JP2011516029A

JP2011516029A - 高光合成生物

Info

Publication number: JP2011516029A
Application number: JP2010533328A
Authority: JP
Inventors: エリックデブロー; スリラムコスリ; デビッドベリー; ノーバーアフェヤン; フランクスクラリー; ダンロバートソン; ブライアングリーン; クリスチャンリドリー
Original assignee: ジュールアンリミテッドインコーポレイテッド
Priority date: 2007-11-10
Filing date: 2008-11-10
Publication date: 2011-05-26
Also published as: CA2704227A1; AU2008323673B8; EP2327769A1; JP2014087360A; AU2008323673A1; EP2615164A1; AU2008323673B2; JP5905871B2; EP2327769B1; MX2010005061A; US20130273613A1; ES2413482T3; WO2009062190A2; US7785861B2; US20090203070A1; WO2009062190A3; US20110124073A1; EP2217695A2

Abstract

本開示は、操作された生物に、改善された産業適合性を付与する経路および機構を特定する。本発明はまた、改善された産業適合性を有する操作された生物を開示する。光捕獲、二酸化炭素固定、NADH産生、NADPH産生、耐熱性、pH耐性、煙道ガス耐性、耐塩性、栄養分非依存性、および近赤外光吸収をもたらす、人工的な生物工学的モジュールが開示される。開示された、操作された生物は、これらのモジュールの1つまたは複数を含みうる。関心対象の炭素ベース産物、バイオマス、または薬学的薬剤を生成するために、操作された生物を使用する方法も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本願は、2007年11月10日に出願された米国特許仮出願60/987,046号;2008年2月28日に出願された米国特許仮出願61/032,169号;および2008年8月22日に出願された米国特許仮出願61/090,933号からの優先権を主張する。それぞれの開示は、全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられる。

分野
本発明は合成生物学の分野に関し、さらに具体的には、二酸化炭素および光をバイオマスおよび関心対象の炭素ベース産物に効率的に変換するように設計された、産業化された光独立栄養生物に関する。

背景
光合成とは、生物学的実体がエネルギーを得るために太陽光およびCO₂を利用して糖を産生するプロセスである。既存の光独立栄養生物(すなわち、植物、藻類、および光合成細菌)は工業バイオプロセスにあまり適していない。特に、ほとんどの生物の倍加時間(10〜72時間)は、大腸菌（Escherichia coli）などの産業化された従属栄養生物(20分)と比較して長い。さらに、光独立栄養生物は、多くの場合、pH、温度、および耐塩性を含む一般的な環境ストレスにおいて中程度の変化を受けやすい。このような感受性があるために、光独立栄養体を産業に使用するのは効率が悪い。さらに、ますます毒性が強くなってきている環境要因(例えば、重金属、窒素、および硫黄をベースとする工業副産物を含む毒性汚染物質)のために、光独立栄養体の特定の工業用途への適用はさらに限定されることがある。

微生物において潜在的に産生することができる望ましい産物(例えば、操作された大腸菌において産生されるエタノールおよび他の高級分枝アルコール(Atsumi, et al. Nature (2008) vol451:86-90（非特許文献１）)は、光独立栄養体では産生代謝経路が適合しないかもしくは不十分なために、または必要な、細胞に基づく生体触媒が全く存在しないために処理しにくいことが見出されている。

従って、当技術分野において、工業バイオプロセスにより適した、改善された光独立栄養生物が必要とされる。

Atsumi, et al. Nature (2008) vol451:86-90

概要
本発明は、例えば、光捕獲および炭素固定の効率を遺伝的に改善することによって、ならびにフォトバイオリアクター内で増やすための増殖特性を最適化することによって、光合成生物を安定して利用する経路を操作するための方法および組成物を提供する。本発明はまた、結果として生じた、二酸化炭素および光を関心対象の炭素ベース産物を効率的に変換する操作された「高光合成」細胞および生物を提供する。

光捕獲核酸、二酸化炭素固定経路核酸、NADH経路核酸、NADPH経路核酸、耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、栄養分非依存性核酸、および近赤外光吸収核酸からなる群より選択される少なくとも1つの操作された核酸を含み、前記の操作された核酸によってコードされる異種タンパク質を発現するか、前記の操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を過剰発現するか、前記の操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を下方制御するか、または前記の操作された核酸の存在の結果として遺伝子がノックアウトされている、操作された光合成細胞が、本明細書において提供される。

本明細書では、複数の操作された光捕獲核酸、二酸化炭素固定経路核酸、NADH経路核酸、NADPH経路核酸、耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、栄養分非依存性核酸、および近赤外光吸収核酸を含む、操作された細胞も提供される。

本発明はまた、3-ヒドロキシプロピオン酸回路タンパク質、カルビン回路タンパク質、炭素-アセチル-CoAフラックスタンパク質、糖新生経路タンパク質、グリオキシル酸シャント経路タンパク質、ピルビン酸合成経路タンパク質、還元的TCA回路タンパク質、およびウッド-ユングダール(Woods-Ljungdahl)経路タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする操作された炭素固定経路核酸を含む、操作された光合成細胞を提供する。

本発明はまた、NAD⁺依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ-idh1タンパク質;NAD⁺依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ-idh2タンパク質;リンゴ酸デヒドロゲナーゼタンパク質;可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(sthAまたはudhA)タンパク質;膜結合型ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、サブユニットα、pntAタンパク質;膜結合型ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、サブユニットβ、pntBタンパク質;およびNADH:ユビキノン酸化還元酵素(nuo)オペロンタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする操作されたNADH経路核酸を含む、操作された光合成細胞を提供する。

本発明はまた、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ;zwfタンパク質;6-ホスホグルコノラクトナーゼ-pglタンパク質;6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、gndタンパク質;NADP依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼタンパク質;NADP依存性リンゴ酸酵素;可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(sthAまたはudhA)タンパク質;膜結合型ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、サブユニットα、pntAタンパク質;および膜結合型ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、サブユニットβ、pntBタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする操作されたNADPH経路核酸を含む、操作された光合成細胞を提供する。

本発明はまた、ベタイン生合成タンパク質;光化学系安定化タンパク質および修復タンパク質;ならびにタンパク質フォールディングタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする操作された耐熱性核酸を含む、操作された光合成細胞を提供する。

本発明はまた、グルタミン酸デカルボキシラーゼA(GadA)タンパク質;グルタミン酸デカルボキシラーゼβ(GadB)タンパク質;グルタミン酸:γ-アミノ酪酸アンチポーター(GadC)タンパク質;生分解性アルギニンデカルボキシラーゼ(AdiA)タンパク質;アルギニン:アグマチンアンチポーター(AdiC)タンパク質;シャペロンタンパク質dnaK2(DnaK)タンパク質;DNA指向性RNAポリメラーゼ、σサブユニット(sll0306)タンパク質;Zn依存性プロテアーゼ(sll0528)タンパク質;金属依存性ホスホエステラーゼ(sll0549)タンパク質;酸ストレス関連膜タンパク質(sll0939)タンパク質;熱ショック分子シャペロン(sll1514)タンパク質;マンノース-1-リン酸グアニルトランスフェラーゼ(sll1558)タンパク質;RNAポリメラーゼσ因子(sll2012)タンパク質;カルボキシル末端プロセシングプロテアーゼ(slr0008)タンパク質;分子シャペロン(slr0093)タンパク質;ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素(slr0611)タンパク質;CheY様レシーバー(slr1214)タンパク質;シグナル伝達ヒスチジンキナーゼ(slr1285)タンパク質;スーパーオキシドジスムターゼ(slr1516)タンパク質;ヒドロゲナーゼ発現/形成タンパク質(slr1675)タンパク質;エステラーゼ(slr1916)タンパク質;ヒドロゲナーゼ成分タンパク質(ssl3044)タンパク質;塩素イオンチャネルタンパク質;および酸ストレス耐性タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする操作されたpH耐性核酸を含む、操作された光合成細胞を提供する。

さらに、本発明は、NO_x耐性タンパク質、SO_x耐性タンパク質、水銀耐性タンパク質、金属耐性タンパク質、および粒子エアロゾル耐性タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする操作された煙道ガス耐性核酸を含む、操作された光合成細胞をさらに提供する。

さらに別の態様において、本発明は、Na⁺/H⁺アンチポータータンパク質(apnhaP)、カタラーゼタンパク質(katG)、塩およびカドミウムストレス関連タンパク質(CW80Cd404)、breast basic conserved(bbc1)タンパク質、およびベタイン生合成タンパク質を含む群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする操作された耐塩性核酸を含む、操作された光合成細胞を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、クロロフィルd生合成核酸を含む操作された近赤外光吸収核酸を含む、操作された光合成細胞を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、アンモニア同化タンパク質、硝酸/亜硝酸同化タンパク質、硝酸/亜硝酸同化-亜硝酸耐性タンパク質、窒素固定タンパク質、尿素同化タンパク質、ビタミンB₁₂生合成タンパク質、ビタミンB₁₂生合成-Co²⁺輸送タンパク質、およびビタミンB₁₂非依存性タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする操作された栄養分非依存性核酸を含む、操作された光合成細胞を提供する。ある特定の関連する態様において、ビタミンB₁₂生合成タンパク質は、ウロポルフィリン-III C-メチルトランスフェラーゼコバルトキラターゼ(cysG)タンパク質;シロヒドロクロリンコバルトキラターゼ(cbiK)タンパク質;プレコリン-2 C20-メチルトランスフェラーゼ(cbiL)タンパク質;プレコリン-3Bメチラーゼ(cbiH)タンパク質;二機能CbiG/プレコリンメチルトランスフェラーゼ(cbiG)タンパク質;プレコリン-4 C11-メチルトランスフェラーゼ(cbiF)タンパク質;コバラミン生合成タンパク質(cbiD);NADPH依存性プレコリン-6A還元酵素(cbiJ)タンパク質;プレコリン-6B C5,15-メチルトランスフェラーゼ(cbiE)タンパク質;プレコリン-6B C12デカルボキシラーゼ(cbiT)タンパク質;プレコリン-8X-メチルムターゼ (cbiC)タンパク質;コビリニン酸A,C-ジアミド合成酵素(cbiA)タンパク質;コビリニン酸(I)a,c-ジアミドアデノシルトランスフェラーゼ(btuR)タンパク質;コビリニン酸合成酵素(cbiP)タンパク質;コビリン酸デカルボキシラーゼ(cobD)タンパク質;アデノシルコビナミドリン酸合成酵素(cbiB)タンパク質;αリバゾール-5'-Pホスファターゼ(cobC)タンパク質;コバラミン(5'リン酸)合成酵素(cobS)タンパク質;コビナミドリン酸グアニリルトランスフェラーゼ(cobU)タンパク質;およびニコチン酸-ヌクレオチドジメチルベンズイミダゾール-Pホスホリボシルトランスフェラーゼ(cobT)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む。さらに別の関連する態様において、ビタミンB₁₂生合成-Co²⁺輸送タンパク質は、ABC型Co²⁺輸送系、パーミアーゼ成分タンパク質;ABC型コバルト輸送系、ペリプラズム成分タンパク質;およびABC型コバルト輸送系、パーミアーゼ成分タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む。他の関連する態様において、ビタミンB₁₂非依存性タンパク質は、5-メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸-ホモシステインメチルトランスフェラーゼ(metE)タンパク質;リボヌクレオシド-二リン酸還元酵素、αサブユニット(nrdA)タンパク質;およびリボヌクレオシド-二リン酸還元酵素、βサブユニット(nrdB)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む。関連する態様において、metEタンパク質は、大腸菌K12(アクセッション番号NP_418273.1)に由来するか、サーモシネココッカス・エロンガタス(Thermosynechococcus elongatus)BP-1(アクセッション番号NP_681881)に由来する。

本発明の様々な態様において、操作された核酸は、操作された細胞によって発現される異種タンパク質をコードするか、操作された細胞内で内因性タンパク質の過剰発現を引き起こすか、操作された細胞内で内因性タンパク質のダウンレギュレーションを引き起こすか、または操作された細胞内で遺伝子ノックアウトを引き起こす。

本発明の別の局面において、操作された細胞は、バイオマス、関心対象の炭素ベース産物、または薬学的薬剤を産生するのに用いられる。

さらに他の態様では、本発明は、耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、栄養分非依存性核酸、および近赤外光吸収核酸からなる群より選択される少なくとも1つの操作された核酸を含み、前記の操作された核酸によってコードされる異種タンパク質を発現するか、前記の操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を過剰発現するか、前記の操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を下方制御するか、前記の操作された核酸の存在の結果として遺伝子がノックアウトされている、操作された炭素固定細胞を提供する。

本発明のある特定の態様において、操作された細胞は、独立栄養細胞である。ある特定の他の態様において、操作された細胞は、光独立栄養細胞である。本発明の様々な態様において、操作された細胞は、植物、原核生物、真核生物、酵母、糸状菌、原生動物、藻類および合成細胞からなる群より選択される。

関心対象の炭素ベース産物を産生する方法も開示される。前記方法は、a)光捕獲核酸、二酸化炭素固定経路核酸、NADH経路核酸、NADPH経路核酸、耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、栄養分非依存性核酸、および近赤外光吸収核酸からなる群より選択される少なくとも1つの操作された核酸を発現するように、細胞を操作する工程であって;b)前記細胞が、前記の操作された核酸によってコードされる異種タンパク質を発現する工程、前記の操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を過剰発現する工程、前記の操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を下方制御する工程、または前記の操作された核酸の存在の結果として遺伝子がノックアウトされる工程;ならびにc)CO₂および光の存在下で前記細胞を培養して、関心対象の炭素ベース産物を産生する工程を含む。

本発明の様々なモジュールの操作に関連して発現または上方制御することができる遺伝子を特定する表1を提供する。本発明の様々なモジュールの操作に関連して下方制御またはノックアウトすることができる遺伝子を特定する表2を提供する。 B12を含まないA⁺培地アガロースプレート上での、野生型および遺伝子操作されたシネココッカス属(Synechococcus)の種PCC7002の生存を示す。クロロフィルa(Chl a)からのクロロフィルd(Chl d)誘導の合成スキームを提供する。簡単にするために、Chl前駆体であるクロロフィリドを図に示した。エポキシドヒドロラーゼ検索のクエリー配列を提供する。 A.マリナゲノムのオキシゲナーゼをコードする遺伝子として同定された遺伝子を列挙する表3を提供する。 A.マリナゲノムのオキシゲナーゼをコードする遺伝子として同定された遺伝子を列挙する表3を提供する。 A.マリナゲノムのオキシゲナーゼをコードする遺伝子として同定された遺伝子を列挙する表3を提供する。 A.マリナゲノムのエポキシド還元酵素をコードする遺伝子として同定された遺伝子を列挙する表4を提供する。 A.マリナゲノムのSAM利用オキシゲナーゼをコードする遺伝子として同定された遺伝子を列挙する表5を提供する。 A.マリナゲノムの光化学系タンパク質をコードする遺伝子として同定された遺伝子を列挙する表6を提供する。図10は、トランスジェニックシネココッカス属の種PCC7002株:JCC1-UdhA(レーン2および3);JCC1-ZWF(レーン4);ならびにJCC1-SAR86(レーン5)のPCR確認を示したアガロースゲルの写真である。図10Bは、JCC136からのPCR産物を示したアガロースゲルの写真である。シネココッカス属の種PCC7002株JCC136およびJCC136-FbpIにおける、時間の関数としてのエタノール産生(左)およびエタノール:OD比(右)のグラフを示す。

配列表
添付の配列表に列挙したアミノ酸配列は、37C.F.R.1.822において定義されたアミノ酸残基の標準的な文字略語を用いて示した。添付のアミノ酸配列表。

略語および用語
用語および方法の以下の説明は、本発明の開示をより詳しく説明するために、かつ本開示の実施において当業者を案内するために提供される。本明細書で使用する「含む(comprising)」は「含む(including)」を意味し、単数形「1つの(a)」もしくは「1つの(an)」または「その(the)」は、特に文脈によってはっきり規定されていない限り複数の指示物を含む。例えば、「細胞を含む(comprising a cell)」についての言及は、1つまたは複数のこのような細胞を含み、「チオエステラーゼを含む(comprising a thioesterase)」についての言及は、1つのまたは複数のチオエステラーゼペプチドおよび当業者に公知のその均等物についての言及を含む。「または(or)」という用語は、特に文脈によってはっきり規定されていない限り、述べられた複数の代替要素の中の1つの要素、または2つもしくはそれ以上の要素の組み合わせを指す。

特に説明のない限り、本明細書において使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法および材料に類似するまたは均等な任意の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を下記で説明する。材料、方法、および実施例は単なる例示であり、限定を目的としない。本開示の他の特徴は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。

アクセッション番号:本説明全体を通じてアクセッション番号は、以下のデータベース:NCBI (National Center for Biotechnology Information)、TIGR (The Institute for Genomic Research)、およびKEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)において見出されるものに対応する。アクセッション番号は、2007年11月10日にデータベースに提供されたものである。

酵素分類番号(EC):本説明全体を通じて提供されるEC番号は、京都大学が一部出資している、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomeicsが管理している、KEGGリガンドデータベースから得たものである。EC番号は、2007年11月10日にデータベースに提供されたものである。

DNA:デオキシリボ核酸。DNAは、ほとんどの生物の遺伝物質を含む長鎖ポリマーである(一部のウイルスは、リボ核酸、RNAを含む遺伝子を有する)。DNAポリマー中の反復単位は4種類のヌクレオチドであり、これらはそれぞれ、リン酸基が付着しているデオキシリボース糖に結合した、4種類の塩基アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンのうちの1つを含む。

コドン:DNA分子中のヌクレオチドトリプレットはコドンと呼ばれ、ペプチドのアミノ酸をコードする。コドンという用語は、DNA配列が転写されたmRNA中の、3つのヌクレオチドからなる対応する(および相補する)配列についても用いられる。

内因性:核酸分子および特定の細胞または微生物に関して本明細書で使用する場合、細胞内にあり、組換え操作法を用いて細胞に導入されていない、核酸配列またはペプチドを指す。例えば、細胞が自然から最初に単離された時に細胞に存在する遺伝子は、内因性であるとみなされる。制御配列、例えば、転写または翻訳を活性化するプロモーター配列またはエンハンサー配列が組換え法によって変えられていても、遺伝子は依然として内因性であるとみなされる。

外因性:核酸分子および特定の細胞または微生物に関して本明細書で使用する場合、細胞が自然から最初に単離された時に細胞に存在しない核酸配列またはペプチドを指す。例えば、異なる微生物に由来し、組換えDNA法または他の核酸送達法を用いて別の細胞に入るように操作された核酸は、外因性であるとみなされる。

発現:遺伝子がコードしている情報が、細胞の構造および機能を支持する分子、例えば、タンパク質、トランスファーRNA、またはリボソームRNAに変換されるプロセス。発現された遺伝子には、mRNAに転写され、次いで、タンパク質に翻訳された遺伝子、およびRNAに転写されるが、タンパク質に翻訳されない遺伝子(例えば、トランスファーRNAおよびリボソームRNA)が含まれる。

過剰発現:過剰発現は、遺伝子が、その遺伝子の内因性転写速度と比較して速い速度で転写される任意の状態を指す。一部の例では、過剰発現は、その遺伝子の内因性翻訳速度と比較して速い遺伝子翻訳速度をさらに含む。過剰発現を試験する方法は当技術分野において周知である。例えば、転写RNAレベルは、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を用いて評価することができ、タンパク質レベルは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)分析を用いて評価することができる。さらに、遺伝子は、内因活性と比較して高い活性を示す時に過剰発現しているとみなされ、これは、例えば、遺伝子のインヒビターの濃度もしくは活性の減少によって、または高活性を有する変異体バージョンの発現によって起こり得る。好ましい態様において、宿主細胞が、望ましい生化学的活性を有する内因性遺伝子をコードする場合、外因性遺伝子を過剰発現させることが有用であり、これにより、バイオプロセスにおいてより明確な調節制御、および天然遺伝子に明確に焦点を合わせた、中心代謝調節の影響を潜在的に緩和する手段が可能になる。

ダウンレギュレーション:ダウンレギュレーションは、遺伝子が、その遺伝子の内因性転写速度と比較して遅い速度で転写される任意の状態を指す。ある特定の態様において、遺伝子発現は、核酸、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖RNA、低分子干渉RNA、低分子ヘアピン型RNA、ミクロRNA、リボザイムなどの発現によって下方制御される。一部の例では、ダウンレギュレーションは、その遺伝子の内因性翻訳速度と比較して遅い遺伝子翻訳レベルをさらに含む。さらに、遺伝子は、内因性活性と比較して低い活性を示す時に下方制御されているとみなされ、これは、例えば、遺伝子のインヒビターの濃度もしくは活性の増加によって、または低活性を有する変異体バージョンの発現によって起こり得る。ダウンレギュレーションを試験する方法は当業者に周知であり、例えば、転写RNAレベルはRT-PCRを用いて評価することができ、タンパク質レベルはSDS-PAGE分析を用いて評価することができる。

ノックアウト:発現レベルまたは活性レベルが0まで減少している遺伝子。一部の例では、遺伝子は、そのコード配列の一部または全てを欠失または置換することによってノックアウトされる。他の例では、遺伝子は、1つまたは複数のヌクレオチドをそのオープンリーディングフレームに導入するか、1つまたは複数のヌクレオチドを除去して、ナンセンスタンパク質産物または他の方法で機能しないタンパク質産物が翻訳されることによってノックアウトされる。

独立栄養体:独立栄養体(または独立栄養生物)は、単純な無機分子および外部エネルギー源、例えば、光(光独立栄養体)または無機化合物の化学反応から複雑な有機化合物を産生する生物である。

従属栄養体:従属栄養体(または従属栄養生物)は独立栄養体と異なり、光または無機化学反応から直接エネルギーを得ることができず、そのため有機炭素基質を食べなければならない生物である。従属栄養体は、摂取した有機分子を分解することによって化学エネルギーを得る。従属栄養体には、動物、菌類、および非常に多くのタイプの細菌が含まれる。

高光合成:組換えDNA法によって、工業バイオプロセスに関連する1つまたは複数の機能改善、ならびに二酸化炭素および光から、減少した炭素産物または細胞量への変換をもたらす内因性核酸および/または外因性核酸を発現するように特異的に操作されている、光合成タンパク質を発現する細胞または生物。高光合成細胞はまた、1つまたは複数の機能改善を実現するように進化または変異誘発されている、前記のように操作された細胞または生物を含む。

炭化水素:概して、元素炭素(C)、任意に、酸素(O)および水素(H)からなる化合物を指す。

生合成経路:「代謝経路」とも呼ばれ、ある化学種を別の化学種に変換(変形)するための一組の同化または異化の生化学的反応を指す。例えば、炭化水素生合成経路は、投入物および/または代謝産物を炭化水素産物様中間体に変換し、次いで、炭化水素または炭化水素産物に変換する一組の生化学的反応を指す。同化経路は小さな分子から大きな分子の構築を伴い、エネルギーを必要とするプロセスである。異化経路は大きな分子の分解を伴い、多くの場合、エネルギーを放出する。

セルロース:セルロース[(C₆H₁₀O₅)_n]は、β-グルコースからなる長鎖ポリマー多糖炭水化物である。セルロースは植物の主な構造成分であり、ヒトは消化することができない。セルロースは植物細胞壁内のありふれた材料であり、1838年にこのようなものとして最初に述べられた。ほぼ純粋な形をしたセルロースは天然では綿繊維でしか見られない。セルロースはリグニンおよび任意のヘミセルロースと組み合わせて、全ての植物材料において見出される。

界面活性剤:界面活性剤は、界面活性剤が溶解している液体の表面張力を小さくすることができる物質である。界面活性剤は、典型的には、水溶性の頭部と炭化水素の鎖および尾部からなる。水溶性基は親水性であり、イオン性または非イオン性のいずれでもよく、炭化水素鎖は疎水性である。

バイオ燃料:バイオ燃料は、生物学的供給源に由来する任意の燃料である。

操作された核酸:「操作された核酸」は、天然の核酸分子と少なくとも1つの相違点を含む核酸分子である。操作された核酸には、改変された、または改変されていない全ての外因性異種配列(すなわち、操作された核酸を有する生物または細胞以外の生物または細胞から得られた配列)、ならびに天然配列と比較して改変されている、変異しているか、欠失または挿入を含む、内因性遺伝子、オペロン、コード配列、または非コード配列が含まれる。操作された核酸は、起源に関係なく、天然には関連しない誘導性プロモーターまたは別の制御配列に連結した全ての配列も含む。操作された核酸は、内因性遺伝子の発現を下方制御またはノックアウトするのに使用することができる全ての配列をさらに含む。これらには、アンチセンス分子、RNAi分子、相同組換えを生じる構築物、cre-lox構築物などが含まれる。

光捕獲核酸:「光捕獲核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、光エネルギー(すなわち、光子)を、化学エネルギー、例えば、プロトン勾配、還元力、または少なくとも1つの高エネルギーリン酸結合を含有する分子、例えば、ATPもしくはGTPに変換する1つもしくは複数のタンパク質をコードする核酸を指す。例示的な光捕獲核酸には、光活性化プロトンポンプ、例えば、ロドプシン、キサントロドプシン、プロテオロドプシン、およびバクテリオロドプシンをコードする核酸、ならびに集光性捕獲効率を直接調節するタンパク質(集光性複合体、LHCIおよびLHCII)または間接的に調節するタンパク質(切断型集光性アンテナ、tla1)をコードする核酸が含まれる。光捕獲核酸には、発現すると光捕獲が低下する1つまたは複数の内因性遺伝子の発現を減らす、またはノックアウトするのに用いられる核酸がさらに含まれる。

二酸化炭素固定経路核酸:「二酸化炭素固定経路核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、独立栄養炭素固定を可能にするタンパク質をコードする核酸を指す。二酸化炭素固定経路核酸にはまた、炭素フラックスを、効率的な増殖または炭素ベース産物形成に必要とされる重要な細胞中間体、例えば、アセチル-CoAに向ける核酸も含まれる。例示的な二酸化炭素固定経路核酸には、プロピオニル-CoAカルボキシラーゼ、ピルビン酸合成酵素、葉酸デヒドロゲナーゼ、およびリブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RubisCo)をコードする核酸が含まれる。二酸化炭素固定経路核酸には、発現すると二酸化炭素固定が低下する1つまたは複数の内因性遺伝子の発現を減らす、またはノックアウトするのに用いられる核酸がさらに含まれる。

NADH経路核酸:「NADH経路核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、炭素固定を行うための還元型NADの適切にバランスのとれた供給を維持するタンパク質をコードする核酸を指す。例示的なNADH経路核酸には、NAD⁺依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼおよびリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする核酸が含まれる。NADH経路核酸には、発現すると、炭素固定および他の必要な生物学的プロセスを行うための還元型NADの適切にバランスのとれた供給の維持が損なわれる、1つまたは複数の内因性遺伝子の発現を減らす、またはノックアウトするのに用いられる核酸がさらに含まれる。

NADPH経路核酸:「NADPH経路核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、炭素固定を行うための還元型NADPHの適切にバランスのとれた供給を維持するタンパク質をコードする核酸を指す。例示的なNADPH経路核酸には、ホスホグルコノラクトナーゼおよび可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードする核酸が含まれる。NADPH経路核酸には、発現すると、炭素固定および他の必要な生物学的プロセスを行うための還元型NADPの適切にバランスのとれた供給の維持が損なわれる、1つまたは複数の内因性遺伝子の発現を減らす、またはノックアウトするのに用いられる核酸がさらに含まれる。

耐熱性核酸:「耐熱性核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、過剰発現、ダウンレギュレーション、または阻害されると耐熱性が高まるタンパク質をコードする核酸を指す。例示的な耐熱性核酸には、ClpC/Hsp100、groESL1、HspA、およびPsbUをコードする核酸が含まれる。耐熱性核酸には、発現すると耐熱性が損なわれる1つまたは複数の内因性遺伝子の発現を減らす、またはノックアウトするのに用いられる核酸がさらに含まれる。

pH耐性核酸:「pH耐性核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、過剰発現、ダウンレギュレーション、または阻害されると、高pHまたは低pHでの増殖が可能になるタンパク質をコードする核酸を指す。例示的なpH耐性核酸には、グルタミン酸デカルボキシラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼをコードする核酸が含まれる。pH耐性核酸には、発現するとpH耐性が損なわれる1つまたは複数の内因性遺伝子の発現を減らす、またはノックアウトするのに用いられる核酸がさらに含まれる。

煙道ガス耐性:「煙道ガス耐性核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、過剰発現、ダウンレギュレーション、または阻害されると、二酸化炭素、SO_x、NO_x、およびN₂を含む煙道ガス成分の存在下での増殖が可能になるタンパク質をコードする核酸を指す。例示的な煙道ガス耐性核酸には、スーパーオキシドジスムターゼ、カタラーゼ、システイン合成酵素、およびNirKをコードする核酸が含まれる。煙道ガス耐性核酸には、発現すると煙道ガス耐性が損なわれる1つまたは複数の内因性遺伝子の発現を減らす、またはノックアウトするのに用いられる核酸がさらに含まれる。

栄養分非依存性核酸:「栄養分非依存性核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、過剰発現、ダウンレギュレーション、または阻害されると、外因性栄養分の非存在下で、または低濃度の外因性栄養分の下での繁殖を可能にするタンパク質をコードする核酸を指す。例示的な栄養分非依存性核酸には、MetEおよびNrdBをコードする核酸が含まれる。栄養分非依存性遺伝子には、発現すると、外因性栄養分の非存在下で、または低濃度の外因性栄養分の下での繁殖が損なわれる1つまたは複数の内因性遺伝子の発現を減らす、またはノックアウトするのに用いられる核酸がさらに含まれる。

耐塩性核酸:「耐塩性核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、過剰発現、ダウンレギュレーション、または阻害されると高塩分の条件下で、例えば、海水中での繁殖が可能になるタンパク質をコードする核酸を指す。例示的な耐塩性核酸には、Na+/H+アンチポーターをコードする核酸およびbreast basic conservedが含まれる。

アセチル-CoAフラックス核酸:「アセチル-CoAフラックス核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、過剰発現、ダウンレギュレーション、または阻害されると単位時間に産生されるアセチル-CoAが増加するタンパク質をコードする核酸を指す。過剰発現され得る例示的な核酸には、パントテン酸キナーゼおよびピルビン酸デヒドロゲナーゼが含まれる。下方制御、阻害、またはノックアウトされ得る核酸には、アシルコエンザイムAデヒドロゲナーゼ、生合成グリセロール3-リン酸デヒドロゲナーゼ、および乳酸デヒドロゲナーゼが含まれる。

クロロフィルd核酸:「クロロフィルd核酸」は、単独でまたは別の核酸と組み合わせて、過剰発現、ダウンレギュレーション、または阻害されると、クロロフィルdが生合成され、反応中心である光化学系(PS)IおよびPSIIに組み込まれるタンパク質をコードする核酸を指す。クロロフィルd核酸は、例えば、環境の可視光線強度が弱いが、他の光合成生物が強く吸収しない近赤外線強度が強く、その結果、光捕獲のためにクロロフィルdを使用する生物が良く育つように、光合成に利用可能な放射線が、クロロフィルaおよび/またはクロロフィルbを用いて光を吸収する生物によって完全に用いられる可能性が高い条件下での、繁殖を可能にする。または、クロロフィルd核酸は、光捕獲のためにクロロフィルdを使用する生物が繁殖できるように、照明に用いられる人工光の波長が選択された条件下での繁殖を可能にする。

配列同一性:2つまたはそれ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の状況での「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、BLASTもしくはBLAST2.0配列比較アルゴリズムと下記のデフォルトパラメータを用いて、または手作業によるアラインメントおよび目視検査によって測定された時に、同じであるか、または特定のパーセントの同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチド(すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって最大限一致するように比較およびアラインメントされた時に、指定された領域にわたって約60％の同一性、好ましくは65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の同一性)を有する、2つまたはそれ以上の配列または部分配列を指す(例えば、NCBIウェブサイトなどを参照されたい)。次いで、このような配列は「実質的に同一」と言われる。この定義はまた、試験配列を編集したものも指すか、これに適用されてもよい。この定義はまた、欠失および/または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列も含む。下記のように、好ましいアルゴリズムはギャップなどを明らかにすることができる。好ましくは、同一性は、長さが少なくとも約25アミノ酸またはヌクレオチドの領域にわって、より好ましくは、長さが50〜100アミノ酸またはヌクレオチドの領域にわって存在する。

配列比較の場合、典型的には、ある配列が参照配列として働き、参照配列と試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列はコンピュータに入力され、必要に応じて、部分配列の座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。好ましくは、デフォルトプログラムパラメータを使用してもよく、別のパラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて参照配列と比較して試験配列のパーセント配列同一性を計算する。

比較ウィンドウ:本明細書で使用する「比較ウィンドウ」は、20〜600、通常には約50〜約200、より通常には約100〜約150からなる群より選択される連続した位置の数のいずれか1つのセグメントについての言及を含む。このセグメントにおいて、ある配列と、同じ数の連続した位置の参照配列が最適にアラインメントされた後に、2つの配列を比較することができる。比較のための配列のアラインメント方法は当技術分野において周知である。比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Smith & Waterman Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性手法のための検索、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.の中のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)、または手作業によるアラインメントもしくは目視検査によって行うことができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al., eds. 1995 補遺)を参照されたい)。

パーセント配列同一性および配列類似性を求めるのに適したアルゴリズムの好ましい例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)、およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている。本発明の核酸およびタンパク質に対するパーセント配列同一性を求めるために、BLASTおよびBLAST 2.0が本明細書に記載のパラメータと共に用いられる。BLAST解析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationのウェブサイトを通じて公的に入手することができる。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントした時に正の値の閾値スコアTにマッチまたは適合する、クエリー配列中の長さWの短いワードを特定することによって、高スコア配列対(high scoring sequence pair)(HSP)を特定することを伴う。Tは、隣接ワードスコア閾値(neighborhood word score threshold)(Altschul et.al.,前出)と呼ばれる。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むさらに長いHSPを発見する検索を開始するための種配列(seed)として働く。次いで、このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加する限り、それぞれの配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータM(一対のマッチ残基のリワードスコア(reward score);常に、>0)およびN(ミスマッチ残基のペナルティースコア(penalty score);常に、<0)を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、累積スコアを計算するためにスコアリング行列が用いられる。累積アラインメントスコアが、その達成される最大値から量Xだけ減少した時に;1つもしくは複数の負のスコアの残基アラインメントの蓄積のために累積スコアが0もしくはそれ以下になった時に;またはいずれかの配列の末端に到達した時に、各方向でのワードヒットの延長は止まる。BLASTアルゴリズムパラメータW、T、およびXはアラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列の場合)は、デフォルトとして、11のワード長(W)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、BLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長、10の期待値(E)、およびBLOSUM62スコアリング行列(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)を参照のこと) 50のアラインメント (B)、10の期待値(E)、M=5、N=-4、および両鎖の比較を使用する。

発明の詳細な説明
生物
本発明は、光独立栄養生物を高光合成生物に変換することを可能にする。光独立栄養生物には、真核生物の植物および藻類、ならびに原核生物のラン藻類、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、および紅色非硫黄細菌が含まれる。

植物には、以下の属:アラビドプシス属(Arabidopsis)、ベータ属(Beta)、グリシン属(Glycine)、ジャトロファ属(Jatropha)、ミスカンサス属(Miscanthus)、パニクム属(Panicum)、パラリス属(Phalaris)、ポプルス属(Populus)、サッカルム属(Saccharum)、サリクス・シモンドシア(Salix Simmondsia)、およびゼア属(Zea)が含まれるが、これに限定されない。

藻類およびラン藻類には、以下の属:アカントセラス属(Acanthoceras)、アカントコッカス属(Acanthococcus)、アカリオクロリス属(Acaryochloris)、アクナンテス属(Achnanthes)、アクナンチジウム属(Achnanthidium)、アクチナストラウム属(Actinastrum)、アクチノクロリス属(Actinochloris)、アクチノシラス属(Actinocyclus)、アクチノタエニウム属(Actinotaenium)、アンフィクリシス属(Amphichrysis)、アンフィジニウム属(Amphidinium)、アンフィクリコス属(Amphikrikos)、アンフィプレウラ属(Amphipleura)、アンフィプロラ属(Amphiprora)、アンフィスリクス属(Amphithrix)、アンホラ属(Amphora)、アナベナ属(Anabaena)、アナベノプシス属(Anabaenopsis)、アネウマスタス属(Aneumastus)、アンキストロデスマス属(Ankistrodesmus)、アンキラ属(Ankyra)、アノモエオネイス属(Anomoeoneis)、アパトコッカス属(Apatococcus)、アファニゾメノン属(Aphanizomenon)、アファノカプサ属(Aphanocapsa)、アファノカエテ属(Aphanochaete)、スイゼンジノリ属(Aphanothece)、アピオシスティス属(Apiocystis)、アピストネマ属(Apistonema)、アルトロデスマス属(Arthrodesmus)、アルテロスピラ属(Artherospira)、アスコクロリス属(Ascochloris)、ホシガタケイソウ属(Asterionella)、アステロコッカス属(Asterococcus)、アウドウイネラ属(Audouinella)、アウラコセイラ属(Aulacoseira)、イカダケイソウ属(Bacillaria)、バルビアニア属(Balbiania)、バムブシナ属(Bambusina)、ウシケノリ属(Bangia)、バシクラミス属(Basichlamys)、カワモヅク属(Batrachospermum)、ビヌクレアリア属(Binuclearia)、ビトリキア属(Bitrichia)、ヒメアオノリ属(Blidingia)、ボトルジオプシス属(Botrdiopsis)、フウセンモ属(Botrydium)、ボトリオコッカス属(Botryococcus)、ボトリオスファエレラ属(Botryosphaerella)、ブラキオモナス属(Brachiomonas)、ブラキシラ属(Brachysira)、ブラキトリキア属(Brachytrichia)、ブレビソニア属(Brebissonia)、ブルボカエテ属(Bulbochaete)、ブミレリア属(Bumilleria)、ブミレリオプシス属(Bumilleriopsis)、カロネイス属(Caloneis)、カロトリクス属(Calothrix)、カムピロジスカス属(Campylodiscus)、カプサアオノリ属(Capsosiphon)、カルテリア属(Carteria)、カテナ属(Catena)、カビヌラ属(Cavinula)、セントリトラクタス属(Centritractus)、セントロネラ属(Centronella)、セラチウム属(Ceratium)、ツノケイソウ属(Chaetoceros)、カエトクロリス属(Chaetochloris)、ジュズモ属(Chaetomorpha)、カエトネラ属(Chaetonella)、カエトネマ属(Chaetonema)、カエトペルティス属(Chaetopeltis)、カエトフォラ属(Chaetophora)、カエトスファエリジウム属(Chaetosphaeridium)、カマエシフォン属(Chamaesiphon)、シャジクモ属(Chara)、カラシオクロリス属(Characiochloris)、カラシオプシス属(Characiopsis)、カラシウム属(Characium)、カラレス属(Charales)、シロモナス属(Chilomonas)、クライノモナス属(Chlainomonas)、クラミドブレファリス属(Chlamydoblepharis)、クラミドカプサ属(Chlamydocapsa)、クラミドモナス属(Chlamydomonas)、クラミドモノプシス属(Chlamydomonopsis)、クラミドミキサ属(Chlamydomyxa)、クラミドネフリス属(Chlamydonephris)、クロラギエラ属(Chlorangiella)、クロランギオプシス属(Chlorangiopsis)、クロレラ属(Chlorella)、クロロボトリス属(Chlorobotrys)、クロロブラキス属(Chlorobrachis)、クロロキトリウム属(Chlorochytrium)、クロロコックム属(Chlorococcum)、クロログロエア属(Chlorogloea)、クロロゴニウム属(Chlorogonium)、クロロロビオン属(Chlorolobion)、クロロモナス属(Chloromonas)、クロロフィセマ属(Chlorophysema)、クロロフィタ属(Chlorophyta)、クロロサッカス属(Chlorosaccus)、クロロサルキナ属(Chlorosarcina)、コリシスティス属(Choricystis)、クロモフィトン属(Chromophyton)、ヒカリモ属(Chromulina)、クロオコシジオプシス属(Chroococcidiopsis)、クロオコックス属(Chroococcus)、タマツナギ属(Chroodactylon)、クロオモナス属(Chroomonas)、クロオテセ属(Chroothece)、クリソアメーバ属(Chrysamoeba)、クリサプシス属(Chrysapsis)、クリシジアストラム属(Chrysidiastrum)、クリソカプサ属(Chrysocapsa)、クリソカプセラ属(Chrysocapsella)、クリソカエテ属(Chrysochaete)、クロソクロムリナ属(Chrysochromulina)、クリソコッカス属(Chrysococcus)、クリソクリナス属(Chrysocrinus)、クリソレピドモナス属(Chrysolepidomonas)、クリソリコス属(Chrysolykos)、クリソネブラ属(Chrysonebula)、クリソフィタ属(Chrysophyta)、クリソピキス属(Chrysopyxis)、クリソサッカス属(Chrysosaccus)、クロソファエレラ属(Chrysophaerella)、クリソステファノスファエラ属(Chrysostephanosphaera)、クロドホラ属(Clodophora)、クラスチジウム属(Clastidium)、クロステリオプシス属(Closteriopsis)、ミカヅキモ属(Closterium)、コッコミキサ属(Coccomyxa)、コメツブケイソウ属(Cocconeis)、コエラステラ属(Coelastrella)、コエラストラム属(Coelastrum)、コエロスファエリウム属(Coelosphaerium)、コエノクロリス属(Coenochloris)、コエノコッカス属(Coenococcus)、コエノシスティス属(Coenocystis)、コラシウム属(Colacium)、コレオカエテ属(Coleochaete)、コロディクティオン属(Collodictyon)、コムプソゴノプシス属(Compsogonopsis)、オオイシソウ属(Compsopogon)、コンジュガトフィタ属(Conjugatophyta)、コノカエテ属(Conochaete)、コロナストラム属(Coronastrum)、ツヅミモ属(Cosmarium)、コスミオネイス属(Cosmioneis)、コスモクラジウム属(Cosmocladium)、クラテリポルツラ属(Crateriportula)、クラチクラ属(Craticula)、クリナリウム属(Crinalium)、クルシゲニア属(Crucigenia)、クルシゲニエラ属(Crucigeniella)、クリプトアウラクス属(Cryptoaulax)、クリプトモナス属(Cryptomonas)、クリプトフィタ属(Cryptophyta)、セテノホラ属(Ctenophora)、シアノジクトン属(Cyanodictyon)、シアノネフロン属(Cyanonephron)、シアノフォラ属(Cyanophora)、シアノフィタ属(Cyanophyta)、シアノテセ属(Cyanothece)、シアノトモナス属(Cyanothomonas)、シクロネキシス属(Cyclonexis)、シクロステファノス属(Cyclostephanos)、タイコケイソウ属(Cyclotella)、クリンドロカプサ属(Cylindrocapsa)、クリンドロシスティス属(Cylindrocystis)、クリンドロスペルマム属(Cylindrospermum)、クリンドロテカ属(Cylindrotheca)、ハダナミケイソウ属(Cymatopleura)、クチビルケイソウ属(Cymbella)、シムベロニズシア属(Cymbellonitzschia)、シストジニウム属(Cystodinium)、ダクチロコッコプシス属(Dactylococcopsis)、デバルヤ属(Debarya)、デンチクラ属(Denticula)、デルマトクリシス属(Dermatochrysis)、デルモカルパ属(Dermocarpa)、デルモカルペラ属(Dermocarpella)、デスマトラクタム属(Desmatractum)、チリモ属(Desmidium)、デスモコッカス属(Desmococcus)、デスモネマ属(Desmonema)、デスモシホン属(Desmosiphon)、ジアカントス属(Diacanthos)、ジアクロネマ属(Diacronema)、ジアデスミス属(Diadesmis)、イタケイソウ属(Diatoma)、ジアトメラ属(Diatomella)、ジセルラ属(Dicellula)、ジクトリクス属(Dichothrix)、ジクトモコッカス属(Dichotomococcus)、ジクラノカエテ属(Dicranochaete)、ジクトヨクロリス属(Dictyochloris)、ジクトヨコッカス属(Dictyococcus)、ジクチオスファエリウム属(Dictyosphaerium)、ジジモシスティス属(Didymocystis)、ジジモゲネス属(Didymogenes)、ジジモスフェニア属(Didymosphenia)、ジラビフィラム属(Dilabifilum)、ジモルホコッカス属(Dimorphococcus)、サヤツナギ属(Dinobryon)、ディノコッカス属(Dinococcus)、ジプロクロリス属(Diplochloris)、ジプロネイス属(Diploneis)、ジプロスタウロン属(Diplostauron)、ジストリオネラ属(Distrionella)、ドシジウム属(Docidium)、ツルギミドロ属(Draparnaldia)、ドゥナリエラ属(Dunaliella)、ジスモルホコッカス属(Dysmorphococcus)、エクバロシスティス属(Ecballocystis)、エラカトスリクス属(Elakatothrix)、エレルベキア属(Ellerbeckia)、エンシオネマ属(Encyonema)、アオノリ属(Enteromorpha)、エントクラジア属(Entocladia)、エントモネイス属(Entomoneis)、エントフィサリス属(Entophysalis)、エピクリシス属(Epichrys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gerheimia)、ラギニオン属(Lagynion)、シラタマモ属(Lamprothamnium)、レマネア属(Lemanea)、レポシンクリス属(Lepocinclis)、レプトシラ属(Leptosira)、ラボコッカス属(Lobococcus)、ラボシスティス属(Lobocystis)、ロボモナス属(Lobomonas)、ルチコラ属(Luticola)、リングビヤ属(Lyngbya)、マレオクロリス属(Malleochloris)、マロモナス属(Mallomonas)、マントニエラ属(Mantoniella)、マルソニエラ属(Marssoniella)、マルチアナ属(Martyana)、マスチゴコレウス属(Mastigocoleus)、ガストグロイア属(Gastogloia)、メロシラ属(Melosira)、メリスモペディア属(Merismopedia)、メソスティグマ属(Mesostigma)、メソタエニウム属(Mesotaenium)、ミクラクチニウム属(Micractinium)、ミクラステリアス属(Micrasterias)、ミクロカエテ属(Microchaete)、ミクロコレウス属(Microcoleus)、ミクロシスティス属(Microcystis)、ミクログレナ属(Microglena)、ミクロモナス属(Micromonas)、ミクロスポラ属(Microspora)、ミクロタムニオン属(Microthamnion)、ミスココッカス属(Mischococcus)、モノクリシス属(Monochrysis)、モノダス属(Monodus)、モノマスティクス属(Monomastix)、モノラフィジウム属(Monoraphidium)、ヒトエグサ属(Monostroma)、ヒザオリ属(Mougeotia)、モウゲオチオプシス属(Mougeotiopsis)、ミオクロリス属(Myochloris)、マイロメシア属(Myromecia)、ミクソサルシナ属(Myxosarcina)、ナエゲリエラ属(Naegeliella)、ナンノクロリス属(Nannochloris)、ナウトコッカス属(Nautococcus)、フナガタケイソウ属(Navicula)、ネグレクテラ属(Neglectella)、ネイジウム属(Neidium)、ネフロクラミス属(Nephroclamys)、ネフロシチウム属(Nephrocytium)、ネフロジエラ属(Nephrodiella)、ネフロセルミス属(Nephroselmis)、ネトリウム属(Netrium)、フラスコモ属(Nitella)、ホシツリモ属(Nitellopsis)、ササノハケイソウ属(Nitzschia)、ノドゥラリア属(Nodularia)、ノストック属(Nostoc)、オクロモナス属(Ochromonas)、サヤミドロ属(Oedogonium)、オリゴカエトホラ属(Oligochaetophora)、オニコネマ属(Onychonema)、オオカルジウム属(Oocardium)、オオシスティス属(Oocystis)、オペホラ属(Opephora)、オフィオシチウム属(Ophiocytium)、オルトセイラ属(Orthoseira)、オシラトリア属(Oscillatoria)、オキシネイス属(Oxyneis)、パチクラデラ属(Pachycladella)、パルメラ属(Palmella)、パルモジクチオン属(Palmodictyon)、パンドリナ属(Pnadorina)、パンヌス属(Pannus)、パラリア属(Paralia)、パシェリナ属(Pascherina)、パウルシュルジア属(Paulschulzia)、クンショウモ属(Pediastrum)、ペディネラ属(Pedinella)、ペディノモナス属(Pedinomonas)、ペディノペラ属(Pedinopera)、ペラゴジクチオン属(Pelagodictyon)、ペニウム属(Penium)、ペラネマ属(Peranema)、ペリジニオプシス属(Peridiniopsis)、ペリジニウム属(Peridinium)、ペロニア属(Peronia)、ペトロネイス属(Petroneis)、ファコタス属(Phacotus)、ウチワヒゲムシ属(Phacus)、ファエアスター属(Phaeaster)、フェオデルマチウム属(Phaeodermatium)、フェオフィタ属(Phaeophyta)、フェオスファエラ属(Phaeosphaera)、フェオタムニオン属(Phaeothamnion)、フォルミジウム属(Phormidium)、フィコペルティス属(Phycopeltis)、フィラリオクロリス属(Phyllariochloris)、フィロカルジウム属(Phyllocardium)、フィロミタス属(Phyllomitas)、ハネケイソウ属(Pinnularia)、ピトホラ属(Pitophora)、プラコネイス属(Placoneis)、プランクトネマ属(Planctonema)、プランクトスファエリア属(Planktosphaeria)、プラノチジウム属(Planothidium)、プレクトネマ属(Plectonema)、ヒゲマワリ属(Pleodorina)、プレウラストラム属(Pleurastrum)、プレウロカプサ属(Pleurocapsa)、プレウロクラジア属(Pleurocladia)、プレウロジスカス属(Pleurodiscus)、プレウロシグマ属(Pleurosigma)、プレウロシラ属(Pleurosira)、プレウロタエニウム属(Pleurotaenium)、ポシロモナス属(Pocillomonas)、ポドヘドラ属(Podohedra)、ポリブレファリデス属(Polyblepharides)、ポリカエトホラ属(Polychaetophora)、ポリエドリエラ属(Polyedriella)、ポリエドリオプシス属(Polyedriopsis)、ポリゴニオクロリス属(Polygoniochloris)、ポリエピドモナス属(Polyepidomonas)、ポリタエニア属(Polytaenia)、ポリトマ属(Polytoma)、ポリトメラ属(Polytomella)、ポルフィリディウム属(Porphyridium)、ポステリオクロモナス属(Posteriochromonas)、プラシノクロリス属(Prasinochloris)、プラシノクラダス属(Prasinocladus)、プラシノフィタ属(Prasinophyta)、カワノリ属(Prasiola)、プロクロルフィタ属(Prochlorphyta)、プロクロロトリックス属(Prochlorothrix)、プロトデルマ属(Protoderma)、プロトシフォン属(Protosiphon)、プロバソリエラ属(Provasoliella)、プリムネシウム属(Prymnesium)、プサモジクチオン属(Psammodictyon)、プサモチジウム属(Psammothidium)、シュードアナベナ属(Pseudanabaena)、シュードエノクロニウム属(Pseudenoclonium)、シュードカルテリア属(Psuedocarteria)、シュードカテ属(Pseudochate)、シュードカラシウム属(Pseudocharacium)、シュードコッコミキサ属(Pseudococcomyxa)、シュードジクチオスファエリウム属(Pseudodictyosphaerium)、シュードケフィリオン属(Pseudokephyrion)、シュードンコビルサ属(Pseudoncobyrsa)、シュードクアドリグラ属(Pseudoquadrigula)、シュードスファエロシスティス属(Pseudosphaerocystis)、シュードスタウラストラム属(Pseudostaurastrum)、シュードスタウロシラ属(Pseudostaurosira)、シュードテトラストラム属(Pseudotetrastrum)、プテロモナス属(Pteromonas)、パンクタストルアタ属(Punctastruata)、ピラミクラミス属(Pyramichlamys)、ピラミモナス属(Pyramimonas)、ピロフィタ属(Pyrrophyta)、クアドリクロリス属(Quadrichloris)、クアドリコッカス属(Quadricoccus)、クアドリグラ属(Quadrigula)、ラジオコッカス属(Radiococcus)、ラジオフィラム属(Radiofilum)、ラフィジオプシス属(Raphidiopsis)、ラフィドセリス属(Raphidocelis)、ラフィドネマ属(Raphidonema)、ラフィドフィタ属(Raphidophyta)、ペイメリア属(Peimeria)、ラブドデルマ属(Rhabdoderma)、ラブドモナス属(Rhabdomonas)、ネダシグサ属(Rhizoclonium)、ロドモナス属(Rhodomonas)、ロドフィタ属(Rhodophyta)、ロイコスフェニア属(Rhoicosphenia)、ロパロジア属(Rhopalodia)、リブラリア属(Rivularia)、ロゼンビンギエラ属(Rosenvingiella)、ロシチジウム属(Rossithidium)、ロヤ属(Roya)、セネデスムス属(Scenedesmus)、シェルフェリア属(Scherffelia)、シゾクラミデラ属(Schizochlamydella)、シゾクラミス属(Schizochlamys)、シゾメリス属(Schizomeris)、シゾトリックス属(Schizothrix)、スクロエデリア属(Schroederia)、スコリオネイス属(Scolioneis)、スコチエラ属(Scotiella)、スコチエロプシス属(Scotiellopsis)、スコウルフィエルジア属(Scourfieldia)、スキトネマ属(Scytonema)、セレナストラム属(Selenastrum)、セレノクロリス属(Selenochloris)、セラホラ属(Sellaphora)、セミオルビス属(Semiorbis)、シデロセリス属(Siderocelis)、ジデロシストプシス属(Diderocystopsis)、ジモンセニア属(Dimonsenia)、シホノネマ属(Siphononema)、シロクラジウム属(Sirocladium)、シロゴニウム属(Sirogonium)、スケレトネマ属(Skeletonema)、ソラストラム属(Sorastrum)、スペルマトゾプシス属(Spermatozopsis)、スファエレロシスティス属(Sphaerellocystis)、スファエレロプシス属(Sphaerellopsis)、スファエロジニウム属(Sphaerodinium)、ヨコワミドロ属(Sphaeroplea)、スファエロゾスマ属(Sphaerozosma)、スピニフェロモナス属(Spiniferomonas)、スパイロジャイラ属(Spirogyra)、スピロタエニア属(Spirotaenia)、スピルリナ属(Spirulina)、スポンジロモラム属(Spondylomorum)、スポンジロシウム属(Spondylosium)、スポロテトラス属(Sporotetras)、スプメラ属(Spumella)、スタウラストラム属(Staurastrum)、スタエロデスマス属(Stauerodesmus)、スタウロネイス属(Stauroneis)、スタウロシラ属(Staurosira)、スタウロシレラ属(Staurosirella)、ステノプテロビア属(Stenopterobia)、ステファノコスティス属(Stephanocostis)、ステファノディスカス属(Stephanodiscus)、ステファノポロス属(Stephanoporos)、ステファノスファエラ属(Stephanosphaera)、スチココッカス属(Stichococcus)、スチコグロエア属(Stichogloea)、スチゲオクロニム属(Stigeoclonium)、スチゴネマ属(Stigonema)、スチピトコッカス属(Stipitococcus)、ストケシエラ属(Stokesiella)、ストロムボモナス属(Strombomonas)、スチロクリサリス属(Stylochrysalis)、スチロジニウム属(Stylodinium)、スチロイキシス属(Styloyxis)、スチロスファエリジウム属(Stylosphaeridium)、スリレラ属(Surirella)、シキジオン属(Sykidion)、シムプロカ属(Symploca)、シネココッカス属(Synechococcus)、シネコシスティス属(Synechocystis)、シネドラ属(Synedra)、シノクロモナス属(Synochromonas)、シヌラ属(Synura)、タベラリア属(Tabellaria)、タブラリア属(Tabularia)、テイリンギア属(Teilingia)、テムノガメタム属(Temnogametum)、テトメモラス属(Tetmemorus)、テトラクロレラ属(Tetrachlorella)、テトラシクラス属(Tetracyclus)、テトラデスマス属(Tetradesmus)、テトラエドリエラ属(Tetraedriella)、テトラエドロン属(Tetraedron)、テトラセルミス属(Tetraselmis)、ヨツメモ属(Tetraspora)、テトラストラム属(Tetrastrum)、タラシオシラ属(Thalassiosira)、タムニオカエテ属(Thamniochaete)、トラコクロリス属(Thorakochloris)、トレア属(Thorea)、トリペラ属(Tolypella)、トリポスリクス属(Tolypothrix)、トラケロモナス属(Trachelomonas)、トラキジスカス属(Trachydiscus)、トレボウキシア属(Trebouxia)、トレンテホリア属(Trentepholia)、トレウバリア属(Treubaria)、トリボネマ属(Tribonema)、アイアカシオ属(Trichodesmium)、トリコジスカス属(Trichodiscus)、トロキスシア属(Trochiscia)、トリブリオネラ属(Tryblionella)、ヒビミドロ属(Ulothrix)、ウログレナ属(Uroglena)、ウロネマ属(Uronema)、ウロソレニア属(Urosolenia)、シリオミドロ属(Urospora)、ウバ属(Uva)、バキュオラリア属(Vacuolaria)、フシナシミドロ属(Vaucheria)、ボルボックス属(Volvox)、ボルブリナ属(Volvulina)、ウェステラ属(Westella)、ウォロスジンスキア属(Woloszynskia)、キサンチジウム属(Xanthidium)、キサントフィタ属(Xanthophyta)、キセノコッカス属(Xenococcus)、ジグネマ属(Zygnema)、ジグネモプシス属(Zygnemopsis)、およびジゴニウム属(Zygonium)が含まれるが、これに限定されない。

緑色非硫黄細菌には、以下の属:クロロフレクサス属(Chloroflexus)、クロロネマ属(Chloronema)、オシロクロリス属(Oscillochloris)、ヘリオスリックス属(Heliothrix)、ヘルペトシフォン属(Herpetosiphon)、ロゼイフレキサス属(Roseiflexus)、およびサーモミクロビウム属(Thermomicrobium)が含まれるが、これに限定されない。

緑色硫黄細菌には、以下の属:クロロビウム属(Chlorobium)、クラスロクロリス属(Clathrochloris)、およびプロステコクロリス属(Prosthecochloris)が含まれるが、これに限定されない。

紅色硫黄細菌には、以下の属:アロクロマチウム属(Allochromatium)、クロマチウム属(Chromatium)、ハロクロマチウム属(Halochromatium)、イソクロマチウム属(Isochromatium)、マリクロマチウム属(Marichromatium)、ロドブラム属(Rhodovulum)、サーモクロマチウム属(Thermochromatium)、チオカプサ属(Thiocapsa)、チオロドコッカス属(Thiorhodococcus)、およびチオキスチス属(Thiocystis)が含まれるが、これに限定されない。

紅色非硫黄細菌には、以下の属:ファエオスピリラム属(Phaeospirillum)、ロドバカ属(Rhodobaca)、ロドバクター属(Rhodobacter)、ロドミクロビウム属(Rhodomicrobium)、ロドピラ属(Rhodopila)、ロドシュードモナス属(Rhodopseudomonas)、ロドサラシウム属(Rhodothalassium)、ロドスピリラム属(Rhodospirillum)、ロドビブリオ属(Rodovibrio)、およびロゼオスピラ属(Roseospira)が含まれるが、これに限定されない。

高光合成変換には、大規模な遺伝子改変(表1および表2)が必要である。従って、好ましい態様において、親の光独立栄養生物を外因性DNAで形質転換することができる。

高光合成変換に好ましい生物には、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、パニクム・ビルガタム(Panicum virgatum)、ミスカンサス・ギガンテウス(Miscanthus giganteus)、およびトウモロコシ(Zea mays)(植物)、ボトリコッカス・ブラウニ(Botryococcus braunii)、コナミドリムシ(Chlamydomonas reinhardtii)、およびデュナリエラ・サリナ(Dunaliela salina)(藻類)、シネココッカス属の種PCC7002、シネココッカス属の種PCC7942、シネコシスティス属の種PCC6803、およびサーモシネココッカス・エロンガタスBP-1(ラン藻類)、クロロビウム・テピダム(Chlorobium tepidum)(緑色硫黄細菌)、クロロフレクサス・アウランチカス(Chloroflexus auranticus)(緑色非硫黄細菌)、クロマチウム・テピダム(Chromatium tepidum)、およびクロマチウム・ビノサム(Chromatium vinosum)(紅色硫黄細菌)、ロドスピリラム・ラブラム(Rhodospirillum rubrum)、ロドバクター・カプスラタス(Rhodobacter capsulatus)、およびロドシュードモナス・パラスリス(Rhodopseudomonas palusris)(紅色非硫黄細菌)が含まれる。

繁殖
液体培地中で、またはアガロース含有プレート上で光合成生物を培養する方法は、当業者に周知である(例えば、ATCCおよびInstitute Pasteurに関連したウェブサイトを参照されたい)。例えば、シネココッカス属の種PCC7002細胞(Pasteur Culture Collection of Cyanobacteriaから入手可能)は、16μg/Lビオチン、20mM MgSO₄、8mM KCl、および300mM NaClを添加した、BG-11培地(17.65mM NaNO₃、0.18mM K₂HPO₄、0.3mM MgSO₄、0.25mM CaCl₂、0.03mM クエン酸、0.03mM クエン酸鉄アンモニウム、0.003mM EDTA、0.19mM Na₂CO₃、2.86mg/L H₃BO₃、1.81mg/L MnCl₂、0.222mg/L ZnSO₄、0.390mg/L Na₂MoO₄、0.079mg/L CuSO₄、および0.049mg/L Co(NO₃)₂、pH7.4)において培養される(例えば、Institute Pasteurに関連したウェブサイト、およびPrice GD, Woodger FJ, Badger MR, Howitt SM, Tucker L. 「Identification of a SulP-type bicarbonate transporter in marine cyanobacteria. Proc Natl. Acad. Sci USA (2004). 101(52):18228-33を参照されたい)。典型的には、培養物は28℃に維持され、120μmol photon/m²/sの光強度下で、5％CO₂を用いて連続して通気される。

サーモシネココッカス・エロンガタスBP-1(かずさDNA研究所、日本から入手可能)は、[Iwai M, Katoh H, Katayama M, Ikeuchi M. 「Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium, Thermosynechococcus elongatus BP-1.」 Plant Cell Physiol (2004). 45(2):171-175)]に記載のように、20mM TES-KOH(pH8.2)を添加したBG11培地において繁殖される。典型的には、培養物は50℃に維持され、38μmol photon/m²/sの光強度下で、5％CO₂を用いて連続して通気される。

コナミドリムシ(Duke University, Durham, North Carolinaが管理しているChlamydomonas Center culture collectionから入手可能) は、(Geraghty AM, Anderson JC, Spalding MH. 「A 36 kilodalton limiting-CO2 induced polypeptide of Chlamydomonas is distinct from the 37 kilodalton periplasmic anhydrase.」 Plant Physiol (1990). 93:116-121)に記載のように、143mg/L K₂HPO₄、73mg/L KH₂PO₄、400mg/L NH₄NO₃、100mg/L MgSO₄-7H₂O、50mg/L CaCl₂-2 H₂0、1mL/L微量元素ストック、およびTris塩基を用いてpH7.6に滴定された10mL/L 2.0M MOPSからなる最小塩培地において増殖される。典型的には、培養物は24℃に維持され、60μmol photon/m²/sの光強度下で、5％CO₂を含む空気を用いて通気される。

前記は、典型的な繁殖条件を規定している。適宜、別の培地または気体組成物、別の温度(5〜75℃)、および/または光束(0〜5500μmol photon/m²/s)を用いて、インキュベーションが行われる。

光は、自然照明(太陽光)、標準的な白熱灯、蛍光灯、もしくはハロゲン電球を含む様々な機構によって、または特別に設計された照明付グロースチャンバー(例えば、モデルLI15照明付グロースチャンバー(Sheldon Manufacturing, Inc. Cornelius, OR)内での繁殖によって当てられる。特定の波長および/または強度を必要とする実験の場合、光は、波長スペクトルおよび強度を注意深く制御できる発光ダイオード(LED)(Philips)を介して供給される。

二酸化炭素は、固体培地添加物(すなわち、重炭酸ナトリウム)の含有によって、または気体としてグロースインキュベーターまたは培地に分散させることによって供給される。ほとんどの実験は、1〜30％の濃度の高濃度の二酸化炭素ガスを用いて行われる。二酸化炭素ガスは、生物が混合するのに十分な速度で、直接、増殖培地に入れて通気される。高濃度の二酸化炭素ガスが用いられる場合、ガスは市販のボンベから純粋な形で、または優先的に、石炭プラント、精製所、セメント製造施設、天然ガス施設、醸造所などからの排ガスもしくは煙道ガスを含む高濃度の供給源から生じる。

プラスミド
遺伝子工学に関連するプラスミドは、典型的には、少なくとも2つの機能エレメント1)宿主生物内でのDNA配列の増幅を可能にする複製起点、および2)選択マーカー(例えば、アンピシリン、カナマイシン、ゼオシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、スペクチノマイシンなどに対する耐性を付与する抗生物質耐性マーカー)を含む。プラスミドは、主な目的が望ましい異種DNAインサートの増幅である場合、「クローニングベクター」と呼ばれることが多い。プラスミドはまた、異種DNAインサートの転写および翻訳を誘導するシス作用調節配列(例えば、プロモーター、転写ターミネーター、リボソーム結合部位)を含んでもよい。このようなプラスミドは「発現ベクター」と呼ばれることが多い。プラスミドが、複数種での増幅を可能にする機能エレメントを含有する場合、このようなプラスミドは「シャトルベクター」と呼ばれる。シャトルベクターは当業者に周知である。例えば、pSE4は、大腸菌およびシネココッカス属での増幅を可能にするシャトルベクターである[Maeda S, Kawaguchi Y, Ohy T, and Omata T. J. Bacteriol. (1998). 180:4080-4088]。関心対象の光独立栄養生物への形質転換による導入の前に、大腸菌において遺伝子および調節配列の容易な操作を可能にするシャトルベクターは、本発明において特に有用である。

形質転換法
原核生物の標準的な形質転換法は当業者に周知である[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning--A Laboratory Manual (2nd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, N.Y.;およびCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.の合弁事業, (1997 補遺まで、およびこれを含む)]。

多くの原核生物は天然でコンピテントである。他の原核生物は、化学処理によってコンピテントにすることができる。形質転換法の非限定的な例には、外因性DNAの存在下での直接インキュベーション、熱ショックによる形質転換、エレクトロポレーションによる形質転換、バイオリスティックパーティクルボンバードメントによる形質転換、脂質もしくは融合剤(すなわち、ポリエチレングリコール)の添加による形質転換、異種微生物との接合、またはウイルス粒子を介した形質導入が含まれる。

シネココッカス属の種PCC7002細胞は、[Essich ES, Stevens Jr E, Porter RD 「Chromosomal Transformation in the Cyanobacterium Agmenellum quadruplicatum.」 J Bacteriol (1990). 172(4):1916-1922]に以前に記載された最適化プロトコールに従って形質転換される。細胞は、培地A(18g/L NaCl、5g/L MgSO₄・7 H₂0、30mg/L Na₂EDTA、600mg/L KCl、370mg/L CaCl₂・2 H₂O、1g/L NaNO₃、50mg/L KH₂PO₄、1g/L Trizma塩基pH8.2、4μg/LビタミンB12、3.89mg/L FeCl₃・6 H₂0、34.3mg/L H₃BO₃、4.3mg/L MnCl₂・4 H₂0、315μg/L ZnCl₂、30μg/L MoO₃、3μg/L CuSO₄・5 H₂0、12.2μg/L CoCl₂・6 H₂0)[Stevens SE, Patterson COP, and Myers J. 「The production of hydrogen peroxide by green algae: a survey.」 J. Phycology (1973). 9:427-430]+ 5g/L NaNO₃の中で、約10⁸細胞/mLまで培養される。9体積の細胞を、0.15M NaCl/0.015Mクエン酸三ナトリウムに溶解した1体積の1〜10μg/mL DNAと混合し、27〜30℃で3時間インキュベートした後に、1体積のDNaseIを最終濃度10μg/mLまで添加する。細胞を、45℃に調節した0.6％培地A重層寒天2.5mLにプレートし、インキュベートする。滅菌したパスツールピペットを用いて、適切な濃度の抗生物質を含有する0.6％培地A寒天2.0mLを下層におくことによって、細胞に抗生物質を曝露した。3〜4日後に、形質転換体を選択した。選択は、典型的には、固体培地上では、200μg/mlカナマイシン、8μg/mlクロラムフェニコール、10μg/mlスペクチノマイシンを用いて行われるが、液体培地中では、150μg/mlカナマイシン、7μg/mlクロラムフェニコール、および5μg/mlスペクチノマイシンが用いられる。

サーモシネココッカス・エロンガタスBP-1細胞は、[Iwai M, Katoh H, Katayama M, and Ikeuchi M. 「Improved genetic transformation of the thermophilic cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus BP-1. Plant Cell Physiol (2004). 45(2):171-175]に以前に記載された最適化プロトコールに従って形質転換される。対数期の中間部の培養物を外因性DNA(典型的に3〜20μg)とインキュベートし、BioRad Gene Pulsur Xcell (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)を用いて10kV/cmの電界強度でエレクトロポレーションする。エレクトロポレーション後に、細胞を、45℃で24時間、BG11培地1ml中で回復させる。細胞を、適切な抗生物質を含有するBG11プレートに直接プレートするか、任意で、0.35％(w/v)融解寒天(Difco, USA)を含有するBG11培地と予め混合する。

形質転換は、典型的には、レシピエント細胞と、大腸菌から単離された精製プラスミドDNAとのインキュベーションを伴う。対照的に、細菌接合は、ある細菌種から別の細菌種にDNAを直接導入する別の手段を提供する。例えば、大腸菌と、シネコシスティス属(Synechocystic)PCC6803およびPCC6714、ならびにシネココッカス属PCC7942およびPCC6301、ならびに好熱性シネココッカス・エロンガタス(Synechococcus elongatus)を含むラン藻との接合を可能にする技法は、

に記載されている。

真核生物光独立栄養体の形質転換に関連する技法は当業者に公知である。このような方法は、分子生物学に関連する教科書に記載されている(Packer & Glaser, 1988, 「Cyanobacteria」, Meth. Enzymol., Vol. 167; Weissbach & Weissbach, 1988, 「Methods for plant molecular biology」, Academic Press, New York, Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989, 「Molecular Cloning: A laboratory manual」, 2nd edition Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.;およびClark M S, 1997, Plant Molecular Biology, Springer, N.Y.) 、ならびに「真核生物藻類を形質転換するための方法およびツール(Methods and tools for transformation of eukaryotic algae)」米国特許第6,027,900号を参照されたい)。

コナミドリムシ細胞の形質転換のために様々なアプローチを使用することができる。コナミドリムシ核区画の形質転換は、[Kindle KL. 「High-frequency nuclear transformation of Chlamydomonas reinhardtii.」 Proc Natl Acad Sci (1990). 87:1228-1232]に記載のように行われる。簡単に言えば、細胞を1.5x10⁶/mlの濃度まで増殖させ、ペレット化し、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)の5％(v/v)ポリエチレングリコール(PEG, M_r 6000)に再懸濁する。その後に、再懸濁した細胞を線状プラスミドDNAまたは環状プラスミドDNAとインキュベートし、300mgの0.5mmガラスビーズの存在下で、Genie Vortex IIミキサー(Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)を用いて最大速度で10〜30秒間、攪拌する。すぐに、細胞を、適切な抗生物質または栄養分選択を含有するアガロースプレートにプレートする。または、コナミドリムシ細胞をアガロースプレートに直接プレートし、これに、[Sodeinde OA and Kindle KL. 「Homologous recombination in the nuclear genome of Chlamydomonas reinhardtii.」 Proc Natl Acad Sci (1993). 90:9199-9203]に以前に記載されたように、Bio-Rad PDS-1000He粒子送達システム(Bio-Rad Laboratories; Hercules, CA)を用いて、1μgのプラスミドDNAがコーティングされた500μgのタングステン微粒子を衝突させた。

コナミドリムシ葉緑体は、(Kindle KL, Richards KL, Stern DB. 「Engineering the chloroplast genome: Techniques and capabilities for chloroplast transformation in Chlamydomonas reinhardtii. Proc Natl Acad Sci. (2001). 88:1721-1725)に記載のように形質転換される。簡単に言えば、細胞を、対数期中期まで、任意で、0.5mM 5-フルオロデオキシウリジンの存在下で増殖させ、300mgの0.5mmガラスビーズの存在下で、一本鎖プラスミドDNAまたは二本鎖プラスミドDNAと共に、Genie Vortex IIミキサーを用いて最大速度で15〜30秒間、攪拌する。攪拌後すぐに、細胞を、適切な濃度の抗生物質を含有する選択用寒天プレートにプレートする。典型的には、100μg/mlのスペクチノマイシンが用いられる。

コナミドリムシミトコンドリアは、(Remacle C, Cardol P, Coosemans N, Galsne M, and Bonnefoy N. 「High-efficiency biolistic transformation of Chlamydomonas mitochondria can be used to insert mutations in complex I genes.」 Proc Natl Acad Sci (2006). 103: 4771-4776.]に記載のように形質転換される。簡単に述べると、細胞を、液体Tris酢酸リン酸培地(TAP)[http://openwetware.org/wiki/Media_formula]中で、2〜3x10⁶細胞/mlの濃度まで増殖させ、10⁸細胞をTAPプレート上に広げ、これに、Bio-Rad PDS-1000He装置を用いて、1100psi圧力および少なくとも29インチHgの部分チャンバー真空の下で、DNAがコーティングされたタングステンビーズを衝突させる。プレートは、マイクロキャリアアセンブリから約7cmの位置に配置され、任意で、形質転換効率を高めるためにストッピングスクリーンを使用する。

表1および表2は、既存の光独立栄養生物に高光合成特性を伝える好ましい遺伝子を規定する。

表1は、炭素固定速度、耐熱性、pH耐性、煙道ガス耐性、耐塩性、集光性効率、還元力発生、および栄養分非依存性を増強するために過剰発現される遺伝子と、関連する経路、酵素委員会(EC)番号、例示的な遺伝子名、供給源生物、GenBankアクセッション番号、および代替の供給源に由来するホモログに関する情報を列挙する。親の生物が、示された酵素活性を有する遺伝子をコードする場合でも、CO₂固定を改善するために、これらの成分を過剰発現することが有用である。1つの態様において、天然酵素配列が過剰発現される。好ましい態様において、外因性遺伝子を過剰発現することが有用であり、これにより、バイオプロセスにおけるより明確な調節制御、および天然遺伝子に明確に焦点を合わせた、中心的な代謝調節の影響を潜在的に緩和する手段が可能になる。

同一のもしくは相同のポリペプチドをコードするが、1)宿主生物のコドン使用頻度表に基づいて発現レベルを変えるために;2)二次構造を付加もしくは除去するために;3)制限エンドヌクレアーゼ認識配列を付加もしくは除去するために;および/または4)遺伝子の合成および組み立てを容易にするためにヌクレオチド置換を含む、示された遺伝子のヌクレオチド配列(またはDNA配列)は、Codon Devices Inc (Cambridge, MA)によって組み立てられる。DNA2.0 (Menlo Park, CA)、Blue Heron Biotechnology (Bothell, WA)、およびGeneart (Regensburg, Germany)を含む別の供給業者もまた、述べられたように用いられる。商業的供給業者では成り立たない配列は、DNAもしくはcDNA試料またはcDNA/BACライブラリーからポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて調製することができる。最初に、インサートを、クローニングベクター、例えば、pUC19に入れて増幅および配列決定する。重要なことに、pUC19に入れた関心対象の各遺伝子の一次合成および配列検証によって、様々に組み合わせた各単位を、望ましい酵素の転写および翻訳を推進する別のデスティネーションベクターに移すよう融通がきくようになる。分子の移動を容易にするために、特有のおよび/またはユニークなクローニングサイトが、オープンリーディングフレーム(ORFs)の5’末端および3’末端に含められる。

必要とされる代謝経路は、最初に、常に「オン」の構成的プロモーターによって推進される発現カセット内にコードされる。多くのこのようなプロモーター、例えば、spcリボソームタンパク質オペロン(P_spc)、pBR322のβラクタマーゼ遺伝子プロモーター(P_bla)、バクテリオファージλP_Lプロモーター、プラスミドpBR322の複製制御プロモーター(P_RNAIもしくはP_RNAII)、またはrrnBリボソームRNAオペロンのP1もしくはP2プロモーター[Liang ST, Bipatnath M, Xu YC, Chen SL, Dennis P, Ehrenber M, Bremer H. Activities of Constitutive Promoters in Escherichia coli. J. Mol Biol (1999). Vol 292, Number 1, pgs 19-37]、米国特許5,846,744号に記載のクロレラ(Chlorella)ウイルスプロモーター[「クロレラウイルスプロモーター」]、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター[Zheng X, Deng W, Luo K, Duan H, Chen Y, McAvoy R, Song S, Pei Y, Li Y. 「The cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter sequence alters the level and patterns of activity of adjacent tissue- and organ-specific gene promoters.」 Plant Cell Rep (2007). 26(8):1195-1203]、アナベナ属の構成的petHプロモーター[Valladares A, Muro-Pastor AM, Fillat MF, Herrero A, Flores E. 「Constitutive and nitrogen-regulated promoters of the petH gene encoding ferredoxin:NADP+ reductase in the heterocyst-forming cyanobacterium Anabaena sp.」 FEBS Lett (1999). 449(2-3):159-64]、クラミドモナス属のRbcS2プロモーター[Leon R, Couso I, Fernandez E. 「Metabolic engineering of ketocarotenoids biosynthesis in the unicellular microalgae Chlamydomonas reinhardtii.」 J Biotechnol (2007). 130(2):143-152]、およびミクロキスティス・アルギノーザ(Microcystis aeruginosa)K-81のpsbAコアプロモーター配列[Shibato J, Asayama M, Shirai M. 「Specific recognition of the cyanobacterial psbA promoter by RNA polymerases containing principal sigma factors.」 Biochim. Biophys Acta (1998). 1442(2-3):296-303]は公知である。

必要に応じて、経路を設計および試験した後、転写レベルを増加または減少させてネットワークを最適化するために、例えば、保存された-35エレメントおよび-10エレメント、またはこれらのエレメント間の間隔を改変することによって、構成的プロモーターの強度が「調整」される。

構成的発現が最適でない(すなわち、有害な作用を有する、ネットワークとかみ合わないなど)と分かったら、誘導性プロモーターが用いられる。誘導性プロモーターは、誘導剤、しばしば、低分子または代謝産物を添加する前は「オフ」である(転写されない)。適切な誘導性プロモーター系の例には、アラビノース誘導性P_bad [Khlebnikov A, Datsenko KA, Skaug T, Wanner BL, Keasling JD. 「Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter.」 Microbiology (2001). 147 (Pt 12): 3241-7]、ラムノース誘導性 rhaP_BADプロモーター [Haldimann A, Daniels L, Wanner B. J Bacteriol (1998).「Use of new methods for construction of tightly regulated arabinose and rhamnose promoter fusions in studies of the Escherichia coli phosphate regulon.」 180:1277-1286]、プロピオン酸誘導性pPRO[Lee SK and Keasling JD. 「A propionate-inducible expression system for enteric bacteria.」 Appl Environ Microbiol (2005). 71(11):6856-62)]、IPTG誘導性lacプロモーター[Gronenborn. Mol Gen Genet (1976). 「Overproduction of phage lambda repressor under control of the lac promoter of Escherichia coli.」 148:243-250]、合成tacプロモーター[De Boer HA, Comstock LJ, Vasser M. 「The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and lac promoters.」 PNAS (1983). 80:21-25]、合成trc プロモーター[Brosius J, Erfle M, Storella J. 「Spacing of the -10 and -35 regions in the tac promoter. Effect on its in vivo activity.」 J Biol Chem (1985). 260:3539-3541]、またはT7 RNA ポリメラーゼ系[Studier FW and Moffatt BA. 「Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes.」 J Mol Biol (1986]. 189:113-130、テトラサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリン誘導性tetAプロモーター/オペレーター系[Skerra A. 「Use of the tetracycline promoter for the tightly regulated production of a murine antibody fragment in Escherichia coli」 Gene (1994). 151:131-135]、コナミドリムシのニッケル誘導性Cpx1およびCyc6 プロモーター[Quinn JM, Kropat J, Merchant S. 「Copper response element and Crr1-dependent nickel-responsive promoter for induced, reversible gene expression in Chlamydomonas reinhardtii.」 Eukaryotic Cell (2003). 2(5):995-1002]、シネココッカス属の亜硝酸誘導性nirAプロモーター[Qi Q, Hao M, Ng W, Slater SC, Baszis SR, Weiss JD, and Valentin HE. 「Application of the Synechococcus nirA promoter to establish an inducible expression system for engineering the Synechocystis tocopherol pathway.」 Appl. Environ. Microb (2005) 71(10):5678-5684]、ボルボックス属の硫黄応答性アリールスルファターゼプロモーター[Hallman A and Sumper M. 「Reporter genes and highly regulated promoters as tools for transformation experiments in Volvox carteri.」 Proc Natl Acad Sci (1994). 91(24):11562-11566]が含まれる。これらの、および他の天然誘導性プロモーターまたは合成により得られた誘導性プロモーターが用いられる(例えば、米国特許第7,235,385号;組換えタンパク質の発現を増強する方法(Methods for enhancing expression of recombinant proteins)を参照されたい)。

さらなる層の発現制御を提供するために、別の複製起点が選択される。細胞1個あたりのコピー数は「遺伝子投与量効果」の一因となる。例えば、高レベルの遺伝子発現の一因となる細胞1個あたり300〜1000コピーの各プラスミドを作製するために、高コピーpMB1またはcolE1起点が用いられる。対照的に、コピー数を細胞1個あたり約1〜20コピーに制限するために、低コピー起点をコードするプラスミド、例えば、pSC101またはp15Aが活用される。プラスミドコピー数をさらに調整する技法および配列は公知である(例えば、米国特許第5,565,333号、プラスミド複製起点を含有するプラスミドのコピー数を増やすプラスミド複製起点(Plasmid replication origin increasing the copy number of plasmid containing said origin);米国特許第6,806,066号、プラスミドコピー数を制御するための改変ColE1複製起点を有する発現ベクター(Expression vectors with modified ColE1 origin of replication for control of plasmid copy number)を参照されたい)。シネココッカス属の種PCC7002を含む、ある特定の生物は、様々なコピー数を有する内因性プラスミドをコードする[Yano S, Kawata Y, Kojima H. 「Salinity-dependent copy number changes of endogenous plasmids in Synechococcus sp. PCC 7002]。従って、発現カセットを別個の内因性プラスミドに標的化することによって、遺伝子投与量を改変することができる。

発現レベルはまた、翻訳効率を調整することによっても最適化される。大腸菌では、シャイン・ダルガノ(SD)配列[Shine J and Dalgarno L. Nature (1975)「Determination of cistron specificity in bacterial ribosomes.」254(5495):34-8]は、リボソームをmRNAに向け、リボソームと開始コドンを並べることによって翻訳開始を容易にするコンセンサス配列である。適宜、翻訳効率を上げるまたは下げるために、SD配列の調整が用いられる。

注目すべきことに、ある特定の状況では、SD配列の非存在下で高レベルの翻訳が観察されることがある[Mutsuda M and Sugiura M. 「Translation initiation of cyanobacterial rbcS mRNAs requires the 38-kDa ribosomal protein S1 but not the Shine-Dalgarno sequence.」 J Biol Chem (2006). 281(50):38314-38321; Xu J, Mironova R, Ivanov IG, Abouhaidar MG. J Basic Microbiol (1999). 「A polylinker-derived sequence, PL, highly increased translation efficiency in Escherichia coli.」39(1):51-60]。発現レベルを調整するために、関心対象の遺伝子内で、または関心対象の遺伝子外で、mRNA二次構造が操作される。

翻訳レベルを上げるまたは下げるために、コドン使用頻度も操作される。

ある態様では、関心対象の各遺伝子は特有のプラスミドにおいて発現される。好ましい態様において、望ましい生合成経路は多シストロンプラスミドベクターにおいて発現される。有用な発現ベクターが内部で設計され、外部の遺伝子合成供給業者によって合成されている。

最適化
最初に、前記のエピソームプラスミドを用いて、以下の生合成経路およびモジュールが試験および最適化される。非限定的な最適化には、プロモーターの交換および調整、リボソーム結合部位の操作、遺伝子の順番の変更(例えば、遺伝子ABC対BAC、CBA、CAB、BCA)、分子シャペロンの同時発現、活性を上げるもしくは下げるような遺伝子配列のランダム変異誘発もしくは標的化変異誘発、フォールディング、またはアロステリック調節、別の種に由来する遺伝子配列の発現、コドン操作、細胞内標的化配列、例えば、シグナル配列の付加もしくは除去などが含まれる。

それぞれの遺伝子またはモジュールが個々にまたは交互に、並行して最適化される。その後に、機能的なプロモーターおよび遺伝子配列は、当業者に公知の標準的な技法を用いて、選択圧(すなわち、抗生物質の含有)の非存在下で安定して増幅できるように光独立栄養宿主の染色体に組み込まれる。

表2は、炭素固定速度、耐熱性、pH耐性、煙道ガス耐性、耐塩性、集光性効率、還元力発生、および栄養分非依存性を高めるために下方制御またはノックアウトされる遺伝子と、関連する経路、酵素委員会(EC)番号、例示的な遺伝子名、供給源生物、およびGenBankアクセッション番号に関する情報を列挙している。

内因性DNA配列の破壊
ある特定の場合では、宿主生物に天然にある(すなわち、「内因性」の)染色体DNA配列が変えられる。特定の遺伝子産物の発現を増加および減少させるために、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーターなどを含む非コード領域が操作される。別の態様では、目的のタンパク質の安定性、フォールディング、活性、または局在化に影響を及ぼすように、内因性遺伝子のコード配列が変えられる。または、特定の遺伝子を、完全に欠失または「ノックアウト」することができる。このような操作のための技法および方法は当業者に公知である。

ある特定の態様において、内因性遺伝子の発現レベルを下げるために、転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)が、異種RNA配列、しばしば、破壊を必要とする遺伝子に対するアンチセンスの発現を介して用いられる。

他の態様において、内因性遺伝子発現を下方制御するために、天然にコードされるまたは外因性の低分子RNAまたはミクロRNA種の発現が用いられる。

選択およびアッセイ
選択圧は、高光合成生物を試験および最適化するための評価可能な手段を提供する。高温度下でも生き残る能力は、改善した耐熱性モジュールが首尾よく働いているという証拠となる。煙道ガス(または煙道ガス組成物に近い人工気体製剤)を通気した培地中で増殖する能力によって、改善した煙道ガス耐性モジュールが首尾よく働いていることが確かめられる。野生型対応物より速く複製する能力によって、改善したCO₂固定モジュールが首尾よく働いていることが確かめられる。培地添加物としてビタミンB₁₂を欠く培地中で生き残り、複製する能力によって、ビタミンB₁₂モジュールが首尾よく働いていることが確かめられる。

所望であれば、選択圧の前に、変異原、例えば、紫外光、アルキル化剤[例えば、エチルメタンスルホン酸(EMS)、メチルメタンスルホン酸(MMS)、硫酸ジエチル(DES)、およびニトロソグアニジン(NTG、NG、MMG)]、DNAインターカレーター(例えば、臭化エチジウム)、亜硝酸、塩基類似体、ブロモウラシル、トランスポゾンなどを用いた処理によって、さらなる遺伝的変異を導入することができる。

その代わりとして、または選択圧に加えて、許容可能な(すなわち、非選択的な)条件下で増殖させた後に、様々な代謝標識試験(放射能を含む)、生化学的分析(ミカエリス・メンテン)、ガスクロマトグラフィー質量分析(GC/MS)、質量分析、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF)、キャピラリー電気泳動(CE)、および高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)を介して、特定の産物の産生量を測定することによって、経路活性をモニタリングすることができる。

発酵方法
高光合成生物からの産物の産生および単離は、特定の発酵法を使用することによって強化することができる。産生を最大にしながら、費用を少なくする必須の要素は、このような産物に変換される炭素源のパーセントを高めることである。炭素原子は、正常な細胞生活環の間に、脂質、糖類、タンパク質、および核酸の産生を含む細胞機能に進む。産物に関連しない活性に必要な炭素の量を減らすことによって、産生物の産生の効率を高めることができる。これは、最初に、微生物を望ましい密度まで増殖させることによって実現する。好ましい密度は、対数増殖期のピークに達した密度であろう。このような時点で、細胞増殖を止めるように複製チェックポイント遺伝子を利用することができる。具体的には、クオラムセンシング機構(Camilli, A. and Bassler, B.L Science 311:1113; Venturi, V. FEMS Microbio Rev 30: 274;およびReading, N.C. and Sperandio, V. FEMS Microbiol Lett 254:1において概説される)を使用して、遺伝子、例えば、p53、p21、または他のチェックポイント遺伝子を活性化することができる。大腸菌の細胞複製および細胞増殖を止めるために活性化することができる遺伝子には、umuDC遺伝子が含まれる。この遺伝子が過剰発現されると、対数期から進行が止まり定常増殖になる(Murli, S., Opperman, T., Smith, B.T., and Walker, G.C. 2000 Journal of Bacteriology 182: 1127.)。UmuCは、ほとんどのUV変異誘発および化学変異誘発の機構基礎である非コード損傷にわたって損傷乗り越え合成を行うことができるDNAポリメラーゼである。umuDC遺伝子産物は、損傷乗り越え合成プロセスに必要であり、DNA損傷チェックポイントとしても役立つ。UmuDC遺伝子産物には、UmuC、UmuD、umuD’、UmuD’₂C、UmuD’₂およびUmuD₂が含まれる。同時に、これらの産物合成遺伝子が活性化され、従って、産物が作られると同時に、使用される重要な複製経路および維持経路の必要が最小限になる。

または、細胞増殖および産物産生は同時に達成することができる。この方法では、細胞はバイオリアクター内で増殖され、投入物は連続して供給され、産物は連続して取り出される。バッチ、フェドバッチ、および連続発酵が一般的であり、当技術分野において周知であり、例は、Thomas D. Brock in Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass.、またはDeshpande, Mukund V., Appl. Biochem. Biotechnol (1992), 36:227において見出される。

全ての産生方法において、投入物には、二酸化炭素、水、および光が含まれる。二酸化炭素は大気に由来してもよく、石炭プラント、精製所、セメント製造施設、天然ガス施設、醸造所などからの排ガスまたは煙道ガスを含む高濃度の供給源に由来してもよい。水は、無塩でもよく、低塩分でもよく、海の水でもよく、高塩分でもよい。光は、太陽光でもよく、白熱灯、LED、光ファイバー、および蛍光灯を含む人工光源でもよい。

集光性生物は、その生産性が、太陽の照射が集光性生物の光化学系を活性化するのに十分な時に限定されない。好ましい集光性生物バイオプロセスでは、細胞は、エネルギー駆動装置として光を用いて増殖および産物の産生を可能にする。十分な光が無ければ、細胞は、中心的な代謝速度を最小限にするように誘導することができる。この目的で、選択された産物の中にエネルギーを貯蔵して細胞を動かすように、産物の産生に特異的な誘導性プロモーターを強く刺激することができる。十分な誘導力があれば、細胞は増殖の労力を最小限にし、集光からの蓄えを、特異的に産物の産生のために使用する。それにもかかわらず、光子が全く捕獲されないか、ほとんど捕獲されない十分な光を欠く時に、正味の生産性は最小になると予想される。

好ましい態様において、細胞は、最終産物が細胞から放出されるように操作される。最終産物が細胞から放出される態様では、連続法を使用することができる。このアプローチでは、所望の産物を産生する生物を含むリアクターを、複数の手法で組み立てることができる。1つの態様において、リアクターは連続してまとめて操作され、培地の一部は取り出され、水性産物が自己分離し、取り出された産物および残りが発酵チャンバーに戻されるように、あまり攪拌されない環境内で保持される。産物が分離して水相に入らない態様では、培地が取り出され、適切な分離法(例えば、クロマトグラフィー、蒸留など)が用いられる。

別の態様において、産物は細胞から分泌されない。この態様において、フェドバッチ発酵アプローチが用いられる。このような場合、反応チャンバーが細胞および産物で飽和するまで、細胞は、前記のように投入物(光、水、および二酸化炭素)に連続して曝露された状態で増殖される。培養物の大部分〜全てが取り出され、細胞が溶解され、適切な分離法(例えば、クロマトグラフィー、蒸留、濾過、遠心分離など)によって、産物が単離される。

好ましい態様において、発酵チャンバーは、連続した還元的発酵を受けている発酵物を密閉している。この場合、安定した還元環境が作り出される。電子の平衡は、二酸化炭素(気体の形をしている)を放出することによって維持される。前記のように、NAD/HおよびNADP/H平衡の増加もまた、電子の平衡の安定化に役立ち得る。

遺伝子および細胞産物の検出および分析
本発明の改変生物によって産生された産物のレベルおよび同一性を分析するために、ガスクロマトグラフィー-質量分析、および液体クロマトグラフィー-質量分析、HPLC、キャピラリー電気泳動、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析などの任意の標準的な分析方法を使用することができる。

高光合成細胞において新たな機能的生化学経路が形成したことを検出できることは、本方法の実施にとって重要である。一般的に、前記のアッセイは、例えば、新規合成経路の一部として、または宿主細胞環境において異所的に供給される分子の化学修飾によって有機低分子などを産生する、宿主細胞の異種の生化学的変換反応を検出するために行われる。宿主細胞による、このような分子の生成は「試験抽出物」中で検出されてもよい。「試験抽出物」は、条件培地、細胞溶解産物、細胞膜、またはその半精製もしくは精製された分画産物でもよい。最後のものは、前記のように、相分離、クロマトグラフィー分離、または溶媒分画(例えば、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、テトラヒドロフラン(THF)、アセトニトリル、ベンゼン、エーテル、炭酸水素塩、ジクロロメタン、クロロホルム、石油エーテル、ヘキサン、シクロヘキサン、ジエチルエーテルなど)を含む古典的な分画/精製法によって調製することができる。細胞断片ではなく細胞全体に及ぼす宿主細胞によって生じた活性の影響を試験するために、レスポンダー細胞を用いてアッセイがセットアップされた場合、宿主細胞および試験細胞は共培養されてもよい(任意で、カルチャーインサート、例えば、Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA, カタログ番号40446によって分離されてもよい)。

ある特定の態様において、アッセイは、化学的技法または測光法によって、組換え宿主細胞の生合成経路によって産生(または破壊)された分子種を直接検出するようにセットアップされる。このような分子種の産生または分解は、少なくとも一部は、異種ゲノムDNAの発現に依存しなければならない。他の態様において、本方法の検出工程は、分画された培地/細胞溶解産物(試験抽出物)の特徴付け、または生化学的検出系もしくは生物学的検出系への試験抽出物の適用を伴う。他の態様において、アッセイは、宿主細胞における表現型変化を観察することによって、例えば、宿主細胞内の異種生合成経路の確立に依存したオートクライン様式で、異種経路の産物の形成を間接的に検出する。

ある特定の態様において、化合物の公知のクラスに関連する類似体、例えば、アルカロイド、アミノグリコシド、アンサマクロライド(ansamacrolide)、β-ラクタム(ペニシリンおよびセファロスポリンを含む)、カルバペネム、テルペノイド、プロスタノイドホルモン、糖、脂肪酸、リンコサミド、マクロライド、ニトロフラン、ヌクレオシド、オリゴ糖、オキサゾリジノン、ペプチドおよびポリペプチド、フェナジン、ポリエン、ポリエーテル、キノロン、テトラサイクリン、ストレプトグラミン、スルホンアミド、ステロイド、ビタミンおよびキサンチンの類似体を探す。このような態様では、天然物を直接同定および/または単離するための利用可能なアッセイがあり、このような条件下で類似体が同様に挙動すると予想されれば、本方法の検出工程は、細胞培地または細胞調製物において関心対象の類似体を直接検出する工程と同じくらい直接的なものであり得る。例えば、試験抽出物のクロマトグラフィー分離または他の生化学的分離が行われてもよく、類似体の有無は、公知の化合物が類似条件下で生じる画分中で、例えば、分光測定により検出される。ある特定の態様において、このような化合物は、培地および/または組換え細胞を分画する必要無く検出することができる特徴的な蛍光またはリン光を有することがある。

関連する態様において、試験試料と異種細胞(「試験細胞」)またはその成分を接触させることによって、全てのもしくは分画した培地または組換え宿主細胞からの溶解産物をアッセイすることができる。例えば、試験細胞は原核細胞または真核細胞でもよく、組換え宿主細胞からの条件培地(全てまたは分画)と接触され、条件培地が、試験細胞から生物学的応答または生化学的応答を誘導する能力が評価される。例えば、アッセイは、試験細胞における表現型変化を、例えば、遺伝子の転写速度もしくは翻訳速度またはスプライシングパターン;タンパク質の安定性;タンパク質、核酸、または脂質のリン酸化、プレニル化、メチル化、グリコシル化、または他の翻訳後修飾;セカンドメッセンジャー、例えば、cAMP、イノシトールリン酸の生成などの変化として検出することができる。このような作用は、例えば、細胞の特定成分を単離および研究することによって直接測定されてもよく、例えば、レポーター遺伝子発現、表現型マーカーの検出、および試験細胞に対する細胞傷害性活性または細胞分裂停止活性によって、間接的に測定されてもよい。

組換え宿主細胞によって産生された試験化合物の生理活性をスクリーニングする場合、細胞内セカンドメッセンジャーの生成を直接測定することができる。様々な細胞内エフェクターが同定されている。例えば、受容体またはイオンチャネルにより調節される事象の阻害剤または増強剤として、化合物または化合物をコードする遺伝子を単離することを目的としたスクリーニングの場合、下流シグナル伝達タンパク質、例えば、アデニリルシクラーゼ、ホスホジエステラーゼ、ホスホイノシチダーゼ、ホスホイノシトールキナーゼ、およびホスホリパーゼからの、セカンドメッセンジャーの生成レベルを検出することができ、様々なイオンの細胞内レベルも同様に検出することができる。

さらに他の態様において、検出可能なシグナルは、セカンドメッセンジャー、例えば、カルシウム、イノシトールリン酸の加水分解産物、cAMPなどの濃度に活性が依存する酵素プローブまたは発色/蛍光プローブを用いて発生してもよい。

多くのレポーター遺伝子および転写調節エレメントが当業者に公知であり、他のレポーター遺伝子および転写調節エレメントは、当業者に公知の方法によって同定または合成することができる。レポーター遺伝子の例には、CAT(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ)(Alton and Vapnek (1979), Nature 282: 864-869)、ルシフェラーゼ、および他の酵素検出系、例えば、β-ガラクトシダーゼ;ホタルルシフェラーゼ(deWet et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7:725-737);細菌ルシフェラーゼ (Engebrecht and Silverman (1984), PNAS 1: 4154-4158; Baldwin et al. (1984), Biochemistry 23: 3663-3667);アルカリホスファターゼ(Toh et al. (1989) Eur. J. Biochem. 182: 231-238, Hall et al. (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2: 101)、ヒト胎盤分泌アルカリホスファターゼ(Cullen and Malim (1992) Methods in Enzymol. 216:362-368);β-ラクタマーゼまたはGSTが含まれるが、これに限定されない。

レポーター遺伝子構築物において使用するための、または指標遺伝子のゲノム遺伝子座を改変するための転写制御エレメントには、プロモーター、エンハンサー、ならびにリプレッサーおよびアクチベーター結合部位が含まれるが、これに限定されない。適切な転写調節エレメントは、発現が迅速に誘導される、概して、発現が、細胞表面タンパク質と、細胞表面タンパク質の活性を調整するエフェクタータンパク質が接触して数分以内に誘導される、遺伝子の転写調節領域に由来してもよい。このような遺伝子の例は、最初期遺伝子(Sheng et al. (1990) Neuron 4: 477-485を参照されたい)、例えば、c-fosが含まれるが、これに限定されない。最初期遺伝子は、リガンドと細胞表面タンパク質が結合すると迅速に誘導される遺伝子である。遺伝子構築物における使用に好ましい転写制御エレメントには、最初期遺伝子に由来する転写制御エレメント、最初期遺伝子の特徴の一部もしくは全てを示す他の遺伝子に由来するエレメント、または機能的に連結された遺伝子がこのような特徴を示すように構築された合成エレメントが含まれる。転写制御エレメントが得られる好ましい遺伝子の特徴には、静止状態の細胞において低発現または検出不可能に発現されること、細胞外刺激の数分以内に転写レベルが迅速に誘導されること、一過的な、かつ新たなタンパク質合成とは無関係に誘導され、後の転写停止が新たなタンパク質合成を必要とすること、これらの遺伝子から転写されるmRNAsの半減期が短いことが含まれるが、これに限定されない。これらの特性の全てが存在する必要はない。

さらに他の態様において、検出工程は、無細胞系、例えば、細胞溶解産物または精製もしくは半精製されたタンパク質もしくは核酸調製物の形で設けられる。組換え宿主細胞から得られた試料を、タンパク質間相互作用、タンパク質-核酸相互作用、タンパク質-リガンド相互作用、核酸-核酸相互作用などが関与する、このような2つ一組の複合体(「標的複合体」)を阻害するまたは増強するような活性について試験することができる。アッセイは、例えば、複合体の一方または両方の分子に関連する内因活性または異種活性によって、標的複合体の獲得または損失を検出することができる。

無細胞系、例えば、精製または半精製されたタンパク質を用いて得ることができる無細胞系において行われるアッセイは、分子標的が試験試料と接触された時に、迅速に進展し、分子標的変化を比較的容易に検出できるように作製できるので、「一次」スクリーニングとして好ましいことが多い。さらに、試験試料の細胞毒性の影響および/またはバイオアベイラビリティは、インビトロ系では一般的に無視することができ、その代わりに、アッセイは、主に、他の分子との結合親和性の変化または分子標的の酵素的特性(該当する場合)の変化において明らかな場合があるように、分子標的に及ぼす試料の影響に焦点を当てている。2つ一組の複合体の検出および定量は、複合体の形成の阻害(または増強)における試験試料の効力を求める手段を提供する。化合物の効力は、様々な濃度の試験試料を用いて得られたデータから用量反応曲線を作成することによって評価することができる。さらに、比較のためのベースラインを得るために、対照アッセイも行うことができる。例えば、対照アッセイでは、非形質転換宿主細胞からの条件培地を添加することができる。

標的複合体の量は様々な技法によって検出することができる。例えば、複合体形成の調整は、例えば、検出可能に標識された(例えば、放射標識された、蛍光標識された、もしくは酵素標識された)タンパク質などを用いて、イムノアッセイによって、またはクロマトグラフィー検出によって定量することができる。

さらに他の態様において、精製または半精製された酵素を用いて、試験試料をアッセイすることができる。酵素活性を阻害または増強する試験試料の能力は、都合よく、その酵素の基質の変換速度を追跡することによって検出することができる。

さらに他の態様では、検出工程は、異種ゲノム配列の発現の副産物が誘導された宿主細胞における表現型変化を検出するように設計することができる。前述の細胞をベースとするアッセイ形式の多くはまた、宿主細胞において、例えば、オートクラインに似た様式で使用することもできる。

検出工程は、組換え宿主細胞によって産生された生物学的に活性な分子を単離するための基礎となることに加えて、関心対象の生合成経路をコードする遺伝子を含むゲノムクローンを同定するのにも使用することができる。さらに、このような検出工程に頼る反復性のおよび/またはコンビナトリアルなサブクローニング法によって、検出された経路を付与する個々の遺伝子を、より大きなゲノム断片からクローニングすることができる。

本スクリーニング方法は、例えば、ヒト成分を用いて得られた検出アッセイの試験試料の効力と、例えば、真菌成分または細菌成分から得られた検出アッセイの効力を比較する、ディファレンシャルな形式で行うことができる。従って、殺菌剤または殺真菌剤としての選択性が選択プロトコールにおける判断基準でもよい。

宿主株は、本方法が成功するために高レベルの新規化合物を産生する必要はない。遺伝子の発現は最適でなくてもよく、包括的な調節因子が存在しなくてもよく、代謝産物プールが産物の最大産生を支持しなくてもよい。代謝産物を検出する能力は、多くの場合、特に、バイオアッセイが少量の天然物に対して感度がある場合、最大レベルの産生を必要としない。従って、最大下での初期の化合物産生が、本方法の成功に対する制限である必要はない。

最後に、前記のように、試験試料は、例えば、条件培地または細胞溶解産物から得られてもよい。後者に関して、ある特定の場合では、宿主細胞から適切に排出されてなくてもよい異種発現化合物があってもよいことが予期される。細胞溶解のために、当技術分野において利用可能な様々な技法がある。好ましいアプローチ、すなわち、宿主細胞特異的な溶解因子の使用は本発明の別の局面である。例えば、ファージ(例えば、P1、λ、φ80)を使用して、大腸菌を選択的に溶解することができる。同様に、ラン藻類ファージを使用して、ラン藻類、例えば、シネココッカス属およびプロクロロコッカス属(Prochlorococcus)を選択的に溶解することができる。このようなファージを、増殖した宿主細胞培養物に添加すると、細胞内の新たな生合成経路の異種産物への接近を最大にすることができる。さらに、このような因子は、宿主細胞ライブラリーと共に共培養され得る、試験生物、例えば、ヒト細胞の増殖を妨害しない。

代謝最適化
最適化プロセスの一部として、本発明はまた、炭素およびエネルギーを消費し得るが、有用な産物(例えば、炭化水素、ワックスエステル、界面活性剤、および他の炭化水素産物)を産生しない望ましくない副反応がもしあれば、これを排除する工程を提供する。これらの工程は、望ましい産物の収率を改善するのに役立つ可能性がある点で有益であり得る。

異なるアプローチの組み合わせが用いられてもよい。このようなアプローチには、例えば、メタボロミクス(細胞内に蓄積する望ましくない産物および代謝中間体を同定するのに用いられ得る)、代謝モデリングおよび同位体標識(炭化水素産生に寄与する代謝反応を介したフラックスを確かめる)、ならびに従来の遺伝的技法(不要な代謝反応を排除する、または実質的に無能にする)が含まれる。例えば、代謝モデリングは、細胞の代謝経路を介したフラックスを定量し、重要な代謝段階の排除の影響を確かめる手段を提供する。さらに、メタボロミクスおよび代謝モデリングによって、望ましい産物の産生に及ぼす重要な代謝段階の排除の影響をさらに深く理解することができる。

特定の代謝操作が望ましい産物の細胞代謝および合成にどのように影響を及ぼすかを予測するために、公知の細胞代謝経路を介したモル流束(molar flux)を説明する理論フレームワークが開発された。この理論フレームワークのいくつかの重要な局面には、(i)公知の経路の比較的完全なデータベース、(ii)細胞組成物およびエネルギー要件の増殖速度に依存する組込み、(iii)異なる増殖速度および希釈率でのタンパク質のアミノ酸組成および膜の脂肪酸組成の実験測定、ならびに(iv)代謝操作の結果として生じることが知られている副反応の実験測定が含まれる。これらの新たな開発によって、重要な代謝経路におけるフラックスおよび酵素活性の調節をより正確に予測することが可能になる。

このようなタイプのモデルは、例えば、廃水処理リアクター内で、強化された生物学的リン除去を担う生物、およびポリケチド産生糸状菌における代謝フラックスを分析するために適用されている。例えば、

を参照されたい。

産物
本発明における高光合成生物は、生物学的糖、炭化水素産物、固形、および薬を含むが、これに限定されない産物カテゴリーを生じるように操作することができる。

生物学的糖には、グルコース、デンプン、セルロース、ヘミセルロース、グリコーゲン、キシロース、デキストロース、フルクトース、ラクトース、フルクトース、ガラクトース、ウロン酸、マルトース、およびポリケチドが含まれるが、これに限定されない。好ましい態様において、生物学的糖は、グリコーゲン、デンプン、またはセルロースでもよい。

セルロースは、陸生生体バイオマスの最も豊富な形態である(Crawford, R. L. 1981. Lignin biodegradation and transformation, John Wiley and Sons, New York.)。セルロース、特に、コットンリンターはニトロセルロース製造に用いられる。セルロースはまた、紙の主要な構成成分でもある。セルロース単量体(β-グルコース)は、1,4グリコシド結合を介して連結される。セルロースは直鎖である(コイルは生じない)。ミクロフィブリル中で、複数の水酸基(hydroxide group)が互いに水素結合しており、これは、鎖を堅固に保ち、高い引張り強度の一因となっている。セルロース材料があるとして、20℃の17.5％水酸化ナトリウム溶液に溶解しない部分は、真のセルロースであるαセルロースである。溶解し、次いで、酸性化によって沈殿する部分はβセルロースである。溶解するが、沈殿しない部分はγセルロースである。ヘミセルロースは、数種類のヘテロポリマーのうちのいずれでもよい植物細胞壁多糖の一つのクラスである。これらには、キシラン、キシログルカン、アラビノキシラン、アラビノガラクタン、グルクロノキシラン、グルコマンナン、およびガラクトマンナンが含まれる。このクラスの多糖は、ほとんど全ての細胞壁においてセルロースと共に見出される。ヘミセルロースはセルロースより重量が小さく、温水またはキレート剤によって抽出することはできないが、アルカリ水溶液によって抽出することができる。ポリマー鎖はペクチンおよびセルロースに結合して、架橋繊維の網目を形成する。

本質的に3つのタイプの炭化水素産物:(1)少なくとも1つの芳香環を有する、芳香族炭化水素産物;(2)二重結合、三重結合、または芳香族結合の無い、飽和炭化水素産物;および(3)炭素原子間の1つまたは複数の二重結合または三重結合を有する、不飽和炭化水素産物がある。「炭化水素産物」は、C、H、任意でOからなり、炭素骨格に水素原子および酸素原子が結合している化合物とさらに定義されてもよい。酸素は骨格に単結合または二重結合していてもよく、水素が結合していてもよい。エーテルおよびエステルの場合、酸素は骨格に組み込まれていてもよく、炭素鎖に2つの単結合によって連結されてもよい。1個の炭素原子が1つまたは複数の酸素原子に結合してもよい。炭化水素産物はまた、前記の化合物が、タンパク質、コエンザイムAおよびアセチルコエンザイムAを含む生物学的薬剤に結合していてもよい。炭化水素産物には、炭化水素、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、エーテル、エステル、カロテノイド、およびケトンが含まれるが、これに限定されない。

炭化水素産物には、アルカン、アルケン、アルキン、ジエン、イソプレン、アルコール、アルデヒド、カルボン酸、界面活性剤、ワックスエステル、ポリマー化学物質[ポリフタレートカーボネート(PPC)、ポリエステルカーボネート(PEC)、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)、ポリ-β-ヒドロキシ酪酸(PHB)、ポリラクチド(PLA)、およびポリカプロラクトン(PCL)]、モノマー化学物質[プロピレングリコール、エチレングリコール、および1,3-プロパンジオール、エチレン、酢酸、酪酸、3-ヒドロキシプロパン酸(3-HPA)、アクリル酸、およびマロン酸]、ならびにその組み合わせも含まれる。ある好ましい態様では、炭化水素産物は、アルカン、アルコール、界面活性剤、ワックスエステル、およびその組み合わせである。他の炭化水素産物には、脂肪酸、アセチル-CoA結合炭化水素、アセチル-CoA結合炭水化物、およびポリケチド中間体が含まれる。

組換え生物は、広範囲のサイズにわたる炭化水素産物および中間体を産生するように操作することができる。産生することができる特定のアルカンには、例えば、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカン、およびオクタデカンが含まれる。好ましい態様において、炭化水素産物は、オクタン、デカン、ドデカン、テトラデカン、およびヘキサデカンである。産生することができる炭化水素前駆体、例えば、アルコールには、例えば、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプタデカノール、およびオクタデカノールが含まれる。より好ましい態様において、アルコールは、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、およびデカノールより選択される。

界面活性剤は、洗剤および洗浄剤を含めて様々な製品に用いられており、また、織物、革、紙の添加剤として、化学プロセスにおいて、化粧品および薬において、食品産業および農業において用いられる。さらに、界面活性剤は、環境にアクセスすることが難しいと分かっている原油の抽出および単離を助けるために、または水エマルジョンとして用いられることがある。用途の違いによって特徴付けられる、4つのタイプの界面活性剤がある。陰イオン界面活性剤は洗剤様活性を有し、一般的に、洗浄用途に用いられる。陽イオン界面活性剤は長鎖炭化水素を含有し、多くの場合、タンパク質を処理するのに用いられ、合成ポリマーは、柔軟仕上げ剤およびヘアコンディショナーの成分である。両性界面活性剤も長鎖炭化水素を含有し、典型的にはシャンプーに用いられる。非イオン界面活性剤は一般的に洗浄用製品に用いられる。

さらに、炭化水素はバイオ燃料として産生されることがある。バイオ燃料は、生物学的供給源-最近まで生きていた生物またはその代謝副産物、例えば、牛のふんに由来する任意の燃料である。バイオ燃料は、生物の代謝産物に由来する燃料とさらに定義されてもよい。好ましいバイオ燃料は、バイオディーゼル、バイオ原油(biocrude)、エタノール、「再生可能な石油(renewable petroleum)」、ブタノール、およびプロパンを含むが、これに限定されない。

固形炭素には、例えば、石炭、黒鉛、グラフェン、セメント、カーボンナノチューブ、カーボンブラック、ダイアモンド、および真珠が含まれる。石炭およびダイアモンドなどの純粋な炭素固体が好ましい固形である。

例えば、イソプレノイドベースのタキソールおよびアルテミシニン、またはオセルタミビルを含めて、薬を産生することができる。

プラスミド構築
pJB5ベースプラスミドの構築
シネココッカス属の種PCC7002への組換えのために、pJB5ベースプラスミドを空の発現ベクターとして設計した。2つの相同性領域である上流相同性領域(UHR)および下流相同性領域(DHR)を、関心対象のクローニングされた遺伝子に隣接するように設計した。これらの500bp相同性領域は、それぞれ、天然プラスミドpAQ1(GenBankアクセッションNC_005025)上のUHRおよびDHRの位置3301-3800および3801-4300に対応する。組み込まれた構築物にスペクチノマイシン耐性およびストレプトマイシン耐性を付与するために、aadAプロモーター、遺伝子配列、およびターミネーターを設計した。発現用に、aph2カナマイシン耐性カセットプロモーターおよびリボソーム結合部位(RBS)を用いて、pJB5を設計した。このプロモーターおよびRBSの下流に、本発明者らは、NdeIおよびEcoRIの制限エンドヌクレアーゼ認識部位、ならびにXhoI部位、BamHI部位、SpeI部位、およびPacI部位を設計および挿入した。EcoRI部位の後に、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)(adhII)ターミネーターからの、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来の天然ターミネーターを含めた。便利なXbaI制限部位がUHRおよびDHRに隣接するので、組換えしようとするDNAを、ベクターの残りから切断することができる。pJB5、pJB6、およびpJB7は、DNA2.0(Menlo Park, CA)が構築した。

pJB161ベースプラスミドの構築
pJB5ベースプラスミドを補うために、pJB161ベースプラスミドを設計したが、2つの遺伝子を同時にシネココッカス属の種PCC7002に組み込むために異なる組込み部位および耐性マーカーがある。pJB5に由来するUHRおよびDHRを、シネココッカス属の種PCC7002の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子に隣接する領域と置換した。新たなldh-UHRおよびldh-DHRをPCR増幅した。これらは、それぞれ、lac-UHRおよびlac-DHRの、天然プラスミドpAQ7(GenBankアクセッションNC_0104774)上の位置185990-77および184333-184913に対応する。PCRに使用したプライマーは、以下の通り:
:lac-UHR用フォワードプライマー-

、lac-UHR用下流プライマー-

;lac-DHR用上流プライマー-

、lac-DHR用下流プライマー-

であった。lac-UHR用上流プライマーによってSbfI制限エンドヌクレアーゼ部位が付加され、lac-UHR用下流プライマーによってNotI制限部位が付加され、lac-DHR用上流プライマーによってAscI制限部位が付加され、lac-DHR用下流プライマーによってFseI制限部位が付加された。高忠実度Phusion DNA Polymerase Master Mix(New England Biolabs, Beverly, MA)を用いて、相同性領域を、シネココッカス属の種PCC7002ゲノムDNAから増幅した。増幅されたldh-DHR領域およびpJB5プラスミドを、FseIおよびAscI(New England Biolabs)制限エンドヌクレアーゼを用いた周知の実験法を用いて個々に消化した。結果とした生じたDNA断片を、公表された技法から逸脱することなく、1％TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Isolation Kit(Qiagen)を用いて精製し、Quick Ligation Kit(New England Biolabs)を用いて連結した。連結された産物により、標準的な技法を用いて、化学的にコンピテントなEPI400(EpiCentre(登録商標))細胞を形質転換し、連結された産物をPCRによって確認した。結果とした生じたプラスミドを、ldh-UHR領域を組み込むために、もう1回クローニングに供した。増幅されたldh-UHR領域および新たに構築されたプラスミドを、SbfIおよびNotI(New England Biolabs)制限エンドヌクレアーゼを用いた周知の実験法を用いて個々に消化した。両消化物を、公表された技法から逸脱することなく、1％TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Isolation Kit(Qiagen)を用いて精製し、Quick Ligation Kit(New England Biolabs)を用いて連結した。連結された産物により、標準的な技法を用いて、化学的にコンピテントなEPI400細胞(EpiCentre)を形質転換し、連結された産物をPCRによって確認した。結果とした生じたプラスミド、pJB165を、PCRおよび制限消化によって確認した。

最後に、組み込まれた構築物の耐性マーカーを変えるために、クローニングベクターpMAKK76(アクセッション番号:U08460)からのカナマイシン耐性カセットを、PacI制限部位およびAscI制限部位がそれぞれ遺伝子の5’末端および3’末端に隣接するように設計した。カセットはDNA2.0(Menlo Park, CA)が構築した。このカセットとpJB165を、PacIおよびAscI(New England Biolabs)制限エンドヌクレアーゼを用いた周知の実験法を用いて個々に消化した。両消化物を、公表された技法から逸脱することなく、1％TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Isolation Kit(Qiagen)を用いて精製し、Quick Ligation Kit(New England Biolabs)を用いて連結した。連結された産物により、標準的な技法を用いて、化学的にコンピテントなEPI400細胞(EpiCentre)を形質転換した。結果とした生じたプラスミドpJB161を、PCRによって、および形質転換コロニーの抗生物質カナマイシン耐性によって確認した。

pJB5-PdcAdhIIおよびJCC136の構築
以下の手順を用いて、ピルビン酸デカルボキシラーゼ(pdc)およびアルコールデヒドロゲナーゼ(adhII)遺伝子をpJB5プラスミドにクローニングした。ザイモモナス・モビリス(GenBank:DD161475、M15394)からのpdc-adhII遺伝子を、NdeI部位がpdcコード領域の開始に取って代わるように設計した。pdc遺伝子の後に、本発明者らは、2つの制限エンドヌクレアーゼ部位(XhoIおよびBamHI)を設計した。次に、adhII配列全体を制限部位の後に設計し、最後に、挿入されたEcoRI部位の下流に天然adhIIターミネーターも含めた。この構築物はDNA2.0(Menlo Park, CA)が構築し、pJB5およびインサート上でのNdeIおよびEcoRI(New England Biolabs; Ipswitch、MA)による制限消化によって挿入し、その後に、Quick Ligation Kit(New England Biolabs;Ipswitch, MA)を用いて連結した。連結された構築物により、NEB5αF’Iqコンピテント大腸菌(高効率)(New England Biolabs: Ipswitch, MA)を形質転換した。

標準的な手順を用いた、pJB5-PdcAdhIIによるシネココッカス属の種PCC7002の形質転換
簡単に述べると、シネココッカス属の種PCC7002を、Frigaard NU et al. (2004)「Gene inactivation in the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002 and the green sulfur bacterium Chlorobium tepidum using in vitro-made DNA constructs and natural transformation」 Methods Mol Biol 274:325-340に記載のA⁺培地を含む、30℃、1％CO₂でインキュベートされた振盪フラスコ中で、OD₇₃₀1.0まで48時間、コロニーから増殖させた。培養物500μLを、各構築物についてQiagen Qiaprep Spin Miniprep Kit(Valencia, CA)から調製した1〜5μgのDNA 30μLを含む試験管に添加した。細胞を、約1バブル/2秒で1％CO₂を通気しながら4時間インキュベートした。細胞200μLを、1.5％Bactoアガーを含むA⁺培地プレート上にプレートし、低照度で30℃で2日間増殖させた。最終濃度が10μg/mLとなるように、スペクチノマイシンを下層においた。耐性コロニーは7〜10日間生存した。コロニーをPCRによってスクリーニングした。結果とした生じた株をJCC136と名付けた。

pJB263ベースプラスミドの構築
pJB263ベースプラスミドをpJB5と同様に構築したが、これは、シネコシスティス属の種PCC6803のglgA遺伝子(アクセッション番号:NP_441947)の組込みおよび置換のために構築した。シネコシスティス属の種PCC6803のglgA遺伝子の750bp上流および下流に、glgA-UHRおよびglgA-DHRを設計した。これらは、それぞれ、染色体上の2266647〜22667396および2264463〜2265212の(-)鎖(アクセッション番号:NC_000911)に対応する。glgA-UHRおよびglgA-DHRは、SbfIおよびNotI制限エンドヌクレアーゼ部位ならびにPacIおよびAscI制限エンドヌクレアーゼ部位が隣接し、後で、これらの間で消化しやすくなるように配列スペーサーを付けて設計した。この構築物はDNA2.0(Menlo Park, CA)が構築した。このカセットとpJB5-PdcAdhIIを、NotIおよびAscI(New England Biolabs)制限エンドヌクレアーゼを用いた周知の実験法を用いて個々に消化した。両消化物を、公表された技法から逸脱することなく、1％TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Isolation Kit(Qiagen)を用いて精製し、Quick Ligation Kit(New England Biolabs)を用いて連結した。連結された産物により、標準的な技法を用いて、化学的にコンピテントなEPI400細胞(EpiCentre)を形質転換した。結果とした生じたプラスミドpJB263を、PCRによって、および形質転換コロニーの抗生物質スペクチノマイシン耐性によって確認した。

実施例
本明細書において提供される実施例は、本発明をさらに詳細に例示する。これらの実施例は、当業者が本発明の様々な局面を理解および実施する助けとなるように提供され、従って、限定するものであると解釈すべきでない。本明細書に記載のものに加えて、本発明の様々な変更および拡張は当業者に明らかであり、従って、このような変更および拡張は本発明の範囲内にある。

実施例1:光捕獲の改善
光合成生物は、光を効率的に捕獲する精巧な方法を進化させてきた。この方法は、しばしば、光合成生物の自然生息地を制限している。真核生物の光独立栄養生物は、光エネルギーを捕獲し、光合成反応中心に送る集光性複合体(LHC)として知られる、クロロフィルおよびカロテノイド結合タンパク質のスーパーファミリーをコードする[Green BR and Durnford DG. 「The chlorophyll-carotenoid proteins of oxygenic photosynthesis.」 Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol (1996).47:685-714]。クロロフィル分子は、具体的には、いわゆる「アンテナ」構造で並べられている。反応中心1個あたりのクロロフィル分子の数は、光化学系II(PSII)では反応中心1個あたり350超のクロロフィルaおよびクロロフィルb分子、ならびに光化学系I(PSI)では300のクロロフィルa分子を含めて、大幅に異なる場合がある。アンテナは、全く新しいタンパク質ベースの反応中心および付随する電子輸送系を作る必要なく光吸収スペクトルを高める手段を提供する。大きなアンテナは、自然において生物に生存上の利益をもたらす。しかしながら、高い光強度の条件下では、大きなアンテナは過剰な光子を吸収し、蛍光または熱として無駄に放散しなければならない。一重項状態の励起クロロフィル分子を安全に放散し損なうと、極めて有害な活性酸素種である一重項酸素が形成することがある[Muller P, Li X, Niyogi KK. 「Non-photochemical quenching. A response to excess light energy.」Plant Physiology (2001). 125:1558-66]。

生物は、天然では、光条件の変化に対する適応応答としてクロロフィルアンテナサイズを大きくする、または小さくする[Falkowski PG and Owens TG. 「Light-shade adaptation.」 Plant Physiol (1980). 66:592-595; Ballottari M, Dall’Osto L, Morosinotto T, and Bassi R. 「Contrasting behavior of higher plant photosystem I and II antenna systems during acclimation.」 J Biol Chem (2007). 282(12):8947-58]。

最近、tla1

またはLHCタンパク質ファミリー全体[Mussgnug JH, Thomas-Hall S, Rupprecht J, Foo A, Klassen V, McDowall A, Schenk PM, Kruse O, and Hankamer B. 「Engineering photosynthetic light capture: impacts on improved solar energy to biomass conversion.」 (2007). 5(6):802-14]を下方制御することによって、微細藻類の通常は動的なアンテナサイズを遺伝的に永久に縮めることができることが証明された。より小さなアンテナを有する株は、特に、高光束下では、細胞遮光(cell shading)の低下および生産性の向上を示す。

緑色硫黄光合成細菌および緑色非硫黄光合成細菌の集光性アンテナであるクロロソームは、特殊化したリポタンパク質区画、典型的には、バクテリオクロロフィル(BChl)c、BChla、カロテノイド、およびキノンを含む区画である[Frigaard NU, Li H, Milks KJ, and Bryant DA.「Nine mutants of Chlorobium tepidum each unable to synthesize a different chlorosome protein still assemble functional chlorosomes. J Bacteriol (2004). 186(3):636-53]。天然では、クロロソームは、極めて弱い光条件下での増殖を可能にするので、緑色細菌に大きな生存上の利益をもたらす。アンテナ構造は、BChlc合成酵素(bchK)を不活性化することによって排除することができる[Friggard NU, Voigt GD, and Bryant DA.「Chlorobium tepidum mutant lacking bacteriochlorophyll c made by inactivation of the bchK gene, encoding bacteriochlorophyll c synthase.」 J Bacteriol (2002). 184(12):3368-76]。このような変異体は、弱い光条件下では野生型対応物より約1/7の速さで複製するが、強い光強度下では部分的にしか損なわれない(約2.3倍)。

ラン藻類および赤色藻類の集光性アンテナであるフィコビリソームは、主に、フィコビリンタンパク質であるフィコエリトリン、フィコシアニン、およびアロフィコシアニンからなる[Grossman AR, Schaefer MR, Chiang GG, and Collier JL.「The phycobilisome, a light-harvesting complex responsive to environmental conditions.」 Microbiol Rev (1993). 57(3):725-49]。植物、藻類、および緑色細菌の集光性アンテナと同様に、フィコビリソームはラン藻類では完全に必要ない。

光独立栄養生物は、光エネルギーを、化学エネルギー(プロトン輸送力(PMF)により動くATP合成酵素を介して、ATPの形で)および還元力(NADPH)に変換するために光合成反応中心を常に利用しているが、古細菌ロドプシン様タンパク質(バクテリオロドプシン)によって例示されるように、光活性化プロトン移行系を用いる公知の光独立栄養生物はない[Oesterhelt D and Stoeckenius W. 「Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium.」 Nature New Biol (1971). 233(39):149-52]。それにもかかわらず、関連配列が、細菌において光駆動エネルギー発生(光従属栄養)を媒介することが明確に示されている。

本発明は、光独立栄養体における1つまたは複数の形の光駆動プロトンポンプの外因性発現が、光エネルギーをPMFに変換する並行手段を提供することによって生物効率を高めることを開示する。PMFは、膜を通過する分子の能動輸送を動かすか、または内因性もしくは外因性ATP合成酵素を介してATPを発生させるのに使用することができる。輸送は、細胞増殖間の全エネルギーの15〜25％を消費すると見積もられている[Stouthamer AH. 「A theoretical study on the amount of ATP required for synthesis of microbial cell material.」 Antonie Van Leeuwenhoek (1973). 39(3):545-65; Carruthers A. 「Mechanisms for the facilitated diffusion of substrates across cell membranes.」 Biochemistry (1991). 30(16):3898-906]。従って、光駆動プロトンポンプの発現は、光独立栄養生物に15〜25％までのエネルギー効率向上をもたらし、これは、倍加時間、CO₂固定速度、および/または炭素ベース産物形成の改善によって現れる。

プロテオロドプシン(PR)遺伝子が生物において優先的に発現される。例示的なPR配列は、Martinerz A, Bradley AS, Walbauer JR, Summons RE, DeLong EF. PNAS (2007).「Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host.」 104(13):5590-5595に記載の遺伝子座ABL60988である。

さらに、もしくはその代わりとして、バクテリオロドプシン遺伝子が発現される[Oesterhelt D, Stoeckenius W. Nature (1971) 「Rhodopsin-like protein from the purple membrane of Halobacterium halobium.」 233:149-152]。例示的なバクテリオロドプシン配列は、Ng WV et al. PNAS (2000).「Genome sequence of Halobacterium species NRC-1.」97(22):12176-22181に記載のNP_280292遺伝子座である。以前に、バクテリオロドプシンは、酵母ミトコンドリアにおいて機能的に発現されている [Hoffmann A, Hildebrandt V, Heberle J, Buldt G. 「Photoactive mitochondria: In vivo transfer of a light-driven proton pump into the inner mitochondrial membrane of Schizosaccharomyces pombe.」 Proc. Natl. Acad. Sci (1994). 91: 9637-71]。

同様に、これに加えて、もしくはその代わりとして、デルタロドプシン(deltarhodopsin)が発現される。

例示的なデルタロドプシン配列は、Ihara K et al. J Mol Biol (1999)「Evolution of the archael rhodopsins: evolution rate changes by gene duplication and functional differentiation.」285:163-174に記載の、ハロテリゲナ(Haloterrigena)の種のArg-4のAB009620 遺伝子座である。

同様に、他のプロトンポンプに加えて、もしくはその代わりとして、レプトスフェリア・マクランス(Leptosphaeria maculans)オプシンタンパク質が発現される。例示的な真核生物の光活性化プロトンポンプは、Waschuk SA, Benzerra AG, Shi L, and Brown LS. PNAS (2005). 「Leptosphaeria rhodopsin: Bacteriorhodopsin-like proton pump from a eukaryote.」102(19):6879-83]に記載の、レプトスフェリア・マクランスに由来するオプシン、アクセッション番号AAG01180である。

最後に、他のプロトンポンプに加えてもしくはその代わりとして、キサントロドプシンプロトンポンプとカロテノイドアンテナが発現される(Balashov SP, Imasheva ES, Boichenko VA, Anton J, Wang JM, Lanyi JK. Science (2005) 「Xanthorhodopsin: A proton pump with a light harvesting cartenoid antenna.」 309(5743): 2061-2064)。例示的なキサントロドプシン配列は、Mongodin EF et al. PNAS (2005). 「The genome of Salinibacter ruber: Convergence and gene exchange among hyperhalophilic bacteria and archaea.」102(50):18147-18152に記載のサリニバクター・ルーバー(Salinibacter ruber) DSM 13855に由来する遺伝子座ABC44767である。

これらのポンプは単独で、または組み合わせて用いられ、特定の細胞に最適化される。ポンプは、1つまたは複数の膜位置、例えば、細胞膜、外膜、ミトコンドリア膜、および/または葉緑体膜に組み込まれるようにすることができる。キサントロドプシンおよびプロテオロドプシンの同時発現が最適な組み合わせである。

前記の1つまたは複数のプロトンポンプの発現に加えて、レチナール生合成経路が発現される。PRおよびレチナール生合成オペロンが大腸菌において機能的に発現されると、ポンプは、アジド処理された大腸菌集団にプロトン輸送力を回復することができる[Walter JM, Greenfield D, Bustamante C, Liphardt J. PNAS (2007). 「Light-powering Escherichia coli with proteorhodopsin.」 104(7):2408-2412]。6遺伝子レチナール生合成オペロン、アクセッション番号 EF100190が公知であり(Martinerz A, Bradley AS, Walbauer JR, Summons RE, DeLong EF. PNAS (2007).「Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host.」 104(13):5590-5595)、アミノ酸配列イソペンテニル-二リン酸δ-イソメラーゼ(Idi)、遺伝子座ABL60982;15,15’-βカロチンジオキシゲナーゼ(Blh)、遺伝子座ABL60983;リコペンシクラーゼ(CrtY)、遺伝子座ABL60984;フィトエン合成酵素(CrtB)、EC2.5.1.32、遺伝子座ABL60985;フィトエンデヒドロゲナーゼ(CrtI)、遺伝子座ABL60986;およびゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素(CrtE)、遺伝子座ABL60987をコードする。

前記の6つの酵素は、全てのロドプシン関連プロトンポンプに共通にある必須の発色団であるレチナールの合成を可能にする。ある特定の態様において、キサントロドプシンポンプおよびC-40サリニキサンチンアンテナによって例示されるように、カロテノイドによって、さらなるスペクトル吸収が提供される。これらの態様において、βカロチンケトラーゼ(CrtO)、例えば、Mongodin EF et al (2005)に記載のサリニバクター・ルーバーのSRU_1502遺伝子座のcrtO遺伝子が発現される。他のcrtO遺伝子には、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)(AY705709)およびデイノコッカス・ラジオデュランス(Deinococcus radiodurans) R1 (NP_293819)に由来するものが含まれる。

ある特定の態様において、PMFをATPに最大限に変換するために、内因性または外因性のATP合成酵素(EC3.6.3.14)が過剰発現される。例示的なATP合成酵素は、大腸菌に由来するF₁-F₀ATP合成酵素である。膜結合F₀サブユニットは、膜結合型ATP合成酵素のF0セクター、サブユニットa(AtpB)、遺伝子座NP_418194;膜結合型ATP合成酵素のF0セクター、サブユニットc(AtpE)、遺伝子座NP_418193;および膜結合型ATP合成酵素のF0セクター、サブユニットb(AtpF)、遺伝子座NP_418192に示したアミノ酸配列からなる。触媒F₁サブユニットは、膜結合型ATP合成酵素のF1セクター、αサブユニット(AtpA)、遺伝子座NP_418190;膜結合型ATP合成酵素のF1セクター、εサブユニット(AtpC)、遺伝子座NP_418187;膜結合型ATP合成酵素のF1セクター、βサブユニット(AtpD)、遺伝子座NP_418188;膜結合型ATP合成酵素のF1セクター、γサブユニット(AtpG)、遺伝子座NP_418189;および膜結合型ATP合成酵素のF1セクター、δサブユニット、(AtpH)遺伝子座NP_418191に示したアミノ酸配列からなる。

好ましい態様では、適応、進化、または操作の前に、野生型生物より小さな集光性アンテナを含有するように以前に適応、進化、または操作された生物内において、1つまたは複数の細胞膜の状況で光駆動プロトンポンプが発現される。このような生物は、特に、高光束下で繁殖された時に、光エネルギーから細胞エネルギー、バイオマス、および産物への変換が他に類を見ないほど効率がよい。

光捕獲モジュールのプロテオロドプシンをコードするSAR86遺伝子の発現
本明細書で使用するSAR86プロテオロドプシン遺伝子(Beja, et al. (Science (2000) vol. 289: 1902-1906; GenBank: AF279106) は、Jessica WaltersおよびJan Liphardt(University of California, Berkeley)によって以前に構築および提供されたプラスミドから入手した。Walters-Liphardt宿主プラスミドは、βラクタマーゼカセットがSAR86プロテオロドプシン遺伝子を有するpBR322プラスミド誘導体である。Walters-Liphardtプラスミドから、フォワードプライマー

およびリバースプライマー

を含むPCRプライマーを用いて、プロテオロドプシン遺伝子を増幅した。PCR増幅は、高忠実度Phusion DNA Polymerase Master Mix (New England Biolabs, Beverly, MA)を用いて行った。フォワードプライマーによりNdeI制限認識部位が付加され、リバースプライマーにより停止コドンおよびMfeI制限認識部位が付加される。

増幅されたプロテオロドプシンPCR遺伝子産物をpJB5発現ベクター(「pJB5-PR」)に、NdeIおよびMfeI(New England Biolabs)制限エンドヌクレアーゼを用いた周知の実験法を用いてインサートおよびベクターを個々に消化することによってクローニングした。両消化物を、公表された技法から逸脱することなく、1％TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Isolation Kit(Qiagen)を用いて精製し、Quick Ligation Kit(New England Biolabs)を用いて連結した。連結された産物により、標準的な技法を用いて、化学的にコンピテントなEPI400細胞(EpiCentre)を形質転換し、これをPCRによって確認した。

シネココッカス属の種PCC7002を形質転換するために、pJB5-PRプラスミドストックを、Qiagenミニプレップキットを用いて精製した。1〜2マイクログラムのpJB5-PRプラスミドを、光学密度1まで増殖させたシネココッカス属の種PCC7002細胞に添加し、低強度軌道振盪および低照度光源を用いて37℃で4時間インキュベートした。次いで、細胞をA⁺固体培地プレート上にプレートし、照明付きインキュベーター(100〜250uE/m2/s、37℃)に1日間入れた。25マイクログラム/mLスペクチノマイシンをプレートの下層におき、コロニーが増殖するまでインキュベートした(約5日)。標的シネココッカス属宿主細胞への組込みは、「コロニーPCR」プロトコールによる全細胞ゲノムDNAのPCRによって確認した。簡単に述べると、約1mmコロニーを50μl脱イオン水に再懸濁し、5μlを、Phusion DNA Polymerase Master Mix(New England Biolabs, Beverly, MA)を用いる20μlの標準的PCR反応に使用した。標準的PCRサイクル条件の開始時には、2分98℃の変性段階を加えた。PCRは、コロニーの正しいバンドを示した。この株をJCC1-SAR86(図10、レーン5)と名付けた。

実施例2:CO₂固定の改善
独立栄養炭素固定を可能にする4つの公知の経路:3-ヒドロキシプロプリオン酸(hydroxyproprionate)(3-HPA)回路(クロロフレクサス・アウランチアカス(Chloroflexus aurantiacus)およびクレナルカエオタ・シムビオサム(Crenarchaeota symbiosum)によって用いられる)、還元的TCA回路(クロロビウム・テピダムによって用いられる)、還元的アセチルコエンザイムA経路(ウッド-ユングダール経路とも知られる;化学合成独立栄養体(chemolithoautotroph)、例えば、クロストリジウム・サーモアセチカム(Clostridium thermoaceticum)、メタノバクテリウム・サーマウトトロフィカム(Methanobacterium thermautotrophicum)、およびダスルフォバクテリウム・アウトロフィカム(Dusulfobacterium autotrophicum)によって用いられる)、ならびに還元的ペントースリン酸回路(カルビン回路とも知られる、植物、藻類、および全てのラン藻類によって用いられる)がある。定義により、全ての光独立栄養生物は、無機CO₂を、糖などの複雑な還元有機炭素分子に固定する能力を有する。

本発明は、野生型および/または変異体酵素の過剰発現を含む、宿主の内因性CO₂固定経路に機能改善を加えることによって、CO₂固定の速度および効率を改善する。または、もしくはさらに、宿主の内因性CO₂固定経路に1つまたは複数の外因性CO₂固定酵素または経路を加えることによって、機能改善が加えられる。

操作された生物は野生型対応物より速く複製する。タバコ葉における2つのカルビン回路酵素の過剰発現は、野生型植物と比較して成長を速めることが以前に示されている[Tamoi M, Nagaoka M, Yabuta Y, and Shigeoka S. 「Carbon metabolism in the Calvin cycle.」 Plant Biotechnology (2005). 22:355-360]。理論に拘束されるつもりはないが、内因性および/または外因性のCO₂固定酵素を改善すると、CO₂を生物学的中間体および炭素産物により速く変換することが可能になる。この変換は、光独立栄養生物の倍加時間を支配する制限局面であると考えられる。

表1は、炭素固定の速度および効率を上げるために過剰発現される遺伝子と、関連する経路、酵素委員会(EC)番号、例示的な遺伝子名、供給源生物、GenBankアクセッション番号、および代替の供給源に由来するホモログに関する情報を列挙している。親の生物が、示された酵素活性を有する遺伝子をコードする場合でも、CO₂固定を改善するために、これらの成分を過剰発現することが有用である。1つの態様において、天然の酵素配列が過剰発現される。好ましい態様では外因性遺伝子を過剰発現することが有用であり、これにより、バイオプロセスにおいてより明確な調節制御、および天然遺伝子に明確に焦点を当てた、中心代謝調節の影響を潜在的に和らげる手段が可能になる。

I.機能的な3-ヒドロキシプロピオン酸回路の酵素
機能的な3-ヒドロキシプロピオン酸回路を確立するために、以下の酵素活性が発現される。この経路は、天然では、クロロフレクサス・アウランチアカスによって用いられる [Herter S, Farfsing J, Gad’On N, Rieder C, Eisenreich W, Bacher A, and Fuchs G. J Bacteriol (2001). 「Autotrophic CO₂ fixation by Chloroflexus aurantiacus: study of glyoxylate formation and assimilation via the 3-hydroxypropionate cycle.」 183(14):4305-16]。

アセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACCアーゼ)、(EC6.4.1.2)は、アセチル-CoA、CO₂、およびATPから、マロニルCoA、ADP、およびPiを生成する。例示的なACCアーゼサブユニットαは、大腸菌に由来するaccA、遺伝子座AAA70370である。例示的なACCアーゼサブユニットβは、大腸菌に由来するaccD、遺伝子座AAA23807である。例示的なビオチン-カルボキシル担体タンパク質は、大腸菌に由来するaccB、遺伝子座ECOACOACである。例示的なビオチンカルボキシラーゼは、大腸菌に由来するaccC、遺伝子座AAA23748である。

マロニルCoA還元酵素(3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼとも知られる)(EC1.1.1.59)、は、マロニルCoAおよび2つのNADPHから、3-ヒドロキシプロプリオン酸、2つのNADP⁺、およびCoAを生成する。アルコール活性およびデヒドロゲナーゼ活性の両方を有する例示的な二機能酵素は、クロロフレクサス・アウランチアカスに由来するmcr、遺伝子座AY530019である。

3-ヒドロキシプリオピオニル(hydroxypriopionyl)-CoA合成酵素(3-ヒドロキシプロピオニル-CoAデヒドラターゼ、またはアクリロイル-CoA還元酵素とも知られる)は、3-ヒドロキシプリオピオン酸(hydroxypriopionate)、ATP、CoA、およびNADPHから、プロピオニル-CoA、AMP、PPi(無機ピロリン酸)、H₂O、およびNADP⁺を生成する。例示的な遺伝子は、クロロフレクサス・アウランチアカスに由来するプロピオニル-CoA合成酵素(pcs)、遺伝子座AF445079である。

プロピオニル-CoAカルボキシラーゼ(EC6.4.1.3)は、プロピオニル-CoA、ATP、およびCO₂からS-メチルマロニル-CoA、ADP、およびPi(無機リン酸)を生成する。例示的な2サブユニット酵素は、ロゼオバクター・デニトリフィカンス(Roseobacter denitrificans)に由来するプロピオニル-CoAカルボキシラーゼαサブユニット(pccA)、遺伝子座RD1_2032、およびロゼオバクター・デニトリフィカンスに由来するプロピオニル-CoAカルボキシラーゼβサブユニット(pccB)、遺伝子座RD1_2028である。

メチルマロニル-CoAエピメラーゼ(EC5.1.99.1)は、S-メチルマロニル-CoAからR-メチルマロニル-CoAを生成する。ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)に由来する例示的な酵素は、遺伝子座CP000661である。

メチルマロニル-CoAムターゼ(EC5.1.99.2)は、R-メチルマロニル-CoAからスクシニル-CoAを生成する。一例は、yliKタンパク質(遺伝子座NC000913.2)である。

スクシニル-CoA:L-リンゴ酸CoAトランスフェラーゼは、スクシニル-CoAおよびリンゴ酸からL-マリル-CoAおよびコハク酸を生成する。例示的な2サブユニット酵素は、クロロフレクサス・アウランチアカスに由来するSmtA、遺伝子座DQ472736.1、およびクロロフレクサス・アウランチアカスに由来するSmtB、遺伝子座DQ472737.1である。

フマル酸還元酵素(EC1.3.1.6)は、コハク酸およびNAD⁺からフマル酸およびNADHを生成する。例示的なフマル酸還元酵素は、大腸菌frdオペロン(遺伝子座J01611)である。frdAフマル酸還元酵素フラビンタンパク質サブユニットが公知である。一部の種は他の種より一方向を好む場合があることに留意することが重要である。さらに、これらのタンパク質の多くは、一方向バージョンおよび二方向バージョンを発現する生物に存在する。例は、frdB、フマル酸還元酵素鉄-硫黄サブユニット、およびg15サブユニットg13サブユニットである。

フマル酸ヒドラターゼ(EC4.2.1.2)は、フマル酸および水からリンゴ酸を生成する。大腸菌は、3種類の別個の例示的なフマル酸ヒドラターゼ:クラスI好気性フマル酸ヒドラターゼ(fumA)、遺伝子座CAA25204;クラスI嫌気性フマル酸ヒドラターゼ(fumB)、遺伝子座AAA23827;クラスIIフマル酸ヒドラターゼ(fumC)、遺伝子座CAA27698をコードする。

L-マリル-CoAリアーゼ(EC4.2.1.2)は、L-マリル-CoAからアセチル-CoAおよびグリオキシル酸を生成する。例示的な遺伝子は、ロゼオバクター・デニトリフィカンスに由来するmclA、遺伝子座NC_008209.1である。

このセクションにおいて列挙した前記の酵素活性は、2つのCO₂分子から、有機2-炭素グリオキシル酸分子を合成する能力を付与する。この反応の化学量論は、2 CO₂+3 ATP+3 NADPH→グリオキシル酸+2 ADP+2 Pi+AMP+PPi+3 NADP⁺である。

II.機能的な還元的TCA回路の酵素
機能的な還元的TCA回路を確立するために、以下の酵素活性が発現される。この経路は、天然ではクロロビウム・テピダムによって用いられる。

ATP-クエン酸リアーゼ(EC.2.3.3.8)は、クエン酸、ATP、およびCoAから、アセチル-CoA、オキサロ酢酸、ADP、およびPiを生成する。例示的なATPクエン酸リアーゼは、ATPクエン酸リアーゼサブユニット1、遺伝子座CY1089およびATPクエン酸リアーゼサブユニット2、遺伝子座CT1088を含む、クロロビウム・テピダムに由来する2サブユニット酵素である。

ヒドロゲノバクター・サーモフィラス(Hydrogenobacter thermophilus)は、クエン酸からオキサロ酢酸を生成する代替経路を用いる。第1の段階では、2サブユニットシトリル-CoA合成酵素が、クエン酸、ATP、およびCoAからシトリル-CoAを生成する。大サブユニット:ccsA、遺伝子座BAD17844;小サブユニット:ccsB、遺伝子座BAD17846。

ヒドロゲノバクター・サーモフィラスのシトリル-CoAリガーゼ(ccI)、遺伝子座BAD17841は、シトリル-CoAからオキサロ酢酸およびアセチル-CoAを生成する。

リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.37)は、オキサロ酢酸およびNADHからリンゴ酸およびNAD⁺を生成する。クロロビウム・テピダムに由来する例示的なリンゴ酸デヒドロゲナーゼは、遺伝子座CAA56810である。

フマラーゼ(フマル酸ヒドラターゼとも知られる)(EC4.2.1.2)は、リンゴ酸からフマル酸および水を生成する。大腸菌は3種類のフマラーゼ遺伝子をコードし、これらを光独立栄養生物において過剰発現することができる。例示的な大腸菌フマラーゼヒドラターゼクラスI(好気性アイソザイム)は、fumAである。例示的な大腸菌フマル酸ヒドラターゼクラスI(嫌気性アイソザイム)は、fumBである。例示的な大腸菌フマル酸ヒドラターゼクラスIIは、fumCである。

コハク酸デヒドロゲナーゼ(EC1.3.99.1)は、フマル酸およびFADH₂からコハク酸およびFAD⁺を生成する。大腸菌は、4サブユニットコハク酸デヒドロゲナーゼ複合体(SdhCDAB)をコードする。これらの酵素もまた前記の3-HPA経路において用いられるが、逆方向で用いられる。一部の種は他の種より一方向を好む場合があることに留意することが重要である。コハク酸デヒドロゲナーゼおよびフマル酸還元酵素は、同じ酵素的相互変換であるコハク酸+FAD⁺→フマル酸+FADH₂の逆方向である。大腸菌において、順反応および逆反応は別個の複合体によって触媒され、フマル酸還元酵素は嫌気条件下で作動し、コハク酸デヒドロゲナーゼは好気条件下で作動する。このグループには、サイトゾル古細菌フマル酸還元酵素のBサブユニットの領域、例えば、SdhAフラビンタンパク質サブユニット、遺伝子座NP_415251;SdhB鉄-硫黄サブユニット、遺伝子座NP_415252;SdhC膜アンカーサブユニット、遺伝子座NP_415249;およびSdhD膜アンカーサブユニット、遺伝子座NP_415250も含まれる。

アセチル-CoA:コハク酸CoAトランスフェラーゼ(スクシニル-CoA合成酵素とも知られる)(EC6.2.1.5)は、コハク酸、CoA、およびATPから、スクシニル-CoA、ADP、およびPiを生成する。大腸菌は、2つのαサブユニットおよびβサブユニットからなるヘテロ四量体をコードする。例示的な大腸菌スクシニル-CoA合成酵素サブユニットαは、sucD、遺伝子座AAA23900である。例示的な大腸菌スクシニル-CoA合成酵素サブユニットβは、sucC、遺伝子座AAA23899である。クロロビウム・テピダムsucC(AAM71626)およびsucD(AAM71515)も使用することができる。

2-オキソケトグルタル酸合成酵素(α-ケトグルタル酸合成酵素とも知られる)(EC1.2.7.3)は、スクシニル-CoA、CO₂、および還元型フェレドキシンから、α-ケトグルタル酸、CO₂、および酸化型フェレドキシンを生成する。クロロビウム・リミコラ(Chlorobium limicola)DSM245に由来する例示的な酵素は、アクセッション番号EAM42575;EAM42574;EAM42853;およびEAM42852を有する4サブユニット酵素である。この活性は大腸菌において機能的に発現された。Yun NR, Arai H, Ishii M, Igarashi Y. Biochem Biophys Res Communic (2001). The Genes for anabolic 2-oxoglutarate:Ferredoxin oxidoreductases from Hydrogenobacter thermophilus TK-6. 282(2):589-594。同じ細菌には別の5サブユニットOGORクラスターがある。Yun NR et al. Biochem Biophys Res Communic (2002). A novel five-subunit-type 2-oxoglutalate:ferredoxin oxidoreductases from Hydrogenobacter thermophilus TK6. 292(1):280-6。対応する遺伝子はDABGEである。ヒドロゲノバクター・サーモフィラスに由来する例示的なα-ケトグルタル酸合成酵素は、korA、遺伝子座AB046568:46-1869およびkorB遺伝子座AB046568:1883-2770を含むヘテロ二量体酵素である。

イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.42)は、α-ケトグルタル酸、CO₂およびNADPHから、D-イソクエン酸およびNADP⁺を生成する。例示的な遺伝子は、クロロビウム・リミコラに由来する単量体型idh、遺伝子座EAM42635である。別の例示的な酵素は、シネココッカス属の種WH8102、icd、アクセッションCAE06681に由来する酵素である。

別の態様において、α-ケトグルタル酸、CO₂、およびNADHから、イソクエン酸およびNAD⁺を生成する、NAD依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.41)が発現される。例示的なNAD依存性酵素は、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に由来する2サブユニットミトコンドリアバージョン、サブユニット1、idh1遺伝子座YNL037Cである。第2のサブユニットは、idh2、遺伝子座YOR136Wである。

アコニターゼ(アコニット酸ヒドラターゼまたはクエン酸ヒドロリアーゼとも知られる)(EC4.2.1.3)は、cis-アコニット酸中間体を介してD-クエン酸からクエン酸を生成する。大腸菌は、アコニット酸ヒドラターゼ1および2(acnAおよびacnB)をコードする。例示的なアコニット酸ヒドラーゼ1は、大腸菌acnA、遺伝子座b1276である。例示的な大腸菌アコニット酸ヒドラターゼ2は、acnB、遺伝子座b0118である。

ピルビン酸合成酵素(ピルビン酸:フェレドキシン酸化還元酵素とも知られる)(EC1.2.7.1)は、アセチル-CoA、CO₂および還元型フェレドキシンから、ピルビン酸、CoA、および酸化型フェロドキシン(ferrodoxin)を生成する。例示的なピルビン酸合成酵素は、破傷風菌(Clostridium tetani)E88に由来する四量体酵素porABCDである。サブユニットporA、遺伝子座AA036986;サブユニットporB、遺伝子座AA036985;サブユニットporC、遺伝子座AA036988;およびサブユニットporD、遺伝子座AA036987。

ホスホエノールピルビン酸合成酵素(PEP合成酵素、ピルビン酸、水ジキナーゼとも知られる)(EC2.7.9.2)は、ピルビン酸、ATP、および水から、ホスホエノールピルビン酸、AMP、およびPiを生成する。大腸菌は、例示的なPEP合成酵素、ppsAをコードする。大腸菌ppsA酵素、遺伝子座AAA24319およびアクイフェクス・アエオリカス(Aquifex aeolicus)VF5に由来する対応する酵素ppsA、遺伝子座AAC07865も使用することができる。

ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPカルボキシラーゼPEPCアーゼ、PEPCとも知られる)(EC4.1.1.31)は、ホスホエノールピルビン酸、水、およびCO₂から、オキサロ酢酸およびPiを生成する。大腸菌は、例示的なPEPカルボキシラーゼ、ppCをコードする。大腸菌ppC酵素、遺伝子座CAA29332も使用することができる。

このセクションに記載した前記の酵素は、2つのCO₂分子から、有機2-炭素アセチル-CoA分子を合成する能力を付与する。この反応の化学量論は、2 CO₂+2 ATP+3 NADH+1 FADH₂+CoASH→アセチル-CoA+2 ADP+2 Pi+AMP+PPi+FAD⁺+3 NAD⁺である。

III.機能的なウッド-ユングダール回路の酵素
機能的なウッド-ユングダール経路を確立するために、以下の酵素活性が発現される。この経路は、天然では、ムーレラ・サーモアセチカ(Moorella thermoacetica)(以前は、クロストリジウム・サーモアセチカムとして知られる)、メタノバクテリウム・サーモアウトロフィカム(Methanobacterium thermoautrophicum)、およびデスルフォバクテリウム・オートロフィカム(Desulfobacterium autotrophicum)によって用いられる。

NADP依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ(EC1.2.1.4.3)は、CO₂およびNADPHから、ギ酸およびNADP⁺を生成する。例示的なNADP依存性ギ酸デヒドロゲナーゼは、Mt-fdhA、遺伝子座AAB18330およびβサブユニット、Mt-fdhB、遺伝子座AAB18329を含有する、ムーレラ・サーモアセチカ(以前に、クロストリジウム・サーモアセチカムとして知られる)に由来する2サブユニットMt-fdhA/B酵素である。

ギ酸テトラヒドロ葉酸リガーゼ(EC6.3.4.3)は、ギ酸、ATP、およびテトラヒドロ葉酸から、10-ホルミルテトラヒドロ葉酸、ADP、およびPiを生成する。例示的なギ酸テトラヒドロ葉酸リガーゼは、クロストリジウム・アシジ-ウリシ(Clostridium acidi-urici)遺伝子座M21507に由来する。この酵素活性の代替の供給源には、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)に由来する遺伝子座AAB49329(Swiss-ProtエントリーQ59925)、または遺伝子座BA000016によってコードされる、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)に由来するSwiss-ProtエントリーQ8XHL4を有するタンパク質が含まれる。

メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ(5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼとも知られる)(EC3.5.4.9および1.5.1.5)は、10-ホルミルテトラヒドロ葉酸およびNADPHから、5,10-メチエニルテトラヒドロ葉酸中間体を介して、5,10-メチレン-THF、水、およびNADP⁺を生成する。大腸菌は、二機能メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼ/デヒドロゲナーゼ、folD、例えば、大腸菌酵素、遺伝子座AAA23803をコードする。この酵素活性の代替の供給源には、ムーレラ・サーモアセチカに由来する遺伝子座ABC19825(folD)、破傷風菌に由来する遺伝子座AAO36126;およびクロストリジウム・パーフリンゲンスに由来する遺伝子座BAB81529が含まれる。全て二機能folD酵素である。

メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(EC1.5.1.20)は、5,10-メチレン-テトラヒドロ葉酸およびNADPHから5-メチルテトラヒドロ葉酸およびNADP⁺を生成する。大腸菌は、例示的なメチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素、metF、例えば、大腸菌酵素、遺伝子座CAA24747をコードする。この酵素活性の代替の供給源には、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)に由来する遺伝子座AAC23094およびネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)に由来する遺伝子座CAA30531が含まれる。

5-メチルテトラヒドロ葉酸コリノイド/鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼは、5-メチル-テトラヒドロ葉酸およびコリノイドFe-Sタンパク質から、テトラヒドロ葉酸およびメチル化コリノイドFe-Sタンパク質を生成する。例示的な遺伝子、acsEは、ムーレラ・サーモアセチカの遺伝子座AAA53548によってコードされる。この活性は大腸菌において機能的に発現される(Roberts DL, Zhao S, Doukov T, and Ragsdale S. The reductive acetyl-CoA Pathway: Sequence and heterologous expression of active methyltetrahydrofolate:corrinoid/Urib -sulfur protein methyltransferase from Clostridium thermoaceticum. J. Bacteriol (1994). 176(19):6127-30)。この活性の代替の供給源は、カルボキシドサーマス・ヒドロゲノホルマス(Carboxydothermus hydrogenoformas)に由来するacsE遺伝子、遺伝子座CP000141によってコードされる。

一酸化炭素デヒドロゲナーゼ/アセチル-CoA合成酵素(EC1.2.7.4/1.2.99.2および2.3.1.169)は二機能2サブユニット酵素であり、CO₂、還元型フェレドキシン、およびメチル化コリノイドタンパク質から、アセチル-CoA、水、酸化型フェレドキシン、およびコリノイドタンパク質を生成する。例示的な一酸化炭素デヒドロゲナーゼ酵素、サブユニットβは、ムーレラ・サーモアセチカに由来する遺伝子座AAA23228によってコードされる。この活性の別の例示的な供給源は、タンパク質アクセッションYP_360060である、カルボキシドサーマス・ヒドロゲノフォルマーゼ(Carboxydothermus hydrogenoformase)に由来するacsB遺伝子、遺伝子座CHY_1222によってコードされる。例示的なアセチル-CoA合成酵素、サブユニットαは、ムーレラ・サーモアセチカに由来する遺伝子座AAA23229である。

このセクションに記載した前記の酵素は、2つのCO₂分子から、有機2-炭素アセチル-CoA分子を合成する能力を付与する。この反応の化学量論は、2 CO₂+1 ATP+2 NADPH+2還元型フェレドキシン+コエンザイムA→アセチル-CoA+2 H₂O+ADP+Pi+2 NADP⁺+2酸化型フェレドキシンである。

機能的なCO₂固定経路を含有するように操作された細胞は、有機炭素源を欠く最小培地での増殖を介して選択される。生存に基づく選択に加えて、細胞を、放射標識CO₂ (すなわち、C¹⁴-CO₂)の存在下で最小培地において増殖することができる。当業者に公知の一般的な技法を用いて、代謝同化を検証および特徴付けるために、詳細な取り込み研究が用いられる。

IV.機能的な還元的ペントースリン酸回路の酵素
機能的な還元的ペントースリン酸(カルビン)回路を確立するために、以下の酵素活性が発現される。この経路は、天然では、全ての植物、藻類、およびラン藻類によって用いられる。

リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RuBisCo)(EC4.1.1.39)は、リブロース-1,5-二リン酸、CO₂、およびH₂Oから、2分子の3-ホスホグリセリン酸を生産的に生成する。その名の通り、RuBisCoは非生産的酸素化反応を触媒することもできる。いくつかのクラスのRuBisCoが公知であり、これらのいずれかおよび全てを過剰発現することができる[Watson GMF, Tabita FR.FEMS Microbiology Letters (1997) 「Microbial ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase: a molecule for phylogenetic and enzymological investigation.」146(1):13-22]。紅色細菌グループに由来する例示的なI型「グリーン(Green)様」RuBisCoは、シネココッカス属spWH7803(リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ-小サブユニット(CbbS)、遺伝子座AAB48081)および(リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ-大サブユニット(CbbL)、遺伝子座AAB8080)に由来する。ラン藻/植物グループに由来する例示的なI型「グリーン様」RuBisCoは、シネココッカス・エロンガタスPCC6301(リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ-小サブユニット(RbcS)、遺伝子座YP_170839)および(リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ-大サブユニット(RbcL)、遺伝子座YP_170840)に由来する。例示的なI型「レッド(Red)様」RuBisCoは、ロドバクター・スフェロイデス(リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ-小サブユニット(CbbS)、遺伝子座P27998)および(リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ-大サブユニット(CbbL)、遺伝子座P27997)に由来する。例示的なII型RuBisCoは、ロドバクター・スフェロイデス(リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(CbbM)、遺伝子座P29278)に由来する。最後に、例示的なIII型RuBisCoは、メタノカルドコッカス・ジャナシ(Methanocaldococcus jannaschii)(リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RbcL)、遺伝子座Q58632)に由来する。

ある態様において、RuBisCo活性化を改善するために、および/またはRuBisCo炭素固定の競合阻害剤を放出するために、ルビスコアクチバーゼが過剰発現される。例示的なルビスコアクチバーゼは、シネココッカス属の種JA-3-3Ab(遺伝子座ABC98646)に由来する。

ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)(EC2.7.2.3)は、3-ホスホグリセリン酸およびATPから、1,3-ビスホスホグリセリン酸ADPを生成する。例示的なホスホグリセリン酸キナーゼは、シネココッカス属の種PCC6301に由来する遺伝子座BAD78623である。

グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)(EC1.2.1.13)は、1,3-ビスホスホグリセリン酸およびNADPHから、グリセルアルデヒド3-リン酸およびNADP⁺を生成する。例示的なGAPDHは、プロクロロコッカス・マリナス(Prochlorococcus marinus)に由来するcbbG遺伝子、遺伝子座NP_875968によってコードされる。

トリオースリン酸イソメラーゼ(EC5.3.1.1)は、グリセルアルデヒド3-リン酸からジヒドロキシアセトンリン酸(DHAP)を生成する。例示的なトリオースリン酸イソメラーゼは、シネコシスティス属の種PCC6803に由来するtpiA遺伝子、遺伝子座Q59994によってコードされる。

フルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼ(EC4.1.2.13)は、DHAPおよびグリセルアルデヒド3-リン酸から、フルクトース-1,6-二リン酸を生成する。例示的なクラスIフルクトース1,6-二リン酸アルドラーゼは、シネコシスティス属の種PCC6803に由来するfda遺伝子、遺伝子座NP_441723によってコードされる。例示的なクラスIIフルクトース1,6-二リン酸アルドラーゼは、シネコシスティス属の種PCC6803に由来する、fbaA遺伝子、遺伝子座BAA10184によってコードされる。

フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ(EC3.1.3.11)は、フルクトース-1,6-二リン酸およびH₂0から、フルクトース-6-リン酸およびPiを生成する。例示的なフルクトース-1,6-ビスホスファターゼは、シネコシスティス属の種PCC6803に由来するfbp遺伝子、遺伝子座NP_441738によってコードされる。

トランスケトラーゼ(EC2.2.1.1)は、フルクトース6-リン酸およびグリセルアルデヒド3-リン酸から、キシルロース5-リン酸およびエリトロース4-リン酸を生成する。例示的なトランスケトラーゼは、シネココッカス属の種PCC6301に由来するtktA遺伝子、遺伝子座YP_171693によってコードされる。

ペントース-5-リン酸-3-エピメラーゼ(EC5.1.3.1)は、キシルロース-5-リン酸からリボース-5-リン酸を生成する。例示的なペントース-5-リン酸-3-エピメラーゼは、シネコシスティス属の種PCC6301に由来するrpe遺伝子、遺伝子座YP_171630によってコードされる。

セドヘプツロース-1,7-二リン酸アルドラーゼ(EC4.1.2.13)は、エリトロース-4-リン酸およびDHAPから、セドヘプツロース-1,7-二リン酸を生成する。例示的なセドヘプツロース-1,7-二リン酸アルドラーゼは、サーモシネココッカス・エロンガタスBP-1に由来するrpaA遺伝子、遺伝子座NP_681166によってコードされる。

セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼ(SBPアーゼ)(EC3.1.3.37)は、セドヘプツロース-1,7-二リン酸およびH₂Oから、セドヘプツロース-7-リン酸およびPiを生成する。例示的なSBPアーゼは、コナミドリムシに由来するcsbp遺伝子、遺伝子座CAA52439によってコードされる。

トランスケトラーゼ(EC2.2.1.1)は、セドヘプツロース7-リン酸およびグリセルアルデヒド3-リン酸から、リボース-5-リン酸およびキシルロース5-リン酸を生成する。例示的なトランスケトラーゼは、シネココッカス属の種PCC6301に由来するtktA遺伝子、遺伝子座YP_171693によってコードされる。

リボース-5-リン酸イソメラーゼ(EC5.3.1.6)は、キシルロース-5-リン酸またはリボース-5-リン酸からリブロース-5-リン酸を生成する。例示的なリボース-5-リン酸イソメラーゼは、シネココッカス・エロンガタスPCC6301に由来するrpiA遺伝子、遺伝子座YP_171649によってコードされる。

ホスホリブロキナーゼ(EC2.7.1.19)は、リブロース-5-リン酸およびATPから、リブロース-1,5-二リン酸およびADPを生成する。例示的なホスホリブロキナーゼは、コナミドリムシに由来するprkA遺伝子、遺伝子座AAA33090である。ある特定の態様では、NADPH/NADHの比に応じて、PRK/CP12/GAPDH複合体の会合/解離を介してカルビン回路を調節する、小さなCP12タンパク質が過剰発現される[Tamoi M, Miyazaki T, Fukamizo T, Shigeoka S. 「The calvin cycle in cyanobacteria is regulated by CP12 via the NAD(H)/NADP(H) ratio under light/dark conditions.」 The Plant Journal (2005). 42:504-12]。例示的なCP12遺伝子は、サーモシネココッカス・エロンガタスBP-1に由来する遺伝子座BAC09372である。

ある特定の態様において、炭素フラックスを特定の重要な中間体に変えることによって、炭素固定速度および/または炭素産物効率が増強される。1つの態様において、炭素フラックスは、パントテン酸キナーゼ、例えば、シエンココッカス属(Syenchococcus)の種JA-3-3Abに由来する遺伝子座YP_473820、ならびに/またはピルビン酸デヒドロゲナーゼ、例えば、シネココッカス属PCC6301に由来するpdhAB、遺伝子座YP_1728660(pdhA)およびYP_172072(pdhB)の過剰発現を介してアセチル-CoAに向けられる。さらに、またはその代わりとして、アセチル-CoAへの炭素フラックスを効率的に下げる内因性遺伝子が下方制御またはノックアウトされる。これらの態様において、アシルコエンザイムAデヒドロゲナーゼ(EC1.3.99.3、遺伝子座YP_171045)、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.94、遺伝子座YP_401539)、および/または乳酸デヒドロゲナーゼ(ldhA)(EC1.1.1.28、遺伝子座YP_170916)が下方制御またはノックアウトされる。

前記のある特定の酵素は、CO₂を2-炭素アセチル-CoA(還元的TCAおよびウッド-ユングダール経路)またはグリオキシル酸(3-HPA経路)に同化する経路を提供する。これらの組み合わせ(優先的に、3-HPA回路および還元的TCA回路)もまた特殊な場合において操作される。このシナリオでは、CO₂固定反応の産生物(アセチル-CoAおよびグリオキシル酸)はグリオキシル酸回路の投入物として用いられ、グリオキシル酸回路は、アセチル-CoAおよびグリオキシル酸を(4-炭素リンゴ酸中間体を介して)4-炭素オキサロ酢酸に結合する[Chung T, Klumpp DJ, Laporte DC. J Bacteriol (1988). 「Glyoxylate bypass operon of Escherichia coli: cloning and determination of the functional map.」 170(1):386-92.]。これらの重要な酵素はグリオキシル酸シャント経路に関与する。好ましい態様では、CO₂固定を最大にするために、全てが過剰発現される。

リンゴ酸合成酵素(EC2.3.3.9)は、アセチル-CoA、水、およびグリオキシル酸からリンゴ酸およびコエンザイムAを生成する。例示的な酵素は、大腸菌遺伝子座JW3974(aceB)によってコードされる。別の例示的な活性は、大腸菌がコードする代替のリンゴ酸合成酵素、JW2943遺伝子座リンゴ酸合成酵素G(glcB)によって提供される。

イソクエン酸リアーゼ(EC4.1.3.1)は、イソクエン酸からグリオキシル酸およびコハク酸を生成する。例示的な酵素は、大腸菌遺伝子座JW3975(aceA)によってコードされる酵素である。

リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.37)は、リンゴ酸およびNAD⁺からオキサロ酢酸およびNADHを生成する。例示的な酵素は、大腸菌遺伝子座JW3205(mdh)によってコードされる酵素である。

糖新生は、生物が、ピルビン酸、乳酸、グリセロール、およびグルコース生成アミノ酸を含む非糖炭素基質からグルコースを生成するプロセスである。解糖のほとんどの段階は、3つの例外を除いて二方向性である(Hers HG, Hue, L. Ann Rev. Biochem (1983).「Gluconeogenesis and related aspects of glycolysis.」52:617-53)に概説される)。ある特定の態様において、糖新生の速度を改善するために、これらの酵素活性が発現される。

I.ピルビン酸からホスホエノールピルビン酸への変換
ピルビン酸からホスホエノールピルビン酸への変換には、以下の通り2つの酵素活性が必要とされる。

ピルビン酸カルボキシラーゼ(EC6.4.4.1)は、ピルビン酸、ATP、およびCO₂からオキサロ酢酸、ADP、およびPiを生成する。例示的なピルビン酸カルボキシラーゼは、サッカロマイセス・セレビシエに由来するYGL062W遺伝子座、pyc1によってコードされる。

ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ(EC4.1.1.49)は、オキサロ酢酸およびATPから、ホスホエノールピルビン酸(phosphoenolpyurate)、ADP、Pi、およびCO₂を生成する。例示的なホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼは、大腸菌遺伝子座JW3366、pckAによってコードされる。

II.フルクトース1,6-二リン酸からフルクトース-6-リン酸への変換
フルクトース1,6-二リン酸からフルクトース-6-リン酸への変換には、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ(EC3.1.3.11)が必要とされる。フルクトース-1,6-ビスホスファターゼは、フルクトース-1,6-二リン酸および水からフルクトース-6-リン酸およびPiを生成する。例示的なフルクトース-1,6-ビスホスファターゼは、大腸菌遺伝子座JW4191、fbp、(EC＃4.1.2.13)によってコードされる。

サーモシネココッカス・エロンガテスBP-1遺伝子fbpI(アクセッション番号:NP_682066)、fbpII(アクセッション番号:NP_681331)、およびfbaA(アクセッション番号:NP_681166)は、それぞれ、フルクトースビスホスファターゼIタンパク質(E.C.1.6.1.1)、フルクトースビスホスファターゼIIタンパク質(E.C.1.6.1.1)、およびフルクトースビスホスファターゼアルドラーゼタンパク質(E.C.XXX)をコードし、以下のプライマー:
fbpIフォワードプライマー

およびリバースfbpIプライマー

;fbpIIフォワードプライマー

およびリバースプライマー

;fbaAフォワードプライマー

およびリバースプライマー

を用いて、サーモシネココッカス・エロンガテスBP-1株ゲノムDNAから直接増幅された。PCR増幅は、PCR SuperMix High Fidelity(Invitrogen, Carlsbad, CA)および標準的なPCR増幅条件を用いて行った。fbpIおよびfbpIIフォワードプライマーによりNdeI制限認識部位が付加され、fbaAフォワードプライマーによりBsmAI制限認識部位が付加され、全てのリバースプライマーにより停止コドンおよびEcoRI制限認識部位が付加される。

増幅されたfbpI PCR遺伝子産物、fbpII PCR遺伝子産物、およびfbaA PCR遺伝子産物をpJB5発現ベクターに、周知の実験法を用いてインサートおよびベクターを個々にNdeIおよびEcoRIまたはBsmAIおよびEcoRI(New England Biolabs)制限エンドヌクレアーゼで消化することによってクローニングした(「pJB5-fbpI」、「pJB5-fbpII」、「pJB5-fbaA」)。消化物を、公表された技法から逸脱することなく、0.8％TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Extraction Kit(Qiagen)を用いて精製し、T4 DNAリガーゼ(New England Biolabs)を用いて連結した。連結された産物により、標準的な技法を用いて、化学的にコンピテントなNEB 5-α大腸菌細胞(New England Biolabs)を形質転換し、これをPCRによって確認した。

別々のJCC136調製物を個々に形質転換するために、pJB5-fbpI、pJB5-fbpII、およびpJB5-fbaAプラスミドストックを、Qiagenミニプレップキットを用いて精製した。1〜2マイクログラムの上述のプラスミドDNAを、OD_730nm1の個々のJCC136細胞調製物に添加し、低強度軌道振盪および低照度光源を用いて37℃で4時間インキュベートした。次いで、細胞をA⁺固体培地プレート上にプレートし、照明付きインキュベーター(100〜250μE/m2/s、37℃)に1日間入れた。25マイクログラム/mL_[final]スペクチノマイシンをプレートの下層におき、コロニーが増殖するまでインキュベートした(約5日)。pJB5-fbpI形質転換の場合、標的シネココッカス属宿主細胞への組込みは、「コロニーPCR」プロトコールによる全細胞ゲノムDNAのPCRによって確認した。簡単に述べると、約1mmコロニーを50μl脱イオン水に再懸濁し、5μlを、Phusion DNA Polymerase Master Mix(New England Biolabs, Beverly, MA)を用いる20μlの標準的PCR反応に使用した。標準的PCRサイクル条件の開始時には、2分98℃の変性段階を加えた。PCRは、コロニーの正しいバンドを示した。この株をJCC136-FbpI(図10、パネルB、レーン2)と名付けた。

JCC136およびJCC136-FbpIのシングルコロニーを、100μg/ml_[final]スペクチノマイシンを添加した10mLのA⁺を含む試験管に入れ、37℃浴に浸し、1％CO₂を通気して増殖させた。培養物をOD_730nm5.0またはそれ以上まで増殖させ(Molecular Devices Spectramax M2e; OD_730nm1は約0.3gのCDWに等しいことが以前に確かめられている)、次いで、スピンダウンし(21,000RCF、20℃、5分)、新鮮なA⁺培地に最初の濃度まで再懸濁し、次いで、適宜、25mLのA⁺を含む125mLバッフル付振盪フラスコに入れて、OD_730nm0.2まで希釈し戻した。各時点(希釈後、0時間、24時間、48時間、72時間、および96時間)について約1mLの培養物を採取し、OD_730nmを記録した(適宜、読取値が0.04〜0.4となるように希釈した。これは、Spectramax M2eにおいて最も正確な範囲であることが以前に確かめられている)。すぐに、試料を21,000RCFで、4℃で10分間スピンダウンした。上清を新しいチューブに入れ、分析の準備ができるまで-80℃で凍結した。

J&W Scientific DB-ALC1(カタログ番号:123-9134;長さ:30m、内径0.320mm、フィルム厚:1.80μm)を用いて、ヘッドスペースガス分析器(headspace analyzer)および水素炎イオン化検出器(Agilent)を備えたAgilent 7890 Gas Chromatographを使用することによって、各時点からの上清をエタノールおよびアセトアルデヒドについて分析した。各試料100μlをヘッドスペースガス分析に供した。対照はA⁺のみについて測定し、Sigmaから入手したエタノールおよびアセトアルデヒドの標準の段階希釈から、較正曲線を得た。エタノールの濃度および光学密度に対して規準化したエタノールを、図11にプロットした。

III.グルコース-6-リン酸からグルコースへの変換
グルコース-6-リン酸からグルコースへの変換には、グルコース-6-ホスファターゼ(EC3.1.3.68)が必要とされる。グルコース-6-ホスファターゼは、グルコース-6-リン酸および水から、グルコースおよびPiを生成する。例示的なグルコース-6-ホスファターゼは、サッカロマイセス・セレビシエYHR044C遺伝子座、dog1によってコードされる。別の例示的なグルコース-6-ホスファターゼ活性は、サッカロマイセス・セレビシエYHR043C遺伝子座、dog2によってコードされる。

糖新生の出発物質であるオキサロ酢酸は、グリオキシル酸シャントを介して(還元的TCA経路もしくはウッド-ユングダール経路および3-HPA経路からの投入物を活用する)、またはピルビン酸のカルボキシル化を介して生成される。グリオキシル酸シャントの非存在下では、ピルビン酸フェレドキシン:酸化還元酵素(EC1.2.7.1)のピルビン酸合成酵素活性によって、アセチル-CoA、CO₂、および還元型フェレドキシンから、ピルビン酸、CoA、および酸化型フェレドキシンを生成することができる[Furdui C and Ragsdale SW. J. Biol. Chem (2000). 「The role of pyruvate ferredoxin oxidoreductase in pyruvate synthesis during autotrophic growth by the Woods-Ljungdahl pathway.」275(37):28494-99]。ピルビン酸合成酵素活性を有する例示的なピルビン酸フェレドキシン酸化還元酵素は、ムーレラ・サーモアセチカム(Moorella thermoaceticum)に由来する遺伝子座Moth_0064によってコードされる。

実施例3:還元力の操作
前記のCO₂固定経路には、主に、NADH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型)およびNADPH(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型)の形で還元力を発生させることが必要な場合がある。

操作された光独立栄養生物の炭素同化を最大にするために、従って、増殖速度を最大にするために、適切なバランスがとれた還元型NAD⁺ (NADH)および還元型NADP⁺ (NADPH)を維持することが重要である。

表1は、還元力モジュールを過剰発現するための候補遺伝子と、関連する経路、酵素委員会(EC)番号、例示的な遺伝子名、供給源生物、GenBankアクセッション番号、および代替の供給源に由来するホモログに関する情報を列挙している。

I.NADH
NADHレベルが最適以下のままである場合、細胞内NADH濃度を上げるために、以下の遺伝子の過剰発現を含む複数の方法が用いられる。

NAD⁺依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.41)は、イソクエン酸およびNAD⁺から、2-オキソグルタル酸、CO₂、およびNADHを生成する。注目すべきは、ほとんどの細菌イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、NADP⁺依存性(EC1.1.1.42)である。例示的なNAD⁺依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼは、遺伝子座YNL037C、idh1および遺伝子座YOR136W、idh2を含む、八量体サッカロマイセス・セレビシエ酵素である。

リンゴ酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.37)は、リンゴ酸およびNAD⁺から、オキサロ酢酸およびNADHを生成する。NADHプールを増加させるために、NAD依存性リンゴ酸デヒドロゲナーゼの過剰発現を使用することができる。例示的な酵素は、大腸菌遺伝子座JW3205(mdh)によってコードされる。

ロドバクター・カプスラータに由来するNADH:ユビキノン酸化還元酵素は、キノンプールとNAD⁺との間の電子流を逆転できるという点でユニークである。

Nuo複合体Iをコードするロドバクター属Nuoオペロンは、逆の電子流によってさらなるNADHを生成するように再構成することができる。

光独立栄養細胞において逆の電子流およびNADH生成を可能にするために、14のnuo遺伝子nuoA-N(および機能未知の7つのORF)からなる、ロドバクター・カプスラータnuoオペロン、遺伝子座AF029365を発現することができる。このオペロンは、NuoA、アクセッションAAC24985.1;NuoB、アクセッションAAC24986.1;NuoC、アクセッションAAC24987.1;NuoD、アクセッションAAC24988.1;NuoE、アクセッションAAC24989.1;NuoF、アクセッションAAC24991.1;NuoG、アクセッションAAC24995.1;NuoH、アクセッションAAC24997.1;NuoI、アクセッションAAC24999.1;NuoJ、アクセッションAAC25001.1;NuoK、アクセッションAAC25002.1;NuoL、アクセッションAAC25003.1;NuoM、アクセッションAAC25004.1;およびNuoN、アクセッションAAC25005.1をコードする。

ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(EC1.6.1.1)が発現すると、NADPHおよびNAD⁺からNADHおよびNADP⁺が生成される。例示的な酵素は、sthA(udhAとも知られる)、遺伝子座JW551によってコードされる、大腸菌可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼである。別の例示的な酵素は、pntA、遺伝子座JW1595によってコードされる、NAD(P)トランスヒドロゲナーゼサブユニットα、およびpntB、遺伝子座JW1594によってコードされるNADPトランスヒドロゲナーゼサブユニットβからなる多サブユニットによってコードされる、膜結合型大腸菌ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼである。

NADH産生のためのピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼをコードするudhA遺伝子の発現
大腸菌K12 udhA遺伝子(アクセッション番号:NP_418397)は、ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(E.C.＃1.6.1.1)をコードする。この遺伝子を、フォワードプライマー

およびリバースプライマー

を用いて、大腸菌K12株ゲノムDNAから直接増幅した。PCR増幅は、高忠実度Phusion DNA Polymerase Master Mix (New England Biolabs, Beverly, MA)を用いて行った。フォワードプライマーによりNdeI制限認識部位が付加され、リバースプライマーにより停止コドンおよびEcoRI制限認識部位が付加される。

増幅されたudhA PCR 遺伝子産物をpJB5発現ベクターに、周知の実験法を用いてインサートおよびベクターを個々にNdeIおよびEcoRI(New England Biolabs)制限エンドヌクレアーゼで消化することによってクローニングした(「pJB5-udhA」)。両消化物を、公表された技法から逸脱することなく、1％TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Isolation Kit(Qiagen)を用いて精製し、Quick Ligation Kit (New England Biolabs)を用いて連結した。連結された産物により、標準的な技法を用いて、化学的にコンピテントなEPI400細胞(EpiCentre)を形質転換し、これをPCRによって確認した。

シネココッカス属の種PCC7002を形質転換するために、pJB5-udhAプラスミドストックを、Qiagenミニプレップキットを用いて精製した。1〜2マイクログラムのpJB5-udhAプラスミドを、光学密度1まで増殖させたシネココッカス属の種PCC7002細胞に添加し、低強度軌道振盪および低照度光源を用いて37℃で4時間インキュベートした。次いで、細胞をA⁺固体培地プレート上にプレートし、照明付きインキュベーター(100〜250μE/m2/s、37℃)に1日間入れた。25マイクログラム/mLスペクチノマイシンをプレートの下層におき、コロニーが増殖するまでインキュベートした(約5日)。標的シネココッカス属宿主細胞への組込みは、「コロニーPCR」プロトコールによる全細胞ゲノムDNAのPCRによって確認した。簡単に述べると、約1mmコロニーを50μl脱イオン水に再懸濁し、5μlを、Phusion DNA Polymerase Master Mix(New England Biolabs, Beverly, MA)を用いる20μlの標準的PCR反応に使用した。標準的PCRサイクル条件の開始時には、2分98℃の変性段階を加えた。PCRは、コロニーの正しいバンドを示した。この株をJCC1-UdhA(図10、レーン2および3)と名付けた。

II.NADPH
NADPHは、還元的(特に、脂肪酸)生合成における電子ドナーとして役立つ。光独立栄養に十分なNADPHレベルを維持するために、3つの類似した方法が単独でまたは組み合わせて用いられる。方法1および方法2は、WO2001/007626、細胞NADPHを増やすことによってL-アミノ酸を産生する方法(Methods for producing L-amino acids by increasing cellular NADPH)に記載されている。方法3は、米国特許出願公開第2005/0196866号、大腸菌における細胞内NADPHの利用可能性の増大(Increasing intracellular NADPH availability in E. coli)に記載されている。

NADPHのためのグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼをコードするzwf遺伝子の発現
大腸菌K12 zwf遺伝子(アクセッション番号:AAC74922)は、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(E.C.1.1.1.49)をコードする。この遺伝子を、フォワードプライマー

およびリバースプライマー

増幅されたzwf遺伝子PCR産物をpJB5発現ベクターに、周知の実験法を用いてインサートおよびベクターをNdeIおよびEcoRI (New England Biolabs)制限エンドヌクレアーゼで消化することによってクローニングした(「pJB5-Zwf」)。両消化物を、公表された技法から逸脱することなく、1％TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Isolation Kit(Qiagen)を用いて精製し、Quick Ligation Kit(New England Biolabs)を用いて連結した。連結された産物により、標準的な技法を用いて、化学的にコンピテントなEPI400細胞(EpiCentre)を形質転換し、これをPCRによって確認した。

シネココッカス属の種PCC7002を形質転換するために、pJB5-Zwfプラスミドストックを、Qiagenミニプレップキットを用いて精製した。1〜2マイクログラムのpJB5-Zwfプラスミドを、光学密度1まで増殖させたシネココッカス属の種PCC7002細胞に添加し、低強度軌道振盪および低照度光源を用いて37℃で4時間インキュベートした。次いで、細胞をA⁺固体培地プレート上にプレートし、照明付きインキュベーター(100〜250μE/m2/s、37℃)に1日間入れた。25マイクログラム/mLスペクチノマイシンをプレートの下層におき、コロニーが増殖するまでインキュベートした(約5日)。標的シネココッカス属宿主細胞への組込みは、「コロニーPCR」プロトコールによる全細胞ゲノムDNAのPCRによって確認した。簡単に述べると、約1mmコロニーを50μl脱イオン水に再懸濁し、5μlを、Phusion DNA Polymerase Master Mix(New England Biolabs, Beverly, MA)を用いる20μlの標準的PCR反応に使用した。標準的PCRサイクル条件の開始時には、2分98℃の変性段階を加えた。PCRは、コロニーの正しいバンドを示した。この株をJCC1-Zwf(図10、レーン4)と名付けた。
A.ペントースリン酸経路を介したフラックスの増加

ペントースリン酸経路を介したフラックスを増加させると、グルコース1分子あたりNADPH 2分子が生成される。

ホスホグルコースイソメラーゼ、例えば、シネココッカス属の種PCC6301に由来するpgi(遺伝子座YP_172776)のダウンレギュレーションまたは不活性化は、グルコースをペントースリン酸経路に押しやることが知られている。従って、これは、大腸菌工学において以前に適用されたように、細胞内NADPHプールを増加させるアプローチの1つを提供する。

グルコース-6-リン酸およびNADP⁺からNADPHおよび6-ホスホ-グルコノラクトンを生成する、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.49)の過剰発現は、NADPHレベルを高める別の手法を提供する。例示的な酵素は、大腸菌グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、zwf、遺伝子座JW1841によってコードされる酵素である。

6-ホスホグルコラクトンおよび水から6-ホスホグルコン酸を生成する6-ホスホグルコノラクトナーゼ(EC3.1.1.31)の過剰発現は、ペントースリン酸経路を介したフラックスを増加させる別のアプローチを提供する。例示的な酵素は、大腸菌6-ホスホグルコノラクトナーゼ、pgl、遺伝子座JW0750によってコードされる酵素である。

6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.44)の過剰発現は、6-ホスホグルコン酸およびNADP⁺から、リボース-5-リン酸、CO₂、およびNADPHを生成する。これはまた、ペントースリン酸経路を介したフラックスを増加させることによって、NADPHレベルを高めるのにも使用することができる。例示的な酵素は、大腸菌6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、gnd、遺伝子座JW2011によってコードされる。

B.NADP ⁺ 依存性酵素の発現
NAD依存性酵素の代わりに、またはNAD依存性酵素に加えて、NADP⁺依存性酵素を発現することができる。

イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(EC1.1.1.42)の過剰発現は、イソクエン酸およびNADP⁺から、2-オキソグルタル酸、CO₂、およびNADPHを生成する。例示的な酵素は、大腸菌イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、icd、遺伝子座JW1122によってコードされる。

リンゴ酸酵素(EC1.1.1.40)の過剰発現は、リンゴ酸およびNADP⁺から、ピルビン酸、CO₂、およびNADPHを生成する。例示的なNADP依存性酵素は、maeB、遺伝子座JW2447によってコードされる大腸菌リンゴ酸酵素である。

C.ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼの発現
ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(EC1.6.1.1)の発現は、NADHおよびNADP⁺からNADPHおよびNAD⁺を生成する。例示的な酵素は、sthA(udhAとも知られる)、遺伝子座JW551によってコードされる大腸菌可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼである。別の例示的な酵素は、pntA、遺伝子座JW1595によってコードされる、NAD(P)トランスヒドロゲナーゼサブユニットα、およびpntB、遺伝子座JW1594によってコードされる、NADPトランスヒドロゲナーゼサブユニットβからなる多サブユニットによってコードされる、膜結合型大腸菌ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼである。

実施例4:耐熱性の改善
ある特定の態様では、フォトバイオリアクターが高い動作温度で維持される。高い動作温度に耐え、良く育つように光独立栄養生物を操作すると、冷却費が少なくなり、炭素ベース産物の産生のキネティクスが速くなる。光独立栄養生物の耐熱性を高める4つの重要な手法には、アクセサリータンパク質による光合成装置の安定化、細胞内の他の細胞内タンパク質を安定化するシャペロンの発現、細胞膜の脂質プロファイルの変化、およびベタインなどの浸透圧保護剤の発現が含まれる。

光化学系IIは、光合成装置において熱感受性が最も高いタンパク質である[Berry J, Bjorkman O. Plant Physiol (1980) 「Photosynthetic response and adaptation to temperature in higher plants.」31:491]。光化学系IIに対する損傷は、主に、この複合体の酸素放出成分に位置し、D1の分解および置換は、損傷を受けた光化学系の修復における重要な段階である[Nixon PJ, Barker M, Boehm M, de Vries R, Komenda J. 「FtsH-mediated repair of the photosystem II complex in response to light stress.」 J. Exp. Biol (2005). 56(411):357-63]。1つの態様において、耐熱性の助けとなるために、シネコシスティス属の種PCC6803の光化学系IIの中のこれらの酸素放出成分を保護することが知られている3種類の遺伝子psbO、psbU、およびpsbVが過剰発現される[Kimura A, Eaton-Rye JJ, Morita EH, Nishiyama Y, Hayashi H. Plant Cell Physiol. (2002). 「Protection of the Oxygen-Evolving Machinery by the Extrinsic Proteins of Photosystem II is Essential for Development of Cellular Thermotolerance in Synechocystis sp. PCC 6803.」 Plant Cell Physiol. 43(8):932-938]。これらの3種類の例示的な遺伝子はアミノ酸配列をコードし、光化学系IIマンガン安定化ポリペプチド(PsbO)、遺伝子座NP_441796;PSII複合体12kDa外因性タンパク質(PsbU)、遺伝子座NP_440167;およびチトクロムc550(PsbV)、遺伝子座NP_441834である。

二次的な熱毒性源は、高温での全体的なタンパク質不安定性に起因する。具体的には、ClpB[Eriksson M, Schelin J, Miskiewicz E, Clarke AK. J Bacteriol (2001) 「Novel Form of ClpB/HSP100 Protein in the Cyanobacterium Synechococcus.」 183(24):7392-7396]、GroESL[Rajaram H, Ballal AD, Apte SK, Wiegert T, Schumann W. Biochimica et Biophysica Acta (2001) 「Cloning and characterization of the major groESL operon from a nitrogen-fixing cyanobacterium Anabaena sp. strain L-31.」 1519(1-2):143-146]、および HspA[Roy SK, Hiyama T, Nakamoto H. Eur J Biochem (1999). 「Purification and characterization of the 16-kDa heat-shock-responsive protein from the thermophilic cyanobacterium Synechococcus vulcanus, which is an alpha-crystallin-related, small heat shock protein.」262(2):406-416]を含む、いくつかのシャペロンが、高温でのタンパク質のフォールディングおよび分解を助けることによって耐熱性を付与する。好ましい態様では、高い耐熱性を光独立栄養生物に付与するために、好熱菌サーモシネココッカス・エロンガタスBP-1に由来するこれらの遺伝子のオルソログが過剰発現される。これらの例示的な遺伝子はアミノ酸配列をコードし、16.6kDa低分子熱ショックタンパク質分子シャペロン(HspA)、遺伝子座NP_681663;60kDシャペロニン1(GroEL-1)、遺伝子座NP_680976;60kDシャペロニン2(GroEL-2)、遺伝子座NP_682202;コ-シャペロニン(GroES)、遺伝子座NP_680977;およびエンドペプチダーゼ(ClpB)、遺伝子座NP_683242である。

その代わりとして、またはさらに、耐熱性に関与するタンパク質の内因性リプレッサーが下方制御または欠失される。例えば、破壊することができる例示的な調節遺伝子には、hrcA、例えば、シネコシスティス属の種PCC6803の遺伝子座NP_440130[Nakamoto H, Suzuki M, Kojima K. 「Targeted inactivation of the hrcA repressor gene in cyanobacteria.」 FEBS Lett (2003). 549(1-3):57-62]、およびヒスチジンキナーゼhik34、例えば、シネコシスティス属の種PCC6803の遺伝子座slr1285[Suzuki I, Kanesaki Y, Hayashi H, Hall J, Simon WJ, Slabas AR, Murata N. 「The histidine kinase Hik34 is involved in thermotolerance by regulating the expression of heat shock genes in Synechocystis.」 Plant Physiol (2005). 138(3):1409-21.]が含まれる。

さらに、またはその代わりとして、耐熱性を高めるために、細胞膜および細胞内膜の脂質プロファイルを改変することができる。注目すべきは、耐熱性が最も高い生物は、高飽和脂肪酸、しばしば、長いおよび/または環式の脂肪酸尾部を有する高飽和脂肪酸を保持する機構を進化させてきた。望ましい光独立栄養生物において天然で発現していれば、脂肪酸不飽和化酵素(EC1.14.19)、例えば、δ-12-不飽和化酵素、例えば、シネコシスティス属の種PCC6803のdesA遺伝子(遺伝子座NP_441489)、δ-15不飽和化酵素、例えば、シネコシスティス属の種PCC6803のdesB、遺伝子座NP_441622、ステアロイル-CoA9-不飽和化酵素(EC1.14.19.1)、例えば、シネコシスティス属の種PCC6803のdesC遺伝子、遺伝子座NP_442430、および/またはδ-6-不飽和化酵素(EC1.14.19.3)、例えば、シネコシスティス属の種PCC6803のdesD遺伝子、遺伝子座NP_441824を下方制御またはノックアウトすることが有用である。

さらに、またはその代わりとして、光独立栄養生物の耐熱性を改善するために、浸透圧保護剤ベタインの生合成を可能にする経路が操作される[Yang X, Wen X, Gong H, Lu Q, Yang Z, Tang Y, Liang Z, Lu C. 「Genetic engineering of the biosynthesis of glycinebetaine enhances thermotolerance of photosystem II in tobacco plants.」 Planta (2007). 225(3):719-33]。この態様において、グリシンをサルコシンに変換し、サルコシンをジメチルグリシンに変換するために、グリシンサルコシンメチルトランスフェラーゼが発現され、ジメチルグリシンのメチル化を触媒してベタインにするために、ジメチルグリシンメチルトランスフェラーゼが発現される[Waditee R, Bhuiyan NH, Rai V, Aoki K, Tanaka Y, Hibino T, Suzuki S, Takano J, Jagendorf AT, Takabe T, and Takabe T. 「Genes for direct methylation of glycine provide high levels of glycinebetaine and abiotic-stress tolerance in Synechococcus and Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci (2005). 102(5):1318-23]。例示的なグリシンサルコシンメチルトランスフェラーゼ遺伝子は、アファノテセ・ハロフィチカ(Aphanothece halophytica)に由来するApGSMT、遺伝子座BAC56939によってコードされる。例示的なジメチルグリシンメチルトランスフェラーゼは、アファノテセ・ハロフィチカに由来するApDMT、遺伝子座BAC56940によってコードされる。

実施例5:pH耐性の改善
ある特定の態様において、生物生産性を高めるために、CO₂レベルの上昇が用いられる。しかしながら、フォトバイオリアクター内のCO₂レベルが上昇すると、付随して培地の酸性度が上がり、これは細胞にとって有毒な場合がある。高い酸性度条件に対して耐性となるように細胞を操作すると、生産性が上がり、外部pH制御に関連した費用が少なくなる。本発明において、酸耐性を付与する1つまたは複数の機構が細胞に入るように操作される。

2つの類似したかつ相補的な酸耐性機構が、アミノ酸に基づく脱炭酸、および細胞内pHを上げる排出を使用する[Richard H, Foster JW. J Bacteriol (2004) 「Escherichia coli Glutamate- and Arginine-Dependent Acid Resistance Systems Increase Internal pH and Reverse Transmembrane Potential.」186(18):6032-6041]。

グルタミン酸に基づく酸耐性に必要な遺伝子は、グルタミン酸デカルボキシラーゼアイソザイムGadAおよびGadB、ならびにグルタミン酸/GABAアンチポーターGadCである。アルギニンに基づく酸耐性は、アルギニンデカルボキシラーゼAdiAおよびアルギニン/アグマチンアンチポーターAdiCを必要とする。さらに、両酸耐性機構とも、Cl^-チャネルEriCおよびMriTの少なくとも1つを必要とする[Iyer R, Iverson TM, Accardi A, Miller C. Nature (2002) 「A biological role for prokaryotic ClC chloride channels.」 419(6908):715-718]。好ましい態様では、高い酸耐性を付与するために、腸内細菌大腸菌K12に由来する、これらのアミノ酸に基づく酸耐性機構の1つまたは両方に必要な遺伝子が過剰発現される。これらの例示的な遺伝子はアミノ酸配列をコードし、グルタミン酸デカルボキシラーゼA(GadA)、EC4.1.1.15、遺伝子座NP_417974;グルタミン酸デカルボキシラーゼβ(GadB)、4.1.1.15、遺伝子座NP_416010;グルタミン酸:γ-アミノ酪酸アンチポーター(GadC)、遺伝子座NP_416009;生分解性アルギニンデカルボキシラーゼ(AdiA)、EC4.1.1.19、遺伝子座NP_418541);アルギニン:アグマチンアンチポーター(AdiC)、遺伝子座NP_418539);塩素イオンチャネルタンパク質(EriC)、遺伝子座NP_414697;および塩素イオンチャネルタンパク質(MriT)、遺伝子座NP_416109である。

さらに、もしくはその代わりとして、操作された細菌に酸耐性を付与するために、細菌酸応答機構に関与することが知られている遺伝子が過剰発現される。酸ストレスに応答して過剰発現される32の遺伝子が以前に同定されている[Ohta H, Shibata Y, Haseyama Y, Yoshino Y, Suzuki T, Kagasawa T, Kamei A, Ikeuchi M, Enami I. Photosynth Res (2005) 「Identification of genes expressed in response to acid stress in Synechocystis sp. PCC 6803 using DNA microarrays.」 84(1-3):225-230]。好ましい態様では、高い酸耐性を付与するために、細菌シネコシスティス属の種PCC6803において発現する遺伝子の1つまたは複数が過剰発現される。これらの例示的な遺伝子はアミノ酸配列をコードし、シャペロンタンパク質dnaK2(DnaK)、遺伝子座NP_441989;DNA指向性RNAポリメラーゼ、σサブユニット(sll0306)、遺伝子座NP_441950;Zn依存性プロテアーゼ(sll0528)、遺伝子座NP_442805;金属依存性ホスホエステラーゼ(sll0549)、遺伝子座NP_442414;酸ストレス耐性タンパク質(sll0846)、遺伝子座NP_441124;酸ストレス関連膜タンパク質(sll0939)、遺伝子座NP_440194;酸ストレス耐性タンパク質(sll1086)、遺伝子座NP_441667;酸ストレス耐性タンパク質(sll1483)、遺伝子座NP_442911;16.6kDaの小さな熱ショックタンパク質、分子シャペロン(sll1514)、遺伝子座NP_440316;マンノース-1-リン酸グアニルトランスフェラーゼ(sll1558)、EC2.7.7.13、遺伝子座NP_441699;RNAポリメラーゼσ因子(sll2012)、遺伝子座NP_441031;カルボキシル末端プロセシングプロテアーゼ(slr0008)、EC3.4.21.102、遺伝子座NP_442119;分子シャペロン(slr0093)、遺伝子座NP_442496;酸ストレス耐性タンパク質(slr0270)、遺伝子座NP_441273;ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素(slr0611)、遺伝子座NP_439899;酸ストレス耐性タンパク質(slr0967)、遺伝子座NP_440193;CheY様レシーバー(slr1214)、遺伝子座NP_440716;シグナル伝達ヒスチジンキナーゼ(slr1285)、遺伝子座NP_441610;酸ストレス耐性タンパク質(slr1413)、遺伝子座NP_440062;スーパーオキシドジスムターゼ(slr1516)、EC1.15.1.1、遺伝子座NP_441347;酸ストレス耐性タンパク質(slr1544)、遺伝子座NP_440790;酸ストレス耐性タンパク質(slr1573)、遺伝子座NP_442902;酸ストレス耐性タンパク質(slr1674)、遺伝子座NP_441676;ヒドロゲナーゼ発現/形成タンパク質(slr1675)、遺伝子座NP_441677;酸ストレス耐性タンパク質(slr1676)、遺伝子座NP_441678;酸ストレス耐性タンパク質(slr1687)、遺伝子座NP_441698;酸ストレス耐性タンパク質(slr1915)、遺伝子座NP_440459;エステラーゼ(slr1916)、遺伝子座NP_440460;ヒドロゲナーゼ成分タンパク質(ssl3044)、遺伝子座NP_441697;酸ストレス耐性タンパク質(ssl3769)、遺伝子座NP_441305;酸ストレス耐性タンパク質(ssr2016)、遺伝子座NP_440709;酸ストレス耐性タンパク質(ssr2595)、遺伝子座NP_440789)である。

実施例6:煙道ガス耐性
煙道ガスは、典型的には、N₂ (80％)、CO₂ (10〜15％)、O₂ (2〜3％)、ならびに微量のCO(70〜110ppm)、NO_x(最も典型的にはNO₂)(50〜70ppm)、SO₂ (180〜250ppm)からなる。煙道ガスの成分のうち、NO_xおよびSO₂のみが、光独立栄養生物の成長に悪影響を及ぼすと考えられている[Negoro M, Shioji N, Miyamoto K, Miura Y. 「Growth of microalgae in high CO₂ gas and effects of SO_x and NOx.」 Appl Biochem Biotechnol (1991). Spring (28-29): 877-86.]。

好ましい態様において、光独立栄養細胞は、NO₂を含むNO_xに対して改善した耐性を示すように操作される。NO₂耐性を改善する例示的な手段の1つは、ニトロソモナス・ユーロパエア(Nitrosomonas europaea)に由来するncgA(NP_841001)、ncgB(NP_841000)、およびncgC(NP_840999)遺伝子の過剰発現によるものである[Beaumont HJ, Lens SI, Westerhoff HV, and van Spanning RJ. 「Novel nirK cluster genes in Nitrosomonas europaea are required for NirK-dependent tolerance to nitrite.」 J. Bacteriol (2005). 187(19):6849-51]。

好ましい態様において、光独立栄養細胞は、SO₂を含むSO_xに対して改善した耐性を示すように操作される。SO₂耐性を改善する例示的な手段の1つは、シネココッカス属PCC7942(YP_398721)に由来するシステイン合成酵素A、cysK[O-アセチル-L-Ser(チオール)-リアーゼ](EC4.2.99.8および2.5.1.47)の過剰発現によるものである[Noji M, Saito, M, Nakamura M, Aono M, Saji H, Saito K. 「Cysteine synthase overexpression in tobacco confers tolerance to sulfur-containing environmental pollutants.」 Plant Physiology (2001). 126:973-980]。さらに、またはその代わりとして、スーパーオキシドジスムターゼ、例えば、シネコシスティス属の種PCC6803に由来する例示的なsodA(NP_441347;EC1.15.1.1)遺伝子が過剰発現される。好ましい態様において、カタラーゼ、例えば、シネコシスティス属の種PCC6803に由来するkatG(NP_441295; EC 1.11.16) 遺伝子も過剰発現される[Tseng MJ, Liu CW, Yiu JC. 「Enhanced tolerance to sulfur dioxide and stress of transgenic Chinese cabbage plants expressing both superoxide dismutase and catalase in chloroplasts.」 Plant Physiol. Biochem (2007). 45(10-11):822-33]。

鉛、クロム、銅、水銀などの重金属は工業燃焼プロセスの副産物であり、一般的に、排気煙道ガスを通じて放出され、ラン藻類に対して毒性の脅威をもたらす。これらのおよび他の重金属汚染物質に対する耐性を付与するようにラン藻類に入れて操作することができる遺伝子が同定されている。例えば、重金属耐性の付与に潜在的に関連している遺伝子は、天然プラスミドpMOL28(アクセッション番号NC_006525)およびpMOL30(アクセッション番号NC_006466)上に見られる。これらのプラスミドは、最初、工業沈殿物、土壌、および廃棄物、または高レベルの重金属毒性を有する他の領域における細菌コロニー形成土壌中のラルストニア・メタリデュランス(Ralstonia metallidurans)において同定された。pMOL28およびpMOL30プラスミドは、コバルト、ニッケルおよびクロム酸に対する重金属耐性(pMOL28)、ならびにコバルト、亜鉛、カドミウム、銅、鉛および水銀に対する重金属耐性(pMOL30)を付与する。例えば、鉛耐性に関与することが知られているpMOL28遺伝子およびタンパク質には、pbrT(アクセッション番号YP_145624)、pbrR(アクセッション番号YP_145623)、Pb排出ATPアーゼ(アクセッション番号YO_145622)、およびpbrD(アクセッション番号YP_145620)が含まれる。ニッケル耐性およびコバルト耐性に関与するpMOL28遺伝子には、cnrC(アクセッション番号CAI30229)、cnrA(アクセッション番号CAI30227)、推定ニッケルおよびコバルト耐性遺伝子(アクセッション番号CAI11305;CAI11304;CAI11303)が含まれる。多基質認識タンパク質(コバルト-亜鉛-カドミウム)が、遺伝子czcD(アクセッション番号YP_145593.1)、czcC(アクセッション番号YP_145593.1)、およびczcB(アクセッション番号YP_145594.1)によってコードされる。銅耐性のためのpMOL30遺伝子には、copA(アクセッション番号YP_145682.1)、copK(アクセッション番号Q58AD3;2K0Q_A)、copC(アクセッション番号YP_145680.1)、copD(アクセッション番号YP_145679.1)、および銅耐性膜貫通タンパク質(アクセッション番号YP_14682)が含まれる。クロム酸耐性遺伝子のpMOL30遺伝子には、chrB(アクセッション番号YP_16177)およびクロム酸輸送タンパク質遺伝子(アクセッション番号YP_161712)が含まれる。pMOL30上の他の重金属耐性遺伝子は水銀耐性を付与することができ、水銀輸送タンパク質遺伝子(アクセッション番号YP_161729)、ペリプラズム水銀イオン結合タンパク質遺伝子(アクセッション番号YP_161728)、推定水銀還元酵素遺伝子(アクセッション番号YP_161727)、および推定水銀耐性タンパク質遺伝子(アクセッション番号YP_161725)を含む。

金属耐性を付与する遺伝子の他の供給源は、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)において同定され、2つの水銀耐性遺伝子merI(アクセッション番号ABL96631)およびmerH(アクセッション番号ABL96629)、ならびに水銀還元酵素遺伝子merA(アクセッション番号ABL96630)を含む。または、水銀耐性を付与するオペロンがストレプトマイセス属の種CHR28において同定されており、水銀還元酵素merA(アクセッション番号AAF64138)、有機水銀化合物リアーゼmerB(アクセッション番号AAF64140)、水銀輸送merT(アクセッション番号AAF64136)、orfIV(アクセッション番号AAF64134)、および細胞外水銀結合タンパク質merP(アクセッション番号AAF64135)を含む。

これらの実施例は、重金属耐性を付与するための潜在的な遺伝子供給源の一部にすぎず、包括的かつ限定的なものであると解釈すべきでない。例えば、最近、トルコのグループは、埋立地から単離した細菌に由来するプラスミドが複数の重金属耐性を媒介したことを報告した(MN Unaldi-Coral, et al., Annals Microbio. (2005) vol. 55(3):175-179)。金属耐性遺伝子の他の供給源には、植物および酵母(S. Clemens, et al., EMBO (1999) vol. 18:3325-3333)、シュードモナス属(Pseudomonas)の種(D. Reneiro, et al., Gene (1995) vol. 166:77-82)、細菌種、例えば、毒性環境からの適応可能な圧力に供された大腸菌(KR Brocklehurst and AP Morby, Microbiology (2000) vol. 146:2277-2282)などが含まれる。

実現可能性の研究から、細菌種が首尾よく形質転換され、重金属耐性を媒介する遺伝子を発現できることが分かっている。例えば、大腸菌属(Escherichia)の種が、他の細菌、例えば、バチルス属(Bacillus)(Y. Wang, et al., J. Bacteriology (1987) vol. 169:4848-4851)ならびにマウスを含む高等生物(CC Huang, et al. Gene (1999) vol. 239:361-366)において見出される遺伝子から水銀耐性を付与するように変えられている。

実施例7:耐塩性の操作
多くの地理学的場所において、利用可能な水供給は高塩分の影響を受けている。結果として、ある特定の態様では、汽水(8〜500mM NaCl)または海水(約530mM)の中で光独立栄養生物を繁殖させることが有利である。関心対象の光独立栄養細胞がこれらの条件下で良く育つことができない場合に、耐塩性を付与する核酸を過剰発現することが必要である。

1つの態様において、Na⁺/H⁺アンチポーターが過剰発現される。例示的なNa⁺/H⁺アンチポーターは、耐塩性ラン藻類アファノテセ・ハロフィチカに由来するapnhaP遺伝子(遺伝子座BAB69459)である[Waditee R, Hibino T, Nakamura T, Incharoensakdi A, and Takabe T. 「Overexpression of a Na⁺/H⁺ antiporter confers salt tolerance on a freshwater cyanobacterium, making it capable of growth in sea water.」 Proc Natl Acad Sci (2002). 99(6):4109-4114]。場合によっては、海水中での増殖速度を改善するために、カタラーゼ、例えば、シネコシスティス属の種PCC6803に由来するkatG(NP_441295;EC1.11.16)遺伝子も過剰発現される。

さらに、またはその代わりとして、クラミドモナス属の種W80の塩およびカドミウムのストレスに関連する新規の遺伝子、scsr、遺伝子座BAE53693が発現される[Tanaka S, Suda Y, Ikeda K, Ono M, Miyasaka H, Watanabe M, Sasaki K, and Hirata K. 「A novel gene with antisalt and anticadmium stress activities from the halotolerant marine green alga Chlamydomonas sp. W80.」 FEMS Microbiol Lett (2007). 271:48-52]。

さらに、またはその代わりとして、クラミドモナス属の種W80のbreast basic conserved遺伝子、bbc1、遺伝子座BAA23724が発現される[Tanaka S, Ikeda K, and Miyasaka H. 「Enhanced tolerance against salt-stress and freezing-stress of Escherichia coli cells expressing algal bbc1 gene.」 Curr. Microbiol (2001). 42:173-177]。

さらに、またはその代わりとして、光独立栄養生物の耐塩性を改善するために、浸透圧保護剤ベタインの生合成を可能にする経路が操作される。この態様において、グリシンをサルコシンに変換し、サルコシンをジメチルグリシンに変換するために、グリシンサルコシンメチルトランスフェラーゼが発現され、ジメチルグリシンのメチル化を触媒してベタインにするために、ジメチルグリシンメチルトランスフェラーゼが発現される[Waditee R, Bhuiyan NH, Rai V, Aoki K, Tanaka Y, Hibino T, Suzuki S, Takano J, Jagendorf AT, Takabe T, and Takabe T. 「Genes for direct methylation of glycine provide high levels of glycinebetaine and abiotic-stress tolerance in Synechococcus and Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci (2005). 102(5):1318-23]。例示的なグリシンサルコシンメチルトランスフェラーゼ遺伝子は、アファノテセ・ハロフィチカに由来するApGSMT、遺伝子座BAC56839によってコードされる。例示的なジメチルグリシンメチルトランスフェラーゼは、アファノテセ・ハロフィチカに由来するApDMT、遺伝子座BAC56940によってコードされる。

耐塩性が改善したトランスジェニックラン藻類
アファノテセ・ハロフィチカに由来するNa/H+アンチポーター(アクセッション番号:BAB69459)との相同性によって同定された、シネココッカス属の種PCC7002に由来する推定Na/H+アンチポーターを、以下のプライマー:NaHフォワードプライマー-

、NaHリバースプライマー-

を用いて、PCR増幅した。フォワードプライマーによりNdeI制限エンドヌクレアーゼ認識部位が付加され、リバースプライマーによりMfeI制限部位が付加される。

PCR産物をpJB263に、インサートおよびベクターを個々にNdeIおよびEcoRI(New England Biolabs)で消化することによってクローニングした。両消化物を、標準的な技法を用いて、1％TAEアガロースゲル上でゲル単離し、Gel Extraction Kit(Qiagen)を用いて精製し、Quick Ligation Kit (New England Biolabs)を用いて連結した。連結された産物により、標準的な技法を用いて、化学的にコンピテントなEPI400細胞(EpiCentre)を形質転換し、これをPCRによって確認した。結果とした生じたプラスミド、pJB263-NaHをPCR分析によって確認した。

以下の手順を用いて、シネコシスティス属の種PCC6803の細胞をpJB263-NaHで形質転換した。シネコシスティス属の種PCC6803を形質転換するために、pJB263-NaHプラスミドストックを、Qiagenミニプレップキットを用いて精製した。1〜2マイクログラムのpJB263-NaHプラスミドを、光学密度1まで増殖させたシネコシスティス属の種PCC6803細胞に添加し、低強度軌道振盪および低照度光源を用いて30℃で4時間インキュベートした。次いで、細胞をA⁺固体培地プレート上にプレートし、照明付きインキュベーター(100〜250uE/m2/s、30℃)に1日間入れた。25マイクログラム/mLスペクチノマイシンをプレートの下層におき、コロニーが増殖するまでインキュベートした(約5日)。標的シネコシスティス属宿主細胞への組込みは、「コロニーPCR」プロトコールによる全細胞ゲノムDNAのPCRによって確認した。

実施例8:栄養分非依存性
CO2および光に加えて、光独立栄養生物は、典型的には、無機栄養源およびビタミンを必要とする。必要とされる栄養分は、一般的には、このような生物をベンチスケールで増やしている間に増殖培地に添加される。しかしながら、このような栄養分には、工業スケールのバイオプロセスの状況では法外な費用がかかる。

窒素は、アミノ酸およびヌクレオチドを含む様々な細胞高分子の重要な構成要素である。安価な供給源を効率的に利用するように光独立栄養体を操作すると、大きな経済的利点および実用的利点が得られる。

1つの態様において、空気中および煙道ガス中にほぼ80％(v/v)の濃度で存在することが見出されているN₂を固定するように光独立栄養体が操作される。この態様において、必要とされる補因子およびアクセサリータンパク質の合成に必要な遺伝子[Herrero A, Muro-Pastor AM, Flores E. J Bacteriol (2001) 「Nitrogen Control in Cyanobacteria」. 183(2):411-425]に加えて、窒素固定に必要な遺伝子が過剰発現される。このような18の例示的な遺伝子:FeMo補因子生合成タンパク質(NifB)、遺伝子座NP_485557;[4Fe-4S]フェレドキシン(FdxN)、遺伝子座BAB77882;L-システイン脱硫酵素(NifS)、EC2.8.1.7、遺伝子座NP_485499;Feクラスターアクセサリータンパク質(NifU)、遺伝子座NP_485498;ニトロゲナーゼ-Feサブユニット(NifH)、EC1.18.6.1、遺伝子座NP_485497;ニトロゲナーゼ-αサブユニット(NifD)、EC1.18.6.1、遺伝子座NP_485484;ニトロゲナーゼ-βサブユニット(NifK)、EC1.18.6.1、遺伝子座NP_485483;FeMo補因子生合成タンパク質(NifE)、遺伝子座NP_485481;FeMo補因子生合成タンパク質(NifN)、遺伝子座NP_485480;FeSクラスターアクセサリータンパク質(NifX)、遺伝子座NP_485479;FeMo補因子アクセサリータンパク質(NifW)、遺伝子座NP_485476;FeMo補因子アクセサリータンパク質(HesA)、遺伝子座NP_485475;FeS補因子アクセサリータンパク質(HesB)、遺伝子座NP_485474;窒素固定特異的フェレドキシン(FdxH)、遺伝子座NP_485473;ピルビン酸-フラボドキシン酸化還元酵素(NifJ)、EC1.2.7.1、遺伝子座NP_486843;ホモクエン酸合成酵素(NifV)、EC2.3.3.14、遺伝子座NP_485450;FeMo補因子アクセサリータンパク質(NifZ)、遺伝子座NP_485451;およびFeMo補因子アクセサリータンパク質(NifT)、遺伝子座NP_485452)が、ノストック属の種PCC7120において見出される。前記遺伝子を過剰発現させると、光独立栄養生物は、唯一の窒素源としてN₂ガスを用いて増殖できるようになる。

さらに、またはその代わりとして、煙道ガスの微量成分である亜硝酸を同化するように、光独立栄養が操作される。この態様では、細胞を、亜硝酸/硝酸輸送体を発現するように操作し、亜硝酸をアンモニアに変換する能力と共に運ばなければならない。活性のある硝酸/硝酸輸送体をコードする例示的な遺伝子配列、例えば、ABC型硝酸/亜硝酸輸送系基質結合タンパク質(NrtA)、遺伝子座YP_171021;ABC型硝酸/亜硝酸輸送系パーミアーゼタンパク質(NrtB)、遺伝子座YP_171022;ABC型硝酸/亜硝酸輸送系ATP結合タンパク質(NrtC)、遺伝子座YP_171023;ABC型硝酸/亜硝酸輸送系ATP結合タンパク質(NrtD)、遺伝子座YP_171024)が、シネココッカス属の種PCC6301において見出され[Herrero A, Muro-Pastor AM, Flores E. J Bacteriol (2001)「Nitrogen Control in Cyanobacteria」. 183(2): 411-425]、硝酸および亜硝酸を移入するために細胞において過剰発現される。その代わりとして、シネココッカス属の種PCC7002に由来する単一のポリペプチド硝酸/亜硝酸輸送体(NrtP)遺伝子、亜硝酸/硝酸パーミアーゼ(NrtP)、遺伝子座AAD45941が過剰発現される[Sakamoto T, Inoue-Sakamoto K, Bryant DA. J Bacteriol (1999). 「A Novel Nitrate/Nitrite Permease in the Marine Cyanobacterium Synechococcus sp. Strain PCC 7002.」181(23):7363-7372]。

高濃度では、亜硝酸はほとんどの細胞に対して毒性である。亜硝酸毒性を軽減するために、光独立栄養細胞は、ニトロソモナス・ユーロパエアATCC19718において見出された亜硝酸耐性オペロン内の遺伝子[Beaumont HJE, Lens SI, Westerhoff HV, van Spanning RJM. 「Novel nirK Cluster Genes in Nitrosomonas europaea Are Required for NirK-Dependent Tolerance to Nitrite.」 J Bacteriol (2005). 187(19):6849-6851]、マルチ銅オキシダーゼ1型(NirK)、遺伝子座NP_840998;チトクロムc、クラスIC(NcgA)、遺伝子座NP_841001;チトクロムc、クラスI(NcgB)、遺伝子座NP_841000;チトクロムc、クラスIC(NcgC)、遺伝子座NP_840999を過剰発現するように操作される。

さらに、またはその代わりとして、光独立栄養細胞はアンモニアを同化するように操作される。この態様において、細胞はアンモニウムパーミアーゼを過剰発現するように操作される。シネコシスティス属の種PCC6803において見出される例示的なアンモニウムパーミアーゼ[Montesinos ML, Muro-Pastor AM, Herrero A, Flores E. 「Ammonium/Methylammonium Permeases of a Cyanobacterium. Identification and analysis of three nitrogen-regulated amt genes in Synechocystis sp. PCC 6803.」 J Biol Chem(1998). 273(47):31463-31470]:高親和性アンモニウム/メチルアンモニウムパーミアーゼ(Amt1)、遺伝子座NP_442561;アンモニウム/メチルアンモニウムパーミアーゼ(Amt2)、遺伝子座NP_440272;アンモニウム/メチルアンモニウムパーミアーゼ(Amt3)、遺伝子座NP_442793が過剰発現される。

さらに、またはその代わりとして、尿素を同化するように光独立栄養細胞が操作される。この態様では、尿素輸送体を過剰発現して、尿素を細胞に効率的に取り込むように、細胞を操作しなければならない。高親和性尿素取り込みのための5つのABC型輸送体、例えば、ABC型、高親和性尿素パーミアーゼ、ペリプラズムドメイン(UrtA)、遺伝子座CAB70948.1;ABC型、高親和性尿素パーミアーゼ、膜ドメイン(UrtB)、遺伝子座CAB70949.1;ABC型、高親和性尿素パーミアーゼ、膜ドメイン(UrtC)、遺伝子座CAB70950.1;ABC型、高親和性尿素パーミアーゼ、ATP結合ドメイン(UrtD)、遺伝子座CAB70951.1、およびABC型、高親和性尿素パーミアーゼ、ATP結合ドメイン(UrtE)、遺伝子座CAB70952.1を含む、ノストック属の種PCC7120において見出される例示的な尿素輸送体[Valladares A, Montesinos ML, Herrero A, Flores E. 「An ABC-type, high-affinity urea permease identified in cyanobacteria.」 Molecular Microbiology (2002). 43(3):703-715]が過剰発現される。

さらに、尿素アミドヒドロラーゼ(EC3.5.1.5)(「ウレアーゼ」)およびその関連するアクセサリータンパク質が過剰発現される。これは、尿素からアンモニアおよび二酸化炭素への変換を触媒する。ureABCウレアーゼ遺伝子:尿素アミドヒドロラーゼ、γサブユニット(ureA)、遺伝子座AAC61500;尿素アミドヒドロラーゼ、βサブユニット(UreB)、遺伝子座AAC61501;尿素アミドヒドロラーゼ、αサブユニット(UreC)、遺伝子座AAC61502;およびをアクセサリータンパク質ウレアーゼアクセサリータンパク質をコードするureDEFG 遺伝子(UreD)、遺伝子座AAC61499;ウレアーゼアクセサリータンパク質(UreE)、遺伝子座AAC61498;ウレアーゼアクセサリータンパク質(UreF)、遺伝子座AAC61497;およびウレアーゼアクセサリータンパク質(UreG)、遺伝子座AAC61496を含む、シネココッカス属の種WH7805において見出される例示的なウレアーゼ[Collier J, Brahamsha B, Palenik B. 「The marine cyanobacterium Synechococcus sp. WH7805 requires urease to utilize urea as a nitrogen source: molecular-genetic and biochemical analysis of the enzyme」 Microbiology (1999). 145(2):447-459]が過剰発現される。

ビタミンB12は、ラジカルベースの反応触媒を容易にするビタミン補因子である。シネココッカス属の種PCC7002などの、調査された全微細藻類の少なくとも半分を含む多くの生物は、増殖のためにビタミンB12の外部供給源を必要とし、これには、大規模な工業バイオプロセスでは法外な費用がかかる[Croft MT, Warren MJ, Smith AG. 「Algae Need Their Vitamins」, Eukaryotic Cell (2006) 5(8):1175-1183]。1つの態様において、ビタミンB12生合成経路を発現するように光独立栄養細胞を操作することによって、ビタミンB12は不要になる。以下の20の遺伝子:ウロポルフィリン-III C-メチルトランスフェラーゼ(CysG)、EC2.1.1.107、遺伝子座NP_462380;シロヒドロクロリンコバルトキラターゼ(CbiK)、EC4.99.1.3、遺伝子座NP_460970;プレコリン-2 C20-メチルトランスフェラーゼ(CbiL)、EC2.1.1.130、遺伝子座NP_460969;プレコリン-3Bメチラーゼ(CbiH)、EC2.1.1.131、遺伝子座NP_460972;二機能CbiG/プレコリンメチルトランスフェラーゼ(CbiG)、遺伝子座NP_460973;プレコリン-4 C11-メチルトランスフェラーゼ(CbiF)、EC2.1.1.133、遺伝子座NP_460974;コバラミン生合成タンパク質(CbiD)、遺伝子座NP_460977;NADPH依存性プレコリン-6A還元酵素(CbiJ)、EC1.3.1.54、遺伝子座NP_460971;プレコリン-6B C5,15-メチルトランスフェラーゼ(CbiE)、EC2.1.1.132、遺伝子座NP_460976;プレコリン-6B C12デカルボキシラーゼ(CbiT)、EC2.1.1.132、遺伝子座NP_460975;プレコリン-8X-メチルムターゼ(CbiC)、EC5.4.1.2、遺伝子座NP_460978;コビリニン酸A,C-ジアミド合成酵素(CbiA)、EC6.3.1.-、遺伝子座NP_460980;コビリニン酸(I)a,c-ジアミドアデノシルトランスフェラーゼ(BtuR)、EC2.5.1.17、遺伝子座NP_460677;コビリニン酸合成酵素(CbiP)、EC6.3.5.10、遺伝子座NP_460964;コビリニン酸デカルボキシラーゼ(CobD)、EC4.1.1.81、遺伝子座NP_459636;アデノシルコビナミド-リン酸合成酵素(CbiB)、EC6.3.1.10、遺伝子座NP_460979;αリバゾール-5'-Pホスファターゼ(CobC)、EC3.1.3.73、遺伝子座NP_459635;コバラミン(5'リン酸)合成酵素(CobS)、EC2.7.8.26、遺伝子座NP_460962;コビナミドリン酸グアニリルトランスフェラーゼ(CobU)、EC2.7.7.62、遺伝子座NP_460963;およびニコチン酸-ヌクレオチドジメチルベンズイミダゾール-Pホスホリボシルトランスフェラーゼ(CobT)、EC2.4.2.21、遺伝子座NP_460961)を含むが、これに限定されない、ネズミチフス菌において見出される例示的な生合成経路が過剰発現される。

さらに、コバルトの取り込みおよびビタミンB12への組込みを可能にするために、コバルト輸送体をコードする遺伝子が過剰発現される。ネズミチフス菌において見出された例示的なコバルト輸送体タンパク質:ABC型Co2+輸送系、パーミアーゼ成分(CbiM)、遺伝子座NP_460968;ABC型コバルト輸送系、ペリプラズム成分(CbiN)、遺伝子座NP_460967;およびABC型コバルト輸送系、パーミアーゼ成分(CbiQ)、遺伝子座NP_461989)が過剰発現される。

好ましい態様では、ビタミンB12非依存性酵素を過剰発現して、この補因子を全く必要としなくするように、光独立栄養生物が操作される。ほとんどの光独立栄養生物では、メチオニン合成酵素(EC2.1.1.13)およびクラスIIリボヌクレオチド還元酵素しかビタミンB12を必要としない。従って、サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)に由来する例示的なビタミンB12非依存性メチオニン合成酵素(EC2.1.1.14):5-メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸-ホモシステインメチルトランスフェラーゼ(MetE)、遺伝子座NP_229090が過剰発現される。さらに、シネコシスティス属の種PCC 6803に由来する例示的なクラスIリボヌクレオチド還元酵素(nrdAB):リボヌクレオシド-二リン酸還元酵素、αサブユニット(NrdA)、遺伝子座NP_441654;リボヌクレオシド-二リン酸還元酵素、βサブユニット(NrdB)、遺伝子座NP_443040が過剰発現される。

さらに、本発明の宿主細胞の栄養(例えば、ビタミンB12)非依存性は、5-メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸-ホモシステインメチルトランスフェラーゼ(metE)、リボヌクレオシド-二リン酸還元酵素、αサブユニット(nrdA)、およびリボヌクレオシド-二リン酸還元酵素、βサブユニット(nrdB)をコードする様々なタンパク質を、metE、nrdAまたはnrdBと少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一の配列を含めて、発現させることによって達成できることが意図される。

株の構築
発現プラスミドpJB5は、シネココッカス属の種PCC 7002の天然pAQ1プラスミド上の配列と相同な2つの500bp DNA領域を含有する。2つの相同性領域の間には、プロモーターおよびリボソーム結合部位、DNA配列挿入部位、ならびにスペクチノマイシン耐性を付与する耐性カセットaadA1がある。大腸菌に由来するmetE遺伝子(NP_418273)およびサーモシネココッカス・エロンガタスBP-1に由来するmetE遺伝子(NP_681881)がそれぞれpJB6上およびpJB7上にコードされる。これらのプラスミドは全て、NdeI(New England Biolabs)およびEcoRI(New England Biolabs)を用いて消化され、pJB6およびpJB7に由来する約1kb断片、ならびにpJB5に由来する大きな断片を、標準的な技法(Qiagen)を用いてゲル単離および精製した。pJB6およびpJB7に由来する断片を、標準的な技法を用いてpJB5に連結および形質転換して、pJB5-6およびpJB5-7を形成した。

シネココッカス属の種PCC 7002を、以下の通り、pJB5-6およびpJB5-7を用いて形質転換した。pJB5-6およびpJB5-7を、SbfI(New England Biolabs)で1時間、消化および不活性化し、熱失活させた。DNAを、暗いインキュベーター内で、A⁺中で、OD730 1の新鮮な細胞と37℃で4時間インキュベートした。次いで、細胞を新鮮なA⁺培地20mLで希釈し、光を中程度にし、1％CO₂を含む空気を用いて24時間、通気した。次いで、細胞を、10ug/mLスペクチノマイシンを含有する新鮮なA⁺培地で20倍希釈し、同じ条件下で5日間増殖させた。再度、細胞を、ビタミンB12を含まないA⁺培地25mLで20倍希釈し、細胞を高密度まで増殖させた後に、これを2回繰り返した。2回目の増殖の後、細胞を、ビタミンB12を含まないA⁺プレート上にプレートした。

図3A〜Dは、希釈し、ビタミンB12を含まないA⁺培地において一晩増殖させた、野生型シネココッカス属の種PCC 7002、ならびに大腸菌MetEを遺伝子導入により発現する細胞およびサーモシネココッカス・エロンガタスBP-1 MetEを遺伝子導入により発現する細胞を示す。細胞を希釈し、次いで、プレートし、照明付きインキュベーター内で、ビタミンB12が十分なプレートおよびビタミンB12欠損プレート上で37℃で1週間、増殖させた。図3Aは、B12が十分なプレート上での野生型シネココッカス属を示すのに対して、図3Bは、ビタミンB12欠損プレートを示す。図3Cは、ビタミンB12欠損プレート上での、大腸菌MetEを有するトランスジェニックシネココッカス属株を示し、図3Dは、ビタミンB12欠損プレート上でのサーモシネココッカス・エロンガタスMetEを示す。結果から、遺伝子導入により発現したメチオニン合成酵素は、ラン藻類のビタミンB12要求をレスキューする(rescue)ことが分かる。

実施例9:近赤外光吸収
アカリオコリス・マリナ(Acaryochloris marina)は、主なChl構成要素としてクロロフィル(Chl)dを有することが知られている唯一の生物である。Chl dは700nm〜750nmの近赤外光を吸収し、酸素発生光合成を行う。アカリオコリス・マリナはまた、主な構成要素として多くの生物に見出されるChl aも含有する。Chl aは、ホルミル基の代わりにビニル基を有するという点のみChl dと異なる。次いで、本発明者らは、図4に示した機構の1つまたは複数によって、Chl dはChl aから得られる(すなわち、Chl d前駆体は類似するChl a前駆体から得られると考えた)。

アカリオコリス・マリナゲノムは配列決定およびアノテートされているので、ゲノム内に含まれる、推定のオキシゲナーゼをコードする遺伝子およびエポキシドヒドロラーゼをコードする遺伝子の位置を決定することができる。図6は、ある形の「オキシゲナーゼ」として、A.マリナのアノテーションにおいて明確に同定された遺伝子を列挙している。これらの同定は、他の公知のオキシゲナーゼとの相同性比較によってなされたので、BLAST検索はこれ以上行わなかった。図7は、Protein BLASTによって決定された、EC3.2.2.3(エポキシドヒドロラーゼ)をコードするアナベナ・バリアビリス(Anabaena variabilis)遺伝子と最も類似するA.マリナ由来遺伝子を列挙している。期待値が0.5未満の全ての遺伝子を示した。クエリーとして使用したタンパク質配列を図5に示した。

Swingley et al., PNAS 105:2005(2008)において、Sアデノシルメチオニン(SAM)を用いて水から酸素を転移する方法が代替の酸素化法であると指摘されている。このタイプの推定タンパク質をコードする遺伝子を図8に示した。

遺伝子座タグAM1_5665に対応するタンパク質(タンパク質id ABW30612.1)[アカリオコリス・マリナMBIC11017](図6B)は、Swingley et al., PNAS 105:2005(2008)によって、可能性のあるオキシゲナーゼと指摘されたが、公知の例と大きな相同性を有さない。このことは、Chl d形成において特に重要であることを意味するのかもしれない。

遺伝子座タグAM1_2935に対応するタンパク質(タンパク質id ABW27932.1)[アカリオコリス・マリナMBIC11017]は、可能性のあるチオレドキシンであり、GenBankアノテーションにおいて、「epox」を明確に含有する唯一の遺伝子であると見出された(図7を参照されたい)。

遺伝子座タグAM1_5023)に対応するタンパク質(タンパク質id ABW29989.1)[アカリオコリス・マリナMBIC11017]および遺伝子座タグAM1_5798)に対応するタンパク質(タンパク質id ABW30743.1)[アカリオコリス・マリナMBIC11017]は、Swingley et al., PNAS 105:2005(2008)による配列決定された他のラン藻類とほとんど相同性を共有せず、従って、Chl d合成において重要である可能性がある。

光受容体としてクロロフィルdを使用することができる光化学系タンパク質のアカリオコリス・マリナ遺伝子およびコードされるタンパク質配列は、2000年6月7日に株式会社海洋バイオテクノロジー研究所、東京都文京区本郷1丁目28番10号によって出願された特願2000-170696に対応する、2001年12月18日に公開された特開2001-346585、発明の名称「クロロフィルdを光受容色素として用いることのできる光化学系タンパク質とそれをコードする遺伝子」において提供される。この全開示は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。アカリオコリス・マリナ遺伝子座タグAM1_2457、AM1_2458、AM1_2166、AM1_1083、AM1_2026、およびAM1_1084に対応する6つの光化学系タンパク質のアミノ酸配列を、特開2001-346585出願から取得し、BLASTP検索のクエリー配列として使用した。BLASTP検索によって、表6に示し、図9に見られる、6つの光化学系タンパク質に対応する完全長アミノ酸配列が同定された。

アカリオコリス・マリナ遺伝子座タグAM1_2457に対応するタンパク質(タンパク質id ABW27465.1)[アカリオコリス・マリナMBIC11017]は、光化学系Iコアタンパク質PsaAである。アカリオコリス・マリナ遺伝子座タグAM1_2458に対応するタンパク質(タンパク質id ABW27466.1)[アカリオコリス・マリナMBIC11017]は、光化学系Iコアタンパク質PsaBである。これらの2サブユニットタンパク質は一緒に集合して、光エネルギーを酸化還元力に変換し、光化学系IIによって供給された電子を用いてNADP⁺を還元する光化学系Iタンパク質を形成する。

アカリオコリス・マリナ遺伝子座タグAM1_2166)に対応するタンパク質(タンパク質id ABW27180.1)[アカリオコリス・マリナMBIC11017]は、光化学系II D1タンパク質PsbAである。アカリオコリス・マリナ遺伝子座タグAM1_1083)に対応するタンパク質(タンパク質id ABW26122.1)[アカリオコリス・マリナMBIC11017]は、光化学系II D2タンパク質PsbDである。PsbAおよびPsbDは一緒に集合して、光化学系IIタンパク質を形成する。光化学系IIタンパク質は、光エネルギーを酸化還元力に変化し、水を分解し、電子を取り込み、光化学系Iに電子を供給する。

アカリオコリス・マリナ遺伝子座タグAM1_2026に対応するタンパク質(タンパク質id ABW27041.1)[アカリオコリス・マリナMBIC11017]は、光化学系II CP47タンパク質PsbBである。アカリオコリス・マリナ遺伝子座タグAM1_1084)に対応するタンパク質(タンパク質id ABW26123.1)[アカリオコリス・マリナMBIC11017]は、光化学系II CP43タンパク質PsbCである。PsbBおよびPsbCは集合し、光化学系IIコアアンテナタンパク質を形成する。水分解に用いられる光エネルギーを捕獲するためにアンテナによって吸収されたエネルギーは、反応中心タンパク質に送られる。

本発明の一態様によれば、近赤外光(すなわち、700nm〜750nm付近の光)を吸収するように光独立栄養体が作り出される。この態様において、クロロフィルdの合成、ならびにクロロフィルdに結合し、光エネルギーを還元力に変換するための光受容体としてクロロフィルdを使用することができる光化学系タンパク質IおよびIIの合成に必要な遺伝子が過剰発現される。例示的な遺伝子には、本明細書において開示されるアカリオコリス・マリナタンパク質のいずれかをコードする遺伝子が含まれる。

（表7）非公式の配列表(5’->3’)

科学刊行物、条約、付与前(pre-grant)の特許公報、および発行された特許を含む刊行物の全ての引用は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書の開示は、本発明を例示することを目的とし、本発明を限定することを目的とせず、本発明の範囲は以下の特許請求の範囲によって決定される。

Claims

光捕獲核酸、二酸化炭素固定経路核酸、NADH経路核酸、NADPH経路核酸、耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、栄養分非依存性核酸、および近赤外光吸収核酸からなる群より選択される少なくとも1つの操作された核酸を含み、該操作された核酸によってコードされる異種タンパク質を発現するか、該操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を過剰発現するか、該操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を下方制御するか、または該操作された核酸の存在の結果として遺伝子がノックアウトされている、操作された光合成細胞。
複数の操作された光捕獲核酸、二酸化炭素固定経路核酸、NADH経路核酸、NADPH経路核酸、耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、栄養分非依存性核酸、および近赤外光吸収核酸をさらに含む、請求項1記載の操作された光合成細胞。
複数の操作された核酸が複数の異種核酸をコードする、請求項2記載の操作された光合成細胞。
操作された光捕獲核酸が、プロテオロドプシン、バクテリオロドプシン、デルタロドプシン、オプシン、キサントロロドプシン、レチナール生合成経路タンパク質、およびATP合成酵素タンパク質を含む群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
操作された光捕獲核酸が、イソペンテニル二リン酸δイソメラーゼ;15,15’-βカロチンジオキシゲナーゼ;リコペンシクラーゼ;フィトエン合成酵素;フィトエンデヒドロゲナーゼ;ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素;およびβカロチンケトラーゼタンパク質からなる群より1つまたは複数のタンパク質を含む1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項4記載の操作された光合成細胞。
ATP合成酵素タンパク質が、膜結合型ATP合成酵素のF0セクター、サブユニットaタンパク質;膜結合型ATP合成酵素のF0セクター、サブユニットcタンパク質;膜結合型ATP合成酵素のF0セクター、サブユニットbタンパク質;膜結合型ATP合成酵素のF1セクター、αサブユニットタンパク質;膜結合型ATP合成酵素のF1セクター、εサブユニットタンパク質;膜結合型ATP合成酵素のF1セクター、βサブユニットタンパク質;膜結合型ATP合成酵素のF1セクター、γサブユニットタンパク質;および膜結合型ATP合成酵素のF1セクター、δサブユニットタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項4記載の操作された光合成細胞。
操作された核酸が存在することで、ApcEタンパク質、CpcG1タンパク質、CpcA(フィコシアニンαサブユニット)タンパク質、CpcB(フィコシアニンβサブユニット)タンパク質、CpcC(フィコビリソームロッドリンカーペプチド)タンパク質、CpcD(フィコシアニンリンカータンパク質9K)タンパク質、CpcE(フィコビリソーム成熟タンパク質)タンパク質、CpcG(フィコビリソームロッドコアリンカーポリペプチド)タンパク質、CpcF(フィコシアニンαサブユニットフィコシアノビリンリアーゼ)タンパク質、pufA(集光性B875α鎖)タンパク質、およびpufB(集光性B875β鎖)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質の発現が下方制御またはノックアウトされる、請求項4〜6のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
操作された炭素固定経路核酸が、3-ヒドロキシプロピオン酸回路タンパク質、カルビン回路タンパク質、炭素-アセチル-CoAフラックスタンパク質、糖新生経路タンパク質、グリオキシル酸シャント経路タンパク質、ピルビン酸合成経路タンパク質、還元的TCA回路タンパク質、およびウッド-ユングダール経路タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
3-ヒドロキシプロピオン酸回路タンパク質が、アセチル-CoAカルボキシラーゼ(サブユニットα)タンパク質;アセチル-CoAカルボキシラーゼ(サブユニットβ)タンパク質;ビオチン-カルボキシル担体タンパク質(accB)、ビオチン-カルボキシラーゼタンパク質;マロニルCoA還元酵素タンパク質;3-ヒドロキシプロピオニル-CoA合成酵素タンパク質;プロピオニル-CoAカルボキシラーゼ(サブユニットα)タンパク質;プロピオニル-CoAカルボキシラーゼ(サブユニットβ)タンパク質;メチルマロニル-CoAエピメラーゼタンパク質;メチルマロニル-CoAムターゼタンパク質;スクシニル-CoA:L-リンゴ酸CoAトランスフェラーゼ(サブユニットα)タンパク質;スクシニル-CoA:L-リンゴ酸CoAトランスフェラーゼ(サブユニットβ)タンパク質;フマル酸還元酵素-frdA-フラビンタンパク質サブユニットタンパク質;フマル酸還元酵素鉄-硫黄サブユニット-frdbタンパク質;g15サブユニット[フマル酸還元酵素サブユニットc]タンパク質;g13サブユニット[フマル酸還元酵素サブユニットD]タンパク質;フマル酸ヒドラターゼ-クラスI好気性(fumA)タンパク質;フマル酸ヒドラターゼ-クラスI嫌気性(fumB)タンパク質;フマル酸ヒドラターゼ-クラスII(fumC)タンパク質;およびL-マリル-CoAリアーゼタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項8記載の操作された光合成細胞。
カルビン回路タンパク質が、フルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼ-クラスI(Fda)タンパク質;フルクトース-1,6-二リン酸アルドラーゼ-クラスII(FbaA)タンパク質;グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)、cbbGタンパク質;ホスホリブロキナーゼ(PrkA)タンパク質;CP12タンパク質;トランスケトラーゼ(TktA)タンパク質;フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ(Fbp)タンパク質;ペントース-5-リン酸-3-エピメラーゼ(Rpe)タンパク質;セドヘプツロース-1,7-二リン酸アルドラーゼ(RpaA)タンパク質;セドヘプツロース-1,7-ビスホスファターゼ(SBPアーゼ)タンパク質;リボース-5-リン酸イソメラーゼ(RpiA)タンパク質;ホスホグリセリン酸キナーゼタンパク質;トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA)タンパク質;リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RubisCo)-小サブユニット-cbbSタンパク質;リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RubisCo)-大サブユニットcbbLタンパク質;リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ-小サブユニット(RbcS)タンパク質;リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ-大サブユニット(RbcL)タンパク質;リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ-小サブユニット(CbbS)タンパク質;リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ-大サブユニット(CbbL)タンパク質;リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(CbbM)タンパク質;リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RbcL)タンパク質;およびルビスコアクチバーゼタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項8記載の操作された光合成細胞。
炭素-アセチル-CoAフラックスタンパク質が、パントテン酸キナーゼ(panK)タンパク質;ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、αサブユニット(pdhA)タンパク質;およびピルビン酸デヒドロゲナーゼ、αサブユニット(pdhB)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項8記載の操作された光合成細胞。
糖新生経路タンパク質が、ピルビン酸カルボキシラーゼタンパク質、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼタンパク質、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼタンパク質、グルコース-6-ホスファターゼ-dog1タンパク質、およびグルコース-6-ホスファターゼ-dog2タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項8記載の操作された光合成細胞。
グリオキシル酸シャント経路タンパク質が、リンゴ酸合成酵素-aceBタンパク質、リンゴ酸合成酵素-glcBタンパク質、イソクエン酸リアーゼ-aceAタンパク質、およびリンゴ酸デヒドロゲナーゼタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項8記載の操作された光合成細胞。
ピルビン酸合成経路タンパク質が、ピルビン酸合成酵素活性を有するピルビン酸フェレドキシン:酸化還元酵素タンパク質を含む、請求項8記載の操作された光合成細胞。
還元的TCA回路タンパク質が、ATP-クエン酸リアーゼ、サブユニット1タンパク質;ATP-クエン酸リアーゼ、サブユニット2タンパク質;シトリル-CoA合成酵素(大サブユニット)タンパク質;シトリル-CoA合成酵素(小サブユニット)タンパク質;シトリル-CoAリガーゼタンパク質;リンゴ酸デヒドロゲナーゼタンパク質;フマラーゼヒドラターゼ(好気性アイソザイム、fumA)タンパク質;フマラーゼヒドラターゼ(嫌気性アイソザイム、fumB)タンパク質;フマラーゼヒドラターゼ(fumC)タンパク質;コハク酸デヒドロゲナーゼ(フラビンタンパク質サブユニット-SdhA)タンパク質;SdhB鉄-硫黄サブユニットタンパク質;SdhC膜アンカーサブユニットタンパク質;SdhD膜アンカーサブユニットタンパク質;スクシニル-CoA合成酵素αサブユニット(sucD)タンパク質;スクシニル-CoA合成酵素αサブユニットタンパク質;スクシニル-CoA合成酵素β-サブユニット(sucC)タンパク質;スクシニル-CoA合成酵素βサブユニットタンパク質;α-ケトグルタル酸サブユニットα-korAタンパク質;2-オキソグルタル酸合成酵素タンパク質;2-オキソグルタル酸合成酵素タンパク質;2-オキソグルタル酸合成酵素タンパク質;2-オキソグルタル酸合成酵素タンパク質;α-ケトグルタル酸サブユニットβ-korBタンパク質;イソクエン酸デヒドロゲナーゼ-NADP依存性(Idh)タンパク質;イソクエン酸デヒドロゲナーゼ(Icd)タンパク質;イソクエン酸デヒドロゲナーゼ-NAD依存性サブユニット1タンパク質;イソクエン酸デヒドロゲナーゼ-NAD依存性サブユニット2タンパク質;アコニット酸ヒドラターゼ1(acnA)タンパク質;アコニット酸ヒドラターゼ2(acnB)タンパク質;ピルビン酸合成酵素、サブユニットA porAタンパク質;ピルビン酸合成酵素、サブユニットB porBタンパク質;ピルビン酸合成酵素、サブユニットC porCタンパク質;ピルビン酸合成酵素、サブユニットD porDタンパク質;ホスホエノールピルビン酸合成酵素-ppsAタンパク質;ホスホエノールピルビン酸合成酵素-ppsAタンパク質;およびPEPカルボキシラーゼ、ppCタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項8記載の操作された光合成細胞。
ウッド-ユングダール経路タンパク質が、NADP依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ-サブユニットA Mt-fdhAタンパク質;NADP依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ-サブユニットB Mt-fdhBタンパク質;ギ酸テトラヒドロ葉酸リガーゼタンパク質;ホルミルテトラヒドロ葉酸合成酵素タンパク質;ギ酸テトラヒドロ葉酸リガーゼタンパク質;メテニルテトラヒドロ葉酸シクロヒドロラーゼタンパク質;メチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ;メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素(MetF)タンパク質;5-メチルテトラヒドロ葉酸コリノイド/鉄硫黄タンパク質メチルトランスフェラーゼ(AcsE)タンパク質;一酸化炭素デヒドロゲナーゼ/アセチル-CoA合成酵素-サブユニットβタンパク質;アセチル-CoAデカルボニラーゼ/合成酵素複合体サブユニットβ(AcsB)タンパク質;および一酸化炭素デヒドロゲナーゼ/アセチル-CoA合成酵素-サブユニットαタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項8記載の操作された光合成細胞。
操作された核酸が存在することで、アシルコエンザイムAデヒドロゲナーゼタンパク質、生合成グリセロール3-リン酸デヒドロゲナーゼタンパク質、および乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質の発現が下方制御またはノックアウトされる、請求項8記載の操作された光合成細胞。
操作されたNADH経路核酸が、NAD⁺依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ-idh1タンパク質;NAD⁺依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼ-idh2タンパク質;リンゴ酸デヒドロゲナーゼタンパク質;可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(sthAまたはudhA)タンパク質;膜結合型ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、サブユニットα、pntAタンパク質;膜結合型ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、サブユニットβ、pntBタンパク質;およびNADH:ユビキノン酸化還元酵素(nuo)オペロンタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
NADH:ユビキノン酸化還元酵素(nuo)オペロンタンパク質が、NuoAタンパク質、NuoBタンパク質、NuoCタンパク質、NuoDタンパク質、NuoEタンパク質、NuoFタンパク質、NuoGタンパク質、NuoHタンパク質、NuoIタンパク質、NuoJタンパク質、NuoKタンパク質、NuoLタンパク質、NuoMタンパク質、およびNuoNタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項18記載の操作された光合成細胞。
操作されたNADPH経路核酸が、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ;zwfタンパク質;6-ホスホグルコノラクトナーゼ-pglタンパク質;6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、gndタンパク質;NADP依存性イソクエン酸デヒドロゲナーゼタンパク質;NADP依存性リンゴ酸酵素;可溶性ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(sthAまたはudhA)タンパク質;膜結合型ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、サブユニットα、pntAタンパク質;および膜結合型ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ、サブユニットβ、pntBタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
操作された核酸が存在することで、ホスホグルコースイソメラーゼタンパク質の発現が下方制御またはノックアウトされる、請求項20記載の操作された光合成細胞。
操作された耐熱性核酸が、ベタイン生合成タンパク質;光化学系安定化タンパク質および修復タンパク質;ならびにタンパク質フォールディングタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
ベタイン生合成タンパク質が、グリシンサルコシンメチルトランスフェラーゼ(ApGSMT)タンパク質およびジメチルグリシンメチルトランスフェラーゼ(ApDMT)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項22記載の操作された光合成細胞。
光化学系安定化タンパク質および修復タンパク質が、光化学系IIマンガン安定化ポリペプチド(PsbO)タンパク質;PSII複合体12kDa外因性タンパク質(PsbU)タンパク質;およびチトクロムc550(PsbV)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項22記載の操作された光合成細胞。
タンパク質フォールディングタンパク質が、熱ショックタンパク質分子シャペロン(HspA)タンパク質、シャペロニン1(GroEL-1)タンパク質、シャペロニン2(GroEL-2)タンパク質、コシャペロニン(GroES)タンパク質、およびエンドペプチダーゼ(ClpB)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項22記載の操作された光合成細胞。
操作された耐熱性核酸が、δ-12-不飽和化酵素(desA)タンパク質、δ-15不飽和化酵素(desB)タンパク質、ステアロイル-CoA 9-不飽和化酵素(desC)タンパク質、δ-6-不飽和化酵素(desD)タンパク質、熱誘導性転写リプレッサータンパク質(hrcA)、およびヒスチジンキナーゼ34タンパク質(hik34)からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質の発現を下方制御またはノックアウトする、請求項22記載の操作された光合成細胞。
操作されたpH耐性核酸が、グルタミン酸デカルボキシラーゼA(GadA)タンパク質;グルタミン酸デカルボキシラーゼβ(GadB)タンパク質;グルタミン酸:γ-アミノ酪酸アンチポーター(GadC)タンパク質;生分解性アルギニンデカルボキシラーゼ(AdiA)タンパク質;アルギニン:アグマチンアンチポーター(AdiC)タンパク質;シャペロンタンパク質dnaK2(DnaK)タンパク質;DNA指向性RNAポリメラーゼ、σサブユニット(sll0306)タンパク質;Zn依存性プロテアーゼ(sll0528)タンパク質;金属依存性ホスホエステラーゼ(sll0549)タンパク質;酸ストレス関連膜タンパク質(sll0939)タンパク質;熱ショック分子シャペロン(sll1514)タンパク質;マンノース-1-リン酸グアニルトランスフェラーゼ(sll1558)タンパク質;RNAポリメラーゼσ因子(sll2012)タンパク質;カルボキシル末端プロセシングプロテアーゼ(slr0008)タンパク質;分子シャペロン(slr0093)タンパク質;ゲラニルゲラニルピロリン酸合成酵素(slr0611)タンパク質;CheY様レシーバー(slr1214)タンパク質;シグナル伝達ヒスチジンキナーゼ(slr1285)タンパク質;スーパーオキシドジスムターゼ(slr1516)タンパク質;ヒドロゲナーゼ発現/形成タンパク質(slr1675)タンパク質;エステラーゼ(slr1916)タンパク質;ヒドロゲナーゼ成分タンパク質(ssl3044)タンパク質;塩素イオンチャネルタンパク質;および酸ストレス耐性タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
塩素イオンチャネルタンパク質が、塩素イオンチャネルタンパク質(EriC)および塩素イオンチャネルタンパク質(MriT)からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項27記載の操作された光合成細胞。
酸ストレス耐性タンパク質が、酸ストレス耐性タンパク質(sll0846)、酸ストレス耐性タンパク質(sll1086)、酸ストレス耐性タンパク質(sll1483)、酸ストレス耐性タンパク質(slr0270)、酸ストレス耐性タンパク質(slr0967)、酸ストレス耐性タンパク質(slr1413)、酸ストレス耐性タンパク質(slr1544)、酸ストレス耐性タンパク質(slr1573)、酸ストレス耐性タンパク質(slr1674)、酸ストレス耐性タンパク質(slr1676)、酸ストレス耐性タンパク質(slr1687)、酸ストレス耐性タンパク質(slr1915)、酸ストレス耐性タンパク質(ssl3769)、酸ストレス耐性タンパク質(ssr2016)、および酸ストレス耐性タンパク質(ssr2595)からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項27記載の操作された光合成細胞。
操作された煙道ガス耐性核酸が、NO_x耐性タンパク質、SO_x耐性タンパク質、水銀耐性タンパク質、金属耐性タンパク質、および粒子エアロゾル耐性タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
NO_x耐性タンパク質が、マルチ銅オキシダーゼ1型(NirK)タンパク質;マルチ銅オキシダーゼ1型(ncgA)タンパク質;チトクロムc、クラスI(ncgB)タンパク質;およびチトクロムc、クラスIC(ncgC)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項30記載の操作された光合成細胞。
SO_x耐性タンパク質が、システイン合成酵素A(cysK)タンパク質、スーパーオキシドジスムターゼ(sodA)タンパク質、およびカタラーゼ(katG)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項30記載の操作された光合成細胞。
操作された耐塩性核酸が、Na⁺/H⁺アンチポータータンパク質(apnhaP)、カタラーゼタンパク質(katG)、塩およびカドミウムストレス関連タンパク質(CW80Cd404)、breast basic conserved(bbc1)タンパク質、ならびにベタイン生合成タンパク質を含む群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
ベタイン生合成タンパク質が、グリシンサルコシンメチルトランスフェラーゼ(ApGSMT)タンパク質およびジメチルグリシンメチルトランスフェラーゼ(ApDMT)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項33記載の操作された光合成細胞。
操作された近赤外光吸収核酸がクロロフィルd生合成核酸からなる、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
クロロフィルd生合成核酸が、オキシゲナーゼタンパク質、光化学系タンパク質、エポキシド還元酵素タンパク質、およびSAM利用オキシゲナーゼタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項35記載の操作された光合成細胞。
オキシゲナーゼタンパク質が、フェオホルビドAオキシゲナーゼタンパク質、酸化還元酵素、2-ニトロプロパンジオキシゲナーゼファミリータンパク質、リスケ2Fe-2Sドメインタンパク質、リスケ鉄-硫黄(cytb6f)融合タンパク質、ヘムオキシゲナーゼタンパク質、フィタノイル-CoAジオキシゲナーゼ(PhyH)タンパク質、第1のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、リグノスチルベン-α,β-ジオキシゲナーゼタンパク質、リポキシゲナーゼタンパク質、ヘムオキシゲナーゼタンパク質、第1のレチナール色素上皮膜(COG3670ジオキシゲナーゼファミリーのメンバー)タンパク質、キヌレニン3-モノオキシゲナーゼタンパク質、フィタノイル-CoAジオキシゲナーゼ(PhyH)スーパーファミリータンパク質、ジオキシゲナーゼサブファミリータンパク質、第2のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、第2のレチナール色素上皮膜(COG3670ジオキシゲナーゼファミリーのメンバー)タンパク質、ルシフェラーゼ様モノオキシゲナーゼタンパク質、第1の短いリスケ鉄硫黄タンパク質、抗生物質生合成モノオキシゲナーゼドメインタンパク質、サリチル酸1-モノオキシゲナーゼタンパク質、第3のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、キヌレニン3-モノオキシゲナーゼタンパク質、2OG-Fe(II)オキシゲナーゼタンパク質、リスケ2Fe-2Sドメインタンパク質、ISSタンパク質、第1の酸化還元酵素、2OG-Fe(II)オキシゲナーゼファミリータンパク質、フェオホルビドAオキシゲナーゼタンパク質、第4のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、第5のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、第3のレチナール色素上皮膜(COG3670ジオキシゲナーゼファミリーのメンバー)タンパク質、モノオキシゲナーゼ、フラビン結合ファミリータンパク質、芳香環切断ジオキシゲナーゼ様タンパク質、第6のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、モノオキシゲナーゼ、FAD結合タンパク質、第1のリポキシゲナーゼタンパク質、第2の短いリスケ鉄硫黄タンパク質、第2の酸化還元酵素、2OG-Fe(II)オキシゲナーゼファミリータンパク質、第7のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、第1の抗生物質生合成モノオキシゲナーゼタンパク質、第2のリポキシゲナーゼタンパク質、第3の酸化還元酵素、2OG-Fe(II)オキシゲナーゼファミリータンパク質、リスケ[2Fe-2S]ドメインタンパク質と融合した膜タンパク質、第2の抗生物質生合成モノオキシゲナーゼタンパク質、チトクロムb6f複合体リスケ鉄-硫黄サブユニットPetCタンパク質、第4の酸化還元酵素、2OG-Fe(II)オキシゲナーゼファミリータンパク質、4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼタンパク質、第8のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、第9のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、第5の酸化還元酵素、2OG-Fe(II)オキシゲナーゼファミリータンパク質、第2のリスケ、2Fe-2Sタンパク質、第10のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、亜硝酸還元酵素のフェレドキシンサブユニット、および環ヒドロキシル化ジオキシゲナーゼ、保存されたリスケ(2Fe-2S)領域タンパク質を含有、クロロフィリドオキシゲナーゼ類似体タンパク質、モノオキシゲナーゼ、FAD結合タンパク質、システインジオキシゲナーゼI型ファミリータンパク質、グリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性/ジオキシゲナーゼ、EC1.13.11.27および2.5.1.18タンパク質、フェニルプロピオン酸ジオキシゲナーゼおよび関連する環ヒドロキシル化ジオキシゲナーゼ、大末端サブユニットタンパク質、第1のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼ、EC1.13.11.39および1.13.11.27タンパク質、第11のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、ジオキシゲナーゼタンパク質、ヘムオキシゲナーゼタンパク質、ヘムオキシゲナーゼ(開環)タンパク質、第3の抗生物質生合成モノオキシゲナーゼタンパク質、第4の抗生物質生合成モノオキシゲナーゼタンパク質、第2のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、EC1.13.11.39および1.13.11.27タンパク質、グリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼタンパク質、EC2.5.1.18、ならびに第3のグリオキサラーゼ/ブレオマイシン耐性タンパク質/ジオキシゲナーゼ、EC1.13.11.39および1.13.11.27タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項36記載の操作された光合成細胞。
エポキシド還元酵素タンパク質が、チオレドキシン還元酵素、ビタミンKエポキシド還元酵素タンパク質、第1のα/βヒドロラーゼフォールドタンパク質、第2のα/βヒドロラーゼフォールドタンパク質、第1のヒドロラーゼ、α/βフォールドファミリータンパク質、第2のヒドロラーゼ、α/βフォールドファミリータンパク質、第3のα/βヒドロラーゼフォールドタンパク質、第4のα/βヒドロラーゼフォールドタンパク質、第3のヒドロラーゼ、α/βフォールドファミリータンパク質、第5のα/βヒドロラーゼフォールドタンパク質、第6のα/βヒドロラーゼフォールドタンパク質、第4のヒドロラーゼ、α/βフォールドファミリータンパク質、第7のα/βヒドロラーゼフォールドタンパク質、カルボキシエステラーゼNPタンパク質、第5のヒドロラーゼ、α/βフォールドファミリータンパク質、α/βヒドロラーゼタンパク質、リゾホスホリパーゼタンパク質、第6のヒドロラーゼ、α/βフォールドファミリー、および仮説エポキシド還元酵素タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項36記載の操作された光合成細胞。
SAM利用オキシゲナーゼタンパク質が、S-アデノシル-メチルトランスフェラーゼMraWタンパク質、ラジカルSAMドメイン/B₁₂結合ドメインタンパク質、プレコリン-2 C20-メチルトランスフェラーゼタンパク質、第1のラジカルSAMドメインタンパク質、第2のラジカルSAMドメインタンパク質、第3のラジカルSAMドメインタンパク質、マグネシウムプロトポルフィリンO-メチルトランスフェラーゼタンパク質、ラジカルSAM酵素、Cfrファミリータンパク質、第4のラジカルSAMドメインタンパク質、第5のラジカルSAMドメインタンパク質、およびSAM依存性メチルトランスフェラーゼタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項36記載の操作された光合成細胞。
光化学系タンパク質が、光化学系IサブユニットPsaAタンパク質、光化学系IサブユニットPsaBタンパク質、光化学系IIサブユニットPsbAタンパク質、光化学系IIサブユニットPsbDタンパク質、光化学系IIコアアンテナサブユニットPsbBタンパク質、および光化学系IIコアアンテナサブユニットPsbCタンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項36記載の操作された光合成細胞。
操作された栄養分非依存性核酸が、アンモニア同化タンパク質、硝酸/亜硝酸同化タンパク質、硝酸/亜硝酸同化-亜硝酸耐性タンパク質、窒素固定タンパク質、尿素同化タンパク質、ビタミンB₁₂生合成タンパク質、およびビタミンB₁₂生合成-Co²⁺輸送からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする、請求項1〜3のいずれか一項記載の操作された光合成細胞。
アンモニア同化タンパク質が、高親和性アンモニウム/メチルアンモニウムパーミアーゼ(amt1)タンパク質、アンモニウム/メチルアンモニウムパーミアーゼ(amt2)タンパク質、およびアンモニウム/メチルアンモニウムパーミアーゼ(amt3)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項41記載の操作された光合成細胞。
硝酸/亜硝酸同化タンパク質が、ABC型硝酸/亜硝酸輸送系基質結合タンパク質(nrtA)、ABC型硝酸/亜硝酸輸送系パーミアーゼタンパク質(nrtB)、ABC型硝酸/亜硝酸輸送系ATP結合タンパク質(nrtC)、ABC型硝酸/亜硝酸輸送系ATP結合タンパク質(nrtD)、亜硝酸/硝酸パーミアーゼタンパク質(nrtP)、亜硝酸還元酵素タンパク質(nirA)、および硝酸還元酵素タンパク質(narB)からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項41記載の操作された光合成細胞。
硝酸/亜硝酸同化-亜硝酸耐性タンパク質が、マルチ銅オキシダーゼ1型(NirK)タンパク質;マルチ銅オキシダーゼ1型(ncgA)タンパク質;チトクロムc、クラスI(ncgB)タンパク質;およびチトクロムc、クラスIC(ncgC)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項41記載の操作された光合成細胞。
窒素固定タンパク質が、FeMo補因子生合成タンパク質(nifB)、[4Fe-4S]フェレドキシン(fdxN)タンパク質、L-システイン脱硫酵素(nifS)タンパク質、Feクラスターアクセサリータンパク質(nifU)、ニトロゲナーゼ-Feサブユニット(nifH)タンパク質、ニトロゲナーゼ-αサブユニット(nifD)タンパク質、ニトロゲナーゼ-βサブユニット(nifK)タンパク質、FeMo補因子アクセサリータンパク質(nifE)、FeMo補因子アクセサリータンパク質(nifN)、FeMo補因子アクセサリータンパク質(nifX)、FeMo補因子アクセサリータンパク質(nifW)、FeMo補因子アクセサリータンパク質(hesA)、FeSクラスター補因子アセンブリアクセサリータンパク質(hesB)、窒素固定特異的フェレドキシン(FdxH)タンパク質、ピルビン酸:フラボドキシン酸化還元酵素(nifJ)タンパク質、ホモクエン酸合成酵素(nifV)タンパク質、FeMo補因子アクセサリータンパク質(nifZ)、およびFeMo補因子アクセサリータンパク質(nifT)からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項41記載の操作された光合成細胞。
尿素同化タンパク質が、尿素アミドヒドロラーゼ、γサブユニット(ureA)タンパク質;尿素アミドヒドロラーゼ、βサブユニット(ureB)タンパク質;尿素アミドヒドロラーゼ、αサブユニット(ureC)タンパク質;ウレアーゼアクセサリータンパク質(ureD);ウレアーゼアクセサリータンパク質(ureE);ウレアーゼアクセサリータンパク質(ureF);ウレアーゼアクセサリータンパク質(ureG);ABC型、高親和性尿素パーミアーゼペリプラズムドメイン(urtA)タンパク質;ABC型、高親和性尿素パーミアーゼ、膜ドメイン(urtB)タンパク質;ABC型、高親和性尿素パーミアーゼ、膜ドメイン(urtC)タンパク質;ABC型、高親和性尿素パーミアーゼ、ATP結合ドメイン(urtD)タンパク質;およびABC型、高親和性尿素パーミアーゼ、ATP結合ドメイン(urtE)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項41記載の操作された光合成細胞。
ビタミンB₁₂生合成タンパク質が、ウロポルフィリン-III C-メチルトランスフェラーゼコバルトキラターゼ(cysG)タンパク質;シロヒドロクロリンコバルトキラターゼ(cbiK)タンパク質;プレコリン-2 C20-メチルトランスフェラーゼ(cbiL)タンパク質;プレコリン-3Bメチラーゼ(cbiH)タンパク質;二機能CbiG/プレコリンメチルトランスフェラーゼ(cbiG)タンパク質;プレコリン-4 C11-メチルトランスフェラーゼ(cbiF)タンパク質;コバラミン生合成タンパク質(cbiD);NADPH依存性プレコリン-6A還元酵素(cbiJ)タンパク質;プレコリン-6B C5,15-メチルトランスフェラーゼ(cbiE)タンパク質;プレコリン-6B C12デカルボキシラーゼ(cbiT)タンパク質;プレコリン-8X-メチルムターゼ(cbiC)タンパク質;コビリニン酸A,C-ジアミド合成酵素(cbiA)タンパク質;コビリニン酸(I)a,c-ジアミドアデノシルトランスフェラーゼ(btuR)タンパク質;コビリニン酸合成酵素(cbiP)タンパク質;コビリン酸デカルボキシラーゼ(cobD)タンパク質;アデノシルコビナミドリン酸合成酵素(cbiB)タンパク質;αリバゾール-5'-Pホスファターゼ(cobC)タンパク質;コバラミン(5'リン酸)合成酵素(cobS)タンパク質;コビナミドリン酸グアニリルトランスフェラーゼ(cobU)タンパク質;およびニコチン酸-ヌクレオチドジメチルベンズイミダゾール-Pホスホリボシルトランスフェラーゼ(cobT)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項41記載の操作された光合成細胞。
ビタミンB₁₂生合成-Co²⁺輸送タンパク質が、ABC型Co²⁺輸送系、パーミアーゼ成分タンパク質;ABC型コバルト輸送系、ペリプラズム成分タンパク質;およびABC型コバルト輸送系、パーミアーゼ成分タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項41記載の操作された光合成細胞。
ビタミンB₁₂非依存性タンパク質が、5-メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸-ホモシステインメチルトランスフェラーゼ(metE)タンパク質;リボヌクレオシド-二リン酸還元酵素、αサブユニット(nrdA)タンパク質;およびリボヌクレオシド-二リン酸還元酵素、βサブユニット(nrdB)タンパク質からなる群より選択される1つまたは複数のタンパク質を含む、請求項41記載の操作された光合成細胞。
metEタンパク質が、大腸菌（Escherichia coli）K12(アクセッション番号NP_418273.1)またはサーモシネココッカス・エロンガタス(Thermosynechococcus elongatus)BP-1(アクセッション番号NP_681881)に由来する、請求項49記載の操作された光合成細胞。
耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、栄養分非依存性核酸、および近赤外光吸収核酸からなる群より選択される少なくとも1つの操作された核酸を含み、該操作された核酸によってコードされる異種タンパク質を発現するか、該操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を過剰発現するか、該操作された核酸の存在の結果として内因性タンパク質を下方制御するか、または該操作された核酸の存在の結果として遺伝子がノックアウトされている、操作された炭素固定細胞。
耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、近赤外光吸収核酸、および栄養分非依存性核酸からなる群より選択される複数の操作された核酸を含む、請求項51記載の操作された光合成細胞。
関心対象の炭素ベース産物を産生する方法であって、以下の工程を含む方法:
(a)光捕獲核酸、二酸化炭素固定経路核酸、NADH経路核酸、NADPH経路核酸、耐熱性核酸、pH耐性核酸、煙道ガス耐性核酸、耐塩性核酸、栄養分非依存性核酸、および近赤外光吸収核酸からなる群より選択される少なくとも1つの操作された核酸を発現するように、細胞を操作する工程であって、少なくとも1つの操作された核酸の発現が、(i)該操作された核酸によってコードされる異種タンパク質の発現、(ii)該操作された核酸の存在の結果としての内因性タンパク質の過剰発現、または(iii)該操作された核酸の存在の結果としての内因性タンパク質の過小発現を含む、工程;ならびに
(b)CO₂および光の存在下で該細胞を培養して、関心対象の炭素ベース産物を産生する工程。
関心対象の炭素ベース産物を取り出す工程をさらに含む、請求項53記載の方法。
関心対象の炭素ベース産物が、タンパク質、コエンザイムA、アセチルコエンザイムA、アルデヒド、カルボン酸、エーテル、エステル、カロテノイド、ケトン、アルカン、アルケン、アルキン、ジエン、イソプレン、カルボン酸、界面活性剤、ワックスエステル、ポリマー化学物質[ポリフタレートカーボネート(PPC)、ポリエステルカーボネート(PEC)、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリヒドロキシアルカノエート(PHA)、ポリ-β-ヒドロキシ酪酸(PHB)、ポリラクチド(PLA)、およびポリカプロラクトン(PCL)]、モノマー化学物質[プロピレングリコール、エチレングリコール、および1,3-プロパンジオール、エチレン、酢酸、酪酸、3-ヒドロキシプロパン酸(3-HPA)、アクリル酸、マロン酸、脂肪酸、アセチル-CoA結合炭化水素、アセチル-CoA結合炭水化物、およびポリケチド中間体、エタン、プロパン、ブタン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン、ドデカン、トリデカン、テトラデカン、ペンタデカン、ヘキサデカン、ヘプタデカン、オクタデカン、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、ウンデカノール、ドデカノール、トリデカノール、テトラデカノール、ペンタデカノール、ヘキサデカノール、ヘプタデカノール、およびオクタデカノール、バイオディーゼル、バイオ原油、「再生可能な石油」、ならびに薬物からなる群より選択される1つまたは複数の産物を含む、請求項53記載の方法。