、シリカ球状ナノ粒子からの散乱光のフォトンバーストピーク面積は、粒径に変換される。粒径の周波数分布ヒストグラムを図８Ｃに示す。これらの結果は、それぞれ、ＴＥＭ試験法で得られた５種類のナノ粒子の粒径分布の結果（図７Ｆ）と全く同様であり、これは本発明で提供される方法が混合シリカ球状ナノ粒子試料中の５種類のシリカ球状ナノ粒子の粒径分布を精度よく特徴付けることを示している。

実施例６
実施例１に記載した方法で測定するが、その相違点は、波長５３２ｎｍのレーザをレンズ１（ソーラボ製のC330TM-A）により集束させて、ビームウエスト径６．４μｍのレーザビーム１２とすること、ならびに、照射強度をビームウエストの位置で、４９８ｋＷ／ｃｍ^２とすることである。図２を参照されたい。Ｒを０．７３μｍ、ωを３．２μｍとして、検出領域の体積を算出すると、１０．７ｆＬとなる。試料液流中の単一ナノ粒子に測定光を照射する時間は、０．３ｍｓである。被検試料液は、粒径６．７ｎｍの金ナノ粒子を濃度２×１０^９個／ｍＬで含む懸濁液である。

ＡＰＤ（光電検出器７として利用）を用いた変換により得られた電気信号と時間との相関図を図１０Ａ１に示す。算出されたＳＮ比は５である。図１０Ａに示す結果から、粒径６．７ｎｍの単一金ナノ粒子からの散乱光は、バックグラウンドから適切に区別できることがわかる。

実施例７
実施例６に記載した方法で測定するが、その相違点は、被検試料液が粒径１０ｎｍの金ナノ粒子を濃度２×１０^９個／ｍＬで含む懸濁液であることである。

ＡＰＤ（光電検出器７として利用）を用いた変換により得られた電気信号と時間との相関図を図１０Ｂ１に示す。算出されたＳＮ比は５３である。図１０Ｂに示す結果から、粒径１０ｎｍの単一金ナノ粒子からの散乱光は、バックグラウンドから明確に区別できることがわかる。

実施例３、６および７の結果は、本発明で提供される方法が単一ナノ粒子からの散乱光の検出感度を効果的に向上し、それにより、ビームウエストの位置において、照射強度を増強することにより、検出限界を小さくできることを示している。

実施例８
実施例６に記載した方法で測定するが、その相違点は、被検試料液が粒径２４ｎｍのシリカ球状ナノ粒子を濃度２×１０^９個／ｍＬで含む懸濁液であることである。

ＡＰＤ（光電検出器７として利用）を用いた変換により得られた電気信号と時間との相関図を図１０Ｃ１に示す。算出されたＳＮ比は７である。図１０Ｃに示す結果から、粒径２４ｎｍの単一シリカ球状ナノ粒子からの散乱光は、バックグラウンドから適切に区別できることがわかる。

実施例９
実施例６に記載した方法で測定するが、その相違点は、被検試料液が粒径２９ｎｍのシリカ球状ナノ粒子を濃度２×１０^９個／ｍＬで含む懸濁液であることである。

ＡＰＤ（光電検出器７として利用）を用いた変換により得られた電気信号と時間との相関図を図１０Ｄ１に示す。算出されたＳＮ比は２７である。図１０Ｄに示す結果から、粒径２９ｎｍの単一シリカ球状ナノ粒子からの散乱光は、バックグラウンドから明確に区別できることがわかる。

以上、本発明の好ましい実施形態について、添付の図面を参照しながら説明したが、本発明は、これらの実施形態の詳細に限定されるものではない。当業者は、本発明の精神を逸脱することなく、本発明の技術的解決法に対して、修正や改変を行うことができる。しかし、これらの修正や改変は、本発明の保護範囲に属するものと解釈すべきである。例えば、対物レンズは、単純なレンズで置き換えることができる。

また、上記実施形態に記載した特定の技術的特徴は、相反しなければ、適当な形で組合わせ得ることに留意されたい。不必要な反復を避けるため、本発明で考えられる組合わせについては、詳しく説明しない。

１色消し二重レンズ
２試料管
３対物レンズ
４ダイクロイックフィルタ
５バンドパスフィルタ
６レンズ
７光電検出器
８エッジフィルタ
９バンドパスフィルタ
１０レンズ
１１光電検出器
１２レーザ
１３シース流
１４試料液流

Claims

下記工程を含むことを特徴とするナノ粒子検出法：
（１）シース液を用いた流体力学的集束により被検試料液を圧縮して試料液流とする工程であって、前記試料液流が被検ナノ粒子を含み、前記ナノ粒子が前記試料液流中で実質的に互いに分離され、かつ実質的に同じラインを流れるようにする工程；
（２）前記試料液流に測定光を照射する工程であって、前記試料液流中の単一ナノ粒子が０．１〜１０ｍｓ、好ましくは０．２〜２ｍｓ間にわたって、前記測定光により照射されるようにする工程；
（３）前記測定光を照射された前記試料液流の領域を検出領域として定義し、前記測定光の照射領域から放出された光信号をレンズ結像系により収集し、前記レンズ結像系により収集された前記光信号を視野絞りに通過させることにより、前記検出領域外の前記光信号をフィルタ除去して、前記検出領域からの前記光信号を増強するようにする工程；
（４）前記視野絞りにより増強された前記光信号を光電信号変換し、前記試料液流中の各ナノ粒子から放出された散乱光および／または蛍光の電気信号をそれぞれ取得する工程；および
（５）前記電気信号により前記ナノ粒子の定性および／または定量分析を実施する工程。
前記検出領域の体積が１〜１，０００ｆＬ、好ましくは１０〜１００ｆＬ、より好ましくは１０〜３０ｆＬである請求項１記載の方法。
前記試料液流の流径が０．１〜２０μｍ、好ましくは０．５〜５μｍ、より好ましくは１〜３μｍである請求項１または２記載の方法。
前記試料液流の体積流量が０．１〜１００ｎＬ／ｍｉｎ、好ましくは０．５〜３０ｎＬ／ｍｉｎ、より好ましくは１〜５ｎＬ／ｍｉｎである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
シース液の流速が０．５〜１０ｃｍ／ｓｅｃ、好ましくは１〜３ｃｍ／ｓｅｃ、より好ましくは１．２〜２．５ｃｍ／ｓｅｃである請求項１記載の方法。
前記測定光のビーム径が前記試料液流の流径の１〜１５０倍、好ましくは２〜５０倍、より好ましくは５〜２０倍である請求項１記載の方法。
前記測定光の強度が０．０５〜８，０００ｋＷ／ｃｍ^２、好ましくは０．５〜５，０００ｋＷ／ｃｍ^２、より好ましくは１０〜１，０００ｋＷ／ｃｍ^２である請求項１または６記載の方法。
前記レンズ結像系が無限補正光学系または有限補正光学系である請求項１記載の方法。
前記無限補正光学系が無限対物レンズおよび結像レンズを含むのに対し、前記有限補正光学系が有限対物レンズを含む請求項８記載の方法。
前記視野絞りが前記光電検出器または前記光電検出器の前方に取り付けた開口絞りの光感応領域である請求項１記載の方法。
前記光感応領域の面積または前記開口絞りの開口面積が５０〜５×１０^６μｍ^２、好ましくは２×１０^３〜２×１０^５μｍ^２、より好ましくは８×１０^３〜８×１０^４μｍ^２である請求項１０記載の方法。
前記光電信号変換が光電検出器により行われ、前記光電検出器が、例えば、アバランシェフォトダイオード、光電子増倍管、シリコンフォトダイオード、電荷結合素子または相補型金属酸化物半導体デバイスを含むが、これらに限定されることはなく、好ましくは前記光電検出器がアバランシェフォトダイオードである請求項１、１０または１１記載の方法。
前記ナノ粒子の粒径が１〜１，０００ｎｍ、好ましくは５〜２００ｎｍ、より好ましくは６．７〜１００ｎｍである請求項１記載の方法。
前記ナノ粒子が人工合成または天然ナノ粒子であり、好ましくは、前記天然ナノ粒子が原核細胞、細胞内小器官およびウイルスなどのうち少なくとも１種の生物学的ナノ粒子である請求項１または１３記載の方法。