CN103487359A

CN103487359A - 一种激光激发的细胞和颗粒形态和分布测量装置

Info

Publication number: CN103487359A
Application number: CN201310440841.XA
Authority: CN
Inventors: 任重; 刘国栋
Original assignee: Jiangxi Science and Technology Normal University
Current assignee: Jiangxi Science and Technology Normal University
Priority date: 2013-09-25
Filing date: 2013-09-25
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2033-09-25
Also published as: CN103487359B

Abstract

一种全自动激光激发的细胞和颗粒形态和分布测量装置，包括激光辐射单元、流动检测单元、前向探测单元、后向探测单元和侧向探测单元。本发明装置汇聚电子技术、计算机技术、激光技术、流体技术，生物医学技术。本发明除了能实现细胞大小、形态的测量之外，还可以对包括细胞质、细胞核和细胞内抗原及基因蛋白进行定量分析。利用前向、后向和侧向探测方法，大大提高了细胞形态和分布测量的范围和准确度，相比其他类型的颗粒检测仪和细胞检测装置，本发明在功能、测量范围和准确度上有较大的提高，具有更好的实用性。

Description

一种激光激发的细胞和颗粒形态和分布测量装置

技术领域

本发明涉及生物医学测量和医疗器械技术领域，具体涉及一种激光激发的细胞和颗粒形态和分布测量装置。

背景技术

在一些工业化领域，比如石化、陶瓷、水泥、涂料、制药、军工等，对颗粒大小和分布情况要做到细节的了解，目前大多采用激光粒度仪来测量颗粒的参数，虽然速度快、不与检测物质直接接触等优点，但是目前传统的激光粒度仪结构基本固定，大多是单光束单镜头和多光束多镜头结构。对于单光束单镜头结构，其结构简单、测量范围较小；对于多光束多镜头结构，虽然测量范围广，但是结构复杂且价格较贵。为了避免结构复杂的同时扩展其测量和使用范围，有些人在激光粒度仪原有的结构基础上做了一些改进。如：中国发明专利申请公开说明书（公开号：CN 101368899、CN 10129028A、CN 1760660、CN 102221518A和CN 102081032A），但这些改进同样使得设备结构复杂、调试困难，无法满足不同类型或大小的颗粒测量的需要，适用性差。

传统的激光粒度仪大多是通过检测散射光来对粉体、悬液和气体颗粒进行粒径大小和形状的测量，而对于颗粒或细胞本身的性质和其内部组分特征，比如：对生物细胞中红细胞、白细胞、中性粒子细胞、巨噬细胞等细胞的大小、形态，以及细胞膜、细胞质和细胞核的性状，将无法进行测量和做定量分析。目前，对生物细胞进行检测，特别是对细胞内（细胞质和细胞核）的组分和形态进行检测，是通过细胞进行染色标记，然后利用流式细胞仪来测量的。对于流式细胞仪而言，虽然可以检测其前向、侧向散射光和侧向荧光，但是对于后向散射光反而大于前向散射光的较小粒径的细胞或颗粒，却没有进行检测，从而降低了细胞粒径和形态检测的范围和准确度。

发明内容

为了克服上述细胞和颗粒检测的不足之处，本发明专利提出了一种激光激发的细胞和颗粒形态和分布测量装置。

具体技术方案如下：

一种激光激发的细胞和颗粒形态和分布测量装置，包括激光辐射单元（100）、流动检测单元（200）、前向探测单元（300）和侧向探测单元（500），还包括后向探测单元（400）；

所述的激光辐射单元（100）沿光传播方向依次由激光器（110）、扩束镜（120）、针孔（130）、准直透镜（140）、聚焦透镜（150）构成；

所述的流动检测单元（200）从外至内为检测室（210）、检测室内的鞘流管（220）、鞘流管内的样品管（230）、位于流动监测单元下部的喷嘴（240）构成，样品管（230）和鞘流管（220）均与喷嘴（240）相连，样品液和鞘流液可从喷嘴（240）喷出；

所述的检测室为一中空横截面为正方形的透明石英玻璃封闭室，检测室的内外玻璃面保持平行；

流动室内的鞘流管中充满流动的鞘液，被测样品悬液在正压力下，形成样本流通过样品管（230）被吸入流动室内，并且通过喷嘴（240）喷出，而鞘液在高压下通过鞘流管喷出。鞘液的流速大于被测样品悬液的流速，被测样品悬液在鞘流液的包裹下，以样品液柱的形式同轴通过轴流的中央，并且被测样品以单个排队的形式通过流过检测区在该孔的中心；

所述的前向探测单元（300）由前向傅立叶透镜（310）和前向散射光探测器（320）构成；

所述的侧向探测单元（500）由侧向准直镜（510）、双色性反射镜（520）、侧向散射光探测单元（530）和荧光探测单元（540）构成；所述的侧向散射光探测单元（530）由滤光片（531）、侧向傅里叶透镜（532）和侧向散射光探测器（533）构成；所述的荧光探测单元（540）由荧光滤光片组件（541）、荧光傅里叶透镜（542）和荧光探测器（543）构成；

所述的后向探测单元（400）由后向傅立叶透镜（410）和后向散射光探测器(420)构成；

所述前向散射光探测器(320) 后向散射光探测器(420)采用同心环形结构硅光电池探测器；所述的硅光电池探测器环数大于2环，优选为2-4环，由内至外依次用于检测细胞和颗粒前向小角度散射光和前向大角度散射光。

为达到更好的技术效果，所述的激光器（110）采用激发波长固定的激光器，或波长可调谐的激光器。所述的侧向探测单元，其特征在于所述的侧向散射光探测器（533）和荧光探测器（543）均采用光电倍增管，其响应光波长范围从200nm到800nm。

本发明的一种激光激发的细胞和颗粒形态和分布测量装置，使用时，由激光器发出一定波长的光束，经扩束镜扩束后，再经过针孔将高阶散射光滤除，然后空间低频激光束经过准直透镜准直成平行光束，光束宽度约为5mm。准直后的光束由聚焦透镜聚焦后直接照射到流动检测单元的被测细胞上，细胞的前向散射光经过前向傅里叶透镜成像于前向硅光电池探测器上，同时，细胞的后向散射光经过后向傅里叶透镜成像于后向硅光电池探测器上。根据Mie散射理论，粒径大的细胞，前向散射光强于后向散射光，并且其散射光的发散角度小；反之，粒径小的细胞，前向散射光弱于后向散射光，并且其散射光的发散角度大。另外，侧向散射光被侧向光接收镜接收后，经过双色性反射镜，将侧向散射光和荧光进行分离，双色性反射镜将低于激光激发波长的荧光透过，再经过滤光片组件和荧光傅里叶透镜，将一定波长的荧光成像与荧光倍增管上，而侧向散射光被双色反射镜以侧向光轴成90度角度反射，反射后的光经过滤光片后，再由傅里叶透镜成像于光电倍增管上。最后，由前向、后向硅光电池探测器、侧向散射光光电倍增管和荧光倍增管将成像的光信号转换成相应的电信号后，经过多路放大器放大和多路数据采集卡采集转换成相应的数字信号后，经过PCI总线传输至计算机中，最后交予软件进行分析处理。

本发明的一种全自动激光激发的细胞形态和分布测量装置，与现有的技术相比，具有的有益的效果有：

（1）相比单光路多镜头、单镜头多光路和多镜头多光路结构的激光粒度仪，本发明的装置，结构简单，易于系统调试。

（2）采用前向探测、后向和侧向探测方式，不仅可以探测细胞的前向和后向散射光来反映细胞粒径的大小和分布情况，还可以对侧向荧光和散射光进行探测，从而可以区分不同类型的细胞（如：红细胞、白细胞、中性粒子细胞、淋巴细胞和嗜酸性细胞等）及基细胞膜、细胞质、细胞核等细胞内的组分、形态和分布进行定量分析，大大提高了仪器的使用范围，功能更加强大。

（3）由于本发明采用会聚光照射被测细胞颗粒，相比普通的激光粒度仪采用的扩束平行光照射方式，该方法提高了细胞颗粒入射光强度，使得散射光能量得到了增强，相应的转换后的电信号能量液得到了增强，易于后续的数据分析，精度得到了很大的提高。

（4）除了探测前向和侧向散射光，本发明还可以探测后向散射光，从而增加了对样品散射光的信息，使得样品散射光散点图增加到三维，大大增加了探测的准确度。

附图说明

图1为本发明的总体结构示意图。

图2为本发明的结构俯视示意图。

图3为本发明的环形硅光电池结构示意图。

图4为本发明的流动检测室侧面剖视图。

图5为本发明的被测细胞的前、后和侧向散射光及侧向荧光示意图。

图6为本发明的荧光滤光片轮组件示意图。

图7为本发明的实施例2的激光辐射单元示意图。

具体实施例

实施例1

一种激光激发的细胞和颗粒形态和分布测量装置，如图1所示，包括激光辐射单元（100）、流动检测单元（200）、前向探测单元（300）、后向探测单元（400）和侧向探测单元（500）。如图2所示，其特征在于：激光辐射单元（100）沿光传播方向依次包括激光器（110）、扩束镜（120）、针孔（130）、准直透镜（140）、聚焦透镜（150）构成；流动检测单元（200）从外至内由检测室（210）、鞘流管（220）、样品管（230）构成，而喷嘴（240）位于检测室（210）的下方。前向探测单元（300）由前向傅立叶透镜（310）和前向散射光探测器（320）构成。后向探测单元（400）由后向傅立叶透镜（410）和后向散射光探测器(420)构成；侧向探测单元（500）由侧向光接收镜（510）、双色性反射镜（520）、侧向散射光探测单元(530)和荧光探测单元(540)构成。其中侧向散射光探测单元(530)由侧向散射光滤光片(531)、侧向散射光傅里叶透镜(532)和侧向散射光探测器(533)构成；荧光探测单元(540)由荧光滤光片轮组件(541)、荧光傅里叶透镜(542)和荧光探测器组件(543)构成。

采用聚焦光束照射被测细胞，从而产生前向散射光、后向散射光和侧向散射光及侧向荧光。

激光辐射单元(100)为测量细胞提供入射光源，其中激光器(110)采用固定单一波长的激光器，氩离子激光器，其波长为488nm，功率为５mW。扩束镜(120)选择10倍显微物镜，数值孔径为0.25。针孔(130)的大小为10-20μm可调，位置在扩束镜(120)的像方焦点和准直透镜(140)物方焦点重合处。激光器(110)发出的光束在经过扩束镜（120）扩束、针孔（130）滤波和准直透镜(140)准直后，光束直径约为5mm。再经过焦距为200mm的聚焦透镜(150)聚焦直接照射至流动室(210)中的被测细胞(250)上，形成几何尺寸约为22μm×66μm的高斯光斑。前向傅里叶透镜(310)和后向傅里叶透镜(410)，焦距均为100mm，并且前向傅里叶透镜（310）和后向傅里叶透镜（410）以流动室210为中心成轴对称分布。前向散射光探测器（320）和后向散射光探测器(420)均为同心环形结构的硅光电池探测器，环数为2-4环，且前向散射光探测器(320)和后向散射光探测器(420)也以流动室(210)为中心成轴对称分布。前向和后向散射光探测器（320）选用上海欧光环形硅光电池，如图3所示，环数为4环，第一环（321和421）为中心圆面，其内直径为0mm, 外直径为0.5mm; 第二环（322和422）内直径尺寸为0.6mm, 外直径为2.7mm；第三环（323和423）内直径尺寸为2.8mm, 外直径为3.9mm; 第四环（324和424）内直径尺寸为4.0mm, 外直径为15mm，其设计公差小于5μm。根据Mie散射原理，粒径大的细胞或颗粒，其光散射角度小；而粒径小的细胞或颗粒，其光散射角度大。所以，前向散射光探测器（320）和后向散射光探测器（420）的第一环321、421主要用于检测信号的直流分量，实现信号对中校正；第二环（322、422）、第三环（323、423）主要用于检测大细胞和颗粒的小角度散射光；第四环(324、424)主要用于检测小细胞和颗粒的大角度散射光。我们选择激发波长488nm的激光器，前向傅里叶透镜(310)的焦距均为100mm，根据环形硅光电池每环尺寸和公式r_m=1.357λf/(πD_m)，其中，λ为入射光波长，f为傅立叶透镜焦距，r_m为第m环探测器内半径，可以反推得到，该焦距和探测器下测量的细胞和颗粒的粒径范围约为2.8μm至400μm。

流动检测单元（200）从外至内由流动室（210）、流动室中包裹的鞘流管(220)、鞘流管中包裹的样品管（230）、及位于流动检测单元下部的喷嘴(240)组成，其中流动室210为内部成横截面长方形中空的透明石英玻璃封闭室，中空大小尺寸为430μm×180μm，其剖面结构如图4所示。流动室210内部的鞘流管220中充满流动的鞘液，鞘液为磷酸盐缓冲液。被测细胞悬液在正压力下，形成样本流通过样品管230被吸入流动室内，并且通过喷嘴240喷出，而鞘液在高压下通过鞘液管喷出。由于鞘液的流速大于被测细胞悬液的流速，通常被测细胞悬液样本流的流速控制在10m/s以下，而鞘液流速相比样本流流速比在1：50至几百。这样就使得被测细胞悬液在鞘流液的包裹下，以细胞液柱的形式同轴通过轴流的中央，并且被测细胞以单个细胞排队的形式通过流过检测区在该孔的中心。如图5所示，被测细胞在入射激光1的照射下，分成前向散射光2、后向散射光3、侧向散射光4和侧向荧光5。其中，前向散射光2、后向散射光3、侧向散射光4与入射激光的波长一致，而侧向荧光5是根据细胞染色材料的不同，通过一定波长的入射激光照射后，激发产生不同波长的荧光，通常荧光的波长要长于入射激发光的波长。

侧向光接收透镜（510）为大数值孔径准直透镜。双色性反射镜（520）为短通滤光反射片，它与侧向光接收的光轴成45度夹角，它将小于特定波长的侧向散射光通过，而将大于特定波长的荧光反射，反射方向与侧向光接收方向成夹角90度。若激光器（110）的激发波长为488nm,被测细胞（250）染色标记不同，受激光激发就会产生波长不同的激发荧光，若采用异硫氰酸荧光素，该染色剂在激发波长488nm激光的激发下，可以产生波长为520nm的激发荧光；若染色标记使用多甲藻叶绿素蛋白，由于多甲藻叶绿素蛋白在激发波长488nm激光的激发下，可以产生波长为677nm的激发荧光，故双色性反射镜(520)的选通波长优选为530±15nm的短通滤光反射片，则低于515nm的侧向散射光就可以平行与侧向光轴通过双色性反射镜（520），而大于515nm的激发荧光则被双色性反射镜（520）以垂直侧向光轴方向反射。

侧向散射光滤光片（531）选用波长488nm±10nm的带通滤光片，可以保证滤除波长488nm以外的侧向散射光。侧向散射光傅立叶透镜（532）与前后向傅立叶透镜（310、410）一致。侧向散射光探测器（533）选用响应波长范围在200nm-800nm的光电倍增管来探测侧向散射光。

由于不同染色剂在一定波长的激发下，产生不同波长的激发荧光，因此，荧光滤光片轮组件（541）为一系列波长的带通滤光片组成的滤光片轮转装置，如图6所示。荧光滤光片轮组件（541）选用北京奥普特斯光电技术有限公司生产的带通滤光片，其波长可为：532nm±30nm（型号：Opts-532-VLF）、578±20nm(型号：Opts-578-VLF)、600±20nm(型号：Opts-600-VLF) 、636±20nm（型号：Opts-636-VLF）、660±20nm(型号：Opts-660-VLF)、690±20nm（型号：Opts-690-VLF），这些带通滤光片对入射光的峰值透射率均可以达到75%。荧光傅里叶透镜(542)与前向傅立叶透镜（310）一致。荧光探测器(543)与侧向散射光探测器(533)相一致，均选用响应波长范围在200nm-800nm的光电倍增管。

实施例2

采用准直光照射被测细胞，如图7所示。此方案的激光辐射单元的光路步骤如下所述：激光器110发出的光束在经过扩束镜120扩束、针孔130滤波和准直透镜140准直后，再经过聚焦透镜150聚焦，聚焦后的光经过视场光阑160后，再经过准直透镜170将光束准直，并将入射光束宽度变成约100μm后照射流动室210中的被测细胞250。

其余同实施例1。

实施例3

采用波长可调的半导体激光器，可调波长范围为400-800nm。

其余同实施例1。

Claims

1.一种激光激发的细胞和颗粒形态和分布测量装置，其特征在于包括激光辐射单元（100）、流动检测单元（200）、前向探测单元（300）和侧向探测单元（500），还包括后向探测单元（400）；

流动室内的鞘流管中充满流动的鞘液，被测样品悬液在正压力下，形成样本流通过样品管（230）被吸入流动室内，并且通过喷嘴（240）喷出，而鞘液在高压下通过鞘流管喷出。

2.鞘液的流速大于被测样品悬液的流速，被测样品悬液在鞘流液的包裹下，以样品液柱的形式同轴通过轴流的中央，并且被测样品以单个排队的形式通过流过检测区在该孔的中心；

3.如权利要求1所述的检测装置，其特征在于所述的激光器（110）采用激发波长固定的激光器，或波长可调谐的激光器。

4.根据权利要求3所述的侧向探测单元，其特征在于所述的侧向散射光探测器（533）和荧光探测器（543）均采用光电倍增管，其响应光波长范围从200nm到800nm。