JP2003510089A - 複製能力のあるアデノウイルスのないｅ１欠失アデノウイルスの製造に有用な細胞系及び構築物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 Ｅ１欠失アデノウイルスベクターをトランスに相補するために有用な細胞系が記述される。これらの細胞系は、多数の継代接種にわたって複製能力のあるアデノウイルスのない高収量のＥ１欠失アデノウイルスベクターを提供することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本研究は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ
Ｈｅａｌｔｈ）のＮＩＤＤＫ（ＤＫ４７７５７−０６及びＤＫ４９１３６−０
５）、ＮＨＬＢＩ（ＨＬ４９０４０−０８）及びＮＩＣＨＤ（ＨＤ３２６４９−
０５）により援助された。米国政府は、本発明にある種の権利を有することがで
きる。 発明の分野 本発明は、一般にウイルスベクターを製造するための、そしてより詳細にはア
デノウイルスの製造のための構築物及び方法の分野に関する。 発明の背景 組換えアデノウイルスは、治療的及び予防的（ワクチン）用途の両方を包含す
る様々な目的のための細胞への導入遺伝子の送達のために有用であると記述され
ている。しかしながら、Ｅ１欠失アデノウイルスの成功した商品化は適当な製造
方法を必要とし、それはこれから開発されなければならない。ベクターでのＥ１
トランス相補細胞系(complementing cell line)の感染及び得られる溶解産物の
精製は、十分な量の生成物をもたらす簡単で且つ基準化できる（ｓｃａｌａｂｌ
ｅ）方法である。都合の悪いことに、遺伝子治療のためのＥ１欠失アデノウイル
スベクターの製造は、ベクターとトランスフェクションしたＥ１遺伝子間の相同
的組換えによりもたらされる複製能力のあるアデノウイルス（ＲＣＡ）の出現に
より悩まされている。

【０００２】 ＲＣＡを防ぐためにいくつかの方法が記述されている。しかしながら、現在ま
でのところこれらの方法のいずれも、安定でありそして検出可能なＲＣＡのない
高収量のＥ１欠損アデノウイルスを生産するＥ１相補細胞系をもたらしていない
。

【０００３】 Ｊ．−Ｌ．Ｉｍｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：７５−８
４（１９９６）は、Ｅ１ａ及びＥ１ｂオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ
）並びに隣接するｐＩＸ遺伝子で安定にトランスフェクションされた５４９細胞
を記述している。Ｅ１ａは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターにより導
かれ、そして報告によればＲＣＡは除かれた。しかしながら、この系を記述する
さらに最近の公開は、ＩｍｌｅｒがＥ１ｂタンパク質発現を検出できなかったこ
とを示している。１９９７年１月３日に公開された、Ｉｎｔｒｏｇｅｎｅ，ＷＯ
９７／００３２６を参照。

【０００４】 このＩｎｔｒｏｇｅｎｅ出願は、上記引用のＩｍｌｅｒのものの代わりの系を
記述した。この出願は、Ｅ１ａ及びＥ１ｂを発現するがｐＩＸを発現しないある
種のヒト二倍体細胞から得られる細胞系を記述している（ＥＣＡＣＣ ＮＯ．９
６０２２９４０）。これらの細胞は、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂに対応するがＥ１ａプロモ
ーター、Ｅ１ｂ ８．３ｋｂタンパク質をコードするＥ１ｂ遺伝子の一部及びあ
らゆるｐＩＸ配列を除くＡｄのｎｔ４５９−３５１０を含有するベクターでのヒ
ト胚網膜芽細胞（ＨＥＲ）細胞のトランスフェクションにより製造された。

【０００５】 ＲＣＡを防ぐための別の系は、Ｍａｓｓｉｅ，ＵＳ ５，８９１，６９０に記
述されている。この特許は、Ｅ１ａ遺伝子及びＥ１ｂ遺伝子を含むＡｄ Ｅ１領
域の一部を含んでなるが５’ＩＴＲ、パッケージング配列及びＥ１ａプロモータ
ーを欠く安定に組込まれた相補要素を有するＡｄ Ｅ１相補細胞系を記述してい
る。さらに、Ｅ１ａ遺伝子は、第一のプロモーター要素の制御下であり、そして
Ｅ２ｂ遺伝子は第二のプロモーターの制御下である。Ｍａｓｓｉｅにより記述さ
れそして請求される特定の細胞系は、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂプロモーター、及びＥ１ｂ
遺伝子の一部を含むＡｄ５のｎｔ５３２−３５２５を含有する。この細胞系は、
８．３ｋｂの産物をコードするＥ１ｂ遺伝子のカルボキシ末端を含有せず、また
それはｐＩＸ遺伝子配列も含有しない。

【０００６】 当該技術分野において必要とされるものは、全てのアデノウイルスＥ１ａ及び
Ｅ１ｂ遺伝子産物を発現し、そして検出可能なＲＣＡのない高収量のＥ１欠損ア
デノウイルスを生産する安定なＥ１相補細胞系である。 発明の要約 都合よく、本発明は、安定であり、無血清培地における懸濁培養に適応させる
ことができ、そして多量のベクターをもたらすＥ１発現細胞系を提供する。重要
なことに、これらの細胞系は、複製能力のあるアデノウイルス（ＲＣＡ）のない
環境におけるＥ１欠失組換えアデノウイルスの単離及び継代培養を可能にする。
さらに、本発明の細胞系は、ＲＣＡのない環境における新規な組換え体の単離及
び継代培養を可能にするためにベクターを効果的にプラーク形成する（ｐｌａｑ
ｕｅ）。

【０００７】 従って、一つの態様として、本発明は、検出可能な複製能力のあるアデノウイ
ルスのない組換えＥ１欠損アデノウイルスの製造のために有用なＥ１相補細胞系
を提供する。このＥ１相補細胞系は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プ
ロモーターの制御下のアデノウイルスＥ１ａ及びアデノウイルスＥ１ｂをコード
する核酸配列を含んでなる核酸分子で安定に形質転換された異数体細胞系を含む
。好適には、核酸分子は、アデノウイルスＥ１ａをコードする配列に対して５’
のアデノウイルス配列を欠く。

【０００８】 別の態様として、本発明は、複製能力のあるアデノウイルスのないＥ１欠損ア
デノウイルス粒子のパッケージング方法を提供する。この方法は、本発明のＥ１
相補細胞系からの細胞にベクターを導入することを含み、ここで、ベクターは、
アデノウイルスＥ１領域における欠損、複製及びパッケージングに必要なアデノ
ウイルス５’及び３’シス要素、アデノウイルスｐＩＸ、並びにアデノウイルス
遺伝子及び導入遺伝子の発現に必要な調節配列を含有する。

【０００９】 別の態様として、本発明は、検出可能な複製能力のあるアデノウイルスのない
Ｅ１欠損アデノウイルス粒子を製造する方法を提供する。この方法は、本発明の
Ｅ１相補細胞系からの細胞にＥ１欠損アデノウイルスを感染させること並びに細
胞がＥ１ａ及びＥ１ｂタンパク質を発現できる条件下で培養することを含む。

【００１０】 本発明の他の態様及び利点は、以下の本発明の詳細な記述から容易に明らかで
ある。 発明の詳細な記述 本発明は、検出可能な複製能力のあるアデノウイルス（ＲＣＡ）のないＥ１欠
失アデノウイルスを製造する方法、並びにこの方法に有用な細胞系及びベクター
を提供する。得られるＥ１欠失アデノウイルスは、汚染するＲＣＡが実質的にな
いので、これらのアデノウイルスは、哺乳動物に遺伝子を送達することにおける
使用に特によく適している。

【００１１】 一つの望ましい態様として、本発明は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ
）遺伝子より得られるプロモーターからＥ１遺伝子座を安定に発現するＨｅＬａ
に基づく細胞系を提供する。これらの細胞系は、Ｅ１オープンリーディングフレ
ーム（ＯＲＦ）に対して５’のアデノウイルス配列を有さず、そしてＥ１に対し
て３’の減少した相同性を有する（もしくは相同性を有さない）。これらの細胞
系は、ＲＣＡの出現なしに２９３細胞と等しいかもしくはそれより上のレベルで
Ｅ１欠失ベクターのプラーク形成及び増幅を維持する。

【００１２】 そのような細胞系の一つの例はＧＨ３２９細胞系であり、これは１９９９年９
月２９日にＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍ
ａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９，ＵＳＡに寄託されており、そし
て受託番号ＰＴＡ−８０３を与えられている。この寄託は、ブダペスト条約の規
定に従って、そして３７ ＣＦＲ §§１．８０１の必要条件に従ってなされてい
る、以下参照。ＧＨ３２９細胞は、少なくとも２０継代接種にわたって検出可能
な複製能力のあるアデノウイルス（ＲＣＡ）なしにＥ１欠失ウイルスベクターを
相補する（そしてその複製を与える）ことが判明している。現在、ＧＨ３２９は
、単一コピーの各Ｅ１ａ及びＥ１ｂタンパク質を発現すると考えられる。しかし
ながら、ＧＨ３２９細胞系を用いて得られる収量は、ＲＣＡが５〜１０継代接種
後に認められる２９３細胞において得られるものと少なくとも同等である。

【００１３】 別の適当な細胞系はＧＨ３６４細胞系であり、これは５〜１０コピーの間のＥ
１ａ及びＥ１ｂタンパク質を発現する。本発明のさらに別の細胞系はＧＨ３５４
細胞系である。ＧＨ３５４細胞は、少なくとも２０継代接種にわたって検出可能
なＲＣＡなしにＥ１欠失ウイルスベクターを相補する（そしてその複製を与える
）ことが判明している。さらに、ＧＨ３２９細胞系でのように、ＧＨ３５４細胞
系を用いて得られる収量は、２９３細胞において得られるものと少なくとも同等
である。

【００１４】 本発明の細胞系は、無血清培地における増殖に容易に適応するので、前臨床及
び臨床用途のためのＥ１欠失アデノウイルスの製造に特によく適している。本発
明の細胞系、例えばＧＨ３２９は、当業者に周知である技術を用いて無血清培地
における増殖に適応させることができる。これらの無血清培地適応細胞系は、本
発明により包含される。

【００１５】 場合により、本発明の細胞系から他の有用な細胞系を得ることができる。例え
ば、ＧＨ３２９（もしくはＧＨ３５４もしくはＧＨ３６４）細胞系は、本明細書
において記述する技術並びに当該技術分野において既知である技術を用いて別の
所望のタンパク質（１つもしくは複数）を安定に発現するように改変することが
できる。一つの望ましい態様として、ＧＨ３２９細胞系の誘導体は、それらがＥ
１欠失ウイルスの複製に必要とされるアデノウイルスタンパク質（もしくはその
機能性フラグメント）を発現する１つもしくはそれ以上の配列を含有するように
ＧＨ３２９細胞を安定に形質転換することにより製造することができる。細胞系
により提供されるアデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ機能に加えて、必要とされる
アデノウイルス機能には、Ｅ２ａ及びＥ４ ＯＲＦ６が包含される。従って、一
つの態様として、Ｅ２領域もしくはＥ４領域またはその組み合わせの必要とされ
る機能を発現するＧＨ３２９誘導体細胞系を製造することができる。好適には、
ＧＨ３２９誘導体細胞系を製造するために使用する核酸分子（１つもしくは複数
）は、Ｅ１コーディング領域に対して５’のアデノウイルス配列を含有せず、そ
して宿主細胞において所望の機能性タンパク質を発現するために必要とされる最
低限のアデノウイルス配列のみを含有する。この情報を与えられれば、当業者は
、他のＧＨ３２９誘導体細胞系を容易に工学設計することができる。 Ｉ．Ｅ１相補細胞系 Ａ．標的細胞 ＨｅＬａ細胞を形質転換して本発明のＧＨ３２９細胞系を製造するために使用
するベクターは、他のＥ１トランス相補細胞系を開発するために用いることがで
きる。好ましくは、そのような他の細胞系は、ＨｅＬａ細胞、子宮頸癌由来の異
数体上皮様細胞［ＡＴＣＣ ＣＣＬ２］から得られる。しかしながら、本明細書
において記述するベクターを用いて、別の哺乳動物宿主細胞を、限定なしに、Ｖ
ｅｒｏ細胞、Ａ５４９及びＨＫＢ細胞のような細胞を包含するヒト細胞タイプの
ような任意の哺乳動物種から選択することができる。他の哺乳動物種、例えば、
霊長類細胞、げっ歯類細胞もしくは生物学的研究所において一般に使用される他
の細胞もまた有用である。細胞を提供する哺乳動物種の選択は本発明の制約では
なく；また哺乳動物細胞のタイプ、すなわち、繊維芽細胞、肝細胞、腫瘍細胞等
も制約ではない。

【００１６】 Ｂ．形質転換するＤＮＡ分子 好適には、標的細胞は、ＰＧＫプロモーターの制御下のアデノウイルスＥ１ａ
及びＥ１ｂをコードするＤＮＡ配列を最低限保有するＤＮＡ分子で形質転換され
る。この分子は、Ｅ１領域の５’のアデノウイルス配列を欠き、好ましくは天然
のＥ１ａプロモーターを除き、そしてＥ１領域に対して３’の最低限の配列を含
有する（すなわち、場合により部分的ｐＩＸ配列を含有してもよい）。

【００１７】 本発明において有用なアデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子をコードするＤ
ＮＡ配列は、現在同定されている４１種のヒト型を包含する任意の既知のアデノ
ウイルス型の中から選択することができる。同様に、他の動物に感染することが
既知であるアデノウイルスは、これらの遺伝子配列を与えることができる。各Ｅ
１ａ及びＥ１ｂ遺伝子配列のためのアデノウイルス型の選択は、本発明を限定し
ない。血清型Ａｄ５のものを包含する多数のアデノウイルス血清型の配列は、Ｇ
ｅｎｂａｎｋから入手可能である。様々なアデノウイルス株はＡＴＣＣから入手
可能であり、または様々な商業的及び研究機関の供給者から注文により入手可能
である。以下の代表的態様において、Ｅ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子配列は、アデノウ
イルス血清型５（Ａｄ５）からのものである。

【００１８】 「Ｅ１ａ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡ」により、Ｅ１ａもしく
は任意の機能性Ｅ１ａ部分をコードする任意のアデノウイルス遺伝子を意味する
。同様に包含されるのは、Ｅ１ａ遺伝子もしくは機能性部分の任意の対立遺伝子
もしくは他の改変である。そのような改変は、どうにかしてＥ１ａ発現もしくは
機能を、並びに天然に存在するその対立遺伝子変異体を高めるために通常の遺伝
子工学もしくは突然変異促進技術を用いることにより故意に導入することができ
る。

【００１９】 「Ｅ１ｂ遺伝子産物を発現するアデノウイルスＤＮＡ」により、Ｅ１ｂもしく
は任意の機能性Ｅ１ｂ部分をコードする任意のアデノウイルス遺伝子を意味する
。同様に包含されるのは、Ｅ１ｂ遺伝子もしくは機能性部分の任意の対立遺伝子
もしくは他の改変である。そのような改変は、どうにかしてＥ１ｂ発現もしくは
機能を、並びに天然に存在するその対立遺伝子変異体を高めるために通常の遺伝
子工学もしくは突然変異促進技術を用いることにより故意に導入することができ
る。

【００２０】 Ａｄ Ｅ１ａ及びＡｄ Ｅ１ｂを保有する核酸分子は、これらの成分を宿主細胞
に導入する任意の形態であることができる。最も好適には、これらの配列はベク
ター内に含まれる。「ベクター」には、限定なしに、プラスミド、ファージ、ト
ランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン等のような任意の遺伝子
要素が包含される。一つの特に適当な態様として、核酸分子は、Ａｄ Ｅ１ａ、
Ａｄ Ｅ１ｂ、部分的ｐＩＸ配列及びＰＧＫプロモーターを保有するプラスミド
である。

【００２１】 核酸分子は、ある種の選択可能なレポーターもしくはマーカー遺伝子をコード
するもののような他の非ウイルス配列、例えば、とりわけ、ハイグロマイシンも
しくはプリマイシン（purimycin）、またはＧ４１８選択のためのネオマイシン
耐性遺伝子をコードする配列を含有することができる。分子はさらに他の成分を
含有することができる。

【００２２】 本発明の核酸分子の構築には通常の技術を利用することができる。一般に、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋを参照。

【００２３】 いったん所望の核酸分子が設計されると、それを任意の適当な方法により標的
細胞に導入することができる。そのような方法には、例えば、トランスフェクシ
ョン、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイ
ルス感染及びプロトプラスト融合が包含される。

【００２４】 その後、細胞を標準的な方法に従って培養し、そして場合により、耐性遺伝子
を発現する細胞を含有する細胞について選択するために抗生物質を含有する培地
に接種する。選択の期間の後、耐性コロニーを単離し、増やし、そしてＥ１発現
についてスクリーニングする。上記引用のＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌを参照
。 ＩＩ．Ｅ１欠失アデノウイルスの製造におけるＥ１相補細胞の使用 本発明のＥ１相補細胞は、様々な目的のために有用である。最も好適には、こ
れらの細胞（例えばＧＨ３２９）は、Ｅ１欠損ベクターから組換えウイルス（す
なわち、ウイルス粒子）をパッケージングすること及び検出可能なＲＣＡのない
Ｅ１欠損アデノウイルスの高収量の製造に用いられる。

【００２５】 Ａｄ５ Ｅ１ａ及びＥ１ｂを発現する本発明の細胞は、Ａｄ５及びＡｄ２の配
列を含有するＥ１欠損ベクター（例えばプラスミド）から組換えウイルスをパッ
ケージングすることにおける使用に適している。さらに、これらの細胞は、当業
者に既知である、他のＡｄ血清型から組換えウイルスを製造することに有用であ
ると予想される。

【００２６】 Ａ．Ｅ１欠損ベクターのパッケージング 好ましい態様として、本発明のこの方法は、宿主細胞への導入遺伝子の送達の
ために有用なＥ１欠失アデノウイルス粒子への導入遺伝子を含有するＥ１欠失ベ
クターのパッケージングを含む。好ましい態様として、Ｅ１欠失ベクターは、例
えば本発明の細胞系により供給されるような、相補Ｅ１タンパク質の存在下での
み複製する感染性アデノウイルス粒子を生産しそしてパッケージングするために
必要な全てのアデノウイルス遺伝子を含有する。ベクターは、Ｅ１ａ及びＥ１ｂ
配列の両方における欠損を含有し、そして最も望ましくは、これらのタンパク質
をコードする配列の全てもしくは大部分を欠失している。

【００２７】 パッケージングされるＥ１欠失ベクターは、最低限、複製及びパッケージング
に必要なアデノウイルス５’及び３’シス要素、導入遺伝子、並びにｐＩＸ遺伝
子もしくはその機能性フラグメントを含有する。ベクターはさらに、宿主細胞に
おけるコードする導入遺伝子産物の発現を可能にする調節配列を含有し、これら
の調節配列は導入遺伝子に操作可能に連結される。本明細書において用いる場合
、「操作可能に連結される」配列には、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列及
び目的の遺伝子を制御するためにトランスにもしくは離れて作用する発現制御配
列の両方が包含される。また、ベクターに含まれるのは、ベクターにより保有さ
れる他の遺伝子産物、例えばｐＩＸ遺伝子に操作可能に連結される調節配列であ
る。

【００２８】 １．アデノウイルス要素 パッケージングされるＥ１欠損ベクターは、最低限、アデノウイルスのシスに
作用するアデノウイルス５’及び３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（これらは
複製起点として働く）並びに天然の５’パッケージング／エンハンサードメイン
を含む。これらは、線状Ａｄゲノムをパッケージングするために必要な５’及び
３’シス要素であり、そしてさらにＥ１プロモーターのエンハンサー要素を含有
する。

【００２９】 ウイルス粒子にパッケージングされるＥ１欠失ベクターは、それがｐＩＸ遺伝
子産物を発現するようにさらに設計される。最も好適には、ｐＩＸ遺伝子は損な
われておらず、天然のプロモーターを含有し、そして全長タンパク質をコードす
る。しかしながら、所望に応じて、天然のｐＩＸプロモーターを別の所望のプロ
モーターで置換することができる。あるいはまた、ｐＩＸの機能性フラグメント
をコードする配列をベクターにおける使用のために選択することができる。さら
に別の代案として、ｐＩＸもしくはその機能性フラグメントをコードする天然の
配列は、発現を高めるために改変することができる。例えば、天然の配列は、選
択した宿主細胞における発現を高めるように優先コドンを挿入するために、例え
ば部位特異的突然変異誘発もしくは他の適当な技術により改変することができる
。場合により、ｐＩＸは、別個の分子上でＥ１相補細胞系に与えることができる
。

【００３０】 最低限のアデノウイルス配列のみを含有する代表的ベクターは、ＡｄΔＥ１−
Ｅ４ベクターと呼ばれ、そして存在する中間遺伝子（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ
ｇｅｎｅ）ＩＸを除いてＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、中間遺伝子ＩＸａ並びに後
期遺伝子Ｌ１、Ｌ２、Ｌ２（Ｌ３）、Ｌ４及びＬ５を包含する全ての機能性アデ
ノウイルス遺伝子を欠く。しかしながら、好ましい態様として、Ｅ１欠失ベクタ
ーは、上記の最低限のアデノウイルス配列に加えて、機能性アデノウイルスＥ２
及びＥ４領域を含有する。別の適当な態様として、Ｅ１欠失ベクターにおけるア
デノウイルス配列は、５’及び３’シス要素、機能性Ｅ２及びＥ４領域、中間遺
伝子ＩＸ及びＩＸａ、並びに後期遺伝子Ｌ１〜Ｌ５を含む。しかしながら、Ｅ１
欠失ベクターは、必要とされる最低限の配列を考慮に入れて、当業者により容易
に設計されることができ、そしてこれらの代表的態様に限定されるものではない
。

【００３１】 ベクターは、導入遺伝子及びｐＩＸをコードする配列が５’ＩＴＲの下流で且
つ３’ＩＴＲの上流に位置するように構築される。導入遺伝子は、目的のポリペ
プチド、タンパク質もしくは他の生成物をコードする、アデノウイルス配列に対
して異種起源の核酸配列である。導入遺伝子は、導入遺伝子の転写を可能にする
ように調節成分に操作可能に連結される。

【００３２】 ２．導入遺伝子 導入遺伝子配列の組成は、得られるウイルスを用いる用途により決まる。例え
ば、導入遺伝子配列の一つのタイプはレポーター配列を含み、これは発現すると
検出可能なシグナルを生成する。そのようなレポーター配列には、限定なしに、
β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファター
ゼ、チミジンキナーゼ、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、導かれる高親和
性抗体が存在するかもしくは常法により製造することができる当該技術分野にお
いて周知である例えばＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、インフルエンザ赤血球凝集素タ
ンパク質等を包含する膜結合タンパク質、及びとりわけ赤血球凝集素もしくはＭ
ｙｃからの抗原標識ドメインに適切に融合した膜結合タンパク質を含んでなる融
合タンパク質をコードするＤＮＡ配列が包含される。

【００３３】 しかしながら、望ましくは、導入遺伝子は、タンパク質、ペプチド、アンチセ
ンス核酸（例えばＲＮＡ）、酵素もしくは触媒性ＲＮＡのような、生物学及び医
学において有用な生成物をコードする非マーカー配列である。導入遺伝子は、正
常な遺伝子が正常より低いレベルで発現される欠損もしくは機能性遺伝子産物が
発現されない欠損を包含することができる遺伝子欠損を直すかもしくは改善する
ために用いることができる。導入遺伝子配列の一つの望ましいタイプは、宿主細
胞において発現される治療的タンパク質もしくはポリペプチドをコードする。本
発明はさらに、例えば、複数サブユニットタンパク質により引き起こされる遺伝
子欠損を直すかもしくは改善するために、複数の導入遺伝子を使用することを含
む。ある場合には、タンパク質の各サブユニットをコードするため、または異な
るペプチドもしくはタンパク質をコードするために異なる導入遺伝子を用いるこ
とができる。これは、タンパク質サブユニットをコードするＤＮＡのサイズが大
きい場合、例えば、免疫グロブリン、血小板由来増殖因子もしくはジストロフィ
ンタンパク質に望ましい。細胞が複数サブユニットタンパク質を生産するために
、異なるサブユニットの各々を含有する組換えウイルスを細胞に感染させる。あ
るいはまた、タンパク質の異なるサブユニットを同じ導入遺伝子によりコードす
ることができる。この場合、単一の導入遺伝子は、サブユニットの各々をコード
するＤＮＡを含み、各サブユニットのＤＮＡは、内部リボソーム侵入部位（ｉｎ
ｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）により
隔てられる。これは、サブユニットの各々をコードするＤＮＡのサイズが小さい
、例えば、サブユニットをコードするＤＮＡ及びＩＲＥＳの合計が５キロ塩基未
満である場合に望ましい。他の有用な遺伝子産物には、免疫応答を誘発する分子
、挿入、欠失もしくはアミノ酸置換を含有する天然に存在しないアミノ酸配列を
有するキメラもしくはハイブリッドポリペプチドのような天然に存在しないポリ
ペプチドが包含される。例えば、一本鎖の工学設計した免疫グロブリンは、ある
種の免疫無防備状態患者において有用であり得るはずである。天然に存在しない
遺伝子配列の他のタイプには、アンチセンス分子、及びリボザイムのような触媒
性核酸が包含され、これらは、遺伝子の過剰発現を減らすために用いることがで
きるはずである。しかしながら、選択する導入遺伝子は、宿主への送達のために
望ましいかもしくは研究のために望ましい任意の生成物をコードすることができ
る。導入遺伝子配列の選択は、本発明の制約ではない。

【００３４】 ３．調節配列 ベクターの上記に同定した主要な要素（例えばアデノウイルス配列及び導入遺
伝子）に加えて、ベクターはまた、導入遺伝子を含有する宿主細胞において導入
遺伝子の発現を導くために必要な通常の制御要素も含む。従って、ベクターは、
導入遺伝子に連結されそして導入遺伝子と共にベクターのウイルス配列間に位置
する選択したプロモーターを含有する。適当なプロモーターは、構成的及び誘導
性プロモーターの中から容易に選択することができる。これら及び他の一般的な
ベクター要素の選択は慣例であり、そして多数のそのような配列が利用できる［
例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ及びそれに引用される参考文献を参照］。

【００３５】 構成的プロモーターの例には、限定なしに、レトロウイルスのラウス肉腫ウイ
ルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（場合によりＲＳＶエンハンサーを有する）
、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（場合によりＣＭＶエンハンサ
−を有する）［例えばＢｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−
５３０（１９８５）を参照］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクター
ゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（Ｐ
ＧＫ）プロモーター及びＥＦ１αプロモーター［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］が包含
される。亜鉛誘導性ヒツジメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、デキサメタ
ゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポ
リメラーゼプロモーター系［ＷＯ ９８／１００８８］；エクジソン昆虫プロモ
ーター［Ｎｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
９３：３３４６−３３５１（１９９６）］、テトラサイクリン抑制系［Ｇｏｓｓ
ｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５
５４７−５５５１（１９９２）］、テトラサイクリン誘導系［Ｇｏｓｓｅｎ ｅ
ｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９（１９９５），また、
Ｈａｒｖｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，２：
５１２−５１８（１９９８）も参照］、ＲＵ４８６誘導系［Ｗａｎｇ ｅｔ ａ
ｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５：２３９−２４３（１９９７）及びＷａｎ
ｇ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：４３２−４４１（１９９７）］及
びラパマイシン誘導系［Ｍａｇａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．，１００：２８６５−２８７２（１９９７）］を包含する誘導性プロモータ
ーは、外因的に与えられる化合物により調節される。

【００３６】 ４．他のベクター要素 導入遺伝子及び調節配列（例えばプロモーター、ポリＡ配列等）に隣接するＡ
ｄ ＩＴＲを保有するベクターは、これらの成分を宿主細胞に導入する任意の形
態であることができる。好ましくは、ベクターはプラスミドの形態である。好ま
しくは、相同的組換えを防ぐために、プラスミドは、Ｅ１領域もしくはＥ１領域
に対して５’の領域におけるいかなるアデノウイルス配列も含有しない。それは
、ある種の選択可能なレポーターもしくはマーカー遺伝子をコードするもののよ
うな非ウイルス配列、例えば、とりわけ、ハイグロマイシンもしくはプリマイシ
ン（ピューロマイシン）をコードする配列を含有することができる。プラスミド
の他の成分には、複製起点及びエプスタイン・バーウイルス核抗原を用いるアン
プリコン系のようなアンプリコン、例えば、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
）におけるベクター成分を包含することができる。Ｊ．Ｈａｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８４：１４１−１４８（１９９１）も参照。この
アンプリコン系もしくは同様のアンプリコン成分は、細胞における高コピーエピ
ソーム複製を可能にする。

【００３７】 場合によりこのベクターに存在してもよい他の異種起源の核酸配列には、ＲＮ
Ａ転写産物の効率のよいポリアデニル化のために必要とされるシグナルを与える
配列、並びに機能性スプライス供与及び受容部位を有するイントロンが包含され
る。本発明において有用なベクターに用いる一般的なポリＡ配列は、パポーバウ
イルスＳＶ−４０から得られるものである。ポリＡ配列は、一般に、導入遺伝子
配列の後で且つ３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列の前に挿入される。本発明において有用
なベクターはまた、望ましくはプロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子の
間に位置する、イントロンを含有することもできる。一つの可能なイントロン配
列もまたＳＶ−４０から得られ、そしてＳＶ−４０ Ｔイントロン配列と呼ばれ
る。これら及び他の一般的なベクター要素の選択は慣例であり、そして多数のそ
のような配列が利用できる［例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ、並びに例え
ば３．１８−３．２６及び１６．１７−１６．２７頁でそれに引用される参考文
献を参照］。

【００３８】 ５．アデノウイルス配列の共トランスフェクション 好ましくは、Ｅ１欠失ベクターは、本発明のＥ１相補細胞系の存在下でのパッ
ケージング及び複製のために必要とされる全ての機能性アデノウイルス配列を含
有する。トランス相補細胞系により供給されるＥ１ａ及びＥ１ｂ機能に加えて、
機能性アデノウイルスＥ２ａ及びＥ４ ＯＲＦ６領域が必要とされる。しかしな
がら、必要とされる機能がＥ１欠失ベクターから欠けている（すなわち、Ｅ１欠
失ベクターがＥ２ａ及び／もしくはＥ４ ＯＲＦ６における機能性欠失をさらに
含有する）場合、これらの機能は他の供給源により供給することができる。一つ
の態様として、これらの機能は、必要とされるアデノウイルス機能の発現を導く
ことができる１つもしくはそれ以上の核酸分子でのＥ１相補細胞系の共トランス
フェクションにより供給することができる。あるいはまた、必要とされるアデノ
ウイルス機能を供給するために形質転換されている本発明の改変されたＧＨ３２
９細胞系を利用することができる。

【００３９】 例えば、Ｅ１を欠失しそして欠損のあるＥ２領域を有するベクターは、必要と
されるＥ２機能（例えばＥ２ａ）を発現する核酸分子（例えばプラスミド）で本
発明のＧＨ３２９細胞をトランスフェクションすることによりこれらの細胞にお
いて相補することができる。別の例として、Ｅ１〜Ｅ４機能を欠いているベクタ
ーは、機能性Ｅ２、Ｅ３及びＥ４（例えばＥ４ ＯＲＦ６）を発現する核酸分子
でＧＨ３２９細胞をトランスフェクションすることによりこれらの細胞において
相補することができる。本発明の細胞に核酸分子を共トランスフェクションする
場合、そのような核酸分子はアデノウイルスＥ１配列を含有せず；またそれはＥ
１領域に対して５’のいかなる配列も含有しない。これらの核酸分子の構築は、
当業者の技術の範囲内である。

【００４０】 好適には、上記のような選択した組換えベクターを当該技術分野において既知
であるトランスフェクション技術のような通常の技術を用いて本発明の細胞系か
らのＥ１相補細胞系に導入する［Ｋ．Ｋｏｚａｒｓｋｙ ｅｔ ａｌ，Ｓｏｍ．
Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．，１９（５）：４４９−４５８（
１９９３）を参照］。その後、組換えＥ１欠失アデノウイルスをトランスフェク
ション後に単離し、精製する。精製方法は当業者に周知であり、そして容易に選
択することができる。例えば、ウイルスをプラーク精製に供することができ、そ
して精製されたウイルスを得るために溶解産物を塩化セシウム遠心分離に供する
ことができる。

【００４１】 Ｂ．Ｅ１欠失アデノウイルスの増幅 本発明のＥ１トランス相補細胞系（もしくはその誘導体）は、Ｅ１欠損アデノ
ウイルスを増幅するために用いることができる。好適には、Ｅ１欠損アデノウイ
ルスは、この方法に使用する前に細胞破壊屑及び他のウイルス物質から単離され
、精製されている。これは、増幅するＥ１欠損アデノウイルスが本発明のもの以
外の方法により製造される場合に特に望ましい。適当な精製方法、例えばプラー
ク精製は、当業者に周知である。

【００４２】 本発明のＥ１トランス相補細胞系、例えばＧＨ３２９からの細胞の培養物もし
くは好ましくは懸濁物に常法を用いてＥ１欠損アデノウイルスを感染させる。適
当な感染多重度（ＭＯＩ）は、容易に選択することができる。しかしながら、約
０．１〜約１００、約０．５〜約２０及び／もしくは約１〜約５の範囲のＭＯＩ
が望ましい。次に、本発明の細胞系により発現されるＥ１の存在下で細胞増殖及
びＥ１欠損アデノウイルスの複製を可能にする条件下で細胞を培養する。好適に
は、ウイルスを５、１０もしくは２０継代接種までにわたる連続継代接種に供す
る。しかしながら、所望に応じて、ウイルスをより少ないもしくはより多い継代
接種に供することができる。

【００４３】 細胞を２〜３回の凍結融解に供し、得られる溶解産物を次に回収のための遠心
分離に供し、そして上清を集める。溶解産物における細胞タンパク質からｒＡｄ
−ΔＥ１を濃縮するために塩化物勾配遠心分離もしくはカラムクロマトグラフィ
ーのような通常の精製技術を用いる。しかしながら、都合よく、本発明の細胞系
の使用による本発明の方法は、通常の製造技術を悩ませる汚染するＲＣＡの問題
を回避する。 ＩＩＩ．本発明の方法により製造されるＥ１欠失Ａｄ 本発明はＥ１欠失アデノウイルスを無血清培地中でそして検出可能なＲＣＡな
しに製造することを可能にするので、本発明に従って製造されるこれらのアデノ
ウイルスは様々な用途に適しており、そして特にインビボでの用途に適している
。従って、本発明に従って製造されるＥ１欠失アデノウイルスは、ＲＣＡでの汚
染が実質的にない。

【００４４】 一つの態様として、Ｅ１欠失ウイルスは、一過性導入遺伝子発現が治療に役立
つ用途（例えば、癌におけるｐ５３遺伝子導入及び心臓疾患におけるＶＥＧＦ遺
伝子導入）に適していると考えられている。しかしながら、Ｅ１欠失アデノウイ
ルスは、一過性導入遺伝子発現が所望される用途に限定されるものではない。Ｅ
１欠失アデノウイルスは、選択した導入遺伝子の送達及び発現が所望される様々
な場合に有用である。

【００４５】 Ｅ１欠失アデノウイルスの適当な用量は、処置する症状、動物もしくはヒト患
者の健康状態、年齢及び体重、並びに他の関連因子により、当業者により容易に
決定されることができる。しかしながら、一般に、適当な用量は、約８０ｋｇの
体重を有する成人ヒトに対して、用量当たり１０¹⁰〜１０¹⁸、そして好ましくは
約１０¹⁴〜１０¹⁶ウイルス粒子の範囲であることができる。この用量を約０．０
１ｍＬ〜約１ｍＬの生理学的に適合する担体に懸濁し、そして任意の適当な手段
により送達することができる。用量は、必要もしくは所望に応じて、毎日、毎週
、毎月もしくは他の選択した間隔で繰り返すことができる。

【００４６】 以下の実施例は、本発明の代表的細胞系の製造及び２０継代接種にわたって検
出可能なＲＣＡのないＥ１欠失アデノウイルスを製造することにおけるそれらの
使用を例示するために提供する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定しない
。以下の実施例では特定の試薬及び条件が略述されるが、本発明の精神及び範囲
により包含されるものである改変を行い得ることを当業者は理解する。実施例１−Ｅ１相補細胞系の製造 本実施例において記述するように、Ｖｅｒｏ、Ａ５４９及びＨｅＬａ細胞を、
５１１〜３９２４ｂｐ（Ｅ１ａ及びＥ１ｂオープンリーディングフレーム及びｐ
ＩＸ遺伝子の一部）に及ぶＡｄ５ゲノムの３．４ｋｂ ＤＮＡフラグメントを保
有するプラスミド構築物で安定にトランスフェクションした。図１は、関連構築
物の概要図を示す。これらの構築物では、Ｅ１ａの天然のプロモーターをサイト
メガロウイルス初期遺伝子（ＣＭＶ）もしくはヒトホスホグリセリン酸キナーゼ
遺伝子（ＰＧＫ）からのいずれかの配列で置換した。以下に記述するＥ１欠失ベ
クターの５’領域（０−３６０ｂｐ）との重複はなく、そして３’領域での減少
した重複がある（ベクターは３３１２ｂｐで始まり、一方、２９３におけるアデ
ノウイルス配列は４３００ｂｐにまで及ぶ）。

【００４７】 Ａ．ＰＧＫＥ１プラスミドの構築 Ａｄ５ Ｅ１領域（ｍ．ｕ．１．４２−１０．９）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＳＫ（−）ベクターにクローン化した。３．４ｋｂのＥ１フラグメントをさらに
、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子［ＰＧＫ］［Ａｄｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｇ
ｅｎｅ，６０：６５−７４（１９８７）］もしくはサイトメガロウイスル［ＣＭ
Ｖ］の前初期遺伝子［Ｔｈｏｍｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６５９−６６３（１９８４）］から得られるプ
ロモーターから発現を与えるプラスミドにサブクローン化した。両方ともＧ４１
８選択のためのネオマイシン耐性遺伝子を含有した。

【００４８】 Ｂ．トランスフェクション及びＧ４１８耐性クローンの選択 ＨｅＬａ、Ａ５４９及びＶｅｒｏ細胞はＡＴＣＣから入手し、そして１０％ウ
シ胎仔血清を補足したダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥＭ）におい
て単層として維持した。各プレートに対して１０μｇのプラスミドＤＮＡを用い
て、１００ｍｍプレートに接種した細胞上にリン酸カルシウム沈殿によりプラス
ミドをトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後に細胞を
トリプシン消化し、そしてＧ４１８含有培地に１：５〜１：４０の範囲の様々な
希釈で接種した。２週の選択後にＧ４１８耐性コロニーを単離し、増やし、そし
てＥ１発現についてスクリーニングした。

【００４９】 Ａ５４９トランスフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ）からは１個の
みの安定なクローンが生じ、一方、ＨｅＬａからは７０個を超えるクローンが、
そしてＶｅｒｏ細胞トランスフェクタントからは５０個のクローンが単離された
（データは示さない）。

【００５０】 Ｃ．新規なＥ１系統のスクリーニング方法 安定なＧ４１８耐性クローンを最初に青色コメット（ｃｏｍｅｔ）形成アッセ
イでスクリーニングし、ここでは、６ウェルプレート中の１ｘ１０⁶細胞に２０
０ ＬａｃＺ形成単位（ＬＦＵ）のＨ５．ＣＢＬａｃＺ［β−アクチンプロモー
ターからのＥ１欠失アデノウイルス発現ＬａｃＺ］［Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ
．Ｖｉｒｏｌ．，７０：８９３４−８９４３（１９９６）］を感染させた。感染
の６日後に細胞を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）で組織化学的に染色し、そして各ウェルにおける青色
細胞のコメットを評点した。続いて、強く陽性のクローンを４ウェルチャンバー
（ｃｈａｍｂｅｒ）スライドガラスに２４時間接種した。細胞におけるＥ１ａ及
びＥ１ｂタンパク質の発現レベルは、マウスモノクローナル抗体（Ｏｎｃｏｇｅ
ｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて免疫蛍光染色により評価した。

【００５１】 Ｇ４１８耐性クローンを増やし、そして最初に、ＬａｃＺ導入遺伝子を保有す
るＥ１欠失アデノウイルスベクターの増殖を維持するそれらの能力についてスク
リーニングし；Ｅ１欠失アデノウイルス複製を維持することができる唯一のクロ
ーンはＨｅＬａ由来であった。実施例２−新規なＥ１相補細胞系の特性化 Ａ．遺伝子組成 各Ｅ１相補クローンから全ゲノムＤＮＡを単離し、適切な制限エンドヌクレア
ーゼで消化して内部のＥ１含有プラスミドフラグメントを遊離し、そして電気泳
動後にＤＮＡハイブリダイゼーションにより評価した。より詳細には、ＤＮＡを
１％アガロースゲル上で分別し、ナイロンフィルターに移し、そして１．１ｋｂ
Ｅ１ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩフラグメントをハイブリダイズさせた。

【００５２】 試験した全ての細胞系は、ＨｅＬａゲノムに組み込まれた少なくとも１コピー
のＥ１遺伝子を有する。１個のＰＧＫ−Ｅ１クローン（ＧＨ３６４）及び１つの
ＣＭＶ−Ｅ１細胞系（ＧＨ４１４）は、５−１０コピーのＥ１遺伝子を保有する
。

【００５３】 Ｂ．Ｅ１タンパク質の生産 各クローンの細胞ペレットを６０ｍｍプレートから採取し、そして２００μｌ
の溶解バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０，１４０ｍＭ ＮａＣ
ｌ，１％ ＮＰ−４０ ｖ／ｖ，１ｍＭ ＰＭＳＦ，各１μｇ／ｍｌのロイペプチ
ン、アンチパイン、キモスタチン、ダイズトリプシンインヒビター）に再懸濁し
た。溶解産物を氷上で１時間インキュベーションし、そしてミクロ遠心分離機（
ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）において４℃で１４，０００ｒｐｍで３０分
間回転させた。上清を集め、そして総タンパク質濃度をローリー法により決定し
た。サンプル（５０μｇ）を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分別し、そして
ニトロセルロース膜に電気移動させた。Ｅ１ａ及びＥ１ｂタンパク質は、それぞ
れ、マウスポリクローナル抗体（ＰｈａｒｍＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
，ＣＡ）及びラットモノクローナル抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）
で強化化学発光（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）（
ＥＣＬ）系（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏ
ｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）を用いて検出した。２９３細胞からの総細胞タンパ
ク質をコントロールとして用いた。

【００５４】 ウェスタンブロット分析は、総発現及びＥ１ａとＥ１ｂタンパク質の比率に関
して、異なるクローン間で多様なＥ１タンパク質発現プロフィールを示した。抗
−Ａｄ５抗体は、Ｅ１ａタンパク質を約３５−４６ｋＤａでダブレットとして同
定した。

【００５５】 Ｃ．新規なＥ１相補細胞系でのＥ１欠失組換えウイルスＨ５．ＣＢＬａｃＺの 増殖速度論 ＨｅＬａ、２９３及び新規なＥ１細胞系の細胞にＨ５．ＣＢＬａｃＺを０．５
に等しい感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。感染した細胞を感染後２４、４８
、７２、９６及び１２０時間で採取した。細胞を３回の凍結／融解により感染培
地において溶解し、そしてウイルスの力価を２９３細胞での連続希釈感染及びそ
れに続くＸ−ｇａｌでの組織化学染色により決定した。細胞を２０時間後にＸ−
ｇａｌで組織化学的に染色し、そして青色細胞を計数した。力価は、ＬａｃＺ形
成単位（ＬＦＵ／ｍｌ）として表され、ここで、１ＬＦＵは、感染後２４時間で
１個の細胞において視覚的に検出可能なＬａｃＺ発現をもたらすために十分なウ
イルスの量として定義される。

【００５６】 各細胞系におけるＨ５．ＣＢＬａｃＺウイルスの収量を図２Ａに示し、ここで
、ｙ軸はｌｏｇ目盛りであり、そして時間点をｘ軸上に示す。２つの細胞系、Ｇ
Ｈ３２９及びＧＨ３５４は、Ｅ１欠失ウイルスの生産に関して２９３細胞よりよ
いとまではいかないが同等であった（図２Ａ）。

【００５７】 Ｄ．新規なＥ１細胞系でのＨ５．ＣＢＬａｃＺウイルスの相対プラーク形成効 率（Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｐｌａｑｕｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）（ＲＰ Ｅ） 新規なＥ１細胞系を、Ｈ５．ＣＢＬａｃＺウイルスのプラーク形成を維持する
それらの能力に関して２９３細胞と比較した。細胞にＨ５．ＣＢＬａｃＺを一続
きの連続希釈で感染させ、そして２０時間後に表面寒天で覆った。感染後１０日
目にニュートラルレッドで染色することによりプラークを検出した。ＲＰＥは、
２９３細胞でのものと比較した場合のＨ５．ＣＢＬａｃＺウイルスの力価のパー
センテージとして計算した。細胞にＨ５．ＣＢＬａｃＺを一続きの連続希釈にわ
たって感染させ、そして２０時間後に表面寒天で覆った。

【００５８】 感染後１０日目にニュートラルレッドで染色することによりプラークを検出し
た。ＲＰＥは、Ｈ５．ＣＢＬａｃＺウイルスの力価のパーセンテージとして計算
した。実棒（Ｓｏｌｉｄ ｂａｒｓ）、３回の異なる実験からの各細胞系の平均
ＲＰＥ；誤差棒、標準偏差。２つの細胞系、ＧＨ３２９及びＧＨ３５４は、Ｅ１
欠失ウイルスのプラーク形成効率に関して２９３細胞よりよいとまではいかない
が同等であった（図２Ｂ）。実施例３−２９３もしくはＧＨ３２９細胞のいずれかにおける複数継代接種後の Ｅ１欠失組換えウイルス調製物におけるＲＣＡの検出 ＲＣＡを生じる傾向は、（最初にＧＨ３２９で単離された）Ｅ１欠失ＬａｃＺ
ウイルスを連続して継代接種すること並びにＧＨ３２９及び２９３細胞の両方に
より研究した。各溶解産物の一部を用いて非Ｅ１発現細胞系（Ａ５４９）に感染
させてＲＣＡについて評価し、これは、下記のように、連続継代接種で細胞病理
学として現れ、そしてＤＮＡハイブリダイゼーション分析により確かめた。しか
しながら、粗Ｈｉｒｔ ＤＮＡをサザンブロット分析に使用したので、各サンプ
ルにおけるＲＣＡの量を定量するためにこのアッセイを用いることは難しいと思
われる。

【００５９】 Ｈ５．ＣＢＬａｃＺウイルスは、標準的なプロトコル（Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．
，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：８９３４−８９４３，１９９６）に従ってＧＨ３２
９細胞で２回プラーク精製した。Ｘ−ｇａｌ組織化学染色により同定した青色プ
ラークを選択し、ＧＨ３２９細胞における大規模調製に拡大し、そしてＣｓＣｌ
勾配遠心分離により精製した。精製したＨ５．ＣＢＬａｃＺウイルスを継代接種
０（Ｐ０）と称し、そして２０継代接種までにわたって同時に２９３及びＧＨ３
２９細胞での連続継代接種に使用した。各細胞系において増やした大規模調製ウ
イルスを継代接種５、１０、１５及び２０からＣｓＣｌ勾配で精製した。Ａ５４
９細胞はＡＴＣＣから入手し、そして１０％ ＦＢＳを補足したＦ−１２Ｋ培地
において培養した。ＲＣＡアッセイでは、細胞をウイルス感染の２４時間前に１
５０ｍｍプレート当たり１ｘ１０⁷細胞の密度で接種した。全部で１ｘ１０⁸ＰＦ
Ｕずつの試験ウイルスを２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％ペニシリン／スト
レプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を含む８０ｍｌのＦ−１２Ｋ培地において希釈し、そ
して各プレートから増殖培地を除いた後にＡ５４９細胞の４枚の１５０ｍｍプレ
ートに加えた。感染の２４時間後に、各プレートに１．６ｍｌのＦＢＳを加えた
。陽性コントロールとして、１ＰＦＵのＡｄ５野生型ウイルスを上記の感染方法
の１ｘ１０⁸ＰＦＵの試験品の各々に加えた。陰性コントロールプレートもまた
同時に分析した。各プレートからの感染細胞を１４日後に採取し、そして３回の
凍結融解により感染培地において溶解した。各プレートからの総細胞溶解産物の
２０％を用いて上記のプロトコルに従ってＡ５４９細胞の１枚のプレートに感染
させた。感染の７日後に、プレートを細胞変性効果に関して光学顕微鏡下で調べ
た。本研究に用いたＲＣＡアッセイは、１０⁸ＰＦＵの組換えウイルス中１ＰＦ
ＵのＲＣＡを検出することができる。各プレートからの感染細胞を培地と共に採
取し、そして細胞ペレットを回収するために回転させて落とした。各細胞ペレッ
トを０．５ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０に再懸濁し、そして３
サイクルの凍結融解により溶解した。Ｓｏｒｖａｌｌ−２６における３，２００
ｒｐｍで１５分間の遠心分離後に、各サンプルの上清を集めた。各上清の１／３
を等容量の２ｘプロナーゼ溶液（２ｍｇ／ｍｌプロナーゼ，１００ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．６，２ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ ＳＤＳ，溶液を３７℃で４５分
間インキュベーションする）と混合し、３７℃で４時間インキュベーションし、
フェノール−クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈殿させた。粗ウイルス
ＤＮＡサンプルを等容量のＴＥバッファーに再懸濁し、そしてＮｓｉＩエンドヌ
クレアーゼ消化及びサザンブロット分析に供した。ブロットに４２０ｂｐ Ｅ１
−ＸｂａＩ／ＣｌａＩ ＤＮＡプローブをハイブリダイズさせた。

【００６０】 これらの結果は、２９３細胞では継代接種５〜１０の間に有意なＲＣＡが出現
し、一方、ＧＨ３２９では２０継代接種後にＲＣＡが検出されないことを示した
。ＲＣＡアッセイの感度は、ベクターの存在下で０継代接種のＧＨ３２９細胞に
１ｐｆｕの野生型Ａｄを加えることにより確かめた。

【００６１】 本明細書において引用する全ての公開は、引用することにより本明細書に組み
込まれる。本発明は、特に好ましい態様に関して記述されているが、本発明の精
神からそれずに改変を行い得ることが理解される。そのような改変は、添付の請
求項の範囲内に入ると解釈される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｅ１欠失組換えアデノウイルスベクター、２９３細胞におけるＡｄ５ ＤＮＡ
配列及び新規なＥ１細胞系におけるＰＧＫ Ａｄ５Ｅ１フラグメントの構造の概
要図である。

【図２Ａ】 ２９３及び新規なＥ１細胞系におけるＥ１欠失組換えアデノウイルス、Ｈ５．
ＣＢＬａｃＺの増殖速度論のグラフである。研究の詳細は、実施例２Ｃを参照。
各細胞系におけるＨ５．ＣＢＬａｃＺウイルスの収量をｌｏｇ目盛りでｙ軸上に
示す。時間点をｘ軸上に示す。

【図２Ｂ】 ２９３細胞と比較した新規なＥ１細胞系でのＨ５．ＣＢＬａｃＺウイルスの相
対プラーク形成効率（ＲＰＥ）を示す棒図表である。研究の詳細は、実施例２Ｄ
を参照。ＲＰＥは、Ｈ５．ＣＢＬａｃＺウイルスの力価のパーセンテージとして
計算した。実棒、３回の異なる実験からの各細胞系の平均ＲＰＥ；誤差棒は標準
偏差を表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:93） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウイルソン，ジエイムズ・エム アメリカ合衆国ペンシルベニア州19035グ ラドウイン・ノースアビニヨンドライブ 1350 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA04 DA02 EA04 FA02 GA11 HA01 4B065 AA90X AA95X AA95Y AB01 BA02 CA24 CA45 4C085 AA03 BA77 GG01

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御
   下のアデノウイルスＥ１ａ及びアデノウイルスＥ１ｂをコードする核酸配列を含
   んでなる核酸分子で安定に形質転換された異数体細胞系を含んでなり、そしてこ
   こで、核酸配列は、アデノウイルスＥ１ａをコードする配列に対して５’のアデ
   ノウイルス配列の欠失をさらに含んでなる、検出可能な複製能力のあるアデノウ
   イルスのない組換えＥ１欠損アデノウイルスの製造のために有用なＥ１相補細胞
   系。
2. 【請求項２】 異数体細胞系がＨｅＬａ細胞系である請求項１に記載のＥ１
   相補細胞系。
3. 【請求項３】 核酸配列がｐＩＸ遺伝子領域の核酸配列をさらに含んでなる
   請求項１もしくは請求項２に記載のＥ１相補細胞系。
4. 【請求項４】 核酸分子がプラスミドベクターである請求項１〜３のいずれ
   かに記載のＥ１相補細胞系。
5. 【請求項５】 核酸分子がアデノウイルスＥ１ａ及びアデノウイルスＥ１ｂ
   をコードする核酸の複数コピーを含んでなる請求項１〜４のいずれかに記載のＥ
   １相補細胞系。
6. 【請求項６】 Ｅ１相補細胞系が該核酸分子の複数コピーを含んでなる請求
   項１〜５のいずれかに記載のＥ１相補細胞系。
7. 【請求項７】 アデノウイルスＥ１ａをコードする配列及びＥ１ｂをコード
   する配列が独立してアデノウイルス５型から選択される請求項１〜６のいずれか
   に記載のＥ１相補細胞系。
8. 【請求項８】 細胞系がＧＨ３６４及びＧＨ３５４よりなる群から選択され
   る請求項１に記載のＥ１相補細胞系。
9. 【請求項９】 受託番号ＰＴＡ−８０３でＡＴＣＣに寄託した、ＧＨ３２９
   と称するアデノウイルスＥ１相補細胞系。
10. 【請求項１０】 （ａ）ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモータ
    ーの制御下のアデノウイルスＥ１ａ及びアデノウイルスＥ１ｂをコードする核酸
    配列を含んでなる核酸分子で安定に形質転換された異数体細胞系を含んでなるＥ
    １相補細胞系から細胞を用意すること、ここで、核酸配列は、アデノウイルスＥ
    １ａをコードする配列に対して５’のアデノウイルス配列の欠失をさらに含んで
    なる： （ｂ）５’から３’に、アデノウイルス５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲｓ）、
    該細胞においてアデノウイルスｐＩＸの発現を導く配列の制御下のアデノウイル
    スｐＩＸをコードする核酸配列、及びアデノウイルスＥ１領域における欠損、及
    びアデノウイルス３’ＩＴＲｓを含んでなる組換えベクターで該細胞をトランス
    フェクションすること；並びに （ｃ）組換えＥ１欠損アデノウイルス粒子へのＥ１欠損ベクターのパッケージン
    グを可能にする条件下で該トランスフェクションした細胞を培養すること、 の工程を含んでなる、複製能力のあるアデノウイルスのないＥ１欠損アデノウイ
    ルス粒子のパッケージング方法。
11. 【請求項１１】 該組換えベクターが、選択した導入遺伝子をさらに含んで
    なる請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 該導入遺伝子が５’〜３’ＩＴＲ間に位置する請求項１１
    に記載の方法。
13. 【請求項１３】 少なくとも一つのアデノウイルス遺伝子をコードするアデ
    ノウイルス配列及びアデノウイルスＥ１領域における欠損を含んでなる第二の組
    換えベクターで該細胞をトランスフェクションすることの工程をさらに含んでな
    る請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 【請求項１４】 該第二の組換えベクターがアデノウイルスＥ２ａをコード
    する請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 該第二の組換えベクターがアデノウイルスＥ４もしくはそ
    の機能性フラグメントをコードする請求項１３もしくは請求項１４に記載の方法
    。
16. 【請求項１６】 機能性フラグメントがＥ４ ＯＲＦ６である請求項１５に
    記載の方法。
17. 【請求項１７】 Ｅ１相補細胞系がＧＨ３２９、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８０３
    ；ＧＨ３６４及びＧＨ３５４よりなる群から選択される請求項１０に記載の方法
    。
18. 【請求項１８】 （ａ）Ｅ１相補細胞系にＥ１欠損アデノウイルスを感染さ
    せること、ここで、該細胞系は、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモ
    ーターの制御下のアデノウイルスＥ１ａ及びアデノウイルスＥ１ｂをコードする
    核酸配列を含んでなる核酸分子で安定に形質転換された異数体細胞系を含んでな
    り、そして核酸配列は、アデノウイルスＥ１ａをコードする配列に対して５’の
    アデノウイルス配列の欠失をさらに含んでなる： （ｂ）Ｅ１相補細胞系でＥ１欠損アデノウイルス粒子を２〜２０継代接種にわた
    って継代すること；及び （ｃ）Ｅ１欠損アデノウイルス粒子を集めること、 の工程を含んでなる、複製能力のあるアデノウイルスのないＥ１欠損アデノウイ
    ルス粒子を増幅する方法。
19. 【請求項１９】 （ａ）のＥ１欠損アデノウイルスが、 （ｉ）ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下のアデノウ
    イルスＥ１ａ及びアデノウイルスＥ１ｂをコードする核酸配列を含んでなる核酸
    分子で安定に形質転換された異数体細胞系を含んでなるＥ１相補細胞系から細胞
    を用意すること、ここで、核酸配列は、アデノウイルスＥ１ａをコードする配列
    に対して５’のアデノウイルス配列の欠失をさらに含んでなる： （ｉｉ）アデノウイルス５’及び３’逆方向末端反復配列（ＩＴＲｓ）、該細胞
    においてアデノウイルスｐＩＸの発現を導く配列の制御下のアデノウイルスｐＩ
    Ｘをコードする核酸配列、並びにアデノウイルスＥ１領域における欠損を含んで
    なる組換えベクターで該細胞をトランスフェクションすること； （ｉｉｉ）組換えＥ１欠損アデノウイルス粒子へのＥ１欠損ベクターのパッケー
    ジングを可能にする条件下で該トランスフェクションした細胞を培養すること；
    及び （ｉｖ）実質的に全ての細胞破壊屑から組換えＥ１欠損アデノウイルス粒子を精
    製すること、 を含んでなる工程により製造される、請求項１８に記載の方法。