CN103728236A - 一种检测纳米粒子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测单个纳米粒子的方法，该方法包括如下步骤：（1）使用鞘液通过流体动力学聚焦将待测的样品液体压缩成样品液流；（2）向所述样品液流照射测量光，其中，所述样品液流中的单个纳米粒子接受测量光照射的时间为0.1-10毫秒；（3）将接受测量光照射的所述样品液流的区域定义为探测区，通过透镜成像系统收集由接受测量光照射的区域发出的光信号，使透镜成像系统所收集的光信号通过视场光阑以滤除探测区外的光信号并富集探测区的光信号；（4）将通过视场光阑富集得到的光信号进行光电信号转换。本发明能够实现对粒径为40-1000nm的低折射率纳米颗粒和粒径10-150nm纳米金颗粒的检测。

Description

一种检测纳米粒子的方法

技术领域

本发明涉及仪器分析领域，具体地，涉及一种检测单个纳米粒子的方法。

背景技术

近年来纳米生物技术迅猛发展，具有独特结构与功能的人工合成纳米颗粒在药物的靶向传输、肿瘤的高分辨成像、疾病诊断等生物医学以及蛋白纯化、生化分析、食品安全、环境监测等领域正发挥着越来越重要的作用。功能化纳米颗粒粒径分布的测定对于纳米颗粒的质量控制及实际运用具有重要意义。此外，自然界中存在着众多的生物纳米颗粒如细菌、病毒、细胞器、分子组装体等，快速、高分辨的纳米颗粒检测技术将为病原体鉴别、病毒疫苗的质量控制、基因转运病毒载体的转导效率测定、以及基础生命科学研究等提供有力的分析手段。

通过高灵敏度流式细胞术可以有效地分析纳米粒子，例如文献（Anal.Chem.2009,81,2555-2563和J.Am.Chem.Soc.2010,132,12176-12178）中公开了一种高灵敏度流式细胞术的技术方案，具体公开了：使用鞘液通过流体动力学聚焦将待测的样品液体压缩成样品液流，向样品液流照射测量光，且接受测量光照射的样品液流的体积为约800fL和150fL，通过非球面透镜收集样品液流中的各个纳米粒子发出的散射光和/或荧光并获取信号，根据信号对纳米粒子进行分析；但是该公开的技术方案仅能检测粒径大于100nm的聚苯乙烯纳米粒子，无法检测粒径更小的低折射率材质纳米粒子。对于纳米颗粒，散射光强度随颗粒粒径的六次方衰减，即粒径减少一半，其信号强度减少64倍，因此，难以实现对粒径更小的纳米粒子进行检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够检测粒径更小的纳米粒子的方法。

为了实现上述目的，本发明提供了一种检测纳米粒子的方法，该方法包括如下步骤：（1）使用鞘液通过流体动力学聚焦将待测的样品液体压缩成样品液流，其中，所述样品液流含有待检测的纳米粒子，且所述纳米粒子在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动；（2）向所述样品液流照射测量光，其中，所述样品液流中的单个纳米粒子接受测量光照射的时间为0.1-10毫秒，优选为0.2-2毫秒；（3）将接受测量光照射的所述样品液流的区域定义为探测区，通过透镜成像系统收集由接受测量光照射的区域发出的光信号，使透镜成像系统所收集的光信号通过视场光阑以滤除探测区外的光信号并富集探测区的光信号；（4）将通过视场光阑富集得到的光信号进行光电信号转换，分别获取所述样品液流中的各个纳米粒子所发出的散射光和/或荧光的电信号；（5）根据所述电信号对所述纳米粒子进行定性和/或定量分析。

通过上述技术方案，本发明能够实现对粒径为40-1000nm的低折射率纳米颗粒（如聚苯乙烯、二氧化硅纳米粒子）和粒径10-150nm纳米金颗粒的检测。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是本发明优选的一种实施方式的光路示意图。

图2是探测区的示意图。

图3是本发明优选的一种实施方式的液流系统示意图。

图4是实施例1中44nm聚苯乙烯纳米球的透射电镜图。

图5是实施例1中10nm纳米金的透射电镜图。

图6是实施例1中样品的检测结果。A-D分别是44nm聚苯乙烯纳米球、40nm二氧化硅纳米球、10nm纳米金颗粒和T7噬菌体样品的检测结果，A1-D1为散射光通道的信号波形图，A2-D2为散射光峰面积的频率分布直方图。

图7是实施例1、2中40nm二氧化硅纳米球和实施例2中50、64、78、90nm二氧化硅纳米球的透射电镜图，并分别统计150个纳米颗粒的粒径得出每种纳米颗粒的平均粒径和粒径分布图。

图8是实施例2中40、50、64、78、90nm二氧化硅纳米球混合样品的检测结果。A为混合样品的散射光峰面积的分布直方图。B为高斯拟合的散射光峰面积的中位值与透射电镜测定的平均粒径的关系图。C为经散射光峰面积-粒径转化后混合样品的粒径分布直方图。

附图标记说明

1  消色差双合透镜    2  样品管        3  物镜

4  二向色滤光片      5  带通滤光片    6  透镜

7  光电探测器        8  边缘滤光片    9  带通滤光片

10 透镜              11 光电探测器    12 激光

13 鞘液              14 样品液流

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种检测的纳米粒子的方法，该方法包括如下步骤：（1）使用鞘液通过流体动力学聚焦将待测的样品液体压缩成样品液流，其中，所述样品液流含有待检测的纳米粒子，且所述纳米粒子在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动；（2）向所述样品液流照射测量光，其中，所述样品液流中的单个纳米粒子接受测量光照射的时间为0.1-10毫秒，优选为0.2-2毫秒；（3）将接受测量光照射的所述样品液流的区域定义为探测区，通过透镜成像系统收集由接受测量光照射的区域发出的光信号，使透镜成像系统所收集的光信号通过视场光阑以滤除探测区外的光信号并富集探测区的光信号；（4）将通过视场光阑富集得到的光信号进行光电信号转换，分别获取所述样品液流中的各个纳米粒子所发出的散射光和/或荧光的电信号；（5）根据所述电信号对所述纳米粒子进行定性和/或定量分析。

其中，所述鞘液可以为流式细胞术中常规使用的各种鞘液，例如为水、生理盐水和磷酸盐缓冲液中的至少一种，优选使用水作为鞘液，更优选用作鞘液的水为去离子水。

其中，所述流体动力学聚焦具有流式细胞术中常规的定义，具体是指所述鞘液包绕着样品液体流动，样品液体在所述鞘液的作用下形成液流，即样品液流。

其中，可以通过流式细胞术领域常规的调节方法，调节所述纳米粒子在所述样品液体中的浓度，使得所述纳米粒子在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动。

其中，将接受测量光照射的所述样品液流的区域定义为探测区。具体地，参照图2，测量光的光束与样品液流重叠的区域即为探测区。其中，所述探测区的体积的测量和计算方法可以为流式细胞仪常规的方法，如文献（Anal.Chem.1987,59,846-850）中描述的测量和计算方法。

具体地，样品液流的半径Rs可以表达为式I：

$\mathrm{Rs}=R{[1-{\left(\frac{Q_{\mathrm{shcath}}}{Q_{\mathrm{samplc}}-Q_{\mathrm{shcath}}}\right)}^{1/2}]}^{1/2}$ 式I

式I中，Q_sheath为鞘液流量，Q_sample为样品液流的流量；R为流通池横截面的等效半径。例如，如果流动池的中心是一个边长为250μm的方形孔道，其相同截面积的等效圆形通道的半径为141μm。而鞘液的流速为2.1cm/sec，样品液流的体积流量控制在5nL/min，这样可以计算得出样品液流的截面的半径大约为1.1μm，即Rs=1.1μm。

当激光光斑的半径ω大于样品流截面半径R时，探测区是一个纵向的近似圆柱体，其体积为2πR²ω。例如，如果激光光束被聚焦成半径为16μm的光斑，即ω=8μm；样品流截面的半径R=1.1μm。激光探测区应该是一个纵向的圆柱体，其体积约为61fL (2πx 1.1²×8μm³)。

根据本发明的方法，其中，探测区的体积可以为1-1000fL，优选为10-100fL，更优选为10-30fL。其中，在优选所述探测区的体积为10-30fL的情况下，能够进一步提高本发明的方法的检测灵敏度和精确度。

根据本发明的方法，其中，所述样品液流的直径为0.1-20μm，优选为0.5-5μm，更优选为1-3μm。其中，在优选所述样品液流的直径为1-3μm的情况下，能够进一步提高本发明的方法的检测灵敏度和精确度。

根据本发明的方法，其中，所述样品液流的流量为0.1-100nL/min，优选为0.5-30nL/min，更优选为1-5nL/min。其中，在优选所述样品液流的流量为1-5nL/min的情况下，能够进一步提高本发明的方法的检测灵敏度和精确度。

根据本发明的方法，其中，所述鞘液的流速可以为0.5-10cm/sec，优选为1-3cm/sec，更优选为1.2-2.5cm/sec。其中，在优选所述鞘液的流速为1.2-2.5cm/sec的情况下，能够进一步提高本发明的方法的检测灵敏度和精确度。

根据本发明的方法，其中，所述测量光的光束直径可以为所述样品液流的直径的1-150倍，优选为2-50倍，更优选为5-20倍。其中，在优选测量光的光束直径可以为所述样品液流的直径的5-20倍的情况下，能够进一步提高本发明的方法的检测灵敏度和精确度。

根据本发明的方法，所述测量光可以为流式细胞术领域常规使用的测量光，本领域技术人员可以选择合适波长的激光作为测量光，例如，对于纳米金颗粒，通常选用波长为530-550nm的激光作为测量光；其中，为了进一步提高测量的信噪比并避免过高激光功率带来的热效应，优选情况下，所述测量光的强度为0.05-1000kW/cm²，进一步优选为5-50kW/cm²。

根据本发明的方法，其中，所述透镜成像系统可以为无限远校正光学系统或有限远校正光学系统。所述无限远校正光学系统可以包括无限远物镜和成像透镜，所述有限远校正光学系统可以包括有限远物镜。其中，所述无限远校正光学系统中的无限远物镜可以通过商购获得，例如购自奥林巴斯的型号为Olympus ULWD MSPlan 50×(0.55N.A.)的物镜；所述无限远校正光学系统中的成像透镜可以通过商购获得，例如购自Thorlabs公司的型号为C240TM-A的透镜，焦距为8mm；所述有限远校正光学成像系统可以通过商购获得，例如购自南京冀飞科技有限公司的型号为LPL 40×/0.65160/1.5的物镜。为了能更方便地在成像光路系统中添加光学元件，优选情况下，所述透镜成像系统为无限远校正光学系统。

其中，无限远物镜或有限远物镜的放大倍数为10-150倍，优选为30-100倍，更优选为50-100倍；所述成像透镜的焦距在1-1000mm，优选为5-250mm，更优选为7.5-200mm。

其中，所述实像可以在任意适合的方向成像，优选情况下，在与测量光方向和样品液流方向基本上垂直的方向上成像。所成的像可以由散射光所成，也可以由散射光和荧光所成。

根据本发明的方法，其中，接受测量光照射的区域可以包括接受测量光照射的所述样品液流的区域，也可以包括接受测量光照射的鞘液的区域。透镜成像系统所收集的光信号可以包括探测区的光信号，也可以包括探测外的光信号。通过视场光阑以滤除探测区外的光信号并富集探测区的光信号的目的是进行光学空间滤波，也相当于通过使用视场光阑限定了光学系统的检测范围，并从而限定了光电信号转换的范围。

其中，视场光阑可以为光电探测器的自身光敏区或光电探测器前添加的孔径光阑。

其中，优选情况下，光敏区面积或孔径光阑的孔径面积为50-5×10⁶μm²，更优选为2×10³-2x10⁵μm²，进一步优选为8×10³-8×10⁴μm²。

根据本发明的方法，其中，光电信号转换可以通过各种光电探测器完成，例如但不限于是通过雪崩光电二极管、光电倍增管、硅光电二极管、电荷耦合元件、互补金属氧化物导体器件来实现的，优选是通过雪崩光电二极管来实现的。

光电倍增管（PMT）具有增益高(增益倍率为10⁶-10⁷)、光敏区面积大、暗电流低等优点，但同时它的量子效率较低。例如Hamamatsu公司的型号为R928的PMT，一般等效输入噪声（ENI）为1.3×10^-16W。

雪崩光电二极管（APD）是一种具有内部放大作用的光电二极管，光敏区面积很小，直径仅为180μm左右。入射光子被吸收后形成载流子的雪崩倍增现象，APD的增益一般在10²-10³。例如购自Perkin Elmer公司的SPCM-AQR-12和SPCM-AQRH-14两种型号的APD。

根据本发明的方法，其中，在获得所述电信号后，根据所述电信号对所述纳米粒子进行定性和/或定量分析的方法可以为常规的方法，例如将空白样品和/或标准样品（包括内标和外标）与待测样品的电信号进行比较。

根据本发明的方法，其中，所述纳米粒子的粒径为1-1000nm，优选为5-200nm，更优选为10-100nm。

根据本发明的方法，其中，所述纳米粒子为人工合成的或天然的纳米粒子，优选所述天然的纳米粒子为原核细胞、细胞器和病毒等生物纳米颗粒中的至少一种。

以下通过实施例进一步详细说明本发明。

以下实施例中，粒径为44nm的聚苯乙烯纳米球购自美国Spherotech公司，其透射电镜图如图4所示。粒径为10nm的纳米金颗粒购自美国nanoComposix公司，其透射电镜图如图5所示。参照文献（Langmuir,2008,24,1714-1720）中的方法合成40、50、60、78、90nm二氧化硅纳米球，其透射电镜结果如图7所示。上述已知粒径的纳米粒子的粒径数值均是按照透射电镜方法测定得到的统计平均值。上述粒径为44nm的聚苯乙烯纳米球和粒径为10nm的纳米金颗粒的浓度数值均是厂家给出的，合成40、50、60、78、90nm二氧化硅纳米球的浓度数值是采用单颗粒计数方法测定得到的数值，具体方法参照文献（J.Am.Chem.Soc.2010,132,12176-12178）。参照文献（Nucleic Acids Res.2006,34,e137）中的方法培养和纯化T7噬菌体（头部直径约为60nm）。将粒径为44nm的聚苯乙烯纳米球、粒径为40、50、60、78、90nm的不同二氧化硅纳米球、粒径为10nm的纳米金颗粒和T7噬菌体用超纯水稀释为浓度均为2×10⁹个/mL的悬液，将这些悬液作为待测的样品液体。

实施例1

参考图1所示的光路系统和图3所示的液流系统，用压力为150kPa的氮气将待测的样品液体（粒径为44nm的聚苯乙烯纳米球的浓度为2×10⁹个/mL的悬液）压入密闭的样品管2，调节氮气的压力，使得样品液体的流量为2nL/min。其中，所述样品管为内径为40μm外径为240μm的石英毛细管，毛细管末端被处理成约12度的锥形喷嘴。所述样品管轴向平行自上而下地插入鞘液室，所述鞘液室为由石英玻璃形成的截面为250μm×250μm且轴向长度为20mm的长方体腔体，所述样品管的末端位于所述鞘液室轴向且距离上端8mm处的位置。所述鞘液室中自上而下流动着流速为2cm/sec的鞘液13。

根据文献（Anal.Chem.1987,59,846-850）中的计算方法（如式I所示），计算得到鞘液流速为2cm/sec且样品液体的流量为2nL/min的情况下，所述样品管的末端以上的样品液流14的截面的半径大约为0.73μm。波长为532nm的激光经Thorlabs公司的型号为AC050-010-A1的消色差双合透镜1，聚焦成束腰直径为16μm的激光光束12，束腰位置的照射强度为7kW/cm²、在激光光束12的束腰位置，该激光光束12的轴与样品液流14的轴相交且垂直，照射在所述样品管的末端以下的150μm处的位置，参见图2，取R为0.73μm，ω为8μm，计算得到探测区（即，接受测量光（即激光光束12）照射的所述样品液流14的区域）的体积为26.8fL，所述样品液流中的单个纳米粒子接受测量光照射的时间为0.8毫秒。

通过无限远校正光学系统收集由接受测量光照射的区域发出的光信号，无限远校正光学系统包括物镜3、透镜6和透镜10，物镜3为奥林巴斯的型号为Olympus ULWD MSPlan 50×(0.55N.A.)的物镜，透镜6和透镜10均为Thorlabs公司的型号为C240TM-A的透镜。其中，无限远校正光学系统的物镜3的轴与所述激光光束12的轴与样品液流14的轴相垂直。在无限远校正光学系统中，物镜3和透镜10共轴，透镜6的轴与物镜3和透镜10的轴垂直并相交，交点位于物镜3和透镜10之间，交点处设置有二向色滤光片4，该二向色滤光片4为美国Semrock公司型号为FF555-Dio2-25×36的二向色滤光片，该二向色滤光片4将经物镜3射出的光信号分成两路，波长小于555nm的光线（该波长范围内的光信号为所检测的粒径为44nm的聚苯乙烯纳米球的散射光）被反射进入透镜6，而波长大于555nm的光线（该波长范围内的光信号为所检测的粒径为44nm的聚苯乙烯纳米球的荧光信号）被透射进入透镜10。带通滤光片5（购自Semrock，型号FF01-524/24-25）设置在透镜6和二向色滤光片4之间，用于滤除波长在512-536nm以外的散射光。边缘滤光片8（购自Semrock，型号LP03-532RS）设置在透镜10和二向色滤光片4之间，用于除去激发光产生的散射背景（即去除波长532nm的光线并透射波长大于532nm的光线），滤光片9（购自Semrock，型号FF01-579/34-25）设置在透镜10和滤光片8之间，用于滤除波长在562-596nm以外的荧光。

被二向色滤光片反射的波长小于555nm的光线经过带通滤光片5和透镜6后被光电探测器7所检测。在所述R为0.73μm，ω为8μm探测区的实像周围还具有鞘液和光窗的杂散光的光信号，选取具有直径为180μm的光敏区的SPCM-AQRH-14型号的APD作为光电探测器7，将该APD的光敏区作为视场光阑，进行物镜3到样品液流14的距离和APD的光敏区的空间位置的光学校准，滤除探测区外的光信号并富集探测区的光信号，光学校准后，该APD的光敏区所接收的光信号即为视场光阑富集得到的光信号，并且；最后使用上述APD的光敏区所接收的光信号进行光电转换。

其中，光学校准的过程中，当APD的输出信号表明纳米颗粒的散射光强度最强且信噪比最好时，认为物镜3到样品液流14的距离和APD的光敏区的空间位置为最优化的位置，即达到了光学校准的目的并完成了光学校准过程。其中，物镜3的焦距和透镜6的焦距决定了探测区经透镜成像系统的放大倍数，探测区的尺寸乘以所述成像系统的放大倍数等于焦平面处的光斑尺寸，即最小光斑尺寸。探测区的光信号经透镜6聚焦，在与透镜6的焦平面平行的平面上，探测区的光斑尺寸随着该平面与透镜6距离的不同而连续变化。通过调节APD的空间位置使得探测区的光斑尺寸与APD的光敏区尺寸匹配，且探测区的光斑中心与APD的光敏区的中心位置重合，使得纳米颗粒的散射光强度最强且信噪比最好。

作为光电探测器7的APD转换得到的电信号相对于时间变化的关系图如图6A1所示，根据信噪比S/N为去除背景信号的散射光峰高与背景信号标准方差的比值，计算得到S/N为48。由图6A1的结果可知粒径44nm的单个聚苯乙烯纳米颗粒的散射光能够以较高的信噪比被检测。

作为光电探测器7的APD转换得到的散射光的峰面积的频率分布直方图如图6A2所示，其中散射光峰是指电信号相对于时间变化的关系图上的峰，根据变异系数CV为散射光峰面积的标准方差与散射光峰面积的平均值的比值，计算得到变异系数CV值为90%。根据Mie散射理论，在粒径远小于激发光波长的情况下，纳米颗粒的散射光与粒径的六次方成正比，因此可以得到粒径分布的变异系数

这与用透射电镜检测方法得到的CV值（9.1%）基本相同，从而说明本发明的方法被证明能够用于检测44nm的聚苯乙烯纳米球的粒径分布，并取得可以信赖的检测结果。

对比例1

采用实施例1的方法进行测量，不同的是，样品管2中样品液体的流量为20nL/min；鞘液13的流速为20cm/sec。即，样品液流14的截面的半径大约为0.73μm，取R为0.73μm，ω为8μm，探测区体积为26.8fL，所述样品液流中的单个纳米粒子接受测量光照射的时间为0.08毫秒。

作为光电探测器7的APD转换得到的电信号相对于时间变化的关系图中，无法从背景噪声中分辨出信号。

对比例2

采用实施例1的方法进行测量，不同的是，选取具有8x24mm光敏区的Hamamatsu公司的型号为R928的PMT作为光电探测器7，并将该PMT的光敏区置于与实施例1中APD的光敏区相同的位置上，该PMT的光敏区面积为1.92x10⁸μm²，无法排除杂散光，即，不进行光学空间滤波。

作为光电探测器7的PMT转换得到的电信号相对于时间变化的关系图中，无法从背景噪声中分辨出信号。

实施例1、对比例1-2的结果表明本发明的方法通过将控制所述样品液流中的单个纳米粒子接受测量光照射的时间为0.1-10毫秒并排除探测区外的光信号，实现了单个纳米颗粒散射光的高灵敏检测。

实施例2

采用实施例1的方法进行测量，不同的是，待测的样品液体为粒径为40nm二氧化硅纳米球的浓度为2×10⁹个/mL的悬液。

作为光电探测器7的APD转换得到的电信号相对于时间变化的关系图如图6B1所示，计算得到信噪比S/N为10。由图6B1的结果可知单个粒径为40nm二氧化硅纳米球的散射光能够明显从背景中分辨出来。

作为光电探测器7的APD转换得到的散射光峰面积的频率分布直方图如图6B2所示，计算得到变异系数CV值为40%，根据Mie散射理论，可以得到粒径分布的变异系数

这与用透射电镜检测方法得到的CV值（4.8%）基本相同，从而说明本发明的方法被证明能够用于检测40nm二氧化硅纳米球的粒径分布，并取得可以信赖的检测结果。

实施例3

采用实施例1的方法进行测量，不同的是，待测的样品液体为粒径为10nm的纳米金颗粒的浓度为2×10⁹个/mL的悬液。

作为光电探测器7的APD转换得到的电信号相对于时间变化的关系图如图6C1所示，计算得到信噪比S/N为10。由图6C1的结果可知单个粒径为10nm的纳米金颗粒的散射光能够明显从背景中分辨出来。

作为光电探测器7的APD转换得到的散射光峰面积的频率分布直方图如图6C2所示，计算得到变异系数CV值为55%，根据Mie散射理论，可以得到粒径分布的变异系数

这与厂家给出的透射电镜检测方法得到的CV值（7.1%）基本相同，从而说明本发明的方法被证明能够用于检测10nm的纳米金颗粒的粒径分布，并取得可以信赖的检测结果。

实施例4

采用实施例1的方法进行测量，不同的是，待测的样品液体为T7噬菌体的浓度为2×10⁹个/mL的悬液。

作为光电探测器7的APD转换得到的电信号相对于时间变化的关系图如图6D1所示，计算得到信噪比S/N为105。由图6D1的结果可知单个T7噬菌体的散射光能够以较高的信噪比得到检测。

作为光电探测器7的APD转换得到的散射光峰面积的频率分布直方图如图6D2所示，计算得到变异系数CV值为12%，根据Mie散射理论，可以得到粒径分布的变异系数

如果天然存在的T7噬菌体的粒径不存在差别，那么本发明的方法对于粒径检测的系统误差为1.9%。

实施例5

将浓度均为2×10⁹个/mL的粒径40、50、60、78、90nm二氧化硅纳米球等体积混合得到二氧化硅纳米球混合样品。采用实施例1的方法进行测量，不同的是，待测的样品液体为上述二氧化硅纳米球混合样品。

作为光电探测器7的APD转换得到的散射光的光子爆发的峰面积的频率分布直方图如图8A所示。可见，散射光的光子爆发的峰的频率明显呈5个峰出现，分别对应于五种不同粒径的二氧化硅纳米球。

将五种不同粒径的二氧化硅纳米球的散射光峰面积的中位值与各自的粒径拟合关系曲线，如图8B所示，曲线方程为y=3.75e-8x^6.15，其中y表示散射光峰面积，x表示粒径，R²值高达0.9997，表明二氧化硅纳米颗粒的粒径与散射光峰面积呈6.15次方关系，与Mie散射理论的6次方很好吻合。

根据方程y=3.75e-8x^6.15将二氧化硅纳米球的散射光的光子爆发的峰面积换算为粒径，粒径的频率分布直方图如图8C所示，结果与透射电镜分别得到五种纳米颗粒的粒径分布结果（图7F）极为相似，表明本发明的方法精确地表征了二氧化硅纳米球混合样品中五种不同粒径的二氧化硅纳米球的粒径分布。

以上结合附图详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。例如，可以将物镜改变为单透镜。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (14)

1.一种检测纳米粒子的方法，该方法包括如下步骤：

（1）使用鞘液通过流体动力学聚焦将待测的样品液体压缩成样品液流，其中，所述样品液流含有待检测的纳米粒子，且所述纳米粒子在所述样品液流中基本上相互隔开并基本上在同一直线上流动；

（2）向所述样品液流照射测量光，其中，所述样品液流中的单个纳米粒子接受测量光照射的时间为0.1-10毫秒，优选为0.2-2毫秒；

（3）将接受测量光照射的所述样品液流的区域定义为探测区，通过透镜成像系统收集由接受测量光照射的区域发出的光信号，使透镜成像系统所收集的光信号通过视场光阑以滤除探测区外的光信号并富集探测区的光信号；

（4）将通过视场光阑富集得到的光信号进行光电信号转换，分别获取所述样品液流中的各个纳米粒子所发出的散射光和/或荧光的电信号；

（5）根据所述电信号对所述纳米粒子进行定性和/或定量分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，探测区的体积为1-1000fL，优选为10-100fL，更优选为10-30fL。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述样品液流的直径为0.1-20μm，优选为0.5-5μm，更优选为1-3μm。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述样品液流的流量为0.1-100nL/min，优选为0.5-30nL/min，更优选为1-5nL/min。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述鞘液的流速为0.5-10cm/sec，优选为1-3cm/sec，更优选为1.2-2.5cm/sec。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述测量光的光束直径为所述样品液流的直径的1-150倍，优选为2-50倍，更优选为5-20倍。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其中，所述测量光的强度为0.05-1000kW/cm²，优选为5-50kW/cm²。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述透镜成像系统为无限远校正光学系统或有限远校正光学系统。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述无限远校正光学系统包括无限远物镜和成像透镜，所述有限远校正光学系统包括有限远物镜。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，视场光阑可以为光电探测器的自身光敏区或光电探测器前添加的孔径光阑。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，光敏区面积或孔径光阑的孔径面积为50-5×10⁶μm²，优选为2×10³-2x10⁵μm²，更优选为8×10³-8x10⁴μm²。

12.根据权利要求1、10或11所述的方法，其中，光电信号转换是通过光电探测器来实现的，例如但不限于雪崩光电二极管、光电倍增管、硅光电二极管、电荷耦合元件或互补金属氧化物导体器件，优选是通过雪崩光电二极管来实现的。

13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述纳米粒子的粒径为1-1000nm，优选为5-200nm，更优选为10-100nm。

14.根据权利要求1或13所述的方法，其中，所述纳米粒子为人工合成的或天然的纳米粒子，优选所述天然的纳米粒子为原核细胞、细胞器和病毒等生物纳米颗粒中的至少一种。

Images