JP4995469B2 - 遺伝子組み換え微生物及びそれを用いたポリエステルの製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、生分解性ポリエステルであるポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）の商業的生産に有用な、改良された微生物と、当該微生物を利用したＰＨＡの製造方法に関する。

ポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）は、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機分子のポリマーである。これらのポリマーは生分解性を示し、また、再生可能な資源から産生されることから、環境調和型素材または生体適合素材として工業的に生産し、多様な産業へ利用する試みが行われている熱可塑性ポリマーである。
遺伝子組換え技術を応用して作製された菌株を用いて、ＰＨＡを工業的規模で培養する際に最も重要な課題のひとつは、導入した遺伝子の安定的な保持と発現である。原核生物の遺伝子の導入法としてしばしば利用されるのは以下の２つの方法である。１つは宿主となる菌株内で自律複製することができ、かつ選択マーカー遺伝子を持つプラスミドを調製し、ＰＨＡ合成に関与する遺伝子を組み込んだのち、菌体内に導入する方法である。もう１つは宿主染色体へ当該遺伝子を組み込む方法である。

前者の方法では、当該遺伝子を組み込まれたプラスミドが、増殖あるいは分裂する際にしばしば脱落することが知られている（特許文献１参照）。プラスミドが脱落した菌体はＰＨＡ生産能を失うので、商業的生産性が低下する。プラスミドの脱落を防止するために、従来、組換え菌の培養では選択マーカーとして抗生物質耐性遺伝子を用い、選択圧として抗生物質を培地に添加することでプラスミド保持菌のみを生育させる手法が一般的であった。しかしながら、抗生物質使用によるコストの増加や、培養廃液中の残留抗生物質による環境への影響が問題となっている。
プラスミド安定化のために、Ｒ１プラスミド由来のｐａｒＢ遺伝子をポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と表記）生産プラスミドに組み入れた組換え大腸菌が作製された（非特許文献１参照）。この大腸菌は、１１０−１２０世代の培養後もほぼ１００％プラスミドを保持していた。しかしながら、人工的に作製されたプラスミドは、脱落しても宿主に影響がないため、このようなプラスミドはやはり脱落の可能性を含んでいる。

後者の宿主染色体へ当該遺伝子を組み込む方法においては、染色体上に組み込まれた遺伝子は世代を超えても忠実に複製、保持されることから安定であると考えられ、ＰＨＡの合成に関する遺伝子を染色体に組み込んだ微生物がすでに報告されている（特許文献２、非特許文献２、非特許文献３参照）。ＰＨＡ生合成酵素をコードする遺伝子を大腸菌の染色体にランダムに挿入することによって作製された組換え大腸菌株は、細胞乾燥重量の８５％を超えるレベルでＰ（３ＨＢ）を産生した（特許文献２参照）。しかしながら、実用面においては、Ｐ（３ＨＢ）よりもやわらかい物性を有することが用途範囲の拡大につながる。そういった性質をもったＰＨＡにポリ（３−ヒドロキシ酪酸−３−ヒドロキシヘキサン酸）（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と表記）があるが、当ポリマーを大腸菌に産生させるためには基質モノマー供給のための遺伝子をさらに共存させる必要があり、なお、高い生産効率を達成するための妨げになっている。さらには、染色体上にランダムに遺伝子を組み込む場合には、組み込まれた部位によっては、その部位上の、あるいはその部位周辺の遺伝子の発現に影響を及ぼし、ＰＨＡ生産株として充分は能力を発揮できない状況が存在する。

Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株をはじめとした複数の微生物では、染色体ＤＮＡのほかに巨大なプラスミド（メガプラスミド）を持つことが知られており、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株のメガプラスミドｐＨＧ１はすでに配列情報も公開されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３０５３７８）。メガプラスミド上の遺伝子の機能を解析する手段としてトランスポゾン変異を利用してＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓのメガプラスミド上にランダムな遺伝子組み換えが行われた報告がある（非特許文献４参照）。しかし、この場合は導入遺伝子の安定的な保持と発現を目的としていなかったし、導入された遺伝子はＰＨＡ合成に関連しない抗生物質耐性遺伝子（Ｔｎ５）であった。

従来、導入した遺伝子を安定的に発現させるためには、染色体上に遺伝子を導入することが有効であるとされていたが、宿主微生物が本来有するプラスミド上に遺伝子を導入することで安定的に共重合ポリエステルを生成させた例はなかった。さらに、該プラスミド上の遺伝子のうち、合成されたＰＨＡを分解することでＰＨＡ生産の低下を引き起こす可能性があるＰＨＡデポリメラーゼのホモログをコードする遺伝子上に部位特異的にＰＨＡ合成酵素を挿入することで、デポリメラーゼホモログ遺伝子の破壊と導入遺伝子の発現を同時に行って共重合ポリエステルを蓄積させた場合の効果は知られておらず、また、従来知られていた技術から単純には予測することもできなかった。
特開昭５９−２０５９８３号公報 米国特許第６５９３１１６号明細書 Ｌｅｅ等、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３２：２０３−２１１（１９９４） Ｋｒａｎｚ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６３：３００３−３００９（１９９７） Ｙｏｒｋ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８３：４２１７−４２２６（２００１） Ｔｈｏｍａｓ Ｅｉｔｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｂｅｌ Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：３２２２−３２２７（１９９１）

本発明は、上記現状に鑑み、微生物を利用した生分解性ポリエステルの生産過程において、ポリエステル合成に関与する遺伝子を安定的に発現する遺伝子組換え微生物を作製する。その際、遺伝子の安定的な発現に抗生物質など選択圧を必要としないこと、かつ遺伝子組換えによって当該微生物の生存や物質生産に直接的あるいは間接的に関与する代謝系に悪影響を与えないことを目的とする。

本発明者らは、上述の課題を解決するために鋭意検討した結果、外因性のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を、宿主微生物が本来有しているプラスミド上に挿入したポリエステル生産微生物が、何の選択圧も必要とすることなく、かつ安定的に高レベルのＰＨＡを蓄積できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち本発明は以下の通りである。
（１）宿主微生物が本来有しているプラスミドのＤＮＡ上に、ポリエステル合成に関与する遺伝子が挿入された微生物。
（２）前記プラスミドがメガプラスミドである上記（１）の微生物。
（３）宿主微生物が、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ属、Ｓｈｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属又はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の何れかに分類される上記（１）又は（２）の微生物。
（４）宿主微生物が、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ又はＷａｕｔｅｒｓｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａより選ばれる一種である上記（１）〜（３）いずれか１つの微生物。
（５）宿主微生物が、３−ヒドロキシ酪酸合成酵素をコードする構造遺伝子を完全欠失あるいは部分欠失したＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４株、又は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株の何れかであることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれか１つの微生物。
（６）Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株の３−ヒドロキシ酪酸合成酵素をコードする構造遺伝子を完全欠失した株を宿主とする上記（５）の微生物。
（７）ポリエステル合成に関与する遺伝子が、宿主微生物のプラスミドのＤＮＡ上にある、ＰＨＡデポリメラーゼ及び／またはそのホモログをコードする遺伝子を破壊する形で挿入された上記（１）〜（６）のいずれか１つの微生物。
（８）ポリエステル合成に関与する遺伝子が宿主微生物のプラスミドのＤＮＡ上にある、配列番号１８の塩基配列で示されるＰＨＡデポリメラーゼホモログをコードする遺伝子を破壊する形で挿入された上記（７）の微生物。
（９）ポリエステル合成に関与する遺伝子が、チオラーゼ、レダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ又はエピメラーゼからなる遺伝子及び該遺伝子の変異体からなる遺伝子群より選択される、少なくとも１種類であることを特徴とする上記（１）〜（８）の何れか１つの微生物。
（１０）ＰＨＡシンターゼまたはその変異体がＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来であることを特徴とする上記（９）の微生物。
（１１）ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子の変異体が、ＰＨＡシンターゼをコードするアミノ酸配列の、１４９番目のアミノ酸のアスパラギンをセリンに置換、及び／又は、１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸をグリシンに置換したアミノ酸配列をコードする遺伝子である、上記（１０）の微生物。
（１２）ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子の変異体が、ＰＨＡシンターゼをコードするアミノ酸配列の、１４９番目のアミノ酸のアスパラギンをセリンに置換し、且つ１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸をグリシンに置換した配列番号１７で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子である、上記（１１）の微生物。
（１３）ポリエステルが、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシトリデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシペンタデカン酸、および３−ヒドロキシヘキサデカン酸からなる群より選択されるモノマーユニットの少なくとも２種から構成される共重合ポリエステルである上記（１）〜（１２）のいずれか１つの微生物。
（１４）共重合ポリエステルが３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のモノマーユニットで構成される共重合ポリエステルであることを特徴とする、上記（１３）の微生物。
（１５）ＨＧ−ｄ１株（受領番号ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０４９４）である微生物。
（１６）上記（１）〜（１５）のいずれか１つの微生物を用いたポリエステルの製造方法。

以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の微生物は、宿主微生物が本来有しているプラスミドのＤＮＡ上にポリエステル合成に関与する遺伝子が挿入された微生物である。
本発明における宿主微生物としては、プラスミドを本来有する微生物であれば特に制限なく利用することができ、別の炭素源を利用できるように改変された微生物、基質モノマーの生成や取り込みが改変された微生物、または生産を増大するように改変された微生物などの遺伝子組み替えされた微生物を含む。上記プラスミドは、宿主微生物が増殖あるいは分裂する際により安定して保持される点から、メガプラスミドであることが好ましい。
該宿主微生物としては、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ属、Ｓｈｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の何れかに分類されるものを用いることが好ましい。例としてはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｓｈｉｎｏｒｈｉｏｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ（メガプラスミドのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ００６４６９及びＡＬ５９１９８５）、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ（メガプラスミドのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ５６９４５３およびＡＹ５６９４５４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ（メガプラスミドのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ３４４０６８）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ（メガプラスミドのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＬ６４６０５３）、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｗｅｓｔｆａｌｉｃａ（メガプラスミドのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号 ＡＪ５７６０３９）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（メガプラスミドのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ００８６８７及びＡＥ００８６９０）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（メガプラスミドのＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ００２０８６）などの細菌類が含まれる。
安全性および生産性の観点から好ましくはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ、Ｗａｕｔｅｒｓｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａと分類学上同一）であり、より好ましくはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株（ＤＳＭ４２８）及びその変異株、並びに、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４株（ＤＳＭ５４１）であり、更に好ましくはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株及びその変異株である。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株の変異株としては、例えばＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株から３−ヒドロキシ酪酸合成酵素をコードする構造遺伝子（ｐｈｂＣ）を完全欠失あるいは部分欠失した株が挙げられる。上記宿主微生物としては、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株のｐｈｂＣを完全欠失した株が特に好ましい。この株は、Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｍ．Ｙｏｒｋ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８３，１４，４２１７−４２２６（２００１）中に示されているＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｒｅ１０３４と同様の方法で作製することができる。

本発明におけるメガプラスミドとは、通常のプラスミドよりもサイズが大きく（１００ｋｂ〜３Ｍｂ程度）、科学論文などでメガプラスミドあるいは巨大プラスミドと呼ばれるものである。メガプラスミドを有する微生物としてはＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ（Ｔｈｏｍａｓ Ｅｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｂｅｌ Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ， Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６６：３２２２−３２２７ （１９９１））、Ｓｈｉｎｏｒｈｉｏｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｔｒｅｖｏｒ Ｃ．Ｃｈａｒｌｅｓ ａｎｄ Ｔｕｒｌｏｕｈ Ｍ．Ｆｉｎａｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２７：５−２０（１９９０））、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ（Ｃｈｉｒｉｓｔｉｎａら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １５０：３０７５−３０８７Ｐ（２００４））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ（Ｃ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０（１）：４０２４０６（１９８２））、Ｇｏｒｄｏｎｉａ ｗｅｓｔｆａｌｉｃａ（Ｄａｎｉｅｌ Ｂｒｏｋｅｒら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６（１）：２１２２２５（２００４））、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｌ Ｕｎｇｅｒ，ら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４（２）：７２３７３０（１９８５））、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓなどが知られている。

本発明におけるポリエステル合成に関与する遺伝子は、各種のＰＨＡ蓄積生物に由来する遺伝子のうち共重合ポリエステルの蓄積に関与するものであればどのようなものでもよいが、チオラーゼ、レダクターゼ、ＰＨＢシンターゼ、ＰＨＡシンターゼ、アシル−ＣｏＡトランスフェラーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ又はエピメラーゼの何れかをコードする遺伝子及び該遺伝子の変異体からなる遺伝子群より選択される少なくとも１種を用いることが好ましい。そのような遺伝子として例えば、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ（Ｆｕｋｕｉ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９：４８２１−４８３０（１９９７））、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｏｒａｌｌｉｎｅ（ＧｅｎＫＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１９９６４）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｔｉｍｍ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０９：１５−３０（１９９２））Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ（Ｈｕｉｓｍａｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：２１９１−２１９８（１９９１））およびＴｈｉｏｃｙｓｔｉｔ ｖｉｏｌａｃｅａｅ（Ｌｉｅｂｅｒｇｅｓｅｌｌ等、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３８：４９３−５０１（１９９３））などから単離されているポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が挙げられる。これらの内、ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子又はその変異体を用いる場合は、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来であることが好ましい。
またそれらの遺伝子は、目的とする酵素活性が失われない範囲内でアミノ酸配列が改変されるように、塩基配列の一部を置換、挿入、欠失等によって変化させた変異体も使用することができる。例えば、Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８：２４１１−２４１９（２００２）に記載されている、１４９番目のアミノ酸のアスパラギンがセリンに置換されたＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来であるＰＨＡ合成酵素遺伝子（Ｎ１４９Ｓ変異体遺伝子）、１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸がグリシンに置換されたＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子（Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子）、または上記の２つのアミノ酸置換が組み合わされた、配列番号１７のアミノ酸配列で示されるＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来であるＰＨＡ合成酵素遺伝子（Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子、国際公開第０３／０５０２７７号パンフレット）などを好ましく用いることができる。上記の遺伝子はプロモーター及び／又はリボソーム結合部位を有し得るが、必ずしも必要ではない。

本発明におけるポリエステルとは、式：［−Ｏ−ＣＨＲ−ＣＨ_２−ＣＯ−］（ＲはＣ_ｎＨ_２ｎ＋１で表されるアルキル基で、ｎは１以上の整数である。Ｒは２種以上含まれていてもよい。）で示される３−ヒドロキシアルカン酸を繰り返しモノマー単位とする重合体で、モノマー単位が３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシトリデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシペンタデカン酸、および３−ヒドロキシヘキサデカン酸からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましく、より好ましくは２種以上の共重合ポリエステルである。その中でも、ポリエステルの樹脂としての物性の観点から、共重合ポリエステルが３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のモノマーユニットで構成されるポリヒドロキシアルカン酸が更に好ましい。

微生物が本来有しているプラスミドへポリエステル合成に関与する遺伝子を挿入する態様は、遺伝子を挿入する部分がプラスミド上のｏｒｉ領域やｐａｒ領域など、プラスミドの複製および保持に関わる遺伝子以外の部分であり、かつ外因性のポリエステル合成酵素遺伝子、つまりポリエステル合成に関与する遺伝子（挿入遺伝子）が発現するように挿入されていればどのような挿入位置および挿入形態であってもよい。好ましくはＰＨＡデポリメラーゼ及び／又はそのホモログの構造遺伝子の内部に挿入する形態、即ちＰＨＡデポリメラーゼ及び／又はそのホモログを破壊する形での挿入である。宿主がＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａの場合は、ＰＨＡデポリメラーゼのホモログをコードする配列番号１８の塩基配列で示される遺伝子を破壊する形で挿入することが好ましい。これらの遺伝子を破壊することによって、菌体内で生成されたポリマーを菌自身が消費するのを抑制する効果が期待され、ポリマー高生産の一助となると推測される。挿入後に、被挿入遺伝子（ＰＨＡデポリメラーゼ及び／又はそのホモログ）はプラスミド上からすべて失われていてもよいし、一部が存在していてもよく、分断されて存在していてもよい。挿入の一つの態様として、挿入遺伝子がリボソーム結合部位を有し、かつプロモーターを有しない場合は、被挿入遺伝子のプロモーターの下流に接続されるような挿入方法が選択できる。また、前記と異なる挿入の一つの態様として、挿入遺伝子がプロモーターおよびリボソーム結合部位を有しない場合は、被挿入遺伝子のリボソーム結合部位の下流に接続されるような置き換わり方が選択できる。ポリエステル合成酵素遺伝子の挿入後に発現するポリエステル合成酵素蛋白は、挿入遺伝子がコードする単独の蛋白であってもよいし、被挿入遺伝子がコードする構造蛋白との融合蛋白であってもよく、挿入したポリエステル合成酵素遺伝子の酵素活性を有していればよい。本発明で用いるポリエステル合成酵素遺伝子の挿入の態様は以上の例示に限定されるものではないが、好ましい態様としては被挿入遺伝子の開始コドンから終止コドンまでの間の部分にプロモーター、リボソーム結合部位、構造遺伝子およびターミネーターを有する挿入遺伝子が挿入されるものである。

染色体上に遺伝子を部位特異的に挿入する方法は当業者に周知であり、微生物が本来有しているプラスミド上に遺伝子を挿入する方法も同様にして行うことができる。代表的な方法としてはトランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ｏｈｍａｎ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６２：１０６８−１０７４（１９８５））や相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Ｎｏｔｉ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５４：１９７−２１７（１９８７））などがあり、また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ１ｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をシュークロース添加培地耐性株として容易に単離する方法（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６：１１９５−１２０４（１９９２）、Ｌｅｎｚ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７６：４３８５−４３９３（１９９４））も利用することができるが、微生物が本来有しているプラスミド上に遺伝子挿入できればその方法は特に制限されない。

以下にＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来であるＰＨＡ合成酵素遺伝子（Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子）をＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａのＰＨＡデポリメラーゼ酵素遺伝子ホモログ（ｐｈｇ１７８）に挿入する場合の方法を、以下により具体的に例示する。
まず、挿入遺伝子のフラグメントを作製する。挿入フラグメントは配列番号１９に示すようにＰＨＡＣ_Ｒｅのコーディング配列（ＣＤＳ：開始コドンから終止コドンまでを含む）直前の上流配列にＰＨＡＣ_ＲｅのＣＤＳ、プロモーター、およびリボソーム結合部位をふくむＤＮＡ配列がつながり、コーディング配列の下流はｐｈｂＢの終始コドン直後の下流配列がつながった形とする。

この挿入フラグメントをプラスミド上のＰＨＡデポリメラーゼ遺伝子ホモログをコードするｐｈｇ１７８の構造遺伝子（配列番号１８）の中に挿入した形の配列番号２０に示すような置換フラグメントを作製する。挿入遺伝子の上流配列と下流配列はプラスミド上の遺伝子と相同組換えを起こすために必要な相同配列であって、一般的にはその長さが長いほど組換え頻度は高くなるが、相同組換えさえ起こればよく、その長さは任意に設定できる。上記相同配列は、通常５０ｂｐ以上、好ましくは５００ｂｐ以上あればよい。

置換フラグメントには、遺伝子置換の際に選択マーカーとなる遺伝子を付加することができる。選択マーカーとなる遺伝子は、例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、アンピシリン等の抗生物質の耐性遺伝子や各種の栄養要求性を相補する遺伝子等が使用できる。宿主微生物としてＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａを用いる場合にはカナマイシンの耐性遺伝子が好適である。
それらに加えて、第二段階の相同組み換えによって選択マーカー遺伝子を含む領域が脱落した微生物株の選択を容易にするための遺伝子が付加できる。そのような遺伝子としてはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ１ｉｓ由来のｓａｃＢ遺伝子等が例示できる（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６：１１９５−１２０４（１９９２））。この遺伝子が発現している微生物株はシュークロースを含む培地で生育できないことが知られており、シュークロースを含む培地での生育により、第二段階の相同的組換えによってこの遺伝子を失った株を選択することが容易となる。

これらで構成された置換フラグメントは宿主微生物株中で複製しないベクターに接続することによって遺伝子置換用のプラスミドベクターが作製される。Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属やＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属等で利用できるこのようなベクターには例えば、ｐＵＣベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＢＲ３２２ベクターあるいはそれらと同じ複製起点を持つベクター等が挙げられる。さらには、接合伝達を可能にするｍｏｂ、ｏｒｉＴなどのＤＮＡ配列を共存させることも可能である。
このような構成で作製された遺伝子置換用のプラスミドベクターはエレクトロポレーション法や接合伝達法などの公知に方法によりＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａに導入することができ、相同組換えを行うことができる。
次に、相同組換えによって宿主微生物が本来有しているプラスミドのＤＮＡ上に遺伝子置換用のプラスミドベクターが挿入された株の選択を行う。選択は、遺伝子置換用プラスミドベクターに共存させた選択用の遺伝子に基づいた方法によって行うことができる。カナマイシン耐性遺伝子を用いた場合にはカナマイシンを含む培地で生育してきた株から選ぶことができる。

次の段階で第二の相同組換えによって染色体上から選択マーカー遺伝子を含む領域が脱落した株を選択する。挿入時に利用した選択用の遺伝子に基づいて、例えばカナマイシンを含む培地で生育できなくなった株を選択してもよいが、例えばｓａｃＢ遺伝子を遺伝子置換用プラスミドに共存させている場合は、シュークロースを含む培地で生育してくる株から容易に選択できる。このようにして得られた株が所望するように遺伝子が置換された株かどうか確認するには、ＰＣＲ法やサザンハイブリダイゼーション法、ＤＮＡ塩基配列の決定など、公知の方法が使用できる。以上のようにしてＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅのＰＨＡ合成酵素遺伝子がプラスミド上のＰＨＡデポリメラーゼ遺伝子ホモログ（ｐｈｇ１７８）に挿入された株を取得することができる。

このような株としては、以下の実施例で作製したＨＧ−ｄ１株が挙げられ、上記ＨＧ−ｄ１株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ブダペスト条約に基づいて国際寄託されている（受領日：平成１８年１月３１日、受領番号：ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０４９４）。

本発明の微生物を用いたポリエステルの製造方法は、特に限定はないが、以下に例示する。本発明において、本発明の微生物を炭素源存在下で増殖させることにより、微生物体内に共重合ポリエステルを蓄積させることができる。炭素源としては、糖、油脂または脂肪酸を用いることができる。炭素源以外の栄養源として、窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を任意に用いることができる。
糖としては、例えば、フラクトース等の炭水化物が挙げられる。油脂としては、炭素数が１０以上である飽和・不飽和脂肪酸を多く含む油脂、例えばヤシ油、パーム油、パーム核油等が挙げられる。脂肪酸としては、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体が挙げられる。

窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第ニカリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。

培養温度は、その菌が生育可能な温度であればよいが、２０℃〜４０℃が好ましい。培養時間は、特に制限はないが、１〜１０日間程度で良い。
得られた該培養菌体に蓄積されたポリエステルは公知の方法により回収することができる。例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離器等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてポリエステルを抽出する。このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてポリエステルを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてポリエステルを回収することができる。
ポリエステル生産確認の簡易法としては、Ｎｉ１ｅｒｅｄを用いた染色法を利用できる。すなわち、組換え菌が生育する寒天培地にＮｉ１ｅｒｅｄを加え、組換え菌を１〜７日間培養し、組換え菌が赤変するか否かを観察することにより、ポリエステル生産の有無を確認できる。

本発明によれば、微生物を利用した生分解性ポリエステルの生産過程において、ポリエステル合成に関与する遺伝子を安定的に発現する遺伝子組換え微生物を作製することができる。その際、遺伝子の安定的な発現に抗生物質など選択圧を必要としない。かつ遺伝子組換えによって当該微生物の生存や物質生産に直接的あるいは間接的に関与する代謝系に悪影響を与えない。

以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお、実施例において「部」や「％」は重量基準である。
（製造例１）ＫＮＫ−００５株の作製
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株由来のＰＨＡＣＡＢオペロンプロモーターおよびターミネーターを有するＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のポリエステル合成酵素変異体遺伝子（Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体）をクローニングする際にＰＣＲの鋳型として用いたＫＮＫ−００５株は以下のようにして作製した。
＜遺伝子置換用プラスミドの作製＞
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株の菌体を鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号１と配列番号２で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子（ＰＨＡＣ_Ｒｅ）の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、（３）４５℃で３０秒、（４）７２℃で３分、（２）から（４）を２５サイクル、（５）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（タカラバイオ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩで切断し、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）（東洋紡社製）を同酵素で切断した部位にサブクローニングした（ｐＢｌｕｅ−ＰＨＡＣ_Ｒｅ）。

Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のポリエステル合成酵素変異体遺伝子であるＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体は、次のように作製した。
まず、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（−）（東洋紡社製）をＰｓｔＩ処理し、ＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いて平滑末端化しライゲーションすることによりＰｓｔＩサイトを欠失したプラスミドｐＢｌｕｅ−Ｎｅｗを作製した。このプラスミドのＥｃｏＲＩサイトにｐＪＲＤ２１５−ＥＥ３２ｄ１３（特開平１０−１０８６８２号公報）より同酵素で切り出したｄ１３断片をクローニングした（ｐＢｌｕｅ−ｄ１３）。次に、理化学研究所より分与されたクローンＥ２−５０由来のプラスミド（Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８：２４１１−２４１９（２００２））を鋳型とし、配列番号３と４に記載のプライマーのセット及び配列番号５と６に記載のプライマーのセットを用いてそれぞれＰＣＲ法により増幅、２断片を得た。その条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、（３）５５℃で３０秒、（４）７２℃で２分、（２）から（４）を２５サイクル、（５）７２℃で５分である。増幅された２断片を等モル混合し再びＰＣＲ反応を行い２断片を結合させた。その条件は（１）９６℃で５分、（２）９５℃で２分、（３）７２℃で１分、（２）から（３）を１２サイクルであり、ポリメラーゼとしてはＰｙｒｏｂｅｓｔポリメラーゼ（タカラバイオ製）を用いた。目的サイズのＤＮＡ断片をアガロース電気泳動ゲルより切り出しＰｓｔＩとＸｈｏＩで処理し、同酵素で処理したｐＢｌｕｅ−ｄ１３に断片を入れ替える形でクローニングした（ｐＢｌｕｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ）。塩基配列決定を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、ＰＨＡ合成酵素の１４９番目のアミノ酸であるアスパラギンがセリンに、１７１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸がグリシンに置換された変異遺伝子であることを確認した。

ｐＢｌｕｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇを鋳型として配列番号７と配列番号８で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体の構造遺伝子ＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲ条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、（３）４５℃で３０秒、（４）７２℃で２分、（２）から（４）を２５サイクル、（５）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（タカラバイオ製）を用いた。次に、ｐＢｌｕｅ−ＰＨＡＣ_Ｒｅを制限酵素ＳｂｆＩとＣｓｐ４５Ｉで処理し、同酵素で処理した上記増幅ＤＮＡ断片をＰＨＡＣ_Ｒｅ構造遺伝子と入れ替える形でクローニングした（ｐＢｌｕｅ−ＰＨＡＣ_Ｒｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ）。

次に、プラスミドｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ３７５３３）を制限酵素ＸｈｏＩとＤｒａＩで処理してカナマイシン耐性遺伝子を含む約１．３ｋｂのＤＮＡ断片を単離後、ＤＮＡブランティングキット（タカラバイオ製）を用いて末端を平滑化し、ｐＢｌｕｅ−ＰＨＡＣ_Ｒｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇを制限酵素ＳａｌＩで切断後同様に平滑末端化した部位に挿入した（ｐＢｌｕｅ−ＰＨＡＣ_Ｒｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｋｍ）。
続いて、プラスミドｐＭＴ５０７１（Ｔｓｕｄａ、ＧＥＮＥ，２０７：３３−４１（１９９８））を制限酵素ＮｏｔＩで処理してｓａｃＢ遺伝子を含む約８ｋｂのＤＮＡ断片を単離し、ｐＢｌｕｅ−ＰＨＡＣ_Ｒｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｋｍを同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子置換用プラスミドｐＢｌｕｅ−ＰＨＡＣ_Ｒｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−ＫｍＳＡＣを作製した。

＜遺伝子置換株の作製＞
遺伝子置換用プラスミドｐＢｌｕｅ−ＰＨＡＣ_Ｒｅ：：Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−ＫｍＳＡＣで大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７００５）を形質転換し、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株の染色体上に組み込まれた株を取得した（第一段階の相同組換え）。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株を選択して、選択マーカー遺伝子を含む領域が脱落した株を取得した（第二段階の相同組換え）。さらにＰＣＲによる解析によりＰＨＡＣ_Ｒｅ遺伝子がＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子に置換された菌株を単離した。この遺伝子置換株をＫＮＫ−００５株と命名し、塩基配列決定を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、染色体上のＰＨＡＣ_Ｒｅ遺伝子の開始コドンから終止コドンまでがＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体遺伝子の開始コドンから終止コドンまでに置換された株であることを確認した。上記ＫＮＫ−００５株は、茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（受託日：平成１７年１月２０日、受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２０７）。

（実施例１）メガプラスミド上への遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製
挿入用遺伝子としてＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株由来のＰＨＡＣＡＢオペロンプロモーターおよびターミネーターを有するＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来のポリエステル合成酵素変異体遺伝子（Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ変異体）を次のように作製した。
ＫＮＫ−００５株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号９および配列番号１０で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、（３）６８℃で２分、（２）から（３）を２５サイクルであり、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した（Ｐ_Ｒｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｔ）。
次に、破壊する遺伝子をＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株のメガプラスミド上にあるＰＨＡＺホモログをコードする遺伝子（ｐｈｇ１７８）とし、以下の手順で部分欠失したｐｈｇ１７８遺伝子を作製した。
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株の菌体を鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号１１および配列番号１２で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｐｈｇ１７８遺伝子の上流側の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、（３）６４℃で３０秒、（４）６８℃で５０秒、（２）から（４）を２５サイクルであり、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片をＨＧ１とした。
同様にＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株の菌体を鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号１３および配列番号１４で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、ｐｈｇ１７８遺伝子の下流側の構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、（３）６４℃で３０秒、（４）６８℃で５０秒、（２）から（４）を２５サイクルであり、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片をＨＧ２とした。

ＨＧ１およびＨＧ２を等モル混合しライゲートしてできたＤＮＡ断片をテンプレートとして配列番号１１および配列番号１４で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、部分欠失したｐｈｇ１７８遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ条件は（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、（３）６４℃で３０秒、（４）６８℃で１分、（２）から（４）を２５サイクルであり、ポリメラーゼとしてはＫＯＤ−ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｌＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（−）（ＴＯＹＯＢＯ製）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした（ＨＧ／ｐＢｌｕ）。
挿入用ＤＮＡ断片（Ｐ_Ｒｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｔ）を、ＨＧ／ｐＢｌｕの同制限酵素で消化した部位に挿入した（ＨＧ：：Ｐ_Ｒｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｔ／ｐＢｌｕ）。
塩基配列決定を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、鋳型としたＤＮＡ部分の塩基配列と同一であることを確認した。
プラスミドｐＪＲＤ２１５を鋳型とし、配列番号１５と配列番号１６で示されるプライマーを用いてＰＣＲ反応を行い、約１．２ｋｂｐのカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製した。次にｐＭＴ５０７１を制限酵素ＢａｍＨＩで処理し、同酵素で処理した上記ＤＮＡ断片をクロラムフェニコール耐性遺伝子と入れ替える形でクローニングした（ｐＫｍ−ｓａｃＢＲ）。
続いて、プラスミドｐＫｍ−ｓａｃＢＲを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出し、ＨＧ：：Ｐ_Ｒｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｔ／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドＨＧ：：Ｐ_Ｒｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｔ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを作製した（図１）。

（実施例２）遺伝子挿入用宿主の作製
遺伝子挿入用の宿主としてｐｈｂＣを完全欠失した株Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ｄ１株を作製した。作製方法は、文献Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｍ．Ｙｏｒｋ等、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １８３，１４，４２１７−４２２６（２００１）中に示されているＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｒｅ１０３４の作製方法と同じである。

（実施例３）遺伝子挿入株の作製
遺伝子破壊・挿入用プラスミドＨＧ：：Ｐ_Ｒｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｔ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍを用いて大腸菌Ｓ１７−１株（ＡＴＣＣ４７００５）を形質転換し、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ｄ１株とＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。２５０ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム ２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム ５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・ ７水塩 ０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素ニカリウム１ｇ／Ｌ、寒天 １５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ｄ１株のメガプラスミド上に組み込まれた株を取得した（第一段階の相同組換え）。
この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、２０％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株を選択して選択マーカー遺伝子（カナマイシン耐性遺伝子、ｓａｃＢ遺伝子）を含む領域が脱落した株を取得した（第二段階の相同組換え）。さらにＰＣＲによる解析によりｐｈｇ１７８遺伝子内部にＰ_Ｒｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｔが挿入された菌株を単離した。この遺伝子破壊・挿入株をＨＧ−ｄ１株と命名し、塩基配列決定を、ＰＥＲＫＩＮ ＥＬＭＥＲ ＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて行い、メガプラスミド上のｐｈｇ１７８遺伝子の内部にＰ_Ｒｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｔが挿入された株であることを確認した。
上記ＨＧ−ｄ１株は、上述の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている（受領日：平成１８年１月３１日、受領番号：ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０４９４）。

（実施例４）ポリエステルの生産および精製
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％ Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％ Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％ Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％ Ｎａ_２ＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ ＫＨ_２ＰＯ_４（ｐＨ６．８）とした。前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％ Ｎａ_２ＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ ＫＨ_２ＰＯ_４、１．２９ｗ／ｖ％ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％パームＷオレイン油、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣ１_３・６Ｈ_２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣ１_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣ１_２・６Ｈ_２Ｏを溶かしたもの。）とした。
ポリエステル生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％ Ｎａ_２ＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．２９１ｗ／ｖ％ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１ｗ／ｖ％ ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ ＦｅＣ１_３・６Ｈ_２Ｏ、１ｗ／ｖ％ ＣａＣ１_２・２Ｈ_２０、０．０２ｗ／ｖ％ ＣｏＣ１_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ ＮｉＣ１_２・６Ｈ_２Ｏを溶かしたもの。）、０．０５ｗ／ｖ％ ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン製）とした。炭素源はパーム核油を分別した低融点画分であるパーム核油オレインを単一炭素源として用い、培養全般を通じ、比基質供給速度が０．０８−０．１（油脂（ｇ））×（正味乾燥菌体重量（ｇ））^−１×（時間（ｈ））^−１となるように流加した。
ＨＧ−ｄ１株のグリセロ−ルストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７−６．８の間でコントロールしながら２８時間培養した。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
ポリエステル生産培養は６Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−１０００型）に前培養種母を５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量３．６Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。培養は約６４時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収、メタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した結果、１６９．３ｇ／Ｌであった。
得られた乾燥菌体約１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のポリエステルを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が約３０ｍｌになるまで濃縮後、約９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したポリエステルをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ポリエステルの重量を測定し、菌体内のポリエステル含量を算出した。その結果、ＨＧ−ｄ１株によるポリエステル含量は６５時間で７８．５（ｗｔ％）という高含量であった。

（実施例５）ポリエステル生産能の安定性評価
実施例４のポリエステル生産培養終了時の培養菌液を希釈してＮｕｔｒｉｅｎｔ Ａｇａｒ培地に播種し、生育してきたコロニーをＮｉｌｅＲｅｄ含有培地（リン酸水素２ナトリウム・１２水塩 ９ｇ、リン酸２水素カリウム １．５ｇ、塩化アンモニウム ０．０５ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２ｇ、フルクトース０．５ｇ、塩化コバルト・６水塩 ０．２５ｐｐｍ、塩化鉄（ＩＩＩ）・６水塩１６ｐｐｍ、塩化カルシウム・２水塩 １０．３ｐｐｍ、塩化ニッケル・６水塩 ０．１２ｐｐｍ、硫酸銅・５水塩 ０．１６ｐｐｍ、Ｎｉｌｅｒｅｄ ０．５ｍｇ、寒天 １５ｇ／Ｌ）に接種した。３０℃、３日間の培養後、コロニーが赤色を呈しているものがポリエステルを生産していると判定できる。１００コロニーを調べた結果、すべてのコロニーがポリエステル生産能を保持していた。

本発明によれば、産業用発酵過程においてポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）を安定的に高生産できる組換え微生物株が提供され、高純度のポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）が簡便かつ大量に、しかも安価に製造することが可能となる。本発明では、宿主微生物が本来有しているプラスミドにＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入することにより、遺伝子の安定的な発現に抗生物質などの選択圧を必要とせず、遺伝子組換えによって当該微生物の生存や物質生産に直接的あるいは間接的に関与する代謝系に悪影響を与えない。

実施例１で構築した遺伝子挿入用プラスミドベクターＨＧ：：Ｐ_Ｒｅ−Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ−Ｔ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ−Ｋｍの構成を示した模式図である。

Claims (14)

1. Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、又はＷａｕｔｅｒｓｉａ属の何れかに分類される宿主微生物が本来有しているプラスミドのＤＮＡ上に、ＰＨＢシンターゼ又はＰＨＡシンターゼの何れかをコードする遺伝子及び該遺伝子の変異体からなる遺伝子群より選択される少なくとも１種のポリエステル合成に関与する遺伝子が挿入された微生物。
2. 前記プラスミドがメガプラスミドである請求項１記載の微生物。
3. 宿主微生物が、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ又はＷａｕｔｅｒｓｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａより選ばれる１種である請求項１または２に記載の微生物。
4. 宿主微生物が、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株（ＤＳＭ４２８）、３−ヒドロキシ酪酸合成酵素をコードする構造遺伝子を完全欠失あるいは部分欠失したＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株、又は、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ ＰＨＢ−４株（ＤＳＭ５４１）の何れかであることを特徴とする請求項３に記載の微生物。
5. 宿主微生物が、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ Ｈ１６株の３−ヒドロキシ酪酸合成酵素をコードする構造遺伝子を完全欠失した株である請求項４に記載の微生物。
6. 前記遺伝子が、宿主微生物のプラスミドのＤＮＡ上にある、ＰＨＡデポリメラーゼ及び／又はそのホモログをコードする遺伝子を破壊する形で挿入された請求項１〜５の何れか１項に記載の微生物。
7. 前記遺伝子が、宿主微生物のプラスミドのＤＮＡ上にある、ＰＨＡデポリメラーゼのホモログをコードする配列番号１８の塩基配列で示される遺伝子を破壊する形で挿入された請求項６に記載の微生物。
8. ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子またはその変異体がＡｅｒｏｍｏｎａｓ ｃａｖｉａｅ由来であることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の微生物。
9. ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子の変異体が、ＰＨＡシンターゼをコードするアミノ酸配列の、１４９番目のアミノ酸のアスパラギンをセリンに置換、及び／又は、１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸をグリシンに置換したアミノ酸配列をコードする遺伝子である請求項８に記載の微生物。
10. ＰＨＡシンターゼをコードする遺伝子の変異体が、ＰＨＡシンターゼをコードするアミノ酸配列の、１４９番目のアミノ酸のアスパラギンをセリンに置換し、且つ１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸をグリシンに置換した配列番号１７で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子である請求項９に記載の微生物。
11. ポリエステルが、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシ吉草酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシヘプタン酸、３−ヒドロキシオクタン酸、３−ヒドロキシノナン酸、３−ヒドロキシデカン酸、３−ヒドロキシウンデカン酸、３−ヒドロキシドデカン酸、３−ヒドロキシトリデカン酸、３−ヒドロキシテトラデカン酸、３−ヒドロキシペンタデカン酸、および３−ヒドロキシヘキサデカン酸からなる群より選択されるモノマーユニットの少なくとも２種から構成される共重合ポリエステルである請求項１〜１０の何れか１項に記載の微生物。
12. 共重合ポリエステルが３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸のモノマーユニットで構成される共重合ポリエステルであることを特徴とする請求項１１に記載の微生物。
13. ＨＧ−ｄ１株（受領番号：ＦＥＲＭ ＡＢＰ−１０４９４）である請求項１〜１２の何れか１項に記載の微生物。
14. 請求項１〜１３の何れか１項に記載の微生物を用いたポリエステルの製造方法。

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