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KR101293886B1 - 폴리락틱산 또는 폴리락틱산 공중합체 생성능을 지닌 재조합 랄스토니아 유트로파 및 이것을 이용하여 폴리락틱산 또는 폴리락틱산 공중합체를 제조하는 방법 - Google Patents

폴리락틱산 또는 폴리락틱산 공중합체 생성능을 지닌 재조합 랄스토니아 유트로파 및 이것을 이용하여 폴리락틱산 또는 폴리락틱산 공중합체를 제조하는 방법 Download PDF

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KR101293886B1
KR101293886B1 KR1020090009256A KR20090009256A KR101293886B1 KR 101293886 B1 KR101293886 B1 KR 101293886B1 KR 1020090009256 A KR1020090009256 A KR 1020090009256A KR 20090009256 A KR20090009256 A KR 20090009256A KR 101293886 B1 KR101293886 B1 KR 101293886B1
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Abstract

본 발명은 폴리락테이트 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체 생성능을 가지는 재조합 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) 및 이것을 이용하여 폴리락테이트 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 제조하는 방법을 제공한다. 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 락틸-CoA를 기질로 사용하는 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate: PHA) 합성효소의 유전자가 도입된 본 발명의 재조합 랄스토니아 유트로파를 배양하면 락테이트 중합체 및 락테이트 공중합체를 효율적으로 제조할 수 있다.
폴리락테이트, 락테이트 공중합체, 락틸-CoA, 재조합 랄스토니아 유트로파

Description

폴리락틱산 또는 폴리락틱산 공중합체 생성능을 지닌 재조합 랄스토니아 유트로파 및 이것을 이용하여 폴리락틱산 또는 폴리락틱산 공중합체를 제조하는 방법{Recombinant Ralstonia eutropha Having an Producing Ability of Polylactate or Its Copolymers and Method for Preparing Polylactate or Its Copolymers Using the Same}
본 발명은 폴리락테이트 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체 생성능을 가지는 재조합 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) 및 이것을 이용하여 폴리락테이트 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
폴리락테이트(PLA)는 락테이트(lactate)로부터 유래된 대표적인 생분해성 고분자로서 범용고분자 혹은 의료용 고분자로서의 응용성이 높은 고분자이다. 현재 PLA는 미생물 발효에 의해 생산된 락테이트를 중합하여 제조되고 있으나, 락테이트의 직접중합에 의해서는 낮은 분자량(1000-5000 달톤)의 PLA만이 생성된다. 100,000 달톤 이상의 PLA를 합성하기 위해서는 락테이트의 직접중합으로 얻어진 낮은 분자량의 PLA로부터 연쇄커플링제(chain coupling agent)를 이용하여 보다 분자량이 큰 PLA로 중합하는 방법이 있으나 유기용제(solvent)나 연쇄커플링제의 첨가로 인해 공정이 복잡해지고, 또한 이들을 제거가 쉽지 않다는 단점이 있다. 현재 상용화되어 있는 고분자량 PLA 생산공정은 락테이트를 락타이드(lactide)로 전환한 다음, 락타이드 링의 개환축합반응을 통해 PLA를 합성하는 방법이 사용되고 있다.
화학합성을 통하여 락테이트를 이용하여 PLA를 합성할 경우 PLA 호모폴리머는 쉽게 수득할 수 있지만 다양한 모노머 조성을 지닌 PLA 공중합체의 합성은 어렵고 상업적으로 효용성이 매우 떨어지는 단점이 있다.
한편, 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoaste, PHA)는 과도한 탄소원이 존재하면서 인, 질소, 마그네슘, 산소 등의 다른 영양분이 부족할 때, 미생물이 에너지나 탄소원 저장물질로 그 내부에 축적하는 폴리에스터(polyester)이다. PHA는 기존의 석유로부터 유래된 합성고분자와 비슷한 물성을 가지면서 완전한 생분해성을 보이기 때문에 기존의 합성 플라스틱을 대체할 물질로 인식되고 있다.
미생물에서 PHA를 생산하기 위해서는 미생물의 대사산물을 PHA 모노머로 전환해 주는 효소와 PHA 모노머를 이용하여 PHA 고분자를 합성하는 PHA 합성효소(synthase)가 필수적이다. 미생물을 이용하여 PLA 및 LA 공중합체를 합성할 때도 같은 시스템이 필요하며 원래의 PHA 합성효소의 기질인 하이드록시아실-CoA(hydroxyacyl-CoA)를 제공할 수 있는 효소 이외에 추가로 락틸-CoA(락틸-CoA)를 제공할 수 있는 효소가 필요하다.
더 나아가 생분해성 고분자의 경제적인 생산을 위해서는 효율적으로 셀 내에 PLA 및 PLA 공중합체를 축적시키는 것이 매우 중요하며, 특히 고농도 배양을 통해 고농도의 PLA 및 PLA 공중합체를 생산하는 것이 중요하다. 따라서 이 조건에 부합하는 효율적인 재조합 미생물을 제조할 수 있는 기술이 필요한 실정이다.
따라서 본 발명은 고농도의 폴리락테이트 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 생산할 수 있는 새로운 재조합 미생물 및 이를 이용한 폴리락테이트 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 고농도의 폴리락테이트 중합체 또는 폴리락테이트 공중합체를 생산할 수 있는 재조합 랄스토니아 유트로파 및 이를 이용한 폴리락테이트 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 락틸-CoA를 제공하기 위한 Clostridium propionicum 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 및 이에 의해 만들어진 락틸-CoA를 기질로 이용하는 슈도모나스 속 6-19(Pseudomonas sp. 6-19)의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소(synthase)의 변이체를 사용하여 성공적으로 폴리락테이트 중합체 및 공중합체를 합성할 수 있었다(대한민국 특허출원 제10-2006-0116234호).
더 나아가 본 발명자들은 생분해성 고분자의 경제적인 생산을 위해서 폴리락테이트 중합체를 효율적으로 생산할 수 있는 재조합 랄스토니아 유트로파를 제작하고자 하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 먼저 PHA 생산능을 유실한 재조합 랄스 토니아 유트로파를 제작하였고, 이 재조합 랄스토니아 유트로파를 Clostridium propionicum 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제와 슈도모나스 속 6-19(Pseudomonas sp. 6-19)의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 발현하는 플라스미드로 형질전환하거나, Clostridium propionicum 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제를 발현하는 유전자와 슈도모나스 속 6-19(Pseudomonas sp. 6-19)의 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소를 발현하는 유전자를 PHA 생산능을 유실한 재조합 랄스토니아 유트로파에 도입함으로써, 형질전환된 재조합 랄스토니아 유트로파를 제조하였으며, 이렇게 제조된 재조합 랄스토니아 유트로파를 이용하여 글루코스로부터 폴리락테이트 중합체 및 폴리락테이트공중합체를 효율적으로 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 폴리락테이트 중합체 또는 폴리락테이트 공중합체를 효율적으로 제조할 수 있는 재조합 랄스토니아 유트로파를 제공하며, 이러한 재조합 랄스토니아 유트로파를 배양하는 것을 특징으로 하는 폴리락테이트 중합체 또는 공중합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 야생형 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)의 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate: PHA) 생합성 유전자 오페론가 제거되고, 외래의 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및 락틸-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자가 도입된 폴리락테이트 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체 생성능을 가지는 재조합 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)를 제공한다.
본 발명에 있어서 상기 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자는 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라제(pct) 유전자일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 pct 유전자는 클로스트리디움 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 pct 유전자일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 pct 유전자는 실질적으로 동등하거나 우수한 락틸-CoA 생성 활성을 갖는 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라제를 코딩하는 그의 변이체를 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 pct 유전자는 이에 제한되는 것은 아니나,
서열번호 1의 핵산 서열(cp-pct);
서열번호 1의 핵산 서열에서 A1200G가 변이된 핵산 서열(cppct512);
서열번호 1의 핵산 서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 핵산 서열(cppct522);
서열번호 1의 핵산 서열에서 A1200G가 변이되고, 서열번호 1의 핵산 서열에 대응하는 아미노산 서열에서 Gly335Asp가 변이된 핵산 서열(cppct531);
서열번호 1의 핵산 서열에서 A1200G가 변이되고, 서열번호 1의 핵산 서열에 대응하는 아미노산 서열에서 Ala243Thr이 변이된 핵산 서열(cppct532);
서열번호 1의 핵산 서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 1의 핵산 서열에 대응하는 아미노산 서열에서 Asp65Gly이 변이된 핵산 서열(cppct533);
서열번호 1의 핵산 서열에서 A1200G가 변이되고, 서열번호 1의 핵산 서열에 대응하는 아미노산 서열에서 Asp257Asn이 변이된 핵산 서열(cppct534);
서열번호 1의 핵산 서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 1의 핵산 서열에 대응하는 아미노산 서열에서 Asp65Asn이 변이된 핵산 서열(cppct535);
서열번호 1의 핵산 서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 1의 핵산 서열에 대응하는 아미노산 서열에서 Thr199Ile이 변이된 핵산 서열(cppct537); 및
서열번호 1의 핵산 서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 1의 핵산 서열에 대응하는 아미노산 서열에서 Val193Ala이 변이된 핵산 서열(cppct540)로 이루어진 군으로부터 선택된 염기 서열을 가지는 것일 수 있다. 상기 pct 유전자 변이체들은 대한민국 특허출원 10-2007-0081855호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 pct 유전자는 서열번호 1의 핵산 서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 1의 핵산 서열에 대응하는 아미노산 서열에서 Val193Ala이 변이된 핵산 서열(cppct540)을 가지는 것일 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 락틸-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소 의 유전자는 슈도모나스 속 6-19(pseudomonas sp. 6-19)의 PHA 합성효소 유전자일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 락틸-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자는 실질적으로 동등하거나 우수한 PHA 합성능을 갖는 PHA 합성효소를 코딩하는 그의 변이체를 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 락틸-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자는 이에 제한되는 것은 아니나,
서열번호 2의 아미노산 서열; 또는
서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 가지는 것일 수 있다.
상기 락틸-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자 변이체들은 대한민국 특허출원 10-2008-0068607호에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 PHA 합성효소의 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477G 및 Q481M이 변이된 아미노산 서열(C1335); 서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(C1310); 및 서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(C1312)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응하는 핵산 서열을 가지는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 재조합 랄스토니아 유트로파는 3HB-CoA 생성 효소를 코딩하는 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 3HB-CoA 생성 효소를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 경우, 배지에 하이드록시알카노에이트를 포함시키지 않더라도 하이드록시알카노에이트의 몰분율이 높은 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체의 제조가 가능하다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 3HB-CoA 생성 효소를 코딩하는 유전자는 케토티올라제 유전자 및 아세토아세틸-CoA 리덕타제 유전자일 수 있다. 상기 케토티올라제 유전자 및 아세토아세틸-CoA 리덕타제 유전자는 이에 제한되는 것은 아니나, 랄스토니아 유트로파에서 유래한 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 재조합 랄스토니아 유트로파는 PhaG 유전자를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 PhaG 유전자는 P. Putida KT2440 유래의 PhaG 유전자일 수 있다. 재조합 랄스토니아 유트로파가 PhaG 유전자를 추가로 포함할 경우 상기 재조합 랄스토니아 유트로파는 MCL의 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체 생성능을 갖게 된다.
상기 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자, 락틸-CoA를 기질로 사용하는 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate: PHA) 합성효소의 유전자, 3HB-CoA 생성 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 PhaG 유전자를 재조합 랄스토니아 유트로파에 도입하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자 및/또는 락틸-CoA를 기질로 사용하는 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate: PHA) 합성효소 의 유전자를 포함하는 벡터를 제작하고, 이러한 재조합 벡터로 야생형의 PHA 합성 오페론이 제거된 랄스토니아 유트로파를 형질전환시키는 방법을 이용할 수 있다.
용어 “벡터(vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 본 발명에서, 상기 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 목적상 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 그러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는 해당 유전자가 선택된 발현숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절 서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여 야만 한다.
상기 “발현조절 서열(expression control sequence)”이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.
본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절 서열의 예로는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fD 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결 (operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 전술한 바와 같이 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명에 적합한 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다.
본 발명은 또한 전술한 재조합 랄스토니아 유트로파를 탄소원 및 락테이트; 또는 탄소원, 락테이트 및 하이드록시알카노에이트를 포함하는 배지에서 배양하고;
상기 재조합 랄스토니아 유트로파로부터 폴리락테이트 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 회수하는 것을 포함하는
폴리락테이트 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체의 제조방법을 제공한다.
예를 들어, 상기 재조합 랄스토니아 유트로파를 글루코스를 포함하는 배지에서 배양하면 재조합 랄스토니아 유트로파로부터 폴리락테이트를 수득할 수 있으며, 상기 재조합 랄스토니아 유트로파를 글루코스 및 하이드록시알카노에이트를 포함하는 배지 중에서 배양하면 재조합 랄스토니아 유트로파로부터 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 수득할 수 있게 된다. 상기 재조합 랄스토니아 유트로파가 3HB-CoA 생성 효소를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 경우, 배지에 하이드록시알카노에이트를 포함시키지 않더라도 하이드록시알카노에이트의 몰분율이 높은 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체의 제조가 가능하며, 상기 재조합 랄 스토니아 유트로파가 PhaG 유전자를 추가로 포함하는 경우에는 MCL의 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 생성하는 것이 가능하다.
이에 제한되는 것은 아니나, 상기 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체는 예를 들어, 폴리(3HA-co-LA), 폴리(3HB-co-LA), 폴리(3HP-co-LA), 폴리(3HB-co-4HB-co-LA), 폴리(3HP-co-4HB-co-LA), 폴리(3HB-co-3HV-co-LA), 폴리(4HB-co-LA-co-3HP), 폴리(MCL 3-HA-co-LA) 등을 포함한다.
보다 구체적으로, 배지에 포함시키는 하이드록시알카노에이트의 종류에 따라 수득되는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체의 종류는 달라질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체 중의 하이드록시알카노에이트는 3-하이드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate), 3-하이드록시발레르산(3-hydroxyvalerate), 4-하이드록시부티레이트(4-hydroxybutyrate), 탄소수가 6∼14개인 중간사슬 길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산((D)-3-hydroxycarboxylic acid), 2-하이드록시프로피온산(2-hydroxypropionic acid), 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid), 3-하이드록시헥산산(3-hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시헵탄산(3-hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(3-hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(3-hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시데칸산(3-hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시운데칸산(3-hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시도데칸산(3-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(3-hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(3-hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시발레르산(4-hydroxyvaleric acid), 4-하 이드록시헥산산(4-hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(4-hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(4-hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(4-hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(5-hydroxyvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(5-hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸산(6-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시-4-펜텐산(3-hydroxy-pentenoic acid), 3-하이드록시-4-trans-헥센산(3-hydroxy-4-trans-hexenoic acid), 3-하이드록시-4-cis-헥센산(3-hydroxy-4-cis-hexenoic acid), 3-하이드록시-5-헥센산(3-hydroxy-5-hexenoic acid), 3-하이드록시-6-trans-옥텐산(3-hydroxy-6-trans-octenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-옥텐산(3-hydroxy-6-cis-octenoic acid), 3-하이드록시-7-옥텐산(3-hydroxy-7-octenoic acid), 3-하이드록시-8-노넨산(3-hydroxy-8-nonenoic acid), 3-하이드록시-9-데센산(3-hydroxy-9-decenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-도데센산(3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-도데센산(3-hydroxy-6-cis dodecenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-7-cis-테트라데센산(3-hydroxy-7-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-5,8-cis-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5,8-cis-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4-메틸발레르산(3-hydroxy-4-methylvaleric acid), 3-하이드록시-4-메틸헥산산(3-hydroxy-4-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸헥산산(3-hydroxy-5-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸헵탄산(3-hydroxy-6-methylheptanoic acid), 3-하이드록시-4-메틸옥탄산(3-hydroxy-4-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸옥탄산(3-hydroxy-5- methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸옥탄산(3-hydroxy-6-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(3-hydroxy-7-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸노난산(3-hydroxy-6-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸노난산(3-hydroxy-7-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-8-메틸노난산(3-hydroxy-8-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸데칸산(3-hydroxy-7-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-9-메틸데칸산(3-hydroxy-9-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸-6-옥텐산(3-hydroxy-7-methyl-6-octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산-메틸에스테르(3-hydroxysuccinic acid-methyl ester), 3-하이드록시아디핀산-메틸에스테르(3-hydroxyadipinic acid-methyl ester), 3-하이드록시스베린산-메틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-methyl ester), 3-하이드록시아젤라인산-메틸에스테르(3-hydroxyazelaic acid-methyl ester), 3-하이드록시세바신산-메틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-methyl ester), 3-하이드록시스베린산-에틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-ethyl ester), 3-하이드록시세바신산-에틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-ethyl ester), 3-하이드록시피메린산-프로필에스테르(3-hydroxypimelic acid-propyl ester), 3-하이드록시세바신산-벤질에스테르(3-hydroxysebacic acid-benzil ester), 3-하이드록시-8-아세톡시옥탄산(3-hydroxy-8-acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시-9-아세톡시노난산(3-hydroxy-9-acetoxynonanoic acid), 페녹시-3-하이드록시부티레이트(phenoxy-3-hydroxybutyric acid), 페녹시-3-하이드록시발레르산(phenoxy-3-hydroxyvaleric acid), 페녹시-3-하이드록시헵탄산(phenoxy-3-hydroxyheptanoic acid), 페녹시-3-하이드록시옥탄 산(phenoxy-3-hydroxyoctanoic acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시부티레이트(para-cyanophenoxy-3-hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시발레르산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시헥산산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹시-3-하이드록시헥산산(para-nitrophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시-5-페닐발레르산(3-hydroxy-5-phenylvaleric acid), 3-하이드록시-5-시클로헥실부티레이트(3-hydroxy-5-cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(3, 12-dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시-5-cis-테트라데센산(3,8-dihydroxy-5-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4,5-에폭시데칸산(3-hydroxy-4,5-epoxydecanoic acid), 3-하이드록시-6,7-에폭시도데칸산(3-hydroxy-6,7-epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시-8,9-에폭시-5,6-cis-테트라데칸산(3-hydroxy-8,9-epoxy-5,6-cis-tetradecanoic acid), 7-시아노-3-하이드록시헵탄산(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid), 9-시아노-3-하이드록시노난산(9-cyano-3-hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시-7-플루오로헵탄산(3-hydroxy-7-fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시-9-플루오로노난산(3-hydroxy-9-fluorononanoic acid), 3-하이드록시-6-클로로헥산산(3-hydroxy-6-chlorohexanoic acid), 3-하이드록시-8-클로로옥탄산(3-hydroxy-8-chlorooctanoic acid), 3-하이드록시-6-브로모헥산산(3-hydroxy-6-bromohexanoic acid), 3-하이드록시-8-브로모옥탄산(3-hydroxy-8-bromooctanoic acid), 3-하이드록시-11-브로모운데칸산(3-hydroxy-11-bromoundecanoic acid), 3-하이드록시-2-부텐산(3-hydroxy-2-butenoic acid), 6-하이드록시-3-도데센산(6-hydroxy-3-dodecenoic acid), 3-하이드록시-2-메틸부티레이트(3-hydroxy-2-methylbutyric acid), 3-하이드록시-2-메틸발레르산(3-hydroxy-2-methylvaleric acid), 및 3-하이드록시-2,6-디메틸-5-헵텐산(3-hydroxy-2,6-heptenoic acid)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[실시예]
<실시예 1> PHA 생성능이 유실된 랄스토니아 유트로파의 제작
R. eutropha에서 폴리(3-hydroxybutyrate)[P(3HB)] 합성에 관여하는 PHA 생합성 유전자 오페론을 없애기 위하여 재조합 벡터를 다음과 같이 제작하였다.
pSYL105 벡터(Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347)에서 Ralstonia eutropha H16 유래의 PHB 생산 오페론이 함유된 DNA 절편을 BamHI/EcoRI으로 절단하여, pBluescript II (Stratagene)의 BamHI/EcoRI 인식부위에 삽입함으로써 pReCAB 재조합 벡터를 제조하였다.
pReCAB 벡터는 PHA 합성효소 (phaCRE)와 단량체 공급효소 (phaARE & phaBRE)가 PHB 오페론 프로모터에 의해 항시적으로 발현되며, 대장균에서도 잘 작동된다고 알려져 있다(Lee et al., Biotech. Bioeng., 1994, 44:1337-1347). pReCAB를 BstBI/NdeI 으로 절단하여 R.eutropha H16 PHA 합성효소 (phaCRE)와 b-ketothiolase (phaARE)와 acetoacetyl-CoA reductase (phaBRE)를 코딩하는 유전자를 제거한 다음, PCR을 통해 플라스미드 pEGFP (BD Biosciences Clontech)으로부터 증폭한 GFP 유전자를 삽입하였다 (p△CAB-GFP).
EGFP_F_BstBI aaaaattcgaaac aggaaacagaat atggtgagcaag (서열번호 3)
EGFP_R_NdeI ggaattcCATATGttacttgtacagctcgtcca (서열번호 4)
p△CAB-GFP 를 BamHI/XhoI으로 절단하여 GFP 유전자 시퀀스의 5’방향으로는 R. eutropha PHA 생합성 프로모터가, 3’방향으로는 transcription terminator 유전자가 붙어있는 유전자 조각을 수득하였으며 그 유전자 조각을 BamHI/SalI으로 자른 pK18mobSacB 벡터(Schafer et al. Gene (1994) 145: 69-73)에 삽입하여 pK18-△CAB-GFP 벡터를 제작하였다. pK18mobSacB벡터는 sacB 유전자를 발현할 수 있어 수크로스를 이용한 크로모좀에 외래 유전자를 삽입하여 재조합 미생물을 제작하는데 유용하게 쓰인다.
pK18-△CAB-GFP 벡터를 대장균 S17-1에 형질전환 후 S17-1(pK18-△CAB-GFP)를, 25mg/l 카나마이신이 포함된 LB 배지에서 37℃, 24시간 액체 배양하였다. R. eutropha NCIMB11599도 LB 배지에서 30℃, 24시간 액체 배양 후, 이 두 배양액을 S17-1(pK18-△CAB-GFP) 과 R. eutropha NCIMB11599의 부피비가 3 : 1이 되게 혼합하여 LB 고체배지에 100ul씩 적가하였다. 이를 18시간 30℃ 정체 배양기에서 배양하였다. 이 과정에서 교배가 일어나, S17-1의 pK18-△CAB-GFP 벡터가 Ralstonia eutropha 에 옮겨져, 도 2에서 나타낸것처럼 Ralstonia의 크로모좀 DNA에 homology 위치에서 1차 크로스오버가 일어난다. pK18-△CAB-GFP은 R. eutropha에서 복제가 불가능하기 때문에 유전자의 1차 크로스오버를 통해 pK18-△CAB-GFP는 R. eutropha의 크로모좀으로 삽입이 되며, 삽입이 정상적으로 일어날 때 R. eutropha는 카나마이신 500 mg/L가 포함된 플레이트에서 저항성을 나타내게 된다.
1차 크로스오버를 통해 pK18-△CAB-GFP가 R. eutropha의 크로모좀으로 삽입된 콜로니는 LB 플레이트에서 교배한 세포를 LB 액체배지에 현탁해 카나마이신 500 mg/L과 클로람페니콜 35mg/l 이 포함된 플레이트에 도말하여 선별하였다. 2차 크로스오버를 위해 1차 크로스오버가 일어난 재조합 R. eutropha를 LB 액체 배지에서 30℃, 24시간 배양후 100ul를 수크로스 70 g/L가 함유된 LB 플레이트에 도말하였다. sacB 유전자에 의해 2차 크로스오버가 일어난 R. eutropha를 PCR를 통해 재조합 R. eutropha로서 선택하였다(도 2). 정상적으로 2차 크로스오버가 일어날 경우 재조합 R. eutropha는 PHA biosynthesis 오페론 (phaCAB)를 유실하게 되며 대신 GFP 유전자가 크로모좀에 남아있게 된다. 콜로니 PCR을 통해 GFP가 정상적으로 크로모좀에 삽입된 재조합 R. eutropha를 찾아내었고 R. eutropha GFP라 이름지었다.
<실시예 2> Pseudomonas sp. 6-19 (KCTC 11027BP) 유래 PHA synthase와 Clostridium propionicum 유래의 propionyl-CoA transferase(CPPCT) 가 삽입된 재조합 R. eutropha 의 제작
실시예 1에서 제작한 pK18-△CAB-GFP벡터를 BamHI/NdeI으로 절단하여 GFP를 제거한 후 pPs619C1335CPPCT540 벡터를 BamHI/NdeI으로 절단하여 수득한 유전자조각을 삽입함으로써 pK18-△CAB-335540 벡터를 제작하였다. 이 벡터를 이용하여 phaCAB가 제거되고 크로모좀에 Pseudomonas sp. 6-19 (KCTC 11027BP) 유래 phaC1Ps6-19335와 Clostridium propionicum 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라제(CPPCT540)이 삽입된 재조합 R. eutropha 335540을 제작하였다(표 1). 제작 방법은 대장균 S17-1을 이용하여 실시예 1에서와 같은 방법으로 수행하였다(도 2).
[표 1]
재조합 랄스토니아 유트로파 사용된 재조합 플라스미드
R. eutropha NCIMB11599
R. eutropha GFP pK18-△CAB-GFP
R. eutropha 335540 pK18-△CAB-335540
R. eutropha 335ReAB pK18-△CAB-335ReAB
R. eutropha 310540ReAB pK18-△CAB-310540ReAB
R. eutropha 312540ReAB pK18-△CAB-312540ReAB
<실시예 3> Pseudomonas sp. 6-19 (KCTC 11027BP) 유래 PHA synthase와 Ralstonia eutropha H16 유래의 ketothiolase (phaA RE )및 acetoacetyl-CoA reductase(phaB RE )가 삽입된 재조합 R. eutropha의 제작
실시예 1에서 제작한 pK18-△CAB-GFP벡터를 BamHI/NdeI으로 절단하여 GFP 를 제거한 후 pPs619C1335ReAB 벡터를 BamHI/NdeI으로 절단하여 수득한 유전자조각을 삽입함으로써 pK18-△CAB-335ReAB 벡터를 제작하였다. 이 벡터를 이용하여 phaCAB가 제거되고 크로모좀에 Pseudomonas sp. 6-19 (KCTC 11027BP) 유래 phaC1Ps6-19335와 Ralstonia eutropha H16 유래의 PHB 단량체 공급효소인 (phaARE & phaBRE)가 삽입된 재조합 R. eutropha 335ReAB을 제작하였다(표 1). 제작 방법은 대장균 S17-1을 이용하여 실시예 1에서와 같은 방법으로 수행하였다(도 2).
<실시예 4> Pseudomonas sp. 6-19 (KCTC 11027BP) 유래 PHA synthase, Clostridium propionicum 유래 propionyl-CoA transferase(CPPCT)와 Ralstonia eutropha H16 유래의 ketothiolase (phaA RE )및 acetoacetyl-CoA reductase(phaB RE )가 삽입된 재조합 R. eutropha의 제작
실시예 1에서 제작한 pK18-△CAB-GFP벡터를 BamHI/NdeI으로 절단하여 GFP를 제거한 후 pPs619C1310CPPCT540ReAB와 pPs619C1312CPPCT540ReAB 벡터를 BamHI/NdeI으로 절단하여 수득한 유전자조각을 삽입함으로써 pK18-△CAB-310540ReAB와 pK18-△CAB-312540ReAB 벡터를 제작하였다. 이 벡터를 이용하여 phaCAB가 제거되고 크로모좀에 Pseudomonas sp. 6-19 (KCTC 11027BP) 유래 phaC1Ps6-19310 또는 phaC1Ps6-19312, Clostridium propionicum 유래의 propionyl-CoA transferase(CPPCT540)와 Ralstonia eutropha H16 유래의 PHB 단량체 공급효소인 (phaARE & phaBRE)가 삽입된 재조합 R. eutropha 310540ReAB와 R. eutropha 312540ReAB을 제작하였다(표 1). 제작 방법은 대장균 S17-1을 이용하여 실시예 1에서와 같은 방법으로 수행하였다(도 2).
<실시예 5> 재조합 R. eutropha 의 배양을 통한 P(3HB-co-LA) 공중합체의 생합성
표 1 에 도시된 재조합 R. eutropha를 포도당을 기본 기질로 하는 34 ?g/mL의 클로람페니콜을 함유한 최소배지에서 배양하여 P(3HB-co-LA) 공중합체를 생합성 하였다. 최소배지의 성분은 다음과 같다 (/L). KH2PO4, 2.65 g; Na2HPO4, 3.8 g; NH4Cl, 0.72 g; MgSO47H2O, 0.4 g; Tracer, 1 mL. 또한, tracer의 성분은 다음과 같다 (/L). FeSO4·7H2O, 10 g; ZnSO4·7H2O, 2.25 g; CuSO4·5H2O, 1 g; MnSO4·5H2O, 0.5 g; CaCl2·2H2O, 2 g; Na2B4O7·7H2O, 0.23 g; (NH4)6Mo7O24, 0.1 g; 35 % HCl, 10 mL. 본 배양 전, 종균 배양은 항생제를 포함하는 LB 배지에서 30시간 동안 이루어졌다. 종균 배양액을 기질과 항생제가 함유된 최소배지에 1%가 되게 접종하여 주어 본 배양을 4일간 수행하였다. 모든 배양은 30 ℃, 200 rpm의 속도로 이루어졌다. 배양 후 원심분리를 통하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 80 ℃의 건조기에서 48시간 건조 후, 가스크로마토그래피 분석을 수행하여 균체 내 축적된 P(3HB-co-LA) 공중합체 함량을 측정하였고, 그 결과를 표 2에 도시하였다. 분석에 사용된 표준물질은 P(3HB-co-12 mol% 3HV) 공중합체 및 PLA 고분자 이었다.
[표 2] 재조합 R. eutropha의 배양을 통한 P(3HB-co-LA) 공중합체의 생합성
재조합 R. eutropha 기질 P(3HB-co-LA) (wt%) LA mol%
R. eutropha 335540 2% 포도당 24.33 0.00
2% 포도당, 3HB* 47.73 0.00
2% 포도당, NaL+ 7.72 31.71
2% 포도당, 3HB, NaL+ 25.20 16.18
R. eutropha 310540ReAB 2% 포도당 46.33 0.05
1.5% 포도당, NaL++ 24.06 8.64
R. eutropha 312540ReAB 2% 포도당 46.50 0.06
1.5% 포도당, NaL++ 12.87 7.18
NaL+++ 17.97 7.48
*3HB: 3-hydroxybutyrate, 2 g/L
+NaL: Sodium lactate (pH 7), 4 g/L
++NaL: Sodium lactate (pH 7), 6 g/L
+++NaL: Sodium lactate (pH 7), 24 g/L
<실시예 6> 재조합 R. eutropha 의 배양을 통한 P(3HB-co-LA-co-mcl3HA) 공중합체의 생합성
R. eutropha GFP를 Pseudomonas sp. 6-19 (KCTC 11027BP) 유래 PHA synthase, Clostridium propionicum 유래 propionyl-CoA transferase(CPPCT), P. putida KT2440 유래 PhaG를 발현하는 벡터로 형질전환한 후 실시예 5와 같이 배양 하였다. 탄소원으로는 2%포도당을 사용하였다. 균체 내 축적된 공중합체 함량을 결과를 표 3에 도시하였다.
벡터제작과정은 다음과 같다.
먼저 pPs619C1300CPPCT532 혹은 pPs619C1334CPPCT532 벡터에 P. putida KT2440으로부터 PCR로 증폭한 phaG 유전자를 NdeI site에 삽입하였다 (pPs619C1300CPPCT532PhaG 또는 pPs619C1334CPPCT532PhaG). 다음에 pPs619C1300CPPCT532PhaG 또는 pPs619C1334CPPCT532PhaG를 BamHI/XhoI으로 자른 후 유전자조각을 pBBR1MCS2 벡터에 같은 site에 삽입함으로써 R. eutropha 에서 복제가능한 재조합 플라스미드를 제작하였다 (pMCS2Ps619C1300CPPCT532PhaG 또는 pMCS2Ps619C1334CPPCT532PhaG). 위의 벡터를 이용하여 재조합 R. eutropha를 제작하였다.
KTPhaG500f-NdeI ggaattc catatg ggggttggcgccggg ggag (서열번호 5)
KTPhaGb-2100-NdeI 5- ggaattc catatg gga tcg gtg ggt aat tgg cc (서열번호 6)
[표 3] 재조합 R. eutropha의 배양을 통한 P(LA-co-3HB-co-mcl3HA) 공중합체의 생합성
Enzymes in Plasmid PHA
content
(wt %)		 PHA composition (mol %)
LA
(C3)		 3HB
(C4)		 3HHx
(C6)		 3HO
(C8)		 3HD
(C10)		 3HDD
(C12)		 3H5DD
(C12')
PhaC1-300Ps6-19
Pct532
PhaG		 20.9 2.0 94.1 0.5 0.8 0.9 1.5 0.3
PhaC1-334Ps6-19
Pct532
PhaG		 19.7 2.7 91.7 0.5 1.2 1.3 2.3 0.3
도 1은 본 발명의 슈도모나스 속 6-19 유래 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 변이체 유전자와 클로스트리디움 프로피오니쿰 유래의 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라아제 변이체 유전자 및 랄스토니아 유트로파 유래 phaAB 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제작하는 과정을 도식화한 것이다.
도 2는 재조합 랄스토니아 유트로파 제작을 위해 대장균 S17-1과 랄스토니아 유트로파의 교배 및 랄스토니아 유트로파 크로모좀 내 타겟 유전자의 삽입 과정을 도식화한 것이다.
<110> LG CHEM, LTD. <120> Recombinant Ralstonia eutropha Having an Producing Ability of Polylactate or Its Copolymers and Method for Preparing Polylactate or Its Copolymers Using the Same <130> P08445 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1572 <212> DNA <213> Clostridium propionicum <220> <221> gene <222> (1)..(1572) <223> Propionyl-CoA transferase of Clostridium propionicum <400> 1 atgagaaagg ttcccattat taccgcagat gaggctgcaa agcttattaa agacggtgat 60 acagttacaa caagtggttt cgttggaaat gcaatccctg aggctcttga tagagctgta 120 gaaaaaagat tcttagaaac aggcgaaccc aaaaacatta cctatgttta ttgtggttct 180 caaggtaaca gagacggaag aggtgctgag cactttgctc atgaaggcct tttaaaacgt 240 tacatcgctg gtcactgggc tacagttcct gctttgggta aaatggctat ggaaaataaa 300 atggaagcat ataatgtatc tcagggtgca ttgtgtcatt tgttccgtga tatagcttct 360 cataagccag gcgtatttac aaaggtaggt atcggtactt tcattgaccc cagaaatggc 420 ggcggtaaag taaatgatat taccaaagaa gatattgttg aattggtaga gattaagggt 480 caggaatatt tattctaccc tgcttttcct attcatgtag ctcttattcg tggtacttac 540 gctgatgaaa gcggaaatat cacatttgag aaagaagttg ctcctctgga aggaacttca 600 gtatgccagg ctgttaaaaa cagtggcggt atcgttgtag ttcaggttga aagagtagta 660 aaagctggta ctcttgaccc tcgtcatgta aaagttccag gaatttatgt tgactatgtt 720 gttgttgctg acccagaaga tcatcagcaa tctttagatt gtgaatatga tcctgcatta 780 tcaggcgagc atagaagacc tgaagttgtt ggagaaccac ttcctttgag tgcaaagaaa 840 gttattggtc gtcgtggtgc cattgaatta gaaaaagatg ttgctgtaaa tttaggtgtt 900 ggtgcgcctg aatatgtagc aagtgttgct gatgaagaag gtatcgttga ttttatgact 960 ttaactgctg aaagtggtgc tattggtggt gttcctgctg gtggcgttcg ctttggtgct 1020 tcttataatg cggatgcatt gatcgatcaa ggttatcaat tcgattacta tgatggcggc 1080 ggcttagacc tttgctattt aggcttagct gaatgcgatg aaaaaggcaa tatcaacgtt 1140 tcaagatttg gccctcgtat cgctggttgt ggtggtttca tcaacattac acagaataca 1200 cctaaggtat tcttctgtgg tactttcaca gcaggtggct taaaggttaa aattgaagat 1260 ggcaaggtta ttattgttca agaaggcaag cagaaaaaat tcttgaaagc tgttgagcag 1320 attacattca atggtgacgt tgcacttgct aataagcaac aagtaactta tattacagaa 1380 agatgcgtat tccttttgaa ggaagatggt ttgcacttat ctgaaattgc acctggtatt 1440 gatttgcaga cacagattct tgacgttatg gattttgcac ctattattga cagagatgca 1500 aacggccaaa tcaaattgat ggacgctgct ttgtttgcag aaggcttaat gggtctgaag 1560 gaaatgaagt cc 1572 <210> 2 <211> 559 <212> PRT <213> Pseudomonas sp. 6-19 (KCTC 11027BP) <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(559) <223> PHA synthase of Pseudomonas sp. 6-19 (KCTC 11027BP) <400> 2 Met Ser Asn Lys Ser Asn Asp Glu Leu Lys Tyr Gln Ala Ser Glu Asn 1 5 10 15 Thr Leu Gly Leu Asn Pro Val Val Gly Leu Arg Gly Lys Asp Leu Leu 20 25 30 Ala Ser Ala Arg Met Val Leu Arg Gln Ala Ile Lys Gln Pro Val His 35 40 45 Ser Val Lys His Val Ala His Phe Gly Leu Glu Leu Lys Asn Val Leu 50 55 60 Leu Gly Lys Ser Gly Leu Gln Pro Thr Ser Asp Asp Arg Arg Phe Ala 65 70 75 80 Asp Pro Ala Trp Ser Gln Asn Pro Leu Tyr Lys Arg Tyr Leu Gln Thr 85 90 95 Tyr Leu Ala Trp Arg Lys Glu Leu His Asp Trp Ile Asp Glu Ser Asn 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Asp Val Ala Arg Gly His Phe Val Ile Asn Leu Met 115 120 125 Thr Glu Ala Met Ala Pro Thr Asn Thr Ala Ala Asn Pro Ala Ala Val 130 135 140 Lys Arg Phe Phe Glu Thr Gly Gly Lys Ser Leu Leu Asp Gly Leu Ser 145 150 155 160 His Leu Ala Lys Asp Leu Val His Asn Gly Gly Met Pro Ser Gln Val 165 170 175 Asn Met Gly Ala Phe Glu Val Gly Lys Ser Leu Gly Val Thr Glu Gly 180 185 190 Ala Val Val Phe Arg Asn Asp Val Leu Glu Leu Ile Gln Tyr Lys Pro 195 200 205 Thr Thr Glu Gln Val Tyr Glu Arg Pro Leu Leu Val Val Pro Pro Gln 210 215 220 Ile Asn Lys Phe Tyr Val Phe Asp Leu Ser Pro Asp Lys Ser Leu Ala 225 230 235 240 Arg Phe Cys Leu Arg Asn Asn Val Gln Thr Phe Ile Val Ser Trp Arg 245 250 255 Asn Pro Thr Lys Glu Gln Arg Glu Trp Gly Leu Ser Thr Tyr Ile Glu 260 265 270 Ala Leu Lys Glu Ala Val Asp Val Val Thr Ala Ile Thr Gly Ser Lys 275 280 285 Asp Val Asn Met Leu Gly Ala Cys Ser Gly Gly Ile Thr Cys Thr Ala 290 295 300 Leu Leu Gly His Tyr Ala Ala Ile Gly Glu Asn Lys Val Asn Ala Leu 305 310 315 320 Thr Leu Leu Val Ser Val Leu Asp Thr Thr Leu Asp Ser Asp Val Ala 325 330 335 Leu Phe Val Asn Glu Gln Thr Leu Glu Ala Ala Lys Arg His Ser Tyr 340 345 350 Gln Ala Gly Val Leu Glu Gly Arg Asp Met Ala Lys Val Phe Ala Trp 355 360 365 Met Arg Pro Asn Asp Leu Ile Trp Asn Tyr Trp Val Asn Asn Tyr Leu 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Pro Pro Val Phe Asp Ile Leu Phe Trp Asn Asn Asp 385 390 395 400 Thr Thr Arg Leu Pro Ala Ala Phe His Gly Asp Leu Ile Glu Leu Phe 405 410 415 Lys Asn Asn Pro Leu Ile Arg Pro Asn Ala Leu Glu Val Cys Gly Thr 420 425 430 Pro Ile Asp Leu Lys Gln Val Thr Ala Asp Ile Phe Ser Leu Ala Gly 435 440 445 Thr Asn Asp His Ile Thr Pro Trp Lys Ser Cys Tyr Lys Ser Ala Gln 450 455 460 Leu Phe Gly Gly Asn Val Glu Phe Val Leu Ser Ser Ser Gly His Ile 465 470 475 480 Gln Ser Ile Leu Asn Pro Pro Gly Asn Pro Lys Ser Arg Tyr Met Thr 485 490 495 Ser Thr Glu Val Ala Glu Asn Ala Asp Glu Trp Gln Ala Asn Ala Thr 500 505 510 Lys His Thr Asp Ser Trp Trp Leu His Trp Gln Ala Trp Gln Ala Gln 515 520 525 Arg Ser Gly Glu Leu Lys Lys Ser Pro Thr Lys Leu Gly Ser Lys Ala 530 535 540 Tyr Pro Ala Gly Glu Ala Ala Pro Gly Thr Tyr Val His Glu Arg 545 550 555 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP_F_BstBI <400> 3 aaaaattcga aacaggaaac agaatatggt gagcaag 37 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP_R_NdeI <400> 4 ggaattccat atgttacttg tacagctcgt cca 33 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KTPhaG500f-NdeI <400> 5 ggaattccat atgggggttg gcgccggggg ag 32 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KTPhaGb-2100-NdeI 5 <400> 6 ggaattccat atgggatcgg tgggtaattg gcc 33

Claims (16)

  1. 야생형 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha)의 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate: PHA) 생합성 유전자 오페론이 제거되고, 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자, 락틸-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자 및 3HB-CoA 생성 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 폴리락테이트 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체 생성능을 가지는 재조합 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 락테이트를 락틸-CoA로 전환하는 효소의 유전자는 프로피오닐-CoA 트랜스퍼라제(pct) 유전자인 재조합 랄스토니아 유트로파.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 pct 유전자는 클로스트리디움 프로피오니쿰(Clostridium propionicum) 유래의 pct 유전자인 재조합 랄스토니아 유트로파.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 pct 유전자는
    서열번호 1의 핵산 서열(cp-pct);
    서열번호 1의 핵산 서열에서 A1200G가 변이된 핵산 서열(cppct512);
    서열번호 1의 핵산 서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이된 핵산 서열(cppct522);
    서열번호 1의 핵산 서열에서 A1200G가 변이되고, 서열번호 1의 핵산 서열에 대응하는 아미노산 서열에서 Gly335Asp가 변이된 핵산 서열(cppct531);
    서열번호 1의 핵산 서열에서 A1200G가 변이되고, 서열번호 1의 핵산 서열에 대응하는 아미노산 서열에서 Ala243Thr이 변이된 핵산 서열(cppct532);
    서열번호 1의 핵산 서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 1의 핵산 서열에 대응하는 아미노산 서열에서 Asp65Gly이 변이된 핵산 서열(cppct533);
    서열번호 1의 핵산 서열에서 A1200G가 변이되고, 서열번호 1의 핵산 서열에 대응하는 아미노산 서열에서 Asp257Asn이 변이된 핵산 서열(cppct534);
    서열번호 1의 핵산 서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 1의 핵산 서열에 대응하는 아미노산 서열에서 Asp65Asn이 변이된 핵산 서열(cppct535);
    서열번호 1의 핵산 서열에서 T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 1의 핵산 서열에 대응하는 아미노산 서열에서 Thr199Ile이 변이된 핵산 서열(cppct537);및
    서열번호 1의 핵산 서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 1의 핵산 서열에 대응하는 아미노산 서열에서 Val193Ala이 변이된 핵산 서열(cppct540)로
    이루어진 군으로부터 선택된 것인 재조합 랄스토니아 유트로파.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 pct 유전자는 서열번호 1의 핵산 서열에서 T78C, T669C, A1125G 및 T1158C가 변이되고, 서열번호 1의 핵산 서열에 대응하는 아미노산 서열에서 Val193Ala이 변이된 핵산 서열(cppct540)을 가지는 것인 재조합 랄스토니아 유트로파.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 락틸-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자는 슈도모나스 속 6-19(pseudomonas sp. 6-19)의 PHA 합성효소 유전자인 재조합 랄스토니아 유트로파.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 락틸-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자는
    서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477R, S477H, S477F, S477Y, S477G, Q481M, Q481K 및 Q481R로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변이를 포함하는 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열을 가지는 것인 재조합 랄스토니아 유트로파.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 락틸-CoA를 기질로 사용하는 PHA 합성효소의 유전자는 서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S325T, L412M, S477G 및 Q481M이 변이된 아미노산 서열(C1335);
    서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481K가 변이된 아미노산 서열(C1310); 및
    서열번호 2의 아미노산 서열에서 E130D, S477F 및 Q481R이 변이된 아미노산 서열(C1312)로
    이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열에 대응하는 핵산 서열을 가지는 것인 재조합 랄스토니아 유트로파.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서,
    상기 3HB-CoA 생성 효소를 코딩하는 유전자는 케토티올라제 유전자 및 아세토아세틸-CoA 리덕타제 유전자인 재조합 랄스토니아 유트로파.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 케토티올라제 유전자 및 아세토아세틸-CoA 리덕타제 유전자는 랄스토니아 유트로파에서 유래한 것인 재조합 랄스토니아 유트로파.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 랄스토니아 유트로파가 MCL(medium chain length)의 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체 생성능을 가지는 것인 재조합 랄스토니아 유트로파.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 재조합 랄스토니아 유트로파가 PhaG 유전자를 추가로 포함하는 것인 재조합 랄스토니아 유트로파.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 PhaG 유전자는 P. Putida KT2440 유래의 PhaG 유전자인 재조합 랄스토니아 유트로파.
  15. 제1항 내지 제8항 및 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항의 재조합 랄스토니아 유트로파를 탄소원 및 락테이트; 또는 탄소원, 락테이트 및 하이드록시알카노에이트를 포함하는 배지에서 배양하고;
    상기 재조합 랄스토니아 유트로파로부터 폴리락테이트 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체를 회수하는 것을 포함하는
    폴리락테이트 또는 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체의 제조방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 하이드록시알카노에이트-락테이트 공중합체 중의 하이드록시알카노에이트는 3-하이드록시부티레이트(3-hydroxybutyrate), 3-하이드록시발레르산(3-hydroxyvalerate), 4-하이드록시부티레이트(4-hydroxybutyrate), 탄소수가 6∼14개인 중간사슬 길이의 (D)-3-하이드록시카르복실산((D)-3-hydroxycarboxylic acid), 2-하이드록시프로피온산(2-hydroxypropionic acid), 3-하이드록시프로피온산(3-hydroxypropionic acid), 3-하이드록시헥산산(3-hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시헵탄산(3-hydroxyheptanoic acid), 3-하이드록시옥탄산(3-hydroxyoctanoic acid), 3-하이드록시노난산(3-hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시데칸산(3-hydroxydecanoic acid), 3-하이드록시운데칸산(3-hydroxyundecanoic acid), 3-하이드록시도데칸산(3-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시테트라데칸산(3-hydroxytetradecanoic acid), 3-하이드록시헥사데칸산(3-hydroxyhexadecanoic acid), 4-하이드록시발레르산(4-hydroxyvaleric acid), 4-하이드록시헥산산(4-hydroxyhexanoic acid), 4-하이드록시헵탄산(4-hydroxyheptanoic acid), 4-하이드록시옥탄산(4-hydroxyoctanoic acid), 4-하이드록시데칸산(4-hydroxydecanoic acid), 5-하이드록시발레르산(5-hydroxyvaleric acid), 5-하이드록시헥산산(5-hydroxyhexanoic acid), 6-하이드록시도데칸산(6-hydroxydodecanoic acid), 3-하이드록시-4-펜텐산(3-hydroxy-pentenoic acid), 3-하이드록시-4-trans-헥센산(3- hydroxy-4-trans-hexenoic acid), 3-하이드록시-4-cis-헥센산(3-hydroxy-4-cis-hexenoic acid), 3-하이드록시-5-헥센산(3-hydroxy-5-hexenoic acid), 3-하이드록시-6-trans-옥텐산(3-hydroxy-6-trans-octenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-옥텐산(3-hydroxy-6-cis-octenoic acid), 3-하이드록시-7-옥텐산(3-hydroxy-7-octenoic acid), 3-하이드록시-8-노넨산(3-hydroxy-8-nonenoic acid), 3-하이드록시-9-데센산(3-hydroxy-9-decenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-도데센산(3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid), 3-하이드록시-6-cis-도데센산(3-hydroxy-6-cis dodecenoic acid), 3-하이드록시-5-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-7-cis-테트라데센산(3-hydroxy-7-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-5,8-cis-cis-테트라데센산(3-hydroxy-5,8-cis-cis tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4-메틸발레르산(3-hydroxy-4-methylvaleric acid), 3-하이드록시-4-메틸헥산산(3-hydroxy-4-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸헥산산(3-hydroxy-5-methylhexanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸헵탄산(3-hydroxy-6-methylheptanoic acid), 3-하이드록시-4-메틸옥탄산(3-hydroxy-4-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-5-메틸옥탄산(3-hydroxy-5-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸옥탄산(3-hydroxy-6-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸옥탄산(3-hydroxy-7-methyloctanoic acid), 3-하이드록시-6-메틸노난산(3-hydroxy-6-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸노난산(3-hydroxy-7-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-8-메틸노난산(3-hydroxy-8-methylnonanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸데칸산(3-hydroxy-7-methyldecanoic acid), 3-하이드록시-9-메틸데칸산(3-hydroxy-9- methyldecanoic acid), 3-하이드록시-7-메틸-6-옥텐산(3-hydroxy-7-methyl-6-octenoic acid), 말산(malic acid), 3-하이드록시숙신산-메틸에스테르(3-hydroxysuccinic acid-methyl ester), 3-하이드록시아디핀산-메틸에스테르(3-hydroxyadipinic acid-methyl ester), 3-하이드록시스베린산-메틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-methyl ester), 3-하이드록시아젤라인산-메틸에스테르(3-hydroxyazelaic acid-methyl ester), 3-하이드록시세바신산-메틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-methyl ester), 3-하이드록시스베린산-에틸에스테르(3-hydroxysuberic acid-ethyl ester), 3-하이드록시세바신산-에틸에스테르(3-hydroxysebacic acid-ethyl ester), 3-하이드록시피메린산-프로필에스테르(3-hydroxypimelic acid-propyl ester), 3-하이드록시세바신산-벤질에스테르(3-hydroxysebacic acid-benzil ester), 3-하이드록시-8-아세톡시옥탄산(3-hydroxy-8-acetoxyoctanoic acid), 3-하이드록시-9-아세톡시노난산(3-hydroxy-9-acetoxynonanoic acid), 페녹시-3-하이드록시부티레이트(phenoxy-3-hydroxybutyric acid), 페녹시-3-하이드록시발레르산(phenoxy-3-hydroxyvaleric acid), 페녹시-3-하이드록시헵탄산(phenoxy-3-hydroxyheptanoic acid), 페녹시-3-하이드록시옥탄산(phenoxy-3-hydroxyoctanoic acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시부티레이트(para-cyanophenoxy-3-hydroxybutyric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시발레르산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyvaleric acid), para-시아노페녹시-3-하이드록시헥산산(para-cyanophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), para-니트로페녹시-3-하이드록시헥산산(para-nitrophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid), 3-하이드록시-5-페닐발 레르산(3-hydroxy-5-phenylvaleric acid), 3-하이드록시-5-시클로헥실부티레이트(3-hydroxy-5-cyclohexylbutyric acid), 3,12-디하이드록시도데칸산(3, 12-dihydroxydodecanoic acid), 3,8-디하이드록시-5-cis-테트라데센산(3,8-dihydroxy-5-cis-tetradecenoic acid), 3-하이드록시-4,5-에폭시데칸산(3-hydroxy-4,5-epoxydecanoic acid), 3-하이드록시-6,7-에폭시도데칸산(3-hydroxy-6,7-epoxydodecanoic acid), 3-하이드록시-8,9-에폭시-5,6-cis-테트라데칸산(3-hydroxy-8,9-epoxy-5,6-cis-tetradecanoic acid), 7-시아노-3-하이드록시헵탄산(7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid), 9-시아노-3-하이드록시노난산(9-cyano-3-hydroxynonanoic acid), 3-하이드록시-7-플루오로헵탄산(3-hydroxy-7-fluoroheptanoic acid), 3-하이드록시-9-플루오로노난산(3-hydroxy-9-fluorononanoic acid), 3-하이드록시-6-클로로헥산산(3-hydroxy-6-chlorohexanoic acid), 3-하이드록시-8-클로로옥탄산(3-hydroxy-8-chlorooctanoic acid), 3-하이드록시-6-브로모헥산산(3-hydroxy-6-bromohexanoic acid), 3-하이드록시-8-브로모옥탄산(3-hydroxy-8-bromooctanoic acid), 3-하이드록시-11-브로모운데칸산(3-hydroxy-11-bromoundecanoic acid), 3-하이드록시-2-부텐산(3-hydroxy-2-butenoic acid), 6-하이드록시-3-도데센산(6-hydroxy-3-dodecenoic acid), 3-하이드록시-2-메틸부티레이트(3-hydroxy-2-methylbutyric acid), 3-하이드록시-2-메틸발레르산(3-hydroxy-2-methylvaleric acid), 및 3-하이드록시-2,6-디메틸-5-헵텐산(3-hydroxy-2,6-heptenoic acid)로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 제조방법.
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