KR102538109B1

KR102538109B1 - ldhD 유전자가 도입된 재조합 미생물을 이용한 폴리락트산 단일중합체의 제조 방법

Info

Publication number: KR102538109B1
Application number: KR1020180013602A
Authority: KR
Inventors: 강혜옥; 박혜권; 강동균
Original assignee: 주식회사 엘지화학
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2018-02-02
Publication date: 2023-05-26
Anticipated expiration: 2038-02-02
Also published as: KR20190094036A

Abstract

ldhD 유전자가 도입된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 포함하는 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체 제조용 조성물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체의 제조 방법이 제공된다.

Description

ldhD 유전자가 도입된 재조합 미생물을 이용한 폴리락트산 단일중합체의 제조 방법{Method of Preparing PLA Homopolymer Using Recombinant Microorganism Comprising ldhD Gene}

ldhD 유전자가 도입된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 포함하는 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체 제조용 조성물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 폴리락트산 단일중합체의 제조 방법이 제공된다.

폴리락트산(PLA)은 락테이트(lactate)로부터 유래된 대표적인 생분해성 고분자로서 범용고분자 혹은 의료용 고분자로서의 응용성이 높은 고분자이다. 현재 PLA는 미생물 발효에 의해 생산된 락테이트를 중합하여 제조되고 있으나, 락테이트의 직접중합에 의해서는 낮은 분자량(1000-5000 달톤)의 PLA가 주로 생성된다. 100,000 달톤 이상의 PLA를 합성하기 위해서는 락테이트의 직접중합으로 얻어진 낮은 분자량의 PLA로부터 연쇄커플링제(chain coupling agent)를 이용하여 보다 분자량이 큰 PLA로 중합하는 방법이 있으나 유기용제(solvent)나 연쇄커플링제의 첨가로 인해 공정이 복잡해지고, 또한 이들을 제거가 쉽지 않다는 단점이 있다.

또한, 미생물 배양중 생산되는 락트산의 생산량이 낮아 PLA 단일중합체의 생산량에 한계가 있다.

국내특허등록 제10-1211767호

본 발명은 미생물에 락테이트 탈수소효소 D (Lactate Dehydrogenase D) 유전자(ldhD)를 도입하여 락테이트 생산량을 증가시키고, 폴리락트산 [poly(lactic acid); PLA] 단일중합체를 합성하는 기술을 제공한다.

일 예는 락테이트 탈수소효소 D (Lactate Dehydrogenase D) 유전자(ldhD)가 도입된 재조합 미생물을 제공한다.

다른 예는 상기 재조합 미생물을 포함하는, 락트산 (lactic acid) 또는 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산(PLA) 단일중합체 제조용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 락트산 또는 폴리락트산 단일중합체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명은 락트산 함량을 증가 시켜 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체의 생산량을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

일 예는 락테이트 탈수소효소 D (Lactate Dehydrogenase D) 유전자(ldhD)가 도입된 재조합 미생물을 제공한다. 상기 재조합 미생물은 적절한 락테이트 탈수소효소 D 유전자(ldhD)를 포함하는 재조합 벡터로 형질전횐된 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 내재적인 락테이트 탈수소효소 유전자가 불활성화 (결실)된 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 내재적으로 및/또는 외래 (동종 유래 또는 이종 유래)의 CoA 전이효소 암호화 유전자 및 PHA 합성효소 암호화 유전자를 포함하고 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체 제조에 사용하기 위한 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 세포 내 및/또는 세포 외 (예컨대, 배양 배지 또는 배양액 중)의 락트산 함량이 야생형 미생물과 비교하여 현저하게 증가한 것을 특징으로 한다. 따라서, 상기 재조합 미생물은 그 자체로 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

다른 예는 상기 재조합 미생물을 포함하는, 락트산 (lactic acid) 또는 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산(PLA) 단일중합체 제조용 조성물을 제공한다. 일 예에서, 상기 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체 제조용 조성물은 상기 재조합 미생물이 배양된 배양 배지를 포함하지 않는 것일 수 있다.

다른 예는 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 락트산 또는 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체의 제조 방법을 제공한다.

본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "단일중합체 (homopolymer)"는 한 종류의 모노머만으로 형성된 중합체를 의미하는 것으로, 폴리락트산 단일중합체는 락테이트만으로 형성되거나 (즉, 반복단위로 락테이트만을 포함), 락테이트 함량이, 모노머 개수 또는 중량 기준으로, 80% 이상, 85% 이상, 87% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상인 중합체를 의미한다.

본 명세서에서 제공되는 재조합 미생물은 코엔자임-A(CoA) 전이효소 암호화 유전자 및 폴리하이드록시알카노에이트 (polyhydroxyalkanoate; PHA) 합성효소 암호화 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 CoA 전이효소 및 PHA 합성효소를 암호화하는 유전자는 통상적인 유전자 재조합적 방법 (예컨대, CoA 전이효소 암호화 유전자 및 PHA 합성효소 암호화 유전자를 각각 또는 함께 포함하는 재조합 벡터를 사용)으로 미생물 세포 내에 도입되어 있는 것일 수 있다.

또한, 상기 재조합 미생물은 락테이트 생성을 증가시켜 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체의 제조 효율을 높이기 위하여, 락테이트 탈수소효소 D (Lactate Dehydrogenase D) 유전자(ldhD)가 도입된 것일 수 있다. 상기 락테이트 탈수소효소 D 유전자의 도입은 락테이트 탈수소효소 D 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 사용하는 통상적인 유전자 재조합적 방법에 의하여 수행될 수 있다.

상기 재조합 미생물에 있어서, CoA 전이효소 암호화 유전자 및 PHA 합성효소 암호화 유전자, 및 락테이트 탈수소효소 D 암호화 유전자는 각각 별개의 재조합 벡터에 포함(삽입)되거나, 이들 중 2 이상이 함께 하나의 벡터에 포함 (삽입)되어 상기 미생물에 도입될 수 있다.

일 예에서, 상기 재조합 미생물은 미생물 게놈에 내재하는 락테이트 탈수소효소 A 유전자 (ldhA)가 불활성화 (또는 결실)된 것일 수 있다.

상기 CoA 전이효소는, 예컨대, 프로피오닐-CoA 전이효소일 수 있다. 프로피오닐-CoA 전이효소 (EC 2.8.3.1)는 다음의 반응식 1의 화학 반응을 촉매하는 효소이다:

acetyl-CoA + propanoate ⇔ acetate + propanoyl-CoA (반응식 1).

상기 효소 및 이를 암호화하는 유전자는 클로스트리디움 프로피오니쿰(Clostridium propionicum)에서 유래한 것일 수 있다.

예를 들어, 상기 프로피오닐-CoA 전이효소 암호화 유전자는,

(a) 서열번호 1의 염기서열;

(b) 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G (1200번째 염기인 A가 G로 치환된 변이를 의미함; 이하 기재되는 염기서열 변이 표현에 동일하게 적용됨)의 변이를 포함하는 염기서열;

(c) 서열번호 1의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C의 변이를 포함하는 염기서열;

(d) 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G의 변이를 포함하고, 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 G335A (335번째 아미노산 Gly이 Ala로 치환된 변이를 의미함, 이하 기재되는 아미노산 서열 변이 표현에 동일하게 적용됨)의 변이를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열;

(e) 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G의 변이를 포함하고, 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 A243T의 변이가 포함된 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열;

(f) 서열번호 1 의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C의 변이를 포함하고, 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 D65G의 변이를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열;

(g) 서열번호 1의 염기서열에서 A1200G의 변이를 포함하고, 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 D257N의 변이를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열;

(h) 서열번호 1의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C의 변이를 포함하고, 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 D65N의 변이를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열;

(i) 서열번호 1의 염기서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C의 변이를 포함하고, 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 T199I의 변이를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열; 및

(j) 서열번호 1의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C의 변이를 포함하고, 서열번호 1과 대응하는 아미노산 서열에서 V193A의 변이를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열

로 이루어진 군으로부터 선택된 염기서열을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 상기 프로피오닐-CoA 전이효소는 상기 염기서열에 의하여 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 (polyhydroxyalkanoate (PHA) synthase)는 CoA와 hydroxy fatty acid의 티오에스테르를 기질로 사용하여 폴리하이드록시알카노에이트를 생합성하는 효소로서, 탄소수 3-5의 지방산을 사용하는 type (예컨대, Cupriavidus necator , Alcaligenes latus 등의 다양한 박테리아 유래)과 탄소수 6-14의 지방산을 사용하는 type (예컨대, Pseudomonas 속 유래)의 것일 수 있다.

예컨대, 상기 PHA 합성효소 및 이를 암호화하는 유전자는 슈도모나스 속 (Pseudomonas sp.) 균주, 예컨대, 슈도모나스 속 6-19 균주(Pseudomonas sp. 6-19)에서 유래한 PHA 합성효소(phaC)일 수 있다.

예를 들어, 상기 PHA 합성효소는,

서열번호 4의 아미노산 서열; 또는

서열번호 4의 아미노산 서열에서 L18H, V24A, K91R, M128V, E130D, N246S, S325T, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K, Q481R 및 A527S로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열

을 포함하는 것일 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 PHA 합성효소는,

서열번호 4의 아미노산 서열에서,

(i) S325T 및 Q481M;

(ii) E130D, S325T 및 Q481M;

(iii) E130D, S325T, S477R 및 Q481M;

(iv) E130D, S477F 및 Q481K; 및

(v) L18H, V24A, K91R, M128V, E130D, N246S, S325T, S477G, Q481K 및 A527S

로 이루어진 군으로부터 선택되는 변이를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 상기 PHA 합성효소 암호화 유전자는 상기 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.

상기 락테이트 탈수소효소 D는 피루베이트로부터 D-락테이트를 생산하는 효소이다. 일 예에서, 상기 락테이트 탈수소효소 D는 Pediococcus 속 균주 (예컨대, Pediococcus acidilactici) 유래의 효소 (EC.1.1.1.28; 예컨대, 서열번호 33)일 수 있고, 상기 락테이트 탈수소효소 D를 암호화하는 유전자 (ldhD)는 Pediococcus 속 균주 (예컨대, Pediococcus acidilactici) 유래의 것(예컨대, X70925.1; 서열번호 34) 일 수 있다.

상기 재조합 미생물에서 불활성화(결실)되는 락테이트 탈수소효소 유전자는 상기 미생물 게놈에 원래부터 내재된 락테이트 탈수소효소 유전자이다. 일 예에서, 상기 재조합 미생물이 대장균을 형질전환시켜 얻어진 것인 경우, 상기 불활성화(결실)되는 락테이트 탈수소효소 유전자는 락테이트 탈수소효소 A 유전자 (ldhA)일 수 있다.

상기 재조합 미생물은 세포 내 락트산 함량이 높아서, 세포 자체가 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체 제조 효율을 증진시킬 수 있다.

상기 효소들은 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 범위 내에서 추가적인 변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 경우에 따라서, 상기 단백질은, 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification) 될 수도 있다. 또한, 아미노산 서열 상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 효소 단백질을 포함할 수 있다.

또한, 상기 효소를 코딩하는 유전자는, 기능적으로 균등한 코돈 또는 (코돈의 축퇴성에 의해) 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함할 수 있다. 상기 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술, 예를 들어 화학적 합성 방법 또는 재조합 방법을 이용하여 분리 또는 제조하거나, 시판되는 것을 사용할 수 있다.

"벡터"는 개체의 세포 내에서 목적 단백질을 코딩하는 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며, 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 숙주세포로 도입되기 위한 수단이 된다. 상기 벡터는 플라스미드, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터, 박테리오파지 벡터, 코즈미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터 등 다양한 벡터들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 플라스미드 벡터는 pBlue (예컨대, pBluescript II KS(+)), pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈, pUC19 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 상기 박테리오파지 벡터는 lambda gt4 lambda B, lambda-Charon, lambda Δz1, 및 M13 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 바이러스 벡터는 SV40 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

"재조합 벡터"는 외래의 목적 유전자를 포함하는 클로닝 벡터 및 발현 벡터를 포함한다. 클로닝 벡터는 복제기점, 예를 들어 플라스미드, 파지 또는 코스미드의 복제 기점을 포함하며, 다른 DNA 절편이 부착되어 부착된 절편이 복제될 수 있는 레플리콘이다. 발현 벡터는 단백질을 합성하는데 사용되도록 개발되었다.

본 명세서에서 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포 등 각종 숙주세포에서 목적하는 효소 유전자를 발현하고 이를 생산하는 기능을 할 수 있도록 하면 특별히 한정되지 않지만, 벡터 내로 삽입되어 전달된 유전자가 숙주세포의 게놈 내로 비가역적으로 융합되어 세포 내에서 유전자 발현이 장기간 안정적으로 지속되도록 하는 것이 좋다.

이러한 벡터는, 목적 유전자가 선택된 숙주 내에서 발현될 수 있도록 하는 전사 및 해독 발현 조절 서열을 포함한다. 발현 조절 서열로는, 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및/또는 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.　예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및/또는 리보좀 결합 부위를 포함할 수 있다. 진핵세포에 적합한 조절 서열은 프로모터, 터미네이터 및/또는 폴리아데닐화 시그날을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 목적 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다. 그 외에, 인핸서, 목적하는 유전자의 5' 말단 및 3' 말단의 비해독영역, 선별 마커(예컨대, 항생제 내성 마커), 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수도 있다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 게놈 DNA에 통합될 수 있다.

유용한 발현 조절 서열의 예로는, 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 엡스타인 바이러스(EBV) 프로모터, 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터, RNA 폴리머라제 Ⅱ 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 포스포글리세레이트 키나아제 (phosphoglycerate kinase, PGK) 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합을 포함할 수 있다.

세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 목적하는 유전자와 전사 및 해독 발현 조절 서열이 서로 작동가능하도록 연결되어야 한다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더(leader)에 대한 DNA가 단백질의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결될 수 있고, 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고, 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행될 수 있고, 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하여 수행될 수 있다.

당업자는 숙주세포의 성질, 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현 등을 고려하여, 본 발명에 적합한 각종 벡터, 발현 조절 서열, 숙주 등을 선정할 수 있다.

본 명세서에서 제공되는 재조합 미생물은 상기 재조합 벡터를 사용하여 숙주 미생물 세포를 형질전환시켜서 얻어질 수 있다.

용어, "형질전환"은 목적 유전자를 숙주 미생물로 도입시켜 목절 유전자가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.

숙주 미생물로 사용 가능한 미생물은 원핵세포와 진핵세포로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 통상적으로, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 미생물이 숙주 미생물로서 사용될 수 있다. 숙주 미생물이 구체 예로, 대장균 (예를 들어, E. coli DH5a, E. coli JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli B 및 E. coli XL1-Blue)을 포함하는 에스케리키아 속, 페디오코커스 (Pediococcus) 속, 슈도모나스 속, 바실러스 속, 스트렙토마이세스 속, 어위니아 속, 세라티아 속, 프로비덴시아 속, 코리네박테리움 속, 렙토스피라 속, 살모넬라 속, 브레비박테리아 속, 하이포모나스 속, 크로모박테리움 속, 노카디아 속, 진균, 효모 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 진핵 및/또는 원핵 미생물을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

또한, 본 발명의 목적상, 상기 숙주세포는 탄소원으로부터 하이드록시아실-CoA를 생합성하는 경로를 가지고 있는 미생물일 수 있다.

형질전환 방법으로는, 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술, 예들 들어, 전기천공법(electroporation), 전기주입법(electroinjection), 미세주입법(microinjection), 인산칼슘공동-침전법(calcium phosphate co-precipitation), 염화캄슘/염화루비듐법, 레트로바이러스 감염(retroviral infection), DEAE-덱스트란(DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome)법, 폴리에틸렌 글리콜 침전법(polyethylene glycol-mediated uptake), 유전자총(gene gun) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이 때 원형의 벡터를 적절한 제한효소로 절단하여 선형의 벡터 형태로 도입할 수 있다.

상기 형질전환된 재조합 미생물을 적절한 배지에서 배양하여 락트산 또는 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체를 생산할 수 있다. 이 때 사용되는 배지와 배양조건은 재조합 미생물의 종류에 따라 통상적으로 사용되는 것을 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 배양 시 세포의 생육과 단일중합체의 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배지는 상기 미생물에 대하여 알려진 다양한 탄소원, 질소원, 인원 및 미량원소 성분을 포함할 수 있다. 배지 내 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프락토오스, 말토오스, 전분, 셀룰로오스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 배지 내 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 배지 내 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함하거나, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기된 원료들은 배양 과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 필요에 따라, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입할 수 있으며, 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃ 일 수 있다. 배양은 원하는 고분자의 생산량이 최대로 얻어질 때까지 계속될 수 있다.

본 발명에서 제공되는 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체의 제조 방법은 재조합 미생물을 배양하는 단계 이후에, 생산된 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체를 배양물로부터 회수 (또는 분리 또는 정제)하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

재조합 미생물로부터 생산된 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체는, 당업계에 널리 알려져 있는 방법으로 세포 또는 배양 배지로부터 분리해낼 수 있다. 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체의 회수 방법의 예로서, 원심분리, 초음파파쇄, 여과, 이온교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography: HPLC), 가스 크로마토그래피(gas chromatography: GC) 등의 방법이 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 세포 배양시 생산되는 락트산 함량을 높여서 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체를 효율적으로 생산할 수 있는 재조합 미생물을 제공하며, 이러한 재조합 미생물을 사용하여 생산된 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체는 생분해성 및 생체적합성이므로, 전자, 자동차, 식품, 농업 및 의료 분야 등에 폭넓게 활용될 수 있다.

도 1은 pPs619C1310-CpPCT540 벡터의 제작 과정 및 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 pPs619C1249.18H-CPPCT540 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 pSTV29 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 일 실시예에 따른 ldhD 유전자가 도입된 재조합 균주의 유기산 생산량을 보여주는 그래프이다.
도 5는 pSTV29_ldhD 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 6은 pSTV29_ldhA 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재조합 벡터의 제조

1-1. pPs619C1310-CPPCT540 재조합 벡터의 제조

프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 유전자(pct)는 클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제(CP-PCT)의 변이체를 사용하였고, PHA 합성효소 유전자는 슈도모나스 속 MBEL 6-19 (KCTC 11027BP) 유래의 PHA 합성효소의 변이체를 사용하였다. 이 때 사용된 벡터는 pBluescript II (Stratagene Co., USA)이다.

우선, PHA 합성효소(phaC1Ps6-19) 유전자를 분리하기 위하여, 슈도모나스 속 MBEL 6-19 (KCTC 11027BP)의 전체 DNA를 추출하고, phaC1Ps6-19 유전자 서열(서열번호 3)에 기반하여, 프라이머[5'-GAGAGACAATCAAATCATGAGTAACAAGAGTAACG-3'(서열번호 5), 5'-CACTCATGCAAGCGTCACCGTTCGTGCACGTAC-3'(서열번호 6)]를 제작하고, 상기 추출한 전체 DNA를 주형으로 하여, PCR을 수행하였다. 얻어진 PCR 산물을 전기영동하여, phaC1Ps6-19 유전자에 해당하는 1.7 kb 크기의 유전자 절편을 확인하고, phaC1Ps6-19 유전자를 수득하였다.

phaC1Ps6-19 합성효소를 발현시키기 위하여, pSYL105 벡터(Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347)에서 Ralstonia eutropha H16 유래의 PHB 생산 오페론이 함유된 DNA 절편을 BamHI/EcoRI으로 절단하여, pBluescript II (Stratagene Co., USA)의 BamHI/EcoRI 인식부위에 삽입함으로써 pReCAB 재조합 벡터를 제조하였다. pReCAB 벡터는 PHA 합성효소(phaCRE)와 단량체 공급효소(phaARE 및 phaBRE)가 PHB 오페론 프로모터에 의해 항시적으로 발현된다. BstBI/SbfI 인식 부위가 각각 양끝에 하나씩만 포함된 phaC1Ps6-19 합성효소 유전자 절편을 만들기 위해 우선 내재하고 있는 BstBI 위치를 SDM(site directed mutagenesis) 방법으로 아미노산의 변환 없이 제거하였고, BstBI/SbfI 인식부위를 첨가하기 위해 프라이머[5'-ATGCCCGGAGCCGGTTCGAA-3'(서열번호 7), 5'-CGTTACTCTTGTTACTCATGATTTGATTGTCTCTC-3'(서열번호 8), 5'-GAGAGACAATCAAATCATGAGTAACAAGAGTAACG-3' (서열번호 9), 5'-CACTCATGCAAGCGTCACCGTTCGTGCACGTAC-3'(서열번호 10), 5'-GTACGTGCACGAACGGTGACGCTTGCATGAGTG-3'(서열번호 11), 5'-AACGGGAGGGAACCTGCAGG-3'(서열번호 12)]를 이용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다. pReCAB 벡터를 BstBI/SbfI으로 절단하여 R.eutropha H16 PHA 합성효소 (phaCRE)를 제거한 다음, 상기에서 수득한 phaC1Ps6-19 유전자를 BstBI/SbfI 인식부위에 삽입함으로써 pPs619C1-ReAB 재조합 벡터를 제조하였다.

SCL(short chain length) 활성에 영향을 미치는 아미노산 위치 3 곳을 아미노산 서열 배열분석을 통해 찾았고, 프라이머[5'-CTGACCTTGCTGGTGACCGTGCTTGATACCACC-3'(서열번호 13), 5'-GGTGGTATCAAGCACGGTCACCAGCAAGGTCAG-3'(서열번호 14), 5'-CGAGCAGCGGGCATATCATGAGCATCCTGAACCCGC-3'(서열번호 15), 5'-GCGGGTTCAGGATGCTCATGATATGCCCGCTGCTCG-3'(서열번호 16), 5'-ATCAACCTCATGACCGATGCGATGGCGCCGACC-3'(서열번호 17), 5'-GGTCGGCGCCATCGCATCGGTCATGAGGTTGAT-3'(서열번호 18)]를 사용한 SDM 방법을 이용하여, E130D, S325T, Q481M 을 포함하는 phaC1Ps6-19 합성효소 변이체인 phaC1Ps6-19300을 함유한 pPs619C1300-ReAB 를 제조하였다.

여기에 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제가 같이 발현되는 오페론 형태의 항시적 발현되는 시스템을 구축하기 위하여 클로스트리듐 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 (CP-PCT)를 사용하였다. CP-PCT는 클로스트리듐 프로피오니쿰의 염색체 DNA를 프라이머[5'-GGAATTCATGAGAAAGGTTCCCATTATTACCGCAGATGA-3'(서열번호 19), 5'-GCTCTAGATTAGGACTTCATTTCCTTCAGACCCATTAAGCCTTCTG-3'(서열번호 20)]를 이용하여 PCR하여 얻어진 단편을 사용하였다. 이 때, 원래 야생형 CP-PCT에 존재하는 NdeI site를 cloning의 용이성을 위해 SDM 방법을 이용하여 제거하였고, SbfI/NdeI 인식부위를 첨가하기 위해 프라이머[5'-AGGCCTGCAGGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'(서열번호 21), 5'-GCCCATATGTCTAGATTAGGACTTCATTTCC-3'(서열번호 22)]를 이용하여 오버랩핑 PCR을 수행하였다. pPs619C1300-ReAB 벡터를 SbfI/NdeI으로 절단하여 Ralstonia eutrophus H16 유래의 단량체 공급효소 (phaARE 및 phaBRE)를 제거한 다음, 상기 PCR 클로닝한 CP-PCT 유전자를 SbfI/NdeI 인식 부위에 삽입함으로써 pPs619C1300-CPPCT 재조합 벡터를 제조하였다.

다음으로, CP-PCT 유전자에 무작위적 돌연변이(random mutagenesis)를 도입하기 위해 상기에서 제작된 pPs619C1300-CPPCT을 주형으로 하고, 프라이머[5'-CGCCGGCAGGCCTGCAGG-3'(서열번호 23), 5'-GGCAGGTCAGCCCATATGTC-3'(서열번호 24)]를 이용하여 Mn² ⁺이 첨가되고 dNTPs의 농도 차이가 존재하는 조건에서 Error-prone PCR을 실시하였다. 그 후, 무작위적 돌연변이가 포함된 PCR 단편을 증폭하기 위해 상기 프라이머를 이용하여 일반 조건에서 PCR하였다. pPs619C1300-CPPCT 벡터를 SbfI/NdeI으로 절단하여 야생형 CP-PCT 를 제거한 후, 상기 증폭된 돌연변이 PCR 단편을 SbfI/NdeI 인식부위에 삽입시킨 ligation mixture를 만들어 E. coli JM109에 도입하여 ~105정도 규모의 CP-PCT 라이브러리를 제작하였다. 상기 제작된 CP-PCT 라이브러리는 고분자 검출배지(LB agar, glucose 20g/L, LA 1g/L, Nile red 0.5㎍/ml)에서 3일간 생육시킨 후 고분자 생성 여부를 확인하는 스크리닝 작업을 수행하여 ~80여 개체의 후보를 1차 선정하였다. 이들 후보를 고분자가 생성되는 조건에서 4일간 액체 배양(LB agar, glucose 20g/L, LA 1g/L, ampicillin 100mg/L, 37℃)하였고, FACS(Florescence Activated Cell Sorting) 분석을 통하여 2 개체, 즉 CP-PCT Variant 512 (핵산치환 A1200G 포함) 및 CP-PCT Variant 522 (핵산치환 T78C, T669C, A1125G, T1158C 포함)를 선정하였다. 상기 1차 선별된 돌연변이체들(CP-PCT Variant 512, CP-PCT Variant 522)을 기본으로 다시 상기 Error-prone PCR의 방법으로 무작위적 돌연변이를 수행하여 다양한 CP-PCT 변이체들을 얻을 수 있었고, 그 중 CP-PCT Variant 540 (Val193Ala 및 침묵돌연변이 T78C, T669C, A1125G, T1158C 포함)를 2차 선별하여 pPs619C1300-CPPCT540 벡터를 제조하였다.

또한, 상기 제조한 phaC1Ps6-19 합성효소 변이체(phaC1Ps6-19300)를 기초로 하여 프라이머[5'-GAATTCGTGCTGTCGAGCCGCGGGCATATC-3' (서열번호 25), 5'-GATATGCCCGCGGCTCGACAGCACGAATTC-3'(서열번호 26), 5'-GGGCATATCAAGAGCATCCTGAACCCGC-3'(서열번호 27), 5'-GCGGGTTCAGGATGCTCTTGATATGCCC-3'(서열번호 28)]를 사용한 SDM 방법을 이용하여 E130D, S477F 및 Q481K 이 변이된 아미노산 서열을 가진 슈도모나스 속 MBEL 6-19 유래 PHA 합성효소 변이체(phaC1Ps6-19310) 를 함유한 pPs619C1310-CPPCT540 벡터를 제조하였다(도 1).

1-2. pPs619C1249.18H-CPPCT540 재조합 벡터의 제조

상기 1-1 에서 제조한 pPs619C1310-CPPCT540 벡터를 주형으로 하여 프라이머[5'-ATGCCCGGAGCCGGTTCGAA-3'(서열번호 29) 및 5'-GAAATTGTTATCCGCCTGCAGG-3'(서열번호 30)]를 사용하여 error-prone PCR을 수행하였다. error-prone PCR을 수행한 후 돌연변이가 포함된 PCR 단편을 증폭하기 위해 상기 프라이머를 이용하여 다시 PCR 한 후 증폭된 돌연변이들을 pPs619C1310-CPPCT540 벡터의 BstBI/SbfI 위치에 삽입하여 변이체들에 대한 라이브러리를 제작하였다. 제작된 변이체 라이브러리를 E.coli XL-1Blue에 형질전환 시키고, 이를 PHB 검출배지(LB agar, glucose 20g/L, Nile red 0.5μg/ml)에서 3일 동안 배양했다. 배양 후 스크리닝 과정을 통해 최종 선별된 변이체는 L18H, V24A, K91R, M128V, E130D, N246S, S325T, S477G, Q481K 및 A527S이 변이된 아미노산 서열을 가진 pPs619C1249.18H 이었다. 이렇게 하여 재조합 벡터 pPs619C1249.18H-CPPCT540 벡터를 제조하였다(도 2).

실시예 2. 락트산 생산용 재조합 균주의 제조

2.1. ldhA 유전자가 넉아웃(knock-out)된 변이체 제작

Escherichia coli XL1-Blue (Stratagene, USA)를 바탕으로 하여 락테이트가 포함되지 않는 중합체를 생산하기 위하여 대장균의 대사과정 중 락테이트 생산에 관여하는 Escherichia coli XL1-blue 유래 D-락테이트디하이드로게나제 유전자 (ldhA)를 genomic DNA에서 knock-out 시켜, ldhA이 결실된 대장균 변이체 E. coli XL1-Blue(ΔldhA)를 제작하였다. 유전자의 결실은 업계에 잘 알려져 있는 red-recombination 방법을 이용하였다. ldhA를 결실시키기 위해 사용된 올리고머는 서열번호 31 (5'-ATCAGCGTACCCGTGATGCTAACTTCTCTCTGGAAGGTCTGACCGGCTTTAATTAACCCTCACTAAAGGGCG-3') 및 서열번호 32 (5'-ATCAGCGTACCCGTGATGCTAACTTCTCTCTGGAAGGTCTGACCGGCTTTAATTAACCCTCACTAAAGGGCG-3')의 염기서열로 합성하였다.

2.2. ldhD 유전자가 도입된 변이체 제작

pSTV29 벡터 (도 3)에 Pediococcus acidilactici DSM 유래 락테이트 탈수소효소 유전자 (ldhD) (X70925.1; 서열번호 34)를 삽입하여 ldhD 도입을 위한 재조합 벡터 pSTV29_ldhD를 제작하였다(도 5 참조; 프라이머: 5'-AATTAAAAGCTTATGAAGATTATTGCTTAT-3'(서열번호 35); 5'-CAAGATGGATCCTTACTCAAACTTAACTTC-3' (서열번호 36)). 상기 제작된 재조합 벡터 pSTV29_ldhD를 E. coli XL1-blue (Stratagene, USA) 및 상기 실시예 2.1에서 제작된 ldhA 결실 대장균 변이체 E. coli XL1-Blue(ΔldhA)에 각각 도입하여, ldhD가 도입된 대장균 변이체 XB+pSTV29_ldhD 및 XBΔldhA+pSTV29_ldhD (ldhA 결실)를 각각 제작하였다.

2.3. ldhA 유전자가 도입된 변이체 제작

비교를 위하여, pSTV29 벡터(도 3)에 Escherichia coli str. K-12 유래 D-락테이트디하이드로게나제 유전자 (ldhA) (NC_000913.3; 서열번호 38; 아미노산 서열: 서열번호 37)를 삽입하여 ldhA 도입을 위한 재조합 벡터 pSTV29_ldhA를 제작하였다 (도 6 참조; 프라이머: 5'-AATTAAAAGCTTATGAAACTCGCCGTTTAT-3'(서열번호 39); 5'-CAAGATGGATCCTTAAACCAGTTCGTTCGG-3'(서열번호 40)).

상기 재조합 벡터 pSTV29_ldhA를 E. coli XL1-blue (Stratagene, USA)에 도입하여, ldhA가 도입된 대장균 변이체 XB+pSTV29_ldhA (ldhA 과발현 균주)를 제작하였다.

실시예 3. 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체 제조를 위한 재조합 균주 제작

상기 실시예 2.2에서 제작된 ldhD가 도입된 대장균 변이체 XB+pSTV29_ldhD를 상기 실시예 1.2에서 제작된 재조합 벡터 pPs619C1249.18H-CPPCT540를 이용하여 전기천공법(electroporation)으로 형질전환 시켜 재조합 균주 XB+LdhD+249_18H-540를 제작하였다. 비교를 위하여, 상기 실시예 2.3에서 제작된 ldhA가 도입된 대장균 변이체 XB+pSTV29_ldhA를 재조합 벡터 pPs619C1249.18H-CPPCT540를 이용하여 형질전환시켜서 재조합 균주 XB+LdhA+ 249_18H-540를 제작하였다.

실시예 4. 락트산 생산량 측정

상기 실시예 2.2에서 제작된 재조합 균주 XB+pSTV29_ldhD 및 XBΔldhA+ pSTV29_ldhD를 사용하여 락트산 생산량을 시험하였다. 비교를 위하여, 야생형 E.coli XL1-Blue (XB), 상기 실시예 2.1에서 제작된 E.coli XL1-Blue(ΔldhA), 및 실시예 2.3에서 제작된 XB+pSTV29_ldhA (ldhA 과발현 균주)를 각각 사용하여 동일한 시험을 수행하였다.

이들 재조합 균주를 각각 100mg/L 앰피실린(ampicillin)과 30mg/L 클로람페니콜 (chloramphenicol)이 함유되어 있는 3 mL의 LB 배지[Bacto^TM Triptone(BD) 10g/L, Bacto^TM yeast extract(BD) 5g/L, NaCl(amresco) 10g/L]에서 12시간동안 전 배양 (seed culture) 하였다.

얻어진 전 배양액 100ml를 100mg/L의 앰피실린, 30mg/L 클로람페니콜, 글루코오스 20g/L 및 thiamine 10mg/L이 추가로 함유된 100ml MR 배지(배지 1L 당 Glucose 10g, KH₂PO₄ 6.67g, (NH₄)2HPO₄ 4g, MgSO₄·7H₂O 0.8g, citric acid 0.8g, 및 trace metal solution 5mL; 여기에서, Trace metal solution은 1L 당 5M HCl 5mL, FeSO₄·7H₂O 10g, CaCl₂ 2g, ZnSO₄·7H₂O 2.2g, MnSO₄·4H₂O 0.5g, CuSO₄·5H₂O 1g, (NH₄)6Mo₇O₂·4H₂O 0.1g, 및 Na₂B₄O₂·10H₂ O 0.02g 함유)에 접종하여 30℃에서 2일간 250 rpm으로 교반하며 본 배양을 수행하였다.

상기 얻어진 배양액 내 유기산 함량을 HPLC로 분석하였다. 배양액 내 유기산 함량 분석을 위한 HPCL 수행을 위하여, Aminex HPX-87H ion exclusion column(7.8*300 mm, 9㎛)을 사용하여 5mM sulfuric acid(H2SO4)를 flow rate 0.6 ml/min 속도로 흘려주었다. 이 때 column의 온도는 50 ℃로 맞추고, UV 210 nm에서 검출하였다.

상기 얻어진 재조합 균주의 유기산 생산량 측정 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 확인되는 바와 같이, 야생형 E.coli XL1-Blue (XB) 균주에 ldhA 도입되어 ldhA 유전자가 과발현되거나, 야생형 XB 또는 ldhA 결여 XB 균주에 ldhD 유전자가 도입된 경우에, ldhA 또는 ldhD 유전자가 도입되지 않은 경우와 비교하여, 락테이트 생산량이 증가하였다. 특히, ldhA 유전자가 도입된 경우와 비교하여, ldhA 유전자가 결핍되거나 결핍되지 않은 균주에 ldhD 유전자가 도입된 변이체의 락테이트 생산량이 현저하게 증가함을 알 수 있다.

실시예 5. 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체 생산량 측정

E. coli XL1-blue (XB) 및 상기 실시예 3에서 준비된 재조합 균주 XB+LdhD+249_18H-540 및 XB+LdhA+249_18H-540을 각각 100mg/L 앰피실린(ampicillin)이 30mg/L 클로람페니콜 (chloramphenicol) 함유되어 있는 3 mL의 LB 배지[Bacto^TM Triptone(BD) 10g/L, Bacto^TM yeast extract(BD) 5g/L, NaCL(amresco) 10g/L]에서 12시간동안 전 배양 (seed culture) 하였다.

얻어진 전 배양액 100ml를 100mg/L의 앰피실린, 30mg/L 클로람페니콜, 글루코오스 20g/L 및 thiamine 10mg/L이 추가로 함유된 100ml MR 배지(배지 1L 당 Glucose 10g, KH₂PO₄ 6.67g, (NH₄)2HPO₄ 4g, MgSO₄·7H₂O 0.8g, citric acid 0.8g, 및 trace metal solution 5mL; 여기에서, Trace metal solution은 1L 당 5M HCl 5mL, FeSO₄·7H₂O 10g, CaCl₂ 2g, ZnSO₄·7H₂O 2.2g, MnSO₄·4H₂O 0.5g, CuSO₄·5H₂O 1g, (NH₄)6Mo₇O₂·4H₂O 0.1g, 및 Na₂B₄O₂·10H₂ O 0.02g 함유)에 접종하여 30℃에서 4일간 250 rpm으로 교반하며 본 배양을 수행하였다.

상기 배양액을 4℃, 4000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 회수하고 충분한 양의 증류수로 2회 씻어준 후 80℃ 에서 12시간 건조하였다. 제거된 균체를 정량한 후 100℃에서 클로로포름을 용매로 사용하여 황산 촉매 하에서 메탄올과 반응시켜 주었다. 이를 상온에서 클로로포름의 절반에 해당하는 부피의 증류수를 첨가하여 혼합한 후 두 개의 층으로 분리될 때까지 정치시켰다. 두 개의 층 중에서 메틸화된 고분자의 단량체들이 녹아 있는 클로로포름층을 채취하여 가스크로마토그래피(GC)로 고분자의 성분을 분석하였다. 내부 표준물질로는 벤조에이트(benzoate)를 사용하였다. 이 때 사용된 GC 분석조건은 하기의 표 1과 같다.

GC 분석조건

Item	Quality
Model	Hewlett Packard 6890N
Detector	Flame ionization detector(FID)
Column	Alltech Capillary AT^TM-WAX, 30m, 0.53mm
Liquid phase	100% polyethylene Glycol
Inj.port temp/Det.port temp	250℃/ 250℃
Carrier gas	He
Total flow	3ml/min
septum purge went flow	1ml/min
Column head pressure	29kPa
Injection port mode	Splitless
Injection volumn/Solvent	1㎕/chloroform
Initial temp./Time	80℃/5min
Final temp./Time	230℃/5min
Ramp of temp.	7.5℃/min

얻어진 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체 함량 분석 결과를 표 2에 나타내었다.

재조합 균주	PLA homopolymer content (wt%)
XB + LdhD + 249_18H-540	20.2
XB + LdhA + 249_18H-540	7.1
XB + 249_18H-540	7.3

표 2에 나타난 바와 같이, LdhD 유전자를 도입한 재조합 대장균(XB+LdhD+249_18H-540)의 경우, 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체의 세포 내 함량이 20중량% 이상으로 나타났으며, 이는 LdhA 과발현 균주(XB+LdhA+249_18H-540) 및 pPs619C1249.18H-CPPCT540 벡터만 도입한 XB+249_18H-540 균주 (LdhA 유전자 결실되지 않음)와 비교하여 약 3배 이상 증가된 수치이다. 반면, LdhA 과발현 균주(XB+LdhA+249_18H-540)는 락테이트 생산량은 대조구(XB)보다 증가하였지만 (도 4 참조), 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체의 세포 내 함량이 대조구(XB)와 거의 차이가 없었다. 상기 결과는 락테이트 탈수소효소 (Ldh) 계열 효소의 유전자 중에서 LdhD 유전자의 도입이 락테이트를 반복단위로 포함하는 폴리락트산 단일중합체 생산량 증가에 결정적인 역할을 한다는 것을 보여준다.

<110> LG CHEM, LTD. <120> Method of Preparing PLA Homopolymer Using Recombinant Microorganism Comprising LdhD Gene <130> DPP20173749KR <160> 40 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1575 <212> DNA <213> Clostridium propionicum <220> <221> gene <222> (1)..(1575) <223> popionyl-CoA transferase <400> 1 atgagaaagg ttcccattat taccgcagat gaggctgcaa agcttattaa agacggtgat 60 acagttacaa caagtggttt cgttggaaat gcaatccctg aggctcttga tagagctgta 120 gaaaaaagat tcttagaaac aggcgaaccc aaaaacatta cctatgttta ttgtggttct 180 caaggtaaca gagacggaag aggtgctgag cactttgctc atgaaggcct tttaaaacgt 240 tacatcgctg gtcactgggc tacagttcct gctttgggta aaatggctat ggaaaataaa 300 atggaagcat ataatgtatc tcagggtgca ttgtgtcatt tgttccgtga tatagcttct 360 cataagccag gcgtatttac aaaggtaggt atcggtactt tcattgaccc cagaaatggc 420 ggcggtaaag taaatgatat taccaaagaa gatattgttg aattggtaga gattaagggt 480 caggaatatt tattctaccc tgcttttcct attcatgtag ctcttattcg tggtacttac 540 gctgatgaaa gcggaaatat cacatttgag aaagaagttg ctcctctgga aggaacttca 600 gtatgccagg ctgttaaaaa cagtggcggt atcgttgtag ttcaggttga aagagtagta 660 aaagctggta ctcttgaccc tcgtcatgta aaagttccag gaatttatgt tgactatgtt 720 gttgttgctg acccagaaga tcatcagcaa tctttagatt gtgaatatga tcctgcatta 780 tcaggcgagc atagaagacc tgaagttgtt ggagaaccac ttcctttgag tgcaaagaaa 840 gttattggtc gtcgtggtgc cattgaatta gaaaaagatg ttgctgtaaa tttaggtgtt 900 ggtgcgcctg aatatgtagc aagtgttgct gatgaagaag gtatcgttga ttttatgact 960 ttaactgctg aaagtggtgc tattggtggt gttcctgctg gtggcgttcg ctttggtgct 1020 tcttataatg cggatgcatt gatcgatcaa ggttatcaat tcgattacta tgatggcggc 1080 ggcttagacc tttgctattt aggcttagct gaatgcgatg aaaaaggcaa tatcaacgtt 1140 tcaagatttg gccctcgtat cgctggttgt ggtggtttca tcaacattac acagaataca 1200 cctaaggtat tcttctgtgg tactttcaca gcaggtggct taaaggttaa aattgaagat 1260 ggcaaggtta ttattgttca agaaggcaag cagaaaaaat tcttgaaagc tgttgagcag 1320 attacattca atggtgacgt tgcacttgct aataagcaac aagtaactta tattacagaa 1380 agatgcgtat tccttttgaa ggaagatggt ttgcacttat ctgaaattgc acctggtatt 1440 gatttgcaga cacagattct tgacgttatg gattttgcac ctattattga cagagatgca 1500 aacggccaaa tcaaattgat ggacgctgct ttgtttgcag aaggcttaat gggtctgaag 1560 gaaatgaagt cctaa 1575 <210> 2 <211> 524 <212> PRT <213> Clostridium propionicum <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(524) <223> propionyl-CoA transferase <400> 2 Met Arg Lys Val Pro Ile Ile Thr Ala Asp Glu Ala Ala Lys Leu Ile 1 5 10 15 Lys Asp Gly Asp Thr Val Thr Thr Ser Gly Phe Val Gly Asn Ala Ile 20 25 30 Pro Glu Ala Leu Asp Arg Ala Val Glu Lys Arg Phe Leu Glu Thr Gly 35 40 45 Glu Pro Lys Asn Ile Thr Tyr Val Tyr Cys Gly Ser Gln Gly Asn Arg 50 55 60 Asp Gly Arg Gly Ala Glu His Phe Ala His Glu Gly Leu Leu Lys Arg 65 70 75 80 Tyr Ile Ala Gly His Trp Ala Thr Val Pro Ala Leu Gly Lys Met Ala 85 90 95 Met Glu Asn Lys Met Glu Ala Tyr Asn Val Ser Gln Gly Ala Leu Cys 100 105 110 His Leu Phe Arg Asp Ile Ala Ser His Lys Pro Gly Val Phe Thr Lys 115 120 125 Val Gly Ile Gly Thr Phe Ile Asp Pro Arg Asn Gly Gly Gly Lys Val 130 135 140 Asn Asp Ile Thr Lys Glu Asp Ile Val Glu Leu Val Glu Ile Lys Gly 145 150 155 160 Gln Glu Tyr Leu Phe Tyr Pro Ala Phe Pro Ile His Val Ala Leu Ile 165 170 175 Arg Gly Thr Tyr Ala Asp Glu Ser Gly Asn Ile Thr Phe Glu Lys Glu 180 185 190 Val Ala Pro Leu Glu Gly Thr Ser Val Cys Gln Ala Val Lys Asn Ser 195 200 205 Gly Gly Ile Val Val Val Gln Val Glu Arg Val Val Lys Ala Gly Thr 210 215 220 Leu Asp Pro Arg His Val Lys Val Pro Gly Ile Tyr Val Asp Tyr Val 225 230 235 240 Val Val Ala Asp Pro Glu Asp His Gln Gln Ser Leu Asp Cys Glu Tyr 245 250 255 Asp Pro Ala Leu Ser Gly Glu His Arg Arg Pro Glu Val Val Gly Glu 260 265 270 Pro Leu Pro Leu Ser Ala Lys Lys Val Ile Gly Arg Arg Gly Ala Ile 275 280 285 Glu Leu Glu Lys Asp Val Ala Val Asn Leu Gly Val Gly Ala Pro Glu 290 295 300 Tyr Val Ala Ser Val Ala Asp Glu Glu Gly Ile Val Asp Phe Met Thr 305 310 315 320 Leu Thr Ala Glu Ser Gly Ala Ile Gly Gly Val Pro Ala Gly Gly Val 325 330 335 Arg Phe Gly Ala Ser Tyr Asn Ala Asp Ala Leu Ile Asp Gln Gly Tyr 340 345 350 Gln Phe Asp Tyr Tyr Asp Gly Gly Gly Leu Asp Leu Cys Tyr Leu Gly 355 360 365 Leu Ala Glu Cys Asp Glu Lys Gly Asn Ile Asn Val Ser Arg Phe Gly 370 375 380 Pro Arg Ile Ala Gly Cys Gly Gly Phe Ile Asn Ile Thr Gln Asn Thr 385 390 395 400 Pro Lys Val Phe Phe Cys Gly Thr Phe Thr Ala Gly Gly Leu Lys Val 405 410 415 Lys Ile Glu Asp Gly Lys Val Ile Ile Val Gln Glu Gly Lys Gln Lys 420 425 430 Lys Phe Leu Lys Ala Val Glu Gln Ile Thr Phe Asn Gly Asp Val Ala 435 440 445 Leu Ala Asn Lys Gln Gln Val Thr Tyr Ile Thr Glu Arg Cys Val Phe 450 455 460 Leu Leu Lys Glu Asp Gly Leu His Leu Ser Glu Ile Ala Pro Gly Ile 465 470 475 480 Asp Leu Gln Thr Gln Ile Leu Asp Val Met Asp Phe Ala Pro Ile Ile 485 490 495 Asp Arg Asp Ala Asn Gly Gln Ile Lys Leu Met Asp Ala Ala Leu Phe 500 505 510 Ala Glu Gly Leu Met Gly Leu Lys Glu Met Lys Ser 515 520 <210> 3 <211> 1677 <212> DNA <213> Pseudomonas sp. 6-19 <220> <221> gene <222> (1)..(1677) <223> PHA synthase <400> 3 atgagtaaca agagtaacga tgagttgaag tatcaagcct ctgaaaacac cttggggctt 60 aatcctgtcg ttgggctgcg tggaaaggat ctactggctt ctgctcgaat ggtgcttagg 120 caggccatca agcaaccggt gcacagcgtc aaacatgtcg cgcactttgg tcttgaactc 180 aagaacgtac tgctgggtaa atccgggctg caaccgacca gcgatgaccg tcgcttcgcc 240 gatccggcct ggagccagaa cccgctctat aaacgttatt tgcaaaccta cctggcgtgg 300 cgcaaggaac tccacgactg gatcgatgaa agtaacctcg cccccaagga tgtggcgcgt 360 gggcacttcg tgatcaacct catgaccgaa gcgatggcgc cgaccaacac cgcggccaac 420 ccggcggcag tcaaacgctt ttttgaaacc ggtggcaaaa gcctgctcga cggcctctcg 480 cacctggcca aggatctggt acacaacggc ggcatgccga gccaggtcaa catgggtgca 540 ttcgaggtcg gcaagagcct gggcgtgacc gaaggcgcgg tggtgtttcg caacgatgtg 600 ctggaactga tccagtacaa gccgaccacc gagcaggtat acgaacgccc gctgctggtg 660 gtgccgccgc agatcaacaa gttctacgtt ttcgacctga gcccggacaa gagcctggcg 720 cggttctgcc tgcgcaacaa cgtgcaaacg ttcatcgtca gctggcgaaa tcccaccaag 780 gaacagcgag agtggggcct gtcgacctac atcgaagccc tcaaggaagc ggttgacgtc 840 gttaccgcga tcaccggcag caaagacgtg aacatgctcg gggcctgctc cggcggcatc 900 acttgcactg cgctgctggg ccattacgcg gcgattggcg aaaacaaggt caacgccctg 960 accttgctgg tgagcgtgct tgataccacc ctcgacagcg acgtcgccct gttcgtcaat 1020 gaacagaccc ttgaagccgc caagcgccac tcgtaccagg ccggcgtact ggaaggccgc 1080 gacatggcga aggtcttcgc ctggatgcgc cccaacgatc tgatctggaa ctactgggtc 1140 aacaattacc tgctaggcaa cgaaccgccg gtgttcgaca tcctgttctg gaacaacgac 1200 accacacggt tgcccgcggc gttccacggc gacctgatcg aactgttcaa aaataaccca 1260 ctgattcgcc cgaatgcact ggaagtgtgc ggcaccccca tcgacctcaa gcaggtgacg 1320 gccgacatct tttccctggc cggcaccaac gaccacatca ccccgtggaa gtcctgctac 1380 aagtcggcgc aactgtttgg cggcaacgtt gaattcgtgc tgtcgagcag cgggcatatc 1440 cagagcatcc tgaacccgcc gggcaatccg aaatcgcgct acatgaccag caccgaagtg 1500 gcggaaaatg ccgatgaatg gcaagcgaat gccaccaagc atacagattc ctggtggctg 1560 cactggcagg cctggcaggc ccaacgctcg ggcgagctga aaaagtcccc gacaaaactg 1620 ggcagcaagg cgtatccggc aggtgaagcg gcgccaggca cgtacgtgca cgaacgg 1677 <210> 4 <211> 559 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. 6-19 <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(559) <223> PHA synthase <400> 4 Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln Pro Val His 35 40 45 Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro 195 200 205 Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe 405 410 415 Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr 485 490 495 Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr 500 505 510 Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln 515 520 525 Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala 530 535 540 Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gagagacaat caaatcatga gtaacaagag taacg 35 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cactcatgca agcgtcaccg ttcgtgcacg tac 33 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atgcccggag ccggttcgaa 20 <210> 8 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cgttactctt gttactcatg atttgattgt ctctc 35 <210> 9 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gagagacaat caaatcatga gtaacaagag taacg 35 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cactcatgca agcgtcaccg ttcgtgcacg tac 33 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gtacgtgcac gaacggtgac gcttgcatga gtg 33 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 aacgggaggg aacctgcagg 20 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ctgaccttgc tggtgaccgt gcttgatacc acc 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ggtggtatca agcacggtca ccagcaaggt cag 33 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cgagcagcgg gcatatcatg agcatcctga acccgc 36 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gcgggttcag gatgctcatg atatgcccgc tgctcg 36 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 atcaacctca tgaccgatgc gatggcgccg acc 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ggtcggcgcc atcgcatcgg tcatgaggtt gat 33 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ggaattcatg agaaaggttc ccattattac cgcagatga 39 <210> 20 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gctctagatt aggacttcat ttccttcaga cccattaagc cttctg 46 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 aggcctgcag gcggataaca atttcacaca gg 32 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gcccatatgt ctagattagg acttcatttc c 31 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 cgccggcagg cctgcagg 18 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ggcaggtcag cccatatgtc 20 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 gaattcgtgc tgtcgagccg cgggcatatc 30 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gatatgcccg cggctcgaca gcacgaattc 30 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gggcatatca agagcatcct gaacccgc 28 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gcgggttcag gatgctcttg atatgccc 28 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 atgcccggag ccggttcgaa 20 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 gaaattgtta tccgcctgca gg 22 <210> 31 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligomer <400> 31 atcagcgtac ccgtgatgct aacttctctc tggaaggtct gaccggcttt aattaaccct 60 cactaaaggg cg 72 <210> 32 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligomer <400> 32 atcagcgtac ccgtgatgct aacttctctc tggaaggtct gaccggcttt aattaaccct 60 cactaaaggg cg 72 <210> 33 <211> 331 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> d-lactate dehydrogenase (ldhD) from Pediococcus acidilactici <400> 33 Met Lys Ile Ile Ala Tyr Gly Ile Arg Asp Asp Glu Lys Pro Tyr Leu 1 5 10 15 Asp Glu Trp Val Thr Lys Asn His Ile Glu Val Lys Ala Val Pro Asp 20 25 30 Leu Leu Asp Ser Ser Asn Ile Asp Leu Ala Lys Asp Tyr Asp Gly Val 35 40 45 Val Ala Tyr Gln Gln Lys Pro Tyr Thr Ala Asp Leu Phe Asp Lys Met 50 55 60 His Glu Phe Gly Ile His Ala Phe Ser Leu Arg Asn Val Gly Leu Asp 65 70 75 80 Asn Val Pro Ala Asp Ala Leu Lys Lys Asn Asp Ile Lys Ile Ser Asn 85 90 95 Val Pro Ala Tyr Ser Pro Arg Ala Ile Ala Glu Leu Ser Val Thr Gln 100 105 110 Leu Leu Ala Leu Leu Arg Lys Ile Pro Glu Phe Glu Tyr Lys Met Ala 115 120 125 His Gly Asp Tyr Arg Trp Glu Pro Asp Ile Gly Leu Glu Leu Asn Gln 130 135 140 Met Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Arg Ile Gly Arg Ala Ala Ile 145 150 155 160 Asp Ile Phe Lys Pro Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp Val Phe 165 170 175 Arg Asn Pro Ala Leu Glu Lys Glu Gly Met Tyr Val Asp Thr Leu Glu 180 185 190 Glu Leu Tyr Gln Gln Ala Asn Val Ile Thr Leu His Val Pro Ala Leu 195 200 205 Lys Asp Asn Tyr His Met Leu Asp Glu Lys Ala Phe Gly Gln Met Gln 210 215 220 Asp Gly Thr Phe Ile Leu Asn Phe Ala Arg Gly Thr Leu Val Asp Thr 225 230 235 240 Pro Ala Leu Leu Lys Ala Leu Asp Ser Gly Lys Val Ala Gly Ala Ala 245 250 255 Leu Asp Thr Tyr Glu Asn Glu Val Gly Ile Phe Asp Val Asp His Gly 260 265 270 Asp Gln Pro Ile Asp Asp Pro Val Phe Asn Asp Leu Met Ser Arg Arg 275 280 285 Asn Val Met Ile Thr Pro His Ala Ala Phe Tyr Thr Arg Pro Ala Val 290 295 300 Lys Asn Met Val Gln Ile Ala Leu Asp Asn Asn Arg Asp Leu Ile Glu 305 310 315 320 Lys Asn Ser Ser Lys Asn Glu Val Lys Phe Glu 325 330 <210> 34 <211> 996 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ldhD gene (X70925.1) <400> 34 atgaagatta ttgcttatgg aattcgtgac gatgaaaaac catatttaga cgaatgggta 60 acgaagaacc atatcgaggt taaagcggtc cccgatttgt tagattctag taacattgat 120 ttggcaaagg attacgatgg ggtagttgct taccaacaaa agccttacac cgctgattta 180 tttgataaga tgcacgaatt tgggattcat gccttctcgc tgcgtaacgt cggacttgat 240 aacgtacccg cagatgcact caagaaaaat gatatcaaaa tttcgaacgt accagcatat 300 tctccaagag caattgctga attgtcagtc acccaactgt tagcattact ccgtaagatt 360 cctgaatttg aatacaaaat ggctcatggc gattatcgtt gggaaccaga catcggtttg 420 gaacttaatc aaatgaccgt tggggtaatt ggtaccggac ggattggccg tgctgcaatt 480 gacattttta aaccatttgg cgcaaaggta attgcgtacg atgttttccg taatcctgca 540 ttagaaaagg aaggcatgta tgtagatact ttagaagagc tttaccaaca agctaacgtc 600 attactttac acgttccagc actaaaggat aattaccaca tgttggatga aaaggccttt 660 ggtcaaatgc aagacggaac cttcatccta aacttcgcgc gggggacttt agttgataca 720 cctgcacttt taaaggcgtt agatagtggt aaagttgctg gagctgcgct agatacttac 780 gaaaacgaag tcggcatctt tgatgtcgat catggtgatc aaccaattga tgacccagtt 840 tttaacgatt tgatgagtcg ccgtaacgta atgattacgc cacacgctgc cttctacacc 900 cgcccagcgg ttaaaaacat ggttcaaatc gccttagaca acaaccggga cttaattgaa 960 aagaattctt caaagaatga agttaagttt gagtaa 996 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 aattaaaagc ttatgaagat tattgcttat 30 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 caagatggat ccttactcaa acttaacttc 30 <210> 37 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ldhA (fermentative D-lactate dehydrogenase, NAD-dependent) from Escherichia coli str. K-12 <400> 37 Met Lys Leu Ala Val Tyr Ser Thr Lys Gln Tyr Asp Lys Lys Tyr Leu 1 5 10 15 Gln Gln Val Asn Glu Ser Phe Gly Phe Glu Leu Glu Phe Phe Asp Phe 20 25 30 Leu Leu Thr Glu Lys Thr Ala Lys Thr Ala Asn Gly Cys Glu Ala Val 35 40 45 Cys Ile Phe Val Asn Asp Asp Gly Ser Arg Pro Val Leu Glu Glu Leu 50 55 60 Lys Lys His Gly Val Lys Tyr Ile Ala Leu Arg Cys Ala Gly Phe Asn 65 70 75 80 Asn Val Asp Leu Asp Ala Ala Lys Glu Leu Gly Leu Lys Val Val Arg 85 90 95 Val Pro Ala Tyr Asp Pro Glu Ala Val Ala Glu His Ala Ile Gly Met 100 105 110 Met Met Thr Leu Asn Arg Arg Ile His Arg Ala Tyr Gln Arg Thr Arg 115 120 125 Asp Ala Asn Phe Ser Leu Glu Gly Leu Thr Gly Phe Thr Met Tyr Gly 130 135 140 Lys Thr Ala Gly Val Ile Gly Thr Gly Lys Ile Gly Val Ala Met Leu 145 150 155 160 Arg Ile Leu Lys Gly Phe Gly Met Arg Leu Leu Ala Phe Asp Pro Tyr 165 170 175 Pro Ser Ala Ala Ala Leu Glu Leu Gly Val Glu Tyr Val Asp Leu Pro 180 185 190 Thr Leu Phe Ser Glu Ser Asp Val Ile Ser Leu His Cys Pro Leu Thr 195 200 205 Pro Glu Asn Tyr His Leu Leu Asn Glu Ala Ala Phe Glu Gln Met Lys 210 215 220 Asn Gly Val Met Ile Val Asn Thr Ser Arg Gly Ala Leu Ile Asp Ser 225 230 235 240 Gln Ala Ala Ile Glu Ala Leu Lys Asn Gln Lys Ile Gly Ser Leu Gly 245 250 255 Met Asp Val Tyr Glu Asn Glu Arg Asp Leu Phe Phe Glu Asp Lys Ser 260 265 270 Asn Asp Val Ile Gln Asp Asp Val Phe Arg Arg Leu Ser Ala Cys His 275 280 285 Asn Val Leu Phe Thr Gly His Gln Ala Phe Leu Thr Ala Glu Ala Leu 290 295 300 Thr Ser Ile Ser Gln Thr Thr Leu Gln Asn Leu Ser Asn Leu Glu Lys 305 310 315 320 Gly Glu Thr Cys Pro Asn Glu Leu Val 325 <210> 38 <211> 990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ldhA gene (NC_000913.3) <400> 38 atgaaactcg ccgtttatag cacaaaacag tacgacaaga agtacctgca acaggtgaac 60 gagtcctttg gctttgagct ggaatttttt gactttctgc tgacggaaaa aaccgctaaa 120 actgccaatg gctgcgaagc ggtatgtatt ttcgtaaacg atgacggcag ccgcccggtg 180 ctggaagagc tgaaaaagca cggcgttaaa tatatcgccc tgcgctgtgc cggtttcaat 240 aacgtcgacc ttgacgcggc aaaagaactg gggctgaaag tagtccgtgt tccagcctat 300 gatccagagg ccgttgctga acacgccatc ggtatgatga tgacgctgaa ccgccgtatt 360 caccgcgcgt atcagcgtac ccgtgatgct aacttctctc tggaaggtct gaccggcttt 420 actatgtatg gcaaaacggc aggcgttatc ggtaccggta aaatcggtgt ggcgatgctg 480 cgcattctga aaggttttgg tatgcgtctg ctggcgttcg atccgtatcc aagtgcagcg 540 gcgctggaac tcggtgtgga gtatgtcgat ctgccaaccc tgttctctga atcagacgtt 600 atctctctgc actgcccgct gacaccggaa aactatcatc tgttgaacga agccgccttc 660 gaacagatga aaaatggcgt gatgatcgtc aataccagtc gcggtgcatt gattgattct 720 caggcagcaa ttgaagcgct gaaaaatcag aaaattggtt cgttgggtat ggacgtgtat 780 gagaacgaac gcgatctatt ctttgaagat aaatccaacg acgtgatcca ggatgacgta 840 ttccgtcgcc tgtctgcctg ccacaacgtg ctgtttaccg ggcaccaggc attcctgaca 900 gcagaagctc tgaccagtat ttctcagact acgctgcaaa acttaagcaa tctggaaaaa 960 ggcgaaacct gcccgaacga actggtttaa 990 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 aattaaaagc ttatgaaact cgccgtttat 30 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 caagatggat ccttaaacca gttcgttcgg 30

Claims

락테이트 탈수소효소 D (Lactate Dehydrogenase D) 유전자(ldhD), 프로피오닐-CoA 전이효소 암호화 유전자, 및 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 암호화 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 포함하고,
상기 프로피오닐-CoA 전이효소 암호화 유전자는 서열번호 1의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 1의 염기서열이 번역된 아미노산 서열에서 Val193Ala을 포함하도록 변이된 염기서열을 포함하고,
상기 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 암호화 유전자는 서열번호 4의 아미노산 서열에서 L18H, V24A, K91R, M128V, E130D, N246S, S325T, S477G, Q481K 및 A527S 변이를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열을 포함하는 것인, 폴리락트산 단일중합체 제조용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 ldhD 유전자는 Pediococcus 속 균주 유래의 것인, 폴리락트산 단일중합체 제조용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 ldhD 유전자는 서열번호 33의 락테이트 탈수소효소 D를 암호화하는 것인, 폴리락트산 단일중합체 제조용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 ldhD 유전자는 서열번호 34로 표시되는 것인, 폴리락트산 단일중합체 제조용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로피오닐-CoA 전이효소 암호화 유전자는 클로스트리디움 프로피오니쿰(Clostridium propionicum)에서 유래한 것인, 폴리락트산 단일중합체 제조용 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 암호화 유전자는 슈도모나스 속 균주에서 유래한 phaC인, 폴리락트산 단일중합체 제조용 조성물.
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락테이트 탈수소효소 D (Lactate Dehydrogenase D) 유전자(ldhD), 프로피오닐-CoA 전이효소 암호화 유전자, 및 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 암호화 유전자를 포함하는 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하고,
상기 프로피오닐-CoA 전이효소 암호화 유전자는 서열번호 1의 염기서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 1의 염기서열이 번역된 아미노산 서열에서 Val193Ala을 포함하도록 변이된 염기서열을 포함하고,
상기 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 암호화 유전자는 서열번호 4의 아미노산 서열에서 L18H, V24A, K91R, M128V, E130D, N246S, S325T, S477G, Q481K 및 A527S 변이를 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열을 포함하는 것인, 폴리락트산 단일중합체 제조 방법.
제10항에 있어서, 상기 ldhD 유전자는 Pediococcus 속 균주 유래의 것인, 폴리락트산 단일중합체 제조 방법.
제11항에 있어서, 상기 ldhD 유전자는 서열번호 33의 락테이트 탈수소효소 D를 암호화하는 것인, 폴리락트산 단일중합체 제조 방법.
제12항에 있어서, 상기 ldhD 유전자는 서열번호 34로 표시되는 것인, 폴리락트산 단일중합체 제조 방법.