CN118256415A - 生产聚乳酸的基因工程菌株及生产聚乳酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种生产聚乳酸的基因工程菌株，其包括：将已改性的D‑乳酸脱氢酶基因、已改性的丙酰辅酶A转移酶基因和已改性的聚羟基脂肪酸酯合酶基因合成目的基因，并优化了丙酰辅酶A转移酶的启动子、聚羟基脂肪酸酯合酶的启动子，过表达了乙酰辅酶A合酶，弱化乙酸激酶的表达，敲弱脂肪酸途径的关键酶乙酰辅酶A羧化酶、酮基合成酶、β‑酮脂酰‑ACP合酶Ⅲ的基因，得到重组质粒并导入工程菌株中得到工程细胞菌株。该工程细胞菌株采用高密度发酵策略，使得蓝细菌生物量有了提高，解决了现有技术中生产聚乳酸只能用糖来源的原料问题，有望同时解决塑料污染和温室气体二氧化碳过度排放的问题，具有非常大的潜在工业化应用价值。

Description

生产聚乳酸的基因工程菌株及生产聚乳酸的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种生产聚乳酸(PLA)的基因工程菌株及生产PLA的方法。

背景技术

PLA是一种极具发展前景的生物可降解材料，在一次性包装、农业、医药、3D打印等领域具有广泛的应用前景。目前，PLA的生产主要是通过微生物发酵产生乳酸酯，再通过把乳酸酯转变为丙交酯，通过丙交酯环的环化作用来合成PLA。但是这种化学聚合反应对设备的要求较高，且需要加入的溶剂或者链偶联剂不易被去除，这极大地限制了PLA商业化生产的进程。因此，开发制备高性能的PLA的方法是非常有意义的。目前，用生物法生产PLA主要是依赖于糖来源的原料，这也会直接造成了工业生产和粮食的竞争，具有潜在的风险。同时，随着工业化进程的推进，温室气体CO₂排放越演愈烈，全球气候问题严重。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种生产PLA的基因工程菌株及生产PLA的方法。本发明以天然的聚球藻为起始菌株，利用代谢工程和高密度培养的组合策略合成PLA，通过引入了异源的、经过改造的D-乳酸脱氢酶(LDH)、丙酰辅酶A转移酶(PCT)、聚羟基脂肪酸酯合酶(PHA)，然后，系统地进行了不同的代谢工程策略，包括限速步骤的启动子优化、乙酰辅酶A自循环的构建、碳通量重定向。即对限速步骤酶PCT和PHA进行了启动子优化，过表达了乙酰辅酶A合酶，弱化了乙酸激酶的表达，敲弱了脂肪酸途径的关键酶乙酰辅酶A羧化酶、酮基合成酶、β-酮脂酰-ACP合酶Ⅲ的基因，使得PLA的产量得到了提高。同时探索了高密度培养策略(HDC)，包括在培养基中的通入CO₂和光照条件，高密度发酵策略实现高低光的简易调整、不同类型光的组合使用(红光和白光的组合)、可实现冷凝、发酵的时候可自动进行补料和搅拌，培养条件的搅拌速度为200rpm，使得产量进一步提高。从而揭示了利用蓝藻细胞工厂从二氧化碳中生产塑料。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

作为第一方面，本发明提供了一种生产聚乳酸的基因工程菌株，其包括：

(1)将已改性的D-乳酸脱氢酶基因、已改性的丙酰辅酶A转移酶基因和已改性的聚羟基脂肪酸酯合酶基因通过引物合成目的基因，将所述目的基因与载体双酶切，经纯化后，转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒

(2)提取所述重组质粒的DNA，并导入蓝细菌S.elongatus PCC 79422中，提取，验证，得到工程细胞菌株；

步骤(1)中，所述合成目的基因之前，进行了不同的代谢工程策略，包括优化了PCT的启动子、PHA的启动子；过表达了乙酰辅酶A合酶，弱化了乙酸激酶的表达；敲弱了脂肪酸途径的关键酶乙酰辅酶A羧化酶、酮基合成酶、β-酮脂酰-ACP合酶Ⅲ的基因。

作为第二方面，本发明提供了一种利用二氧化碳生产聚乳酸的方法，其包括如下步骤：

(1)、将已改性的LDH基因、已改性的PCT基因和已改性的PHA基因通过引物合成目的基因，将目的基因与载体双酶切，经纯化后，转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒；

(2)、提取重组质粒的DNA，并导入蓝细菌S.elongatus PCC 7942中，提取，验证，得到工程细胞菌株；

(3)、将工程细胞菌株在培养基中培养，培养基中通入二氧化碳和光照条件，离心收集，经过冷冻干燥，回收，得到PLA；

其中，步骤(1)中，所述合成目的基因之前，进行了不同的代谢工程策略，包括优化了丙酰辅酶A转移酶的启动子、聚羟基脂肪酸酯合酶的启动子；过表达了乙酰辅酶A合酶，弱化了乙酸激酶的表达；敲弱了脂肪酸途径的关键酶乙酰辅酶A羧化酶、酮基合成酶、β-酮脂酰-ACP合酶Ⅲ的基因。

优选地，步骤(1)中，已改性的LDH基因来源于保加利亚乳杆菌，已改性的PCT基因来源于丙酸梭菌，已改性的PHA基因来源于假单胞菌。

优选地，步骤(1)中，引物的上游序列如SEQ ID NO.1所示，下游序列如SEQ IDNO.2所示。

优选地，步骤(3)中，二氧化碳的通气量为1.5vvm，通入二氧化碳和空气的体积比为1-10％；光照的强度为125-500μmol photons m^-2s^-1。

优选地，步骤(3)中，培养基包括以下组分：碳酸钠、硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸、硼酸、氯化锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜和硝酸钴。

优选地，碳酸钠的浓度为0.25-1.5g/L。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明通过改造天然的蓝细菌，同时采用高密度发酵的策略，使其能直接利用CO₂和光照条件来生产PLA，使得蓝细菌生物量有了非常大的提高。本发明解决了现有技术中生产PLA只能用糖来源的原料问题，进一步降低了生产成本和收集成本，也有望同时解决塑料污染和温室气体CO₂过度排放的问题，同时能用来生产生物可降解材料PLA，具有非常大的潜在工业化应用价值，也加速了蓝细菌生产PLA的商业化进程。另外，本发明利用两性电解质聚丙烯酰胺絮凝剂，可以非常简单方便地实现蓝细菌细胞的收集。

附图说明

图1为本发明的实施例1中蓝细菌基因工程菌中PLA的合成途径及代谢工程改造策略示意图。

图2为本发明的实施例7中合成的PLA的核磁检测的氢谱和碳谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种生产聚乳酸的基因工程菌株及生产聚乳酸的方法。

下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明。下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

BG-11液体培养基：NaNO₃ 1.5g，K₂HPO₄·3H₂O 0.04g，MgSO₄·7H₂O 0.075g，CaCl₂·2H₂O 0.036g，柠檬酸0.006g，柠檬酸铁铵0.006g，EDTA 0.001g，Na₂CO₃ 0.02g，金属离子母液1mL(g/L:硼酸2.86，MnCl₂·4H₂O 1.81，ZnSO4·7H₂O 0.222，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39，CuSO₄·5H₂O 0.079，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.0494)溶解并定容于1L蒸馏水中。121℃高温高压蒸汽灭菌20min。

BG-11固体培养基：在BG-11液体培养基中加入1.6-2.0％(w/v)琼脂粉。121℃高温高压蒸汽灭菌20min。

培养方法：用于PLA生产的菌株培养方法，取生长到指数期的S.elongatus PCC7942细胞，稀释至装有100mL的BG-11液体培养基的300mL三角瓶中，使细胞最终浓度为OD_730nm＝0.05，该培养基中添加20mg/L的壮观霉素。当菌体长至OD_730nm＝0.4-0.6时，加入1mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。每天取2mL样品用于测定细胞生长，每次取样结束后，向三角瓶中补加等体积的灭过菌的BG-11液体培养基。

实施例1：PYLW07菌株的制备

1、引入PLA合成的代谢途径

如图1所示，根据已经报道的改造过后的乳酸脱氢酶基因(ldhD)、丙酰辅酶A转移酶基因(pct)、聚羟基脂肪酸酯合酶基因(pha)序列(Yang等人，Biotechnology&Bioengineering,2010,105(1)：150-160.)，通过人工合成该序列，然后利用以下引物以合成的序列为模板经PCR扩增得到含三个关键酶的重组基因的片段。

SEQ ID NO.1:5-ACTCGAGATGAGCAACAAGTCAAATGATGAA-3；

SEQ ID NO.2:5-GGATCCTCTAGGACTTCATTTCTTTCAGGCC-3。

将重组基因与pAMMCS12分别用XhoI、BamHI双酶切，纯化后用T₄DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化大肠杆菌感受态细胞。转化液涂布壮观霉素(50μg/mL)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pAM-ldhD-pct-pha。测序由上海派森诺生物技术公司完成。

提取后的重组质粒DNA，通过自然转化利用同源重组的原理，将目标基因整合到S.elongatus PCC 7942染色体上。提取重组转化子的基因组后，再用验证引物SEQ IDNO.3:5-ACCTGGAATTGGTTGAAGG-3，SEQ ID NO.4:5-ACAGCCAAGCTTGCATGC-3，通过PCR扩增验证插入成功，得到PYLW01菌株。

2、限速步骤酶启动子优化

根据P_trc启动子进行全基因合成，设计引物为：SEQ ID NO.5:5-CGACTGCACGGTGCACCA-3，SEQ ID NO.6:5-CATGGTCTGTTTCCTGTGTGAA-3，并经PCR扩增得到P_trc启动子。

将PCR扩增得到的P_trc启动子序列，ldhD、pct和pha三个基因片段各取1μL，与pAM载体进行无缝克隆，得到载体pAM-P_trc-ldhD-P_trc-pct-P_trc-pha。

将载体pAM-P_trc-ldhD-P_trc-pct-P_trc-pha通过自然转化整合到S.elongatus PCC7942染色体中性位点I上，得到PYLW02菌株。

3、乙酰辅酶A合酶的过表达

3.1根据S.elongatus PCC 7942基因组(NC_007595.1)序列设计引物：

SEQ ID NO.11:5-ACTAGTATGGCTGCACCTGTCACGAA-3；

SEQ ID NO.12:5-GGATCCTTAGTCACTGCTTTCCAGAAACAC-3。

将重组基因acsA与pBA3031M分别用SpeI、BamHI双酶切，纯化后用T₄DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化大肠杆菌感受态细胞。转化液涂布卡钠霉素(50μg/mL)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pBA-acsA。测序由上海派森诺生物技术公司完成。

提取后的重组质粒DNA，通过自然转化利用同源重组的原理，将目标基因整合到PYLW02菌株的S.elongatus PCC 7942染色体中性位点III上。提取重组转化子的基因组后，再用验证引物，SEQ ID NO.13:5-AGGGCTTCCCGGTATCAA-3，SEQ ID NO.14:5-ACAGCCAAGCTTGCATGC-3，通过PCR扩增验证插入成功，得到PYLW05菌株。

4、敲弱乙酸激酶基因

根据S.elongatus PCC 7942基因组上乙酸激酶的基因序列，设计24bp的反义RNA，再根据sRNA的骨架Micc和Trbcl的序列，人工合成乙酸激酶的sRNA全长序列。设计引物SEQIDNO.15:5-GGATCCTATCAATAAGTATTAGGTATATGG-3，SEQ ID NO.16:5-GAATTCGCTGTCGAAGTTGAACAT-3，将sRNA全长序列与sRNA分别用BamHI、EcoRI双酶切，纯化后用T₄DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化大肠杆菌感受态细胞。转化液涂布卡钠霉素(50μg/mL)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pBA-acsA-as-ackA。测序由上海派森诺生物技术公司完成。

提取后的重组质粒DNA，通过自然转化利用同源重组的原理，将目标基因整合到PYLW05菌株的S.elongatus PCC 7942染色体中心位点III上，得到PYLW06菌株。

5、继续敲弱乙酰辅酶A羧化酶基因、酮基合成酶基因、β-酮脂酰-ACP合酶Ⅲ的基因

根据S.elongatus PCC 7942基因组上乙酰辅酶A羧化酶基因、酮基合成酶基因、β-酮脂酰-ACP合酶Ⅲ的基因序列，各自设计24bp的反义RNA，再根据sRNA的骨架Micc和Trbcl的序列，人工合成乙酰辅酶A羧化酶基因、酮基合成酶基因、β-酮脂酰-ACP合酶Ⅲ的sRNA全长序列。设计引物SEQ ID NO.17:5-GAATTCTATCAATAAGTATTAGGTATATGG-3，SEQ ID NO.18:5-GAGCTCGCTGTCGAAGTTGAACAT-3，将sRNA全长序列与sRNA分别用EcoRI、SacI双酶切，纯化后用T₄DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化大肠杆菌感受态细胞。转化液涂布卡钠霉素(50μg/mL)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pBA-acsA-as-ackA-as-accC-as-fabF-as-fabH。测序由上海派森诺生物技术公司完成。

提取后的重组质粒DNA，通过自然转化利用同源重组的原理，将目标基因整合到PYLW06菌株的S.elongatus PCC 7942染色体中心位点III上，得到PYLW07菌株。

实施例2:利用重组蓝细菌细胞制备PLA

通过实施例1中构建的重组蓝细菌细胞PYLW07菌株，分别在BG-11液体培养基中培养至OD_730nm为0.5时，加1mol/L的终浓度的IPTG做诱导剂，诱导表达后待生长OD达到最大值时，离心收集该菌株。回收的菌株经过冷冻干燥以氯仿回收聚集在菌株体内的聚合物物质，对回收后的聚合物进行核磁共振(NMR)分析的结果证实上述获得的聚合物物质为PLA，结果如图2。对于该菌株生产PLA的定量实验，利用气相色谱-质谱(GC-MS)测定其单体含量进而计算PLA的产量，方法如Jung等人，Biotechnology&Bioengineering,2010,105(1):161-171中的记载。

实施例3:探究不同浓度的CO₂对蓝细菌生长的影响

蓝细菌是利用CO₂作为碳源来生长的细菌，因此通入CO₂的浓度对蓝细菌会有非常大的影响。为了开发蓝细菌的高密度发酵策略，本发明首先探究了在培养基中通入不同浓度的CO₂对蓝细菌生长的影响。当通入的体积比为1％、2％、5％、7％、10％时，发现当CO₂和空气的体积比为5％时生长的OD_730nm最高为3.5。

实施例4:探究光强对蓝细菌生长的影响

在实施例3条件的基础上，本发明进一步探究了光强对蓝细菌生长的影响。本发明尝试了从125-1000μmol photons m^-2s^-1的光强，发现当光照增加到500μmol photons m^-2s^-1的时候，蓝细菌生长OD达到最大，超过500μmol photons m^-2s^-1之后生长速度下降。当达到10000μmol photons m^-2s^-1的时候，蓝细菌受到了强光的胁迫已不再生长。但蓝细菌在OD_730nm＝1.0之前不易光照过强，因此蓝细菌在OD₇₃₀＝1.0之前，选择125μmol photons m^-2s^-1的光强，随着生长逐渐增加到500μmol photons m^-2s^-1的光强，可以使得生长的最好，可在5天内OD_730nm达到3.5。

实施例5:探究培养基对蓝细菌生长的影响

通过实施例4中已经找到了蓝细菌生长的最适光强，进一步探究优化培养基是否可以进一步提高生长的OD。本发明以BG-11为出发培养基，参考5×BG-11培养基的配方，在BG-11的基础培养基中添加以下条件(L^-1)：Na₂CO₃ 1g、MgSO₄·7H₂O 5g、NaNO₃ 5g、KH₂PO₄(1mol/L)2mL和微量矿物质，该培养基命名为MBG-11。这使得生长相较以前有了提高，OD_730nm从1.5提高到了4.0。

进一步，为了探究高浓度的Na₂CO₃是否可以带来更多的生物量。本发明尝试了不同浓度Na₂CO₃对蓝细菌生长的影响，分别尝试了0.25g/L、0.50g/L、1.0g/L、1.5g/L的Na₂CO₃。通过实验发现，当添加1.0g/L的Na₂CO₃时，OD_730nm最高为7.0。

实施例6：重组蓝细菌PYLW07高密度发酵

利用该PYLW07菌株探究了高密度发酵的策略。首先用S.elongatus PCC 7942菌株的基础培养基(BG-11液体培养基)，对于高密度培养策略，工程化的S.elongatus PCC 7942在改良的BG-11固体培养基(即MBG-11液体培养基)中30℃下使用光生物反应器生长初始光照强度为125μmol photons m^-2s^-1，两天后增加到500μmol photons m^-2s^-1。对于含有体积比5％CO₂的鼓泡空气培养，气体以50mL min^-1的流速鼓泡通过5μm孔径的排气阀。对于PLA生产，在800mL烧瓶中含有20mg/L壮观霉素的500mL BG-11液体培养基中接种，并持续提供富含CO₂的空气(5％，v/v)。然后待其生长至OD_730nm为0.4-0.6后，加入1mmol/L IPTG和2mmol/L茶碱诱导培养物。通过GC-MS检测PLA的产量，其产量最终达到108mg/L，相当于23mg/g DCW，约为初始构建的菌株在摇瓶培养条件下的270倍。制备的PLA分子量(重均分子量Mw为62.5kDa，数均分子量Mn为32.8kDa)在文献报道中处于最高水平。此外，采用高密度培养策略，使其细胞密度比相同工程菌株在摇瓶培养时增加10倍。

实施例7：重组蓝细菌细胞的收集

为了方便快捷地实现蓝细菌细胞PYLW07菌株的收集，本发明尝试了用聚电解质絮凝剂探索自然沉降的效果。聚丙烯酰胺絮凝剂在室温下分别以1：300(w/w)和5：100(w/w)的比例溶解在水中。然后将溶解的聚丙烯酰胺絮凝剂以1.5％(v/v)的比例加入高密度培养得到的发酵液中。混合培养物搅拌2min。接着，将溶解的聚丙烯酰胺絮凝剂加入溶液中并涡旋30s。然后培养物允许重力沉降一段时间。絮凝效率通过在OD₇₃₀nm波长下沉降前后的光密度测量来表征，通过测定结果显示絮凝效率达到90％。

工业潜在价值：

在工业规模上收获微藻生物质是藻类生物质产业的技术经济瓶颈，微藻的小细胞尺寸和培养物中稀释的生物量浓度使得情况更加复杂。在收获过程中需要去除大量的水，使得过程能源和成本密集，大约占生物质生产总成本的30％。PLA是细胞的内含物，因此可以通过离心使得PLA颗粒和细胞一起收集下来。当使用絮凝剂时，细胞可以快速、简便的收集，这具有较大的潜在工业价值。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种生产聚乳酸的基因工程菌株，其特征在于：包括：

(1)将已改性的D-乳酸脱氢酶基因、已改性的丙酰辅酶A转移酶基因和已改性的聚羟基脂肪酸酯合酶基因通过引物合成目的基因，将所述目的基因与载体双酶切，经纯化后，转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒；

(2)提取所述重组质粒的DNA，并导入蓝细菌Synechococcus elongatus PCC 7942中，提取，验证，得到工程细胞菌株；

步骤(1)中，所述合成目的基因之前，进行了不同的代谢工程策略，包括优化了丙酰辅酶A转移酶的启动子、聚羟基脂肪酸酯合酶的启动子；过表达了乙酰辅酶A合酶，弱化了乙酸激酶的表达；敲弱了脂肪酸途径的关键酶乙酰辅酶A羧化酶、酮基合成酶、β-酮脂酰-ACP合酶Ⅲ的基因。

2.一种利用二氧化碳生产聚乳酸的方法，其特征在于：其包括如下步骤：

(1)、将已改性的D-乳酸脱氢酶基因、已改性的丙酰辅酶A转移酶基因和已改性的聚羟基脂肪酸酯合酶基因通过引物合成目的基因，将所述目的基因与载体双酶切，经纯化后，转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒；

(2)、提取所述重组质粒的DNA，并导入蓝细菌Synechococcus elongatus PCC 7942中，提取，验证，得到工程细胞菌株；

(3)、将所述工程细胞菌株在培养基中培养，培养基中通入二氧化碳和光照条件，离心收集，经过冷冻干燥，回收，得到聚乳酸；

其中，步骤(1)中，所述合成目的基因之前，进行了不同的代谢工程策略，包括优化了丙酰辅酶A转移酶的启动子、聚羟基脂肪酸酯合酶的启动子；过表达了乙酰辅酶A合酶，弱化了乙酸激酶的表达；敲弱了脂肪酸途径的关键酶乙酰辅酶A羧化酶、酮基合成酶、β-酮脂酰-ACP合酶Ⅲ的基因。

3.根据权利要求2所述的利用二氧化碳生产聚乳酸的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述已改性的D-乳酸脱氢酶基因来源于保加利亚乳杆菌，已改性的丙酰辅酶A转移酶基因来源于丙酸梭菌，已改性的聚羟基脂肪酸酯合酶基因来源于假单胞菌。

4.根据权利要求2所述的利用二氧化碳生产聚乳酸的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述引物的上游序列如SEQ ID NO.1所示，下游序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求2所述的利用二氧化碳生产聚乳酸的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述二氧化碳的通气量为1.5vvm，通入二氧化碳和空气的体积比为1-10％；所述光照的强度为125-500μmol photons m^-2s^-1。

6.根据权利要求2所述的利用二氧化碳生产聚乳酸的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述培养基包括以下组分：碳酸钠、硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸、硼酸、氯化锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜和硝酸钴。

7.根据权利要求6所述的利用二氧化碳生产聚乳酸的方法，其特征在于：所述碳酸钠的浓度为0.25-1.5g/L。

8.根据权利要求5所述的利用二氧化碳生产聚乳酸的方法，其特征在于：使用两性电解质聚丙烯酰胺絮凝剂收集细胞。