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JP2009502123A - Ｓｐ３５抗体およびその使用 - Google Patents

Ｓｐ３５抗体およびその使用 Download PDF

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JP2009502123A JP2008520375A JP2008520375A JP2009502123A JP 2009502123 A JP2009502123 A JP 2009502123A JP 2008520375 A JP2008520375 A JP 2008520375A JP 2008520375 A JP2008520375 A JP 2008520375A JP 2009502123 A JP2009502123 A JP 2009502123A
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Abstract

内因性Ｓｐ３５はニューロン生存、軸索再生、稀突起神経膠細胞分化および髄鞘形成についての負のレギュレーター（負レギュレーター）である。抗Ｓｐ３５抗体のような内因性Ｓｐ３５機能をブロックする分子は、ニューロンおよび稀突起神経膠細胞機能不全の治療のための治療剤として用いることができる。本発明は、Ｓｐ３５に対して特異的な抗体、および内因性Ｓｐ３５機能のアンタゴニストとしてそのような抗体を使用する方法を提供する。本発明は、さらに、特異的なハイブリドーマおよびファージライブラリ−由来モノクローナル抗体、これらの抗体をコードする核酸、およびこれらの抗体を含むベクターおよび宿主を提供する。本発明は、さらに、有効量の抗Ｓｐ３５抗体を治療を必要とする脊椎動物に投与することを含む、脊椎動物において稀突起神経膠細胞生存および髄鞘形成を促進する方法を提供する。

Description

（発明の分野）
本発明は、神経学、神経生物学および分子生物学に関する。さらに詳しくは、本発明は、脊髄負傷のような神経学的病気、障害および負傷の治療のための分子および方法に関する。
（発明の背景）
軸索および樹状細胞はニューロンから伸びる。伸びている軸索または神経突起の遠位先端は成長円錐として知られた特殊化された領域を含む。成長円錐は、ニューロンの標的細胞への局所環境、ガイド軸索の成長を察知する。成長円錐は環境キュー、例えば、表面接着性、成長因子、神経伝達物質および電場に応答する。成長円錐は、一般には、１日当たり１〜２ミリメートルの速度で前進する。成長円錐は、ラメリポディウムおよび糸状足として分類される延長の手段によって、それより前でいずれか側の領域を探す。延長が不都合な表面と接触すると、それは撤退する。延長が好都合な成長表面と接触すると、それは延長し続け、その方向に成長円錐をガイドする。成長円錐が適当な標的細胞に到達するとシナプス結合が作り出される。
神経細胞機能はそれらの間近の環境におけるニューロンおよび他の細胞の間の接触によって影響される（非特許文献１）。これらの細胞は中枢神経系（ＣＮＳ）における特殊化された神経膠細胞、稀突起神経膠細胞、およびミエリンとで神経軸索を包む末梢神経系（ＰＮＳ）における手腕細胞を含む（非特許文献２）。
ＣＮＳニューロンは負傷の後に再生する固有の潜在能力を有するが、それはミエリンに存在する阻害性蛋白質によってそうすることから阻害される（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。
稀突起神経膠細胞で見出されるいくつかのミエリン阻害性蛋白質が特徴付けられている。ミエリン阻害性蛋白質の公知の例はＮｏｇｏＡ（非特許文献６；非特許文献７）、ミエリン会合糖蛋白質（ＭＡＧ）（非特許文献８；非特許文献９）および稀突起神経膠細胞糖蛋白質（ＯＭ−ｇｐ）（非特許文献１０）を含む。これらの蛋白質の各々はニューロンＮｏｇｏ受容体−１についてのリガンドであることが別々に知られていた（ＮｇＲ１）（非特許文献１１；非特許文献７；非特許文献６；２００２年６月２８日にオンラインで公表されたＤｏｍｅｎｉｃｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ２００２）。
Ｎｏｇｏ受容体−１（ＮｇＲ１）は、８ロイシンリッチリピートを含有するＧＰＩ−繋留膜蛋白質である（非特許文献１２）。阻害性蛋白質（例えば、（ＮｏｇｏＡ，ＭＡＧおよびＯＭ−ｇｐ）との相互作用に際してＮｇＲ１複合体がシグナルを変換し、これは、成長円錐の崩壊および神経突起形成（ｎｅｕｒｉｔｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）の阻害に導く。
ＮｇＲ１−媒介成長円錐崩壊および神経突起形成の結果としての阻害を阻害するための分子および方法に対する満足されていない要望が存在する。加えて、ニューロン生存および軸索再生を増大させる分子に対する要望がある。特に、軸索負傷に関連する病気、障害または負傷の治療については、ニューロンまたは稀突起神経膠細胞細胞死、脱髄または髄鞘脱落は一般に神経系に関する。
そのような病気、障害または負傷は、限定されるものではないが、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、中枢橋ミエリン分解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラベ病）およびウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄負傷、外傷性脳負傷、放射線後負傷、化学療法の神経学的合併症、脳卒中、急性虚血性視神経障害、ビタミンＥ欠乏症、単離ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァー−ビグナミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、およびベル麻痺を含む。これらの病気の中で、ＭＳは最も普及しており、世界中でほぼ２５０万の人々に罹っている。
ＭＳは、一般には、次いで、慢性相まで進行し、神経学的損傷を増大させる、神経学的関連の再発−緩解パターンで始まる。ＭＳは、慢性病巣に位置するミエリン、稀突起神経膠細胞および軸索の破壊に関連する。ＭＳで観察された脱髄は常には永久的ではなく、再髄鞘形成は病気の初期段階において記載されている。ニューロンの再髄鞘形成は稀突起神経膠細胞を必要とする。
種々の病気−修飾処置はＭＳについて利用可能であり、インターフェロンベータおよびＴｙｓａｂｒｉ（登録商標）のようなコルチコステロイドおよび免疫モジュレーターの使用を含む。加えて、ＭＳにおける稀突起神経膠細胞および髄鞘形成の中枢的な役割のため、稀突起神経膠細胞の数を増大させ、または髄鞘形成を増強させるための療法を開発する努力がなされてきた。例えば、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，特許文献１；非特許文献１３参照。しかしながら、ＭＳ、ならびに他の脱髄および髄鞘脱落障害についてのさらなる療法を工夫する緊急の要望が依然として存在する。
米国特許第５，５７４，００９号明細書 Ｒｕｔｉｓｈａｕｓｅｒ，ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．６８：８１９ Ｌｅｍｋｅ，１９９２，ｉｎ Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｚ．Ｈａｌｌ，Ｅｄ．，ｐ．２８１，Ｓｉｎａｕｅｒ Ｂｒｉｔｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎｅｕｒｏｎ ３０：１１−１４ Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：２７９２−２８０３ Ｇｒｉｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．：２２：３１４４−３１６０ Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０３，４３４−４３９ Ｇｒａｎｄｐｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２０００， ４０３， ４３９−４４４ ＭｃＫｅｒｒａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｅｕｒｏｎ １３：８０５−８１１ Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｅｕｒｏｎ １３：７５７−７６７ Ｍｉｋｏｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０６：１２７３−１２７９ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２００２，４１７，９４１−９４４ Ｆｏｕｒｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３４１−３４６ Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６５−７３（２００２）
本発明は、Ｓｐ３５（Ｓｐ３５は文献においてＬＩＮＧＯ−１およびＬＲＲＮ６とも命名されている）は稀突起神経膠細胞およびニューロン細胞において発現され、稀突起神経膠細胞／ニューロン分化、生存および軸索髄鞘形成を負に調節するという発見に基づく。さらに、Ｓｐ３５のあるアンタゴニストは稀突起神経膠細胞およびニューロン細胞の生存、増殖および分化、ならびにニューロンの髄鞘形成を促進する。これらの発見に基づき、本発明は、一般に、Ｓｐ３５のアンタゴニストとして用いることができる抗体、その抗原結合断片または誘導体に関する。加えて、本発明は、一般に、Ｓｐ３５アンタゴニスト抗体または抗原結合断片の投与によって、脱髄、髄鞘脱落、稀突起神経膠細胞／ニューロンの細胞死または軸索負傷に関連する種々の病気、障害または負傷を治療する方法に関する。
ある具体例において、本発明は、
Figure 2009502123
 よりなる群から選択される参照モノクローナル抗体としての、同一Ｓｐ３５エピトープに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を含む。
本発明のある具体例は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチドを含み、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は表４に示されたポリペプチド配列から選択されるか、あるいは表４に示されたポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。
本発明のある具体例は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチドを含み、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は表５に示されたポリペプチド配列から選択されるか、あるいは表５に示されたポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。
本発明のある具体例は、表６に示された配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０、および３８４よりなる群から選択される、あるいは表６に示された配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０および３８４に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチドを含む。
本発明のある具体例は、表８に示された配列番号２７３〜２８６、３７３、３７７、３８１および３８５よりなる群から選択される、あるいは表８に示された該配列番号２７３〜２８６、３７３、３７７、３８１および３８５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチドを含む。
さらなる具体例において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを含み、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は表４に示されたポリヌクレオチド配列から選択される群から選択されるか、あるいは表４に示されたポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０または９５％同一である。
ある具体例において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを含み、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は表５に示されたポリヌクレオチド配列から選択されるか、あるいは表５に示されたポリヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。
本発明の他の具体例は、表７に示された配列番号１７３〜１８４、３７０、３７４、３７８および３８２よりなる群から選択される、あるいは表７に示された該配列番号１７３〜１８４、３７０、３７４、３７８および３８２に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを含む。
本発明の他の具体例は、表９に示された配列番号１８５〜１９４、３７１、３７５、３７９および３８３よりなる群から選択される、あるいは表９に示される該配列番号１８５〜１９４、３７１、３７５、３７９および３８３に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドを含む。
ある具体例において、本発明は、本明細書中に記載される抗体または抗原結合断片を含む組成物を含む。
さらなる具体例において、本発明は、有効量の、単離されたＳｐ３５抗体、またはその断片、あるいは該抗体またはその断片を含む組成物よりなる群から選択される剤を治療を必要とする動物に投与することを含み、ＣＮＳ負傷、ＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性神経障害および脳卒中を治療する方法を含む。
本発明の１つの具体例において、本発明は、有効量の、単離されたＳｐ３５抗体またはその断片、あるいは該抗体またはその断片を含む組成物よりなる群から選択される剤を治療を必要とする動物に投与することによって、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白色質脳障害（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、中枢橋ミエリン分解（ＣＰＭ）、ウォーラー変性、副腎脳白質ジストロフィー、アレキサンダー病、およびペリツェウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）を含めた、稀突起神経膠細胞の成長または分化；ＣＮＳニューロンの脱髄または髄鞘剥離の阻害に関連する病気または障害を治療する方法を含む。
本発明の他の具体例は、ＮｇＲ１を、有効量の、単離されたＳｐ３５抗体またはその断片、あるいは該抗体またはその断片を含む組成物よりなる群から選択される剤と接触させることを含む、Ｎｏｇｏ受容体１（ＮｇＲ１）によるシグナル変換を阻害する方法を含む。
本発明のさらなる具体例は、ニューロンを、有効量の、単離されたＳｐ３５抗体またはその断片、あるいは該抗体またはその断片を含む組成物よりなる群から選択される剤と接触させることを含む、中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの軸索成長の阻害を減少させる方法を含む。
本発明の他の具体例は、ニューロンを、有効量の単離されたＳｐ３５抗体またはその断片、あるいは該抗体またはその断片を含む組成物よりなる群から選択される剤と接触させることを含む、ＣＮＳニューロンの成長円錐崩壊を阻害する方法を含む。
Ｉ．定義
用語「ある」の存在はその存在の１以上をいうことは注意されるべきである；例えば、「あるＳｐ３５抗体」は、１以上のＳｐ３５抗体を表すと理解される。それ自体、用語「ある」、「１以上」および「少なくとも１つ」は本明細書中においては相互交換可能に用いることができる。
本明細書中で用いるように、用語「ポリペプチド」は単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド類」を含むことを意図し、（ペプチド結合としても知られた）アミノ結合によって直線状に連結されたモノマー（アミノ酸）から構成された分子をいう。用語「ポリペプチド」とは２以上のアミノ酸のいずれかの鎖または鎖類をいい、特定の長さの産物を言わない。かくして、ポリペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「蛋白質」、「アミノ酸鎖」、または２以上のアミノ酸の鎖または鎖類をいうのに用いられるいずれの他の用語も「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」はこれらの用語のいずれかの代わりに、またはそれと相互交換可能に用いることができる。用語「ポリペプチド」は、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、蛋白質分解、天然に生じないアミノ酸による修飾を含めた、ポリペプチドの発現後修飾の産物をいうことも意図する。ポリペプチドは天然の生物学的源から誘導できるか、あるいは組み換え技術によって生産できるが、示された核酸配列から必ずしも翻訳されない。それは、化学合成によることを含めた、いずれの方法でも作製することができる。
本発明のポリペプチドは約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、または２，０００以上のサイズであってよい。ポリペプチドは規定された三次元構造を有することができるが、それはそのような構造を必ずしも有しない。規定された三次元構造を持つポリペプチドは折り畳まれているといわれるが、規定された三次元構造を保有しないポリペプチドは、むしろ、非常に多数の異なる立体配座を採ることができ、折り畳まれていないという。本明細書中で用いるように、用語糖蛋白質とは、アミノ酸残基、例えば、セリン残基またはアスパラギン残基の酸素−含有または窒素−含有側鎖を介して蛋白質に結合した少なくとも１つの炭水化物部位にカップリングされた蛋白質をいう。
「単離された」ポリペプチド、またはその断片、改変体または誘導体とは、その天然媒体中にないポリペプチドが意図される。特定レベルの精製は、必要ではない。例えば、単離されたポリペプチドはその天然または天然環境から取り出すことができる。組換えにより生産されたポリペプチドおよび宿主細胞で発現された蛋白質は、いずれかの適当な技術によって分離され、分別され、または部分的にまたは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドのように、本発明の目的では単離されていると考えられる。
本発明のポリペプチドとしてやはり含まれるのは、これまでのポリペプチドの断片、誘導体、アナログ、または改変体、およびそのいずれかの組合せである。用語「断片」、「改変体」、「誘導体」および「アナログ」は、本発明のＳｐ３５抗体または抗体ポリペプチドをいう場合、対応する天然抗体またはポリペプチドの抗原結合特性の少なくともいくつかを保有するいずれのポリペプチドも含む。本発明のポリペプチドの断片は、本明細書中の他の箇所で議論された具体的な抗体断片に加えて、蛋白質分解断片、ならびに欠失断片を含む。Ｓｐ３５抗体の改変体、および本発明の抗体ポリペプチドは前記した断片および、やはり、アミノ酸の置換、欠失または挿入のため変化したアミノ酸配列を持つポリペプチドも含む。改変体は天然に生じるものであってよく、あるいは天然に生じないものであってよい。天然に生じない改変体は当該分野で知られた突然変異誘発技術を用いて生産することができる。改変体ポリペプチドは、保存的または非保存的アミノ酸の置換、欠失または負荷を含むことができる。Ｓｐ３５抗体の誘導体、および本発明の抗体ポリペプチドは、天然ポリペプチドでは見い出されないさらなる特徴を呈するように改変されたポリペプチドである。その例は融合蛋白質を含む。改変体ポリペプチドは、本明細書中においては、「ポリペプチドアナログ」ともいうことができる。本明細書中で用いるようにＳｐ３５抗体または抗体ポリペプチドの「誘導体」とは、機能的側鎖の反応によって化学的に誘導体化された１以上の残基を有する主題のポリペプチドをいう。また、「誘導体」としてやはり含まれるのは、２０の標準アミノ酸の１以上の天然に生じるアミノ酸誘導体を含有するポリペプチドである。例えば、４−ヒドロキシプロリンはプロリンを置き換えることができ；５−ヒドロキシリジンはリジンを置き換えることができ；３−メチルヒスチジンはヒスチジンを置き換えることができ；ホモセリンはセリンを置き換えることができ；およびオルニチンはリジンを置き換えることができる。
用語「ポリヌクレオチド」は、単数核酸ならびに複数核酸を含むことを意図し、単離された核酸分子または構築体、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）をいう。ポリヌクレオチドは慣用的なホスホジエステル結合または非慣用的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）で見出されるようなアミド結合）を含むことができる。用語「核酸」とはいずれかの１以上の核酸セグメント、例えば、ポリヌクレオチドに存在するＤＮＡまたはＲＮＡ断片をいう。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドはその天然環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクターに含有されるＳｐ３５抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的では単離されている。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例は、異種宿主細胞に維持された組換えポリヌクレオチド、または溶液中の（部分的にまたは実質的に）精製されたポリヌクレオチドを含む。単離されたＲＮＡ分子は、本発明のポリヌクレオチドのイン・ビボまたはイン・ビトロＲＮＡ転写体を含む。本発明による単離されたポリヌクレオチドまたは核酸は、さらに、合成より生産されたそのような分子を含む。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターのような調節エレメントであってよく、またはそれを含むことができる。
本明細書中で用いるように、「コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されたコドンよりなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、それはコーディング領域の一部と考えることができるが、いずれかのフランキング配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどはコーディング領域の一部ではない。本発明の２以上のコーディング領域は単一のポリヌクレオチド構築体に、例えば、単一のベクター上に、あるいは別々のポリヌクレオチド構築体に、例えば、（別々の異なる）ベクター上に存在させることができる。さらに、いずれのベクターも単一のコーディング領域を含有することができ、あるいは２以上のコーディング領域を含むことができ、例えば、単一のベクターは別々に免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードすることができる。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、または核酸は、Ｓｐ３５抗体をコードする核酸、またはその断片、改変体または誘導体に融合したまたは融合していない異種コーディング領域をコードすることができる。異種コーディング領域は、限定されるものではないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能的ドメインのような特殊化されたエレメントまたはモチーフを含む。
ある具体例において、ポリヌクレオチドまたは核酸はＤＮＡである。ＤＮＡの場合には、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１以上のコーディング領域と作動可能に会合したプロモーターおよび／または他の転写または翻訳制御エレメントを含むことができる。操作可能な会合は、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドについての領域をコードする場合、遺伝子産物の発現を調節配列の影響または制御下に置くように１以上の調節配列と会合する。（ポリペプチドコーディング領域およびそれと会合したプロモーターのような）２つのＤＮＡ断片は、もしプロモーター機能の誘導の結果、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写がもたらされるならば、およびもし２つのＤＮＡ断片の間の連鎖の性質が遺伝子産物の発現を指令する発現調節配列の能力に干渉しない、または転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力に干渉されないならば、「作動可能に連結」されている。かくして、もしプロモーターがその核酸の転写を行うことができるならば、プロモーターはポリペプチドをコードする核酸に作動可能に会合しているであろう。プロモーターは、所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的転写を指令する細胞−特異的プロモーターであり得る。プロモーター以外に、他の転写制御エレメント、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終止シグナルはポリペプチドと作動可能に会合して、細胞−特異的転写を指令することができる。適当なプロモーターおよび他の転写制御領域は本明細書中に開示される。
種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらは、限定されるものではないが、サイトメガロウィルス（イントロン−Ａと組み合わされた即時型プロモーター）、シミアンウィルス４０（初期プロモーター）、および（ラウス肉腫ウィルスのような）レトロウィルスからのプロモーターおよびエンハンサーセグメントのような、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域を含む。他の転写制御領域は、アクチン、熱ショック蛋白質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβ−グロビン、グロビンのような脊椎動物遺伝子に由来するもの、ならびに真核生物細胞において遺伝子発現を制御することができる他の配列を含む。さらなる適当な転写制御領域は組織−特異的プロモーターおよびエンハンサーならびにリンホカイン−誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）を含む。
同様に、種々の転写制御エレメントは当業者に知られている。これらは、限定されるものではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および終止コドン、およびピコルナウィルスに由来するエレメント（特に、ＣＩＴＥ配列とも言われる内部リボソームエントリー部位、またはＩＲＥＳ）を含む。
他の具体例において、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態のＲＮＡである。
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸コーディング領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指令する分泌またはシグナルペプチドをコードするさらなるコーディング領域と会合することができる。シグナル仮説によると、哺乳動物細胞によって分泌される蛋白質は、一旦粗い小胞体を横切る成長する蛋白質鎖の輸出が開始されたならば、成熟蛋白質から切断されたシグナルペプチドまたは分泌リーダー配列を有する。当業者であれば、脊椎動物細胞によって分泌されたポリペプチドは一般には、完全なまたは「全長」ポリペプチドから切断されて、ポリペプチドの分泌されたまたは「成熟」形態を生じさせる、ポリペプチドのＮ−末端に融合したシグナルペプチドを有することを認識する。ある具体例において、天然シグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチドを用い、あるいは作動可能にそれと会合するポリペプチドの分泌を指令する能力を保有するその配列の機能的誘導体を用いる。別法として、異種哺乳動物シグナルペプチド、またはその機能的誘導体を用いることができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼで置換することができる。
本発明はある種のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体に向けられる。そのような天然に生じる抗体のような全−サイズ抗体に具体的に言及するのでなければ、用語「Ｓｐ３５抗体」は全−サイズ抗体ならびにそのような抗体の抗原結合断片、改変体、アナログ、または誘導体、例えば、天然に生じる抗体または免疫グロブリン分子、あるいは抗体分子と同様に抗原に結合する作製された抗体分子または断片を含む。
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は本明細書中においては相互交換可能に用いる。抗体または免疫ブロブリンは重鎖の少なくとも可変ドメインを含み、通常、重鎖および軽鎖の少なくとも可変ドメインを含む。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリン構造は比較的よく理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）参照。
以下でより詳細に議論されるように、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に区別できるポリペプチドの種々の広いクラスを含む。当業者であれば、重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）として分類され、その中にいくつかのサブクラスがある（例えば、γ１〜γ４）。各々、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥとして抗体の（クラス）を決定するのはこの鎖の性質である。免疫グロブリンサブクラス（イソタイプ）例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１等はよく特徴付けられており、機能的な特殊化を与えることが知られている。これらのクラスおよびイソタイプの各々の修飾されたバージョンは、本開示に鑑みて当業者に容易に認識でき、従って、本発明の範囲内にある。全ての免疫グロブリンクラスは本発明の範囲内に明らかにあり、以下の議論は、一般には、免疫グロブリン分子のＩｇＧクラスに向けられる。ＩｇＧに関しては、標準的な免疫グロブリン分子がほぼ２３，０００ダルトンの分子量の２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および５３，０００〜７０，０００の分子量の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。４つの鎖は、典型的には、「Ｙ」立体配置にてジスルフィド結合によって連結され、ここで、軽鎖は重鎖に囲まれて、「Ｙ」の口で出発し、可変領域を通じて継続する。
軽鎖はカッパまたはラムダ（κ，λ）として分類される。各重鎖クラスはカッパまたはラムダ軽鎖と結合することができる。一般に、軽鎖および重鎖は相互に共有結合され、２つの重鎖の「テイル」部分は、免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子工学により作製された宿主細胞いずれかによって生じる場合、ジスルフィド共有結合または非共有結合によって相互に結合される。重鎖においては、アミノ酸配列はＹ立体配置のフォーク型端部におけるＮ−末端から各鎖の底におけるＣ−末端まで延びる。
軽鎖および重鎖は共に構造および機能のホモロジーの領域に分けられる。用語「定常」および「可変」は機能的に用いられる。この点に関し、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）鎖の双方の部分の可変ドメインは抗原の認識および特異性を決定することが認識されよう。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、トランスプラセンタル移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などのような重要な生物学的特性を付与する。約束により、定常領域ドメインのナンバリングは、それが抗体の抗原結合の部位またはアミノ末端からより離れるに従って増大する。Ｎ−末端部分は可変領域であり、Ｃ−末端部分では定常領域であり；ＣＨ３およびＣＬドメインは、現実には、各々、重鎖および軽鎖のケルボキシ−末端を含む。
前記で示したように、可変ドメインは抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、それに特異的に結合するのを可能とする。すなわち、抗体の、ＶＬドメインおよびＶＨドメイン、または相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットは、組み合わせられて、可変領域を形成し、これは、３次元抗原結合部位を規定する。この第４の抗体特徴は、Ｙの各腕の端部に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨおよびＶＬ鎖の各々上の３つのＣＤＲによって規定される。いくつかの例において、例えば、ラクダ種に由来する、またはラクダ免疫グロブリンに基づいて作製されたある免疫グロブリン分子においては、完全な免疫グロブリン分子は重鎖のみからなることができ、軽鎖は持たない。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−４４８（１９９３）参照。
天然に生じる抗体においては、各抗原結合ドメインに存在する６つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」はアミノ酸の短い連続的でない配列であり、それは特異的に位置して、抗体が水性環境においてその３次元立体配置を採るにつれて、抗原結合ドメインを形成する。「フレームワーク」領域と言われる抗原結合ドメインにおけるアミノ酸の残りはより低い分子間可変性を示す。フレームワーク領域はほとんどがβ−シート立体配座を採り、ＣＤＲは、結合し、いくつかの場合には、β−シート構造の一部を形成するループを形成する。かくして、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合相互作用によって正しい向きにＣＤＲを位置決定する足場を形成するように働く。位置決定されたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対する表面の相補性を規定する。この相補的な表面は、その同族エピトープへの抗原の非共有結合を促進する。各々、ＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むアミノ酸は、当業者によって、いずれかの与えられた重鎖または軽鎖可変領域について容易に同定され得る。というのは、それらは、正確に規定されているからである。（例えば、ここで引用してその全体を援用する、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈｅ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；ａｎｄ Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）参照）。
当該分野において用いられ、および／または許容される用語の２以上の定義がある場合、本明細書中で用いる用語の定義は、明示的に反対の事が述べられるのでなければ、全てのそのような意味を含むことを意図する。具体的な例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの可変領域内で見出される非連続アミノ酸組合せ部位を記載するための用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特別な領域は、ここで引用して援用する、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）、およびＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって記載されており、ここで、定義は、相互に対して比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにも拘わらず、抗体のＣＤＲまたはその改変体を言うためのいずれかの定義の適用は、本明細書中で定義され、用いられる用語の範囲内にあることを意図する。前記引用文献の各々によって定義されるＣＤＲを含む適当なアミノ酸残基は、比較として、以下に表１に記載される。特定のＣＤＲを含む正確な残基の数は、ＣＤＲの配列およびサイズに依存して変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、いずれの残基が特定のＣＤＲを含むかをルーチン的に決定することができる。
Figure 2009502123
 Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．は、いずれの抗体にも適用できる種々のドメイン配列についてのナンバリングシステムを定義した。当業者であれば、配列それ自身を超えるいずれの実験データに頼ることなく、「Ｋａｂａｔナンバリング」のこのシステムをいずれの可変ドメイン配列にも明瞭に割り当てることができる。本明細書中で用いるように、「Ｋａｂａｔナンバリング」とは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９８３）によって記載されたナンバリングシステムをいう。特に断りのない限り、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片改変体、またはその誘導体における特異的アミノ酸残基位置のナンバリングに対する言及はＫａｂａｔナンバリングシステムによる。
ラクダ種においては、ＶＨＨという重鎖可変領域は、完全な抗原結合ドメインを形成する。ラクダＶＨＨ可変領域および慣用的な抗体（ＶＨ）の間の主な差は（ａ）ＶＨＨにおける対応する領域と比較してＶＨの軽鎖接触表面におけるより疎水性のアミノ酸、（ｂ）ＶＨＨにおけるより長いＣＤＲ３、および（ｃ）ＶＨＨ中のＣＤＲ１およびＣＤＲ３の間のジスルフィド結合の頻繁な発生を含む。
本発明の抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、多特異的、ヒト、ヒト化、霊長類化、またはキメラ抗体、単一鎖抗体、エピトープ−結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖｓ、単一鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）単一鎖抗体、ジスルフィド−結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＬまたはＶＨいずれかのドメインを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生じた断片、および（例えば、本明細書中に開示されたＳｐ３５抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含めた）抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体を含む。ＳｃＦｖ分子は当該分野で知られており例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載されている。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、免疫グロブリン分子のいずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものでもあり得る。
単一鎖抗体を含めた抗体断片は、単独で、または以下の全部または部分：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインと組み合わせた可変領域を含むことができる。また、本発明には、やはり、ヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメインと可変領域とのいずれかの組合せを含む抗原結合断片が含まれる。本明細書中に開示された診断および治療方法で用いられる抗体またはその免疫特異的断片は、鳥類および哺乳動物を含めたいずれの動物起源からのものであってもよい。好ましくは、抗体はヒト、マウス、ラバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、リャマ、ウマ、またはニワトリ抗体である。もう１つの具体例において、可変領域は起源が（例えば、サメからの）コンドリクトイド（ｃｏｎｄｒｉｃｔｈｏｉｄ）のものであってよい。本明細書中で用いるように、（ヒト）抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、後に記載され、例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．によって米国特許第５，９３９，５９８号に記載されたような、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、または１以上のヒト免疫グロブリンにとってはトランスジェニックな、内因性免疫ブログリンを発現しない動物から単離された抗体を含む。
本明細書中で用いるように、用語「重鎖部分」は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは：ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上方、中央、および／または下方ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはその改変体または断片の少なくとも１つを含む。例えば、本発明で用いられる結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、あるいはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含むことができる。もう１つの具体例において、本発明のポリペプチドはＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明で用いる結合ポリペプチドはＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠如してもよい。前記したように、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）は、それらがアミノ酸配列が天然に生じる免疫ブログリン分子から変化するように修飾することができるのは当業者に理解されるであろう。
あるＳｐ３５抗体、または本明細書中に開示されるその抗原結合断片、改変体または誘導体において、マルチマーの１つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、マルチマーの第２のポリペプチド鎖上のものと同一である。あるいは、本発明の重鎖部分−含有モノマーは同一でない。例えば、各モノマーは、例えば、二特異的抗体を形成する異なる標的結合部位を含むことができる。
本明細書中で開示された診断および治療方法で用いられる結合ペプチドの重鎖部分は、異なる免疫グロブリン分子に由来することができる。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメイン、およびＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。もう１つの例において、重鎖部分は、部分的にはＩｇＧ１分子から、および部分的には、ＩｇＧ３分子から由来するヒンジ領域を含むことができる。もう１つの例において、重鎖部分は、部分的には、ＩｇＧ１分子から、および部分的には、ＩｇＧ４分子から由来するキメラヒンジを含むことができる。
本明細書中で用いるように、用語「軽鎖部分」は、免疫グロブリン軽鎖に由来するアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖部分はＶＬまたはＣＬドメインの少なくとも１つを含む。
本明細書中で開示されるＳｐ３５抗体、あるいはその抗原結合断片、改変体または誘導体は、抗原のエピトープまたは部分、例えば、それらが認識し、または特異的に結合する標的ポリペプチド（Ｓｐ３５）の項目で記載され、または特定することができる。抗体の抗原結合ドメインと特異的に相互作用する標的ポリペプチドの部分は、「エピトープ」または「抗原決定基」である。標的ポリペプチドは単一のエピトープを含むことができるが、典型的には、少なくとも２つのエピトープを含み、抗原のサイズ、立体配座およびタイプに応じて、いずれかの数のエピトープを含むことができる。さらに、標的ポリペプチド上の「エピトープ」は、非ポリペプチドエレメントであってよく、またはそれを含むことができ、例えば、「エピトープ」は炭水化物側鎖を含むことができるのは注意すべきである。
抗体についてのペプチドまたはポリペプチドエピトープの最小サイズは、約４〜５アミノ酸であると考えられる。ペプチドまたはポリペプチドは好ましくは少なくとも７、より好ましくは少なくとも９、最も好ましくは少なくとも約１５〜約３０の間のアミノ酸を含有する。ＣＤＲはその第３の形態の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを認識できるので、エピトープを含むアミノ酸は連続的である必要はなく、いくつかの場合には、同一ペプチド鎖上にさえなくてもよい。本発明においては、本発明のＳｐ３５抗体によって認識されるペプチドまたはポリペプチドエピトープは、Ｓｐ３５の少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、より好ましくは少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、または約１５〜約３０の間の連続または非連続アミノ酸の配列を含有する。
「特異的に結合する」とは、抗体がその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合すること、および結合が抗原結合ドメインおよびエピトープの間でいくらか相補性を含むことを一般には意味する。この定義に従うと、抗体は、それが、ランダムな無関係なエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介してそのエピトープに結合する場合、エピトープに「特異的に結合する」といわれる。用語「特異性」は、本明細書中においては、ある抗体があるエピトープに結合する相対的親和性を定量するのに用いられる。例えば、抗体「Ａ」は、抗体「Ｂ」よりも与えられたエピトープに対してより高い特異性を有するとみなすことができ、あるいは抗体「Ａ」は、それが関連エピトープ「Ｄ」に対して有するよりも高い特異性で、エピトープ「Ｃ」に結合するということができる。
「優先的に結合する」とは、抗体が、それが関連する、同様な、相同な、または類似のエピトープに結合するであろうよりも容易にエピトープに特異的に結合することを意味する。かくして、与えられたエピトープに「優先的に結合する」抗体は、そのような抗体が関連エピトープと交差反応できるにも拘わらず、関連するエピトープに対するよりもそのエピトープにより結合するであろう。
非限定的例として、抗体は、もしそれが、第２のエピトープについての抗体のＫＤよりも低い解離定数（ＫＤ）でもって第１のエピトープに結合するならば、第１のエピトープに優先的に結合すると考えることができる。もう１つの非限定的な例において、抗体は、もしそれが、第２のエピトープに対する抗体のＫＤよりも少なくとも一桁低い親和性でもって第１のエピトープに結合するならば、第１の抗原に優先的に結合すると考えることができる。もう１つの非限定的例において、抗体は，もしそれが、第２のエピトープについての抗体のＫＤよりも少なくとも二桁低い親和性でもって第１のエピトープに結合するならば、第１のエピトープに優先的に結合すると考えることができる。
もう１つの非限定的例において、抗体は、もしそれが、第２のエピトープに対する抗体のｋ（オフ）よりも小さなオフ速度（ｋ（オフ））でもって第１のエピトープに結合するならば、第１のエピトープに優先的に結合すると考えることができる。もう１つの非限定的例において、抗体は、もしそれが、第２のエピトープについての抗体のｋ（オフ）よりも少なくとも一桁大きさが小さい親和性でもって第１のエピトープに結合するならば、第１のエピトープに優先的に結合すると考えることができる。もう１つの非限定的例において、抗体は、もしそれが、第２のエピトープについての抗体のｋ（オフ）よりも少なくとも二桁大きさが小さな親和性でもって第１のエピトープに結合するならば、第１のエピトープに優先的に結合すると考えることができる。
本明細書中に開示された抗体、あるいは抗原結合断片、改変体、または誘導体は、５Ｘ１０−２ｓｅｃ−１、１０−２ｓｅｃ−１、５Ｘ１０−３ｓｅｃ−１または１０−３ｓｅｃ−１よりも小さな、またはそれと等しいオフ速度（ｋ（オフ））でもって本明細書中で開示された標的ポリペプチドまたはその断片または改変体に結合するということができる。好ましくは、本発明の抗体は、５Ｘ１０−４ｓｅｃ−１、１０−４ｓｅｃ−１、５Ｘ１０−５ｓｅｃ−１、または１０−５ｓｅｃ−１５Ｘ１０−６ｓｅｃ−１、１０−６ｓｅｃ−１、５Ｘ１０−７ｓｅｃ−１または１０−７ｓｅｃ−１よりも小さな、またはそれと等しいオフ速度（ｋ（オフ））でもって本明細書中で開示された標的ポリペプチドまたはその断片またはその改変体に結合するということができる。
本明細書中に開示された抗体、あるいは抗原結合断片、改変体、または誘導体は、１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、５Ｘ１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１または５Ｘ１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１よりも大きなまたはそれと等しい速度（ｋ（オン））でもって本明細書中で開示された標的ポリペプチド、またはその断片または改変体に結合するということができる。より好ましくは、本発明の抗体は、１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、５Ｘ１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１、または５Ｘ１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１または１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１よりも大きなまたはそれと同等な速度（ｋ（オン））でもって本明細書中で開示された標的ポリペプチド、またはその断片または改変体に結合するということができる。
抗体は、もしそれが、それがエピトープへの参照抗体の結合を有る程度ブロックする程度までそのエピトープに優先的に結合するならば、与えられたエピトープへの参照抗体の結合を競合的に阻害するといわれる。競合阻害は、当該分野で知られたいずれかの方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって決定することができる。抗体は、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％だけ、与えられたエピトープへの参照抗体の結合を競合的に阻害するということができる。
本明細書中で用いるように、用語「親和性」とは、同一のエピトープと免疫グロブリン分子のＣＤＲとの結合の強さの尺度をいう。例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．１９８８）ａｔ ｐａｇｅｓ ２７−２８参照。本明細書中で用いるように用語「親和力」とは、免疫ブログリンの集団および抗原の間の複合体の総じての安定性、すなわち、抗原との免疫ブロブリン混合物の機能的組合せ強度をいう。例えば、Ｈａｒｌｏｗの２９〜３４頁参照。親和力は、特異的なエピトープを持つ集団における個々の免疫グロブリン分子の親和性、および免疫グロブリンおよび抗原の価数双方に関連する。例えば、二価モノクローナル抗体、およびポリマーのような硬度に反復するエピトープ構造を持つ抗原の間の相互作用は高親和力の一種である。
本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体もまた、それらの交差−反応性の点について記載でき、または特定できる。本明細書中で用いるように、用語「交差−反応性」とは、第二の抗原と反応する、１つの抗原に対して特異的な抗体の能力をいう；２つの異なる抗原性物質の間の関連性の尺度。かくして、抗体は、もしそれがその形成を誘導した以外のエピトープに結合するならば、交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般には、誘導エピトープとして同一の相補性構造特徴の多くを含有し、いくつかの場合、元来のものよりも現実には良好にフィットすることができる。
例えば、ある抗体は、それらが関連するが同一でないエピトープ、例えば、参照エピトープに対して（当該分野で知られ、かつ本明細書中に記載された方法を用いて計算して）少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％同一性を持つエピトープに結合する点において、ある程度の交差−反応性を有する。抗体は、もしそれが、参照エピトープに対して（当該分野で知られ、かつ本明細書中において記載された方法を用いて計算して）９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満の同一性を持つエピトープに結合しないならば、ほとんどまたは全く交差−反応性を有しないと言うことができる。抗体は、もしそれがそのエピトープのいずれかの他のアナログ、オルソログ、またはホモログに結合しないならば、あるエピトープに対して「高度に特異性」とみなすことができる。
本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体は、本発明のポリペプチドに対するそれらの結合親和性の点でやはり記載でき、または特定することができる。好ましい結合親和性は、
Figure 2009502123
 未満の解離定数またはＫｄを持つものを含む。
本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体は「多特異的」、例えば、二特異的、三特異的、またはより大きな多特異性のものであってよく、これは、それが、同時に、１以上の異なる抗原（例えば、蛋白質）に存在する２以上の異なるエピトープに結合することを意味する。かくして、Ｓｐ３５抗体は「一特異的」または「多特異的」、例えば、「二特異的」であるか否かは、結合ポリペプチドが反応する異なるエピトープの数をいう。多特異的抗体は、本明細書中に記載された標的ポリペプチドの異なるエピトープに対して特異的であってよく、あるいは標的ポリペプチドに対して、ならびに異種ポリペプチドまたは固体支持体材料のような異種エピトープに対して特異的であってよい。
本明細書中で用いるように、用語「価数」とは、Ｓｐ３５抗体、結合ポリペプチドまたは抗体に存在する、潜在的結合ドメイン、例えば、抗原結合ドメインの数をいう。各結合ドメインは、１つのエピトープに特異的に結合する。Ｓｐ３５抗体、結合ポリペプチドまたは抗体が１を超える結合ドメインを含む場合、各結合ドメインは、「二価一特異的」といわれる２つの結合ドメインを持つ抗体については、同一エピトープに特異的に結合でき、あるいは「二価二特異的」といわれる２つの結合ドメインを持つ抗体については、異なるエピトープに特異的に結合できる。抗体は各特性に対して二特異的および二価であってもよい（「二特異的四価抗体」という）。もう１つの具体例において、四価ミニボディまたはドメイン欠失抗体を作成することができる。
二特異的二価抗体、およびそれらを作成する方法は、例えば、その全ての開示をここで引用して援用する、米国特許第５，７３１，１６８号、第５，８０７，７０６号、第５、８２１、３３３号；および米国特許出願公開番号２００３／０２０７３４および２００２／０１５５５３７に記載されている。二特異的四価抗体、およびそれらを作成する方法は、例えば、その双方の開示をここで引用して援用する、ＷＯ ０２／０９６９４８およびＷＯ ００／４４７８８に記載されている。一般に、ＰＣＴ公開ＷＯ ９３／１７７１５；ＷＯ ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Ｔｕｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９（１９９１）；米国特許第４，４７４，８９３号、第４，７１４，６８１号、第４，９２５、６４８号、第５，５７３，９２０号、第５，６０１，８１９号；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３（１９９２）参照。
先に示したように、種々の免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元立体配置がよく知られている。本明細書中で用いるように、用語「ＶＨドメイン」は免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、用語「ＣＨ１ドメイン」は免疫グロブリン重鎖の最初の（最もアミノ酸末端の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端側である。
本明細書中で用いるように、用語「ＣＨ２ドメイン」は、慣用的なナンバリングシステムを用いて、例えば、抗体の約残基２４４から残基３６０へ伸びる重鎖分子の部分を含む（残基２４４〜３６０、Ｋａｂａｔナンバリングシステム；および残基２３１にし３４０、ＥＵナンバリングシステム；Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．ｏｐ．ｃｉｔ参照）。ＣＨ２ドメインは、それがもう１つのドメインと密接に対合しない点でユニークである。むしろ、２つのＮ−結合分岐炭水化物鎖は無傷天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメインの間に位置する。また、ＣＨ３ドメインがＩｇＧ分子のＣＨ２ドメインからＣ−末端まで伸び、ほぼ１０８の残基を含むのもよく記載されている。
本明細書中で用いるように、用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連接する重鎖分子の一部を含む。このヒンジ領域はほぼ２５残基を含み、フレキシブルであり、かくして、２つのＮ−末端抗原結合領域を独立して移動させる。ヒンジ領域は３つの区別されるドメイン：上方、中央、および下方ヒンジドメインに小分けすることができる（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３（１９９８））。
本明細書中で用いるように、用語「ジスルフィド結合」は、２つの硫黄原子の間で形成された共有結合を含む。アミノ酸システインは、第二のチオール基とでジスルフィド結合またはブリッジを形成することができるチオール基を含む。ほとんどの天然に生じるＩｇＧ分子においては、ＣＨ１およびＣＬ領域はジスルフィド結合によって連結され、２つの重鎖は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを用いて２３９および２４２（位置２２６または２２９、ＥＵナンバリングシステム）に対応する位置において２つのジスルフィド結合によって連結される。
本明細書中で用いるように、用語「キメラ抗体」は、免疫反応性領域または部位が第一の種から得られ、またはそれに由来し、（本発明に従って無傷、部分的、または修飾されていてもよい）定常領域が第二の種から得られるいずれの抗体も意味する。好ましい具体例において、標的結合領域または部位が非ヒト源（例えば、マウスまたは霊長類）からのものであり、定常領域はヒトである。
本明細書中で用いるように、用語「作成された抗体」とは、重鎖および軽鎖のいずれかにおける、または双方における可変ドメインが、公知の特異性の抗体からの１以上のＣＤＲの少なくとも部分的置換によっておよび、もし必要であれば、部分的フレームワーク領域置換および配列変換によって改変された抗体をいう。ＣＤＲは、フレームワーク領域が由来する抗体と同一のクラスまたはサブクラスさえの抗体に由来し得るが、ＣＤＲは異なるクラスの抗体から、好ましくは、異なる種からの抗体から由来すると考えられる。既知の特異性の非ヒト抗体からの１以上の「ドナー」ＣＤＲがヒト重鎖または軽鎖フレームワーク領域にグラフトされた作成された抗体は、本明細書中においては、「ヒト化抗体」という。ＣＤＲの全てを、ドナー可変領域からの完全なＣＤＲで置き換えて、１つの可変ドメインの抗原結合能力をもう１つのドメインに移す必要はないであろう。むしろ、標的結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移す必要があるに過ぎないであろう。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、および第６，１８０，３７０号に記載された説明を仮定すると、ルーチン的実験を行うことによって、または試行錯誤テストによって、機能的な作成されたまたはヒト化抗体を得るのは十分に当業者の能力内のものであろう。
本明細書中で用いるように、用語「適切に折り畳まれたポリペプチド」は、ポリペプチドを含む機能的ドメインの全てが顕著に活性であるポリペプチド（例えば、Ｓｐ３５抗体）を含む。本明細書中で用いるように、用語「不適切に折り畳まれたポリペプチド」は、ポリペプチドの機能的ドメインの少なくとも１つが活性でないポリペプチドを含む。１つの具体例において、適切に折り畳まれたポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合によって連結されたポリペプチド鎖を含む、逆に、不適切に折り畳まれたポリペプチドは、少なくとも１つのジスルフィド結合による連結されないポリペプチド鎖を含む。
本明細書中で用いるように、用語「作成された」は、合成手段によって、（例えば、組換え技術、イン・ビトロペプチド合成による、ペプチドの酵素的または「化学的カップリング、またはこれらの技術のいくつかの組合せによる」核酸またはポリペプチド分子の操作を含む。
本明細書中で用いるように、用語「連結された」、「融合された」または「融合」は相互交換可能に用いられる。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含めたいずれの手段によっても、さらに２つのエレメントまたは成分を一緒に連接させることをいう。「イン−フレーム融合」とは、２以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を連接させて、元のＯＲＦの正しい翻訳リーディングフレームを維持するように連続したより長いＯＲＦを形成することをいう。かくして、組換え融合蛋白質が、（そのセグメントは通常は天然にてそのようには連接されていない）元のＯＲＦによってコードされたポリペプチドに対応する２以上のセグメントを含有する単一蛋白質である。リーディングフレームは、かくして、融合したセグメント全体で連続とされているが、セグメントは、例えば、イン−フレームリンカー配列によって物理的にまたは空間的に分離され得る。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドはイン−フレームで融合できるが、「融合された」ＣＤＲが連続したポリペプチドの一部として同時翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域またはさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって分離され得る。
ポリペプチドの関係では、「線状配列」または（配列）は、配列中にて相互に隣接する残基がポリペプチドの一次構造において連続するアミノ〜カルボキシル末端方向のポリペプチドにおけるアミノ酸の順序である。
用語「発現」は、本明細書中で用いるように、遺伝子が生化学的な、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを生じるプロセスをいう。該プロセスは、限定されるものではないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現および安定な発現双方を含めた、細胞内の遺伝子の機能的な存在のいずれかの発現を含む。それは、限定されるものではないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはいずれかの他のＲＮＡ産物への遺伝子の転写、およびそのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含む。もし最終の所望の産物が生化学的であれば、発現はその生化学的およびいずれかの前駆体の創生を含む。遺伝子の発現は「遺伝子産物」を生じる。本明細書中で用いるように、遺伝子産物は、遺伝子の転写によって生じた核酸、例えば、メッセンジャーＲＮＡまたは転写体から翻訳されたポリペプチドいずれかであり得る。本明細書中で記載された遺伝子産物は、さらに、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を持つ核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他の蛋白質サブユニットとの会合、蛋白質分解切断等を持つポリペプチドを含む。
本明細書中で用いるように、用語「処置する」または「処置」とは、治療的処置および予防的または予防手段を共にいい、ここで、目的は、多発性硬化症の進行のような望まない生理学的変化または障害を予防し、または遅延させる（遅くする）ことである。利益があるまたは望まれる臨床的結果は、限定されるものではないが、兆候の軽減、病気の程度の低下、病気の安定化された（すなわち、悪くならない）状態、病気進行の遅延または遅れ、病気状態の軽減または緩和、および（部分的または全体的であるかを問わず）緩解を検出可能または検出不可能を問わず含む。「処置」は、もし処置を受けない予測される生存と比較して、生存を延長させることを意味することもできる。治療を必要とする者は、疾患または障害を既に持つ者ならびに疾患または障害を有する傾向がある者、または疾患または障害を予防すべき者を含む。
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後または療法が望まれるいずれの対象、特に、哺乳動物対象も意味する。哺乳動物対象は、ヒト、家畜動物、農場動物、およびイヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、蓄牛、ウシ等のような動物園、スポーツまたはペット動物を含む。
本明細書中で用いるように、「Ｓｐ３５抗体の投与から利益を受けるであろう対象」および「治療を必要とする動物」のようなフレーズは、例えば、（例えば、診断手法のために）Ｓｐ３５ポリペプチドの検出で用いられるＳｐ３５抗体の投与から、および／またはＳｐ３５抗体でのＭＳのような病気の治療、すなわち、軽減または予防から利益を受けるであろう哺乳動物対象のような対象を含む。本明細書中において、より詳細に記載されるように、Ｓｐ３５抗体はコンジュゲートされていない形態で用いることができるか、あるいは例えば薬物、プロドラッグまたは同位体にコンジュゲートさせることができる。
ＩＩ．Ｓｐ３５
天然に生じるヒトＳｐ３５（Ｓｐ３５）は、３３アミノ酸シグナル配列を含めた、６１４アミノ酸（配列番号２）を有することが予測されるグリコシル化中枢神経系−特異的蛋白質である。Ｓｐは名称ＬＩＮＧＯ−１、ＬＲＲＮ６、ＬＲＲＮ６Ａ、ＦＬＪ１４５９４、ＬＥＲＮ１、ＭＧＣ１７４２２およびＵＮＱ２０１によって当該分野でやはり知られている。ヒト全長野生型Ｓｐ３５ポリペプチドは、（Ｎ−およびＣ−末端キャップを含めた）１４のロイシン−リッチ反復よりなるＬＲＲドメイン、Ｉｇドメイン、膜貫通領域、および小胞体ドメインを含有する。小胞体ドメインは、カノニカルチロシンリン酸化部位を含有する。加えて、天然に生じるＳｐ３５蛋白質は、シグナル配列、ＬＲＲＣＴおよびＩｇドメインの間の短い塩基性領域、およびＩｇドメインおよび小胞体ドメインの間の膜貫通領域を含有する。ヒトＳｐ３５遺伝子（配列番号１）は、６つのさらなるアミノ酸、すなわち、ＭＱＶＳＫＲ（配列番号３）はＳｐ３５シグナル配列のＮ−末端に存在してもしなくてもよいように代替翻訳開始コドンを含有する。表２は、配列番号２として本明細書中で示されたＳｐ３５アミノ酸配列に基づく、アミノ酸残基番号に従ったＳｐ３５度メインおよび他の領域をリストする。Ｓｐ３５ポリペプチドが、ここで引用してその全体を援用する、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ２００４／０８５６４８により詳細に特徴付けられている。
Figure 2009502123
 Ｓｐ３５の組織分布および発生的発現はヒトおよびラットにおいて研究されている。Ｓｐ３５生物学は実験動物（ラット）モデルで研究されている。ラットＳｐ３５の発現は、ノーザンブロットおよび免疫−組織化学染色によって決定されるように、ニューロンおよび稀突起神経膠細胞に局所化される。ラットＳｐ３５ ｍＲＮＡ発現レベルは発生的に調節され、誕生後まもなく、すなわち、約誕生後１日にピークとなる。ラット脊髄横断負傷モデルにおいて、Ｓｐ３５は、ＲＴ−ＰＣＲによって測定して、負傷部位においてアップレギュレートされる。Ｍｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２２８（２００４）参照。
Ｓｐ３５ポリペプチドの種々の構造的および機能的ドメインを含むアミノ酸の関係では、用語「約」は、特に引用した値、および数個の（例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１）アミノ酸だけより大きなまたはより小さな値を含む。表１にリストされたこれらのドメインの位置はコンピュータグラフィックによって予測されていたので、当業者であれば、ドメインを構成するアミノ酸残基は、ドメインを規定するのに用いる基準に応じて、（例えば、約１〜１５残基だけ）わずかに変化し得る。
本発明者らは、全長野生型Ｓｐ３５がＮｇＲ１に結合することを発見した。ＰＣＴ公開番号ＷＯ ２００４／０８５６４８参照。また、本発明者らは、Ｓｐ３５は稀突起神経膠細胞で発現され、Ｓｐ３５蛋白質が稀突起神経膠細胞−媒介軸索のミエリン化の調節に関与することも発見した。ここで引用してその全体を援用する、米国特許公開番号２００６／０００９３８８ Ａ１参照。
全長Ｓｐ３５分子についてのヌクレオチド配列は以下の通りである：
Figure 2009502123
 （配列番号１）。
全長Ｓｐ３５ポリペプチドについてのポリペプチド配列は以下の通りである：
Figure 2009502123
 （配列番号２）。
ＩＩＩ．Ｓｐ３５抗体
１つの具体例において、本発明はＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体に向けられる。例えば、本発明は、表３ＡおよびＢに示された、あるモノクローナル抗体、およびその断片、改変体および誘導体の少なくとも抗原結合ドメインを含む。
表３Ａは、ある全長ファージライブラリー由来抗体によって結合されるＳｐ３５ポリペプチドの領域を記載する。これらの抗体は、表３Ｂに示されるように、ファージディスプレイライブラリー−１に由来するＦａｂ断片と同一の可変領域を有する（例えば、表３ＡにおけるＤ０５は表３ＢにおけるＬｉ０５と同一の可変領域を有し、表３ＡにおけるＤ０６は表３ＢにおけるＬｉ０６と同一の可変領域を有する、等）。抗体を、当該分野で良く知られた方法を用い、表３Ａで規定された結合Ｓｐ３５断片につきテストした。
表３Ｂは、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、免疫沈澱（ＩＰ）、ウェスタンブロット分析、免疫組織化学（ＩＨＣ）、および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のような種々のアッセイにおいてＳｐ３５を検出する指名されたモノクローナル抗体またはＦａｂ断片の能力を記載する。これらのアッセイを行うための詳細なプロトコルは本明細書中に記載されているか、あるいはよく知られており、当業者によって理解される。表３Ｂにリストされたハイブリドーマ−由来モノクローナル抗体は、可溶性Ｓｐ３５のマウスへの注射によって生産され、次いで、当該分野で良く知られており、本明細書中に記載されたハイブリドーマ技術を用いて単離した。表３Ｂにリストされたモノクローナル抗体および抗体Ｆａｂ断片は、当該分野で知られた技術を用いて２つの異なるファージディスプレイライブラリーから単離された。
Figure 2009502123
Figure 2009502123
Figure 2009502123
Figure 2009502123
Figure 2009502123
 本明細書中で用いるように、用語「抗原結合ドメイン」は、抗原上のエピトープ（例えば、Ｓｐ３５のエピトープ）に特異的に結合する部位を含む。抗体の抗原結合ドメインは、典型的には、免疫グロブリン重鎖可変領域の少なくとも一部、および免疫グロブリン軽鎖可変領域の少なくとも一部を含む。これらの可変領域によって形成される結合部位は、抗体の特異性を決定する。
本発明は、より具体的にはＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体に向けられ、ここで、Ｓｐ３５抗体は、
Figure 2009502123
 よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同一のエピトープに結合する。
本発明はさらに、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体に向けられ、ここで、該Ｓｐ３５抗体は、
Figure 2009502123
 よりなる群から選択されるモノクローナル抗体をＳｐ３５への結合から競合的に阻害する。
また、本発明は、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体に向けられ、ここで、該Ｓｐ３５抗体は、
Figure 2009502123
 よりなる群から選択されるモノクローナル抗体の少なくとも抗原結合領域を含む。
ある具体例において、本発明は、特定のＳｐ３５ポリペプチド断片またはドメインに特異的にまたは優先的に結合する抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体に向けられる。そのようなＳｐ３５ポリペプチド断片は、限定されるものではないが、配列番号２のアミノ酸３４〜５３２；３４〜４１７；３４〜４２５；３４〜４９３；６６〜５３２；６６〜４１７；６６〜４２６；６６〜４９３；６６〜５３２；４１７〜５３２；４１７〜４２５（Ｓｐ３５塩基性領域）；４１７〜４９３；４１７〜５３２；４１９〜４９３（Ｓｐ３５ Ｉｇ領域）；または４２５〜５３２を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる断片を含むか；または配列番号２のアミノ酸３４〜５３２；３４〜４１７；３４〜４２５；３４〜４９３；６６〜５３２；６６〜４１７；６６〜４２６；６６〜４９３；６６〜５３２；４１７〜５３２；４１７〜４２５（Ｓｐ３５塩基性領域）；４１７〜４９３；４１７〜５３２；４１９〜４９３（Ｓｐ３５ Ｉｇ領域）；または４２５〜５３２に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であるＳｐ３５改変体ポリペプチドを含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなるＳｐ３５ポリペプチドを含む。
本発明のある種の抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体が結合するさらなるＳｐ３５ペプチド断片は、限定されるものではないが、Ｓｐ３５の１以上のロイシン−リッチ−反復（ＬＲＲ）を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなるものを含む。そのような断片は、例えば、配列番号２のアミノ酸６６〜８９；６６〜１１３；６６〜１３７；９０〜１１３；１１４〜１３７；１３８〜１６１；１６２〜１８５；１８６〜２０９；２１０〜２３３；２３４〜２５７；２５８〜２８１；２８２〜３０５；３０６〜３２９；または３３０〜３５３；を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる断片を含む。配列番号２のアミノ酸６６〜８９；６６〜１１３；９０〜１１３；１１４〜１３７；１３８〜１６１；１６２〜１８５；１８６〜２０９；２１０〜２３３３；２３４〜２５７；２５８〜２８１；２８２〜３０５；３０６〜３２９；または３３０〜３５３に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である改変体Ｓｐ３５ポリペプチドの対応する断片も考えられる。
本発明のある種の抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体が結合するさらなるＳｐ３５ポリペプチド断片は、限定されるものではないが、Ｓｐ３５のＬＲＲに近接する１以上のシステインリッチな領域を含む、実質的にそれよりなる、それよりなる断片を含む。そのような断片は、例えば、配列番号２のアミノ酸３４〜６４を含む、実質的にそれよりなる、それよりなる断片（Ｎ−末端ＬＲＲフランキング領域（ＬＲＲＮＴ））、または配列番号２のアミノ酸３６３〜４１６を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる断片（Ｃ−末端ＬＲＲフランキング領域（ＬＲＲＣＲ））を含む。配列番号２のアミノ酸３４〜６４および３６３〜４１６に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一である改変体Ｓｐ３５ポリペプチドの対応する断片も考えられる。
当該分野で知られているように、２つのポリペプチドの間の「配列同一性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列を第二のポリペプチドの配列に対して比較することによって決定される。本明細書中で議論するように、いずれかの特定のポリペプチドがもう１つのポリペプチドに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一であるか否かは、限定されるものではないが、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｒｅ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１１）のような当該分野で知られた方法およびコンピュータプログラム／ソフトウェアを用いて決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、２つの配列の間の相同性の最良のセグメントを見出すために、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ ２：４８２−４８９（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムを用いる。特定の配列が、例えば、本発明に従って参照配列に対して９５％同一であるか否かを決定するためにＢＥＳＴＦＩＴまたはいずれかの他の配列整列プログラムを用いる場合、パラメーターは、勿論、同一性のパーセンテージが参照ポリペプチド配列の全長にわたって計算され、参照配列におけるアミノ酸の合計数の５％までの相同性におけるそのギャップが許容されるように設定される。
本発明のある種の抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体が結合するさらなるＳｐ３５ペプチド断片は、限定されるものではないが、配列番号２のアミノ酸４１〜５２５；
Figure 2009502123
 を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる、断片を含む。
本発明のある種の抗体、または抗原結合断片、改変体、またはその誘導体が結合するなおさらなるＳｐ３５ペプチド断片は、限定されるものではないが、配列番号２のアミノ酸１〜３３；
Figure 2009502123
 を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる断片を含む。
本発明のある種の抗体または抗原結合断片、改変体または誘導体が結合するなおさらなるＳｐ３５ペプチド断片は、限定されるものではないが、配列番号２のアミノ酸１〜３３；
Figure 2009502123
 を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる断片を含む。
本発明のある種の抗体、または抗原結合断片、改変体、または誘導体が結合するさらなるＳｐ３５ポリペプチド断片は、限定されるものではないが、配列番号２のアミノ酸３４〜６４；
Figure 2009502123
 を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる断片を含む。
本発明のある種の抗体、または抗原結合断片、改変体または誘導体が結合するよりさらなるＳｐ３５ポリペプチド断片は、配列番号２のアミノ酸３４〜５３０；
Figure 2009502123
 を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる断片を含む。
本発明のある種の抗体、または抗原結合断片、改変体、または誘導体が結合するなおさらなるＳｐ３５ペプチド断片は、限定されるものではないが、配列番号２のアミノ酸３６〜６４；
Figure 2009502123
 を含む、実施的にそれよりなる、またはそれよりなる断片を含む。
本発明のある種の抗体、または抗原結合断片、改変体、または誘導体が結合するさらなるＳｐ３５ペプチド断片は、配列番号２のアミノ酸３６〜５３０；
Figure 2009502123
 を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる断片を含む。
本発明のある種の抗体、または抗原結合断片、改変体、または誘導体が結合するさらなるＳｐ３５ペプチド断片は、限定されるものではないが、配列番号２のアミノ酸４１７〜４９３；
Figure 2009502123
Figure 2009502123
 を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる断片を含む。
さらなる具体例において、本発明のある種の抗体、または抗原結合断片、改変体、または誘導体が結合するＳｐ３５ペプチド断片は、Ｓｐ３５のＩｇドメインのペプチド、またはそのようなペプチドの断片、改変体または誘導体を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなるＳｐ３５ポリペプチドを含む。具体的には、以下のポリペプチド配列：Ｘ１がリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、またはアスパラギンであり、Ｘ２がリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、またはアスパラギンであって、Ｘ３が、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、またはアスパラギンであるＩＴＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号２８７）、ＡＣＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号２８８）、ＶＣＸ１Ｘ２ｘ３（配列番号２８９）およびＳＰＸ１Ｘ２Ｘ３（配列番号２９０）を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなるポリペプチド。例えば、本発明のある種の抗体、または抗原結合断片、改変体または誘導体が結合するＳｐ３５ポリペプチド断片は、以下のポリペプチド配列：
Figure 2009502123
 を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる断片を含む。これらのＳｐ３５ポリペプチドはＳｐ３５のＩｇドメインにおける塩基性「ＲＫＨループ」（アルギニン−リジン−ヒスチジンアミノ酸４５６〜４５８）を含む。塩基性トリペプチドを含むさらなるＳｐ３５ポリペプチドはＩＴＰＫＲＲ（配列番号３２１）、ＡＣＨＨＫ（配列番号３２２）およびＶＣＨＨＫ（配列番号３２３）である。
本発明のある種の抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体が結合するさらなるＳｐ３５ポリペプチド断片は、Ｓｐ３５のＩｇドメインのペプチド、またはそのようなペプチドの断片、改変体または誘導体を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなるＳｐ３５ポリペプチドを含む。具体的には、以下のポリペプチド配列：Ｘ４がいずれかのアミノ酸であって、Ｘ５がいずれかのアミノ酸である
Figure 2009502123
Figure 2009502123
 を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなるペプチド。
他の具体例において、本発明のある種の抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体が結合するＳｐ３５ペプチド断片は、Ｓｐ３５のＩｇドメインのペプチド、またはそのようなポリペプチドの断片、改変体または誘導体を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなるＳｐ３５ポリペプチドを含む。具体的には、以下のポリペプチド配列：Ｘ６がリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、またはアスパラギンであり、Ｘ７がいずれかのアミノ酸であって、Ｘ８がリジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン、またはアスパラギンである
Figure 2009502123
 を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなるポリペプチド。例えば、以下のポリペプチド配列：ＳＰＲＬＨ（配列番号３３８）を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなるポリペプチド。
本発明のある種の抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体が結合するＳｐ３５ペプチド断片は、アミノ酸４５２がトリプトファンまたはフェニルアラニン残基である、Ｓｐ３５のＩｇドメインにおけるアミノ酸４５２〜４５８を含有するポリペプチド、またはその誘導体を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなるＳｐ３５ポリペプチドを含む。
本発明のある種の抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体が結合するさらなるＳｐ３５ペプチド断片は、Ｓｐ３５の塩基性ドメインのペプチドを含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなるＳｐ３５トリペプチドを含む。具体的には、以下のポリペプチド配列：
Figure 2009502123
 を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなるペプチド。
さらなる例示的可溶性Ｓｐ３５ポリペプチド、および本発明の抗体または抗体断片を生産するためのこれらの分子を得るための方法および材料は、例えば、ここで引用してその全体を援用する、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００８３２３に見出すことができる。
抗体を作製するための方法は当該分野でよく知られており、本明細書中に記載する。一旦、シグナル配列がない全長Ｓｐ３５に対する、またはその種々の断片に対する抗体が生産されたならば、該抗体または抗原結合断片が結合するＳｐ３５のアミノ酸またはエピトープは、本明細書中に記載されたエピトープマッピングプロトコル、ならびに当該分野で知られた方法によって決定することができる（例えば、“Ｃｈａｐｔｅｒ１１−Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｖ．２，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９６）に記載されている二重抗体−サンドイッチＥＬＩＳＡ）。さらなるエピトープマッピングプロトコルは、共にここで引用してその全体を援用する、Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）に見出すことができる。エピトープマッピングは、商業的に入手可能な手段（すなわち、ＰｒｏｔｏＰＲＯＢＥ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））によって行うこともできる。
加えて、次いで、Ｓｐ３５のいずれかの部分に結合する生産された抗体を、Ｓｐ３５のアンタゴニストとして作用し、かくして、神経突起形成、ニューロンおよび稀突起神経膠細胞の生存、増殖および分化ならびにミエリン形成を促進するそれらの能力についてスクリーニングすることができる。抗体は、実施例１０および１１に記載された方法を用いることによって、稀突起神経膠細胞／ニューロン生存についてスクリーニングすることができる。加えて、抗体は、実施例９の方法を用いることによって、ミエリン形成を促進するためのそれらの能力についてスクリーニングすることができる。最後に、抗体は、稀突起神経膠細胞の増殖および分化、ならびに神経突起形成を促進するそれらの能力について、実施例７に記載された方法を用いることによってスクリーニングすることができる。本発明の抗体の他のアンタゴニストは、本明細書中の実施例に記載された他のアッセイを用いてテストすることができる。
他の具体例において、本発明は、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体を含み、ここで、該エピトープは配列番号２の少なくとも約４〜５のアミノ酸、配列番号２の少なくとも７、少なくとも９、または少なくとも約１５〜約３０の間のアミノ酸を含み、実質的にそれよりなり、またはそれよりなる。記載された配列番号２の与えられたエピトープのアミノ酸は連続的または線状であってよいが、その必要はない。ある具体例において、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープは、細胞の表面に発現された、あるいは例えばＩｇＧ Ｆｃ領域に融合された可溶性断片としての、Ｓｐ３５の細胞外ドメインによって形成された非線状エピトープを含み、実質的にそれよりなり、またはそれよりなる。かくして、ある具体例において、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープは、配列番号２の少なくとも４、少なくとも十５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、約１５〜約３０の間、または少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００の連続的または非連続的アミノ酸を含み、実質的にそれよりなり、またはそれよりなり、ここで、該非連続的アミノ酸は蛋白質折り畳みを介してエピトープを形成する。
他の具体例において、本発明はＳｐ３５の少なくとも１つのエピトープに特異的にまたは優先的に結合する抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体を含み、ここで、該エピトープは前記した配列番号２の１、２、３、４、５、６またはそれを超える連続的または非連続的アミノ酸に加えて、蛋白質を修飾するさらなる部位を含み、実質的にそれよりなり、またはそれよりなり、例えば、炭水化物部位は、Ｓｐ３５抗体が、それが蛋白質の修飾されていないバージョンに結合するよりもより高い親和性でもって修飾された標的蛋白質に結合する。別法として、Ｓｐ３５抗体は、標的蛋白質の修飾されていないバージョンに全く結合しない。
ある態様において、本発明は、参照モノクローナル抗体についてのＫＤ未満である解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片、あるいはＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体に向けられる。
ある具体例において、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体は、前記したＳｐ３５または断片または改変体の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合し、すなわち、無関係なまたはランダムなエピトープにそれが結合するであろうよりも容易にそのようなエピトープに結合し；前記したＳｐ３５または断片または改変体の少なくとも１つのエピトープに優先的に結合し、すなわち、関係する、同様な、相同なまたは類似のエピトープに結合するであろうよりも容易にそのようなエピトープに結合し；前記したＳｐ３５または断片または改変体のあるエピトープにそれ自体が特異的にまたは優先的に結合する参照抗体の結合を競合的に阻害し；または
Figure 2009502123
 未満の解離定数ＫＤによって特徴付けられる親和性でもって前記したＳｐ３５または断片または改変体の少なくとも１つのエピトープに結合する。特別な態様において、該抗体またはその断片は、マウスＳｐ３５ポリペプチドまたはその断片に対して、ヒトＳｐ３５ポリペプチドまたはその断片に優先的に結合する。
抗体結合解離定数の関係で用いるように、用語「約」は、抗体親和性を測定するために利用される方法において固有の変動の程度を可能とする。例えば、用いる機器の精度のレベル、測定される試料の数に基づく標準誤差、および丸め誤差に応じて、用語「約１０−２Ｍ」は、例えば、０．０５Ｍ〜０．００５Ｍを含むであろう。
特別な具体例において、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、５×１０−２ｓｅｃ−１、１０−２ｓｅｃ−１、５×１０−３ｓｅｃ−１または１０−３ｓｅｃ−１よりも低い、またはそれと同等なオフ速度（ｋ（オフ））でもってＳｐ３５ポリペプチド、またはその断片または改変体に結合する。別法として、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、５×１０−４ｓｅｃ−１、１０−４ｓｅｃ−１、５×１０−５ｓｅｃ−１、または１０−５ｓｅｃ−１５×１０−６ｓｅｃ−１、１０−６ｓｅｃ−１、５×１０−７ｓｅｃ−１または１０−７ｓｅｃ−１よりも低い、またはそれと同等なオフ速度（ｋ（オフ））でもってＳｐ３５ポリペプチド、またはその断片または改変体に結合する。
他の具体例において、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体は、１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０３Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１または５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１よりも高いまたはそれと同等なオン速度（ｋ（オン））でもってＳｐ３５ポリペプチド、またはその断片または改変体に結合する。別法として、本発明の抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−１、１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１、または５×１０６Ｍ−１ｓｅｃ−１または１０７Ｍ−１ｓｅｃ−１よりも高い、またはそれと同等なオン速度（ｋ（オン））でもってＳｐ３５ポリペプチド、またはその断片または改変体に結合する。
種々の具体例において、本明細書中に記載されたＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体はＳｐ３５活性のアンタゴニストである。ある具体例において、例えば、ニューロンで発現された、Ｓｐ３５へのアンタゴニストＳｐ３５抗体の結合は、ミエリン−関連神経突起形成阻害またはニューロン細胞死をブロックする。他の具体例において、稀突起神経膠細胞で発現されたＳｐ３５へのＳｐ３５抗体の結合は、稀突起神経膠細胞の成長または分化の阻害をブロックし、またはＣＮＳニューロンの脱髄または髄鞘剥奪をブロックする。
特に言及するのでなければ、本明細書中で用いるように、抗体に関連する「その断片」とは、抗原結合断片、すなわち、抗原に特異的に結合する抗体の一部をいう。１つの具体例において、Ｓｐ３５抗体、例えば、本発明の抗体は二特異的Ｓｐ３５抗体、結合ポリペプチド、または抗体、例えば、１を超えるエピトープ、例えば、１を超える抗原、または同一抗原上の１を超えるエピトープに対する結合特異性を有する二特異的抗体、ミニボディ、ドメイン欠失抗体、または融合蛋白質である。１つの具体例において、二特異的Ｓｐ３５抗体、結合ポリペプチド、または抗体は、本明細書中に開示された標的ポリペプチド、例えば、Ｓｐ３５上の少なくとも１つのエピトープに対して特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する。もう１つの具体例において、二特異的Ｓｐ３５抗体、結合ポリペプチド、または抗体は、標的ポリペプチド上のエピトープに対して特異的な少なくとも１つの結合ドメイン、および薬物またはトキシンに対して特異的な少なくとも１つの標的結合ドメインを有する。なおもう１つの具体例において、二特異的Ｓｐ３５抗体、結合ポリペプチド、または抗体は、本明細書中に開示された標的ポリペプチド上のエピトープに対して特異的な少なくとも１つの結合ドメイン、およびプロドラッグに対して特異的な少なくとも１つの結合ドメインを有する。二特異的Ｓｐ３５抗体、結合ポリペプチド、または抗体は、本明細書中に開示された標的ポリペプチドのエピトープに対して特異的な２つの標的結合ドメイン、および第二の標的に対して特異的な２つの標的結合ドメインを有する四価抗体であってよい。かくして、四価二特異的Ｓｐ３５抗体、結合ポリペプチド、または抗体は各特異性について二価であってよい。
当業者によって知られた、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体は、１以上のエフェクター機能を媒介する定常領域を含むことができる。例えば、抗体定常領域への補体のＣ１成分の結合は補体系を活性化することができる。補体の活性化は細胞病原体のオプソニン化および溶解で重要である。補体の活性化は、免疫応答も刺激し、自己免疫過敏にも関与し得る。さらに、抗体は、細胞上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する抗体Ｆｃ領域上のＦｃ受容体結合部位で、Ｆｃ領域を介して種々の細胞上の受容体に結合する。ＩｇＧ（ガンマ受容体）、ＩｇＥ（イプシロン受容体）、ＩｇＡ（アルファ受容体）およびＩｇＭ（ミュー受容体）を含めた、抗体の異なるクラスに対して特異的な多数のＦｃ受容体がある。細胞表面のＦｃ受容体への抗体の結合は、抗体−被覆粒子の吸い込みおよび破壊、免疫複合体のクリアランス、（抗体−依存性細胞−媒介細胞傷害性、またはＡＤＣＣと呼ばれる）キラー細胞による抗体−被覆標的細胞の溶解、免疫メディエーターの放出、胎盤移動、および免疫グロブリン生産の制御を含めた、多数の重要なおよび多用な生物学的応答をトリガーする。
従って、本発明のある具体例はＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体を含み、ここで、定常領域ドメインの１以上の少なくとも一部は欠失されており、またはそうでなければ、ほぼ同一の免疫原性の全未変化抗体と比較して、低下したエフェクター機能、非共有結合的に重合する能力、腫瘍の部位に局所化する増大した能力、低下した血清半減期、または増大した血清半減期のような所望の生化学的特徴を供するように改変されている。例えば、本明細書中に記載された診断および治療方法で用いるある種の抗体は、免疫グロブリン重鎖と同様なポリペプチド鎖を含むが、１以上の重鎖ドメインの少なくとも一部を欠如するドメイン欠失抗体である。例えば、ある抗体において、修飾された抗体の定常領域の１つの完全なドメインは欠失されており、例えば、ＣＨ２ドメインの全てまたは一部は欠失されるであろう。
本明細書中に記載されたあるＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体において、Ｆｃ部分は当該分野で公知の技術を用いて突然変異させて、エフェクター機能を減少させることができる。例えば、定常領域ドメインの（点突然変異または他の手段を介する）欠失または不活化は、循環する修飾された抗体のＦｃ受容体結合を低下させ、それにより、腫瘍の局所化を増大させることができる。他の場合においては、本発明と合致する定常領域修飾はホタイ結合を抑制し、かくして、コンジュゲートされたサイトトキシンの血清中半減期および非特異的会合を低下させることができるであろう。定常領域のなお他の修飾を用いて、増大した抗原特異性または抗体フレキシビリティーによる増強された局所化を可能とするジスルフィド結合またはオリゴ糖部位を修飾することができる。得られた生理学的プロフィール生物利用性、ならびに腫瘍局所化、生体内分布および血清中半減期のような修飾の他の生化学的効果は、過度な実験なくしてよく知られた免疫学的技術を用いて容易に測定し、定量することができる。
本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体の修飾された形態は、当該分野で知られた技術を用いて全前駆体または親抗体から作製することができる。例示的な技術は本明細書中においてより詳細に議論する。
ある具体例において、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体の可変および定常領域の双方は完全なヒト抗体である。完全なヒト抗体は、当該分野で知られ、かつ本明細書中に記載された技術を用いて作製することができる。例えば、特異的抗原に対する完全なヒト抗体は、抗原性挑戦に応答してそのような抗体を生じるように修飾されているが、その内因性遺伝子座は無力化されているトランスジェニック動物に抗原を投与することによって調製することができる。そのような抗体を作成するのに用いることができる例示的な技術は、引用によりその全体を援用する。米国特許第６，１５０，５８４号；第６，４５８，５９２号；第６，４２０，１４０号に記載されている。他の技術は当該分野で公知である。完全なヒト抗体は、同様に、種々のディスプレー技術、例えば、本明細書中において他の箇所でより詳細に記載されるファージディスプレーまたは他のウイルスディスプレーシステムによって生産することができる。
本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、当該分野で知られた技術を用いて作成し、または製造することができる。ある具体例において、抗体分子またはその断片は、「組換えにより生産」され、すなわち組換えＤＮＡ技術を用いて生産される。抗体分子またはその断片を作成するための例示的な技術は、本明細書中において他の箇所でより詳細に議論される。
本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、例えば、共有結合が抗体がその同族エピトープに特異的に結合するのを妨げないような、部位のいずれかのタイプの抗体への共有結合によって修飾された誘導体も含む。例えば、限定するものではないが、抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アシル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、蛋白質分解切断、細胞リガンドまたは他の蛋白質への結合によって修飾されている抗体を含む。多数の化学的修飾のいずれかは、限定されるものではないが、特異的な化学的切断、アシル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含めた公知の技術によって行うことができる。加えて、誘導体は１以上の非古典的アミノ酸を含有することができる。
ある具体例において、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、標的化すべき動物における、例えば、ヒトにおける有害な免疫応答を誘導しないであろう。１つの具体例において、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、当該分野で認められた技術を用いてその免疫原性を低下されるように修飾される。例えば、抗体はヒト化し、霊長類化し、脱免疫化することができ、あるいはキメラ抗体を作成することができる。抗体のこれらのタイプは、非ヒト抗体、典型的には、親抗体の抗原結合特性を保持し、または実質的に保持するが、ヒトにおいて免疫原性が低いマウスまたは霊長類抗体に由来する。これは、（ａ）全非ヒト可変ドメインをヒト定常領域に植え付けて、キメラ抗体を生じさせる；（ｂ）非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）の１以上の少なくとも一部を、臨界的フレームワーク残基を保持し、または保持することなく、日とフレームワークおよび定常領域に植え付けること；または（ｃ）全非ヒト可変ドメインを移植するが、表面残基の置換によってそれらをヒト様セクションで「覆う」ことを含めた、種々の方法によって達成することができる。そのような方法は、その全てをここで引用してその全体を援用する、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：６５−９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．２８：４８９−４９８（１９９１）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎ．３１：１６９−２１７（１９９４），ａｎｄ 米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、および第６，１９０，３７０号に開示されている。
また、脱免疫化を用いて、抗体の免疫原性を減少させることもできる。本明細書中で用いるように、用語「脱免疫化」は、Ｔ細胞エピトープを修飾するための抗体の改変を含む（例えば、ＷＯ９８５２９７６Ａ１、ＷＯ００３４３１７Ａ２参照）。例えば、出発抗体からのＶＨおよびＶＬ配列を分析し、ヒトＴ細胞エピトープは、相補性−決定領域（ＣＤＲ）および配列内の他の鍵となる残基に関するエピトープの位置を示す各Ｖ領域から「マッピング」される。Ｔ細胞エピトープマップからの個々のＴ細胞エピトープを分析して、最終抗体の活性を改変する危険性が低い代替アミノ酸置換を同定する。アミノ酸置換の組合せを含む一定範囲の代替ＶＨおよびＶＬ配列を設計し、これらの配列を、引き続いて、本明細書中に開示された診断および治療方法で用いるために、一定範囲の結合ポリペプチド、例えば、Ｓｐ３５特異的抗体またはその免疫特異的断片に組込み、次いで、これを機能についてテストする。典型的には、１２および２４の間の改変体抗体を作り出し、テストする。次いで、修飾されたＶおよびヒトＣ領域を含む完全な重鎖および軽鎖遺伝子を発現ベクターにクローン化し、引き続いてのプラスミドを全抗体の生産のために細胞系に導入する。次いで、抗体を適当な生化学的および生物学的アッセイで比較し、最適な改変体を同定する。
本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、当該分野で知られたいずれかの適当な方法によって作り出すことができる。注目する抗原に対するポリクローナル抗体は、当該分野でよく知られた種々の手法によって生産することができる。例えば、Ｓｐ３５抗体、例えば、結合ペプチド、例えば、Ｓｐ３５特異的抗体またはその免疫特異的断片を、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラット、ニワトリ、ハムスター、ヤギ、ラバ等を含めた種々の宿主動物に投与して、抗原に対して特異的なポリクローナル抗体を含有する血清の生産を誘導することができる。宿主の種に依存して、免疫学的応答を増強させるために、種々のアジュバントを用いることができ、これは、限定されるものではないが、（完全および不完全）フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのようなミネラルゲル、リソレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｕｖｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含む。そのようなアジュバントもまた、当該分野で良く知られている。
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換えおよびファージディスプレー技術、またはその組合せの使用を含めた、当該分野で公知の広く種々の技術を用いて調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は当該分野で至られ、かつ、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ ｅｄ．（１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，５６３−６８１（１９８１）（該文献は引用してその全体を援用する。）に教示されたものを含めたハイブリドーマ技術を用いて生産することができる。本明細書中で用いる用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を介して生産された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、いずれの真核生物、原核生物、またはファージクローンも含めた単一クローンに由来する方法を言い、それが生産される方法を言わない。かくして、用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を介して生産された抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、Ｓｐ３５ノックアウトマウスを用いて調製して、エピトープ認識の領域を増加させることができる。モノクローナル抗体は、本明細書中の他の箇所に記載されたハイブリドーマおよび組換えおよびファージディスプレー技術の使用を含めた、当該分野で知られた広く種々の技術を用いて調製することができる。
当該分野で認められたプロトコルを用いて、１つの例において、抗体は、関連抗原（例えば、Ｓｐ３５のような精製された腫瘍関連抗原、あるいはそのような抗原を含む細胞またし細胞抽出物）およびアジュバントの多数の皮下または腹腔内注射によって哺乳動物において生起される。この免疫化は、典型的には、活性化された脾臓細胞またはリンパ球からの抗原−反応性抗体の生産を含む免疫応答を惹起する。得られた抗体を動物の血清から収穫して、ポリクローナル調製物を生産することができるが、脾臓、リンパ節または末梢血液から個々のリンパ球を単離して、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）の均一な調製物を得るのがしばしば望ましい。好ましくは、リンパ球は脾臓から得られる。
このよく知られたプロセス（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５））においては、抗原を注射されている哺乳動物からの比較的短命の、または死滅したリンパ球を不滅化腫瘍細胞系（例えば、ミエローマ細胞系）と融合させ、かくして、ハイブリッド細胞または「ハイブリドーマ」を生産し、これは、不滅であると共に、Ｂ細胞の遺伝子によりコードされた抗体を生産することができる。得られたハイブリッドは、単一抗体の形成のために、選択、希釈、および特異的い電子を含む各個々の株での再成長によって単一の遺伝子的株に分離する。それらは望まれる抗原に対して均一である抗体を生産し、それらの純粋な遺伝子的素性に関して、「モノクローナル」と言われる。
各調製されたハイブリドーマを、融合していない親ミエローマ細胞の成長または生存を阻害する１以上の物質を好ましくは含有する適当な培養基中に蒔き、そこで成長させる。当業者であれば、ハイブリドーマの形成、選択および成長のための試薬、細胞系および培地は、多数の源から商業的に入手可能であり、標準化されたプロトコルがよく確立されてすることを良く認識するであろう。一般には、ハイブリドーマ細胞は成長する培養基を、望まれる抗原に対するモノクローナル抗体の生産についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈澱、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素−結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のようなイン・ビトロアッセイによって決定される。所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞が同定された後、限界希釈手法によってクローンをサブクローン化し、標準的な方法によって成長させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ５９−１０３（１９８６））。さらに、サブクローンから分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテイン−Ａ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気詠動、透析またはアフェニティークロマトグラフィーのような慣用的な精製手法によって培養基、腹水液、または血清から分離できることが認識されよう。
特異的エピトープを認識する抗体断片は、公知の技術によって作り出すことができる。例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、（Ｆａｂ断片を生じさせるための）パパインまたは（Ｆ（ａｂ’）２）断片を生じさせるための）ペプシンのような酵素を用いる免疫グロブリン分子の蛋白質分解切断によって生産することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。
当業者であれば、抗体または抗体断片（例えば、抗原結合部位）をコードするＤＮＡはファージディスプレイライブラリーのような抗体ライブラリーに由来することもできることも認識するであろう。特に、そのようなファージを利用して、レパートリーまたはコンビナトーリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から発現された抗原結合ドメインを利用することができる。注目する抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識された抗原、あるいは固体表面またはビーズに結合した、またはそれに捕獲された抗原を用いて抗原で選択し、または同定することができる。これらの方法で用いられるファージは、典型的には、Ｆａｂ、Ｆｖ ＯＥ ＤＡＢ（軽鎖または重鎖からの個々のＦｖ領域）、またはファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩ蛋白質に組換えにより融合されたジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを持つファージから発現されたｆｄおよびＭ１３結合ドメインを含めたフィラメント状ファージである。例示的な方法は、例えば、その各々をここで引用して援用する。ＥＰ ３６８ ６８４ Ｂ１；米国特許第５，９６９，１０８号、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．ａｎｄ Ｃｈａｍｅｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３７１（２０００）；Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８０１（２００２）；Ｈｕｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：２６８２（２００１）；Ｌｕｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５：１０６３（２００２）に記載されている。いくつかの出版物（例えば、Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３（１９９２））は、鎖シャッフリングによる高親和性ヒト抗体の生産、ならびに大ファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトーリアル感染およびイン・ビボ組換えを記載した。もう１つの具体例において、リボソームディスプレーを用いて、ディスプレープラットホームとしてバクテリオファージを置き換えることができる（例えば、Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７（２０００）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：３７５０（２００１）；またはＩｒｖｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８：３１（２００１））参照。なおもう１つの具体例において、細胞表面ライブラリーを抗体についてスクリーニングすることができる（（Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１０７０１（２０００）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４３：２１１（２０００））。そのような手法は、モノクローナル抗体の単離および引き続いてのクローニングのための伝統的なハイブリドーマ技術に対する代替法を提供する。
ファージディスプレー方法においては、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を運ぶファージ粒子の表面で表示される。例えば、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ配列は動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、リンパ系組織のヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリー）または合成ｃＤＮＡライブラリーから増幅される。ある具体例において、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡは、ＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーによって一緒に接合され、ファジェミドベクター（例えば、ｐ ＣＡＮＴＡＢ ６またはｐＣｏｍｂ３ＨＳＳ）にクローン化される。該ベクターをＥ．ｃｏｌｉにエレクトロポレーションし、該Ｅ．ｃｏｌｉをヘルパーファージで感染させる。これらの方法で用いるファージは、典型的には、ｆｄおよびＭ１３を含めたフィラメント状ファージであり、ＶＨまたはＶＬ領域は、通常は、組換えにより、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩいずれかに融合させる。注目する抗原（すなわち、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片）に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識された抗原、または固体表面またはビーズに結合され、または捕獲された抗原を用いて抗原で選択し、または同定することができる。
抗体を作成するのに用いることができるファージディスプレー方法のさらなる例は、その各々を、ここで引用してその全体を援用する。Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）；Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２−９５８（１９９４）；Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １８７：９−１８（１９９７）；Ｂｕｒｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４）；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＰ９１／０１１３４；ＰＣＴ公開ＷＯ ９０／０２８０９；ＷＯ ９１／１０７３７；ＷＯ ９２／０１０４７；ＷＯ ９２／１８６１９；ＷＯ ９３／１１２３６；ＷＯ ９５／１５９８２；ＷＯ ９５／２０４０１；および米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号および第５，９６９，１０８号に開示されたものを含む。
前記文献に記載されたように、ファージ選択の後に、ファージからの抗体コーティング領域を単離し、これを用いて、ヒト抗体、またはいずれかの他の所望の抗原結合断片を含めた全抗体を作成することができ、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含めたいずれかの所望の宿主において発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組換えにより生産するための技術もまた、ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）；ａｎｄ Ｓａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）；ａｎｄ Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）（該文献を引用によりその全体を援用する）に開示されたもののような当該分野で知られた方法で使用することができる。
単一鎖Ｆｖおよび抗体を生じさせるのに用いることができる技術の例は、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載されたものを含む。ヒトおよびイン・ビトロ検出アッセイにおける抗体のイン・ビボ使用を含めたいくつかの使用については、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を用いるのが好ましいであろう。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体のように、異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を生産するための方法は、当該分野で知られている。例えば、ここで引用によりその全体を援用するＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２（１９８９）；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；および第４，８１６３９７号参照。ヒト化抗体は、非ヒト種からの１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する所望の抗原に結合する非ヒト種抗体に由来する抗体粒子である。しばしば、ヒトフレームワーク領域におけるフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換して、抗原結合を改変し、好ましくは、改良する。これらのフレームワーク置換は、例えば、特定の位置における通常でないフレームワーク残基を同定するための抗原結合および配列比較で重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリングによって、当該分野でよく知られた方法によって同定される。（例えば、ここで引用してその全体を援用する、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）参照）。抗体は、例えば、ＣＤＲ−グラフティング（ＥＰ ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；および第５，５８５，０８９号）、ベニアリングまたはリサーフィシング（ＥＰ ５９２，１０６；ＥＰ ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａ．ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））、および鎖シャッフリング（ここで引用してその全体を援用する米国特許第５，５６５，３３２号）を含めた当該分野で公知の種々の技術を用いてヒト化することができる。
完全にヒトの抗体は、ヒト患者の治療的処置で特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いる前記したファージディスプレー方法を含めた、当該分野で知られた種々の方法によって作成することができる。また、その各々をここで引用してその全体を援用する、米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ公開ＷＯ ９８／４６６４５，ＷＯ ９８／５０４３３，ＷＯ ９８／２４８９３，ＷＯ ９８／１６６５４，ＷＯ ９６／３４０９６，ＷＯ ９６／３３７３５，およびＷＯ ９１／１０７４１も参照。
ヒト抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて生産することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体はランダムに、あるいはマウス胚性幹細胞への相同組換えによって導入することができる。別法として、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域は、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚性幹細胞に導入することができる。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別々に、またはそれと同時に非機能的とすることができる。特に、ＪＨ領域のヘテロ接合性欠失は、内因性抗体の生産を妨げる。修飾された胚性幹細胞を拡大培養し、未分化胚芽細胞へマイクロインジェクションして、キメラマウスを生産する。次いで、キメラマウスを育種して、ヒト抗体対を発現するホモ接合性子孫を得る。トランスジェニックマウスを選択された抗原、例えば、所望の標的ポリペプチドの全て、または一部で通常に免疫化する。抗原に向けられたモノクローナル抗体は、慣用的なハイブリドーマ技術を用いて免疫化されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスによって保有されたヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ−細胞分化の間に再編成され、引き続いて、クラススイッチングおよび体細胞突然変異を受ける。かくして、そのような技術を用い、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を生産するのが可能である。ヒト抗体を生産するためのこの技術の概観については、Ｌｏｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｕｓｚａｒ Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのこの技術、およびそのような抗体を生産するためのプロトコルの詳細な議論については、例えば、ここで引用してその全体を援用する、ＰＣＴ公開ＷＯ ９８／２４８９３；ＷＯ ９６／３４０９６；ＷＯ ９６／３３７３５；米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；および第５，９３９，５９８号参照。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）およびＧｅｎＰｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）のような会社は、前記したのと同様な記述を用いて選択された抗原に対して向けられたヒト抗体を供するのに従事することができる。
選択されたエピトープを認識する完全にヒトの抗体は、「ガイドされた選択」といわれる技術を用いて作り出すことができる。このアプローチにおいて、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を用いて、同一エピトープを認識する完全にヒトの抗体の選択をガイドする。（引用してその全体を援用する（Ｊｅｓｐｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８）、また米国特許第５，５６５，３２２号参照）。
さらに、本発明の標的ポリペプチドに対する抗体は、今度は、当業者によく知られた技術を用いて標的ポリペプチドを「模倣」する抗イディオタイプ抗体を作り出すのに利用することができる（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ ＆ Ｂｏｎａ，ＦＡＳＥＢ Ｊ． ７（５）４３７−４４４（１９８９）ａｎｄ Ｎｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）参照）。例えば、ポリペプチドに結合し、かつポリペプチド多量体化、および／または本発明のポリペプチドのリガンドへの結合を完全に阻害する抗体を用いて、ポリペプチド多量体化および／または結合ドメインを「模倣」し、結果として、ポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合し、それを中和する抗イディオタイプを作成することができる。そのような中和抗イディオタイプ、またはそのような抗イディオタイプのＦａｂ断片を治療的に養生法で用いて、ポリペプチドリガンドを中和することができる。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体を用いて、所望の標的ポリペプチドに結合させ、および／またはそのリガンド／受容体に結合させることができ、それにより、その生物学的活性をブロックすることができる。
もう１つの具体例において、所望のクローナル抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）慣用的な手法を用いて容易に単離し、配列決定することができる。単離され、一部クローン化されたハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい源として働く。一旦単離されれば、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、これは、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、あるいはそうでなければ免疫グロブリンを生産しないミエローマ細胞のような原核生物または真核生物宿主細胞にトランスフェクトされる。さらに詳しくは、（本明細書中に記載されたように合成であり得る）単離されたＤＮＡを用いて、ここで引用して援用する、１９９５年１月２５日に出願されたＮｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，６５８，５７０号に記載されているように製造抗体のための定常および可変領域配列をクローン化することができる。実質的に、これは、選択された細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡへの変換、およびＩｇ特異的プライマーを用いるＰＣＲによる増幅を含む。この目的に適したプライマーもまた米国特許第５，６５８，５７０号に記載されている。以下により詳細に議論されるように、所望の抗体を発現するトランスフェクトされた細胞を比較的大量に成長させて、免疫グロブリンの臨床的および商業的供給を提供することができる。
１つの具体例において、本発明のＳｐ３５抗体は、抗体分子の少なくとも１つの重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む。もう１つの具体例において、本発明のＳｐ３５抗体は１以上の抗体分子からの少なくとも２つのＣＤＲを含む。もう１つの具体例において、本発明のＳｐ３５抗体は１以上の抗体分子からの少なくとも３つのＣＤＲを含む。もう１つの具体例において、本発明のＳｐ３５抗体は１以上の抗体分子からの少なくとも４つのＣＤＲを含む。もう１つの具体例において、本発明のＳｐ３５抗体は、１以上の抗体分子からの少なくとも５つのＣＤＲを含む。もう１つの具体例において、本発明のＳｐ３５抗体は、１以上の抗体分子からの少なくとも６つのＣＤＲを含む。主題のＳｐ３５抗体に含まれ得る少なくとも１つのＣＤＲを含む例示的な抗体分子が本明細書中に記載される。
特別な具体例において、重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を精査して、当該分野で良く知られた方法によって、例えば、他の重鎖および軽鎖可変領域の公知のアミノ酸配列と比較して、配列超可変性の領域を決定することによって、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を同定することができる。ルーチン的な組換えＤＮＡ技術を用い、ＣＤＲの１以上をフレームワーク領域内に、例えば、ヒトフレームワーク領域に挿入して、非ヒト抗体をヒト化することができる。フレームワーク領域は天然に生じるまたはコンセンサスフレームワーク領域であってよく、好ましくはヒトフレームワーク領域であってよい（例えば、ヒトフレームワーク領域のリストについてはＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：４５７−４７９（１９９８）参照）。好ましくは、フレームワーク領域およびＣＤＲの組合せによって生じたポリヌクレオチドは、所望のポリペプチド、例えば、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する抗体をコードする。好ましくは１以上のアミノ酸置換をフレームワーク領域内で行うことができ、好ましくは、アミノ酸の置換は抗体のその抗原への結合を改良する。加えて、そのような方法を用いて、鎖間ジスルフィド結合に参画する１以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換または欠失を行って、１以上の鎖内ジスルフィド結合を欠如する抗体分子を作成することができる。ポリヌクレオチドに対する他の改変は本発明に含まれ、当該分野の技量内のものである。
加えて、適当な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共に適当な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングすることによる「キメラ抗体」の生産のために開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：８５１−８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））を用いることができる。本明細書中で用いるように、キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域、およびヒト免疫グロブリン定常領域、例えば、ヒト化抗体を有するもののような、異なる部分が異なる動物種に由来する分子である。
別法として、単一鎖抗体の生産のために記載された技術（米国特許第４，６９４，７７８号；Ｂｉｒｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４４２（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３（１９８８）；ａｎｄ Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５５４（１９８９））を適合させて、単一鎖抗体を生産することができる。単一鎖抗体は、アミノ酸ブリッジを介してＦｖ領域の重鎖および軽鎖断片を連結させ、その結果、単一鎖抗体を得ることによって形成される。Ｅ．ｃｏｌｉにおける機能的Ｆｖ断片の組立てのための技術も用いることができる（Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））。
本発明のなお他の具体例は、内因性免疫グロブリンを生産できないトランスジェニック動物（例えば、マウス）でのヒトまたは実質的にヒト抗体の作成を含む（例えば、その各々を引用して援用する米国特許第６，０７５，１８１号、第５，９３９，５９８号、第５，５９１，６６９号および第５，５８９，３６９号参照）。例えば、キメラおよび生殖系突然変異体マウスにおける抗体重鎖接合領域のホモ接合性欠失の結果、内因性抗体の生産の完全な阻害がもたらされる。ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイのそのような生殖系突然変異体マウスの移動の結果、抗原挑戦に際してヒト抗体の生産がもたらされるであろう。ＳＣＩＤマウスを用いてヒト抗体を作成するもう１つの好ましい手段は、ここで引用して援用する米国特許第５，８１１，５２４号に開示されている。これらのヒト抗体に関連する遺伝物質もまた本明細書中に記載されたように単離し、操作することができるのは認識されるであろう。
組換え抗体を作成するためのなおもう１つのかなり有効な手段は、Ｎｅｗｍａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１４５５−１４６０（１９９２）によって開示されている。具体的には、この技術の結果、サル可変ドメインおよびヒト定常配列を含有する霊長類化抗体が作成される。この文献を引用してその全体をここで援用する。さらに、この技術は、その各々をここで引用して援用する共通に譲渡された米国特許第５，６５８，５７０号、第５，６９３，７８０号および第５，７５６，０９６号にやはり記載されている。
もう１つの具体例において、リンパ球はミクロ操作および単離された可変遺伝子によって選択することができる。例えば、末梢血液単核細胞は、免疫化哺乳動物から単離し、イン・ビトロにて約７日間培養することができる。培養を、スクリーニング基準を満足する特異的ＩｇＧについてスクリーニングすることができる。陽性ウェルからの細胞を単離することができる。個々のＩｇ−生産Ｂ細胞をＦＡＣＳによって、またはそれらを補体−媒介溶血プラークアッセイにおいて同定することによって単離することができる。Ｉｇ−生産Ｂ細胞を試験管にミクロ操作することができ、ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅することができる。ＶＨおよびＶＬ遺伝子は抗体発現ベクターにクローン化し、発現のために細胞（例えば、真核生物または原核生物細胞）にトランスフェクトすることができる。
別法として、抗体−生産細胞系を当業者によく知られた技術を用いて選択し、培養することができる。そのような技術は種々の研究室マニュアルおよび主な刊行物に記載されている。この点について、いかに記載する本発明で用いるのに適した技術は、ここで引用してその全体を援用する、別冊を含めた、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｎｅｃｅ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されている。
本明細書中に開示された診断および治療方法で用いる抗体は、特に、化学合成によって、あるいは本明細書中に記載された組換え発現技術によって、抗体の合成のための当該分野で公知のいずれかの方法によって生産することができる。
１つの具体例において、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、１以上のドメインが部分的にまたは完全に欠失された合成定常領域を含む（「ドメイン−欠失抗体」）。ある具体例において、適合する修飾抗体は、全ＣＨ２ドメインが除去されたドメイン欠失構築体または改変体を含むであろう（ΔＣＨ２構築体）。他の具体例については、短い連結ペプチドを欠失されたドメインに代えて置換して、可変領域についての柔軟性および移動の自由を供することができる。当業者であればそのような構築体は、抗体の異化速度に対するＣＨ２ドメインの調節特性のため特に好ましい。ドメイン欠失構築体は、ＩｇＧ１ヒト定常ドメイン（例えば、引用してその全体を援用するＷＯ ０２／０６０９５５Ａ２およびＷＯ ０２／０９６９４８Ａ２参照）を考慮する（例えば、Ｂｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄからの）ベクターを用いて誘導することができる。この例示的ベクターは、ＣＨ２ドメインを欠失させ、かつドメイン欠失ＩｇＧ１定常領域を発現する合成ベクターを供するように作成した。
ある具体例において、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体はミニボディである。ミニボディは、当該分野で記載された方法を用いて作成することができる（例えば、引用してその全体を援用する、米国特許第５，８３７，８２１号またはＷＯ ９４／０９８１７Ａ１参照）。
１つの具体例において、本発明のＳｐ３５抗体、または抗原結合断片、改変体、または誘導体は、それがモノマーサブユニットの間の会合を許容する限り、数個または単一さえのアミノ酸の欠失または置換を有する免疫グロブリン重鎖を含む。例えば、ＣＨ２ドメインの選択された領域中での単一アミノ酸の突然変異は、Ｆｃ結合を実質的に低下させ、それにより、腫瘍局所化を増大させるのに十分であろう。同様に、変調すべきエフェクター機能（例えば、補体結合）を制御する１以上の定常領域ドメインのその部分を単純に欠失するのが望ましいであろう。定常領域のそのような部分的欠失は、主題の定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能を無傷としつつ、抗体の選択された特徴（血清中半減期）を改善することができる。さらに、先に言及したように、開示された抗体の定常領域は、得られる構築体のプロフィールを増強させる１以上のアミノ酸の突然変異または置換を通じる合成のものであってよい。この点については、修飾された抗体の立体配置および免疫原性プロフィールを実質的に維持しつつ、保存された結合部位（例えば、Ｆｃ結合）によって供される活性を破壊することができよう。なお他の具体例は、１以上のアミノ酸を定常領域に加えて、エフェクター機能のような望ましい特徴を増強させ、あるいはより多くのサイトトキシンまたは炭水化物結合を供することを含む。そのような具体例において、選択された定常領域ドメインに由来する特異的配列を挿入し、または複製するのが望ましいであろう。
また、本発明は、本明細書中に記載された抗体分子の（誘導体を含めた）改変体（例えば、ＶＨ領域および／またはＶＬ領域）を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる抗体も提供し、その抗体またはその断片は、Ｓｐ３５ポリペプチド、またはその断片、あるいは改変体に免疫特異的に結合する。限定されるものではないが、アミノ酸置換をもたらす部位−特異的突然変異誘発およびＰＣＲ−媒介突然経を含めた、当業者に知られた標準的な技術を用いて、Ｓｐ３５抗体をコードするヌクレオチド配列に突然変異を導入することができる。好ましくは、（誘導体を含めた）改変体は、参照ＶＨ 領域、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬ領域、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３に対して、５０未満アミノ酸置換、４０未満のアミノ酸置換、３０未満アミノ酸置換、２５未満アミノ酸置換、２０未満アミノ酸置換、１５未満アミノ酸置換、１０未満アミノ酸置換、５未満アミノ酸置換、４未満アミノ酸置換、３未満アミノ酸置換、または２未満アミノ酸置換をコードする。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様な電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。同様な電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で定義されている。これらのフェミリーは塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電していない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸を含む。別法として、飽和突然変異誘発によるなどして、突然変異をコーディング配列の全てまたは一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた突然変異体を、活性（例えば、Ｓｐ３５ポリペプチドに結合する能力）を保持する突然変異体を同定するために生物学的活性についてスクリーニングすることができる。
例えば、抗体分子のフレームワーク領域にのみ、あるいはＣＤＲ領域にのみ突然変異を導入するのが可能である。導入された突然経にはサイレントまたは中性ミスセンス突然変異であってよく、すなわち、抗原に結合する抗体の能力に対して全くまたはほとんど効果を有しない。これらのタイプの突然変異には、コドン用法を最適化し、あるいはハイブリフォーマーの抗体生産を改良するのに有用であろう。別法として、非中性ミスセンス突然変異は、抗原に結合する抗体の能力を改変することができる。ほとんどのサイレントおよび中性ミスセンス突然変異の位置はフレームワーク領域にあるようであり、他方、ほとんどの非中性ミスセンス突然変異の位置はＣＤＲにあるようであるが、これは絶対的な要件ではない。当業者であれば、抗原結合活性の改変無し、または結合活性の改変有りのような所望の特性を持つ突然変異体分子を設計し、テストすることができるであろう（例えば、抗原結合活性の改良、または抗体特異性の変化）。突然変異誘発に続き、コードされた蛋白質をルーチン的に発現させることができ、コードされた蛋白質の機能的および／または生物学的活性（例えば、Ｓｐ３５ポリペプチドの少なくとも１つのエピトープに免疫特異的に結合する能力）は、本明細書中に記載された技術を用いて、あるいは当該分野で知られた技術をルーチン的に修飾することによって決定することができる。
ＩＶ．Ｓｐ３５抗体をコードするポリヌクレオチド
また、本発明は、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体をコードする核酸分子も提供する。
１つの具体例において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸分子を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで、重鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ、または重鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも２つは、本明細書中に開示されたモノクローナルＳｐ３５抗体からの参照重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。あるいは、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示されたモノクローナルＳｐ３５抗体からの参照重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。かくして、この具体例によると、本発明の重鎖可変領域は、表４に示されたポリペプチド配列に関してＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
Figure 2009502123
Figure 2009502123
Figure 2009502123
 ある具体例において、ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合断片はＳｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
もう１つの具体例において、本発明ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域が、表４に示されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３基と同一であるポリペプチド配列を有する、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む、実質的にそれより、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。またある具体例において、該ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
さらなる態様において、本発明はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域が、表４に示されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３基をコードするヌクレオチド配列と同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされる、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある具体例において、該ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
ある具体例において、前記したポリヌクレオチドの１以上によってコードされるＶＨを含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる抗体またはその抗原結合断片は、
Figure 2009502123
 それよりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同一のエピトープに特異的にまたは優先的に結合するか、あるいはそのようなモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合するのを競合的に阻害するであろう。
ある具体例において、前記したポリヌクレオチドの１以上によってコードされるＶＨを含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる群から選択される抗体、またはそれよりなる群から選択される結合断片は、
Figure 2009502123
 以下の解離定数（ＫＤ）で、Ｓｐ３５ポリペプチド、またはその断片、あるいはＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的にまたは優先的に結合する。
もう１つの具体例において、本発明は、軽鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ、または軽鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも２つが、本明細書中に開示されたモノクローナルＳｐ３５抗体からの参照軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む、実質的にそれよりなる群から選択される、またはそれよりなる群から選択される単離されたポリヌクレオチドを提供する。あるいは、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示されたモノクローナルＳｐ３５抗体からの参照軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。かくして、この具体例によると、本発明の軽鎖可変領域は、表５に示されたポリペプチド配列に関連するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。
Figure 2009502123
Figure 2009502123
Figure 2009502123
 ある具体例において、該ポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含む抗体または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
もう１つの具体例において、本発明はＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域が、表５に示されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３基と同一であるポリヌクレオチド配列を有する、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある具体例において、該ポリヌクレオチドによってコードされたＶＬを含む抗体、または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
さらなる態様において、本発明は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域が、表５に示されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３基をコードするヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列によってコードされた、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある具体例において、該ポリヌクレオチドによってコードされたＶＬを含む抗体または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
ある具体例において、前記したポリヌクレオチドの１以上によってコードされるＶＬを含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる抗体、またはその抗原結合断片は、
Figure 2009502123
 よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同一のエピトープに特異的にまたは選択的に結合するか、あるいはそのようなモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合するのを競合的に阻害するであろう。
ある具体例において、前記したポリヌクレオチドの１以上によってコードされるＶＬを含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる抗体、またはその抗原結合断片は、
Figure 2009502123
Figure 2009502123
 以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド、またはその断片、あるいはＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的にまたは優先的に結合する。
さらなる具体例において、本発明は、表６に示された配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０、および３８４よりなる群から選択される参照ＶＨポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＨをコードする核酸を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドを含む。ある具体例において、該ポリヌクレオチドによってコードされたＶＨを含む抗体、または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
もう１つの態様において、本発明は、表６に示された配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０、および３８４よりなる群から選択されるポリペプチド配列を有するＶＨをコードする核酸配列を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドを含む。ある具体例において、該ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
Figure 2009502123
Figure 2009502123
Figure 2009502123
 さらなる具体例において、本発明は、配列番号１５８−１７２、３７２、３７６、３８０、および３８４よりなる群から選択される参照ＶＨポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＨをコードする核酸を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドを含む。ある具体例において、該ポリヌクレオチドによってコードされたＶＨを含む抗体、または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
もう１つの態様において、本発明は配列番号１５８−１７２、３７２、３７６、３８０、および３８４よりなる群から選択される、本発明のＶＨをコードする核酸配列を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドを含む。ある具体例において、該ポリヌクレオチドによってコードされたＶＨを含む抗体、または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
ある具体例において、前記したポリヌクレオチドの１以上によってコードされるＶＨを含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる抗体、またはその抗原結合断片は、
Figure 2009502123
Figure 2009502123
 よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同一のエピトープに特異的にまたは優先的に結合するか、あるいはそのようなモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合するのを競合的に阻害するであろう。
ある具体例において、前記したポリヌクレオチドの１以上によってコードされるＶＨを含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる抗体、またはその抗原結合断片は、
Figure 2009502123
 以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド、またはその断片、あるいはＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的にまたは優先的に結合する。
さらなる具体例において、本発明は、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする単離されたポリヌクレオチドを含み、ここで、該ポリヌクレオチドは、表７に示された、配列番号１７３〜１８４、３７０、３７４、３７８および３８２よりなる群から選択される（ＶＨ）核酸配列を含む。ある具体例において、該ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨを含む抗体または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
Figure 2009502123
Figure 2009502123
Figure 2009502123
 さらなる具体例において、本発明は、表７の配列番号１７３−１８４、３７０、３７４、３７８および３８２よりなる群から選択される参照核酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＨ−コーディング核酸を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドを含む。ある具体例において、該ポリヌクレオチドは、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合するＶＨポリペプチドをコードする。
ある具体例において、前記したポリヌクレオチドの１以上によってコードされるＶＨを含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる抗体、またはその抗原結合断片は、
Figure 2009502123
 よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同一のエピトープに特異的にまたは優先的に結合するか、あるいはそのようなモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合するのを競合的に阻害するであろう。
ある具体例において、前記したポリヌクレオチドの１以上によってコードされるＶＨを含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる抗体、またはその抗原結合断片は、
Figure 2009502123
 以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチド、またはその断片、あるいはＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的にまたは優先的に結合する。
さらなる具体例において、本発明は、表８に示された、配列番号２７３〜２８６、３７３、３７７、３８１および３８５よりなる群から選択される参照ＶＬポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＬをコードする核酸配列を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドを含む。ある具体例において、該ポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含む抗体、または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
もう１つの態様において、本発明は、表８に示された、配列番号２７３〜２８６、３７３、３７７、３８１および３８５よりなる群から選択されるポリペプチド配列を有するＶＬをコードする核酸配列を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドを含む。ある具体例において、該ポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含む抗体、または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
Figure 2009502123
Figure 2009502123
 さらなる具体例において、本発明は、配列番号２７３〜２８６、３７３、３７７、３８１および３８５よりなる群から選択される参照ＶＬポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＬをコードする核酸を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドを含む。ある具体例において、該ポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含む抗体、または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
もう１つの態様において、本発明は、配列番号２７３〜２８６、３７３、３７７、３８１および３８５よりなる群から選択される、本発明のＶＬをコードする核酸配列を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドを含む。ある具体例において、該ポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含む抗体、または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
ある具体例において、前記したポリヌクレオチドの１以上によってコードされるＶＬを含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる抗体、またはその抗原結合断片は、
Figure 2009502123
 よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同一のエピトープに特異的にまたは優先的に結合するか、あるいはそのようなモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合するのを競合的に阻害するであろう。
ある具体例において、前記したポリヌクレオチドの１以上によってコードされるＶＬを含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる抗体またはその抗原結合断片は、
Figure 2009502123
 または１０−１５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片、あるいはＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的にまたは優先的に結合する。
さらなる具体例において、本発明は、軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする単離されたポリヌクレオチドを含み、ここで、該ポリヌクレオチドは、表９に示された、配列番号１８５〜１９４、３７１、３７５、３７９および３８３よりなる群から選択される（ＶＬ）核酸配列を含む。ある具体例において、該ポリヌクレオチドによってコードされるＶＬを含む抗体、または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
Figure 2009502123
Figure 2009502123
Figure 2009502123
 さらなる具体例において、本発明は、表９の配列番号１８５−１９４、３７１、３７５、３７９および３８３よりなる群から選択されるＶＬポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一であるＶＬをコードする核酸を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリヌクレオチドを含む。ある具体例において、該ポリヌクレオチドは、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合するＶＬポリペプチドをコードする。
ある具体例において、前記したポリヌクレオチドの１以上によってコードされるＶＬを含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる抗体、またはその抗原結合断片、
Figure 2009502123
 よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同一のエピトープに特異的にまたは優先的に結合するか、あるいはそのようなモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合するのを競合的に阻害するであろう。
ある具体例において、前記したポリヌクレオチドの１以上によってコードされるＶＬを含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる抗体、またはその抗原結合断片は、
Figure 2009502123
Figure 2009502123
 以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片、あるいはＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的にまたは優先的に結合する。
前記したポリヌクレオチドのいずれも、さらに、例えば、コードされたポリペプチド、本明細書中に記載した抗体定常領域、または本明細書中で記載された他の異種ポリペプチドの分泌を指令する、例えば、シグナルペプチドをコードするさらなる核酸を含むことができる。
また、本明細書中において他の箇所でより詳細に記載されるように、本発明は、前記したポリヌクレオチドの１以上を含むポリヌクレオチドを含む組成物を含む。１つの具体例において、本発明は、第一のポリヌクレオチドおよび第二のポリヌクレオチドを含む組成物を含み、ここで、該第一のポリヌクレオチドは本明細書中に記載されたＶＨポリペプチドをコードし、ここで、該第二のポリヌクレオチドは本明細書中に記載されたＶＬポリペプチドをコードする。具体的には、表７に示されたＶＨポリヌクレオチド、および表９に示されたＶＨポリヌクレオチドを含み、実質的にそれよりなり、またはそれよりなる組成物、ここで、該ＶＨポリヌクレオチドおよび該ＶＬポリヌクレオチドは：
Figure 2009502123
 よりなる群から選択される。
また、本発明は他の箇所に記載された本発明のポリヌクレオチドの断片も含む。加えて、本明細書中に記載された、融合ポリヌクレオチド、Ｆａｂ断片、および他の誘導体をコードするポリヌクレオチドも本発明によって考えられる。
該ポリヌクレオチドは当該分野で知られたいずれかの方法によって生産し、または製造することができる。例えば、もし抗体のヌクレオチド配列が知られていれば、抗体をコードするポリヌクレオチドは、簡単に述べれば、抗体をコードする配列の一部を含有するオリゴヌクレオチドを重複させ、これらのオリゴヌクレオチドをアニールし、連結し、次いで、連結されたオリゴヌクレオチドをＰＣＲによって増幅する合成を含む、（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４）に記載された）化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから組み立ててもよい。
別法として、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体をコードするポリヌクレオチドは、適当な源からの核酸から作り出すことができる。もし特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが利用できないが、抗体分子の配列が知られていれば、該抗体をコードする核酸は、当該配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いるＰＣＲ増幅によって、あるいは例えば、当該抗体または他のＳｐ３５抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーからのｃＤＮＡクローンを同定するために、特定の遺伝子配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いるクローニングによって、化学的に合成することができるか、あるいは適当な源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリー、または抗体を発現するのに選択されたハイブリドーマ細胞のような、抗体または他のＳｐ３５抗体を発現するいずれかの組織または細胞から作成されたｃＤＮＡライブラリー、またはそれらから単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡで）から得ることができる。次いで、ＰＣＲによって生じた増幅された核酸を、当該分野で良く知られたいずれかの方法を用いて複製可能なクローニングベクターにクローン化することができる。
一旦、ヌクレオチド配列、およびＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体の対応するアミノ酸配列が決定されたならば、そのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列の操作について当該分野で良く知られた方法、例えば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ等（例えば、共にここで引用してその全体を援用する、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９０）ａｎｄ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９８に記載された技術参照）を用いて操作して、異なるアミノ酸配列を有する抗体を生じさせ、例えば、アミノ酸置換、欠失および／または挿入を作りだすことができる。
Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体をコードするポリヌクレオチドは、修飾されていないＲＮＡまたはＤＮＡ、または修飾されたＲＮＡまたはＤＮＡであってよいいずれかのポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成することができる。例えば、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、および一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖または、より典型的には二本鎖、あるいは一本鎖および二本鎖領域の混合物であってよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子から構成することができる。加えて、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体をコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡおよびＤＮＡ双方を含む三本鎖領域から構成することができる。Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体をコードするポリヌクレオチドは、１以上の修飾された塩基あるいは安定性のために、または他の理由で修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡ骨格を含有することもできる。「修飾された」塩基が、例えば、トリチル化塩基、およびイノシンのような異常な塩基を含む。種々の修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに対して行うことができ；かくして、「ポリヌクレオチド」は、化学的に、酵素的に、または代謝的に修飾された形態を含む。
免疫グロブリンに由来するポリペプチド（例えば、免疫グロブリン重鎖部分または軽鎖部分）の非天然改変体をコードする単離されたポリヌクレオチドは、１以上のヌクレオチドの置換、付加または欠失を、１以上のアミノ酸の置換、付加または欠失がコードされる蛋白質に導入されるように、免疫グロブリンのヌクレオチド配列に導入することによって作り出すことができる。突然変異は、部位−特異的突然変異誘発、およびＰＣＲ−媒介突然変異誘発のような標準的な技術によって導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換を、１以上の非必須アミノ酸残基において行う。
Ｖ．Ｓｐ３５抗体ポリペプチド
本発明は、さらに、Ｓｐ３５抗体、その抗原結合断片、改変体または誘導体をなす単離されたポリペプチドに向けられる。本発明のＳｐ３５抗体は、ポリペプチド、例えば、免疫グロブリン分子に由来するＳｐ３５特異的抗原結合領域をコードするアミノ酸配列を含む。指名された蛋白質「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列を、ポリペプチドの起源という。ある場合には、特定の出発ポリペプチドまたはアミノ酸配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、出発配列、またはその一部のそれと本質的に同一であるアミノ酸配列を有し、ここで、該部分は少なくとも１０〜２０アミノ酸、少なくとも２０〜３０アミノ酸、少なくとも３０〜５０アミノ酸よりなり、あるいはこれは、そうでなければ、出発配列においてその起源を有するように当業者によって同定可能である。
１つの具体例において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリペプチドを提供し、ここで、重鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ、または重鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも２つは、本明細書中に開示されたモノクローナルＳｐ３５抗体からの参照重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。別法として、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は、本明細書中に開示されたモノクローナルＳｐ３５抗体からの参照重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。かくして、この具体例によると、本発明の重鎖可変領域は、前記表４に示された基に関連するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。ある具体例において、ＶＨポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
ある具体例において、本発明は、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリペプチドを提供し、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は、表４に示されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３基に対して同一であるポリペプチド配列を有する。ある具体例において、ＶＨポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
さらなる具体例において、本発明は、表６に示された配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０および３８４よりなる群から選択される参照ＶＨポリペプチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または１００％同一である。ＶＨポリペプチドを含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリペプチドを含む。ある具体例において、ＶＨポリペプチドを含む抗体、または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
もう１つの態様において、本発明は、表６に示された配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０および３８４よりなる群から選択されるＶＨポリペプチドを含み、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリペプチドを含む。ある具体例において、ＶＨポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
ある具体例において、前記したＶＨポリペプチドの１以上を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる抗体、またはその抗原結合断片は、
Figure 2009502123
 よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同一のエピトープに特異的にまたは優先的に結合するか、あるいはそのようなモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合するのを競合的に阻害するであろう。
ある具体例において、前記したＶＨポリペプチドの１以上を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる抗体または抗原結合断片は、
Figure 2009502123
 以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性をもって、Ｓｐ３５ポリペプチド、またはその断片、あるいはＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的にまたは優先的に結合する。
ある具体例において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリペプチドを提供し、ここで、軽鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも１つ、または軽鎖可変領域のＣＤＲの少なくとも２つは、本明細書中に開示されたモノクローナルＳｐ３５抗体からの参照重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。別法として、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３の領域は、本明細書中に開示されたモノクローナルＳｐ３５抗体からの参照軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。かくして、この具体例によると、本発明の軽鎖可変領域は、前記表５に示されたポリペプチドに関連するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ポリペプチド配列を有する。ある具体例において、ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
もう１つの具体例において、本発明は、免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリペプチドを提供し、ここで、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域は、表５に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３基に対して同一であるポリペプチド配列を有する。ある具体例において、ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
さらなる具体例において、本発明は、表８に示された配列番号２７３〜２８６、３７３、３７７、３８１および３８５よりなる群から選択される参照ＶＬポリペプチドに対して少なくとも８０％、８５％、９０％または９５％同一である。ＶＬポリペプチドを含む、実質的にそれよりなる、それよりなる単離されたポリペプチドを含む。ある具体例において、ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
もう１つの態様において、本発明は、表８に示された配列番号２７３〜２８６、３７３、３７７、３８１および３８５よりなる群から選択されるＶＬポリペプチドを含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる単離されたポリペプチドを含む。ある具体例において、ＶＬポリペプチドを含む抗体または抗原結合断片は、Ｓｐ３５に特異的にまたは優先的に結合する。
ある具体例において、前記したＶＬポリペプチドの１以上を含む、実質的にそれよりなる抗体またはその抗原結合断片は、
Figure 2009502123
 よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同一のエピトープに特異的にまたは優先的に結合するか、あるいはそのようなモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合するのを競合的に阻害するであろう。
ある具体例において、前記したＶＬポリペプチドの１以上を含む、実質的にそれよりなる、またはそれよりなる抗体またはその抗原結合断片は、
Figure 2009502123
Figure 2009502123
 以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で持って、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片、Ｓｐ３５改変体ポリペプチドに特異的にまたは優先的に結合する。
他の具体例において、抗体またはその抗原結合断片は、表６に示されたＶＨポリペプチド、および；
Figure 2009502123
 よりなる群から選択される表８に示されたＶＬポリペプチドを含み、実質的にそれよりなり、またはそれよりなる。
前記したポリペプチドのいずれも、さらに、追加のポリペプチド、例えば、コードされたポリペプチド、本明細書中に記載された抗体定常領域、または、本明細書中に記載された他の異種ポリペプチドの分泌を指令するためのシグナルペプチドを含むことができる。加えて、本発明のポリペプチドは、他の箇所に記載されたポリペプチド断片を含む。加えて、本発明のポリペプチドは、本明細書中に記載された、融合ポリペプチド、Ｆａｂ断片、および他の誘導体を含む。
また、本明細書中において、他の箇所により詳細に記載されているように、本発明は、前記したポリペプチドを含む組成物を含む。
また、本明細書中に開示されたＳｐ３５抗体ポリペプチドは、それらが、それらが由来する天然に生じる結合ポリペプチドからアミノ酸配列が変化するように修飾することができるのは当業者によってやはり理解されるであろう。例えば、指名された蛋白質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は同様であり得、例えば、出発配列に対してあるパーセント同一性を有することができ、例えば、それは出発配列に対して６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一であり得る。
さらに、「非必須」アミノ酸領域における保存的置換または変化に導くヌクレオチドまたはアミノ酸置換、欠失、挿入をなすことができる。例えば、指名された蛋白質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、１以上の個々のアミノ酸置換、挿入、または欠失、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれを超える個々のアミノ酸置換、挿入、または欠失を除いて出発配列と同一であり得る。ある具体例において、指名された蛋白質に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、出発配列に対して１〜５、１〜１０、１〜１５、または１〜２０の個々のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する。
本発明のあるＳｐ３５抗体ポリペプチドは、ヒトアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含み、実質的にそれよりなり、またはそれよりなる。しかしながら、あるＳｐ３５抗体ポリペプチドは、もう１つの哺乳動物種に由来する１以上の連続アミノ酸を含む。例えば、本発明のＳｐ３５抗体は、霊長類重鎖部分、ヒンジ部分、または抗原結合領域を含むことができる。もう１つの例において、１以上のマウス−由来アミノ酸は非マウス抗体ポリペプチドに、例えば、Ｓｐ３５抗体の抗原結合部位に存在し得る。ある治療的適応においては、Ｓｐ３５特異的抗体、またはその抗原結合断片、改変体、またはアナログは、抗体が投与される動物において免疫原性でないように設計される。
ある具体例において、Ｓｐ３５抗体ポリペプチドは、抗体に通常は関連しないアミノ酸配列、または１以上の部位を含む。例示的な修飾は、後により詳細に記載する。例えば、本発明の単一鎖ｆｖ抗体断片はフレキシブルなリンカー配列を含むことができ、あるいは機能的部位（例えば、ＰＥＧ薬物、トキシン、標識）を加えるように修飾することができる。
本発明のＳｐ３５抗体ポリペプチドは融合蛋白質を含み、実施的にそれよりなり、またはそれよりなることができる。融合蛋白質が、例えば、少なくとも１つの標的結合部位、および少なくとも１つの異種部分、すなわち、それは天然で天然には連結されない部分を含むキメラ分子である。アミノ酸配列が、融合ポリペプチドに一緒に運ばれる別々の部分に通常は存在することができるか、あるいはそれらは通常同一蛋白質に存在できるが、融合ポリペプチドにおける新しい配置に入れられる。融合蛋白質は、例えば、化学的合成によって、あるいはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドを創製し、翻訳することによって作り出すことができる。
ポリヌクレオドまたはポリペプチドに適応される用語「異種」は、ポリヌクレオドまたはポリペプチドが、それが比較されようとしている存在の残りのそれからの区別される存在に由来する。例えば、本明細書中で用いるように、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、またはアナログは、同一種の非免疫グロブリンポリペプチドまたは異なる種の免疫グロブリンまたは非免疫グロブリンポリペプチドに由来する。
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様な側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられたものである。同様な側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電されていない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイン）、芳香族側鎖、（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。かくして、免疫グロブリンポリペプチドにおける非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同一側鎖ファミリーからのもう１つのアミノ酸残基で置き換えられる。もう１つの具体例において、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーメンバーの順序および／または組成が異なる構造的に同様なストリングで置き換えることができる。
別法として、もう１つの具体例において、突然変異は、飽和突然変異誘発によるなどして、免疫グロブリンコーディング配列の全部または一部に沿ってランダムに導入することができ、得られた突然変異体は、本明細書中に開示された診断および治療方法で用いられるＳｐ３５抗体に取り込むことができ、所望の抗原、例えば、Ｓｐ３５に結合するそれらの能力についてスクリーニングすることができる。
ＶＩ．融合蛋白質および抗体コンジュゲート
本明細書中において他の箇所でより詳細に議論するように、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、さらに、Ｎ−またはＣ−末端において異種ポリペプチドに組換えにより融合させることができ、ポリペプチドまたは他の組成物に化学的にコンジュゲートさせることができる（共有結合および非共有結合コンジュゲーション）。例えば、Ｓｐ３５特異的Ｓｐ３５抗体が、検出アッセイにおいて標識として有用な分子、および異種ポリペプチド、薬物、放射性核種またはトキシンのようなエフェクター分子に組換えにより縮合させ、またはコンジュゲートさせることができる。例えば、ここで引用してその全体を援用する、ＰＣＴ公開ＷＯ ９２／０８４９５；ＷＯ ９１／１４４３８；ＷＯ ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ ３９６，３８７参照。
本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、共有結合は抗体がＳｐ３５に結合するのを妨げないような、いずれかのタイプの分子の抗体への共有結合によって修飾された誘導体を含む。例えば、限定されるものではないが、抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、ホスフィレーション、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、蛋白質分解切断、細胞リガンドまたは他の蛋白質への結合などによって修飾された抗体を含む。多数の化学的修飾のいずれも、限定されるものではないが、特異的化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含めた公知の技術によって行うことができる。加えて、誘導体は１以上の非古典的アミノ酸を含有することができる。
本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、またはその誘導体は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって相互に連結されたアミノ酸、すなわち、ペプチドアイソステールから構成することができ、２０遺伝子−コード付けアミノ酸以外のアミノ酸を含有することができる。Ｓｐ３５特異的抗体は、翻訳後プロセッシングのような天然プロセスによって、または当該分野で良く知られた化学的修飾技術によって修飾することができる。そのような修飾は基本的なテキストにおいて、およびより詳細なモノグラフにおいて、ならびにボリュームがある研究文献においてよく記載されている。修飾が、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシル末端を含めたＳｐ３５特異的抗体におけるいずれかの箇所で、あるいは炭水化物のような部位で起こり得る。同一タイプの修飾が、与えられたＳｐ３５特異的抗体においていくつかの部位で同一または異なる程度存在し得ることは認識されよう。与えられたＳｐ３５特異的抗体は、多くのタイプの修飾を含有することができる。Ｓｐ３５特異的抗体は、例えば、ユビキチン化の結果として分岐させることができ、それらは分岐の有りまたは無しにて環状であり得る。環状、分岐、および分岐環状Ｓｐ３５特異的抗体は翻訳後天然プロセスから由来してもよく、あるいは合成方法によって作成してもよい。修飾はアセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部位の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ＰＥＧ化、蛋白質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化のような蛋白質へのアミノ酸のトランスファー−ＲＮＡ媒介付加、およびユビキチン化を含む。（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ２ｎｄ Ｅｄ．，（１９９３）；Ｐｏｓｔｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６６３：４８−６２（１９９２））。
また、本発明は、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体、および異種ポリペプチドを含む融合蛋白質も提供する。抗体が融合する異種ポリペプチドは機能的に有用であり得、またはＳｐ３５ポリペプチド発現細胞を標的とするのに有用である。ひとつの具体例において、本発明の融合蛋白質は、本発明の抗体のＶＨ領域のいずれかの１以上のアミノ酸配列、または本発明の抗体、またはその断片または改変体のＶＬ領域のいずれかの１以上のアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含み、実質的にそれよりなり、またはそれよりなる。もう１つの具体例において、本明細書中に開示された診断および治療方法で用いられる融合蛋白質は、Ｓｐ３５特異的抗体、またはその断片、改変体、または誘導体のＶＨ ＣＤＲのいずれかの１、２、３のアミノ酸配列、またはＳｐ３５特異的抗体、またはその断片、改変体、または誘導体のＶＬ ＣＤＲのいずれかの１、２、３のアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含み、実質的にそれよりなり、またはそれよりなる。１つの具体例において、融合蛋白質は、本発明のＳｐ３５特異的抗体、またはその断片、誘導体、または改変体のＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む。もう１つの具体例において、融合蛋白質は、本発明のＳｐ３５特異的抗体の少なくとも１つのＶＨ領域のアミノ酸配列、および本発明のＳｐ３５特異的抗体、またはその断片、誘導体、または改変体の少なくとも１つのＶＬ領域のアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む。好ましくは、融合蛋白質のＶＨおよびＶＬ領域は、Ｓｐ３５の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する単一源抗体（または、ｓｃＦｖまたはＦａｂ断片）に対応する。なおもう１つの具体例において、本明細書中に開示された診断および治療方法で用いられる融合蛋白質は、Ｓｐ３５特異的抗体のＶＨ ＣＤＲのいずれかの１、２、３以上のアミノ酸配列、およびＳｐ３５特異的抗体、またはその断片または改変体のＶＬ ＣＤＲのいずれかの１、２、３以上のアミノ酸配列、および異種ポリペプチド配列を有するポリペプチドを含む。好ましくは、ＶＨＣＤＲまたはＶＬ ＣＤＲの２、３、４、５、６以上は、本発明の単一源抗体（またはｓｃＦｖまたはＦａｂ断片）に対応する。これらの融合蛋白質をコードする核酸分子もまた本発明によって含まれる。
文献で報告された例示的な蛋白質は、Ｔ細胞受容体（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２９３６−２９４０（１９８７））；ＣＤ４（Ｃａｐｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−５３１（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３９：６８−７０（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ ９：３４７−３５３（１９９０）；ａｎｄ Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６６７−６７０（１９９０））；Ｌ−セレクチン（ホーミング受容体）（Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１−２２２９（１９９０）；ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：１６４−１６７（１９９１））；ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３（１９９０））；ＣＤ２８およびＢ７（Ｌｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０（１９９１））；ＣＴＬＡ−４（Ｌｉｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １７４：５６１−５６９（１９９１））；ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６：１１３３−１１４４（１９９１））；ＴＮＦ受容体（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３−２８８６（１９９１）；ａｎｄ Ｐｅｐｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３−１４８９（１９９１））；ａｎｄ ＩｇＥ受容体ａ（Ｒｉｄｇｗａｙ ａｎｄ Ｇｏｒｍａｎ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１１５，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．１４４８（１９９１））の融合を含む。
ある具体例において、Ｓｐ３５抗体、その抗体断片、誘導体および改変体は、さらに、標的化部位を含む。標的化部位は、身体のある部分の、例えば、脳またはそのなかの区画への局所化を指令する蛋白質またはペプチドを含む。ある具体例において、Ｓｐ３５抗体、その抗体断片、誘導体および改変体は脳標的化部位に結合され、または融合される。脳標的化部位は共有結合され、（例えば、直接的翻訳融合、あるいは直接的、または所望により切断可能なスペーサー分子を介する化学的結合による）、あるいは非共有結合される（例えば、アビジン、ビオチン、プロテインＡ、ＩｇＧ等のような可逆的な相互作用を介する）。他の具体例において、Ｓｐ３５抗体、その抗体断片、誘導体および改変体はさらに１つの脳標的化部位に結合される。さらなる具体例において、脳標的化部位は複数のＳｐ３５抗体、その抗体断片、誘導体および改変体に結合される。
Ｓｐ３５抗体、その抗体断片、誘導体または改変体に会合した脳標的化部位は、そのようなＳｐ３５抗体、その抗体断片、誘導体および改変体の脳送達を増強させる。蛋白質または治療剤に融合されると、該蛋白質または治療剤を血液脳関門（ＢＢＢ）を介して送達する多数のポリペプチドが記載されている。非限定的例は単一ドメイン抗体ＦＣ５（Ａｂｕｌｒｏｂ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９５，１２０１−１２１４）；ｍＡＢ ８３−１４、ヒトインスリン受容体に対するモノクローナル抗体（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｓ．１２，８０７−８１６）；ヒトトランスフェリン受容体（ｈＴｆＲ）へのＢ２、Ｂ６およびＢ８ペプチド（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１１３５９−１１３６６）；トランスフェリン受容体に対するＯＸ２６モノクローナル抗体（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５９，６６−７０）；および米国特許第６，３０６，３６５号の配列番号１〜１８を含む。前記した文献の内容をここで引用してその全体を援用する。
Ｓｐ３５抗体、その抗体断片、誘導体または改変体の増強された脳送達は、当該分野でよく確立された多数の手段によって決定される。例えば、脳標的化部位に連結された放射線、酵素または蛍光標識されたＳｐ３５抗体、その抗体断片、誘導体および改変体の動物への投与；脳局所化の決定；および局所化の、脳標的化部位に会合していない同等な放射線、酵素または蛍光標識されたＳｐ３５抗体、その抗体断片、誘導体または改変体との比較。増強された標的化を決定する他の手段は前記した文献に記載されている。
本明細書中において他の箇所で議論されたように、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体を異種ポリペプチドに融合させて、ポリペプチドのイン・ビボ半減期を増加させることができ、あるいは当該分野で知られた方法を用いるイムノアッセイで用いることができる。例えば、１つの具体例において、ＰＥＧを本発明のＳｐ３５抗体にコンジュゲートさせて、イン・ビボでのその半減期を増大させることができる。Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ １６：１０６（２００１）；Ａｄｖ．ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５４：５３１（２００２）；またはＷｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ３０：５１２（２００２）。
さらに、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体をペプチドのようなマーカー配列に融合させて、それらの精製または検出を容易とすることができる。好ましい具体例において、マーカーアミノ酸配列は、ｐＱＥベクター中で提供されるタグ（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ，９１３１１）のようなヘキサ−ヒスチジンポリペプチドであり、とりわけ、その多くは商業的に入手可能である。Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されたように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合蛋白質の便宜な精製を提供する。精製でいうような他のペプチドタグは、限定されるものではないが、インフルエンザヘマグルチニン蛋白質に由来するエピトープに対応する「ＨＡ」タグを含み、（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））および「フラグ」タグを含む。
融合蛋白質は当該分野でよく知られた方法を用いて調製することができる（例えば、米国特許第５，１１６，９６４号および第５，２２５，５３８号参照）。融合が行われる正確な部位を、経験的に選択して、融合蛋白質の分泌または結合特徴を最適化することができる。ついで、融合蛋白質をコードするＤＮＡを発現のために宿主細胞にトランスフェクトする。
本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は非コンジュゲーテッド形態で用いることができ、あるいは種々の分子の少なくとも１つにコンジュゲートして、例えば、分子の治療的特性を改良し、標的検出を容易とし、または患者のイメージングまたは療法を行うことができる。本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体を、精製を行う場合には、精製の前または後いずれかに標識し、またはコンジュゲートさせることができる。
特に、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、治療剤、プロドラッグ、ペプチド、蛋白質、酵素、ウィルス、脂質、生物学的応答モディファイアー、医薬剤、またはＰＥＧにコンジュゲートすることができる。
当業者であれば、コンジュゲートは、コンジュゲートすべき選択された剤に依存して種々の技術を用いて組み立てることもできるのを認識するであろう。例えば、ビオチンとのコンジュゲートは、例えば、結合ポリペプチドを、ビオチンＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのようなビオチンの活性化されたエステルと反応させることによって調整される。同様に、蛍光マーカーとのコンジュゲートは、カップリング剤、例えば、本明細書中にリストされたものの存在下で、あるいはイソチオシアネート、好ましくはフルオレセイン−イソチオシアネートとの反応によって調製することができる。本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体のコンジュゲートは同様にして調製される。
本発明は、さらに、診断剤または治療剤にコンジュゲートされた本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体を含む。Ｓｐ３５抗体を診断で用いて、例えば、臨床試験手法の一部として神経学的病気の発生または進行をモニターし、例えば、与えられた治療および／または予防養生法の効率を決定することができる。検出は、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体を検出可能な物質にカップリングさせることによって容易とすることができる。検出可能な物質の例は種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、ルミネセント物質、バイオルミネセント物質、放射性物質、種々の陽電子射出断層撮影法を用いる陽電子放出金属および非放射性常磁性金属イオンを含む。例えば、本発明による診断剤として用いられる抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンについては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号参照。適当な酵素の例はホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含み；適当な補欠分子族複合体の例はストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；適当な蛍光物質の例はウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンを含み；ルミネセント物質の例はルミノールを含み；バイオルミネセント物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびアクオリンを含み；および適当な放射性物質の例は１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎまたは９８Ｔｃを含む。
Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、誘導体は、それをケミルミネセント化合物にカップリングさせることによって検出可能に標識することもできる。次いで、ケミルミネセント−タグドＳｐ３５抗体の存在は、化学反応の間に生じるルミネセンスの存在を検出することによって決定される。特に有用なケミルミネセント標識化合物の例はルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジにウム塩およびオキサレートエステルである。
Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片改変体、または誘導体を検出可能に標識できる方法の１つは、酵素にそれを連結し、かつ酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）において連結された産物を用いることによる（Ｖｏｌｌｅｒ，Ａ．，“Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”Ｍｉｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ２：１−７（１９７８））；Ｖｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｒｙｍｏｌ．７３：４８２−５２３（１９８１）。；Ｍａｇｇｉｏ，Ｅ．（ｅｄ．），Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，（１９８０）；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ），Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，Ｋｇａｋｕ Ｓｈｏｉｎ，Ｔｏｋｙｏ（１９８１））。Ｓｐ３５抗体に結合した酵素は適当な基質、好ましくは色素産生基質等、例えば、分光測定、フルオロメトリーによって、または肉眼によって検出することができる化学部位を生じるように反応するであろう。抗体を検出可能に標識するのに用いることができる酵素は、限定されるものではないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロホスファターゼ、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼを含む。加えて、検出は、該抗素に対する色素酸性基質を使用する比色方法によって達成することができる。また、検出は、同様に調製された標準と比較する基質の酵素反応の程度の肉眼での比較によって達成することもできる。
また、検出は、種々の他のイムノアッセイのいずれかを用いて達成することもできる。例えば、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体を放射性標識することによって、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用を介して抗体を検出することが可能である（例えば、ここで引用して援用する、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ，（Ｍａｒｃｈ，１９８６）参照）。放射性同位体は、限定されるものではないが、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィーを含めた手段によって検出することができる。
Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は１５２Ｅｕのような蛍光放出金属、またはランタニド系列のその他のものを用いて検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート化基を用いて抗体に結合させることができる。
種々の部位をＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体にコンジュゲートするための技術はよく知られている。例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．６２３−５３（１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ‘８４ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ， Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ｐｐ．３０３−１６（１９８５），ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９−５８（１９８２）参照。
ＶＩＩ．抗体ポリペプチドの発現
よく知られているように、ＲＮＡは、グアニジウムイソチオシアネート抽出および沈殿、続いての遠心またはクロマトグラフィーのような標準技術によって元のハイブリドーマ細胞から、または他の形質転換細胞から単離することができる。望ましい場合、ｍＲＮＡは、オリゴｄＴセルロースでのクロマトグラフィーのような標準技術によって全ＲＮＡから単離することができる。適当な技術は当該分野で精通している。
１つの具体例において、抗体の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、よく知られた方法に従って、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを用いて同時にまたは別々に作成することができる。ＰＣＲは、コンセンサス定常領域プライマーによって、あるいは公表された重鎖および軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づくより特異的なプライマーによって開始させることができる。先に議論したように、ＰＣＲを用いて、抗体の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡクローンを単離することもできる。この場合、ライブラリーは、コンセンサスプライマー、またはマウス定常領域プローブのようなより大きな相同プローブによってスクリーニングすることができる。
ＤＮＡ、典型的にはプラスミドＤＮＡは当該分野で知られた技術を用いて細胞から単離し、例えば、組換えＤＮＡ技術に関する前記文献に詳細に記載された標準的なよく知られた技術に従って制限マッピングし、配列決定することができる。勿論、ＤＮＡは、単離プロセスまたは引き続いての分析の間のいずれかの時点において本発明に従って合成のものであってよい。
本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体を供する単離された遺伝物質の操作に続いて、Ｓｐ３５抗体をコードするポリヌクレオチドは、典型的には、所望の量のＳｐ３５抗体を生産するのに用いることができる宿主細胞への導入のために発現ベクターに挿入される。
抗体、またはその断片、誘導体またはアナログ、例えば、本明細書中に記載された標的分子に結合する抗体の重鎖または軽鎖、例えば、Ｓｐ３５抗体の組換え発現は、該抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。一旦、本発明の抗体の抗体分子または重鎖もしくは軽鎖、または（好ましくは、重鎖または軽鎖可変ドメインを含有する）その部分をコードするポリヌクレオチドが得られたならば、抗体分子の生産用のベクターは、当該分野でよく知られた技術を用いる組換えＤＮＡ技術によって生産することができる。かくして、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現させることによって蛋白質を調製する方法は本明細書中に記載されている。当業者によく知られた方法を用いて、抗体コーディング配列、および適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、イン・ビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびイン・ビボ遺伝子組換えを含む。本発明は、かくして、プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体分子、またはその重鎖または軽鎖、または重鎖または軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ ８６／０５８０７；ＰＣＴ公開ＷＯ ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号参照）、抗体の可変ドメインは、全重鎖または軽鎖の発現用のそのようなベクターにクローン化することができる。
宿主細胞を本発明の２つの発現ベクターで共−トランスフェクトすることができ、第一のベクターは重鎖由来ポリペプチドをコードし、第二のベクターは軽鎖由来ポリペプチドをコードする。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等な発現を可能とする同一の選択可能なマーカーを含有することができる。別法として、重鎖および軽鎖ポリペプチド双方をコードする単一ベクターを用いてもよい。そのような状況においては、軽鎖は、有利には、過剰の毒性遊離重鎖を回避するために重鎖の前に置かれる（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖についてのコーディング配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むことができる。
用語「ベクター」または「発現ベクター」は、本明細書中においては、所望の遺伝子を宿主細胞に導入し、それを発現させるためのビークルとして本発明に従って用いられるベクターを意味するように用いられる。当業者に知られているように、そのようなベクターはプラスミド、ファージ、ウィルスおよびレトロウィルスよりなる群から容易に選択することができる。一般に、本発明に適合するベクターは、所望の遺伝子のクローニング、および真核生物または原核生物細胞に入り、および／またはそこで複製する能力を促進するための選択マーカー、適当な制限部位を含むであろう。
本発明の目的では、多数の発現ベクター系を使用することができる。例えば、ベクターの１つのクラスは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウィルス（ＲＳＶ，ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）またはＳＶ４０ウィルスのような動物ウィルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。他のものは、内部リボソーム結合部位を持つポリシストロニックシステムの使用を含む。加えて、ＤＮＡをその染色体に取り込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能とする１以上のマーカーを導入することによって選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主、殺生物剤抵抗性（例えば、抗生物質）、または銅のような重金属に対する抵抗性に対する原栄養性を提供できる。選択マーカー遺伝子は発現すべきＤＮＡ配列に直接的に連結させることができるか、あるいは共形質転換によって同一細胞に導入することができる。さらなるエレメントもまたｍＲＮＡの最適な合成で必要とされるかも知れない。これらのエレメントはシグナル配列、スプライスシグナル、ならびに転写プロモーター、エンハンサー、および終止シグナルを含むことができる。
特に好ましい具体例において、クローン化された可変領域遺伝子は、前記で議論した合成の重鎖および軽鎖定常領域遺伝子（好ましくは、ヒト）と共に発現ベクターに挿入される。１つの具体例において、これは、ＮＥＯＳＰＬＡ（米国特許第６，１５９，７３０号）というＢｉｏｇｅｎ ＩＤＥＣ，Ｉｎｃ．，の所有された発現ベクターを用いて行われる。このベクターはサイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサー、マウスベータグロビン、主要なプロモーター、ＳＶ４０複製起点、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼエクソン１およびエクソン２、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子およびリーダー配列を含有する。このベクターは、可変および定常領域遺伝子の組込み、ＣＨＯ細胞でのトランスフェクション、続いての、Ｇ４１８含有培地での選択、およびメトトレキセート増幅に際して、抗体の非常に高いレベルの発現をもたらすことが判明した。勿論、真核生物細胞において発現を惹起することができるいずれの発現ベクターも本発明で用いることができる。適当なベクターの例は、限定されるものではないが、プラスミドｐｃＤＮＡ３、ｐＨＣＭＶ／Ｚｅｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＥＦ１／Ｈｉｓ、ｐＩＮＤ／ＧＳ、ｐＲｃ／ＨＣＭＶ２、ｐＳＶ４０／Ｚｅｏ２、ｐＴＲＡＣＥＲ−ＨＣＭＶ、ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ，ｐＶＡＸ１、およびｐＺｅｏＳＶ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）、およびプラスミドｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）を含む。一般に、高レベルの免疫グロブリン重鎖および軽鎖を、適切に発現するものについての非常に多数の形質転換細胞をスクリーニングするのは、例えば、ロボットシステムによって実行することができるルーチン的実験である。ベクターシステムは、その各々をここで引用してその全体を援用する、米国特許第５，７３６，１３７号および第５，６５８，５７０号にも教示されている。このシステムは、高い発現レベル、例えば、＞３０ｐｇ／細胞／日を提供する。他の例示的なベクターシステムは、例えば、米国特許第６，４１３，７７７号に開示されている。
他の好ましい具体例において、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、ここでその全体を援用する、２００２年１１月１８日に出願された米国特許出願公開番号２００３−０１５７６４１ Ａ１に開示されたもののようなポリシストロニック構築体を用いて発現させることができる。これらの新規な発現系においては、抗体の重鎖および軽鎖のような注目する多数の遺伝子産物を単一のポリシストロニック構築体から生産することができる。これらのシステムは、有利には、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を用いて、真核生物宿主細胞において、比較的高レベルのＳｐ３５抗体、例えば、結合ポリペプチド、例えば、Ｓｐ３５特異的抗体またはその免疫特異的断片を提供する。適合するＩＲＥＳ配列は、やはりここで援用する米国特許第６，１９３，９８０号に開示されている。当業者であれば、そのような発現システムを用いて、本出願に開示された十分な範囲のＳｐ３５抗体を効果的に生産することができることを認識するであろう。
より一般的には、一旦、Ｓｐ３５抗体のモノマーサブユニットをコードするベクターまたはＤＮＡ配列が調製されたならば、発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することができる。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者によく知られた種々の技術によって達成することができる。これらは、限定されるものではないが、（電気詠動およびエレクトロポレーションを含めた）トランスフェクション、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、包まれたＤＮＡとの細胞融合、マイクロインジェクション、および無傷ウィルスへの感染を含む。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．“Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ”Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ２４．２，ｐｐ．４７０−４７２（１９８８）参照。典型的には、宿主へのプラスミドの導入はエレクトロポレーションを介するものである。発現構築体を保有する宿主細胞を、軽鎖および重鎖の生産に適した条件下で成長させ、重鎖および／または軽鎖蛋白質合成についてアッセイする。例示的なアッセイ技術は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、または蛍光−活性化細胞ソーター分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学等を含む。
発現ベクターは慣用的な技術によって宿主細胞に導入し、次いで、慣用的な技術によってトランスフェクトされた細胞を培養して、本明細書中に記載された方法で用いられる抗体を生産する。かくして、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結された、本発明の抗体、またはその重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。好ましい具体例においては、二重鎖抗体の発現のために、重鎖および軽鎖を共にコードするベクターを、以下に詳細に記載するように、全免疫グロブリン分子の発現のために宿主細胞において共−発現させることができる。
本明細書中で用いるように、「宿主細胞」とは、組換えＤＮＡ技術を用いて構築され、かつ少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを保有する細胞をいう。組換え宿主からの抗体の単離のためのプロセスの記載において、用語「細胞」および「細胞培養」は、明瞭に断りのない限り、抗体の源を示すために相互効果可能に用いられる。換言すれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、全回転沈降させた全細胞から、または培地および懸濁した細胞双方を含有する細胞培養からを意味することができる。
種々の宿主−発現ベクターシステムを利用して、本明細書中に記載された方法で用いる抗体分子を発現させることができる。そのような宿主−発現システムは、注目するコーディング配列を生産し、引き続いて、精製することができるビークルを表すが、適当なヌクレオチドコーディング配列で形質転換し、またはトランスフェクトした場合、イン・サイチュにて本発明の抗体分子を発現することができる細胞も表す。これらは、限定されるものではないが、抗体コーディング配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のような微生物；抗体コーディング配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コーディング配列を含有する組換えウィルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；抗体コーディング配列を含有する組換えウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染させた、または該配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノムから（例えば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳動物ウィルスから（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）由来するプロモーターを含有する組換え発現構築体を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＬＫ、２９３、３Ｔ３細胞）を含む。好ましくは、特に、全組換え抗体分子の発現用の、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような細菌細胞、より好ましくは真核生物細胞を、組換え抗体分子の発現で用いる。例えば、ヒトサイトメガロウイルスからの主要即時型遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わせた、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞は、抗体のための有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
蛋白質発現で用いられる宿主細胞系は、しばしば、哺乳動物起源のものであり；当業者であれば、所望の遺伝子産物がそこで発現されるのに最良に適した特定の宿主細胞系を優先的に決定する能力が保障されている。例示的な宿主細胞系は、限定されるものではないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＤＧ４４およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト頸部癌腫）、ＣＶＩ（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０ Ｔ抗原を持つＣＶＩの誘導体）、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）、ＳＰ２／Ｏ（マウスミエローマ）、Ｐ３×６３−Ａｇ３．６５３（マウスミエローマ）、ＢＦＡ−１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）および２９３（ヒト腎臓）を含む。ＣＨＯ細胞が特に好ましい。宿主細胞系は、典型的には、商業的なサービス、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから、または公表された文献から入手可能である。
加えて、挿入された配列の発現を変調し、または所望の特異的様式で遺伝子産物を修飾し、プロセッシングする宿主細胞株を選択することができる。蛋白質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）は蛋白質の機能で重要であり得る。異なる宿主細胞は、蛋白質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾のための特徴および特異的メカニズムを有する。適当な細胞系または宿主系を選択して、発現させる外来性蛋白質の正しい修飾およびプロセッシングを確実とする。この目的で、一次転写体の適切なプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞マシーンを保有する真核生物宿主細胞を用いることができる。
組換え蛋白質の長期高−収率生産のためには、安定な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞系を作成することができる。ウィルス複製起点を含有する発現ベクターを用いるよりはむしろ、適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等）によって制御されるＤＮＡ、および選択マーカーで宿主細胞を形質転換することができる。外来性ＤＮＡの導入に続いて、作成された細胞を豊富化された培地中で１〜２日増殖させることができ、次いで、選択培地にスイッチする。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する抵抗性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体に安定に組み込むのを可能とし、成長してフォーカスを形成し、それは、今度は、細胞系にクローン化され、拡大培養することができる。有利には、この方法を用いて、抗体分子を安定に発現する細胞系を作成することができる。
限定されるものではないが、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２（１９９２））を含めた多数の選択系を用いることができ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：８１７ １９８０）遺伝子を、各々、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞で使用することができる。また、抗代謝産物抵抗性を以下の遺伝子についても選択の基礎として用いることができる：メトトレキセートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ，Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ａｎｄ Ｍｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；，ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（Ｍａｙ，１９９３））；およびヒグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒを（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。用いることができる組換えＤＮＡ技術の当該分野で通常に知られた方法は、ここで引用してその全体を援用する、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；ａｎｄ ｉｎ Ｃｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｌｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１）に記載されている。
抗体分子の発現レベルはベクター増幅によって増大させることができる（レビューについては、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ， Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３．（１９８７）参照）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させるであろう。増幅された領域が抗体遺伝子に関係するので、抗体の生産もまた増大するであろう（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７（１９８３））。
イン・ビトロ生産はスケールアップを可能として、大量の所望のポリペプチドを得る。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養のための技術は当該分野で知られており、例えば、エアリフトリアクターでのまたは連続的スターラーリアクターでの均一懸濁培養、または例えば、中空線維、マイクロカプセル中での、アガロースマイクロビーズまたはセラミックカートリッジ上での不滅化されたまたは捕獲された細胞培養を含む。必要であるかおよび／または所望であれば、ポリペプチドの溶液は、例えば、合成ヒンジ領域ポリペプチドの優先的生合成後に、または本明細書中に記載されたＨＩＣクロマトグラフィー工程に先立って、またはそれに引き続いて、慣用的なクロマトグラフィー方法、例えば、ゲル濾過、イオン−交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィー、または（イムノ−）アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体をコードする遺伝子は、細菌または酵母または植物細胞のような非哺乳動物細胞において発現させることもできる。容易に核酸を摂取する細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａの株のようなＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓのようなＢａｃｉｌｌａｃｅａｅ；Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、およびＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのメンバーを含む。細菌で発現された場合、異種ポリペプチドは典型的には封入体の一部となることもさらに認識されるであろう。異種ポリペプチドは単離し、精製し、次いで、機能的分子に組み立てらなければならない。抗体の四価形態が望まれる場合、次いで、サブユニットは四価抗体に自己−組み立てられるであろう（ＷＯ ０２／０９６９４８Ａ２）。
細菌系においては、発現すべき抗体分子についての意図された使用に依存して、多数の発現ベクターを有利には選択することができる。例えば、大量のそのような蛋白質を生産すべき場合、抗体分子の医薬組成物の生成のためには、容易に精製される高レベルの融合蛋白質産物の発現を指令するベクターが望ましいであろう。そのようなベクターは、限定されるものではないが、抗体コーディング配列が、融合蛋白質が生成されるようにｌａｃＺコーディング領域とイン・フレームにてベクターの個々に連結することができるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９（１９８９））等を含む。ｐＧＥＸベクターを用いて、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質として外来性ポリペプチドを発現させることもできる。一般には、そのような融合蛋白質は可溶性であって、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、続いて、遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解された細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化された標的遺伝子産物がＧＳＴ部位から放出できるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含めるように設計される。
原核生物に加えて、真核生物微生物も用いることができる。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または通常のベーカーズイーストは、真核生物微生物のなかで最も通常に用いられているが、多数の他の株は、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓが通常は利用可能である。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおける発現では、例えば、プラスミドＹＲｐ７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０：１５７（１９８０））が通常用いられる。このプラスミドは、トリプトファン中で成長する能力を欠如する酵母の突然変異体株、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８５：１２（１９７７））のための選択マーカーを供するＴＲＰ１遺伝子を既に含有する。次いで、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１障害の存在は、トリプトファンの不存在下における成長によって形質転換を検出するための有効な環境を提供する。
昆虫系において、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が典型的には外来性遺伝子を発現させるためのベクターとして用いられる。該ウィルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞で成長する。抗体コーディング配列をウィルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。
一旦、本発明の抗体分子が組換えにより発現されれば、それは、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、特に、プロテインＡ後の特異的抗原に対するアフィニティーによるアフィニティー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心、異なる溶解性によって、あるいは蛋白質の精製用のいずれかの他の標準的な技術によって、免疫グロブリン分子の精製のための当該分野で公知のいずれかの方法によって精製することができる。別法として、本発明の抗体の親和性を増大させるための好ましい方法はＵＳ ２００２ ０１２３０５７ Ａ１に記載されている。
ＶＩＩ．治療Ｓｐ３５抗体を用いる治療方法
本明細書中で記載されるように、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、ＣＮＳニューロンで通常起こる軸索延長のＮｇＲ１−媒介阻害を軽減することができる。これは、軸索延長または神経突起急速成長が脳または脊髄で必要とされる状況において有利である。部分的なまたは完全な破砕または切断としては、軸索延長が必要とされるが、通常は、ノゴ経路の操作を通じて正常には阻害される状況が例示される。脳における軸索延長および／または神経突起急速成長が利益となる病気または障害の例は、脳卒中、多発性硬化症、および多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、中枢橋ミエリン分解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）およびウォーラー変性のような他の神経変性病または障害、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄負傷、外傷性脳負傷、放射線照射後負傷、化学療法の神経学的合併症、脳卒中、神経障害、急性虚血性視神経障害、ビタミンＥ欠乏症、単離ビタミンＥ欠乏症症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァー−ビグナミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、ベル麻痺、脊髄負傷、およびニューロン細胞死に関連する全ての神経学的病気を含む。
本発明者らは、さらに、Ｓｐ３５は稀突起神経膠細胞において発現され、稀突起神経膠細胞生物学に寄与することを発見した。本明細書中に記載された、Ｓｐ３５の可溶性誘導体、ある種のポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡｉ）、ならびにＳｐ３５に特異的に結合するある種の抗体は、稀突起神経膠細胞におけるＳｐ３５機能に対するアンタゴニストとして作用し、稀突起神経膠細胞の増殖、分化および生存を促進し、イン・ビトロおよびイン・ビボにおいてニューロンのミエリン形成を促進する。これは、脱髄および髄鞘脱落に関連する病気、障害または疾患で有利である。稀突起神経膠細胞の増殖、分化および生存、および／またはミエリン形成または再ミエリン形成が利益を受けるであろう病気または障害の例は多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、中枢橋ミエリン分解（ＣＰＭ）、副腎脳白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス−メルツバッピャー病（ＰＭＺ）、球様細胞白質萎縮症（クラッベ病）、ウォーラー変性、視神経炎、横断脊髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、脊髄負傷、外傷性脳負傷、放射線照射後負傷、化学療法の神経学的合併症、脳卒中、急性虚血性視神経障害、ビタミンＥ欠乏症、単離ビタミンＥ欠乏症候群、ＡＲ、バッセン−コルンツヴァイク症候群、マルキアファーヴァー−ビグナミ症候群、異染性白質萎縮症、三叉神経痛、およびベル麻痺を含む。
従って、本発明の１つの具体例は、脊髄負傷、ＣＮＳにおけるニューロン成長の阻害に関連する病気または障害、稀突起神経膠細胞の成長または分化の阻害に関連する病気または障害、およびそのような負傷または病気に罹った、あるいはそのような病気に罹る素因がある動物におけるＣＮＳニューロンの脱髄または髄鞘脱落に関連する病気を治療する方法を提供し、該方法は、有効量のＳｐ３５抗体、またはその抗体−結合断片、改変体、または誘導体を動物に投与することを含み、実質的にそれよりなり、またはそれよりなる。本発明の抗体は本明細書中に記載され、表３Ａおよび３Ｂにリストされたモノクローナル抗体、表３Ａおよび３Ｂにリストされたモノクローナル抗体と同一のエピトープに特異的に結合する抗体、Ｓｐ３５に対する表３Ａおよび３Ｂにリストされたモノクローナル抗体の結合を競合的に阻害する抗体、および表３Ａおよび３Ｂにリストされたモノクローナル抗体に由来するポリペプチドを含む抗体を含む。
本明細書中に開示された治療方法で用いるべき治療Ｓｐ３５抗体を調製し、ＣＮＳ神経突起形成、ニューロン生存、軸索ガイダンスおよび軸索再生を促進する、稀突起神経膠細胞の生存、成長、および／または分化を促進する、およびＣＮＳニューロンのミエリン形成または再ミエリン形成を促進する治療剤として用いることができる。適当な治療Ｓｐ３５抗体の特徴は：Ｓｐ３５活性のブロッキングをもたらすＳｐ３５エピトープへの結合、治療効果を誘導するのに十分な親和性でもってのＳｐ３５への結合、および正常な結合パートナー、例えば、ノゴ受容体に対するよりも優先的なＳｐ３５への結合を含む。
治療Ｓｐ３５抗体はモノクローナル、キメラまたはヒト化抗体、またはＳｐ３５に特異的に結合する抗体の断片であってよい。抗体は一価、二価、多価、または二機能的抗体であってよい。抗体断片は、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片を含む。
本発明による治療Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体は、標識されていないまたはコンジュゲートされていない形態で用いることができ、あるいはさらなる治療効果を発揮してもまたは発揮しなくてもよい薬物、標識または安定化剤にカップリングさせ、または結合させることができる。
いずれかの特定の患者に対する具体的な用量および治療養生法は、用いる特定のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体、患者の年齢、体重、身体的健康、性別、およびダイエット、ならびに投与の時間、排出速度、薬物組合せ、および治療すべき特定の病気の重症度を含めた種々の因子に依存するであろう。医学的看護者によるそのような因子の判断は、当該分野における通常の技量内のものである。該量は、治療すべき個々の患者、投与の経路、処方のタイプ、用いる化合物の特徴、病気の重症度、および所望の効果にやはり依存するであろう。用いる量は、当該分野で良く知られた薬理学的およびファルマコキネティック原理によって決定することができる。
本発明の方法において、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体は、以下により詳細に議論するように、を中枢神経系に直接、脳室内に、またはクモ膜下腔内に、例えば、ＭＳの慢性病巣に投与することができる。
種々の具体例において、前記したＳｐ３５抗体はＳｐ３５活性のアゴニストである。ある具体例において、例えば、ニューロンに発現された、Ｓｐ３５へのアンタゴニストＳｐ３５抗体の結合は、ミエリン−関連神経突起形成阻害またはニューロン細胞死をブロックする。他の具体例において、稀突起神経膠細胞に発現された、Ｓｐ３５へのＳｐ３５抗体の結合は稀突起神経膠細胞の成長または分化の阻害をブロックし、あるいはＣＮＳニューロンの脱髄または髄鞘脱落をブロックする。
本発明の方法において、本明細書中に記載された、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体は、予め形成されたポリペプチドとして直接的にあるいは核酸ベクターを通じて間接的に投与して、有利な軸索形成を可能とし、稀突起神経膠細胞の増殖、分化および生存を促進し、および／またはミエリン形成、または再ミエリン形成を促進することができる。
ある具体例において、対象は、例えば、ベクター中の、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、またはアナログをコードする核酸分子で処理することができる。ポリペプチドをコードする核酸についての用量は、患者当たり約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇＤＮＡの範囲である。感染性ウイルスベクターにつての用量は用量当たり１０〜１００以上のビリオンで変化する。
本発明のいくつかの具体例において、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は：（１）移植可能な宿主細胞を、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体を発現する核酸、例えば、ベクターで形質転換し、またはトランスフェクトすること；および（２）形質転換された宿主細胞を、病気、障害または負傷の部位にて哺乳動物に移植することを含む治療方法で投与する。例えば、形質転換された宿主細胞を脊髄負傷の部位にて、または髄鞘脱落の部位にて移植することができる。本発明のいくつかの具体例において、移植可能な宿主細胞を哺乳動物から取り出し、一次的に培養し、Ｓｐ３５抗体をコードする単離された核酸で形質転換し、またはトランスフェクトし、次いで、それが取り出されたのと同一の哺乳動物に逆移植する。細胞は、それが移植されるのと同一部位から取り出すことができるが、必ずしもその必要はない。時々、エクス・ビボ遺伝子治療として知られたそのような具体例は、限定された時間の間の、作用部位へ局所化されたＳｐ３５ポリペプチドの連続的供給を供することができる。
本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体を投与することを含む、脊髄負傷、ＣＮＳにおけるニューロン成長の阻害に関連する病気または障害、稀突起神経膠細胞の成長または分化の阻害に関連する病気または障害、およびＣＮＳニューロンの脱髄または髄鞘脱落を含む病気を治療する方法は、典型的には、イン・ビトロでテストし、次いで、ヒトで使用するに先立って、所望の治療または予防活性について、許容される動物モデルでイン・ビボでテストされる。トランスジェニック動物を含めた適当な動物モデルは当業者によく知られている。例えば、本明細書中に記載されたＳｐ３５抗体の治療的利用性を証明するためのイン・ビトロアッセイが、細胞系または患者の組織試料に対するＳｐ３５抗体の効果を含む。細胞系および／または組織試料に対するＳｐ３５抗体の効果は、本明細書中において他の箇所で開示されたアッセイのような当業者に知られた技術を利用して決定することができる。本発明に従って、特異的Ｓｐ３５抗体の投与が示されるか否かを決定するのに用いることができるイン・ビトロアッセイは、患者の組織試料が培養で成長させ、化合物に曝露させ、またはそうでなければ、化合物を投与し、組織試料に対するそのような化合物の効果を観察するイン・ビトロ細胞培養アッセイを含む。
補充的な活性化合物もまた本発明の組成物に取り込むことができる。例えば、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体が、１以上のさらなる治療剤と共処方し、および／または共投与することができる。
本発明は、水性溶液のボーラス注射、または制御−放出システムの移植を含めた、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体の選択された標的組織へのいずれかの適当な送達方法を含む。制御−放出インプラントの使用は反復注射の必要性を低下させる。
ＩＸ．医薬組成物および投与方法
本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体を調製し、それを必要とする対象に投与する方法はよく知られているか、あるいは当業者によって容易に決定される。Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体の投与経路は、例えば、経口、非経口、吸入または局所であってよい。本明細書中で用いる用語の非経口は、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣投与を含む。投与の全てのこれらの形態は本発明の範囲内にあると明瞭に考えられるが、投与のための形態は注射、特に、静脈内または動脈内注射または点滴用の溶液であろう。通常、注射用の適当な医薬組成物は緩衝液（例えば、酢酸塩、リン酸塩、またはクエン酸塩緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、所望により、安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）等を含むことができる。しかしながら、本明細書中での教示に適合する他の方法において、本発明のＳｐ３５抗体、または抗原結合断片、改変体、または誘導体は、侵された細胞集団の部位へ直接的に投与し、それにより、病気の組織の治療剤への曝露を増大させることができる。
既に議論したように、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体が、哺乳動物の脊髄負傷、ＣＮＳにおけるニューロン成長の阻害に関連する病気または障害、稀突起神経膠細胞の成長または分化の阻害に関連する病気または障害、およびＣＮＳの脱髄または髄鞘脱落に関連する病気のイン・ビボ治療のための医薬上有効な量で投与することができる。この点に関して、開示された抗体は、活性剤の投与を容易とし、活性剤の安定性を促進するように処方されるであろう。好ましくは、本発明による医薬組成物は、生理学的セーライン、非毒性緩衝液、保存剤等のような医薬上許容される非毒性滅菌担体を含む。本出願の目的では、コンジュゲートされたまたはコンジュゲートされていない、医薬上有効量のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、標的への効果的な結合を達成し、利点を達成し、例えば、病気または障害の兆候を軽減し、あるいは物質または細胞を検出することを意味すべきである。
本発明で用いる医薬組成物は、例えば、イオン交換剤、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒト結成アルブミンのような血清蛋白質、リン酸塩のような緩衝剤物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、プロタミン硫酸、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩のような塩、または電解質、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース−系物質、ポリエチレングリコール、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキディプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂を含めた医薬上許容される担体を含む。
非経口投与用の製剤は滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射有機エステルである。水性担体は水、アルコール／水性溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む、セーラインおよび緩衝化媒体が含まれる。主題の発明において、医薬上許容される担体は、限定されるものではないが、０．０１〜０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液または０．８％セーラインを含む。他の通常の非経口ビヒクルは、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルまたは不揮発性油を含む。非経口ビヒクルはリンゲルデキストロースベースのもののような、流体および栄養補充物、電解質補充物等を含む。保存剤、ならびに例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガス等のような他の添加剤を存在させることもできる。
より詳しくは、注射用途に適した医薬組成物は、（水溶性である場合）滅菌水性溶液、または分散液および滅菌注射溶液または分散液の即席調製用の滅菌粉末を用いる。そのような場合、組成物は滅菌されていなければならず、容易なシリンジ性が存在する程度に流体であるべきである。それは製造および貯蔵の条件下で安定であるべきで、好ましくは、細菌および真菌のような微生物に対する汚染作用に対して保存されるであろう。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコール等）、およびその適当な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合における必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。本明細書中に開示する治療方法で用いる適当な処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１６ｔｈ ｅｄ．（１９８０）に記載されている。
微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パレベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、シメロザール等によって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、マンニトール、ソルビトールのような糖、ポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。注射組成物の延長された吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって実現することができる。
いずれの場合にも、滅菌注射溶液は、必要であれば、本明細書中に列挙した１つの成分、または成分の組み合わせと共に、必要な量の活性化合物（例えば、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体それ自体、または他の活性剤との組合せ）を適当な溶媒に配合し、続いて、濾過滅菌することによって調製することができる。一般には、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒体、および前記列挙のものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに配合することによって調製される。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合には、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、そのあらかじめ滅菌濾過された溶液から有効成分＋いずれかのさらなる所望の成分の粉末が得られる。注射用の製剤は、当該分野で公知の方法に従い、処理し、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジまたはバイアルのような容器に充填し、滅菌条件下で密閉する。さらに、製剤はここで引用してその全体を援用する、同時係属Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ． ０９／２５９，３３７（ＵＳ−２００２−０１０２２０８ Ａ１）に記載されたもののようなキットの形態にパッケージし、販売される。そのような製品は、好ましくは、関連組成物が自己免疫疾患または新形成障害に罹った、またはその素因のある対象を治療するのに有用であることを示す標識または添付文書を有するであろう。
非経口処方は単一ボーラス用量、注入または負荷ボーラス用量、続いての、維持用量であってよい。これらの組成物は特定の固定されたまたは可変の間隔で、例えば、１日に１回、または「必要」ベースで投与することができる。
本発明で用いるある医薬組成物は、例えば、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液を含めた許容される投与形態で投与することができる。ある医薬組成物は鼻エアロゾルまたは吸入によって投与してもよい。そのような組成物は、ベンジルアルコール、または他の適当な保存剤、生物学的利用性を高めるための吸収促進剤、および／または他の慣用的な可溶化剤または分散剤を使用してセーライン中の溶液として調製することができる。
単一投与形態を生じさせるために担体物質と組み合わせることができるＳｐ３５抗体、またはその断片、改変体または誘導体の量は、治療すべき宿主、および特定の投与の態様に応じて変化するであろう。組成物は、注入における確立された時間の間にわたって、単一用量、複数用量として投与することができる。投与養生法を調整して、最適な所望の応答（例えば、治療または予防応答）を供することができる。
本開示の範囲に従い、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、治療効果を生じるのに十分な量にて前記した治療方法に従って、ヒトまたは他の動物に投与することができる。本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、本発明の抗体を公知の技術に従って慣用的な医薬上許容される担体または賦形剤と合わせることによって調製された慣用的な投与単位にてそのようなヒトまたは他の動物に投与することができる。医薬上許容される担体または賦形剤の形態および特徴は、それと合わせるべき有効成分の量、投与の経路、および他のよく知られた変数によって指令されるのは当業者に認識されるであろう。当業者であれば、さらに、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体の１以上の種を含むカクテルは特に効果的であることが判明するであろうとさらに認識するであろう。
脊髄負傷、ＣＮＳにおけるニューロン成長の阻害に関連する病気または障害、稀突起神経膠細胞の成長または分化の阻害に関連する病気または障害、およびＣＮＳの脱髄または髄鞘脱落に関連する病気の治療用の本発明の組成物の有効量は、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトまたは動物であるか、投与される他の医薬、および処置が予防的であるかまたは治療的であるかを含めた多くの異なる因子に依存して変化する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含めた非ヒト哺乳動物も治療することができる。治療用量は、安全性および効率を最適化するための当業者に知られたルーチン的方法を用いて滴定することができる。
Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体での、脊髄負傷、ＣＮＳにおけるニューロン成長の阻害に関連する病気または障害、稀突起神経膠細胞の成長または分化の阻害に関連する病気または障害、およびＣＮＳの脱髄または髄鞘脱落に関連する病気の治療では、用量は、例えば、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常には０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）宿主体重の範囲とすることができる。例えば、用量は、１ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重とすることができ、あるいは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内、好ましくは少なくとも１ｍｇ／ｋｇとすることができる。前記範囲中の中間的な用量もまた、本発明の範囲内にあると意図される。対象には、経験的な分析によって決定されたいずれかの他のスケジュールに従って、毎日、１日おき、週毎にそのような用量を投与することができる。例示的な治療は、例えば、少なくとも６ヶ月の期間にわたる複数用量の投与を含む。さらなる例示的な治療養生法は、２週間ごとに１回、または１ヶ月に１回、または３〜６ヵ月ごとに１回の投与を含む。例示的な投与スケジュールは、連続日での１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、１日毎に３０ｍｇ／ｋｇまたは１週間後との６０ｍｇ／ｋｇを含む。いくつかの方法において、異なる結合特異性を持つ２以上のモノクローナル抗体は同時に投与され、その場合、各投与される抗体の用量は示された範囲内にある。
本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は複数の場合に投与することができる。単一用量の間の間隔は日、週、月または年とすることができる。間隔が患者において標的ポリペプチドまたは標的分子の血中レベルを測定することによって示されるように不規則なものとすることもできる。いくつかの方法において、用量を調整して、１〜１０００μｇ／ｍｌ、ある方法においては２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿中ポリペプチド濃度を達成する。別法として、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体を維持放出処方として投与することができ、その場合、頻度がより低い投与が必要とされる。用量および頻度は、患者における抗体の半減期に依存して変化する。Ｓｐ３５抗体の半減期は、安定なポリペプチドまたは部位、例えば、アルブミンまたはＰＥＧへの融合を介して延長することもできる。一般にヒト化抗体は、最長の半減期を示し、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。１つの具体例において、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体はコンジュゲートされていない形態で投与することができる。もう１つの具体例において、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体はコンジュゲートされた形態にて複数回投与することができる。なおもう１つの具体例において、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体はコンジュゲートされていない形態にて、次いで、コンジュゲートされた形態で、あるいはその逆で投与することができる。
本発明の組成物はいずれかの適当な方法で、例えば、非経口にて、心室内、経口、吸入スプレーにより、局所的に、直腸に、鼻内に、頬、膣、またはインプラントされた貯蔵庫を介して投与することができる。用語「非経口」は、本明細書中で用いるように、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、包膜内、肝臓内、病巣内および頭蓋内注射または注入技術を含む。前記したように、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は神経系で作用して、稀突起神経膠細胞の生存、増殖および分化、およびニューロンのミエリン形成、ならびにニューロンの生存、軸索の再生および軸索のガイダンスを促進する。従って、本発明の方法において、Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体または誘導体は、それらが血液−脳関門を横切るように投与される。この通過は、Ｓｐ３５抗体分子それ自身に固有の物理−化学的特性から、医薬処方における他の成分から、または血液−脳関門を破る針、カニューレまたは外科的機器のような機械的なデバイスの使用から由来し得る。Ｓｐ３５抗体が、血液−脳関門を固有に横切らない分子である場合、例えば、横断を容易とする部位への融合、適当な投与経路は、例えば、ＭＳの慢性病巣に向けて直接的に包膜内、または頭蓋内である。Ｓｐ３５抗体が、血液−脳関門を固有に横切る分子である場合、投与の経路は、後に記載する１以上の種々の経路によることができる。いくつかの方法において、抗体は、維持放出組成物、またはＭｅｄｉｐａｄＴＭ デバイスのようなデバイスとして投与される。血液脳関門を横切る送達は、抗Ｆｃ受容体、トランスフェリン、抗インスリン受容体、またはトキシンコンジュゲートまたは浸透増強剤のような担持分子によって増強することができる。
本発明で用いるＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は脳へ直接的に注入してもよい。化合物の直接的脳注入のための種々のインプラントは知られており、神経学的障害にかかったヒト患者への治療化合物の送達で有効である。これらは、ポンプ、定位的に移植された一次的間隙カテーテル、永久的な頭蓋内カテーテルインプラント、および外科的に移植された生分解性インプラントを用いての脳への慢性的注入を含む。例えば、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｒｅｃｔ ｂｒａｉｎ ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｇｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．９：５８９−９５（２００３）；Ｓｃｈａｒｆｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｏｄｉｎｅ−１２５ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｉｍｐｌａｎｔ Ｆｏｒ Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．２４（４）：５８３−９１（１９９２）；Ｇａｓｐａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ １２５Ｉ Ｉｍｐｌａｎｔｓ ｆｏｒ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏｍａｓ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．４３（５）：９７７−８２（１９９９）；ｃｈａｐｔｅｒ ６６，ｐａｇｅｓ ５７７−５８０，Ｂｅｌｌｅｚｚａ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ，”ｉｎ Ｇｉｌｄｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９８）；ａｎｄ Ｂｒｅｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｓａｆｅｔｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ＢＣＮＵ−Ｌｏａｄｅｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｆａｄｉａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｎｅｗｌｙ Ｄｉａｇｎｏｓｅｄ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｇｌｉｏｍａｓ：Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｔｒｉａｌ，”Ｊ．Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２６：１１１−２３（１９９５）参照。
組成物は、化合物用の適当な送達または支持体システムとして機能する生体適合性担体物質に分散されたＳｐ３５抗体も含む。維持放出担体の適当な例は、坐薬またはカプセルのような成型製品の形態である半透性ポリママトリックスを含む。移植可能なまたはマイクロカプセル維持放出マトリックスはポリラクチド（米国特許第３，７７３，３１９号；ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５６（１９８５））；ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ １３３，９８８）を含む。
本発明のいくつかの具体例において、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、脳の適当な領域への直接的注入によって患者に投与される。例えば、Ｇｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ参照。代替技術が利用でき、本発明に従って、Ｓｐ３５抗体を投与するのに適用することができる。例えば、カテーテルまたはインプラントの定位的設置は、Ｒｉｅｃｈｅｒｔ−ＭｕｎｄｉｎｇｅｒユニットおよびＺＤ（Ｚａｍｏｒａｎｏ−Ｄｕｊｏｖｎｙ）多目的局所化ユニットを用いて達成することができる。２ｍｍスライス厚みにて、１２０ｍｌのオムニパック、３５０ｍｇヨウ素／ｍｌを注射するコントラスト−増強コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャンは、三次元多平面処理プランニング（ＳＴＰ，Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を可能とすることができる。この機器は、明瞭な標的確認のためにＣＴおよびＭＲＩ標的情報を融合させる、磁気共鳴イメージング実験に基づくプランニングを可能とする。
ＧＥ ＣＴスキャナー（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）で用いるために修飾されたＬｅｋｓｅｌｌ定位システム（Ｄｏｗｎｓ Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｄｅｃａｔｕｒ，ＧＡ）、ならびにＢｒｏｗｎ−Ｒｏｂｅｒｔｓ−Ｗｅｌｌｓ（ＢＲＷ）定位システム（Ｒａｄｉｏｎｉｃｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）はこの目的で用いることができる。かくして、インプラントの朝に、ＢＲＷ定位フレームの環状ベースリングを患者の頭蓋に付着させることができる。ベースプレートにクランプされた黒鉛ロッドローカライザーフレームを用いて、（標的組織）領域を通じて３ｍｍ間隔で系列的ＣＴセクションを得ることができる。ＣＴ空間およびＢＲＷ空間の間をマッピングするための黒鉛ロッドイメージのＣＴ座標を用い、コンピュータ化処置プランニングプログラムをＶＡＸ １１／７８０コンピュータで実行することができる
（Ｄｉｇｉｔａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｙｎａｒｄ，Ｍａｓｓ．）。
本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、所望により、治療を必要とする障害または疾患を治療するのに有効な他の剤（例えば、予防剤または治療剤）と組み合わせて投与することもできる。
Ｘ．診断剤
本発明は、さらに、個体からの組織または他の組織または体液中でのＳｐ３５蛋白質または転写体の発現レベルを測定し、測定された発現レベルを、正常な組織または体液における標準Ｓｐ３５発現レベルと比較し、それにより、標準と比較した発現レベルの増加は障害を示すことを含む、ニューロン障害または負傷の診断の間で有用な診断方法を提供する。
Ｓｐ３５特異的抗体を用いて、当業者に知られた古典的な免疫組織学的方法を用いて生物学的試料における蛋白質レベルをアッセイすることができる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６（１９８７）参照）。蛋白質レベルを検出するのに有用な他の抗体−ベースの方法は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈澱、またはウェスタンブロッティングのようなイムノアッセイを含む。適当なアッセイは本明細書中において他の箇所でより詳細に記載される。
「Ｓｐ３５ポリペプチドの発現レベルをアッセイする」とは、（例えば、絶対蛋白質レベルを決定し、または見積もることによって）直接的に、あるいは（例えば、第二の生物学的試料における癌関連ポリペプチドレベルと比較することによって）相対的に、第一の生物学的試料中のＳＰ３５ポリペプチドのレベルを訂正的にまたは定量的に測定または見積もることを意図する。好ましくは、第一の生物学的試料中のＳｐ３５ポリペプチド発現レベルを測定し、または見積もり、標準Ｓｐ３５ポリペプチドレベルと比較し、該標準は、障害を有しない個体から得られた第二の生物学的試料から取られ、あるいは障害を有しない個体の集団からのレベルを平均することによって決定される。当該分野で認識されているように、一旦「標準」Ｓｐ３５ポリペプチドレベルが知られたならば、それを比較用の標準として反復して用いることができる。
「生物学的試料」とは、個体、細胞系、組織培養、またはＳｐ３５を潜在的に発現する細胞の他の源から得られるいずれの生物学的試料も意図する。哺乳動物からの組織バイオプシーおよび体液を得る方法は当該分野でよく知られている。
前記した診断方法で用いられるＳｐ３５抗体は、本明細書中の他の箇所で記載されたＳｐ３５遺伝子産物に特異的に結合するいずれのＳｐ３５抗体も含む。
ＸＩ．イムノアッセイ
本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体は、当該分野で知られたいずれかの方法によって免疫特異的結合についてアッセイすることができる。用いることができるイムノアッセイは、限定されるものではないが、少数の名称を挙げれば、ウェスタンブロットのような技術を用いる競合および非競合アッセイシステム、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈澱アッセイ、プレシピチン反応、ゲル拡散プレシピチン反応、免疫拡散アッセイ、凝集反応アッセイ、補体−固定アッセイ、免疫放射線測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイを含む。そのようなアッセイはルーチン的であって、当該分野でよく知られている（例えば、ここで引用してその全体を援用する、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．１（１９９４）参照）。例示的なイムノアッセイを以下に簡単に記載する（が、限定する意図のものではない）。
免疫沈澱プロトコルは、一般に、蛋白質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補足したＲＩＰＡ緩衝液（１％ＮＰ−４０またはトリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２の０．０１Ｍリン酸ナトリウム、１％Ｔｒａｓｙｌｏｌ）のような溶解緩衝液中で細胞の集団を溶解させ、注目する抗体を細胞溶解物に加え、４℃にて一定時間（例えば、１〜４時間、インキュベートし、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に加え、４℃にて約１時間以上インキュベートし、ビーズを溶解緩衝液中で洗浄し、ビーズをＳＤＳ／試料緩衝液中に再懸濁させることを含む。特定の抗原を免疫沈澱させる注目する抗体の能力は、例えば、ウェスタンブロット分析によって評価することができる。当業者であれば、修飾して、抗体の抗原への結合を増加させ、バックグラウンドを減少させるパラメーターに関して知ることができるであろう（例えば、セファロースビーズでの細胞溶解物のプレ−透明化）。免疫沈澱プロトコルに関するさらなる議論については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．１（１９９４） ａｔ １０．１６．１参照。
ウェスタンブロット分析は、一般には、蛋白質試料を調製し、ポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原分子量に依存して８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において蛋白質試料を電気泳動に付し、ポリアクリルアミドゲルからの蛋白質試料をニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンのような膜に移し、ブロッキング溶液（例えば、３％ＢＳＡまたは非脂肪乳を含むＰＢＳ）中で膜をブロックし、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０）中での膜の洗浄、ブロッキング緩衝液中に希釈した一次抗体（注目する抗体）で膜をブロックし、膜を洗浄緩衝液中で洗浄し、ブロッキング緩衝液中に希釈した酵素基質（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２ｐまたは１２５１）にコンジュゲートされた（一次抗体）例えば、抗ヒト抗体を認識する）二次抗体で膜をブロックし、洗浄緩衝液中で膜を洗浄し、次いで、抗原の存在を検出することを含む。当業者であれば、検出されたシグナルを増加させ、バックグラウンドノイズを低下させるように修飾することができるパラメーターに関して知ることができるであろう。ウエスタンブロットプロトコルに関するさらなる議論については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．１（１９９４） ａｔ １０．８．１参照。
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製し、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングし、酵素基質（例えば、ホースラディッシペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼ）のような検出可能な化合物にコンジュゲートされた注目する抗体をウェルに加え、一定時間インキュベートし、次いで、抗原の存在を検出することを含む。ＥＬＩＳＡにおいては、注目する抗体は検出可能な化合物にコンジュゲートさせる必要はなく；その代わり（注目する抗体を認識する）第二の抗体をウェルに加えることができる。さらに、抗原でウェルをコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングすることができる。この場合、検出可能な化合物にコンジュゲートされた第二の抗体を、注目する抗原のコーティングされたウェルへの添加に続いて加えることができる。当業者であれば、検出されたシグナルを増加させるように修飾することができるパラメーターおよび当業者で知られたＥＬＩＳＡの他の変形に関して知ることができるであろう。ＥＬＩＳＡに関するさらなる議論については、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．１（１９９４） ａｔ １１．２．１参照。
抗体の抗原への結合親和性、および抗体−抗原相互作用のオフ−速度は、競合結合アッセイによって決定することができる。競合結合アッセイの１つの例は、増大させる量の未標識抗原の存在下で注目する抗体と一緒に標識された抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）をインキュベートし、次いで、標識された抗原に結合した抗体を検出することを含むラジオイムノアッセイである。特定の抗原に対する注目する抗体の親和性およびオフ−速度はスカチャードプロット分析によってデータから決定することができる。第二の抗体との競合もまたラジオイムノアッセイを用いて決定することもできる。この場合、増大させる量のみ標識の第二の抗体の存在下で、標識された化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）にコンジュゲートされた注目する抗体と共に抗原をインキュベートする。
加えて、癌抗原遺伝子産物またはその保存された改変体またはペプチド断片のイン・サイチュ検出のために、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡観察、または非免疫学的アッセイにおけるように、本発明のＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体を組織学的に使用することができる。イン・サイチュ検出は、患者から組織学的検体を取り出し、次いで、標識されたＳｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体を適用することによって達成することができ、好ましくは、標識された抗体（または断片）を生物学的試料に重ねることによって適用される。そのような手法の使用を通じて、Ｓｐ３５蛋白質、または保存された改変体またはペプチド断片の存在のみならず、知られた組織中のその分布を決定することが可能である。本発明を用い、当業者であれば、（染色手法のような）広く種々の組織学的方法のいずれかを修飾して、そのようなイン・サイチュ検出を達成することができるのを容易に認識するであろう。
Ｓｐ３５遺伝子産物、またはその保存された改変体またはペプチド断片についてのイムノアッセイおよび非イムノアッセイは、典型的には、Ｓｐ３５またはその保存された改変体またはペプチド断片に結合することができる検出可能に標識された抗体の存在下で、細胞培養においてインキュベートされた生物学的流体、組織抽出物、新たに収穫された細胞、または細胞の溶解物のような試料をインキュベートし、次いで、多数の当該分野で良く知られた技術のいずれかによって結合した抗体を検出することを含む。
生物学的試料は、メチルセルロースのような固相支持体または担体、あるいは細胞、細胞粒子または可溶性蛋白質を固定化することができる他の固体支持体と接触させ、それに固定化することができる。次いで、支持体を適当な緩衝液で洗浄し、続いて、検出可能に標識されたＳｐ３５抗体またはその抗原結合断片、改変体または誘導体で処理することができる。次いで、固相支持体を緩衝液で二回目の洗浄をして、未結合の抗体を除去することができる。所望により、抗体を引き続いて標識する。次いで、固体支持体上の結合した標識の量を慣用的な手段によって検出することができる。
「固相支持体または担体」とは、抗原または抗体に結合することができるいずれの支持体も意図する。よく知られた支持体または担体はガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾されたセルロース、ポリアクリルアミド、斑れい岩、およびマグネタイトを含む。担体の性質は、本発明の目的では、ある程度可溶性であるか、または不溶性であり得る。カップリングされた分子が抗原または抗体に結合できる限り、支持体物質は実質的にいずれの可能な構造立体配置を有することもできる。かくして、支持体の立体配置は、ビーズ、または円筒におけるように、試験管の内部表面、またはロッドの外部表面におけるように、球形であってよい。別法として、表面はシート、テスト片などのように平坦であってよい。好ましい支持体はポリスチレンビーズを含む。当業者であれば、抗体または抗原を結合させるための多くの他の適当な担体を知っており、あるいはルーチン的な実験を用いることによってそれを確認することができるであろう。
Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片、改変体、または誘導体の与えられたロッドの結合活性は、よく知られた方法に従って決定することができる。当業者であれば、ルーチン的な実験を使用することによって、各決定のための操作および最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。
抗体−抗原相互作用の親和性を測定するのに適当な種々の方法があるが、速度定数を決定するには比較的少数の方法しかない。方法の殆どは、抗体または抗原を標識することに頼っており、これは、不可避的にルーチン的測定を複雑化し、不確実性を測定された量に導入する。
ＢＩＡｃｏｒｅで行われる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、抗体−抗原相互作用の親和性を測定する慣用的な方法よりも多数の利点を供する：（ｉ）抗体または抗原いずれかを標識するのに要件がない；（ｉｉ）抗体は予め精製される必要がなく、細胞培養上清を直接的に用いることができる；（ｉｉｉ）異なるモノクローナル抗体相互作用の迅速な半定量的な比較を可能とするリアル−タイム測定が可能となり、多くの評価目的で十分である；（ｉｖ）一連の異なるモノクローナル抗体が同一条件下で容易に比較できるように、生物特異的表面を再生することができる；（ｖ）分析手法は十分に自動化され、広いシリーズの実験をユーザーの介入無くして行うことができる。ＢＩＡａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， バーションＡＢ（再版１９９８）、ＢＩＡＣＯＲＥコード番号ＢＲ−１００１−８６；ＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，バージョンＡＢ（再版１９９８），ＢＩＡＣＯＲＥコード番号ＢＲ−１００１−８４。
ＳＰＲベースの結合実験は、結合対の１つのメンバーをセンサーの表面に固定化することを要求する。固定化された結合パートナーをリガンドという。溶液中の結合パートナーを分析物という。いくつかの場合、リガンドは、捕獲分子という、もう１つの固定化された分子への結合を介してリガンドを間接的に表面に付着させる。ＳＰＲ応答は、分析物が結合し、または解離するにつれて、ディテクター表面における質量濃度の変化を反映する。
ＳＰＲに基づき、リアル−タイムＢＩＡｃｏｒｅ測定は、それらが起こるに連れて、直接的に相互作用をモニターする。該技術は動的パラメーターの決定によく適合する。比較親和性ランキングは実行するのに極端に単純であって、キネティックおよび親和性の双方の定数はセンサーグラムデータから由来することができる。
分析物をリガンド表面を横切って区別されるパルスにて注入する場合、得られたセンサーグラムは３つの必須の相に分割することができる：（ｉ）試料注入の間における分析物とリガンドとの会合；（ｉｉ）試料注入の間における平衡または定常状態、ここで、分析物結合の速度は複合体からの解離によってバランスされる；（ｉｉｉ）緩衝液の流動の間における表面からの分析物の解離。
会合および解離相は、分析物−リガンド相互作用のキネティックスについての情報を提供する（ｋａおよびｋｄ、複合体の形成および解離の速度、ｋｄ／ｋａ＝ＫＤ）。平衡相は、分析物−リガンド相互作用の親和性に対して情報を提供する（ＫＤ）
ＢＩＡ評価ソフトウェアは、数的積分および球フィッティングアルゴリズム双方を用いる曲線フィッティングのための包括的な便宜を提供する。データの適当な分析で、別々の速度および相互作用についての親和性定数は、単純なＢＩＡｃｏｒｅ調査から得ることができる。この技術によって測定することができる親和性の範囲は、ｍＭ〜ｐＭの範囲で非常に広い。
エピトープ特異性は、モノクローナル抗体の重要な特徴である。ＢＩＡｃｏｒｅでのエピトープマッピングは、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡまたは他の表面吸着方法を用いる慣用的な技術とは対照的に、標識または精製された抗体を必要とせず、数個のモノクローナル抗体の配列を用いるマルチ−部位特異性テストを可能とする。加えて、非常に多数の分析を自動的に処理することができる。
対様式結合実験は、同一抗原に同時に結合する２つのＭＡｂの能力をテストする。別々のエピトープに向けられたＭＡｂは独立して結合し、他方、同一または密接に関連するエピトープに対して向けられたＭＡｂは各他の結合と干渉するであろう。ＢＩＡｃｏｒｅでのこれらの結合実験は、行うのに直接的である。
例えば、捕獲分子を用いて、第一のＭＡｂに結合させ、続いて、順次、抗原および第二のＭＡｂを加えることができる。サンサーグラムは：１．抗原のうちどれくらい多くが第一のＭＡｂに結合するのか、２．第二のＭＡｂが表面−付着抗原にどの程度結合するか、３．もし第二のＭＡｂが結合しなければ、対様式テストの順番を逆にすると結果を変化させるのか否かを明らかにするであろう。
ペプチド阻害は、エピトープマッピングで用いられるもう１つの技術である。この方法は対様式抗体結合実験を補うことができ、機能的エピトープを、抗原の一次配列が知られている場合に構造的特徴に関連付けることができる。ペプチドまたは抗原断片は、異なるＭＡｂの固定化された抗原への結合の阻害についてテストされる。与えられたＭＡｂの結合に干渉するペプチドは、そのＭＡｂによってはっきりとされるエピトープに構造的に関連すると推定される。
本発明の実施は、特に断りのない限り、当該分野の技量内にある細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の慣用的な技術を使用するであろう。そのような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．，（１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｍｚｙｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４ ａｎｄ １５５（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ−ＩＶ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；ａｎｄ Ｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）参照。
抗体エンジニアリングの一般的原理は、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃ．Ａ．Ｋ．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９５５）に記載されている。蛋白質エンジニアリングの一般的原理は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ．（１９９５）に記載されている。抗体および抗体−ハプテン結合の一般的原理は、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８４）；ａｎｄ Ｓｔｅｗａｒｄ，Ｍ．Ｗ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｔｈｅｉｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）に記載されている。加えて、当該分野で知られ、かつ具体的に記載されていない免疫学における標準的な方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ −Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（８ｔｈ ｅｄ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ（１９９４）ａｎｄ Ｍｉｓｈｅｌｌ ａｎｄ Ｓｈｉｉｇｉ（ｅｄｓ），Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）におけるように一般的に従う。
免疫学の一般的原理を記載する標準的文献研究はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．，“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”ｉｎ Ｂｕｒｄｅｎ，Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３，Ｅｌｓｅｖｅｒｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８４），Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４ｔｈ ｅｄ．Ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｇｏｌｄｓｂｙ，Ｔｈｏｍａｓ Ｊ．Ｋｉｎｄｔ ａｎｄ Ｂａｒｂａｒａ Ａ．Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎｄ ＆ Ｃｏ．（２０００）；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ，Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，Ｊ．ａｎｄ Ｍａｌｅ Ｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６ｔｈ ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ（２００１）；Ａｂｂａｓ Ａ．，Ａｂｕｌ，Ａ．ａｎｄ Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ａ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｅｄ．５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２００５）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｎ（２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩＩ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ（２００３）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｄｉｓｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（２００３）を含む。
前記した文献の全て、ならびにここで引用された全ての文献を引用してその全体を援用する。
実施例１
Ｓｐ３５は稀突起神経膠細胞生物学に関与する。
稀突起神経膠細胞は、（Ａ２Ｂ５を発現する）Ａ２Ｂ５先祖細胞からいくつかの発生段階を通じて成熟し、（Ｏ１およびＯ４を発現する）プレ−ミエリン形成性稀突起神経膠細胞に分化し、最後に、（Ｏ１、Ｏ４およびＭＢＰを発現する）成熟ミエリン形成稀突起神経膠細胞に分化する。かくして、Ａ２Ｂ５、Ｏ１、Ｏ４およびＭＢＰマーカーの存在および不存在をモニターすることによって、与えられた細胞の発生段階を決定し、稀突起神経膠細胞生物学におけるＳｐ３５Ｆｃの役割を評価するのが可能である。稀突起神経膠細胞生物学の一般的なレビューについては、例えば、Ｂａｕｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｈａｍ−Ｄｉｎｈ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８１：８７１−９２７（２００１）参照。
Ｏ４、ＭＢＰおよびＣＮＰａｓｅに対するモノクローナル抗体はＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓからのものであり；ＡＰＣ（クローンＣＣ−１；ｒｅｆ．２９）に対する抗体はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍからのものであった。他の抗体はβＩＩＩチューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ）、Ｓｐ３５（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、Ｆｙｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびホスホ−Ｆｙｎ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）に対するものであった。Ａ２Ｂ５に対するモノクローナル抗体はＣｈｅｍｉｃｏｎから入手可能であった。
Ｓｐ３５は稀突起神経膠細胞において発現される。
精製されたラットＰ１３ ＣＧニューロン、Ｐ２稀突起神経膠細胞、およびＰ４神経膠星状細胞培養におけるＳｐ３５の発現は、逆転写後におけるポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって分析した。Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．からのキットを用いて、製造業者の指示に従い、ラット脳細胞からｍＲＮＡを抽出した。半−定量的ＲＴ−ＰＣＲは順方向プライマー
Figure 2009502123
 （配列番号３４４）を用いて行い、逆方向プライマー
Figure 2009502123
 （配列番号３４５）は、ニューロンにおける高い発現、稀突起神経膠細胞におけるより低い発現、および神経膠星状細胞における発現無しを示した。
稀突起神経膠細胞におけるＳｐ３５の発現は、成体ラット視神経に由来するセクションにおけるイン・サイチュハイブリダイゼーションによって確認した。ラット視神経セクションを調製し、Ｍｉ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｐ３５ ｉｓ ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｇｏ−６６ ｒｅｃｅｐｔｏｒ／ ｐ７５ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ” Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２２１−２８（２００４）に記載されているように処理し、Ｓｐ３５コーディング配列の第一の５００ヌクレオチドを用いてジゴキシゲニン−標識Ｓｐ３５アンチセンスまたはセンスＲＮＡでプローブした。Ｔｙｒａｍｉｄｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および蛍光抗ジゴキシゲニンコンジュゲーティッド抗体キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて製造業者の指示に従い、セクションを染色した。組み合わせたイン・サイチュおよび免疫蛍光分析では、セクションをまずジゴキシゲニン−ＲＮＡでプローブし、次いで、抗体、例えば、ＣＣｌ抗体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；成熟稀突起神経膠細胞のマーカー）または抗Ｓｐ３５抗体でプローブした。我々は、アンチセンスＳｐ３５プローブにハイブリダイズした稀突起神経膠細胞はＣＣ１に対する抗体で共染色されたことを観察した（データは示さず）。センスＳｐ３５プローブを用いて特異的標識は観察されなかった。稀突起神経膠細胞におけるＳｐ３５発現は、Ｐ７ラット皮質の側脳室領域からの組織セクションの免疫組織化学実験によって確認した。ＣＣ１抗体で標識された皮質細胞の大部分は抗Ｓｐ３５抗体でやはり標識された。データは示さず。相互作用の特異性は、抗Ｓｐ３５抗体のＳｐ３５Ｆｃ（実施例２参照）のプレ吸着によって確認され、これは、シグナルを排除した。
Ｓｐ３５発現のＳｐ３５特異的ＲＮＡｉノックダウンは、稀突起神経膠細胞の成長および分化を促進する。
Ｓｐ３５特異的ＲＮＡｉを用いて、稀突起神経膠細胞前駆体細胞におけるＳｐ３５発現を除去して、Ｓｐ３５はどのようにして稀突起神経膠細胞の成長および分化に寄与するかを調べた。５０，０００のＡ２Ｂ５稀突起神経膠細胞先駆体細胞を、以下のようにして調製されたＳｐ３５特異的ＲＮＡｉ配列または対照ＲＮＡｉを運ぶレンチウィルスで感染させた。
マウスおよびラットＳｐ３５ ＲＮＡ配列を比較して、相同な領域を見出して、候補小−ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）で用いた。Ｓｐ３５ ＲＮＡｉのレンチウィルス発現のために、オリゴヌクレオチドＬＶ１−０３５およびＬＶ１−０３６をアニールし、ＨｐａＩおよびＸｈｏＩ消化ｐＬＬ３．７に連結させることによって、ＣＨ３２４を構築した。ｐＬＬ３．７ベクター、さらなる方法およびウィルスの生産はＲｕｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３，４０１−０６（２００３）に記載されている通りであった。Ｓｐ３５ ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドはＭＷＧから購入し、それは以下の配列を有する：ＬＶ１−０３５（センスオリゴ）
Figure 2009502123
 （配列番号３４６）およびＬＶ１−０３６（アンチセンスオリゴ）
Figure 2009502123
 （配列番号３４７）を有する。
対照ＲＮＡｉは、従わぬ場合の文字に示されたヌクレオチド変化を除いて同一のオリゴヌクレオチド配列で消化した：
Figure 2009502123
 。
レンチウィルスを生産するのに先立って、ｐＬＬ３．７からのＤＮＡまたはｐＬＬ３．７における候補ｓｈＲＮＡを、５〜１の比率にてマウスＳｐ３５ＨＡタグドプラスミドで、６−ウェル様式でＣＨＯ細胞に共トランスフェクトした。ノックダウンはトランスフェクトされたＣＨＯ細胞溶解物からのＳｐ３５ＨＡタグのウェスタンブロッド検出によって、ならびに二連ウェルから調製した全ＲＮＡのノーザンブロッドによって分析した。ブロッドをＳｐ３５ ｃＤＮＡの断片でプローブした。アッセイをトランスフェクションから４８時間後に行った。予測されるように、対照−処理細胞に対して、ＣＨ３２４ ＲＮＡｉ−処理ＣＨＯ細胞におけるＳｐ３５ ｍＲＮＡの十倍低下があった。データは示さず。緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を運ぶＲＮＡｉレンチウィルスは、Ｒｕｂｉｎｓｏｎ ｅｔ．ａｌ．に記載されているように生じさせた。対照またはＳｐ３５ ＲＮＡｉいずれかで処理した培養において、稀突起神経膠細胞のほぼ８０％はＧＦＰ陽性であった。細胞数は、ＲＮＡｉ処理によって変化しなかった。分化に対するＲＮＡｉの効果を定量するために、ＧＦＰ−発現稀突起神経膠細胞のみをカウントした。
稀突起神経膠細胞の豊富化集団は、以下のように修飾した、Ｃｏｎｎ，Ｍｅｔｈ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：１−４（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；１９９０）によって記載されたように雌Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｓ ｐ２ラットから成長させた。簡単に述べると、前脳を切開し、ハンクス緩衝化ラット溶液（ＨＢＳＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に入れた。組織を１−ｍｍ断片に切断し０．０１％トリプシンおよび１０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ中で３７℃にて１５分間インキュベートした。解離させた細胞をポリ−Ｌ−リジン−被覆Ｔ７５組織培養フラスコで平板培養し、２０％胎児子牛血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＤＭＥＭ倍地中で３７℃にて１０日間成長させた。フラスコを３７℃にて２００ｒｐｍで一晩震盪させることによって稀突起神経膠細胞前駆体（Ａ２Ｂ５＋）を収集し、その結果、９５％純度の集団を得た。培養を、ＦＧＦ／ＰＤＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含む高−グルコースダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で一週間維持した。ＦＧＦ／ＰＤＧＦの除去は、Ａ２Ｂ５＋細胞が３〜７日後にＯ４＋プレミエリン形成稀突起神経膠細胞に分化し、７〜１０後にＯ４＋およびＭＢＰ＋成熟稀突起神経膠細胞に分化することを可能とした。これらの分化状態は、形態の変化から容易に明らかである：Ａ２Ｂ５＋細胞は形状が二極であり、Ｏ４＋プレミエリン形成稀突起神経膠細胞は、より長くより分岐した突起を有し、ＭＢＰ＋成熟稀突起神経膠細胞は突起の間にミエリンシート構造を含有する。
Ａ２Ｂ５稀突起神経膠細胞前駆体細胞は、ＣＨ３２４ＲＮＡｉを含有するレンチウィルスで感染させた。残りの細胞を３日間培養し、Ｏ４−陽性（稀突起神経膠細胞分化についてのマーカー）稀突起神経膠細胞の数をカウントした。内因性Ｓｐ３５発現は、Ｓｐ３５ ＲＮＡｉレンチウィルスでの感染によって低下し、ＲＴ−ＰＣＲによって確認した。Ｓｐ３５の低下の結果、細胞突起の長さの増加によって、および豊富なミエリンシート構造の存在によって明らかなように、対照感染細胞と比較してより高度に分化した成熟稀突起神経膠細胞をもたらした（データは示さず）。Ｓｐ３５ ＲＮＡｉを発現した細胞において、対照細胞におけるように３倍多くの成熟（Ｏ４−陽性）稀突起神経膠細胞があった。これらのデータは、Ｓｐ３５が稀突起神経膠細胞の分化を負に調節できることを示す。
優性−陰性Ｓｐ３５は稀突起神経膠細胞の成長および分化を促進する。
Ｓｐ３５の野生型および優性−陰性形態を発現するレンチウィルスベクターを構築した。マウス全長Ｓｐ３５（ＦＬ−Ｓｐ３５、配列番号２のアミノ酸残基３４−６１４）をコードするＤＮＡ配列を、プライマー
Figure 2009502123
 を用いるＰＣＲによって増幅し、ＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩ部位においてＨＲＳＴ−ＩＲＥＳｅＧＦＰレンチウィルスベクターに挿入した。同様に、優性陰性Ｓｐ３５（ＤＮ−Ｓｐ３５、配列番号２のアミノ酸残基３４−５８１）を考慮するＤＮＡ配列を、プライマー
Figure 2009502123
 を用いるＰＣＴによって増幅した。Ｒｕｂｉｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ ｂａｓｅｄ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｓｉｌｅｎｃｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ， ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｂｙ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ”， Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４０１−０６（２００３）によって記載されているように、ＦＬ−Ｓｐ３５およびＤＮ−Ｓｐ３５プラスミドを２９３細胞にトランスフェクトして、レンチウィルスを生じさせた。稀突起神経膠細胞を細胞当たり２ ＭＯＩにてレンチウィルスで感染させ、ウェスタンブロットによって、ＦＬ−Ｓｐ３５およびＤＮ−Ｓｐ３５の発現を確認した。
ＤＮ−Ｓｐ３５は、成熟稀突起神経膠細胞の数の増加を生じさせた。対照的に、対照と比較して、成熟稀突起神経膠細胞の数の低下によって明らかなように、全長Ｓｐ３５（ＦＬ−Ｓｐ３５）の過剰発現は、反対の効果を有し、分化を阻害した（データは示さず）。
実施例２
Ｓｐ３５ＦＣ融合蛋白質の構築および精製
ヒトＳｐ３５の細胞外部分（残基１〜５３２）をヒトＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃ領域に融合させて、構築体を作成して、Ｓｐ３５の生物学的機能を調べた。ヒトＳｐ３５についての部分的コーディング配列は、順方向プライマー
Figure 2009502123
 （配列番号３５４）および逆方向プライマー
Figure 2009502123
 （配列番号３５５）を用いてクローン２２７．２からのＰＣＲによって得られた。
平滑末端ＰＣＲ産物をＰＣＲ ＳＣＲＩＰＴ ＡＭＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＳｒｆＩ部位にサブクローンして、ＰＣＴ ＳＣＲＩＰＴ ＡＭＰ−Ｓｐ３５を作製した。ＳａｌＩ断片をＰＣＲ ＳＣＲＩＲＴ ＡＭＰ−Ｓｐ３５から単離し、ＰＣＲＣＡＭＰ Ｉｇベクター（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅベクターＰＣＲ ＳＣＲＩＰＴ ＡＭＰの誘導体）にサブクローンした。ＰＣＲＣＡＭＰ Ｉｇベクターにおいて、ヒンジおよびＦｃガンマ配列をＳａｌＩ（５’）およびＮｏｔＩ（３’）断片としてサブクローンした。ＳａｌＩＳｐ３５断片をＰＣＲＣＡＭＰ ＩｇベクターのＳａｌＩ部位にサブクローンしそれにより、Ｓｐ３５シグナル配列および細胞外ドメイン（１〜５３２）を、ヒトＩｇ１のヒンジおよびＦｃ領域をコードする配列とイン・フレームで融合させた。正しい単離体を同定し、Ｓｐ３５ Ｆｃ断片を含むＮｏｔＩ断片をＣＨＯ発現ベクター、ＰＶ９０（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）の単一ＮｏｔＩクローニング部位にサブクローンした得られたプラスミドをＤＮＡ配列決定によって確認し、ＧＴ１２３と命名した。
Ｓｐ３５Ｆｃ融合蛋白質を発現する安定な細胞系を、ＣＨＯ宿主細胞ＤＧ４４のプラスミドＧＴ１２３でのエレクトロポレーションによって生じさせた。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、１０％透析血清および４ｍＭグルタミンの存在下でアルファマイナスＭＥＭ中で培養して、ヌクレオチド独立性成長を選択した。トランスフェクションから１４日後に細胞に新鮮な培地を供給した。Ｓｐ３５Ｆｃを発現する細胞についてスクリーニングするために、ＣＨＯ細胞をフィコエリスリン（ＰＥ）−標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）で標識し、ＦＡＣＳ Ｍｏ−Ｆｌｏ（Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）での高速フローサイトメトリーソーティングに付した。最高レベルのＳｐ３５Ｆｃを発現した細胞を選択した。これらの細胞を培養にて７日間拡大培養し、次いで、再度標識し、再度ソーティングを行った。最高レベルのＳｐ３５Ｆｃを発現する細胞を、９６−ウェルプレートにおいて個々のクローンとして単離した。これらのクローンを２週間成長させ、次いで、ＦＡＣＳ分析から１日先立って新鮮な培地を供給して、発現レベルについてチェックした。最高レベルのＳｐ３５Ｆｃを発現したクローンを拡大培養し、凍結した細胞バンクを確立した。細胞系を、無血清培地ＢＣＭ１６における懸濁培養で成長するように適合させた。これらのクローンによって生産されたＳｐ３５Ｆｃの力価は、細胞系を３７℃にて４〜５継代の間成長させ、次いで、細胞を５０％最大細胞密度まで成長させ、生きた細胞の密度が７５％まで降下するまでそれらを２８℃にて１０〜１５日間培養することによって決定した。この時点において、培養基を収穫し、細胞およびデブリスを遠心によって除去し、培養上清を、プローグとして抗ヒトＩｇ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ）を用いるウェスタンブロット分析によってＳｐ３５Ｆｃレベルについて力価決定した。
Ｓｐ３５Ｆｃ融合蛋白質を、以下のように清澄化された培養基から精製し：９ｍｌの１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５を９００ｍｌの条件培地に加えた。該培地を４℃にて３ｍｌのプロテインＡセファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に３時間でバッチ負荷した。樹脂を１．５ｃｍ（Ｉ．Ｄ．）カラムに収集し３ｍｌ ＰＢＳで４回、８００ｍＭ ＮａＣｌを含有する４ｍｌのＰＢＳで２回、次いで、再度、３ｍｌのＰＢＳで洗浄した。Ｓｐ３５Ｆｃを、２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ２．８および１００ｍＭ ＮａＣｌでカラムから１．５ｍｌの画分に溶出させ、７５μｌの０．５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．６を加えることによって中和した。ピーク蛋白質−含有画分を２８０ｎｍにおける吸光度によって同定し、プールし、１ｍＬのプロテインＡカラムでのさらなる精製に付した。負荷に先立ち、ＮａＣｌを６００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５に５０ｍＭまで加えた。カラムを６００μｌの１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５および１Ｍ ＮａＣｌで２回、次いで、１ｍｌ ＰＢＳで洗浄した。Ｓｐ３５Ｆｃを、２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４および１００ｍＭ ＮａＣｌでカラムから溶出させ、０．５ｍｌの画分を収集し、２５μｌの０．５ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８．６を加えることによって中和した。ピーク蛋白質含有画分を２８０ｎｍにおける吸光度によって同定し、プールした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを低下させることによってＳｐ３５Ｆｃ蛋白質は、９０ｋＤａの見掛けの質量でもって単一バンド（＞９５％純度）として移動した。非還元条件下で蛋白質は１８０ｋＤａの近似の質量を持つダイマーとして移動した。精製されたＳｐ３５Ｆｃ蛋白質をアリコットし、−７０℃で貯蔵した。
実施例３
Ｓｐ３５特異的モノクローナル抗体の生産
本発明のＳｐ３５ポリペプチドに特異的に結合する抗Ｓｐ３５抗体は、以下の方法および手法を用いて作成した。
Ａ．抗体スクリーニングアッセイ
１．ＥＬＩＳＡアッセイ
Ｓｐ３５Ｆｃ（５０μｌの０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液中０．５μｇ、ｐＨ９．５）を９６−ウェルＭａｘｉＳｏｒｐＴＭプレート（ＮｕｎｃＴＭ）の各ウェルに加えた。次いで、プレートを３７℃にて１時間、または４℃にて１６時間インキュベートした。プレート上の非特異的結合部位は、０．１％ＢＳＡ、０．１％オボアルブミン、０．１％（１５０ｍＭ ＮＡＣＥ中の５％（ｗ／ｖ）無脂肪ドライミルク）および０．００１％アジドを含有する２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を用いてブロックした。血清またはハイブリドーマ上清の希釈（例えば、系列３倍希釈）をプレートの各列を横切って加え、２５℃にて１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、５０μｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ−コンジュゲーテッドヤギ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）の１：１０，０００希釈を各ウェルに加え、さらに１時間インキュベートした。３回の洗浄の後、ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって発色させ、２Ｍ硫酸で停止させた。色強度は４５０ｍＭによって分光光度計でモニターした。
２．ＦＡＣＳアッセイ
ＣＯＳ−７細胞を、販売業者によって記載されているように０．１μＭ ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ Ｇｒｅｅｎ ＣＭＦＤＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で標識した。等容量のＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ標識対照細胞を、抗Ｓｐ３５テスト血清またはハイブリドーマ上清とのインキュベーションの前に、（Ｓｐ３５発現ベクターの一過性トランスフェクションによって生じた）洗浄したＳｐ３５ＣＯＳ−７細胞と混合した。５０マイクロリットルの細胞混合物を９６−ウェルＶ−底ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）３８７７ Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の各ウェルに分注し、１００μｌのマウス血清、ハイブリドーマ上清、または対照抗Ｓｐ３５抗体を加えた。４℃における３０分間のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、ＰＢＳ中の５０μｌのフィコエリスリン−コンジュゲーテッド親和性純粋Ｆ（ａｂ’）２ 断片ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃガンマ特異的第二抗体（１：２００，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と共にインキュベートした。インキュベーションの最後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有する２００μｌのＰＢＳに懸濁させ、ＦＡＣＳ分析に付した。別法として、Ｓｐ３５ＣＯＳ−７細胞をマウス血清またはハイブリドーマ上清と混合し、次いで、Ｒ−フィコエリスリン−コンジュゲーテッドヤギ抗マウス二次抗体で処理し、直接的に標準ＦＡＣＳ分析に付した。
Ｂ．マウスモノクローナル抗Ｓｐ３５抗体ハイブリドーマ生産
８週齢雌ＲＢＦマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、実施例２に記載したように生産された、５０μｇのＳｐ３５Ｆｃ（ヒトＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃ領域に融合した配列番号２のアミノ酸３４〜５３２）を含有するエマルジョンで腹腔内免疫化するか、あるいは２週間毎に１回、５０μｌのヒトＳｐ３５Ｆｃ、および５０μｌのフロイントの完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するエマルジョンで腹腔内免疫化した。免疫化したマウスからの血清を、第一に免疫化の前に、および第二および第三の免疫化から１週間後に収集し、抗Ｓｐ３５抗体力価を、前記したように、Ｓｐ３５発現ＣＯＳ−７細胞でのＦＡＣＳアッセイによって測定した。第三の免疫化の後に、およびハイブリドーマ融合が開始するに３日先立って、ブースター最終用量を与えた。
種々のＳｐ３５ペプチドで免疫化されたマウスからの血清を、前記したようにＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。Ｓｐ３５発現ＣＯＳ−７細胞に特異的に結合する抗体に対して陽性であるマウスを前記したようにフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって同定し、犠牲にした。脾臓細胞をマウスから摘出し、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ，ｅｄ．Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｒ．Ｈ．，ＭｃＫｅａｒｎ，Ｔ．Ｊ．ａｎｄ Ｂｅｃｈｔｏｌ，Ｋ．Ｂ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ（１９８２）に記載されているように、ＦＬ６５３ミエローマ（１０％ＦＢＳ、４５００ｍｇ／Ｌグルコース、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、および２０ｍｇ／ｍｌの８−アザグアニンを含有するＤＭＥＭに維持した、Ｉｇ−／ＨＧＰＲＴ−Ｂａｌｂ／ｃマウスミエローマのＡＰＲＴ−誘導体）に融合させた。融合させた細胞を２４−または４８−ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ Ｗｏｒｋｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に平板培養し、アデニン、アミノプテリン、およびチミジン（ＡＡＴ、Ｓｉｇｍａ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能）を含有する培養基を供給した。ＡＡＴ耐性培養を、Ｓｐ３５ＣＯＳ−７細胞またはＳｐ３５Ｆｃいずれかに結合させるために、前記したようにＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーによってスクリーニングした。さらに陽性のハイブリドーマは、限界希釈法によってサブクローンされる。
Ｓｐ３５Ｆｃで免疫化されたマウスから生産されたモノクローナル抗体を生産する１７のハイブリドーマ細胞系を単離した。ハイブリドーマ−由来モノクローナル抗体の特性を表３Ａおよび３Ｂに示す。
モノクローナル抗体１Ａ７、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３および３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７の可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）をコードするポリヌクレオチドをＰＣＲによって単離し、クローン化し、以下の方法による配列分析に付した。Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニキットを用いて、全ＲＮＡをハイブリドーマー細胞から抽出し、標準的な条件を用い、ｃＤＮＡをＲＴ ＰＣＲによって単離されたＲＮＡから生じさせた。プライマーのカクテルをＲＴ−ＰＣＲで用いた。プライマーの好ましい組は、シグナル配列にハイブリダイズするプライマーの５’末端、およびＦＲ４／定常ドメイン接合の３’側の定常ドメインにハイブリダイズするプライマーの３’末端を持つプライマーを含むものであった。これは、モノクローナル抗体のＮ−末端およびＶ／Ｃ接合について曖昧さがない無傷可変ドメインの増幅を可能とする。当業者であれば、プライマー組は、異なる鋳型を増幅するために、および異なるＰＣＲ条件のために修飾される必要があるのを認識するであろう。場合によっては、高度に豊富な非生産的メッセージ（例えば、融合パートナーからのＣＤＲ３−ＦＲ４フレームシフト非生産的軽鎖）、または非特異的生産的メッセージの存在を生じさせかねず、可変鎖のクローニングを複雑化させかねない。１つの解決は、真性精製抗体からのＮ−末端配列を用いて、縮重プライマーを設計して、クローニングを可能とすることである。別法として、可変ドメインのＮ−およびＣ−末端を「固定」する、Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ ８６：３８３３（１９８９）に記載されたもののような「ユニバーサルフレームワーク」プライマーを用いることができる（すなわち、ＦＲ１のＮ−末端およびＦＲ４のＣ−末端はプライマー−決定される）。
加えて、より効果的なプライマーを設計するための配列データは、ゲル精製され、次いで、配列決定されたバルクＲＴ−ＰＣＲ産物から得ることができる。ＰＣＲ産物は、例えば、ＴＯＰＯクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてサブクローンし、次いで、配列決定することもできる。次いで、複数の独立したサブクローンまたはゲル精製断片から配列データを得て、コンセンサス配列をしっかりと確立する。
Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７の軽鎖の配列は、５’マウスカッパ軽鎖シグナル配列プライマー：
Figure 2009502123
 と、単一３’マウスカッパ定常ドメインプライマー：
Figure 2009502123
 （配列番号４）とのカクテルを用いることによって決定し、ここで、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｗ＝Ａ／ＴおよびＹ＝Ｃ／Ｔである。得られたＰＣＲ産物をサブクローンし、多数の独立したサブクローンを配列決定した。推定コンセンサス配列は、エドマン分解配列決定データと合致した。配列決定は、縮重シグナル配列５’プライマー
Figure 2009502123
 （配列番号３５７）が、増幅の間に３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７軽鎖可変ドメインを生じたものであったことを示した。
３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７重鎖配列は、マウス重鎖シグナル配列５’ＰＣＲプライマー
Figure 2009502123
 と、縮重マウスＩｇＧ ＣＨ１定常ドメイン３’プライマー
Figure 2009502123
 （配列番号３６３）とのカクテルを用いて決定し、ここで、Ｋ＝Ｇ／Ｔ、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、およびＹ＝Ｃ／Ｔである。種々の異なるサイクリング条件での、プライマーのこのカクテルを用いるＰＣＲは、推定Ｎ−末端が精製された３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７抗体のエドマン分解配列によって決定されたのと一致する重鎖可変ドメイン配列を生じなかった。従って、我々は、重鎖ユニバーサルプライマー：
Figure 2009502123
 を用い、ここで、Ｍ＝Ａ／Ｃ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、Ｓ＝Ｃ／Ｇ、およびＷ＝Ａ／Ｔである。この組は、その推定配列が経験的な３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７データと合致したマウス重鎖可変ドメインを生じた。
重鎖可変ドメインＮ−およびＣ−末端が真性であって、プライマー−決定されたものでないことを確認するためにもう１つのＰＣＲ反応を縮重シグナル配列プライマー
Figure 2009502123
 （配列番号３６６）および前記した定常ドメイン３’プライマー
Figure 2009502123
 （配列番号３６７）で行い、ここで、Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ、Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｒ＝Ａ／Ｇ、およびＹ＝Ｃ／Ｔである。縮重シグナル配列プライマーの設計は、前記した「ユニバーサルプライマー」とのＰＣＲ反応からの３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７コンセンサス推定ＦＲ１配列で質問されたＧｅｎｂａｎｋげっ歯類配列データベースのＴＦＡＳＴＡサーチに由来するベストヒットのシグナル配列に基づくものであった。このＰＣＲは、完全なマウス重鎖可変ドメインを持つ産物を生じた。
完全な３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７マウス可変ドメインを、ヒトＩｇＧ１およびカッパ定常ドメインｃＤＮＡと組み合わせて（制限部位を導入するのに必要なサイレント突然変異誘発で）用いて、各々、キメラ重鎖および軽鎖ｃＤＮＡを構築した。全長免疫グロブリンｃＤＮＡを、商業的ＥＢＶ哺乳動物細胞エピソーム発現ベクターｐＣＥＰ４の誘導体であるｐＮＥ００１と呼ばれる発現ベクターにクローン化した。重鎖および軽鎖発現ベクター（各々、ｐＸＷ３７２およびｐＸＷ３６３と呼ばれる）を、２９３−ＥＢＮＡ細胞に共トランスフェクトした。一過的にトランスフェクトされた細胞からの条件培地の（ヒトＩｇＧ−特異的試薬でプローブされた）ウェスタンブロット分析により、キメラ３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７−ｈｕＩｇＧ１、カッパｍＡｂの発現が確認された。得られた３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７ ＶＨおよびＶＬポリペプチド配列を法６および８に示し、各々、配列番号１７３および２０９である。１Ａ７、２Ｆ３、および３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３モノクローナル抗体についての重鎖および軽鎖配列は同様な方法によって決定された。
Ｃ．ファージディスプレーによる抗Ｓｐ３５モノクローナル抗体の同定
その全てをここで引用してその全体を援用する、Ｈｏｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：３４４−３４８（２００５）；Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：１９４−２０５（２００３）；ａｎｄ Ｋｎａｐｐｉｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６（２０００）に記載されているように、抗Ｓｐ３５モノクローナル抗体Ｆａｂ断片を同定し、ファージディスプレイライブラリーから単離した。
ヒト化合成抗体可変領域を含むＭｏｒｐｈｏＳｙｓ Ｆａｂ−ファージディスプレイライブラリーＨｕＣＡＬ（登録商標）ＧＯＬＤ（表３Ｂ中の「ファージディスプレイライブらイー−２」）を標準的なＥＬＩＳＡ ＆ ＩＨＣスクリーニング方法によって組換えヒト可溶性Ｓｐ３５Ｆｃ蛋白質に対してスクリーニングした。例えば、Ｏｓｔｅｎｄｏｒｐ，Ｒ．，Ｆｒｉｓｃｈ，Ｃ．ａｎｄ Ｕｒｂａｎ Ｍ，“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ＨｕＣＡＬ（登録商標）．”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ２ Ｎｏｖｅｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ １３−５２（２００４）参照。Ｓｐ３５に特異的に結合するＦａｂ−ファージを精製し、特徴付けた。これらのファージディスプレー−由来モノクローナル抗体Ｆａｂ断片の特性を、「ファージディスプレイライブラリー−２−由来モノクローナルＦａｂ断片」として表３Ｂに示す。単離されたＦａｂ−ファージ１９６８をさらなる分析のために選択した。
実施例４
抗Ｓｐ３５モノクローナル抗体のＳｐ３５の免疫沈澱
免疫沈澱を行うために、Ｎ−末端のヘマグルチニン（ＨＡ）タグに融合した、Ｓｐ３５を発現するＣＯＳ−１細胞を、ＨＡタグを持つ全長Ｓｐ３５蛋白質を発現するＤＮＡ構築体でＣＯＳ−１細胞を一過的にトランスフェクトすることによって生じさせた。トランスフェクションから４８時間後に、細胞を収穫し、１ｍｍ溶解緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１％トリトンＸ−１００および１０％グリセロール）中で４℃にて３０分間溶解させた。１４，０００×ｇにおける１５分間の遠心の後に、上清をプロテインＡ／Ｇ−セファロースビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と共に４℃にて１時間インキュベートし、次いで、１Ａ７または２Ｆ３抗Ｓｐ３５マウスモノクローナル抗体いずれかと共に４℃にて１時間インキュベートした。ビーズを溶解緩衝液で３回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で沸騰させ、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、ＨＡタグを認識する抗体を用いるウエスタンブロッキングによって分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで示されるように、モノクローナル抗体１Ａ７および２Ｆ３はヒトおよびマウスＳｐ３５を免疫沈澱させた（図１）。図１に示すように、モノクローナル抗体２Ｆ３はヒトおよびマウスＳｐ３５双方を強力に免疫沈澱させ、他方、ヒトＳｐ３５を強力に免疫沈澱させるモノクローナル抗体１Ａ７はマウスＳｐ３５蛋白質を弱く認識したに過ぎなかった。同様に、モノクローナル抗体１Ｇ７、２Ｂ１０、２Ｆ３、３Ｐ４Ｃ２．２Ｄ２、３Ｐ４Ｃ８．２Ｇ９、Ｌｉ０１、Ｌｉ０３、Ｌｉ０５、Ｌｉ０６、Ｌｉ０７、Ｌｉ０８、Ｌｉ１１およびＬｉ１２はヒトまたはマウス、またはヒトおよびマウスＳｐ３５を免疫沈澱させる（表３Ｂ参照）。加えて、Ｌｉ０８はＡＰ−Ｓｐ３５を免疫沈澱させ、モノクローナル抗体１Ｂ６．４および３Ｅ３．１は内因性Ｓｐ３５を免疫沈殿させる（表３Ｂ参照）。
実施例５
抗Ｓｐ３５抗体はＥＬＩＳＡによって決定されたＳｐ３５に特異的に結合する。
Ｓｐ３５ポリペプチドのいずれの領域が、実施例２で生産された種々のハイブリドーマ−およびファージディスプレー−由来モノクローナル抗体によって結合されるのかを決定するために、各々が、実施例１に記載された方法によってＩｇＧ１のヒンジおよびＦｃ領域に融合された、切形されたＳｐ３５ポリペプチドのパネルを用いてＥＬＩＳＡアッセイを行った。該パネルは以下のＳｐ３５断片：配列番号２のアミノ酸３４〜４２５、配列番号２のアミノ酸４１７〜３５２、配列番号２のアミノ酸４１７〜４９３、および配列番号２のアミノ酸３４〜５３２よりなるものであった。オボアルブミンおよびＢＳＡを対照として用いた。表３Ｂに示すように、ハイブリドーマ−由来ｍＡｂ ２Ｆ３、２Ｂ１０、３Ａ３、３Ｐ４ｃ２．２ｄ２、および３Ｐ４ｃ８．２ｇ９、ならびにＦａｂ−ファージ由来ｍＡｂ ３３８３、３５６３、３５６４、３５６５、３５６８、３５６９、３５７０、および３５８２は、全て、１〜４１７および１〜５３４のＳｐ３５断片に特異的に結合し、これらの抗体はＳｐ３５のＬＲＲ領域におけるエピトープに結合することを示唆する。ハイブリドーマ−由来Ｍａｂ １Ａ７、３Ｐ１Ｂ１１Ｆ９、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、３Ｐ２Ｃ６３Ｇ１０．２Ｈ７、２Ｐ２Ｃ９．２Ｇ４、３Ｐ４Ａ６１Ｄ９、および３９４Ｃ５１Ｄ８、およびＦａｂ−ファージ−由来Ｍａｂ ３４９５、３５６６、３５６７、および１９６８は３４〜３５２ Ｓｐ３５断片に特異的に結合し、４１７〜５３２ Ｓｐ３５に弱く結合し、これらの抗体は、少なくともＬＲＲ領域に対してＣ−末端側のＳｐ３５の一部を含むエピトープに結合するようであることを示唆する。同様な実験において、これらの後者の抗体も、ヒトＳｐ３５のアミノ酸３４〜５３４よりなるＳｐ３５ポリペプチドに特異的に結合し、低親和性にて、マウスおよびラットＳｐ３５に結合した。マウスおよびラットＳｐ３５に対するこれらの後者の抗体の親和性は、マウスまたはラットＳｐ３５のアミノ酸４１９がヒスチジン（Ｈ）からアルギニン（Ｒ）に変化した場合に、ヒトＳｐ３５を用いて観察されたレベルまで回復した。アルギニンはヒトＳｐ３５における位置４１９でのアミノ酸である。モノクローナル抗体１Ａ７に対するＫＤは、ヒトＳｐ３５に結合するのに１０ｎＭ（１ｘ１０−９Ｍ）であると、およびマウスＳｐ３５に結合するのに２０μＭ（２ｘ１０−５Ｍ）であると決定された。４１７〜５３２領域に結合した抗体を検出するためのＡｐ−Ｓｐ３５ ＥＬＩＳＡでは、ＥＬＩＳＡを以下のように行った：ＭａｂをＥＬＩＳＡプレートに被覆し、次いで、Ｓｐ３５ＡＰ融合蛋白質と共４℃一晩、続いて、ＡＰ−結合抗ヒト（Ｈ＋Ｋ）（１：５，０００，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に室温にて１時間、あるいはＡＰ−融合蛋白質と共に４℃にて一晩インキュベートした。次いで、ＡＰ基質を、０．１Ｍグリシン、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＺｎＣｌ２、ｐＨ１０．５中の１０ｍｇ／ｍｌ ４ＮＰＰによって発色させ、Ｏ．Ｄ．４０５で読んだ。
実施例６
ＦＡＣＳによって決定されたＳｐ３５に特異的に結合する抗Ｓｐ３５抗体
実施例３に記載されたように生産されたハイブリドーマ−由来抗Ｓｐ３５ ｍＡｂ１Ａ７および２Ｆ３の結合特性をさらに特徴付けるために、マウスまたはヒトＳｐ３５を発現する固定されたおよび生きたＣＯＳ−７または２９３細胞双方への結合を比較した。Ｓｐ３５トランスフェクトおよび非トランスフェクト細胞を固定し、ＦＡＣＳ分析に付した（ＦＡＣＳ：ヒトまたはマウスＳｐ３５またはベクター対照でトランスフェクトされた細胞を培養プレートから解離し、２％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄し、１μｇ／ｍｌの一次抗体と共に１時間インキュベートした。細胞を２％ＦＢＡＳ／ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、氷上でＰＥ標識二次抗体（１：１００，ＪａｃｋｓｏｎＩｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）と共に３０分間インキュベートした。２％ＦＢＳ／ＰＢＳでの２回の洗浄の後、細胞を２％ＰＦＡ中で固定し、ＰＥによるＦＡＣＳ分析に付した）。ＦＡＣＳの結果は、Ｍａｂ １Ａ７および２Ｆ３が、Ｓｐ３５を発現するＣＯＳ−７または２９３細胞に結合するが、Ｓｐ３５を発現しない対照細胞に結合しないことを示す（図２）。
実施例７
神経突起形成アッセイ
ＣＮＳミエリン阻害剤、例えば、ＯＭｇｐのニューロンに対する阻害効果を逆行させる、前記したように生産したハイブリドーマ−由来およびＦａｂ−ファージ−由来モノクローナル抗体の能力をテストするために、Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）培養スライド（４ウエル）を０．１ｍｇ／ｍｌポリ−Ｄ−リジン（Ｓｉｇｍａ（登録商標））で被覆した。Ａｐ−ＯＭｇｐ（１μｇ／スポット）またはＰＢＳを３μｌ液滴としてスポットした。次いで、Ｌａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）スライドを濯ぎ、１０μｇ／ｍｌラミニン（ＧｉｂｃｏＴＭ）で被覆した。Ｐ６−７ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ子ラットからの後根神経接（ＤＲＧ）を１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼタイプ１（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）で解離し、ニューロン細胞中で豊富化させるために予め平板培養した炎−研磨パスツールピベットでトリチュレートし、最後に、予め被覆されたＬａｂ−Ｔｅｋ（登録商標）培養スライド上で１０，０００細胞／ウェルで平板培養した。ＤＲＧの平板培養直後に、１０μｇ／ｍｌのｍＡｂ １Ａ７または２Ｆ３を加えた。培養基は、５％加熱不活化ドナーウシ血清、５％加熱不活化胎児ウシ血清および５０ｍｇ／ｍｌマウス神経成長因子（ｍＮＧＦ）を含有する（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能な）Ｆ１２であり、３７℃および５％ＣＯ２ にて６時間インキュベートした。インキュベーションに続き、スライドを４％パラホルムアルデヒド／２０％スクロース中で固定し、１６時間後に抗βＩＩＩ−チューブリンＴＵＪ１抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ）で染色した。
１：３００希釈した二次抗体抗マウスＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）をスライドに加え、室温にて２時間インキュベートした。スライドをＧｅｌ／ＭｏｕｎｔＴＭ（ＢｉｏｍｅｄａＴＭ）でカバーグラスをかけた。全て製造業者の特定のパラメーターに従って、５×デジタルイメージはＯｐｅｎＬａｂＴＭ ソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）で獲得し、ＯＰＥＮＬＡＢＴＭソフトウェアを用いて神経突起形成の定量のためにイメージを分析した。
ＭＡｂ １Ａ７および２Ｆ３は、ＤＲＧニューロンを神経突起形成のＯＭｇｐ−媒介阻害から保護した（図３）。
実施例８
モノクローナル抗体１Ａ７は、ラット脊髄負傷モデルにおける機能的回復を保護する。
脊髄負傷（「ＳＣＩ」）は、従前に記載された方法（Ｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２４，１０５１１−１０５２０（２００４））から修飾して以下のように、後ろ側半−断面にわたって誘導した。麻酔した雌Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｓラット（７週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）に手術前鎮痛剤（ブプレノルフィン／ブプレネックス、０．０５ｍｇ／ｋｇ ｓ．ｃ．）およびトランキライザー（ミダゾラム、２．５ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ．）を投与し、後側半−切断を胸椎６／７で行い、主な後側中央および後側方皮質脊髄管（ＣＳＴ）を完全に中断した。皮質脊髄管（ＣＳＴ）の後側および後側−側方成分を完全に中断し、ＣＳＴの腹側部分は無傷のまま残した。半−切断後に残る腹側組織ブリッジは、双方の治療グループにおける索のほぼ２０％を構成した（データは示さず）。
Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ（ＢＢＢ）開放視野スコアリング方法（ここで引用して援用する、（Ｅｂｙ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１５３３６−１５３４２（２０００））を用いて、後ろ肢機能を定量し、ＳＣＩ後に全ての動物は顕著な機能的欠陥を維持し、外科的処置の後の日に後肢は殆ど完全に麻痺した。ＣＳＴ横断直後に、クモ膜下腔内カテーテルをＴ７におけるクモ膜下空間に注入し、皮下スペースに挿入されたプライムドミニ−浸透圧ポンプ（Ａｌｚｅｔ ｍｏｄｅｌ ２００４，Ａｌｚａ Ｃｏｒｐ）に連結した。ミニ−浸透圧ポンプは、ヒトＩｇＧイソタイプ対照蛋白質（５ｍｇ／ｍｌ）またはモノクローナル抗体１Ａ７（４．８ｍｇ／ｍｌ）を５週間にわたって０．２５μｌ／時間の速度で継続的に送達した。対照（ヒトＩｇＧ−処理）動物は実験の５週間の持続にわたって実質的な機能を回復したが、３〜４週間においてはプラトーとなり、最終的には、９±０．４５の平均ＢＢＢスコアを獲得した（図７）。対照的に、脊髄横断後５週間の１Ａ７の連続的クモ膜下腔注入の結果、５週間までに対照動物よりも有意に改善されたＢＢＢスコアがもたらされ、２〜５週間のタイムフレームにおける機能の継続した改良が伴い、１１．１±０．７の平均ＢＢＢスコアに到達した（図４）。これらの結果は、抗Ｓｐ３５モノクローナル抗体１Ａ７での処理が、ＢＢＢスコア、軸索再生、および軸索の免疫組織学的染色によって観察されたより低い軸索後退の増加によって示されるように、脊髄負傷後の機能の回復を促進したことを示す。
実施例９
抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、６Ｐ４Ｆ４．１Ｄ３、６Ｐ４Ｆ４．１Ｆ９、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、Ｌｉ０５、Ｌｉ０６、Ｌｉ０８、Ｌｉ１３、Ｌｉ２８、Ｌｉ３３、Ｄ０５およびＤ０８はイン・ビトロにてミエリン形成を促進する。
ミエリン形成における抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７および２Ｆ３の役割は、後根神経接（ＤＲＧ）ニューロンおよび稀突起神経膠細胞の共培養を抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７および２Ｆ３で処理し、免疫組織化学およびウエスタンブロッキングによってミエリン形成についてテストすることによって、イン・ビトロで調べた。これらの研究では、まず、ＤＲＧニューロンの、および稀突起神経膠細胞の初代培養を生じさせる必要があった。
雌Ｌｏｎｇ ＥｖａｎｓラットＥ１４−Ｅ１７胚後根神経接を、Ｐｌａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：６０８３−９１（２００２）によって記載されているように培養した。切開したＤＲＧを、ポリ−Ｌ−リジン−被覆カバーグラス（１００μｇ／ｍｌ）上で２週間平板培養した。細胞をフルオロデオキシウリジンの存在下にて２〜６日間、および１×Ｂ２７、１００ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＮＬＡ培地中で８〜１１日間インキュベートした。
雌Ｌｏｎｇ Ｅｖａｎｓ誕生後２日（Ｐ２）のラット稀突起神経膠細胞を、以下のように修飾して、Ｃｏｎｎ，Ｍｅｔｈ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：１−４（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；１９９０）によって記載されているように培養した。簡単に述べると、前脳をＰ２ラットから摘出し、冷ＨＢＳＳ培地（Ｇｉｂｃｏ）中に入れた。組織断片を１ｍｍピースに切断し、０．０１％トリプシンおよび１０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅ中で３７℃にて１５分間インキュベートした。解離した細胞をポリ−Ｌ−リジン被覆Ｔ７５組織培養フラスコで平板培養し、２０％胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ中で３７℃にて１０日間成長させた。Ａ２Ｂ５−陽性稀突起神経膠細胞を、フラスコを２００ｒｐｍにて３７℃で一晩震盪することによって収集した。Ａ２Ｂ５稀突起神経膠細胞を、２５ｍＭ Ｄ−グルコース、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌヒトアポ−トランスフェリン、５μｇ／ｍｌウシ膵臓インスリン、３０ｎＭセレン酸ナトリウム、１０ｎＭヒドロコルチゾン、１０ｎＭ Ｄ−ビオチン、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦおよびＰＤＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有するＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で７日間培養した。次いで、トリプシン処理によって細胞を収穫した。次いで、２％胎児ウシ血清、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸１００ｎｇ／ｍｌ ＮＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するＮＬＡ培地中の１、３、１０、または３０μｇ／ｍｌの抗Ｓｐ３５モノクローナル抗体１Ａ７または２Ｆ３、または陰性対照抗体の存在または不存在下で、細胞をＤＲＧニューロンと共に培養した。そのようなアッセイにおいて投与すべき有効な抗体用量は、抗体に応じて、０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの範囲であると決定された。当業者であれば、本明細書中に記載されたアッセイを用いて有効用量を決定することができるであろう。
培養基を変化させ、３日毎に種々のモノクローナル抗体を補充した。３７℃における３０日後に、抗βＩＩＩ−チューブリン抗体でのニューロフェラメント用の免疫組織化学染色（「ＩＨＣ」）によって、共−培養細胞を染色して、軸索を同定し、あるいは抗ＭＢＰ抗体での染色により、稀突起神経膠細胞を同定した（図４Ａ〜Ｅ）。また、共−培養細胞を溶解させ、ウェスタンブロット分析に付して、ＭＢＰを定量した（図４Ｇ）。ＩＨＣおよびウェスタンブロット分析に基づき、抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７および２Ｆ３で処理した共培養細胞は、稀突起神経膠細胞およびニューロンの増大した生存、束となった軸索の増大した数およびＭＢＰ陽性細胞の増大した数を示した（図４Ｆ、対照−抗体処理共−培養と比較した場合、１０−培を超えるＭＢＰ−陽性細胞）。
同様な実験において、稀突起神経膠細胞およびＤＲＧ共−培養を、抗Ｓｐ３５抗体Ｌｉ０５およびＬｉ０６、または陰性対照抗体の存在または不存在においてインキュベートした。共−培養細胞を溶解させ、ウェスタンブロット分析に付して、ＭＢＰを定量した（図８）。ウェスタンブロット分析に基づき、抗Ｓｐ３５抗体Ｌｉ０５およびＬｉ０６で処理した共−培養細胞は、３、１０および３０μｇのＳｐ３５Ｆｃ（ＬＩＮＧＯ−１−Ｆｃ）で処理された表−培養細胞と同様にＭＢＰ陽性細胞の増大した数を示した。
同様な実験において、稀突起神経膠細胞およびＤＲＧ共−培養を、抗Ｓｐ３５抗体３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、６Ｐ４Ｆ４．１Ｄ３、６Ｐ４Ｆ４．１Ｆ９、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、Ｌｉ０８、Ｌｉ１３、Ｌｉ２８、およびＬｉ３３の存在または不存在下でインキュベートし、これは、やはりミエリン形成を促進した。同様に、全長抗体Ｄ０５およびＤ−０８もまたミエリン形成を促進した。
これらの結果は、抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７、２Ｆ３、３Ｐ１Ｄ１０．２Ｃ３、３Ｐ１Ｅ１１．３Ｂ７、６Ｐ４Ｆ４．１Ｄ３、６Ｐ４Ｆ４．１Ｆ９、７Ｐ１Ｄ５．１Ｇ９、Ｌｉ０５、Ｌｉ０６、Ｌｉ０８、Ｌｉ１３、Ｌｉ２８、Ｌｉ３３、Ｄ０５およびＤ０８でのＤＲＧ−稀突起神経膠細胞共培養の処理は、対照−抗体処理共−培養と比較して、成熟稀突起神経膠細胞軸索の相互作用およびミエリン形成を促進した。
実施例１０
抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７は、イン・ビボにて稀突起神経膠細胞の生存およびミエリン形成を促進する。
成体野生型Ｃ５７Ｂ１／６雄マウスにクプリゾン（重量にて粉砕したマウス餌で破砕した０．２％）を６週間与えて、Ｍｏｒｅｌｌ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２：２２０−７（１９９８）によって記載された方法に従って脳梁内で脱髄を誘導した。簡単に述べれば、以下に記載する方法によって、クプリゾン供給から２、２．５および３週間後に、抗Ｓｐ３５モノクローナル抗体１Ａ７を脱髄しつつある脳梁に定位注射した。対照マウスに、同一間隔で、対照抗体を含有する滅菌培地を定位的に注射した６週間のクプリゾン供給が完了した後に、マウスを２、４および６週間の正常なダイエット（粉砕したマウス餌のみ）に戻して、再ミエリン形成を可能とした。
１Ａ７および対照モノクローナル抗体は以下のように投与した。クプリゾン−処理したマウスをケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ体重）で麻酔し、定位外科的処置のために設計された固定化装置（Ｄａｖｉｄ Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）に入れた。頭皮を開き、１．７ｍｍの深さのブレグマに対して０．７ｍｍ後ろおよび０．３ｍｍ側方の定位座標を用い、１０μｌのハミルトン（Ｈａｌｍｉｌｔｏｎ）シリンジで、滅菌化合物を、野生型受容体マウスの急性脱髄脳梁に片側注射した（１ｍｌのＨＢＳＳ中１μＭ）（Ｍｅｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．６３：３１３−１８（１９９９））。さらなる対照受容体マウスに、化合物を含有しないＨＢＳＳを定位注射した。頭蓋中の開口にゲルフォームを充填し、該領域をペニシリンおよびストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を綿棒で与え、創傷を縫合した。注射後実験の毎週にマウスを犠牲にし、その脳を摘出し、分子、生化学および組織学分析のために処理した。
抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７処理を受けた動物は、抗ＭＢＰ蛋白質抗体またはルキソールファストブルーを用いるＩＨＣによって、（ＣＣＩ抗体染色に基づいて（図５Ａ））増大した成熟稀突起神経膠細胞の生存、および軸索ミエリン形成を示した（図５Ｂ）。ＣＣ１抗体−陽性稀突起神経膠細胞を、４週間および６週間において定量した（図５Ｃ）。これらの結果は、抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７処理が、対照−抗体処理マウスと比較して、成熟稀突起神経膠細胞生存および軸索ミエリン形成を促進したことを示した。同様に、脱髄のリソレシチンモデルにおいて１Ａ７抗体を受けた動物もまた、対照動物と比較して軸索ミエリン形成を促進した（データは示さず）。
実施例１１
抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７は、視神経横断モデルにおいて網膜神経節細胞（ＲＧＣ）生存を促進する。
抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７を視神経横断モデルにおいてテストし、該モデルはニューロ機能に影響する因子を調べるものである。若い成体雌Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットをこの実験で用いた。各動物の右側視神経を視覚ディスクから１．５ｍｍにて眼窩内で横に切開した。６％フルオロ−ゴールド（Ｆｌｕｏｒｏ−Ｇｏｌｄ）（ＦＧ）に浸漬したゲルフォームのピースを、視覚ディスクの直ぐ背後の新しく横に切開した部位に適用して、生存する網膜神経節細胞（ＲＧＣ）を標識した。動物を、硝子体内注射によって抗ＳＰ３５抗体１Ａ７、対照抗体、またはＰＢＳだけいずれかを受けた３つの群に分けた（各群においてｎ＝６）。各硝子体内注射の容量は４μｌであり、他方、各注射の用量は２μｇであった。硝子体内注射は、視神経の横方向の切開直後に行った。
全ての動物を１週間生存させた。動物を犠牲にしてから２日後に、各動物の左側視神経を横に切開し、６％ＦＧを前記したように投与して、生存するＲＧＣを標識し、内部対照として供した。動物を過剰用量のネムブタールで犠牲にし、網膜を４％パラホルムアルデヒド中で切開した。４つの系方向切断を行って、網膜を４つの四分の一区（上側、下側、鼻側および側頭側）に分けた。次いで、網膜を同一の固定剤で１時間後−固定し、その後、それらを設置培地（Ｄａｋｏ）で平坦−設置した。紫外線フィルター（励起波長＝３３０〜３８０ｎｍ）を用いて、スライドを蛍光顕微鏡下で調べた。２００Ｘ２００μｍ２のアイピースグリッド下で、５００μｍ間隔にて、視覚ディスクから出発し周辺縁まで、標識したＲＧＣを各四分の一区の中線に沿ってカウントした。各処理から得られた生存ＲＧＣのパーセンテージは、負傷した目中の生存ＲＧＣの数をそれらの対側性目と比較することによって表した。全てのデータは、平均±ＳＥＭとして表した。統計学的有意性は片側ＡＮＯＶＡ、続いてＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒポスト飛節テストによって評価した。差はｐ＜０．０５で有意と考えられた。抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７処理マウスは、各々ほぼ５０％ニューロン生存を示したに過ぎない対照−抗体またはＰＢＳ処理マウスと比較した場合、より多くのニューロン生存（８０％）を示した（図６）。
実施例１２
視神経破砕モデルにおける再ミエリン形成についての抗Ｓｐ３５抗体のテスト
硝子体内注射による、２ｍｌ中の２μｌのモノクローナル抗体１Ａ７、２Ｆ３、Ｌｉ０５およびＬｉ０６の丁度投与前に、右側視神経は、眼窩内にて、眼球の後１．５ｍｍ辺りでの、１０秒間の＃５鉗子による完全な破砕を受ける。
動物は、外科的処置から１週間後に、同一処理の第二の硝子体内注射を受ける。外科的処置から２週間後に、動物をＥＭ固定剤で灌流し、ポスト固定し、半薄切片および超薄切片用に処理した。長手方向視神経切片を染色し、ミエリン観察のために調製した。破砕した視神経の近位および遠位部分のミエリン形成を、異なる処理群の間で比較する。Ｓｐ３５Ｆｃおよび１Ａ７、２Ｆ３、Ｌｉ０５およびＬｉ０６処理マウス、ならびに適当な対照を、対照と比較した視神経の遠位部分における再ミエリン形成について分析する。
実施例１３
視神経破砕モデルにおける軸索再生に対する抗Ｓｐ３５抗体のテスト
硝子体内注射を介して、ＰＢＳ中の２μｇのモノクローナル抗体１Ａ７の投与直前に、眼窩内にて、眼球後の１．５〜２ｍｍ辺りでの、１０秒間の＃５鉗子によって右側視神経を破砕した。４匹のラットを１Ａ７抗体でテストし、８匹のラットを対照動物として用いた。動物は、外科的処置から１週間後に、同一処理の第二の硝子体内注射を受けた。テスト動物の犠牲に３日先立って（実験の日１１）、２ｍｌのＣＴＢ−ＦＩＴＣを硝子体内注射して、再生視神経軸索を標識し、前方に動かした。外科的処置後１４日に、動物を灌流し、ポスト固定した。破砕した視神経を凍結された長手方向切片用に処理した。病巣部位を横切るＣＴＢ−ＦＩＴＣ標識軸索を、破砕部位を越えた種々の距離において再生線維としてカウントした。１Ａ７を目に注射した場合、軸索の再生は破砕部位を超えて２５０μｍまで観察された。図１０参照。
実施例１４
抗Ｓｐ３５抗体は、ＭＯＧ誘導ＥＡＥラットモデルを用いて視神経において再ミエリン形成および修復を促進する。
これらの実験のために、ミエリン稀突起神経膠細胞糖蛋白質（ＭＯＧ）誘導実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラットモデルを用いた。これは、ヒト多発性硬化症のための動物モデルである。セーライン中の５０μｌの２００ｎｇフロイント完全アジュバント（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ Ｉｎｃ．）＋５０μｌの５０μｇ ＭＯＧを乳化させ（１：１）、氷上に保持し、その後、各動物について尾の基部に皮内注射した。８〜１０週齢の雌茶色Ｎｏｒｗａｙラットを全ての実験で用いた。当該分野において、一般的な観察は、ＥＡＥモデルがＭＯＧ注射から１５日後辺りに誘導されることを示す。ラットをＥＡＥで臨床的兆候についてスコア取りする兆候を以下のようにスコア取りする：グレード０．５、尾の遠位不全麻痺；グレード１、完全な尾麻痺；グレード１．５、尾の不全麻痺、および温和な後ろ足不全麻痺；グレード２．０、片側のひどい後ろ足不全麻痺；グレード２．５、両側のひどい後足不全麻痺；グレード３．０、完全な両側の後足麻痺；グレード３．５、完全な両側の後足麻痺、および１つの前足の不全麻痺；グレード完全麻痺（四肢麻痺）、瀕死状態、または脂肪。一旦ＥＡＥモデルが誘導されれば、動物は処置を受ける。
２μｇ／μｌの抗Ｓｐ３５抗体（１Ａ７）を、ＭＯＧ−ＥＡＥ誘導に際して日１５において硝子体内注射した。２μｇ／μｌの抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７を日２２および日２８にさらに２回注射した。実験の終了に際して、動物を４％ＰＦＡで灌流した。視神経を１％ＯｓＯ４中で後固定し、脱水し、エポン（Ｅｐｏｎ）中に抱埋した。半薄切片（１μＭ）を切断し、ミエリン形成評価のためにトルイジンブルーで染色した。処理した動物の視神経を、視神経における軸索再生および再ミエリン形成について、未処理動物と比較した。全ての手法は、動物看護および使用委員会制度（ＩＡＣＵＣ）によって認可されたプロトコルに従って行った。
抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７での処理を受けた動物は、正常な視神経、あるいはＭＯＧ−誘導ＥＡＥに付されたが、処置を受けなかった動物と比較して、視神経の再ミエリン形成および修復を示した（図９）。図９Ｃにおいて、矢印はミエリン形成軸索を示す。Ｓｐ３５に対して特異的でない、Ｓｔｅｒｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ＭＯＰＣ２１）からのプロテインＧのドメインＩＩＩを認識する抗体を受ける動物は、正常な視神経、または未処理動物の視神経と比較して、視神経の再ミエリン形成または修復の兆候を示さなかった（データは示さず）。Ｓｐ３５アンタゴニスト抗体１Ａ７は、ラットＭＯＧ−誘導ＥＡＥ視神経炎モデルにおいて、視神経の再ミエリン形成および修復を促進した（図９）。
実施例１５
ＭＯＧ誘導ＥＡＥマウスモデルを用いるＣＮＳ再ミエリン形成の促進についての抗ＳＰ３５抗体のテスト
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化した１００μｇのＭＯＧ１−１２５蛋白質での皮内免疫化（日０）によって、ＥＡＥをマウスの１２９Ｂ６混合株において誘導する。注射された容量はマウス当たり１００μｌであり、３部位（耳介、背中および皮膚）に分配する。エマルジョンは１：１容量比率に基づいて調製し、１ｍｇ／ｍｌ ＭＯＧ１−１２５および２ｍｇ／ｍｌ Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（株Ｈ３７Ｒａ，Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）を含有する。百日咳トキシン（２００ｎｇ／マウス）を免疫化の時点に、およびその後２日に腹腔内投与する。体重および臨床的ＥＡＥスコア（０＝臨床的兆候無し；１＝跛行尾；２＝後足弱化、損なわれた立直り反射またはよたよた歩き歩行；３＝完全な後足麻痺または立直り反射の不存在；４＝ある程度の前足連座を伴う完全な後足麻痺；５＝十分に麻痺した動物；６＝瀕死または死亡）を毎日記録する。全ての手法は我々の動物看護および使用委員会制度（ＩＡＣＵＣ）によって認可されたプロトコルに従って行う。動物は、実験の日０において、１Ａ７、２Ｆ３、Ｌｉ０５およびＬｉ０６モノクローナル抗体または対照抗体での処理を受ける。眼窩後採血技術によって血液試料を実験を通じて種々の時点で採取する。血漿は遠心によってＰＢＭＣから分離し、細胞フェノタイピングはＦＡＣＳ染色によって行う。液性抗ＭＯＧ抗体応答のプロファイリングは、サブクラス−／イソタイプ−特異的ｍＡｂ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いるＥＬＩＳＡによって行う。各実験の最後に、灌流に続いて、脳、脊髄、視神経および坐骨神経を収穫する。
この同一プロトコルを用いて、Ｓｐ３５ノックアウトマウスおよび同腹子においてＥＡＥを誘導する。Ｓｐ３５ノックアウトマウスは典型的にはより低いＥＡＥスコア（１．５）を示し、対照と比較して再発を示さず（４５日の期間に渡る）、次いで、野生型同腹子である（ＥＡＥスコア３．５）。
Ｓｐ３５Ｆｃおよび１Ａ７、２Ｆ３処理動物は、対照と比較して再ミエリン形成について分析する。
ドキシサイクリン誘導性ＴｅｔＯ−ＡＯＸ１プロモーター（Ｍ．Ｌｅｖｅｓｑｕｅ，Ｄ．Ｋｒｕｓｈｉｎｓｋｉｅ ａｎｄ Ｋ．Ｓｔｒａｕｃｈ、調製中の原稿）を用い、Ｈｉｓ−タグドＭＯＧ１−１２５蛋白質をＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて発現させた。ラットＭＯＧの細胞外コーディング配列（シグナル配列）の除去後の成熟蛋白質のＧｌｙ１〜Ｇｌｙ１２５）を以下のプライマー：
Figure 2009502123
 を用いてＰＣＲ増幅した。
本発明は、本発明の個々の態様の単なる説明として意図される記載された具体的な実施形態によってその範囲は制限されるべきではなく、機能的に同等であるいずれの組成物および方法も本発明の範囲内のものである。事実、本明細書中に示され、記載されたものに加えて、本発明の種々の修飾は、これまでの記載および添付の図面から当業者に明らかであろう。そのような修飾は、添付の請求の範囲の範囲内に入ることが意図される。
本明細書中において言及された全ての刊行物および特許出願は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が引用により一体化されるように具体的かつ個々に示されるのと同程度にここで引用して援用する。
モノクローナル抗体１Ａ７および２Ｆ３によるＳｐ３５の免疫沈澱を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。 ＭＡｂ １Ａ７および２Ｆ３がＳｐ３５を発現するＣＯＳ−７または２９３細胞に結合したが、Ｓｐ３５発現を持たない対照細胞には結合しなかったことを示すＦＡＣＳ結果。 ＭＡｂ １Ａ７および２Ｆ３は、神経突起形成のミエリン−媒介阻害からＤＲＧニューロンを保護した。 図４Ａ〜Ｇ：モノクローナル抗体１Ａ７および２Ｆ３、または対照抗体で処理されたＤＲＧニューロンおよび稀突起神経膠細胞の共培養の免疫組織化学染色（「ＩＨＣ」）。パネルＤおよびＥは、各々、パネルＢおよびＣの拡大図である。軸索を同定するための抗βＩＩＩ−チューブリン抗体、または稀突起神経膠細胞を同定するための抗ＭＢＰ抗体での染色。Ｆ：１Ａ７または２Ｆ３での共培養の処理に際しての、ＭＢＰ＋髄鞘形成細胞の定量。Ｇ：モノクローナル抗体１Ａ７および２Ｆ３で処理されたＤＲＧニューロンおよび稀突起神経膠細胞の共培養から生じたＭＢＰを定量するためのウェスタンブロット分析。 図４Ａ〜Ｇ：モノクローナル抗体１Ａ７および２Ｆ３、または対照抗体で処理されたＤＲＧニューロンおよび稀突起神経膠細胞の共培養の免疫組織化学染色（「ＩＨＣ」）。パネルＤおよびＥは、各々、パネルＢおよびＣの拡大図である。軸索を同定するための抗βＩＩＩ−チューブリン抗体、または稀突起神経膠細胞を同定するための抗ＭＢＰ抗体での染色。Ｆ：１Ａ７または２Ｆ３での共培養の処理に際しての、ＭＢＰ＋髄鞘形成細胞の定量。Ｇ：モノクローナル抗体１Ａ７および２Ｆ３で処理されたＤＲＧニューロンおよび稀突起神経膠細胞の共培養から生じたＭＢＰを定量するためのウェスタンブロット分析。 図５Ａ〜Ｃ：Ａ：クプリゾンモデルにおけるマウス稀突起神経膠細胞のＣＣ１抗体染色。Ｂ：クプリゾンモデルにおけるマウスニューロンの抗ＭＢＰ蛋白質抗体またはルキソール速青色染色。Ｃ：４週および６週におけるＣＣ１抗体−陽性稀突起神経膠細胞の定量。 生存するＲＧＣ。モノクローナル抗体１Ａ７での処理。抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７処理マウスは、各々がほぼ５０％ニューロン生存を示したにすぎない対照−抗体またはＰＢＳ処理マウスと比較した場合、有意なニューロン生存（８０％）を示した。 実施例８に記載されたような脊髄負傷後に抗Ｓｐ３５抗体１Ａ７を受けるマウスのＢＢＢスコア。 実施例９に記載されたような、抗Ｓｐ３５抗体Ｌｉ０５、Ｌｉ０６および３、１０および３０ｍｇのＳｐ３５Ｆｃ（ＬＩＮＧＯ−１−Ｉｇ）とのインキュベーション後における共−培養稀突起神経膠細胞およびＤＲＧのウェスタンブロット。 Ａ）正常なラット；Ｂ）ミエリン稀突起神経膠細胞糖蛋白質（ＭＯＧ）誘導実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラット；およびＣ）Ｓｐ３５抗体１Ａ７で処理されたミエリン稀突起神経膠細胞糖蛋白質（ＭＯＧ）誘導実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）ラットの視神経の写真。各視神経の電子顕微鏡写真を視神経の各写真下方に示す。 視神経破砕後におけるＳｐ３５抗体１Ａ７の硝子体内注射を受ける動物でカウントされた断面当たりの再生ニューロン線維の数のグラフ。

Claims (212)

  1. Figure 2009502123
     よりなる群から選択される参照モノクローナル抗体と同一のＳｐ３５エピトープに特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合断片。
  2. Ｓｐ３５に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合断片であって、該抗体またはその断片は、
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される参照モノクローナル抗体がＳｐ３５に特異的に結合するのを競合的に阻害する単離された抗体またはその抗原結合断片。
  3. Ｓｐ３５に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合断片であって、該抗体またはその断片は、
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される単離された抗体、またはその抗原結合断片。
  4. 線状エピトープに結合する請求項１〜３いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  5. 非線状立体配座エピトープに結合する請求項１〜３いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  6. Ｓｐ３５ ＬＲＲドメインに結合する請求項１〜５いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  7. Ｓｐ３５ ＬＲＲＮＴまたはＬＲＲＣＴドメインに結合する請求項１〜５いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  8. 配列番号２のアミノ酸４１７〜５３２または配列番号２のアミノ酸４９５〜５３２からのＳｐ３５の領域に結合する請求項１〜５いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  9. Ｓｐ３５の塩基性領域ドメインに結合する請求項１〜５いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  10. 配列番号２のアミノ酸４１５〜４２４、または配列番号２のアミノ酸４１７〜４２４に結合する請求項９記載の抗体またはその断片。
  11. Ｓｐ３５の免疫グロブリンドメインに結合する請求項１〜５いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  12. 配列番号２のアミノ酸４１９〜４９３に結合する請求項１１記載の抗体またはその断片。
  13. Ｓｐ３５のＬＬＲＣＴドメインに結合する請求項１〜５いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  14. 配列番号２のアミノ酸３６３〜４１４、または配列番号２のアミノ酸３６３〜４１６に結合する請求項１３記載の抗体またはその断片。
  15. 多価であって、少なくとも２つの重鎖および少なくとも２つの軽鎖を含む請求項１〜１４いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  16. 多特異的である請求項１〜１５いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  17. 二特異的である請求項１６記載の抗体またはその断片。
  18. ヒト化された請求項１〜１７いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  19. キメラである請求項１〜１７いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  20. 霊長類化された請求項１〜１７いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  21. 完全なヒト抗体である請求項１〜１７いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  22. Ｆａｂ断片である請求項１〜２１いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  23. Ｆａｂ’断片である請求項１〜２１いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  24. Ｆ（ａｂ）２断片である請求項１〜２１いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  25. Ｆｖ断片である請求項１〜２１いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  26. 単一鎖抗体である請求項１〜２１いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  27. 前記参照モノクローナル抗体に対する解離定数（ＫＤ）未満のＫＤによって特徴付けられる親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片、あるいはＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する請求項１、２、または４〜２６いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  28. Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片、あるいはＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する請求項１〜２６いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  29. マウスＳｐ３５ポリペプチドまたはその断片と比較して、ヒトＳｐ３５ポリペプチドまたはその断片に優先的に結合する請求項１〜２８いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  30. Ｓｐ３５媒介神経突起形成阻害のアンタゴニストである請求項１〜２９いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  31. Ｓｐ３５媒介ニューロン細胞死のアンタゴニストである請求項１〜２９いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  32. Ｓｐ３５媒介ミエリン形成阻害のアンタゴニストである請求項１〜２９いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  33. Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞細胞死のアンタゴニストである請求項１〜２９いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  34. Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞分化阻害のアンタゴニストである請求項１〜２９いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  35. Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞増殖阻害のアンタゴニストである請求項１〜２９いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  36. 前記抗体またはその断片に融合した異種ポリペプチドをさらに含む請求項１〜３５いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  37. 前記抗体が治療剤、プロドラッグ、ペプチド、蛋白質、酵素、ウィルス、脂質、生物学的応答モディファイアー、医薬剤、またはＰＥＧよりなる群から選択される剤にコンジュゲートされた請求項１〜３６いずれか１項記載の抗体またはその断片。
  38. 請求項１〜３７いずれか１項記載の抗体またはその断片、および担体を含む組成物。
  39. ＶＨ領域およびＶＬ領域を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該ＶＨおよびＶＬ領域が、各々、
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される参照ポリペプチドに対して少なくとも９０％同一であるポリペプチド配列を含み、ここで、該ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片はＳｐ３５に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片。
  40. ＶＨ領域およびＶＬ領域を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該ＶＨおよびＶＬ領域は、各々、
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される参照ポリペプチドに対して、２０未満の保存的アミノ酸置換を除いて同一であり、ここで、該ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合断片。
  41. ＶＨ領域およびＶＬ領域を含む単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該ＶＨおよびＶＬ領域は、各々、
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択されるポリペプチドを含む単離された抗体またはその抗原結合断片。
  42. 免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域は、各々、
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される参照重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ポリペプチド配列に対して少なくとも９０％同一であり、ここで、該ＶＨを含む抗体またはその抗原結合断片はＳｐ３５に特異的に結合する単離されたポリヌクレオチド。
  43. 免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域は、各々、
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される参照重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列に対して２０未満の保存的アミノ酸置換を除いて同一であり、ここで、該ＶＨを含む抗体またはその抗原結合断片はＳｐ３５に特異的に結合する単離されたポリヌクレオチド。
  44. 前記ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域が
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択されるポリペプチド配列を含む請求項４２または４３いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  45. 免疫グロブリン重鎖（ＶＨ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該ＶＨの該ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域が
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される核酸配列によってコードされる単離されたポリヌクレオチド。
  46. 配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０および３８４よりなる群から選択される参照ＶＨポリペプチド配列に対して少なくとも９０％同一であるＶＨ領域をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該ＶＨを含む抗体、またはその抗原結合断片はＳｐ３５に特異的に結合する単離されたポリヌクレオチド。
  47. 配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０および３８４よりなる群から選択される参照ＶＨポリペプチド配列に対して、２０未満の保存的アミノ酸置換を除いて同一であるＶＨ領域をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該ＶＨを含む抗体またはその抗原結合断片はＳｐ３５に特異的に結合する単離されたポリヌクレオチド。
  48. 前記ＶＨが前記参照ＶＨに対して同一である請求項４６または４７いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  49. 前記ＶＨが配列番号１７３〜１８４、３７０、３７４、３７８および３８２よりなる群から選択される核酸配列によってコードされる請求項４６または４７いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  50. 前記ＶＨに融合したシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む請求項４２〜４９いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  51. 前記ＶＨに融合したＣＨ１ドメインをコードする核酸をさらに含む請求項４２〜４９いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  52. 前記ＶＨに融合したＣＨ２ドメインをコードする核酸をさらに含む請求項４２〜４９いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  53. 前記ＶＨに融合したＣＨ３ドメインをコードする核酸をさらに含む請求項４２〜４９いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  54. 前記ＶＨに融合したヒンジ領域をコードする核酸をさらに含む請求項４２〜４９いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  55. 前記ＶＨを含む抗体またはその抗原結合断片が
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同一のエピトープに特異的に結合する請求項４２〜５４いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  56. 前記ＶＨを含む抗体またはその抗原結合断片が、
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択されるモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合するのを競合的に阻害する請求項４２〜５４いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  57. 前記ＶＨを含む抗体またはその抗原結合断片が、
    Figure 2009502123
     以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片、あるいはＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する請求項４２〜５４いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  58. 免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域が、各々、
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される参照軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列に対して少なくとも９０％同一であり、ここで、該ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５に特異的に結合する単離されたポリヌクレオチド。
  59. 免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域は、各々、
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される参照軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列に対して２０未満の保存的アミノ酸置換を除いて同一であり、ここで、該ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５に特異的に結合する単離されたポリヌクレオチド。
  60. 前記ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域が
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択されるポリペプチド配列を含む請求項５８または５９いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  61. 免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該ＶＬの該ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域が
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される核酸配列によってコードされる単離されたポリヌクレオチド。
  62. 配列番号２７３〜２８６、３７３、３７７、３８１および３８５よりなる群から選択される参照ＶＬポリペプチド配列に対して少なくとも９０％同一であるＶＬ領域をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５に特異的に結合する単離されたポリヌクレオチド。
  63. 配列番号２７３〜２８６、３７３、３７７、３８１および３８５よりなる群から選択される参照ＶＬポリペプチド配列に対して、２０未満の保存的アミノ酸置換を除いて同一であるＶＬ領域をコードする核酸を含む単離されたポリヌクレオチドであって、該ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５に特異的に結合する単離されたポリヌクレオチド。
  64. 前記ＶＬが該参照ＶＬに対して同一である請求項６２または６３いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  65. 前記ＶＬが、配列番号１８５〜１９４、３７１、３７５、３７９、および３８３よりなる群から選択される核酸配列によってコードされる請求項６４記載のポリヌクレオチド。
  66. 前記ＶＬに融合したシグナルペプチドをコードする核酸をさらに含む請求項５８〜６５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  67. 前記ＶＬに融合したＣＨ１ドメインをコードする核酸をさらに含む請求項５８〜６５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  68. 前記ＶＬに融合したＣＨ２ドメインをコードする核酸をさらに含む請求項５８〜６５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  69. 前記ＶＬに融合したＣＨ３ドメインをコードする核酸をさらに含む請求項５８〜６５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  70. 前記ＶＬに融合したヒンジ領域をコードする核酸をさらに含む請求項５８〜６５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  71. 前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同一のエピトープに特異的に結合する請求項５８〜７０いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  72. 前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択されるモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合するのを競合的に阻害する請求項５８〜７０いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  73. 前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が
    Figure 2009502123
     以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片、あるいはＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する請求項５８〜７２いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  74. 異種ポリヌクレオチドをさらに含む請求項４２〜７３いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  75. 前記異種ポリヌクレオチドが異種ポリペプチドをコードする請求項７４記載のポリヌクレオチド。
  76. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が線状エピトープに特異的に結合する請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  77. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が非線状立体配座エピトープに特異的に結合する請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  78. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５ ＬＲＲドメインに特異的に結合する請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  79. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５ ＬＲＲＮＴドメインに特異的に結合する請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  80. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５ ＬＲＲＣＴドメインに特異的に結合する請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  81. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５免疫グロブリンドメインに特異的に結合する請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  82. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５塩基性領域に特異的に結合する請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  83. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、少なくとも２つの重鎖および少なくとも２つの軽鎖を含む多価抗体分子である請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  84. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が多特異的である請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  85. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が二特異的である請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  86. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が一価、二価、多価、または二機能的である請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  87. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がヒト化された請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  88. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または該ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片がキメラである請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  89. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が霊長類化された請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  90. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が完全なヒト抗体である請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  91. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＦａｂ断片である請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  92. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＦａｂ’断片である請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  93. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＦ（ａｂ）２断片である請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  94. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＦｖ断片である請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  95. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が単一鎖抗体である請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  96. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、
    Figure 2009502123
     以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片、あるいはＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  97. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、マウスＳｐ３５ポリペプチドまたはその断片と比較して、ヒトＳｐ３５ポリペプチドまたはその断片に優先的に結合する請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  98. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５媒介神経突起形成阻害のアンタゴニストである請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  99. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５媒介ミエリン形成阻害のアンタゴニストである請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  100. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５媒介稀突起神経膠細胞死のアンタゴニストである請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  101. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５媒介稀突起神経膠細胞分化阻害のアンタゴニストである請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  102. 前記ＶＨまたは前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５媒介稀突起神経膠細胞増殖阻害のアンタゴニストである請求項４２〜７５いずれか１項記載のポリヌクレオチド。
  103. 請求項４２〜１０２いずれか１項記載のポリヌクレオチドを含む組成物。
  104. ＶＨコーディングポリヌクレオチドおよびＶＬコーディングポリヌクレオチドを含む組成物であって、該ＶＨコーディングポリヌクレオチドおよび該ＶＬコーディングポリヌクレオチドが各々、
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される参照ポリペプチドに対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含み、ここで、該ＶＨおよびＶＬコーディングポリヌクレオチドが一緒に、Ｓｐ３５に特異的に結合する抗体またはその抗原断片をコードする組成物。
  105. ＶＨコーディングポリヌクレオチドおよびＶＬコーディングポリヌクレオチドを含む組成物であって、該ＶＨコーディングポリヌクレオチドおよび該ＶＬコーディングポリヌクレオチドが、各々、
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される参照ポリペプチドに対して、２０未満の保存的アミノ酸置換を除いて同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含み、ここで、該ＶＨおよびＶＬコーディングポリヌクレオチドが、一緒に、Ｓｐ３５に特異的に結合する抗体またはその結合断片をコードする組成物。
  106. ＶＨコーディングポリヌクレオチドおよびＶＬコーディングポリヌクレオチドを含む組成物であって、該ＶＨコーディングポリヌクレオチドおよび該ＶＬコーディングポリヌクレオチドは、各々、
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される参照ポリペプチドに対して同一であるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む組成物。
  107. 前記ＶＨコーディングポリヌクレオチドおよび前記ＶＬコーディングポリヌクレオチドが各々、
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項１０４〜１０６いずれか１項記載の組成物。
  108. 前記ＶＨコーディングポリヌクレオチドおよび前記ＶＬコーディングポリヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドによってコードされるＶＨおよびＶＬポリペプチドが単一鎖抗体またはその断片に含まれるように、同一オープンリーディングフレームに含有される請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  109. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が線状エピトープに特異的に結合する請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  110. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が非線状立体配座エピトープに特異的に結合する請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  111. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５ ＬＲＲドメインに特異的に結合する請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  112. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５ ＬＲＲＮＴドメインに特異的に結合する請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  113. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５ ＬＲＲＣＴドメインに特異的に結合する請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  114. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５免疫グロブリンドメインに特異的に結合する請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  115. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５塩基性領域に特異的に結合する請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  116. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、少なくとも２つの重鎖および少なくとも２つの軽鎖を含む多価抗体分子である請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  117. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、多特異的である請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  118. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、二特異的である請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  119. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、一価、二価、多価、または二機能的である請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  120. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、ヒト化されている請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  121. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、キメラである請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  122. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、霊長類化されている請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  123. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、完全なヒト抗体である請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  124. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、Ｆａｂ断片である請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  125. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、Ｆａｂ’断片である請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  126. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、Ｆ（ａｂ）２断片である請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  127. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、Ｆｖ断片である請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  128. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、単一鎖抗体である請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  129. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、
    Figure 2009502123
     以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片、あるいはＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  130. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、マウスＳｐ３５ポリペプチドまたはその断片と比較して、ヒトＳｐ３５ポリペプチドまたはその断片に優先的に結合する請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  131. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、Ｓｐ３５媒介神経突起形成阻害のアンタゴニストである請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  132. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、Ｓｐ３５媒介ミエリン形成阻害のアンタゴニストである請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  133. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞細胞死のアンタゴニストである請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  134. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞分化阻害のアンタゴニストである請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  135. 前記ＶＨおよびＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が、Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞増殖阻害のアンタゴニストである請求項１０４〜１０７いずれか１項記載の組成物。
  136. 請求項４２〜１０２いずれか１項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  137. 前記ポリヌクレオチドがプロモーターと作動可能に会合している請求項１３６記載のベクター。
  138. ＶＨをコードする前記ポリヌクレオチド、およびＶＬをコードする前記ポリヌクレオチドがインフレームで融合し、それに作動可能に会合した単一プロモーターから同時転写され、かつ単一鎖抗体またはその抗原結合断片に同時翻訳される請求項１３６記載のベクター。
  139. ＶＨをコードする前記ポリヌクレオチド、およびＶＬをコードする前記ポリヌクレオチドがそれに作動可能に会合する単一プロモーターから同時転写される請求項１３６記載のベクター。
  140. ＶＨをコードする前記ポリヌクレオチドおよびＶＬをコードする前記ポリヌクレオチドの間におかれたＩＲＥＳ配列をさらに含む請求項１３９記載のベクター。
  141. ＶＨをコードする前記ポリヌクレオチドおよびＶＬをコードする前記ポリヌクレオチドが別々に転写され、各々は別々のプロモーターに作動可能に会合している請求項１３９記載のベクター。
  142. 前記別々のプロモーターが同一のプロモーターのコピーである請求項１４１記載のベクター。
  143. 前記別々のプロモーターが同一でない請求項１４１記載のベクター。
  144. 請求項１３６〜１４３いずれか１項記載のベクターを含む組成物。
  145. 請求項４５〜５７または７４〜１０２いずれか１項記載のＶＨコーディングポリヌクレオチドを含む第一のベクター、および請求項５８〜７３または７４〜１０２いずれか１項記載のＶＬコーディングポリヌクレオチドを含む第二のベクターを含む組成物。
  146. 請求項４２〜１０２いずれか１項記載のポリヌクレオチド、または請求項１３６〜１４５いずれか１項記載のベクターを含む宿主細胞。
  147. 少なくとも第一および第二のベクターを含む宿主細胞であって、該第一および該第二のベクターは同一でなく、該第一のベクターは免疫グロブリン重鎖可変領域をコードする請求項４２〜５７または７４〜１１２いずれか１項記載のポリヌクレオチドを含み、該第二のベクターは免疫グロブリン軽鎖可変領域をコードする請求項５８〜７３または７４〜１０２いずれか１項記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  148. 請求項１４６〜１４７いずれか１項記載の宿主細胞を培養し、前記抗体を回収することを含む、抗Ｓｐ３５抗体の生産方法。
  149. 請求項１４８の方法によって生産された抗Ｓｐ３５抗体、またはその抗原結合断片。
  150. 免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチドであって、該ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域は、各々、
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される参照重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列に対して少なくとも９０％同一であり、ここで、該ＶＨを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５に特異的に結合する単離されたポリペプチド。
  151. 免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチドであって、該ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域は、各々、
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される参照重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列に対して２０未満の保存的アミノ酸置換を除いて同一であり、ここで、該ＶＨを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５に特異的に結合する単離されたポリペプチド。
  152. 免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む単離されたポリペプチドであって、該ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域が
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される単離されたポリペプチド。
  153. 配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０および３８４よりなる群から選択される参照ＶＨ配列に対して少なくとも９０％同一であるＶＨを含む単離されたポリペプチドであって、該ＶＨを含む抗体、またはその抗原結合断片がＳｐ３５に特異的に結合する単離されたポリペプチド。
  154. 配列番号１５８〜１７２、３７２、３７６、３８０および３８４よりなる群から選択される参照ＶＨ配列に、２０未満の保存的アミノ酸置換を除いて同一であるＶＨを含む単離されたポリペプチドであって、該ＶＨを含む抗体、またはその抗原結合断片がＳｐ３５に特異的に結合する単離されたポリペプチド。
  155. 前記ＶＨが配列番号１５８〜１７２、３７３、３７７、３８１および３８５よりなる群から選択される請求項１５３記載のポリペプチド。
  156. 前記ＶＨを含む抗体またはその抗原結合断片が
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同一のエピトープに特異的に結合する請求項１５０〜１５５いずれか１項記載のポリペプチド。
  157. 前記ＶＨを含む抗体またはその抗原結合断片が
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択されるモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合するのを競合的に阻害する請求項１５０〜１５５いずれか１項記載のポリペプチド。
  158. 前記ＶＨを含む抗体またはその抗原結合断片が、
    Figure 2009502123
     以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片、あるいはＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する請求項１５０〜１５７いずれか１項記載のポリペプチド。
  159. 免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチドであって、該ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域が、各々、
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される参照軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列に対して少なくとも９０％同一であり、ここで、該ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５に特異的に結合する単離されたポリペプチド。
  160. 免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチドであって、該ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域は、各々、
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される参照軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列に対して２０未満の保存的アミノ酸置換を除いて同一であり、ここで、該ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片はＳｐ３５に特異的に結合する単離されたポリペプチド。
  161. 免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離されたポリペプチドであって、該ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域は
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択される単離されたポリペプチド。
  162. 配列番号２７３〜２８６、３７３、３７７、３８１および３８５よりなる群から選択される参照ＶＬ配列に対して少なくとも９０％同一であるＶＬを含む単離されたポリペプチドであって、該ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片はＳｐ３５に特異的に結合する単離されたポリペプチド。
  163. 配列番号２７３〜２８６、３７３、３７７、３８１および３８５よりなる群から選択される参照ＶＬ配列に対して、２０未満の保存的アミノ酸置換を除いて同一であるＶＬを含む単離されたポリペプチドであって、該ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片はＳｐ３５に特異的に結合する単離されたポリペプチド。
  164. 前記ＶＬが配列番号２７３〜２８６、３７３、３７７、３８１および３８５よりなる群から選択される請求項１６２または１６３いずれか１項記載のポリペプチド。
  165. 前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択されるモノクローナル抗体と同一のエピトープに特異的に結合する請求項１５９〜１６４いずれか１項記載のポリペプチド。
  166. 前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が
    Figure 2009502123
     よりなる群から選択されるモノクローナル抗体がＳｐ３５に結合するのを競合的に阻害する請求項１５９〜１６４いずれか１項記載のポリペプチド。
  167. 前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片が
    Figure 2009502123
    Figure 2009502123
     以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片、あるいはＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する請求項１５９〜１６６いずれか１項記載のポリペプチド。
  168. 前記ポリペプチドに融合した異種ポリペプチドをさらに含む請求項１５０〜１６７いずれか１項記載のポリペプチド。
  169. 前記ポリペプチドが治療剤、プロドラッグ、ペプチド、蛋白質、酵素、ウィルス、脂質、生物学的応答モディファイアー、医薬剤、またはＰＥＧよりなる群から選択される剤にコンジュゲートされた請求項１５０〜１６８いずれか１項記載のポリペプチド。
  170. 請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチドを含む組成物であって、前記ＶＨおよび前記ＶＬを含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５に特異的に結合する組成物。
  171. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片が線状エピトープに特異的に結合する請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  172. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片が非線状立体配座エピトープに特異的に結合する請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  173. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５ ＬＲＲドメインに特異的に結合する請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  174. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５ ＬＲＲＮＴドメインに特異的に結合する請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  175. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５ ＬＲＲＣＴドメインに特異的に結合する請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  176. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５塩基性領域に特異的に結合する請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  177. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片がＳｐ３５免疫グロブリンドメインに特異的に結合する請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  178. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片が、少なくとも２つの重鎖および少なくとも２つの軽鎖を含む多価抗体分子である請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  179. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片が多特異的である請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  180. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片が二特異的である請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  181. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片が一価、二価、多価、または二機能的である請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  182. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片がヒト化された請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  183. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片がキメラである請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  184. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片が霊長類化された請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  185. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片が完全なヒト抗体である請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  186. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片がＦａｂ断片である請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  187. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片がＦａｂ’断片である請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  188. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片がＦ（ａｂ）２断片である請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  189. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片がＦｖ断片である請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  190. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片が単一鎖抗体である請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  191. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片が、
    Figure 2009502123
     以下の解離定数（ＫＤ）によって特徴付けられる親和性で、Ｓｐ３５ポリペプチドまたはその断片、あるいはＳｐ３５改変体ポリペプチドに特異的に結合する請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  192. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片が、マウスＳｐ３５ポリペプチドまたはその断片と比較して、ヒトＳｐ３５ポリペプチドまたはその断片に優先的に結合する請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０記載の組成物。
  193. 請求項１５０〜１９２いずれか１項記載のポリペプチド、および担体を含む組成物。
  194. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片が、Ｓｐ３５媒介神経突起形成阻害のアンタゴニストである請求項１５０〜１９２いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０〜１９３いずれか１項記載の組成物。
  195. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片が、Ｓｐ３５媒介ミエリン形成阻害のアンタゴニストである請求項１５０〜１９２いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０〜１９３いずれか１項記載の組成物。
  196. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片が、Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞細胞死のアンタゴニストである請求項１５０〜１９２いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０〜１９３いずれか１項記載の組成物。
  197. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片が、Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞分化阻害のアンタゴニストである請求項１５０〜１９２いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０〜１９３いずれか１項記載の組成物。
  198. 前記ＶＨ、前記ＶＬ、または前記ＶＨおよびＶＬ双方を含む抗体またはその抗原結合断片が、Ｓｐ３５媒介稀突起神経膠細胞増殖阻害のアンタゴニストである請求項１５０〜１９２いずれか１項記載のポリペプチド、または請求項１７０〜１９３いずれか１項記載の組成物。
  199. 請求項１５０〜１６９いずれか１項記載のポリペプチドを含む単離された抗体またはその抗原結合断片。
  200. 有効量の、請求項１〜４１または１９９いずれか１項記載の単離されたＳｐ３５抗体またはその断片、請求項４２〜１０２いずれか１項記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項１５０〜１９２または１９４〜１９８いずれか１項記載の単離されたポリペプチド、または請求項１０３〜１３５、１４４、または１９３いずれか１項記載の組成物よりなる群から選択される剤を負傷に罹った動物に投与することを含むＣＮＳ負傷を治療する方法。
  201. 前記ＣＮＳ負傷が外傷性脳負傷、脊髄負傷、および視神経負傷よりなる群から選択される請求項２００記載の方法。
  202. 有効量の、請求項１〜４１または１９９いずれか１項記載の単離されたＳｐ３５抗体またはその断片、請求項４２〜１０２いずれか１項記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項１５０〜１９２または１９４〜１９８いずれか１項記載の単離されたポリペプチド、または請求項１０３〜１３５、１４４または１９３いずれか１項記載の組成物よりなる群から選択される剤を治療を必要とする動物に投与することを含む、ＣＮＳにおけるニューロン成長の阻害に関連する病気または障害を治療する方法。
  203. 前記病気または障害がＡＬＳ、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病性神経障害、および脳卒中よりなる群から選択される請求項２０２記載の方法。
  204. 有効量の、請求項１〜４１または１９９いずれか１項記載の単離されたＳｐ３５抗体またはその断片、請求項４２〜１０２いずれか１項記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項１５０〜１９２、または１９４〜１９８いずれか１項記載の単離されたポリペプチド、または請求項１０３〜１３５、１４４または１９３いずれか１項記載の組成物よりなる群から選択される剤を治療を必要とする動物に投与することを含む、稀突起神経膠細胞の成長または分化の阻害に関連する病気または障害を治療する方法。
  205. 有効量の、請求項１〜４１または１９９いずれか１項記載の単離されたＳｐ３５抗体またはその断片、請求項４２〜１０２いずれか１項記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項１５０〜１９２、または１９４〜１９８いずれか１項記載の単離されたポリペプチド、または請求項１０３〜１３５、１４４または１９３いずれか１項記載の組成物よりなる群から選択される剤を治療を必要とする動物に投与することを含む、ＣＮＳニューロンの脱髄または髄鞘脱落に関連する病気または障害を治療する方法。
  206. 前記病気または障害が多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多病巣性白質脳障害（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、中枢橋ミエリン分解（ＣＰＭ）、ウォーラー変性、副腎脳白質ジストロフィー、アレキサンダー病、およびペリツェウス−メルツバッヒャー病（ＰＭＺ）よりなる群から選択される請求項２０５記載の方法。
  207. 前記病気または障害が多発性硬化症である請求項２０６記載の方法。
  208. 前記動物が哺乳動物である請求項２００〜２０７いずれか１項記載の方法。
  209. 前記哺乳動物がヒトである請求項２０８記載の方法。
  210. ＮｇＲ１を、有効量の、請求項１〜４１または１９９いずれか１項記載の単離されたＳｐ３５抗体またはその断片、請求項４２〜１０２いずれか１項記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項１５０〜１９２または１９４〜１９８いずれか１項記載の単離されたポリヌクレオチド、または請求項１０３〜１３５、１４４または１９３いずれか１項記載の組成物よりなる群から選択される剤と接触させることを含む、ＮｇＲ１によるシグナル変換を阻害する方法。
  211. ニューロンを、有効量の、請求項１〜４１または１９９いずれか１項記載の単離されたＳｐ３５抗体またはその断片、請求項４２〜１０２いずれか１項記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項１５０〜１９２または１９４〜１９８いずれか１項記載の単離されたぺポリペプチド、または請求項１０３〜１３５、１４４または１９３いずれか１項記載の組成物よりなる群から選択される剤と接触させることを含む、中枢神経系（ＣＮＳ）ニューロンの軸索成長の阻害を減少させる方法。
  212. ニューロンを、有効量の、請求項１〜４２または１９９いずれか１項記載の単離されたＳｐ３５抗体またはその断片、請求項４２〜１０２いずれか１項記載の単離されたポリヌクレオチド、請求項１５０〜１９２または１９４〜１９８いずれか１項記載の単離されたポリペプチド、または請求項１０３〜１３５、１４４または１９３いずれか１項記載の組成物よりなる群から選択される剤と接触させることを含む、ＣＮＳニューロンの成長錐体崩壊を阻害する方法。
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