JPWO2005098001A1

JPWO2005098001A1 - 新規形質転換体

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Publication number: JPWO2005098001A1
Application number: JP2006512128A
Authority: JP
Inventors: 哲也長岡
Original assignee: Kaneka Corp
Current assignee: Kaneka Corp
Priority date: 2004-04-09
Filing date: 2005-04-08
Publication date: 2008-02-28
Also published as: WO2005098001A1; TW200540269A

Abstract

ラルストニア・ユートロファは安全性、高い生産性、安価な炭素源の利用が可能等の観点よりＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の工業的生産に最も適した宿主であると期待されている。しかしながら、低３ＨＨ組成Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産系に比べ、柔軟な性質を活かしたフィルム等への加工に適した高３ＨＨ組成Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の安全且つ安価な生産系が確立されていないため、その高生産系開発が望まれていた。本発明は、フィルム状等への加工に適した柔軟な性質を示す高３ＨＨ組成のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を製造するための新規ポリエステル合成酵素発現プラスミド、該プラスミドを含む高３ＨＨ組成Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）合成能を有する形質転換体、および該形質転換体を使用した高３ＨＨ組成Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の安全且つ安価な製造方法である。

Description

本発明は、高３ＨＨ組成ポリエステル生産用新規プラスミド、およびその形質転換体、またそれを用いた高３ＨＨ組成ポリエステルの製造方法に関するものである。

現在までに数多くの微生物において、エネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積することが知られている。その代表例としては３−ヒドロキシ酪酸（以下３ＨＢと略す）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と略す）であり、１９２５年にバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）で最初に発見された。Ｐ（３ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に分解されることから、環境にやさしいプラスチックとして注目されている。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いため、硬くて脆い性質を持っていることから実用的には応用範囲が限られる。この為、この性質の改良を目的とした研究がなされてきた。

その中で、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（３ＨＶ）とからなる共重合体（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）と略す）の製造方法が開示されている（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）はＰ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際にはＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は３ＨＶモル分率を増加させても、それに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルム等へ加工するために要求される柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取っ手等、硬質成型体の分野にしか利用されなかった。

近年、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステル（以下Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と略す）およびその製造方法について研究がなされた（特許文献３、特許文献４参照）。これら報告のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法は、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｃａｖｉａｅ）を用いてオレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等の油脂から発酵生産するものであった。また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の性質に関する研究もなされている（非特許文献１参照）。この報告では炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてアエロモナス・キャビエを培養し、３ＨＨ組成が１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産している。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成の増加にしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。すなわちＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨ組成を変えることで、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで応用可能な幅広い物性を持つため、テレビの筐体等のように硬さを要求されるものからフィルム等のように柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。しかしながら、本製造方法では菌体生産量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量３０％とポリマー生産性は低いものであり、本ポリマーの実用化に向けた生産方法としては未だ不十分と言わざるを得なかったため、実用化に向けて更に高い生産性が得られる方法が探索された。

Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の工業生産を目指した取組みもなされている。アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）を用いた培養では、オレイン酸を炭素源とした４３時間の流加培養において、菌体量９５．７ｇ／Ｌ、ポリマー含量４５．２％、３ＨＨ組成１７％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が生産された（非特許文献２参照）。また、アエロモナス・ハイドロフィラを、炭素源としてグルコース及びラウリン酸を用いて培養し、菌体量５０ｇ／Ｌ、ポリマー含量５０％を達成した（非特許文献３参照）。しかしながら、アエロモナス・ハイドロフィラはヒトに対して病原性を有する（非特許文献４参照）ことから、工業生産に適した種とはいえない。また、これらの培養生産では高価な炭素源を使用するため、製造コストの観点より安価な炭素源の利用も求められている。

このため、安全な宿主での生産及び生産性の向上を目指した取組みが行なわれた。アエロモナス・キャビエよりポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子がクローニングされた（特許文献５、非特許文献５参照）。本遺伝子をラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ、旧アルカリゲネス・ユートロファス）に導入した形質転換体を用いてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産を行った結果、菌体生産性は４ｇ／Ｌ、ポリマー含量は３０％であった。更に本形質転換体を、炭素源として植物油脂を用いて培養した結果、菌体含量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量８０％が達成された（非特許文献６参照）。しかしながら、安価な植物油脂を炭素源とするもののポリマー生産性は低く、またその３ＨＨ組成は５％であり硬くて脆い物性であった。

また、フラクトースを炭素源としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産できるラルストニア・ユートロファも構築されたが、本菌株のポリマー生産性は低く、実生産に適しているとはいえなかった（非特許文献７参照）。

大腸菌を宿主としたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産株も構築された。アエロモナス属のＰＨＡ合成酵素遺伝子等やラルストニア・ユートロファのＮＡＤＰ−アセトアセチルＣｏ−Ａ還元酵素遺伝子を大腸菌に導入した株が構築された。ドデカンを炭素源として同大腸菌を４０．８時間培養した結果、菌体量７９ｇ／Ｌ、ポリマー含量２７．２％、３ＨＨ組成１０．８％であった（非特許文献８参照）。

アエロモナス・キャビエのＰＨＡ合成酵素遺伝子、エノイルＣｏＡヒドラターゼ遺伝子及びアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した大腸菌も構築された。同大腸菌をラウリン酸を含む培地で培養すると、ポリマー含量約１６％、３ＨＨ組成約１６％であった（非特許文献９）。これらの大腸菌では生産性は低く、工業的生産への適用は困難であった。

一方で、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産性向上並びに３ＨＨ組成制御を目指して、ＰＨＡ合成酵素の人為的な改変が行なわれた（非特許文献１０、非特許文献１１参照）。アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素変異体のなかで、１４９番目のアミノ酸アスパラギンがセリンに置換された変異体酵素や、１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異体酵素は、大腸菌内でのＰＨＡ合成酵素活性や３ＨＨ組成が向上していることが示され、また、５１８番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換された変異体酵素や２１４番目のバリンがグリシンに置換された変異体酵素は大腸菌でのＰＨＡ合成酵素活性やポリマー含量が向上したことが報告されている。しかし、これらは宿主として特殊な大腸菌を用いており未だポリマー含量は低いことから、これらの変異体酵素の特徴を活かした工業的生産に向けた更なる改良が必要であった。

Ｔ．Ｆｕｋｕｉ等がラルストニア・ユートロファを宿主としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産したＰＨＡ合成酵素発現プラスミドは、ｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ３７５３３）にポリエステル合成酵素遺伝子やＤ−エノイルＣｏ−Ａヒドラターゼ遺伝子等を導入したｐＪＲＤＥＥ３２やｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３等（特許文献５参照）であった。本菌株の菌体含量は４ｇ／Ｌと低かったが、植物油脂を炭素源とした同菌株の培養条件改善により菌体含量４５ｇ／Ｌ、ポリマー含量６２．５％、３ＨＨ組成８．１％にまで向上したように、培養方法によって高３ＨＨ組成のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産する方法も研究された（特許文献６参照）。

また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の物性を制御する方法も開示されている（特許文献６参照）。少なくとも２種類の炭素数の異なる油脂および／または脂肪酸を炭素源として用いることによって、３ＨＨ組成が１〜４０ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産することが可能となり、種々の物性を有する（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が生産できるようになった。しかしながら、本製造方法では、３ＨＨ組成制御のために比較的高価なヘキサン酸、オクタン酸等を添加する必要があり、また高濃度のヘキサン酸は細胞毒性を示すことから菌体生産性が低下する結果となっている。また、多成分の炭素源を添加するため、生産設備が複雑・高価なものになりかねない。
特開昭５７−１５０３９３号公報特開昭５９−２２０１９２号公報特開平５−９３０４９号公報特開平７−２６５０６５号公報特開平１０−１０８６８２号公報特開２００１−３４００７８号公報Ｙ．Ｄｏｉ，Ｓ．Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｈ．Ａｂｅ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２８，４８２２−４８２３（１９９５）ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ６７，２４０（２０００）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ５７，５０（２００１）国立感染症研究所、病原体等安全管理規定、別表１付表１（１９９９）Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７９，１５，４８２１−４８３０（１９９７）Ｔ．Ｆｕｋｕｉ等，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．４９，３３３（１９９８）Ｔ．Ｆｕｋｕｉ等Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｖｏｌ３，６１８（２００２）Ｓ．Ｐａｒｋ等Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，ｖｏｌ２，２４８（２００１）Ｘ．Ｌｕ等、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ２２１，９７（２００３）Ｔ．Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，２４１１−２４１９（２００２）Ａ．Ａｍａｒａ等Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ５９，４７７（２００２）

上述したようにラルストニア・ユートロファは安全性、高い生産性、安価な炭素源の利用が可能等の観点よりＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の工業的生産に最も適した宿主であると期待されている。しかしながら、低３ＨＨ組成Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産系に比べ、柔軟な性質を活かしたフィルム等への加工に適した高３ＨＨ組成Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の安全且つ安価な生産系が確立されていないため、その高生産系開発が望まれていた。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討し、アエロモナス・キャビエ由来のｐｈａＣ新規誘導体遺伝子を含む新規なポリエステル合成酵素発現プラスミドを構築した。ラルストニア・ユートロファ等の宿主にその発現プラスミドを導入した形質転換体を作製し、安価な植物油脂による単一炭素源下で培養した結果、３ＨＨ組成が１２ｍｏｌ％以上のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を高生産性にて生産できることを見出した。

すなわち、本発明は、フィルム等への加工性に優れた高３ＨＨ組成のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を製造可能なポリエステル合成酵素発現プラスミド、該プラスミドを含む高３ＨＨ組成ポリエステル合成能を有する形質転換体、および該形質転換体を使用した高３ＨＨ組成ポリエステルの安全且つ安価な製造方法に関する。

つまり、本発明は、高３ＨＨ組成ポリエステル合成酵素発現プラスミドである、ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃ＋１４９ＮＳ１７１ＤＧ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２５９）に含まれるポリエステル合成酵素発現プラスミド（Ｉ）；上記発現プラスミドを小型化したポリエステル合成酵素発現プラスミド（ＩＩ）；上記高３ＨＨ組成ポリエステル合成酵素発現プラスミドによって形質転換された形質転換体及びＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃ＋１４９ＮＳ１７１ＤＧ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２５９）；形質転換体を用いたポリエステルの製造方法に関するものである。
上記製造方法は、好ましくは、ポリエステルが下式（１）

（式中、ｍ、ｎは１以上の整数を表す）で示される、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸からなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）である、上記形質転換体を用いた高３ＨＨ組成ポリエステルの安全且つ安価な製造方法である。

以下に、本発明を詳細に説明する。
本発明のポリエステル合成酵素発現プラスミド（Ｉ）は、ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃ＋１４９ＮＳ１７１ＤＧ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２５９）に含まれるものであり、高生産性かつ高３ＨＨ組成であるＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を合成する酵素の発現プラスミドである。

発現プラスミドの作製
まず、本発明のポリエステル合成酵素発現プラスミド（Ｉ）の作製について説明する。
全体的な遺伝子操作は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，（１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。また、クローニング宿主としては、特に限定はないが、例えば大腸菌ＤＨ５α株等が挙げられる。

本発明において、ベクターとしては広宿主域ベクターの一つであるｐＪＲＤ２１５（ＡＴＣＣ３７５３３）の誘導体ｐＪＲＤｄＴｃ（ＷＯ０４／０７４４７６記載）等を用いることができる。本発現プラスミド構築に使用したベクターの配列を配列番号４に示す。
ポリエステル合成酵素遺伝子として、配列番号３に示すアエロモナス・キャビエ由来のＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ二重変異体遺伝子断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ断片として調製し、上記ベクターの同制限酵素部位に挿入して構築することができる。
なお、Ｎ１４９Ｓ変異体遺伝子及びＤ１７１Ｇ変異体遺伝子は、Ｔ．Ｋｉｃｈｉｓｅ等、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，２４１１−２４１９（２００２）に記載されている、それぞれ１４９番目のアミノ酸のアスパラギンがセリンに、１７１番目のアミノ酸のアスパラギン酸がグリシンに置換された、アエロモナス・キャビエ由来であるポリエステル合成酵素遺伝子である。
図１に、本発明のポリエステル合成酵素発現プラスミド（Ｉ）を構築する手順を示す。

ポリエステル合成酵素遺伝子としては、構造遺伝子のほかに、プロモーター、ターミネーター等、宿主菌で機能する発現ユニットを有していればよい。なお、ポリエステル合成酵素発現プラスミドには、上記発現ユニットが１個以上存在していればよく、複数個存在してもよい。
なお、本発明のＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃ＋１４９ＮＳ１７１ＤＧ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２５９）に含まれるポリエステル合成酵素発現プラスミド（Ｉ）は、本明細書中「ｐＪＲＤｄＴｃ＋１４９ＮＳ１７１ＤＧ」と表すことがある。

次に、本発明のポリエステル合成酵素発現プラスミド（ＩＩ）の作製について説明する。
本発明のポリエステル合成酵素発現プラスミド（ＩＩ）は、ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃ＋１４９ＮＳ１７１ＤＧ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２５９）に含まれるポリエステル合成酵素発現プラスミド（Ｉ）を小型化したものである。

プラスミドを小型化するには、ポリエステル合成酵素遺伝子の発現およびプラスミド複製に不要である部分を欠失させることにより行える。例えば、使用するプラスミドに抗生物質耐性遺伝子が２つ以上あるならば、そのどちらかを欠失させることができる。
本発明の発現プラスミド場合、カナマイシン耐性遺伝子あるいはストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失させることが可能であるが、ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失させることが好ましい。このように特定の遺伝子を欠失させる方法としては、制限酵素部位を利用した方法やＰＣＲによる方法を用いることができる。

また、接合伝達能力の一部または全てを欠失し、かつ、ストレプトマイシン耐性遺伝子を欠失したポリエステル合成酵素発現プラスミドも好適に用いることができる。

本発明のポリエステル合成酵素発現プラスミド（ＩＩ）は、プラスミドを小型化することにより、宿主に発現プラスミドを導入する際、形質転換率を向上させることができる。

形質転換体の作製
次に、形質転換体の作製について説明する。
本発明の形質転換体は、上記ポリエステル合成酵素発現プラスミド（Ｉ）〜（ＩＩ）のいずれかによって形質転換されたものである。つまり、本発明の形質転換体は、上記で得られたポリエステル合成酵素発現プラスミド（Ｉ）〜（ＩＩ）のいずれかを、当該プラスミドに適合する宿主中に導入することにより得られる。

宿主としては、特に制限はないが、天然から単離された微生物や、菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている微生物等を使用できる。具体的にはラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等の細菌類のポリエステル非生産菌を使用することができる。安全性及び生産性の観点から好ましくはラルストニア属であり、より好ましくはラルストニア・ユートロファであり、更に好ましくは変異剤処理又は相同組換えに基づく遺伝子破壊処理によってポリエステル合成酵素が不活性化されたラルストニア・ユートロファであり、例えばラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４株等である。ラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４株は、例えばＤＳＭＺ等の機関から入手可能である。

微生物へのポリエステル合成酵素発現プラスミドの導入は、公知の方法により行うことができる。例えば、エレクトロポレーション法（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｒｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、１巻、１．８．４頁、１９９４年）や、カルシウム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ．Ｅ．Ｍ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１９．１０７２（１９７４））等を用いることができる。

本発明の好ましい形質転換体としては、例えば、宿主としてのラルストニア・ユートロファに、ポリエステル合成酵素発現プラスミド（Ｉ）を導入した形質転換体等が挙げられる。具体的には、以下に示す形質転換体等が挙げられる。
ｐＪＲＤｄＴｃ＋１４９ＮＳ１７１ＤＧをラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４株に導入した形質転換体である、ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃ＋１４９ＮＳ１７１ＤＧ（受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−１０２５９、受託日：平成１７年２月２３日）。なお、この形質転換体は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ブダペスト条約に基づいて国際寄託されている。

Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産
次に、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産について説明する。
本発明のポリエステルの製造方法は、上記形質転換体を用いるものである。
上記ポリエステルとしては、下式（１）

（式中、ｍ、ｎは１以上の整数を表す）で示される、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸からなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）が好ましく、高３ＨＨ組成の共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）がより好ましい。

高３ＨＨ組成Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、柔軟性の良好さから、好ましくは３ＨＨユニットが８ｍｏｌ％以上且つ５０ｍｏｌ％以下であり、より好ましくは１０ｍｏｌ％以上且つ４０ｍｏｌ％以下、とりわけ１２ｍｏｌ％以上且つ３０ｍｏｌ％以下が好ましい。

Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産においては、糖、油脂または脂肪酸を炭素源として与え、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類及びそのほかの有機栄養源を含む培地を用いて、上記形質転換体を培養することができる。

例えば、ラルストニア属、アエロモナス属、エシェリキア属、アルカリゲネス属またはシュードモナス属に属する微生物等の細菌を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、微生物が資化し得る炭素源を与え、場合によっては、窒素源、無機塩類および有機栄養源のうちのいずれかを制限した培地、例えば窒素源を０．０１〜０．１％に制限した培地等を用いることができる。

糖としては、例えばグルコース、フラクトース等の炭水化物が挙げられる。
油脂としては、炭素数が１０以上である飽和・不飽和脂肪酸を多く含む油脂、例えばヤシ油、パーム油、パーム核油等が挙げられる。
脂肪酸としては、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体が挙げられる。

窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。

無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。

そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。

また、培養液中に、本発明の発現プラスミドに存在する抗生物質耐性遺伝子に対応する抗生物質（カナマイシン等）を添加しても良い。
培養温度は、その菌が生育可能な温度であればよいが、２０℃から４０℃が好ましい。培養時間は、特に制限はないが、１〜７日間程度で良い。
その後、得られた該培養菌体からＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を回収すればよい。

本発明において、菌体からのＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の回収は、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離器等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水、メタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を抽出する。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を回収する。

得られたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の重量平均分子量（Ｍｗ）や３ＨＨ組成（ｍｏｌ％）の分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行うことができる。あるいは、ポリエステル生産確認の簡易法としては、Ｎｉｌｅｒｅｄを用いた染色法を利用できる。すなわち、組換え菌が生育する寒天培地にＮｉｌｅｒｅｄを加え、組換え菌を１〜７日間培養し、組換え菌が赤変するか否かを観察することにより、ポリエステル生産の有無を確認できる。

上述したように、新規ポリエステル合成酵素発現プラスミドによるラルストニア・ユートロファの形質転換体を用いることにより、安価な植物油脂等の単一炭素源下での培養においてもフィルム状等への加工に適した高３ＨＨ組成のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を安全且つ高生産性で生産することが可能となった。

以下、実施例により本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術範囲を限定するものではない。
（実施例１）発現プラスミドの構築
高３ＨＨ組成Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産用の発現プラスミドは以下のようにして構築した。
ｐＪＲＤｄＴｃ＋１４９ＮＳ１７１ＤＧ構築用のベクターとしては、配列番号４に示されるＤＮＡでコードされるベクターを用いた。本ベクターは、ＷＯ０４／０７４４７６記載のｐＪＲＤｄＴｃと同様に構築することができる。
ポリエステル合成酵素遺伝子であるアエロモナス・キャビエ由来のＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ二重変異体遺伝子断片は、ＰＣＲ法により作成した。Ｎ１４９Ｓ変異及びＤ１７１Ｇ変異はそれぞれアエロモナス・キャビエ由来ＰＨＡ合成酵素の１４９番目のアミノ酸であるアスパラギンがセリンに、１７１番目のアミノ酸であるアスパラギン酸がグリシンに置換されている。従って、非特許文献１０に記載されているアエロモナス・キャビエ由来のＮ１４９Ｓ変異遺伝子を、一旦ｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングしておき、配列番号１と配列番号２で示される合成ＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。その条件は（１）９４℃で２分、（２）９４℃で３０秒、（３）５５℃で３０秒、（４）７２℃で２分、（２）から（４）を２５サイクル、（５）７２℃で５分であり、ポリメラーゼとしてはＬＡＴａｑポリメラーゼ（宝バイオ製）を用いた。制限酵素ＥｃｏＲＩで切断して配列番号３に示すＮ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ断片を調製し、本ベクターを同酵素で切断した部位に挿入して発現プラスミドｐＪＲＤｄＴｃ＋１４９ＮＳ１７１ＤＧを構築した。

（実施例２）形質転換体の作製
実施例１で得られた発現プラスミドを含むラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４株の形質転換体を電気パルス法により作製した。つまり、遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍのものを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌと発現プラスミド２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、形質転換体を取得した。

（実施例３）形質転換体の選択
実施例２で得られた形質転換体を、Ｎｉｌｅｒｅｄ含有培地（リン酸水素２ナトリウム・１２水塩９ｇ、リン酸２水素カリウム１．５ｇ、塩化アンモニウム０．０５ｇ、硫酸マグネシウム・７水塩０．０２ｇ、フルクトース０．５ｇ、塩化コバルト・６水塩０．２５ｐｐｍ、塩化鉄（ＩＩＩ）・６水塩１６ｐｐｍ、塩化カルシウム・２水塩１０．３ｐｐｍ、塩化ニッケル・６水塩０．１２ｐｐｍ、硫酸銅・５水塩０．１６ｐｐｍ、Ｎｉｌｅｒｅｄ０．５ｍｇ、寒天１５ｇ／１Ｌ）に播種し、３０℃で１週間培養した。その結果、コロニーが赤変したことから菌体内にポリエステルが蓄積していることを確認し、そのコロニーを選択してＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産を行った。この形質転換体は、ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃ＋１４９ＮＳ１７１ＤＧ（受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−１０２５９、受託日：平成１７年２月２３日）の名称で、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ブダペスト条約に基づいて国際寄託されている。

（実施例４）Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産および精製
種母培地の組成は１ｗ／ｖ％Ｍｅａｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２ｗ／ｖ％Ｙｅａｓｔ−ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％Ｎａ_２ＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１５ｗ／ｖ％ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ６．８とした。

前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％Ｎａ_２ＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ＫＨ_２ＰＯ_４、１．２９ｗ／ｖ％（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％パームＷオレイン油、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、１ｗ／ｖ％ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを溶かしたもの。）、５×１０^−６ｗ／ｖ％カナマイシンとした。

Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％Ｎａ_２ＰＯ_４・１２Ｈ_２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％ＫＨ_２ＰＯ_４、０・２９１ｗ／ｖ％（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．１ｗ／ｖ％ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ、１ｗ／ｖ％ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％ＮｉＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを溶かしたもの。）、０．０５ｗ／ｖ％ＢＩＯＳＰＵＲＥＸ２００Ｋ（消泡剤：コグニスジャパン製）、５×１０^−６ｗ／ｖ％カナマイシンとした。炭素源はパーム核油を分別した低融点画分であるパーム核油オレインを単一炭素源として用い、培養全般を通じ、比基質供給速度が０．０８〜０．１（油脂（ｇ））×（正味乾燥菌体重量（ｇ））^−１×（時間（ｈ））^−１となるように流加した。

ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃ＋１４９ＮＳ１７１ＤＧ形質転換体のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３０℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７〜６．８の間でコントロールしながら２８時間培養した。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。

Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）生産培養は６Ｌの生産培地を入れた１０Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ−１０００型）に前培養種母を５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量３．６Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７から６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには７％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。培養は約６０時間行い、培養終了後、遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄後、凍結乾燥し、乾燥菌体重量を測定した。

得られた乾燥菌体約１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が約３０ｍｌになるまで濃縮後、約９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）をろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の重量を測定し、菌体内含量を算出した。その結果、ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃ＋１４９ＮＳ１７１ＤＧ形質転換体のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）含量は６２時間で６６．１（ｗｔ％）という高含量であった。

（実施例５）Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨ組成分析
ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃ＋１４９ＮＳ１７１ＤＧ形質転換体により生産されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨ組成分析は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。

乾燥Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の約２０ｍｇに２ｍｌの硫酸−メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱することでＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ−１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡＢＯＮＤ−１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μｌを注入した。温度条件は、初発温度１００〜２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００〜２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、６２時間培養終了時のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の３ＨＨ組成は１４．７（ｍｏｌ％）というフィルム状への加工に適した高い３ＨＨ組成であった。

本発明の、ｐＪＲＤｄＴｃ＋１４９ＮＳ１７１ＤＧ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２５９）ポリエステル合成酵素発現プラスミドの構築図である。

Claims

ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃ＋１４９ＮＳ１７１ＤＧ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２５９）に含まれるポリエステル合成酵素発現プラスミド。
請求項１に記載のプラスミドを小型化したポリエステル合成酵素発現プラスミド。
請求項１又は２に記載のプラスミドによって形質転換された形質転換体。
宿主がポリエステル非生産性のラルストニア属である請求項３に記載の形質転換体。
宿主がポリエステル非生産性のラルストニア・ユートロファである請求項３又は４に記載の形質転換体。
宿主がラルストニア・ユートロファＰＨＢ−４株である請求項３〜５のいずれか１項に記載の形質転換体。
ＰＨＢ−４／ｐＪＲＤｄＴｃ＋１４９ＮＳ１７１ＤＧ（ＦＥＲＭＢＰ−１０２５９）である形質転換体。
請求項３〜７のいずれか１項に記載の形質転換体を用いたポリエステルの製造方法。
ポリエステルが、下式（１）

（式中、ｍ、ｎは１以上の整数を表す）で示される、３−ヒドロキシ酪酸と３−ヒドロキシヘキサン酸からなる共重合ポリエステルである請求項８に記載のポリエステルの製造方法。