JP2003274933A - ニトリラーゼ産生能を有する微生物の培養法 - Google Patents
ニトリラーゼ産生能を有する微生物の培養法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は、ニトリラーゼ活性の高い微生物菌体
を培養により効率よく生産する方法に関する。ニトリラ
ーゼ活性の高い微生物菌体またはそのニトリラーゼ酵素
は、種々のニトリルを加水分解して対応する有機酸を製
造する触媒として有用である。 【解決手段】ニトリラーゼ産生能を有するアースロバク
ター（Arthrobacter）属に属する微生物の培養におい
て、一般式（Ｉ） 【化１】 〔Ｒ1、Ｒ2は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、アミ
ノ基、ニトロ基、水酸基、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、Ｃ
１〜Ｃ３のアルコキシ基を表わし、ｎは０または１〜３
の整数を表わす。ｎが２または３の場合Ｒ2は相異なっ
ていてもよい。〕で表わされる、２位に置換基を有する
ベンゾニトリル化合物を培養液中に存在させることを特
徴とする微生物の培養法により解決できる。
を培養により効率よく生産する方法に関する。ニトリラ
ーゼ活性の高い微生物菌体またはそのニトリラーゼ酵素
は、種々のニトリルを加水分解して対応する有機酸を製
造する触媒として有用である。 【解決手段】ニトリラーゼ産生能を有するアースロバク
ター（Arthrobacter）属に属する微生物の培養におい
て、一般式（Ｉ） 【化１】 〔Ｒ1、Ｒ2は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、アミ
ノ基、ニトロ基、水酸基、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、Ｃ
１〜Ｃ３のアルコキシ基を表わし、ｎは０または１〜３
の整数を表わす。ｎが２または３の場合Ｒ2は相異なっ
ていてもよい。〕で表わされる、２位に置換基を有する
ベンゾニトリル化合物を培養液中に存在させることを特
徴とする微生物の培養法により解決できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ニトリラーゼ活性
の高い微生物菌体を培養により効率よく生産する方法に
関する。ニトリラーゼ活性の高い微生物菌体またはその
ニトリラーゼ酵素は、種々のニトリルを加水分解して対
応する有機酸を製造する触媒として有用である。
の高い微生物菌体を培養により効率よく生産する方法に
関する。ニトリラーゼ活性の高い微生物菌体またはその
ニトリラーゼ酵素は、種々のニトリルを加水分解して対
応する有機酸を製造する触媒として有用である。
【０００２】
【従来の技術】従来、ニトリラーゼ産生能を有する微生
物としては、例えば、カゼオバクター（Caseobacter）
属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アルカリゲネ
ス（Alcaligenes）属、コリネバクテリウム（Corynebac
terium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）
属、ノカルジア（Nocardia）属、ロドコッカス（Rhodoc
occus）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、ゴ
ルドナ（Gordona）属、バチルス（Bacillius）属、バク
テリジウム（Bacteridium）属、ミクロコッカス（Micro
coccus）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属等
に属する微生物が知られている［特公昭６３−２５９６
号公報、特開平４−４０８９８号公報、特開平８−１７
３１５２号公報、特開平８−１７３１７５号公報、国際
公開ＷＯ９６−０９４０３号公報、国際公開９７−３２
０３０号公報、特許第３００９４２１号公報参照］。
物としては、例えば、カゼオバクター（Caseobacter）
属、シュードモナス（Pseudomonas）属、アルカリゲネ
ス（Alcaligenes）属、コリネバクテリウム（Corynebac
terium）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）
属、ノカルジア（Nocardia）属、ロドコッカス（Rhodoc
occus）属、アースロバクター（Arthrobacter）属、ゴ
ルドナ（Gordona）属、バチルス（Bacillius）属、バク
テリジウム（Bacteridium）属、ミクロコッカス（Micro
coccus）属、アシネトバクター（Acinetobacter）属等
に属する微生物が知られている［特公昭６３−２５９６
号公報、特開平４−４０８９８号公報、特開平８−１７
３１５２号公報、特開平８−１７３１７５号公報、国際
公開ＷＯ９６−０９４０３号公報、国際公開９７−３２
０３０号公報、特許第３００９４２１号公報参照］。
【０００３】しかしながら、上記の微生物におけるニト
リラーゼ活性は一般には低いので、そのニトリラーゼ活
性を高めるために、ニトリラーゼ誘導物質を培地に添加
して培養が行われている。上記の特公昭６３−２５９６
号公報および特開平４−４０８９８号公報等では、アセ
トニトリル、イソブチロニトリル、ベンゾニトリルなど
のニトリル化合物を添加して微生物の培養を行う方法が
記載されている。特許第３００９４２１号公報では、ε
−カプロラクタムなどのラクタム化合物を添加して、ロ
ドコッカス属の微生物を培養する方法が記載されてい
る。また、特開平８−１７３１５２号公報には、エチレ
ンシアンヒドリンを添加して微生物の培養を行う方法が
記載されている。２位に置換基を有するベンゾニトリル
化合物としては、２−アミノベンゾニトリルを培地に添
加してニトリラーゼ産生微生物を培養した例が、特開平
８−２０５８７８号公報、特開平９−１４０３９１号公
報および特開平１０−２７６７９２号公報に記載されて
いるが、アースロバクター属に属する微生物の培養に使
用された例はない。
リラーゼ活性は一般には低いので、そのニトリラーゼ活
性を高めるために、ニトリラーゼ誘導物質を培地に添加
して培養が行われている。上記の特公昭６３−２５９６
号公報および特開平４−４０８９８号公報等では、アセ
トニトリル、イソブチロニトリル、ベンゾニトリルなど
のニトリル化合物を添加して微生物の培養を行う方法が
記載されている。特許第３００９４２１号公報では、ε
−カプロラクタムなどのラクタム化合物を添加して、ロ
ドコッカス属の微生物を培養する方法が記載されてい
る。また、特開平８−１７３１５２号公報には、エチレ
ンシアンヒドリンを添加して微生物の培養を行う方法が
記載されている。２位に置換基を有するベンゾニトリル
化合物としては、２−アミノベンゾニトリルを培地に添
加してニトリラーゼ産生微生物を培養した例が、特開平
８−２０５８７８号公報、特開平９−１４０３９１号公
報および特開平１０−２７６７９２号公報に記載されて
いるが、アースロバクター属に属する微生物の培養に使
用された例はない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】上記のようなニトリラ
ーゼ誘導物質のうち、特公昭６３−２５９６号公報およ
び特開平４−４０８９８号公報等記載のニトリル化合物
は、培養中に微生物が資化してしまうため、その消費に
応じてニトリル化合物を培地に追加する必要があり、常
に安定して高活性の菌体を得ることは難しい。さらに、
一部のニトリル化合物は揮発性、引火性が強く、中には
著しい悪臭を放つものもあり、工業的培養において用い
ることは困難である。また、特許第３００９４２１号公
報記載のラクタム化合物および特開平８−１７３１５２
号公報記載のエチレンシアンヒドリンは培養中ほとんど
資化されず、一定濃度を保つためにニトリラーゼの誘導
効果が安定しているが、ラクタム化合物は通常０．５
％、エチレンシアンヒドリンは通常１．５〜５．０％と
培地に高濃度添加する必要があり、さらにほとんど資化
されず培養後もそのまま培養液中に残存するため、培養
廃液処理の問題がある。本発明の課題は、ニトリラーゼ
産生能を有するアースロバクター属に属する微生物の培
養において、培養液中に少量添加することにより、安定
して誘導効果を発揮し、ニトリラーゼ活性の高い微生物
菌体を得ることができるニトリラーゼ誘導物質を提供す
ることにある。
ーゼ誘導物質のうち、特公昭６３−２５９６号公報およ
び特開平４−４０８９８号公報等記載のニトリル化合物
は、培養中に微生物が資化してしまうため、その消費に
応じてニトリル化合物を培地に追加する必要があり、常
に安定して高活性の菌体を得ることは難しい。さらに、
一部のニトリル化合物は揮発性、引火性が強く、中には
著しい悪臭を放つものもあり、工業的培養において用い
ることは困難である。また、特許第３００９４２１号公
報記載のラクタム化合物および特開平８−１７３１５２
号公報記載のエチレンシアンヒドリンは培養中ほとんど
資化されず、一定濃度を保つためにニトリラーゼの誘導
効果が安定しているが、ラクタム化合物は通常０．５
％、エチレンシアンヒドリンは通常１．５〜５．０％と
培地に高濃度添加する必要があり、さらにほとんど資化
されず培養後もそのまま培養液中に残存するため、培養
廃液処理の問題がある。本発明の課題は、ニトリラーゼ
産生能を有するアースロバクター属に属する微生物の培
養において、培養液中に少量添加することにより、安定
して誘導効果を発揮し、ニトリラーゼ活性の高い微生物
菌体を得ることができるニトリラーゼ誘導物質を提供す
ることにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ニトリラ
ーゼ産生能を有するアースロバクター属微生物の培養に
おいて、ニトリラーゼを誘導生成させる物質および使用
条件について種々検討した結果、優れたニトリラーゼ誘
導物質として知られているε−カプロラクタムに比し、
２位に置換基を有するベンゾニトリル化合物を培養開始
時乃至は培養中に少量添加することにより、ニトリラー
ゼ活性が飛躍的に向上した微生物菌体が容易に得られる
ことを見い出し、本発明を完成するに至った。
ーゼ産生能を有するアースロバクター属微生物の培養に
おいて、ニトリラーゼを誘導生成させる物質および使用
条件について種々検討した結果、優れたニトリラーゼ誘
導物質として知られているε−カプロラクタムに比し、
２位に置換基を有するベンゾニトリル化合物を培養開始
時乃至は培養中に少量添加することにより、ニトリラー
ゼ活性が飛躍的に向上した微生物菌体が容易に得られる
ことを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、ニトリラーゼ産生能
を有するアースロバクター（Arthrobacter）属に属する
微生物の培養において、一般式（Ｉ）
を有するアースロバクター（Arthrobacter）属に属する
微生物の培養において、一般式（Ｉ）
【０００７】
【化２】
【０００８】〔Ｒ1、Ｒ2は、それぞれ独立して、ハロゲ
ン原子、アミノ基、ニトロ基、水酸基、Ｃ１〜Ｃ３のア
ルキル基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基を表わし、ｎは０
または１〜３の整数を表わす。ｎが２または３の場合Ｒ
2は相異なっていてもよい。〕で表わされる、２位に置
換基を有するベンゾニトリル化合物を培養液中に存在さ
せることを特徴とする微生物の培養法（請求項１）、ま
たは微生物がアースロバクター エスピー ＮＳＳＣ１
０４［ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２９］、アースロバクター
エスピー ＮＳＳＣ２０４［ＦＥＲＭ ＢＰ−７６６
２］である請求項１記載の微生物の培養法（請求項２）
である。
ン原子、アミノ基、ニトロ基、水酸基、Ｃ１〜Ｃ３のア
ルキル基、Ｃ１〜Ｃ３のアルコキシ基を表わし、ｎは０
または１〜３の整数を表わす。ｎが２または３の場合Ｒ
2は相異なっていてもよい。〕で表わされる、２位に置
換基を有するベンゾニトリル化合物を培養液中に存在さ
せることを特徴とする微生物の培養法（請求項１）、ま
たは微生物がアースロバクター エスピー ＮＳＳＣ１
０４［ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２９］、アースロバクター
エスピー ＮＳＳＣ２０４［ＦＥＲＭ ＢＰ−７６６
２］である請求項１記載の微生物の培養法（請求項２）
である。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明において、ニトリラーゼ産
生能を有する微生物は、アースロバクター属の微生物で
あり、例えば、アースロバクター エスピー ＮＳＳＣ
１０４［ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２９］、アースロバクタ
ー エスピー ＮＳＳＣ２０４［ＦＥＲＭ ＢＰ−７６
６２］等を挙げることができる。アースロバクター エ
スピーＮＳＳＣ１０４は上記寄託番号で独立行政法人産
業技術総合研究所に寄託されており、その菌学的性質に
ついてはＷＯ９７／３２０３０に記載されている。また
アースロバクター エスピー ＮＳＳＣ２０４は、アー
スロバクター エスピー ＮＳＳＣ１０４の変異処理に
より新たに分離されたものであり、その菌学的性質につ
いては、ＰＣＴ／ＪＰ０１／０６２９１に記載されてい
る。
生能を有する微生物は、アースロバクター属の微生物で
あり、例えば、アースロバクター エスピー ＮＳＳＣ
１０４［ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２９］、アースロバクタ
ー エスピー ＮＳＳＣ２０４［ＦＥＲＭ ＢＰ−７６
６２］等を挙げることができる。アースロバクター エ
スピーＮＳＳＣ１０４は上記寄託番号で独立行政法人産
業技術総合研究所に寄託されており、その菌学的性質に
ついてはＷＯ９７／３２０３０に記載されている。また
アースロバクター エスピー ＮＳＳＣ２０４は、アー
スロバクター エスピー ＮＳＳＣ１０４の変異処理に
より新たに分離されたものであり、その菌学的性質につ
いては、ＰＣＴ／ＪＰ０１／０６２９１に記載されてい
る。
【００１０】ニトリラーゼ産生能を有する微生物の培養
に使用される培地としては、該微生物が生育しうるもの
であれば天然培地、合成培地のいずれであってもよい。
炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、ス
クロース、マルトース又はこれらを含有する糖蜜等の糖
類、デンプン又はデンプン加水分解物等の炭水化物、酢
酸、乳酸等の有機酸、エタノール、グリセリン等のアル
コール類が、単独又は混合して用いられる。
に使用される培地としては、該微生物が生育しうるもの
であれば天然培地、合成培地のいずれであってもよい。
炭素源としては、例えばグルコース、フラクトース、ス
クロース、マルトース又はこれらを含有する糖蜜等の糖
類、デンプン又はデンプン加水分解物等の炭水化物、酢
酸、乳酸等の有機酸、エタノール、グリセリン等のアル
コール類が、単独又は混合して用いられる。
【００１１】窒素源としては、例えばアミン類、アミノ
酸類、硝酸塩類、アンモニア、各種無機酸や有機酸のア
ンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプト
ン、トリプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチー
プリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加
水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を例示する
ことができる。無機塩類としては、例えばリン酸第一カ
リウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫
酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マ
ンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム、その他微量金属等が
適宜用いられる。これら培地成分の添加は、一括で行っ
ても、分割あるいは連続で行っても良い。
酸類、硝酸塩類、アンモニア、各種無機酸や有機酸のア
ンモニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプト
ン、トリプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチー
プリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加
水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を例示する
ことができる。無機塩類としては、例えばリン酸第一カ
リウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫
酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マ
ンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム、その他微量金属等が
適宜用いられる。これら培地成分の添加は、一括で行っ
ても、分割あるいは連続で行っても良い。
【００１２】培地に添加する２位に置換基を有するベン
ゾニトリル化合物は一般式（Ｉ）
ゾニトリル化合物は一般式（Ｉ）
【００１３】
【化３】
【００１４】で表わされる化合物であり、式中、Ｒ1、
Ｒ2は、それぞれ独立して、アミノ基、ニトロ基、水酸
基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子等のハロゲン原
子；メチル、エチル、プロピル等のＣ１〜Ｃ３のアルキ
ル基；メトキシ、エトキシ、プロポキシ等のＣ１〜Ｃ３
のアルコキシ基を表わす。ｎは０または１〜３の整数を
表わす。ｎが２または３の場合Ｒ2は相異なっていても
よい。
Ｒ2は、それぞれ独立して、アミノ基、ニトロ基、水酸
基；フッ素原子、塩素原子、臭素原子等のハロゲン原
子；メチル、エチル、プロピル等のＣ１〜Ｃ３のアルキ
ル基；メトキシ、エトキシ、プロポキシ等のＣ１〜Ｃ３
のアルコキシ基を表わす。ｎは０または１〜３の整数を
表わす。ｎが２または３の場合Ｒ2は相異なっていても
よい。
【００１５】一般式（I）で表わされる具体的な化合物
としては、２−メチルベンゾニトリル、２−メトキシベ
ンゾニトリル、２−フルオロベンゾニトリル、２−クロ
ロベンゾニトリル、２−ブロモベンゾニトリル、２−ア
ミノベンゾニトリル、２−アミノ−５−ニトロベンゾニ
トリル、２−アミノ−５−クロロベンゾニトリル、２−
シアノフェノール、が挙げられる。これらの中でも、２
−アミノベンゾニトリル誘導体、２−シアノフェノール
誘導体が好ましい。
としては、２−メチルベンゾニトリル、２−メトキシベ
ンゾニトリル、２−フルオロベンゾニトリル、２−クロ
ロベンゾニトリル、２−ブロモベンゾニトリル、２−ア
ミノベンゾニトリル、２−アミノ−５−ニトロベンゾニ
トリル、２−アミノ−５−クロロベンゾニトリル、２−
シアノフェノール、が挙げられる。これらの中でも、２
−アミノベンゾニトリル誘導体、２−シアノフェノール
誘導体が好ましい。
【００１６】２位に置換基を有するベンゾニトリル化合
物の培地への添加は、該微生物の生育が大きく阻害され
ない程度で良く、具体的には０．００１％〜１％（Ｗ／
Ｖ）、好ましくは０．００５〜０．１％（Ｗ／Ｖ）であ
る。２位に置換基を有するベンゾニトリル化合物は予め
培地に添加しておいても、微生物の培養中に添加しても
良く、またその添加は一括で行っても、分割あるいは連
続で行っても良い。２位に置換基を有するベンゾニトリ
ル化合物を２種以上添加することも可能である。
物の培地への添加は、該微生物の生育が大きく阻害され
ない程度で良く、具体的には０．００１％〜１％（Ｗ／
Ｖ）、好ましくは０．００５〜０．１％（Ｗ／Ｖ）であ
る。２位に置換基を有するベンゾニトリル化合物は予め
培地に添加しておいても、微生物の培養中に添加しても
良く、またその添加は一括で行っても、分割あるいは連
続で行っても良い。２位に置換基を有するベンゾニトリ
ル化合物を２種以上添加することも可能である。
【００１７】
【実施例】以下、実施例により詳細に説明するが、本発
明はこれらの実施例により限定されるものではない。
明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【００１８】実施例におけるニトリラーゼ活性の測定は
次のようにして行った。１００ｍＭのリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７．５）０．４ｍｌに菌体懸濁液０．１ｍｌ
を加え、クロトノニトリル １０μｌ（１２３μｍｏ
ｌ）を添加して、３５℃、３０分間反応を行った。反応
後、直ちに遠心分離（１６，０００ｒｐｍ、５分、室
温）で菌体を除き、反応液中に生成したクロトン酸を高
速液体クロマトグラフィーにて定量した。１分間に１μ
ｍｏｌのクロトン酸を生成する活性を１単位（Ｕ）とし
た。ここで使用したニトリラーゼ活性を測定するための
菌体懸濁液は、培養液１０ｍｌから遠心分離により得ら
れた菌体に１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．５）を加えて１０ｍｌとしたものである。
次のようにして行った。１００ｍＭのリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７．５）０．４ｍｌに菌体懸濁液０．１ｍｌ
を加え、クロトノニトリル １０μｌ（１２３μｍｏ
ｌ）を添加して、３５℃、３０分間反応を行った。反応
後、直ちに遠心分離（１６，０００ｒｐｍ、５分、室
温）で菌体を除き、反応液中に生成したクロトン酸を高
速液体クロマトグラフィーにて定量した。１分間に１μ
ｍｏｌのクロトン酸を生成する活性を１単位（Ｕ）とし
た。ここで使用したニトリラーゼ活性を測定するための
菌体懸濁液は、培養液１０ｍｌから遠心分離により得ら
れた菌体に１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．５）を加えて１０ｍｌとしたものである。
【００１９】実施例１
前培養用培地として、０．５重量％グルコース，０．５
重量％酵母エキス，０．０３重量％２−アミノベンゾニ
トリル，０．１重量％リン酸二カリウム，０．１重量％
リン酸一カリウム，０．０２重量％硫酸マグネシウム・
７水和物，０．１重量％塩化ナトリウム，０．００１重
量％硫酸第一鉄・７水和物を含み、１Ｎ水酸化ナトリウ
ムでｐＨ７．２に調整したものを用いた。この前培養用
培地２００ｍｌを３リットル容三角フラスコに入れ、１
２１℃で２０分間滅菌した（硫酸第一鉄は別にろ過滅菌
して加えた）後、アースロバクター エスピー ＮＳＳ
Ｃ１０４菌株を接種し、３３℃で３日間振盪して前培養
を行った。本培養用培地として、１０．０重量％コーン
スチープリカー抽出液，２．０重量％スクロース，０．
０３重量％２−アミノベンゾニトリルからなる培地６．
０リットルを１０リットル容ジャーファメンターに用意
した。ここで使用したコーンスチープリカー抽出液と
は、コーンスチープリカー４０重量％を含み、１０Ｎ水
酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整した溶液から不溶物
を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）によって除
いた上清液である。コーンスチープリカー抽出液はろ過
滅菌し、他の培地成分は１１０℃で２０分間滅菌して用
いた。この本培養用培地に前培養液６０ｍｌを植菌し
て、３３℃で５日間通気撹拌培養した。ニトリラーゼ活
性は、上記の方法で測定した。
重量％酵母エキス，０．０３重量％２−アミノベンゾニ
トリル，０．１重量％リン酸二カリウム，０．１重量％
リン酸一カリウム，０．０２重量％硫酸マグネシウム・
７水和物，０．１重量％塩化ナトリウム，０．００１重
量％硫酸第一鉄・７水和物を含み、１Ｎ水酸化ナトリウ
ムでｐＨ７．２に調整したものを用いた。この前培養用
培地２００ｍｌを３リットル容三角フラスコに入れ、１
２１℃で２０分間滅菌した（硫酸第一鉄は別にろ過滅菌
して加えた）後、アースロバクター エスピー ＮＳＳ
Ｃ１０４菌株を接種し、３３℃で３日間振盪して前培養
を行った。本培養用培地として、１０．０重量％コーン
スチープリカー抽出液，２．０重量％スクロース，０．
０３重量％２−アミノベンゾニトリルからなる培地６．
０リットルを１０リットル容ジャーファメンターに用意
した。ここで使用したコーンスチープリカー抽出液と
は、コーンスチープリカー４０重量％を含み、１０Ｎ水
酸化ナトリウムでｐＨ７．０に調整した溶液から不溶物
を遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）によって除
いた上清液である。コーンスチープリカー抽出液はろ過
滅菌し、他の培地成分は１１０℃で２０分間滅菌して用
いた。この本培養用培地に前培養液６０ｍｌを植菌し
て、３３℃で５日間通気撹拌培養した。ニトリラーゼ活
性は、上記の方法で測定した。
【００２０】比較例１
誘導物質として０．０３重量％２−アミノベンゾニトリ
ルの代わりに０．５重量％ε−カプロラクタムを用いた
以外は実施例１と同様の条件で培養を行い、そのニトリ
ラーゼ活性を測定した。結果を表１に示した。
ルの代わりに０．５重量％ε−カプロラクタムを用いた
以外は実施例１と同様の条件で培養を行い、そのニトリ
ラーゼ活性を測定した。結果を表１に示した。
【００２１】
【表１】
【００２２】実施例２
アースロバクター エスピー ＮＳＳＣ２０４菌株を実
施例１と同様の方法で培養し、ニトリラーゼ活性を測定
した。その結果、培養液１ml当たりのニトリラーゼ活性
は、４．８ Ｕであった。
施例１と同様の方法で培養し、ニトリラーゼ活性を測定
した。その結果、培養液１ml当たりのニトリラーゼ活性
は、４．８ Ｕであった。
【００２３】実施例３
前培養用培地として、０．５重量％グルコース，０．５
重量％酵母エキス，０．１重量％リン酸二カリウム，
０．１重量％リン酸一カリウム，０．０２重量％硫酸マ
グネシウム・７水和物，０．１重量％塩化ナトリウム，
０．００１重量％硫酸第一鉄・７水和物を含み、１Ｎ水
酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整したものを用いた。
この前培養用培地２００ｍｌを３リットル容三角フラス
コに入れ、１２１℃で２０分間滅菌した（硫酸第一鉄は
別にろ過滅菌して加えた）後、アースロバクター エス
ピー ＮＳＳＣ２０４菌株を接種し、３３℃で３日間振
盪して前培養を行った。本培養用培地として、５．０重
量％コーンスチープリカー抽出液，１．０重量％スクロ
ース，０．０１重量％２−アミノベンゾニトリルからな
る培地４０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに用意し
た。この本培養用培地に前培養液０．５ｍｌを植菌し
て、３３℃で４日間振盪培養した。ニトリラーゼ活性
は、上記の方法で測定した。結果を第２表に示した。
重量％酵母エキス，０．１重量％リン酸二カリウム，
０．１重量％リン酸一カリウム，０．０２重量％硫酸マ
グネシウム・７水和物，０．１重量％塩化ナトリウム，
０．００１重量％硫酸第一鉄・７水和物を含み、１Ｎ水
酸化ナトリウムでｐＨ７．２に調整したものを用いた。
この前培養用培地２００ｍｌを３リットル容三角フラス
コに入れ、１２１℃で２０分間滅菌した（硫酸第一鉄は
別にろ過滅菌して加えた）後、アースロバクター エス
ピー ＮＳＳＣ２０４菌株を接種し、３３℃で３日間振
盪して前培養を行った。本培養用培地として、５．０重
量％コーンスチープリカー抽出液，１．０重量％スクロ
ース，０．０１重量％２−アミノベンゾニトリルからな
る培地４０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに用意し
た。この本培養用培地に前培養液０．５ｍｌを植菌し
て、３３℃で４日間振盪培養した。ニトリラーゼ活性
は、上記の方法で測定した。結果を第２表に示した。
【００２４】実施例４〜１０
誘導物質として２−アミノベンゾニトリルの代わりに、
２位に置換基を有する他のベンゾニトリル化合物を添加
した以外は実施例３と同様の条件で培養を行い、そのニ
トリラーゼ活性を測定した。それらの結果を第２表に示
した。
２位に置換基を有する他のベンゾニトリル化合物を添加
した以外は実施例３と同様の条件で培養を行い、そのニ
トリラーゼ活性を測定した。それらの結果を第２表に示
した。
【００２５】比較例２〜７
誘導物質として２−アミノベンゾニトリルの代わりに第
２表に示した化合物を用いた以外は、実施例３と同様の
条件で培養を行い、そのニトリラーゼ活性を測定した。
それらの結果を同様に第２表に示した。
２表に示した化合物を用いた以外は、実施例３と同様の
条件で培養を行い、そのニトリラーゼ活性を測定した。
それらの結果を同様に第２表に示した。
【００２６】
【表２】
【００２７】
【発明の効果】２位に置換基を有するベンゾニトリル化
合物は、ニトリラーゼ産生能を有するアースロバクター
属に属する微生物の培養において、ニトリラーゼ誘導物
質として低濃度で高い効果があり、また培養中に資化さ
れ難く、揮発性も低いので、培養液中に安定した濃度で
存在させることができるため、結果として効率よくニト
リラーゼ活性の高い微生物菌体を得ることができる。
合物は、ニトリラーゼ産生能を有するアースロバクター
属に属する微生物の培養において、ニトリラーゼ誘導物
質として低濃度で高い効果があり、また培養中に資化さ
れ難く、揮発性も低いので、培養液中に安定した濃度で
存在させることができるため、結果として効率よくニト
リラーゼ活性の高い微生物菌体を得ることができる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 渡部 健
神奈川県小田原市高田345 日本曹達株式
会社小田原研究所内
Ｆターム(参考） 4B065 AA13X AC14 BB12 CA31
CA60
Claims (2)
- 【請求項１】 ニトリラーゼ産生能を有するアースロバ
クター（Arthrobacter）属に属する微生物の培養におい
て、一般式（Ｉ） 【化１】 〔Ｒ1、Ｒ2は、それぞれ独立して、ハロゲン原子、アミ
ノ基、ニトロ基、水酸基、Ｃ１〜Ｃ３のアルキル基、Ｃ
１〜Ｃ３のアルコキシ基を表わし、ｎは０または１〜３
の整数を表わす。ｎが２または３の場合Ｒ2は相異なっ
ていてもよい。〕で表わされる、２位に置換基を有する
ベンゾニトリル化合物を培養液中に存在させることを特
徴とする微生物の培養法。 - 【請求項２】 微生物がアースロバクター エスピー
ＮＳＳＣ１０４［ＦＥＲＭ ＢＰ−５８２９］、アース
ロバクター エスピー ＮＳＳＣ２０４［ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−７６６２］である請求項１記載の微生物の培養法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002012733A JP2003274933A (ja) | 2001-01-26 | 2002-01-22 | ニトリラーゼ産生能を有する微生物の培養法 |
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001-18008 | 2001-01-26 | ||
| JP2001018008 | 2001-01-26 | ||
| JP2002-9624 | 2002-01-18 | ||
| JP2002009624 | 2002-01-18 | ||
| JP2002012733A JP2003274933A (ja) | 2001-01-26 | 2002-01-22 | ニトリラーゼ産生能を有する微生物の培養法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003274933A true JP2003274933A (ja) | 2003-09-30 |
Family
ID=29219425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002012733A Pending JP2003274933A (ja) | 2001-01-26 | 2002-01-22 | ニトリラーゼ産生能を有する微生物の培養法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2003274933A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009078462A1 (ja) * | 2007-12-18 | 2009-06-25 | Keio University | 新規糖鎖プライマーとその利用 |
-
2002
- 2002-01-22 JP JP2002012733A patent/JP2003274933A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009078462A1 (ja) * | 2007-12-18 | 2009-06-25 | Keio University | 新規糖鎖プライマーとその利用 |
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