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JP2002537795A - ハンセヌラポリモルパ変異体及びそれらを利用する組換え蛋白質の製造方法 - Google Patents

ハンセヌラポリモルパ変異体及びそれらを利用する組換え蛋白質の製造方法

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JP2002537795A
JP2002537795A JP2000602745A JP2000602745A JP2002537795A JP 2002537795 A JP2002537795 A JP 2002537795A JP 2000602745 A JP2000602745 A JP 2000602745A JP 2000602745 A JP2000602745 A JP 2000602745A JP 2002537795 A JP2002537795 A JP 2002537795A
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gene
hansenula polymorpha
mutant
carboxypeptidase
strain
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JP2000602745A
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サンギ リー
ユイスング チョイ
ヒュナハ カング
ジュンクホーン ソーン
ユングホーン バエ
ムーウーグ キム
アガフォノフ ミハイル
ミュングクック キム
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Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Original Assignee
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
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Priority claimed from KR1020000010743A external-priority patent/KR20010086829A/ko
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Abstract

(57)【要約】 本発明はハンセヌラポリモルパ遺伝子およびこれら遺伝子が欠乏された菌株に関し、ハンセヌラポリモルパDL1由来のカルボキシペプチダーゼYをコードする遺伝子PRC1、プロチアーゼAをコードする遺伝子PEP4遺伝子およびカルボキシペプチダーゼαをコードする遺伝子KEX1をクローニングした後、この遺伝子らのうちPRC1とPEP4遺伝子をLEU遺伝子によりディスラプションさせて製作したべクターでハンセヌラポリモルパUR2菌株を形質転換してカルボキシペプチダーゼY、プロチアーゼA変異菌株を製造し、また、PRC1,PEP4,KEX1遺伝子をハンセヌラポリモルパURA3遺伝子ポプアウトカセットによりディスラプションさせて製作したベクターでハンセヌラポリモルパDL1菌株を形質転換してカルボキシペプチダーゼY、プロチアーゼA,カルボキシペプチダーゼα重複変異株を製造した後、前記製造した菌株らは外来蛋白質発現時に宿主として用いてカルボキシ末端分解が減少された外来蛋白質を製造する効果があり、また、ハンセヌラポリモルパ由来の分泌シグナルペプチドとして用いることができる優れた効果がある。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はハンセヌラポリモルパ遺伝子およびハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓ
ｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）変異株、それを使った組換えタンパク質の
製造法に関し、より詳細には、種々のタンパク質を高生産で完全なものとして製
造できる宿主として有効なハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌ
ｙｍｏｒｐｈａ）変異株及びそれを使った組換えタンパク質の製造法に関する。
。
【０００２】
【従来の技術】
組替え蛋白質生産技術は、比較的に最近発達した遺伝子組替え技術を通じて高
等生物由来の遺伝子を多様な微生物から大量発現生産して自然的に生産量が限定
された高付加価値医療用蛋白質を比較的に低廉な費用で生産する技術であって、
今後難治性疾患の増加と国民医療水準の提高により高純度の蛋白質性医薬品の需
要が急増するであろうと予想される。従って、ヒトに無害な多様な微生物を利用
して新機能性組替え蛋白質を比較的に低廉な費用で大量生産できる技術開発の研
究が必要である。
【０００３】 酵母を宿主細胞に利用した組替え蛋白質生産の研究は、主に伝統酵母サカロマ
イセスセレビジアエ(Saccharomyces serevisiae)を利用したが、効率的な外来
蛋白質発現のための強力なプロモーターの不在や長時間発酵時に引き起こされる
プラスミドの不安定性等の理由で組替え蛋白質の生産効率が劣り、高濃度培養時
にfed‐batch発酵(fermentation)が必要であり、発現された異種蛋白質らがハイ
パ−グリコシレ−ション(hyperglycosilation)になるという点で非適切な宿主と
みなされている(Romanos, et al.,Yeast,８,423,1992)。
【０００４】 このような短点を補完する外来蛋白質発現システムがメタノール自化酵母であ
るピチアパストリス(Pichia pastoris)から開発されており(Sudberi et al.,
Yeast,10,1707,1994；Cregg et al.,Bio/Technol.５,479,1987)、最近にはま
た別のメタノール自化酵母であるハンセヌラポリモルパを利用した異種蛋白質発
現システムの開発研究が活発に進められている(Gellissen et al.,Bio/Techno
l.9,291,1991；Janowicz et al.,Yeast 7,431,1991)。新たな代替宿主酵母の
うちの一つであるメタノール自化酵母ハンセヌラポリモルパは安い原料物質であ
るメタノールを炭素源として利用して比較的に容易に高濃度培養が可能であり、
メタノール代謝に係る幾つかの遺伝子由来の強力なプロモーターが存在し、また
、外来遺伝子を宿主細胞の染色体DNAに多重導入(multicopy integration)でき
るため、高濃度培養の間にも安定的に維持される長点がある。
【０００５】 酵母を利用して組替え蛋白質を生産するとき、生産性の増加のためには効率的
な発現および分泌システムの使用は必須的であるが、生産分泌された外来蛋白質
を蛋白質分解酵素等からの分解を防止することも非常に重要である。組替え酵母
を発酵槽で長時間培養するとき、宿主細胞から自然的に分泌されたり、または細
胞内に存在する蛋白質分解酵素が細胞のライシス(lysis)を通じて培地に出て生
産された組替え蛋白質を分解することにより、全体的な組替え蛋白質の生産性を
低下させる問題がある。組替え蛋白質生産ハンセヌラポリモルパ細胞培養液に分
泌された組替え蛋白質をHPLC、MS等を通じて分析した結果、相当部分の組替え蛋
白質カルボキシ末端分解産物が現れ、これは宿主細胞のカルボキシペプチダ−ゼ
により組替え蛋白質カルボキシ末端のアミノ酸が１〜2個除去された産物である
のが観察された。
【０００６】 サカロマイセスセレビジアエの液胞(vacuole)は、高等細胞のリソゾム(lisoso
me)に該当する器官であって、多種の蛋白質分解酵素を含有しており、栄養分枯
渇時に蛋白質分解システムを担当している。特に、カルボキシペプチダ−ゼYは
多様な基質の蛋白質を分解することができる能力に因りカルボキシ末端アミノ酸
分析に利用されており、蛋白質の分類や位置を研究するモデル蛋白質として多く
の研究が進まれている(Rothman et al.,Cell,47,1041,1986；Johnson et al
.,Cell,48,875,1987；Valls et al.,J.Cell,Biol.,111,361,1992)。
【０００７】 また、外来蛋白質の過量発現時に発生するカルボキシ末端の分解は、カルボキシ
ペプチダ−ゼYに起因するものと知られている。カルボキシペプチダ−ゼY遺伝子
は、サカロマイセスセレビジアエ、カンジダアルビカンス(Candida albicans)
、ピチアパストリス(Pichia pastoris)、シゾサカロマイセスポンベ(Shizosacc
haromyces pombe)等でクローニングされて公知されている(Valls et al.,Cel
l,48,887,1987；Mukhtar et al.,Gene,121,173,1992；Ohi et al.,Yeast,12
,31,1996；Tabuchi et al.,J.Bacteriol.,179,4179,1997)、また、サカロマイ
セスセレビジアエプロチア−ゼAはカルボキシペプチアーゼYと共に液胞に存在す
る蛋白質分解酵素である。プロチアーゼAは液胞に存在するプロチアーゼB、カル
ボキシペプチダ−ゼY、アミノペプチダ−ゼYのような蛋白質分解酵素のみならず
、RNase,アルカラインポスパターゼ(alkaline posphatase)、酸トレハラーぜ(a
cid trehalase)のような液胞加水分解剤(vacuolar hydrolase)の蛋白質加水分
解プロセッシング(proteolytic processing)に関与する(H.B.Van Den Hazel
et al.,Yeast.,12,1,1996)。
【０００８】 特に、PEP4遺伝子がディスラプションされた菌株ではカルボキシペプチダ−ゼ
Yの活性度が著しく減少するため、ハンセヌラポリモルパPEP4遺伝子をクローニ
ングしてディスラプションするとカルボキシペプチダ−ゼYを含む諸分解酵素の
活性を低下させることができる。PEP4遺伝子はサカロマイセスセレビジアエ、カ
ンジダアルビカンス、ニューロスポラクラッサ(Neurospora crassa)等でクロー
ニングされて公知されている(Ammerer et al.,Mol.Cell.Biol.,6,2490,1986；
Woolford et al.,Mol.Cell.Biol.,6,25,1986；Lott et al.,Nucleic Acids
Res.,17,1779,1989；Bowman et al.,Genbank accession No.U36471)。
【０００９】 酵母のKEX1遺伝子は、K1、K2 killer toxinとα‐factor(mating pheromon
e)前躯体のプロセッシングに関与するカルボキシペプチダーゼαをコードするも
のと知られている(Alexandra et al.,Cell,50,573,1987)。カルボキシペプチ
ダ‐ゼαはアルギニン(Arginine)、リシン(Lysine)のような塩基性アミノ酸で構
成された蛋白質のカルボキシ末端を特異的に分解するものと知られているが、ト
ロンビン抑制剤であるヒルジン(hirudin)をサカロマイセスセレビジアエで発現
した場合、カルボキシ末端が塩基性アミノ酸である場合のみならず、チロシン(T
yrosine)、リューシン(Leucine)、グルタミン(Glutamine)のような非塩基性アミ
ノ酸で構成された場合にもカルボキシペプチダーゼαによりカルボキシ末端が分
解されるのが明かされた(Hinnen et al.，Gene Expression in recombinan
t microorganism，155‐164，1994)。
【００１０】 従って、ハンセヌラポリモルパでもサカロマイセスセレビジアエの場合と同様
の機能を遂行するであろうと思われて、ハンセヌラポリモルパカルボキシペプチ
ダーゼα遺伝子をクローニングしてカルボキシペプチダーゼα欠乏菌株を製造し
ようとした。KEX1遺伝子はサカロマイセスセレビジアエ、ピチアパストリス、シ
ゾサカロマイセスポンベ、クルイベロマイセスラクチス(Kluyveromyces lactis
)等でクローニングされて公知されている(Bjourson et al．，Cell,50,573,19
87.,Boehm et al.,Genbank accession No.AF095574．,Lyneet al,GenBenk
accession No. AL023554．，Tanguy‐Rougeau et al．，FEES Lett,234
，464，1988)。
【００１１】 人表皮成長因子(human epidermal growth factor；hEGF)は、53個のアミノ
酸で構成された６kDaの箪一ペプチドで構成された蛋白質であって、表皮成長の
促進以外にDNAと蛋白質の合成、カルシウム伝達によるイオン輸送、胃酸分泌の
抑制などの役割をする。このような作用上の特性により現在創傷や火傷の治療、
角膜表層の傷の治療、角膜移植手術後の治療、そして胃潰瘍の治療用として開発
されている。従って、このような薬理学的重要性と動物細胞から極少量のみ抽出
されることに着目してメタノール自化酵母であるハンセヌラポリモルパから大量
発現して分泌させた後、カルボキシ末端の分解か否かを確認した。従来にはハン
セヌラポリモルパでヒト表皮成長因子(hEGF)を効果的に発現させるために、先ず
、ｈEGF遺伝子を含むプラスミドｐUREGFを製造した。
【００１２】 pUREGFはサカロマイセスセレビジアエURA3遺伝子を表皮遺伝子として使用し、
ハンセヌラポリモルパの自己複製配列であるHARS36を含んでおり、メタノール酸
化酵素(methanol oxidase)のプロモーターとサカロマイセスセレビジアエの交
配因子α由来の分泌信号であるプレ‐プロリーダー(pre‐pro leader sequenc
e)、hEGFの構造遺伝子およびメタノール酸化酵素のターミネーター(terminator)
が順次に連結されているプラスミドである。
【００１３】 pUREGFは選択標識遺伝子としてサカロマイセスセレビジアエURA3遺伝子を使用
するため、hEGF遺伝子の多重導入を誘導することができ、メタノール培地で最も
強力に誘導されるメタノール酸化酵素のプロモーターを使用してhEGFの発現を強
力に誘導することができる。
【００１４】 また、サカロマイセスセレビジアエの交配因子α由来のプレ‐プロりーダー後
にhEGF遺伝子を連結して発現されたhEGF蛋白質を細胞外に分泌させる特徴がある
。ハンセヌラポリモルパUR2菌株はハンセヌラポリモルパDL1(leu，ura)菌株をプ
ラスミドpUREGFに形質転換してｈEGF高生産性菌株として選別された菌株である(
韓国特許出願 第97‐54925号)。
【００１５】 本発明者達は、組替え蛋白質生産ハンセヌラポリモルパから完全な形態の蛋白
質を生産するために蛋白質分解酵素欠乏変異菌株を開発しようとした。細胞内で
外来蛋白質のカルボキシ末端の分解は主にカルボキシペプチダーゼYおよびカル
ボキシペプチダーゼαにより行われ、また、カルボキシペプチダーゼYはプロチ
アーゼAにより進行(processing)されるものと知られているため(Van Den Haze
l et al．，Yeast,12，1，1996)、カルボキシペプチダーゼY、カルボキシペプ
チダーゼαとプロチアーゼAをコードする遺伝子であるPRC1、KEX1とPEP4遺伝子
をそれぞれクローニングし、クローニングされたこれら遺伝子を利用してカルボ
キシペプチダーゼY、カルボキシペプチダーゼα、プロチアーゼA欠乏変異菌株と
重複変異株をそれぞれ製造した。
【００１６】 これら変異菌株から外来蛋白質であるヒト表皮成長因子(Human epidermal g
rowth factor；ｈEGF)を発現したとき、カルボキシ末端が分解された蛋白質が
減少したことを確認することにより、本発明を完成した。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ハンセヌラポリモルパ由来のカルボキシペプチダー
ゼY、カルボキシペプチダーゼαおよびプロチアーゼAをコードする遺伝子塩基配
列を同定して提供することにある。 本発明の別の目的は、外来蛋白質生産ハンセヌラポリモルパ菌株のカルボキシ
ペプチダーゼYをコードする遺伝子PRC1、カルボキシペプチダーゼαをコードす
る遺伝子KEX1およびプロチアーゼAをコードするPEP4遺伝子がそれぞれディスラ
プションされたベクターにより外来形質転換されたカルボキシペプチダーゼＹ変
異株、カルボキシペプチダーゼα変異株およびプロチアーゼＡ変異株と共にこれ
ら蛋白質分解酵素が重複してディスラプションされた菌株を提供することにある
。 本発明のまた別の目的は、前記蛋白質分解酵素変異株を宿主細胞として利用し
てカルボキシ末端の分解が殆ど発生しない外来蛋白質生産方法を提供することに
ある。
【００１８】
【課題解決手段】
本発明の前記目的は、サカロマイセスセレビジアエカルボキシペプチダーゼＹ
遺伝子(PRC1)をPCRを利用してクローニングし、これをプローブとして利用して
ハンセヌラポリモルパDL-1の染色体を制限酵素処理してサーダンブラットを繰り
返し行うことにより、ハンセヌラポリモルパPRC1遺伝子の塩基配列を決定した後
、同じ方法でハンセヌラポリモルパのDL-1のプロチアーゼAをコードする遺伝子(
PEP4)塩基配列を決定し、ハンセヌラポリモルパKEX1遺伝子をクローニングする
ために菌株間に類似性が多い部位を基にしてプライマーを合成した後、ハンセヌ
ラポリモルパ染色体を主型としてPCRを行い、ハンセヌラポリモルパKEX1遺伝子
の断片をクローニングした後、これをプローブとして用いてPRC1と同じ方法でハ
ンセヌラポリモルパKEX1全体遺伝子をクローニングした後、ハンセヌラポリモル
パUR2菌株のPRC1とPEP4の遺伝子をそれぞれディスラプションするためにハンセ
ヌラポリモルパLEU2遺伝子をプラスミドｐHDY2、ｐHDP4にそれぞれ挿入してプラ
スミドｐHYLとｐHPLを製造し、このプラスミドｐHYLとｐHPLでハンセヌラポリモ
ルパUR2菌株を形質転換してカルボキシペプチダーゼY変異株とプロチアーゼA変
異株を得て、この変異株らのカルボキシペプチダーゼの活性を測定した後、サー
ダンブラット分析でハンセヌラポリモルパPRC1とPEP4遺伝子のディスラプション
を確認し、また、ハンセヌラポリモルパDL1菌株のKEX1遺伝子をディスラプショ
ンするためにハンセヌラポリモルパURA3遺伝子ポプアウトカセットをプラスミド
ｐKH3.9に挿入してプラスミドｐKUZを製造した後、ハンセヌラポリモルパDL1菌
株を形質転換してカルボキシペプチダーゼα変異株を得て、ハンセヌラポリモル
パURA3遺伝子がポプアウトされた菌株を選別した後、野生型菌株と前記選別した
変異菌株の染色体をゲノムサーダンブラットしてKEX1遺伝子のディスラプション
を確認することにより達成した。
【００１９】 また、ハンセヌラポリモルパDL-1菌株のPRC1、PEP4遺伝子を重複ディスラプシ
ョンするためにURA3遺伝子ポプアウトカセットをプラスミドｐHDY2とpHDP4にそ
れぞれ挿入してプラスミドｐHTUZとｐHPUZをそれぞれ製造し、KEX1遺伝子ディス
ラプションと同じ方法で形質転換とポプアウトを繰り返してプロチアーゼA/カル
ボキシペプチダーゼα変異株、プロチアーゼA/カルボキシペプチアーゼY変異株
、カルボキシペプチダーゼα/カルボキシペプチダーゼY変異株、プロチアーゼA/
カルボキシペプチダーゼα/カルボキシペプチダーゼY変異株をそれぞれ製造した
。
【００２０】 つまり本発明は、 １．ハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha)ＤＬ１（ATCC26012）由来
のカルボキシペプチダ−ゼY(Carboxypeptidase Y)をコードする配列１記載の塩
基配列を担持するPRC1遺伝子。 ２．PRC1遺伝子をディスラプトさせて、配列１のPRC1遺伝子を担持するプラスミ
ドpHDY2（KCTC0732BP)にハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha)ＬＥＵ
２遺伝子を挿入させて構築したベクターpHYL。 ３．PRC1遺伝子をディスラプトさせて、配列１のPRC1遺伝子を担持するプラスミ
ドpHDY2（KCTC0732BP)にハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha)ＵＲＡ
３遺伝子ポップアウトカセットを挿入させて構成したベクターpHYUZ。 ４．ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＵＲ２株が前項２のベク
ターpHYLによって形質転換されたカルボキシぺプチダ−ゼY変異株。 ５．ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１株が前項３のベク
ターpHYUZで形質転換されたカルボキシぺプチダ−ゼY変異株、ハンセヌラポリモ
ルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１/△ｃｐｙ（KCTC0735BP)。 ６．前項４のカルボキシぺプチダ−ゼY変異株に外来タンパク質をコードする遺
伝子を導入し、該細胞を培養培地中で培養することを含む組替えタンパク質の製
造方法。 ７．前項５のカルボキシぺプチダ−ゼY変異株に外来タンパク質をコードする遺
伝子を導入し、該細胞を培養培地中で培養することを含む組替えタンパク質の製
造方法。 ８．前項６又は７の製造方法によって生産される組換えタンパク質。 ９．プロテアーゼＡをコードする配列２の塩基配列を担持する、ハンセヌラポリ
モルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１（ATCC26012)由来のＰＥＰ４遺伝子。 １０．PEP4遺伝子をディスラプトさせて、配列２の遺伝子PEP4を担持するプラス
ミドpHDP4（KCTC0733BP)にハンセヌラポリモルパLEU2遺伝子を挿入して構築され
たベクターpHPL。 １１．PEP4遺伝子をディスラプトさせて、配列２の遺伝子PEP4を担持するプラス
ミドpHDP4（KCTC0733BP)にハンセヌラポリモルパＵＲＡ３遺伝子ポプアウトカッ
セトを挿入して構築されたベクターpHPUZ。 １２．ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＵＲ２株が前項１０の
ベクターpHPLで形質転換されたプロテアーゼＡ変異株。 １３．ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１株が前項１１の
ベクターpHPUZで形質転換されたプロテアーゼA変異株、ハンセヌラポリモルパ（
Hansenula polymorpha）ＤＬ１／△ｐｅｐ４(KCTC0734BP)。 １４．前項１２のプロテアーゼＡ変異株に外来タンパク質をコードする遺伝子を
導入し、該細胞を培養培地中で培養することを含む組替えタンパク質の製造方法
。 １５．前項１３のプロテアーゼＡ変異株に外来タンパク質をコードする遺伝子を
導入し、該細胞を培養培地中で培養することを含む組替えタンパク質の製造方法
。 １６．前項１２又は１３の製造方法によって生産される組換えタンパク質。 １７．カルボキシぺプチダ−ゼαをコードする配列３の塩基配列を担持するハン
セヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＤＬ１(ATCC2
6012)由来のＫＥＸ１遺伝子。 １８．ＫＥＸ１遺伝子をディスラプトさせて、配列３の遺伝子ＫＥＸ１を担持す
るプラスミドpKH3.9にハンセヌラポリモルパＵＲＡ３遺伝子ポプアウトカッセト
を挿入して構築されたベクターpKUZ。 １９．ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１株が前項１８の
ベクターpKUZで形質転換されたカルボキシぺプチダ−ゼα変異株、ハンセヌラポ
リモルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１／△ｋｅｘ１(KCTC0736BP)。 ２０．前項１９のカルボキシぺプチダ−ゼα変異株に外来タンパク質をコードす
る遺伝子を導入し、該細胞を培養培地中で培養することを含む組替えタンパク質
の製造方法。 ２１．前項２０の方法で生産される組換えタンパク質。 ２２．ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１株が前項３のベ
クターpHYUZ及び前項１１のベクターpHPUZで形質転換されたカルボキシぺプチダ
−ゼＹ/プロテアーゼＡ変異株。 ２３．前項２２のカルボキシぺプチダ−ゼＹ/プロテアーゼＡ変異株に外来タン
パク質をコードする遺伝子を導入し、該細胞を培養培地中で培養することを含む
組替えタンパク質の製造方法。 ２４．前項２３の方法で生産される組換えタンパク質。 ２５．ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１株が前項３のベ
クターpHYUZ及び前項１８のベクターpKUZで形質転換されたカルボキシぺプチダ
−ゼＹ/カルボキシぺプチダ−ゼα変異株。 ２６．前項２５のカルボキシぺプチダ−ゼＹ/カルボキシぺプチダ−ゼα変異株
に外来タンパク質をコードする遺伝子を導入し、該細胞を培養培地中で培養する
ことを含む組替えタンパク質の製造方法。 ２７．前項２６の方法で生産される組換えタンパク質。 ２８．組換えタンパク質が、人エピダーマルグロースファクター（hEGF)である
前項２７の組換えタンパク質。 ２９．ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１株が前項１１の
ベクターpHPUZ及び前項１８のベクターpKUZで形質転換されたプロテアーゼＡ/カ
ルボキシぺプチダ−ゼα変異株。 ３０．前項２９のプロテアーゼＡ/カルボキシぺプチダ−ゼα変異株に外来タン
パク質をコードする遺伝子を導入し、該細胞を培養培地中で培養することを含む
組替えタンパク質の製造方法。 ３１．前項３０の方法で生産される組換えタンパク質。 ３２．ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１株が前項３のベ
クターpHYUZ、前項１１のベクターpHPUZ及び前項１８のベクターpKUZで形質転換
されたカルボキシぺプチダ−ゼＹ/プロテアーゼＡ/カルボキシぺプチダ−ゼα変
異株。 ３３．前項３２のカルボキシぺプチダ−ゼＹ/プロテアーゼＡ/カルボキシぺプチ
ダ−ゼα変異株に外来タンパク質をコードする遺伝子を導入し、該細胞を培養培
地中で培養することを含む組替えタンパク質の製造方法。 ３４．前項３３の方法で生産される組換えタンパク質。 ３５．ＭＯＸプロモーターの部位とＴＲＰ３遺伝子の部位を含むＤＮＡ断片の間
に挿入されたSaccharomyces cerevisiae LEU2をハンセヌラポリモルパ（Ｈａ
ｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の選択マーカーとして担持する（mox(
p)::S.cerevisiae LEU::trp3)ベクターpMLT-delta(KCTC0727BP)。 ３６．ハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の ＭＯＸ−ＴＲＰ３ 遺伝子をディスラプトさせて、ハンセヌラポリモルパ(Hansenu
la polymorpha)に前項３５のベクターpMLT-deltaを導入させて調製したハンセ
ヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）△mox変異株。 ３７．ハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が
、ハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＤＬ１
株である前項３６のハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏ
ｒｐｈａ）△mox変異株。 ３８．ハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の ＭＯＸ−ＴＲＰ３ 遺伝子をディスラプトさせて、ハンセヌラポリモルパ(Hansenu
la polymorpha)ＤＬ１−Ｌに前項３５のベクターpMLT-deltaを導入させて調製
したハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）△mo
x変異株ＤＬＴ２（KCTC0728BP)。 ３９．前項３６〜３８の何れか一に記載のハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎ
ｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）△mox変異株が発現カセットで形質転換され、
メタノール培地中で培養され、組換えタンパク質発現宿主として機能し、該発現
カセットはその発現がメタノールで誘導されるプロモーターを含む、組換えタン
パク質の生産方法。 ４０．まずハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ
）△mox変異株を炭素源としてグリセロールを含む培地中で高濃度へ培養し、次
いで炭素源としてメタノールを含む培地中で培養する前項３９の生産方法。 ４１．前項３９又は４０の方法で生産される組換えタンパク質。 ４２．△mox変異株ＤＬＴ２のＭＯＸ遺伝子部位にインテグレートされた発現カ
セットをポッピングアウトする方法。 ４３．前項４２のポッピングアウト技術を使い種々の組換えタンパク質の生産に
一般的な使用のための宿主であって、前項３８で調製された組換えＤＬＴ２株由
来の新規変異株を調製する方法。 からなる。
【００２１】 以下、本発明の構成および作用を説明する。
【実施の態様】
【００２２】 本発明は、公知のサカロマイセスセレビジアエカルボキシペプチダーゼY遺伝
子(PRC１)を利用してクローニングし、これをプローブとして利用してハンセヌ
ラポリモルパDL-1の染色体を幾つかの制限酵素で処理した後、ゲノムサーダンハ
イブリダイゼイション(genomic southern hybridization)し、制限酵素PstIで
切断された染色体の３kb位置でPRC1遺伝子を含有するDNAバンドを確認し、プラ
スミドに挿入してライブラリを製造し、サーダンブラッツトを繰り返してハンセ
ヌラポリモルパPRC1遺伝子を含むプラスミドを選別した後、2.2kbのXhoI/PstI断
片で狭めたプラスミドｐHDY2を更に選別した後、PRC1遺伝子の塩基配列を決定す
る段階；
【００２３】 公知のサカロマイセスセレビジアエPEP4遺伝子を基にしてプライマーを合成し
た後、PCRを行い、サカロマイセスセレビジアエPEP4遺伝子をクローニングした
後、これをプローブとして利用してハンセヌラポリモルパDL‐1の染色体を幾つ
かの制限酵素で処理した後，前記PRC1クローニング方法と同じ方法でゲノムサー
ダンハイブリダイゼイションを施して制限酵素BamHIで切断された染色体の8kb位
置でPEP4遺伝子を含有するDNAバンドを確認し、プラスミドに挿入してライブラ
リを製造した後、サーダンブラットを繰り返してハンセヌラポリモルパPEP4遺伝
子をクローニングする段階；諸菌株から明かされたカルボキシペプチダ‐ゼαの
アミノ酸配列を分析して菌株間に類似性が多い部位を選別し、その部位を基にし
てプライマーを合成した後、ハンセヌラポリモルパDL‐1の染色体を主型にしてP
CRを行い、306bp大のハンセヌラポリモルパKEX1遺伝子断片をクローニングした
後、これをプローブとして利用してハンセヌラポリモルパDL-1の染色体を幾つか
の制限酵素で処理した後、ゲノムサーダンハイブリダイゼイションし、制限酵素
Hind IIIで切断された染色体の4.5kb位置でKEX1遺伝子を含有するDNAバンドを
確認し、プラスミドに挿入してライブラリを製造し、サーダンブラットを繰り返
してハンセヌラポリモルパKEX1遺伝子を含むプラスミドを選別した後、3.9kbのE
coRI/Hind III断片で狭めたプラスミドｐKH3.9を更に選別した後、KEX1遺伝子
の塩基配列を決定する段階；
【００２４】 前記クローニングされたハンセヌラポリモルパDL-1のカルボキシペプチダ‐ゼ
Y（PRC1)およびプロチアーゼA(PEP4)遺伝子を利用して染色体上のこれら遺伝子
らをディスラプションするためにハンセヌラポリモルパLEU2遺伝子をプラスミド
ｐHDY2およびｐHDP4にそれぞれ挿入してｐHYLおよびｐHPLを製造した後、プラス
ミドｐHYLとｐHPLをハンセヌラポリモルパUR2菌株(leu２，ｈEGF,PRC1,PEP4,KEX
1)に形質転換してカルボキシペプチダーゼY変異株(ｈEGF,prc1：：LEU2,PEP4，K
EX1)とプロチアーゼA変異株(ｈEGF,pep４：：LEU2,PRC1，KEX1)をそれぞれ製造
し、前記製造したカルボキシペプチアーゼY変異株とプロチアーゼA変異株のそれ
ぞれに対しカルボキシペプチダーゼYの活性を調査し、野生型菌株と前記変異株
の染色体をゲノムサーダンブラッツトして、それぞれの遺伝子がLEU2遺伝子によ
りディスラプションされたのを確認する段階；
【００２５】 KEX1、PEP4およびPRC1遺伝子を重複ディスラプションするためにハンセヌラポ
リモルパURA3遺伝子ポプアウトカセットをプラスミドｐKH3.9，ｐHDY2,ｐHDP4に
それぞれ挿入してプラスミドｐKUZ,ｐHYUZ,ｐHPUZをそれぞれ製造し、プラスミ
ドｐKUZをハンセヌラポリモルパDL-1菌株(leu２，ura3，KEX1,PEP4,PRC1)に形質
転換してカルボキシペプチダーゼα変異株(leu２，kex1：：URA3,PEP4,PRC1)ヲ製
造した後、URA3遺伝子をポプアウとして除去し、順次にｐHYUZとｐHPUZを形質転
換して、カルボキシペプチダーゼY、プロチアーゼA変異株を製造した後、野生型
菌株と変異菌株の染色体を利用してゲノムサーダンブラッテイングしてKEX1,PEP4 ,PRC1遺伝子がURA3遺伝子によりディスラプションされたのを確認する段階；お
よびカルボキシペプチダーゼYとプロチアーゼA変異菌株でｈEGFを発現させた後
、培養液を遠心分離しHPLC分析して、変異株の細胞外に分泌されたhEGFのカルボ
キシ末端が分解したか否かを確認する段階で構成される。
【００２６】 本発明で形質転換されたカルボキシペプチダーゼY、プロチアーゼA変異株およ
びカルボキシペプチダーゼα変異株は、生命工学研究所内の遺伝子銀行に寄託し
た。
【００２７】 ハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）で、組
換えタンパク質を生産するために、プロテアーゼ欠損のあるハンセヌラポリモル
パ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）変異株が開発された。最初に
、各々カルボキシぺプチダ−ゼY、カルボキシぺプチダ−ゼα、そしてプロテア
ーゼAをコードする遺伝子ＰＲＣ１、ＫＥＸ１、及びＰＥＰ４がクローニングさ
れた。これらクローン化遺伝子の取得で、カルボキシぺプチダ−ゼY欠損変異株
、カルボキシぺプチダ−ゼα欠損変異株、プロテアーゼA欠損変異株、及び多型
欠損変異株が開発された。これら変異株から生産される外来タンパク質は、それ
らのカルボキシル基末端域でアミノ酸欠損が著しく減少した。
【００２８】 本発明で、Saccharomyces cerevisiae遺伝子は、ハンセヌラポリモルパ（Han
senula polymorpha）から興味ある遺伝子をクローンするために利用できる。、
Saccharomyces cerevisiaeカルボキシぺプチダ−ゼY遺伝子（PRC1）は、PCRで
えられ、Southern blottingによるハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorp
ha）PRC1を検出するためのプローブとして使われた。
【００２９】 ハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha）DL-1のゲノムは、種々の制限
酵素で消化され、繰返しSouthern blottingに付した。その結果、ハンセヌラポ
リモルパ(Hansenula polymorpha）PRC1の塩基配列を決定した。この方法は、ハ
ンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha）DL-1のプロテアーゼAをコードす
るPEP４遺伝子の塩基配列の決定にも使われた。
【００３０】 ハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha）KEX1遺伝子のクローニングの
ために、株間で高い相同性をもつ領域をもとにプライマーを合成し、テンプレー
トとして機能するハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha）ゲノムを使い
PCRによってKEX1遺伝子の部分を増幅させた。PCR産物は、ハンセヌラポリモルパ
(Hansenula polymorpha）の全KEX1遺伝子をクローンするためにSouthern blot
tingのプローブとして使用された。
【００３１】 ハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha）LEU2遺伝子は、プラスミドpH
DY2とpHDP4に挿入され、各々プラスミドpHYLとpHPLを構築した。構築されたプラ
スミドpHYLとpHPLで、ハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha）UR2は、
各々、カルボキシぺプチダ−ゼY変異株及びプロテアーゼA変異株に形質転換され
た。これら変異株のカルボキシぺプチダ−ゼ活性の検定とSouthern blotting分
析は、ハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha）PRC1とPEP4遺伝子のデイ
スラプション(disruption)を同定した。
【００３２】 ハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha）DL１株のKEX１遺伝子をデイ
スラプトするために、プラスミドpKUZが、プラスミドpKH3.9にハンセヌラポリモ
ルパ(Hansenula polymorpha）URA3遺伝子ポップアウトカセットを挿入し構築し
、ハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha）DL1株をカルボキシぺプチダ
−ゼα変異株に形質転換するために使用した。選択はハンセヌラポリモルパ(Han
senula polymorpha）URA3遺伝子ポップアウトカセット株でなされ、そのゲノム
は、野生型ゲノムと共に、次いでKEX１遺伝子のデイスラプション(disruption)
を同定のためにSouthern blottingを行った。加えて、ハンセヌラポリモルパ(H
ansenula polymorpha）ＤＬ１株の遺伝子PRC1とPEP4の両方がデイスラプション
(disruption)されていた。この点で、ハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymo
rpha）URA3遺伝子のポップアウトカセットが、プラスミドpHDY2とpHDP4に挿入さ
れ、各々プラスミドpHTUZとpHPUZを構築した。KEX1遺伝子デイスラプション(dis
ruption)と同様に、形質転換とポッピングアウトがプロテアーゼＡ/カルボキシ
ぺプチダ−ゼα変異株、プロテアーゼA/カルボキシぺプチダ−ゼY変異株、カル
ボキシぺプチダ−ゼα/カルボキシぺプチダ−ゼY変異株、及びプロテアーゼA/カ
ルボキシぺプチダ−ゼα/カルボキシぺプチダ−ゼY変異株を調製するために繰り
返された。
【００３３】 本発明では、メタノールオキシダーゼ（メタノール消化ハンセヌラポリモルパ
(Hansenula polymorpha）のメタノール代謝の最初の酵素）をコードするMOX遺
伝子と、直ちにMOX遺伝子に隣接するTRP3遺伝子を、破壊できるベクターも構築
した。このベクターは、MOX遺伝子が破壊されている新規変異株DLT2を調製する
のに使われた。新規変異株DLT2は、メタノールの低濃度で発現誘導可能なプロモ
ーターを担持する発現カセットの助けで、興味ある組換えタンパク質をメタノー
ルの連続的な摂食なしに高い生産量で生産可能な宿主として機能する。さらに、
変異株のMOX遺伝子部位に組換えタンパク質発現カセットが挿入され、そこから
ポップアウト可能となり、それによりその変異株を興味の種々タンパク質の生産
に一般的使用の宿主に使用しうる、ポップアウト技術も開発した。
【００３４】 この発明は、各々ハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha）由来のカル
ボキシぺプチダ−ゼY、カルボキシぺプチダ−ゼα、及びプロテアーゼAをコード
する遺伝子塩基配列を提供する。又、カルボキシぺプチダ−ゼY、カルボキシぺ
プチダ−ゼα、及びプロテアーゼA、及びそれらの組合わせにおける欠損変異株
を提供する。それらは、カルボキシぺプチダ−ゼYをコードする崩壊したPRC１遺
伝子、カルボキシぺプチダ−ゼαをコードする崩壊したKEX1遺伝子、プロテアー
ゼAをコードする崩壊したPEP4遺伝子、及びこれらの組合わせを含むベクターの
使用でハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha）から形質転換されて調製
された。
【００３５】 本発明では、カルボキシル基末端の崩壊のない組換えタンパク質を生産する宿
主細胞として使用できるプロテアーゼ変異株を使って、組換えタンパク質を生産
する方法を提供する。
【００３６】 本発明では、メタノール消化能を欠きメタノールを炭素源として利用できない
ハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha）変異株が、メタノールの低濃度
での発現誘導をおこしうるプロモーターを担持する発現カセットの助けで、メタ
ノールの連続的摂食無しに組換えタンパク質を生産する高産生率宿主として使用
される。
【００３７】 本発明では、ポップアウト技術を提供する。それは、変異株のMOX遺伝子部位
に組換えタンパク質発現カセットが挿入され、そこからポップアウト可能となり
、それによりその変異株を興味の種々タンパク質の生産に一般的使用の宿主に使
用しうる。
【００３８】 以下、本発明の具体的な方法を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明の権
利範囲はこれら実施例にのみ限定されるのではない。
【００３９】
【発明の実施の形態】
実施例１ ハンセヌラポリモルパのプロテアーゼ遺伝子破壊変異体の調製 実験例１：カルボキシペプチダーゼYをコードする遺伝 子PRC1,プロチアーゼAをコードするPEP4遺伝 子およびカルボキシペプチダーゼαをコード する遺伝子KEX1の分離
【００４０】 第一段階：ハンセヌラポリモルパPRC1,PEP4,KEX1遺伝子クロ ーニングのためのプローブ製作 本段階では下記プライマー(C1,C2)を用いてサカロマイセスセレビジアエPRC1
遺伝子をクローニングした。 プライマーC1：５'−ATG AAA GCA TTC ACC AG−３' プライマーC2：５'−TTA TAA GGA GAA ACC AC−３' 即ち、前記合成
したプライマーとサカロマイセスセレビジアエ染色体を主型として94℃で30秒の
変性段階（denaturing step）55℃で30秒のアニーリング段階（annealing ste
p）、および72℃で2分の伸長段階（extending step）の条件で25サイクルのPCR
を行い、1.6kb長のサカロマイセスセレビジアエPRC1遺伝子を分離した。DIG−ラ
ベリンおよびグ検出キット(DIG-labeling and detection kit，Boehringer
Mannheim社製品)を用いて製品マニュアルによりＰＣＲ産物をラベリングしてハ
ンセヌラポリモルパのPRC1遺伝子クローニング用のプローブを製作した。
【００４１】 また、下記プライマー(P1,P2)を用いてサカロマイセスセレビジアエPEP4遺伝
子を増幅した。 プライマーP1：５'−ATG TTC AGC TTG AAA GC−３' プライマーP2：５'−TCA AAT TGC TTT GGC C−３' 即ち、サカロマイセスセレビジアエゲノムDNAから、94℃で30秒の変性段階、5
5℃で30秒のアニーリング段階、72℃で2分の伸長段階の条件で25サイクルのPCR
を行い、1.22kb長のサカロマイセスセレビジアエPEP4遺伝子を分離した。このPE
P4遺伝子を前記ハンセヌラポリモルパPRC1遺伝子クローニングと同じ方法でラベ
リングして、ハンセヌラポリモルパPEP4遺伝子クローニング用プローブを製作し
た。
【００４２】 下記プライマー(K1,K2)を用いて、ハンセヌラポリモルパKEX1遺伝子を見いだ
すためのプローブをＰＣＲにより得た。 プライマーK1：５'−TGG YTS AAC GGH CCW GGH TGY TCB TCB−３' プライマーK2：５'−WGG RAT GTA YTG WCC RGC GTA VGA CTC DCC
−３' 即ち、94℃で30秒の変性段階、50℃で30秒のアニーリング段階、72℃で30秒の
伸長段階の条件で５サイクルを、ついで94℃で30秒の変性段階、55℃で30秒のア
ニーリング段階、72℃で30秒の伸長段階の条件で加熱状態下において20サイクル
のPCRを行い、306bpのハンセヌラポリモルパKEX1遺伝子断片を増幅した。このDN
A断片は前記ハンセヌラポリモルパPRC1遺伝子クローニング用のプローブ調製と
同じ方法でラベリングしてプローブを製作した。
【００４３】 第二段階：ハンセヌラポリモルパDL-1のゲノムDNA単離 ジョンストンの方法(Yeast Genetics，molecular aspects，pp．107‐123，
IRL Press,1998)によりYEPD培地(ペプトン２％、酵母抽出物１％、葡萄糖２％)
で培養したハンセヌラポリモルパDL-1からゲノムDNAを単離した。
【００４４】 第三段階：プラスミドｐHDY2の製作 まず、ハンセヌラポリモルパのゲノムDNAからPRC1遺伝子を見いだすために、
前記第二段階で得たゲノムDNAの６アリコート(aliquot)を制限酵素BamHI,EcoRI,
EcoRV，HindIII，PstI，SalIでそれぞれ処理し、0.9％アガロースゲルで電気泳
動した後、Nytran membrane(Schleicher & Schuell社製品)にブロッティング
により移し、第一段階で製造したラベルされたプローブとハイブリダイゼーショ
ンに適した条件下でサザンブロットした。サザンブロット条件はハイブリッド液
(５×SSC, 0.1％N-lauryl sarcosine，0.02％SDS,２％blocking agent，30％
formamide)を用いて42℃で６時間反応させ、Boehringer Mannheim社の製品マニ
ュアルにより処理した。アルカリホスファターゼが結合された抗体を添加した後
、BCIPとX-phosphateを添加して青色に染色されたバンドを観察した。PstIで処
理した約３kb長のDNA断片で陽性反応が認められた。
【００４５】 青色のバンドが現れた位置のDNAを分離してプラスミドpBluescriptKS II＋に
連結した後、大腸菌DH5αに形質転換してDNAライブラリを製造した後、このDNA
ライブラリを対象としてサザンブロットを繰り返しPRC1遺伝子を含むプラスミド
を選別し、pHDY2を製造した。制限酵素Xhol/PstIを用いて二重消化（double di
gestion）により、DNAを約３kbから約2.2kbの断片に縮小した。Xhol/PstI DNA
断片を含有するプラスミドをpHDY2と呼称した。これは、韓国タイプカルチャー
コレクション(KCTC：Korean Collection of Type Culture)(所在：Korea R
esearch Institite of Bioscience and Biotechnology(KRIBB), #52,Oun-
dong,Yusong-ku,Taejon 305-333,Republic of Korea)に、２０００年２月１
８日に寄託し、受託番号KCTC 0732BPとして受託された。ハンセヌラポリモルパ
DL1 PRC1遺伝子の制限酵素地図と塩基配列決定方法は図１に示し、PRC1遺伝子
の塩基配列を決定した結果は配列１に示した。このDNA配列はGenBankにU67174(1
996．8．17)で登録した。塩基配列を分析した結果、ハンセヌラポリモルパDL1
PRC1遺伝子は1,626bp長でイントロンはなく、サカロマイセスセラビジアPCR1遺
伝子の塩基配列と54％の相同性を示す。配列１を基にして類推したハンセヌラポ
リモルパDL1 PRC1遺伝子のアミノ酸配列はサカロマイセスセラビジアエのカル
ボキシペプチダーゼYと50％の類似性を示した。また、セリンプロテアーゼ(seri
ne protease)の活性部位(active site)中で触媒基(catalytic group)として
作用するセリンであると同定された263番目のセリン残基の周辺領域でも高い類
似性を示した。
【００４６】 第四段階：プラスミドpHDP4の製作 ハンセヌラポリモルパのゲノムDNAからPEP4遺伝子を見いだすために、前記第
二段階で得たゲノムDNAの６アリコート(aliquot)を制限酵素BamHI,EcoRI,EcoRV
，HindIII，PstI，SalIでそれぞれ処理し、0.9％アガロースゲルで電気泳動した
後、Nytran membrane(Schleicher ＆ SchuelI社製品)に移し、第一段階で製
造したプローブを用いて第三段階と同じ方法でサザンブロットした。BamHIで処
理した約8kb長のDNA断片中に陽性反応である青いバンドが認められた。青色のバ
ンドが現れた位置のDNA断片を分離して第三段階と同じ方法でDNAライブラリを製
造した後、このDNAライブラリを対象としてサザンブロットを繰り返してPEP4遺
伝子を含むプラスミドpHDP3を選別した。制限酵素SacI/Hind IIIを用いて二重
消化（double digestion）により、DNA断片を約8kbから約2.0kbに縮小した。Sa
cI/Hind III DNA断片を含有するプラスミドをpHDY4と呼称した。これは、韓国
タイプカルチャーコレクション(KCTC：Korean Collection of Type Culture
)(所在：Korea Research Institite of Bioscience and Biotechnology(K
RIBB), #52,Oun-dong,Yusong-ku,Taejon 305-333,Republic of Korea)に、
２０００年２月１８日に寄託し、受託番号KCTC 0733BPとして受託された。ハン
セヌラポリモルパDL1 PEP4遺伝子の制限酵素地図と塩基配列決定方法は図２に
示し、PEP4遺伝子の塩基配列を決定した結果は配列２に示した。このDNA配列はG
enBankにU67173(1996．8．17)で登録した。塩基配列を分析した結果、ハンセヌ
ラポリモルパDL1 PEP4遺伝子は1,242bp長でイントロンはなく、サカロマイセス
セラビジアPEP4遺伝子の塩基配列と52.4％の相同性を示す。配列２を基にして類
推したハンセヌラポリモルパDL1 PEP4遺伝子のアミノ酸配列はサカロマイセス
セラビジアエのプロテアーゼAと50％の類似性を示した。また、アスパルチルプ
ロチアーゼ(aspartyl protease)の活性部位(active site)中で触媒基(catalyt
ic group)として作用するアスパラギン酸(aspartic acid)であると同定された
117番目のアミノ酸残基でも高い類似性を示した。
【００４７】 第五段階：プラスミドpKH3.9の製作 ハンセヌラポリモルパのゲノムDNAからKEX1遺伝子を見いだすために、前記第
二段階で得たゲノムDNAの６アリコート(aliquot)を制限酵素BamHI,EcoRI,RcoRV
，Hind III，PstI,SalIでそれぞれ処理し、0.9％アガロスゲルで電気泳動した
後、Nytran membrane(Schleicher ＆ Schuell社製品)に移し、第一段階で製
造したラベルされたプローブを用いてハイブリダイゼーションに適した条件下で
サザンブロットした。ハイブリダイゼーションは、組成を変更したハイブリッド 液(５×SSC, 0.1％N-lauryl sarcosine，0.02％SDS,２％blocking agent，50 ％formamide)を用いる以外は、第三段階と同じ方法で行った。Hind IIIで処理 した約4.5kb長のDNA断片中に陽性反応である青いバンドが認められた。青色のバ ンドが現れた位置のDNA断片を分離して第三段階と同じ方法でDNAライブラリを製 造した後、このDNAライブラリを対象としてサザンブロットを繰り返しKEX1遺伝 子を含むプラスミドpKH4.5を選別した。これは、韓国タイプカルチャーコレクシ ョン(KCTC：Korean Collection of Type Culture)(所在：Korea Research Institite of Bioscience and Biotechnology(KRIBB), #52,Oun-dong,Yu song-ku,Taejon 305-333,Republic of Korea)に、２０００年２月１８日に寄 託し、受託番号KCTC 0731BPとして受託された。制限酵素EcoRI/Hind IIIを用 いて二重消化（double digestion）により、DNA断片を約4.5kbから約3.9kbに縮 小した。EcoRI/Hind III DNA断片を含有するプラスミドをpKH3.9と呼称した。 ハンセヌラポリモルパDL1 KEX1遺伝子の制限酵素地図と塩基配列決定方法は図 ３に示し、KEX1遺伝子の塩基配列を決定した結果は配列３に示した。このDNA配 列はGenBankにAF090325(1998．9.4)で登録した。塩基配列を分析した結果、ハン セヌラポリモルパDL1 PEP4遺伝子は1,833bp長でイントロンはない。配列２を基 にして類推したハンセヌラポリモルパDL1 KEX1遺伝子のアミノ酸配列はサカロ マイセスセレビジアエ カルボキシペプチダーゼαと20％の低い類似性を示した 。しかし、176番目のアミノ酸残基部位は、セリンプロチアーゼ(serine protea se)の活性部位で触媒基(catalytic group)として作用するセリンであると同定 され、カルボキシペプチダ‐ゼαのみならずカルボキシぺプチダーゼYとは高い 類似性を示し、Von Heijne方法(Von Heijne，J.Mol,Biol.,173:243,1984)によ りアミノ酸配列を分析した結果、18個のアミノ酸残基からなるシグナルペプチド を含んでいた。
【００４８】 実験例２：ディスラプションされたプラスミドで変異株製造 第一段階：ディスラプションされたプラスミドpHYLの製作 クローニングされたハンセヌラポリモルパDL-1のカルボキシぺプチダーゼYの
遺伝子であるPRC1を利用して染色体上のPRC1遺伝子をディスラプションするため
に、図３から見られる通り、ハンセヌラポリモルパLEU2遺伝子がPRC1遺伝子に挿
入されたプラスミドpHYLを製造した。先ず、制限酵素EcoRIとBamHIで切断して抽
出した1.2kb大のハンセヌラポリモルパLEU2遺伝子をKlenow酵素で処理して平滑
末端になるようにした後、PRC1遺伝子の制限酵素SmaI位置に挿入してプラスミド
ｐHYLを製作した。
【００４９】 第二段階：ディスラプションされたプラスミドｐHPLの製作 ハンセヌラポリモルパDL-1のプロチアーゼAの遺伝子であるPEP4をディスラプ
ションするために、図４に示した通り、ハンセヌラポリモルパLEU2遺伝子でPEP4
遺伝子の一部分を置換したプラスミドｐHPLを製造した。先ず、PEP4遺伝子を制
限酵素EcoRVで処理して1.05kbのPEP4遺伝子断片を除去した後、制限酵素EcoRIと
BamHIで切断して抽出した1.2kb大のハンセヌラポリモルパLRU2遺伝子をKlenow酵
素で処理して平滑末端になるようにした後、交替してプラスミドｐHPLを製作し
た。
【００５０】 第三段階：ディスラプションされたプラスミドｐKUZ,ｐHYUZ,ｐHPUZの製作 クローニングされたハンセヌラポリモルパDL-1のKEX1遺伝子をディスラプショ
ンするために、図６に示した通り、ハンセヌラポリモルパURA3遺伝子を選択遺伝
子として繰り返し使用するためのポプアウトカセット(pop‐aut cassette)を製
造した。先ず、プラスミドpUC19から回収した211bpのBamHI/PvuII LacZ遺伝子
断片を1，323bp大のハンセヌラポリモルパURA3遺伝子の両端に同じ方向になるよ
うに連結してポプアウトプラスミドpLacUR3を製造した。プラスミドpKH3.9をSma
IとEcoRIで処理してプロモーターとコード部位を一部含む1，184bp断片を除去し
、プラスミドpLacUR3をPvuIIとEcoRIで処理して得た211bp大のLacZ遺伝子ダイレ
クトリピート(direct repeats)を含む1，735bp大のハンセヌラポリモルパURA3
遺伝子に交替してプラスミドpKUZを製造し、プラスミドpHDY2をSmaIとEcoRIで処
理してこーデイング部位を含む1，055bp断片を除去し、プラスミドpLacUR3をPvuI IとEcoRIで処理して得た1，735bp大のハンセヌラポリモルパURA3遺伝子に交替し
てプラスミドpHYUZを製造し、プラスミドpHDP4をXhoIとEcoRVで処理してコード
部位を含む303bp断片を除去し、プラスミドpLacUR3をPvuIIとSalIで処理して得
た1，800bp大のハンセヌラポリモルパURA3遺伝子に交替してプラスミドpHPUZを
製造した。先ず、プラスミドpKUZをハンセヌラポリモルパDL-1菌株(leu２，ura
３，KEX1,PEP4，PRC1)に形質転換してカルボキシペプチダーゼα変異株(leu2，k
ex1：：URA3,PEP4,PRC1)を製造した後、５‐フルオロオロト酸(５‐Fluorooroti
c acid)が0.1％含まれた最小交替培地(0.7％アミノ酸が欠乏された酵母基質(YN
B)、２％葡萄糖、0.1％５‐フルオロオロト酸、ウラシル(Urasil)50μg/ml，ロ
イシン(leucine)50μg/ml，２％アガ)で72時間以上培養してハンセヌラポリモル
パURA3遺伝子がポプアウトされた菌株(leu2，ura3,kex1:：LacZ,PEP4,PRC1)を選
別し、この菌株をプラスミドpHYUZに形質転換してカルボキシペプチダーゼα/カ
ルボキシぺプチダーゼY変異株(leu２，kex１：：LacZ,prc１：：LacZ,prc1::URA
3,pep4)を製造した。この菌株を更に５‐フルオロオロト酸が0.1％含まれた最小
交替培地でURA3遺伝子がポプアウトされた菌株(leu2,ura3,kex1::LacZ,prc1::La
cZ,PEP4)を選別し、プラスミドpHPUZを用いて前記の如き方法でカルボキシペプ
チダーゼα/カルボキシペプチダーゼY/プロチアーゼA変異株(leu2,ura3,kex1::L
acZ,prc::LacZ,pep::LacZ)を製造した。また、プラスミドpHYUZとpHPUZを用いて
カルボキシペプチダーゼY/プロチアーゼA変異株(leu2,ura3,prc1::LacZ,pep4::L
acZ,kex1)を、プラスミドpKUZとpHPUZを用いてカルボキシペプチダーゼα/プロ
チアーゼA変異株(leu2,ura3,kex1::LacZ,pep4::LacZ,PRC1)をそれぞれ製造した
。
【００５１】 第四段階：形質転換 ハンセヌラポリモルパの形質転換はリチウム酢酸法により行った。即ち、ハン
セヌラポリモルパhEGF高生産菌株であるUR２(leu２)菌株をYEPD液体培地(ペプト
ン2%,酵母抽出物1%,葡萄糖2%)でOD600＝0.5まで培養し、細胞を回収してLiTE溶
液(0.1M Tris-CI,ｐH8.0,10mM EDTA,10mM LiAc,ｐH7.5)で洗浄した。更に、1
/100体積のLiTE溶液に懸濁してコンペテント細胞(competent cell)を製造した
。100μlのコンペテント細胞に0.5μgのプラスミド運搬DNAとして作用する10μg
の鮭精子DNAと0.6mlのPEG/LiAc溶液(40%PEG400,0.1M Tris-CI,pH8.0,10mM EDT
A,10M LiAc,pH7.5)を添加し30℃で30分間放置した。70μlのDMSO溶液を添加し4
2℃で15分間反応後、氷で急速に冷却し、細胞を回収して最小交替培地(0.67%ア
ミノ酸が欠乏した酵母基質、２%葡萄糖、２%アガ)で37℃で72時間培養した。プ
ラスミドpHPLは制限酵素XhoI/PstIdeで処理して選形化し、プラスミドpHPLは制
限酵素Hind III/NcoIで、pKUZはXhoIで、pHYUZはXhoI/PstIで、pHPUZはSpeI/Sn
aBIで選形化して形質転換に用いた。
【００５２】 実施例３：カルボキシペプチダ−ゼY変異株、プロチア−ゼA 変異株のカルボキシペプチアーゼY活性度測定およ び前記菌株から生成されたhEGF分析 第一段階：カルボキシペプチダ−ゼY,プロチア−ゼA変異株の カルボキしペプチダ−ゼY活性度測定 ジメルホルムアミド(Dimethylformamide)に2.5mg/mlで溶かしたN−ベンジョイ
ル−L−チロシン−P−ニトロアニリド(N−benzoyl−L−tyrosine−P−nitroanil
ide)と0.1MTris−HCl(pH7.5)を1:4で混った溶液を96ウェルマイクロタイタ−プ
レ−ト(96Wel microtiterplate)に0.2mlずつ分株した後、それぞれのウェルに
実施例２で得た形質転換体らを接種して37℃で16時間放置した。カルボキシペプ
チダ−ゼの活性がある細胞の溶液は黄色を帯び、活性がない細胞の溶液は無色に
近いため、450nmで吸光度を測定してPRC1遺伝子が効果的にディスラプションさ
れた菌株を選別した。また、プロチア−ゼA変異菌株ではカルボキシペプチダ−
ゼYのプロセツシングが阻害されるため、カルボキシペプチダ−ゼの活性を測定
することによりPEP４遺伝子がディスラプションされた菌株を選別した。表１に
示した通り、カルボキシペプチダ−ゼY変異菌株でカルボキシペプチダ−ゼの活
性は殆ど現われなく、プロチア−ゼA変異菌株ではカルボキシペプチダ−ゼの活
性が60%以上減少した。これにより本発明者達がクロ−ニングしたPRC１とPEP４
遺伝子がハンセヌラポリモルパカルボキシペプチダ−ゼY,プロチア−ゼAをコ−
デイングする遺伝子であるのを確認し、PRC１とPEP４遺伝子がディスラプション
された菌株でカルボキシペプチダ−ゼの活性が著しく減少したのを確認した。
【００５３】
【表１】カルボキシペプチダ−ゼY変異株でのカルボキシペプチダ−ゼの活性 ┌──────────┬──────────┬────────────┐ │ 菌株 │ Genotipe │カルボキシペプチダーゼA │ │ │ │ 活性(Abs) │ ├──────────┼──────────┼────────────┤ │ハンセヌラポリモルパ│ │ │ │UR2 │leu2,PEP4,PRC1,hEGF │ 2.97 │ ├──────────┼──────────┼────────────┤ │PEP4変異株 │pep4::LEU2,PRC1,hEGF│ 1.00 │ ├──────────┼──────────┼────────────┤ │PRC1変異株 │prc1::LEU2,PEP4,hEGF│ 0.10 │ └──────────┴──────────┴────────────┘
【００５４】 第二段階：サ−ダンブラシトにようるディスラプション確認 ハンセヌラポリモルパLEU２遺伝子によるハンセヌラポリモルパPRC１とPEP４
遺伝子のディスラプションおよびハンセヌラポリモルパURA３遺伝子によるハン
セヌラポリモルパKEX１遺伝子のディスラプションを確認するためにサ−ダンブ
ラツトを行った。実施例２の第四段階で選別した形質転換体それぞれをYEPD培地
に接種して37℃で18〜20時間震湯培養した後、遠心分離して細胞を回収し、1.5m
lチュブに移した。細胞をSTES溶液(0.5M NaCI,0.01M Edta,１% SDS in 0.2
M Tris‐C１,pH7.6)30μlに懸濁し、直径0.4mmのガラス玉を0.8体積程添加した
後、５分間攪拌し、TR緩衝液(１mM EDTA in 10mM Tris‐C１,pH8.0)200μl
とフェノ−ル/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)200μlを添加して2
分間攪拌した後、12,000rpmで遠心分離した。上澄液に2.5倍体積のエタノールを
添加してゲノム遺伝子を沈殿させて乾燥した。ゲノム遺伝子2〜3μgを蒸留水50
μlに溶かし、PRC1ディスラプション菌株のゲノム遺伝子は制限酵素EcoRIで処理
し、PEP4ディスラプション菌株のゲノム遺伝子は制限酵素EcoRVで処理し、KEX1
ディスラプション菌株のゲノム遺伝子はXhoIで処理した後、0.8％アガロスゲル
で電気泳動した。図4,図6,図7に示したPRC1、PEP4、KEX1遺伝子をプローブとし
て用いサザンブロットしてバンドを図７から確認した。カルボキシペプチダ−ゼ
Y変異株のゲノムDNAを制限酵素EcoRIで処理した場合、0.65kb大のPRC1遺伝子断
片にLEU2遺伝子が挿入されて1.85kb大に増大した。プロチアーゼA変異株のゲノ
ムDNAを制限酵素EcoRVで処理した場合、PEP4遺伝子の1.1kbのEcoRV断片をLEU2遺
伝子に交替する過程でEcoRV認識部位が除去されたため、10kb大の位置で箪一バ
ンドを確認することができた。カルボキシペプチダ−ゼα変異株のゲノムDNAをX
hoIで処理した場合、3.5kb大のKEX1遺伝子断片にURA3遺伝子が挿入されて4kb大
に増大し、ポプアウトされた菌株ではURA3遺伝子が除去されることにより2.5kb
大に小さくなるのを確認することができた。従って、PRC1、PEP4遺伝子がハンセ
ヌラポリモルパLEU2遺伝子によりディスラプションされ、KEX1遺伝子がURA3遺伝
子によりディスラプションされたのを確認した。
【００５５】 第三段階：本発明変異菌株から分泌されたhEGFの分析 YP-メタノール培地(酵母抽出物１％、ペプトン２％、メタノール２％)から発
現分泌されたhEGFの分析のために培養液を遠心分離して上澄液を分離した。分離
された培養上澄液はセプ‐パクカートリッジ(Sep-Paku Cartridge,C18,Waters,
Millipore社)による部分精製を経てHPLCで分析した。セプ‐パク部分精製はそれ
ぞれ10mlずつの水、メタノール、0.1％トリフロロアセト酸、20％アセトニトリ
ル/0.1％トリフロロアセト酸で処理して活性化されたセプ‐パクカートリッジに
20％アセトニトリル、0.1％トリフロロアセト酸になるように調整された培養上
澄液を通過させて蛋白質を吸着させた後、20％アセトニトリル、0.1％トリフロ
ロアセト酸でカートリッジを洗浄して不純物を除去した。吸着されたhEGFは1ml
の50％アセトニトリル、0.1％トリフロロアセト酸で3回に亘って抽出した。hEGF
を含む抽出液は凍結乾燥して濃縮した。部分精製された試料は逆相HPLC(Beckman
Model 126System)を利用して分析し、試料の分離のためのコラムは4.6x250mm
、5μm‐C4コラム(Vydac社)を用いた。移動相の流速は0.8ml/分であり、35分間2
0％アセトニトリル、0.1％トリフロロアセト酸から60％アセトニトリル、0.1％
トリフロロアセト酸に濃度を増加させて分離した。この際、試料の分離度は215n
mで吸光度を測定した。HPLCから分離された試料はhEGFを含んでいるピークを確
認するために各ピークの分画を採取した後、ELISAを行った。採取した試料を抗
原コーテイング緩衝液(0.1M sodium carbonate buffer pH9.6)に適宜に希釈
して希釈液100μlずつマイクロタイタープレートウェル(Nunc-immunomodule)に
入れて37℃で2時間反応させた。ウェルをPBSTで洗浄した後、PBSに0.05％に溶か
したゼラチンをウェル当たり100μlずつ入れて37℃で1時間反応させた。前記ウ
ェルをPBSTで洗浄し、hEGFの箪一クローン抗体(monoclonal antibody：UBI ＃
05‐109)を0.05％ゼラチンが入っているPBS溶液に1:10,000の比率で希釈してウ
ェル当たり100μlずつ入れて37℃で2時間反応させた後、更にPBSTで洗浄し、こ
れに西洋わさびパーオキシダーゼが結合された２次抗体(Horse radish peroxi
dase conjugated goat anti‐mouse IgG：Bio-Rad社)を0.05％ゼラチンが入
っているPBS溶液に１：3,000の比率に希釈してウェル当たり100μlずつ入れて37
℃で1時間反応させた後、PBSTで洗浄して発色させた。発色はPierce社のパーオ
キシダーゼ反応基質であるTMB基質キット(Substrate Kit)を用いたが、0.04％T
MB(3,3',5,5'tetramethyl Benzidine)とシトロ酸緩衝液に0.02％で希釈した過
酸化水素を1：1で混合してウェル当たり100μlずつ入れた後、約15分後に2M硫酸
を100μlずつ入れて反応を停止させた。発色させた後の定量は96‐ウェルプレー
トオートリーダー(96‐well plate autoreader：THERMO max,Molecular Dev
ices,USA)を用いて450nmで吸光度を測定し、定量のための標準hEGF試料(recombi
nant hEGF:UBI ＃01‐107)は0.25ng/ウェルから5ngウェルまでそれぞれ希釈し
て反応させた。実験結果、二つの分画が発現されたｈEGFを含んでいたため、こ
れらの定性分析のために採取した分画を凍結乾燥した。二つの形態のhEGFに対し
基礎科学支援研究所にN-末端アミノ酸配列分析と分子量分析を依頼した。分析結
果、二つのピークがｈEGFの活性があるものと現れ、二つのピークのうち比較的
に親水性を示すピークはMALDI-Mass分析結果、分子量が6,205であったため、53
個のアミノ酸からなる完全なｈEGFであり、より高いアセトニトリル濃度で溶出
される完全なｈEGFよりは疎水性を帯びるピークのｈEGFは分子量が6.053と測定
されて、52個のアミノ酸からなるものと確認された。この二つのｈEGFはN-末端
アミノ酸配列分析結果、全てAsn-Ser-Asp-Ser-Glu-から成っているため、シグナ
ルペプチドからKEX2により正確に分離された。これから52個のアミノ酸でなるｈ
EGFはC-末端のアミノ酸一つが遊離して形成されたものであるのが分かり、これ
はC-末端のアミノ酸配列がArg-Leu-Glu-Trp-trpであるため、53個アミノ酸の完
全なｈEGFからアルギニンが遊離して52個アミノ酸のｈEGFになると、より強い疎
水性を示すのが分かった。 前記分析によりHPLCピークに対する情報を確認した
後、ハンセヌラポリモルパUR2菌株と蛋白質分解酵素欠乏菌株から分泌されたｈE
GFの組成を比較すると、プロチアーゼA変異菌株から発現されたｈEGFはUR2から
発現されたｈEGFと比較するとき、全体的な生産量が減少し、カルボキシ末端の
分解程度も大きい変化を確認することができなかった。反面に、カルボキシペプ
チダーゼY変異菌株ではカルボキシペプチダーゼYディスラプション効果を確認す
ることができた。UR2菌株から分泌されたｈEGFのうちカルボキシ末端が分解され
なかった完全な形態の53個のアミノ酸で構成されたｈEGFは37％であるが、カル
ボキシペプチダーゼY変異菌株では53個のアミノ酸で構成されたｈEGFの比率が57 ％に増加した。
【００５６】 実施例２ メタノールオキシダーゼ(MOX)遺伝子をディスラプションしたハンセヌラポリ
モルパ変異株の調製 実験例１：MOX-TRP3遺伝子のディスラプションするためのpMLT-deltaベクターの
構築
【００５７】 The conversion of various yeasts, including Sacchromyces cerevisiae, int
o mutant strains in which particular genes are disrupted, is generally a
ccomplished by selecting the transformants in which introduced selective
marker cassettes are inserted into the genomes through the homologous d
ouble crossover at the sites of genes of interest (Rothstein, Meth. Enzy
mol. 101:202 (1983)). On the other hand, the introduced selective marke
r cassettes are inserted, for most part, into non-specific sites of the
genome of Hansenula polymorpha through nonhomologous recombination. Acc
ordingly, only a very low efficiency is imposed on the success in the pr
eparation of a _mox mutant Hansenula polymorpha strain in which a select
ive marker cassette is inserted into the genome through homologous doubl
e crossover at a site of the MOX gene to disrupt the MOX gene. In order to facilitate a _mox mutant Hansenula polymorpha strain whose M
OX gene is disrupted, the MOX gene and the TRP3 gene, which is immediate
ly adjacent to the MOX gene, were both disrupted on the basis of the pre
vious research result of the present inventors (Agaphonov et al., Yeast
11:1241 (1995)), which discloses that the TRP gene (Reid G. A., Nucl. Ac
ids Res. 16, 6236) can be disrupted to the extent of 2% by homologous re
combination and an expression cassette carrying a MOX promoter and a DNA
segment of the TRP3 gene can be inserted into the genome through the ho
mologous recombination at MOX promoter and TRP3 gene sites to select TRP
+ transformants. To this end, first, a well known vector pSM1 (Agaphono
v et al., Yeast 11:1241 (1995)) was digested with Eco47III/EcoRV to dele
te a 2.5 kb DNA fragment comprising a portion of a MOX promoter, a whole
urokinase gene, and a portion of a TRP3 gene. Separately, a well known
vector YEp13 (Broach et al., Gene 8, 121 (1979)) was digested with HpaI
/SalI to excise a 2 kb DNA fragment which carried a LEU2 gene derived fr
om Saccharomyces. Replacing the deleted 2.5 kb DNA fragment, the obtain
ed 2 kb DNA fragment was ligated to the linearized pSM1 vector to constr
uct vector pMLT-delta which is capable of disrupting a MOX gene and a TR
P gene at once. This construction scheme is illustrated in Fig. 10. As
shown in Fig. 10, pMLT-delta has as a selective maker for Hansenula pol
ymorpha a S. cerevisiae LEU2 gene which is flanked with a portion of a M
OX promoter and a portion of a TRP3 gene (mox(p)::S. cerevisiae LEU2::tr
p3). E. coli DH5α harboring the vector pMLT-delta useful to disrupt MOX-TRP
3 genes was deposited in the Korean Collection for Type Culture of Korea
Research Institute of Bioscience and Biotechnology under the Accession
No. KCTC 0727BP on Feb. 10, 2000.
【００５８】 実験例２： 新規 mox Mutant DLT2の構築および特徴 As a mother strain for the preparation of a MOX-TRP3 gene-disrupted muta
nt, there was employed DL1-L (leu2), a leu-auxotrophic Hansenula polymor
pha DL-1 (ATCC 26012)-derived mutant. The vector pMLT-delta obtained above was cut with restriction enzymes Xh
oI and SacI and introduced, according to the Hill method (Hill et al., N
ucl. Acids Res. 19: 5791(1991)) into Hansenula polymorpha DL1-L(leu2) wh
ich was, then, cultured on a tryptophane-containing minimal solid medium
(2% glucose, 0.67% amino acid-deficient yeast base, 20 mg/L tryptophane
) to primarily select LEU+ transformants. With the aim of selecting a t
rp-, mox- transformants (Fig. 11) in which the introduced mox(p)::S. cer
evisiae LEU2::trp3 cassette was inserted into the MOX promoter and TRP3
gene site through homologous recombination, an observation was made whet
her these LEU+ transformants could be grown on a tryptophane-deficient m
edium containing methanol as a sole carbon source. Through the Southern
blotting using a MOX promoter and a TRP3 gene fragment as probes, the s
elected trp-, mox- transformants were investigated as to whether a major
part of the MOX gene and a portion of the TRP3 gene on their genome wer
e distrupted. The finally selected mutant was called DLT2 (leu2 mox trp
::LEU2). Because DLT2 cannot produce methanol oxidase any more owing to
the disruption of the MOX gene on the genome, its consumption rate of m
ethanol is greatly reduced compared with MOX wild type DL1-L¢s, making
it virtually impossible for DLT2 to grow in the medium containing methan
ol as a sole carbon source, as apparent from the results of Figs. 12A an
d 12B. In addition, the mutant cannot be grown in tryptophane-deficient
media or YPD medium (2% glucose, 2% peptone, 1% yeast extract) on accou
nt of TRP3 gene distruption, as seen in Figs. 12C, 12D and 12E. This _mox mutant DLT2 was deposited in the Korean Collection for Type Cu
lture of Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology under
the accession No. KCTC 0728BP on Feb. 10, 2000.
【００５９】 実験例３：DLT2のMOX遺伝子領域への発現ベクターの挿入並びにそれからのポッ
プアウト（ Pop-Out） Hansenula polymorpha is transformed mainly through nonhomologous recombi
nation, so that most of the introduced expression vectors are inserted i
nto non-specific sites on the genome. However, in the event that an exp
ression cassette which comprised a MOX promoter and a portion of a TRP3
gene at its opposite ends respectively was introduced into the DLT2 host
, which is of _mox as well as _trp, there could be obtained TRP+ transfo
rmants as a result of the homologous recombination at the MOX promoter a
nd TRP3 gene site on the genome. That is, the transformants in which th
e expression cassette was inserted into the MOX gene site (Fig. 13A) cou
ld be selected with relative ease. Furthermore, where the inserted expression vector would be popped out la
ter, the vector pMLT-delta cut with XhoI and SacI, which had been used f
or the preparation of DLT2 in the above experiment 2, was introduced aga
in into the recombinant DLT2 strain to select LEU+ transformants. Ident
ification as to whether the transformants were of mox-, trp- phenotype a
nd expressed preexisting recombinant proteins assured the removal of the
preexisting recombinant expression vector from the genome through the h
omologous recombination, as illustrated in Fig. 13B. By this technique, a DLT2 transformant harboring an old expression vector could be returne
d to its original DLT2, which was thus ready to adopt a new expression v
ector comprising a MOX promoter and a portion of a TRP3 gene at its MOX
site. In addition, a 3.5 kb DNA fragment comprising a MOX gene and a TRP3 gene
was obtained by cutting pMOX3616 (KRIBB report BSKG 1050-885-3) with re
striction enzymes PstI/XbaI and introduced into DLT2 transformants. Of
them, the transformant that rapidly grew on a synthetic medium supplemen
ted with methanol and leucine was selected. That is, the preexisting ex
pression vector inserted into the MOX gene was popped out to revive the
MOX gene, which led to the conversion of the DLT2 transformant into a MO
X+ strain, as illustrated in Fig. 13C. Consequently, after DLT2 transformants are mutated, the previously inse
rted expression vectors can be removed and replaced with new expression
vectors on the host genomes. Alternatively, mutants of desired phenotyp
es can be prepared under the background of MOX+ wild type. Therefore, t
he pop-out technique for expression vectors inserted into host genomes a
llows previously developed mutant strains to be used as hosts for produc
ing various recombinant proteins.
【００６０】 実験例４：MOX野生型(Wild Type)と △mox変異体での組換えタンパク質発現効率
の比較 To compare the recombinant protein expression efficiency of a MOX wild t
ype with that of a _mox mutant strain, DL1-L was used as the MOX wild ty
pe while the DLT2, prepared in the above experiment 2, was selected for
the mutant strain. The recombinant protein of interest was human urinar
y plasminogen kinase (u-PA), simply called urokinase. Into the MOX gene
site of the DLT2 strain (leu2 mox-trp3::ScLEU2), vector pSM1 (Agaphonov
et al., Yeast 11: 1241 (1995)) carrying a u-PA expression cassette in w
hich a u-PA gene is linked to a MOX promoter, was introduced to obtain a
_mox transformant which could express u-PA. On the other hand, a MOX t
ransformant capable of expressing u-PA was prepared by introducing vecto
r pKSM8 (Agaphonov et al., unpublished result), which carries the same u
-PA expression cassette, but uses HLEU2-d (Agaphonov et al., Yeast 15: 5
41 (1999)) as a selective marker, into DL1-L(leu2) and selecting a LEU+
transformant. After being cultured in YPD medium (yeast extract 1%, bacto-peptone 2%,
dextrose 2%) for 18 hours, the transformants selected were inoculated i
nto IM medium (yeast extract 1%, bacto-peptone 3%, methanol 2%) at an am
ount of 17 % and cultured for 70 hours with shaking. The u-PA secreted
into cell cultures was analyzed for activity with the aid of fibrin plat
es in accordance with the Astrup method (Astrup et al., Arch. Biochem. B
iophys. 40: 346 (1952)). Because the _mox transformant grows at a lower
rate in IM medium containing methanol as a main carbon source than does
the MOX transformant, the u-PA activity of cell cultures obtained after
70 hours of the cultivation was calibrated against the total amount of
cell proteins and expressed as IU per mg of total cell protein (IU/mg of
t.c.p.). The results are given in Table 2, below. As apparent from th
e data of Table 2, the u-PA expression efficiency of the _mox transforma
nt is four times as much as that of the MOX transformant, demonstrating
that the DLT2 strain is excellent as a u-PA producing host.
【００６１】
【表２】ハンセヌラポリモルパMOX 野生型(DL1-L)と Δmox 変異体 (DLT2)をフ
ラスコ中で振盪培養した後のウロキナーゼの発現効率 ┌──┬────┬────┬──────────┬─────────┐ │番号│MOX │U-PA活性│ 比活性 │平均値 │ │ │の状態 │(IU/ml) │ (IU/mg of t.c.p.) │(IU/mg of t.c.p.) │ ├──┼────┼────┼──────────┼─────────┤ │１ │ MOX │ １９ │ ６．８ │７．６ │ ├──┤ ├────┼──────────┤ │ │２ │ │ ２５ │ ９．２ │ │ ├──┤ ├────┼──────────┤ │ │３ │ │ ２２ │ ６．９ │ │ ├──┼────┼────┼──────────┼─────────┤ │４ │Δmox │ ２８ │ ２８ │２９．６ │ ├──┤ ├────┼──────────┤ │ │５ │ │ １８ │ ２３ │ │ ├──┤ ├────┼──────────┤ │ │６ │ │ ２９ │ ３６ │ │ ├──┤ ├────┼──────────┤ │ │７ │ │ ２５ │ ３４ │ │ ├──┤ ├────┼──────────┤ │ │８ │ │ ２６ │ ２７ │ │ └──┴────┴────┴──────────┴─────────┘
【００６２】 実験例５：組換えアルブミンの Δmox 変異体 DLT2での産生 Using human serum albumin(HSA), comparison was also conducted for the r
ecombinant expression efficiency between a MOX wild type and a _mox tran
sformant. For this, there was first constructed a recombinant albumin e
xpression cassette in which a gene coding for human serum albumin was in
serted between a MOX promoter and a TRP3 gene fragment. By introducing
the albumin cassette into a MOX gene site of the _mox mutant DLT2, a tra
nsformant DLT2/HSA was prepared (Kang et al., unpublished) and deposited
in the Korean Collection for Type Culture of the Korea Research Institu
te of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) under the accession number KC
TC 0740BP on March 2, 2000. As a transformant in which the albumin expr
ession cassette was introduced into a MOX gene site of the MOX wild type
, there was employed DL1-l/T7 which had been prepared in previous resear
ch (Korean Pat. Appl¢n No. 133190). These transformants were seed-cult
ured for 16-20 hours in YPG medium (yeast extract 1%, bacto-peptone 2%,
glycerol 2%) and then, cultured for 72 hours with shaking in 250 ml baff
led flasks containing expression-inducing YPM medium (yeast extract 1%,
bacto-peptone 2%, methanol 2%). As for albumin quantification, the albu
min secreted into the cell cultures was measured by Western blotting (Ka
ng et al., J. Microbiol. Biotechnol. 8, 42 (1998)) while the intensity o
f appearing bands was read with the aid of a densitometer (Bio-Rad, Mode
l GS-700). Because the _mox mutant DLT2 hardly grows in YPM medium which use methan
ol as a sole carbon source as described in the above experiments 2 and 4
, the transformants were cultured in two steps for comparison. In detai
l, the transformants were first cultured in 50 ml of YPG medium suppleme
nted with glycerol and then, the total cells harvested by centrifugation
were inoculated at a high density into 25 ml of YPM medium. Under the
culturing condition of such methanol medium, the inocula did not grow fu
rther, but the albumin production continued to be conducted by virtue of
the presence of the MOX promoter. As for the _mox transformant DL1-L/H
SA, it produced albumin at an amount of about 120 mg/L when being cultur
ed in 2% methanol-containing YPM medium in flask, as shown in Fig. 14.
This was about twice greater than the albumin amount produced when the M
OX transformant DL1-L/T7 was cultured at a high density, indicating the
possibility that the _mox strain might be more productive of recombinant
proteins than might the MOX wild type even when being cultured at a hig
h density in a large-scale fermentation bath for the mass production of
recombinant proteins. Particularly, when the methanol concentration was
lowered to 0.5%, the albumin production of DLT2/HSA was increased rathe
r than decreased, whereas DL1-L/T7 was greatly degraded in albumin expre
ssion efficiency because the methanol was rapidly consumed as a carbon s
ource. Therefore, the _mox strain has another advance over the MOX wild
type in that recombinant proteins can be obtained at high efficiency wi
thout continuously feeding methanol and the fermentation process is rela
tively simple.
【００６３】 実験例６：新規変異株を多種の組換えタンパク質を製造することに一般的に使用
するための宿主として開発するためのポップアウト技術(pop-out technique)の
使用 The plasmid shuffling technique to facilitate the removal of the express
ion vector from the host cell has been well developed in the traditional
yeast S. cerevisiae, where most expression cassettes were retained in a
n episomal vector capable of extrachromosomal replication (Boeke et al.,
Meth. Enzymol. 154, 164, 1987). The technique provides the S. cerevisi
ae expression system with a powerful means to allow mutant strains, deri
ved from a parental recombinant strain, to be developed as useful host s
trains for general in producing various heterologous proteins. A recomb
inant S. cerevisiae, strain expressing a reporter protein, which can be
easily analyzed, can be mutagenized and screened for the desired phenoty
pe such as super-secretion. After removal of the pre-existent expressio
n vector from the obtained mutants strain of S. cerevisiae, another expr
ession vector can be introduced into the mutants strains to express othe
r recombinant proteins. By contrast, this kind of procedure has been un
able to be carried out in the H. polymorpha system mainly due to the non
-specific integration of expression vector into the host chromosomal DNA
. However, the present invention of DLT2 provides the H. polymorpha syste
m with the pop-out technique in which a recombinant protein expression c
assette integrated into the host chromosome can be efficiently popped ou
t therefrom, as shown in the above experiment 3. The activity of U-PA c
an be also easily analyzed by the plate assay. Therefore, using the rec
ombinant DLT2/u-PA (leu2 mox-trp3::u-PA) expressing u-PA as the parental
strain, which was constructed in the above experiment 4, we carried out
the experiment to isolate super-secretion mutant strains therefrom and
to develop the obtained mutant strains as the general host strains for t
he production of other recombinant proteins (Fig. 15). To obtain mutant
strains with the increased secretion capacity, the recombinant DLT2/u-P
A was undergone with the mutagenesis caused by the chemical mutagen, eth
yl methane sulfonate (EMS). After incubation in 3.5% EMS solution for 3
0 min and subsequent neutralization with 6 % thiosulfate nitrium, the mu
tagenized cells were plated into the fibrin plate (Agaphonov et al., Yea
st 15, 541, 1999) and compared with the parental strain DLT2/u-PA for th
e secretion capacity of u-PA. Among several super-secretion mutants sho
wing at least more than two-fold improved secretion, a mutant named DLT-
90-20/u-PA (leu2 mox-trp3::u-PA opu90-20) with the three-fold improvemen
t in the u-PA secretion was chosen to be developed as the general host s
train for the production of other heterologous proteins. As described i
n the Figure 13B of the above experiment 3, the XhoI/SacI truncated pMLT
-delta was reintroduced into the DLT-90-20/u-PA mutant strain for the se
lection of LEU+ transformants. Subsequently, the mox-, trp- transforman
ts were selected therefrom and the pop-out of the u-PA expression casset
te was confirmed on the fibrin plate. In this procedure, the DLT90-20 m
utant strain was converted to have the MOX-TRP3 genes disrupted with the
ScLEU2 cassette like the original strain DLT2. To exploit the obtained
super-secretion mutant DLT90-20 (leu2 mox-trp3::ScLEU2 opu90-20) as the
host for the production of other recombinant proteins, the HSA expressi
on cassette was inserted into the MOX gene site of DLT90-20 according to
the procedure explained in the above experiment 5. The resultant recom
binant strain DLT90-20/HSA was compared with the DLT2/HSA, which was con
structed in the above experiment 5, for the production capacity of HSA. The DLT90-20/HSA strain showed 150% improvement in the HSA secretion t
han the DLT2/HSA, indicating that the super-secretion mutant 90-20 is al
so useful for the production of HSA. The present result demonstrates th
at another major advantage of the DLT2 strain in the present invention o
ver the previous host strains of H. polymorpha is the feasibility of pop
-out technique, which allows the obtained novel mutant strains to be uti
lized as a general host strain for the production of various recombinant
proteins in the H. polymorpha expression system.
【００６４】
【発明の効果】
以上、前記実施例により説明した通り、カルボキシペプチダーゼYをコードす
る遺伝子PRC1とプロチアーゼAをコードする遺伝子PEP4およびカルボキシペプチ
ダーゼαをコードする遺伝子KEX1をディスラプションした遺伝子で形質転換され
たカルボキシペプチアーゼY変異菌株、プロチアーゼA変異菌株およびカルボキシ
ペプチダーゼα変異菌株のうち、カルボキシペプチダーゼY変異菌株は野生菌株
に比べて外来蛋白質であるｈEGFのカルボキシ末端分解能力を40％以上減少させ
、カルボキシペプチダーゼα遺伝子が追加にディスラプションされた菌株ではカ
ルボキシ末端分解効果をより向上させることができる効果があり、プロチアーゼ
A変異菌株はｈEGFのカルボキシ末端分解低下能力はないが、他の外来蛋白質の場
合、カルボキシ末端分解低下効果を期待することができる優れた効果があり、ま
た、ハンセヌラポリモルパ由来の分泌シグナルペプチドとして使用可能な効果が
あるため、本発明は医薬産業上非常に有用な発明である。
【００６５】
【配列表】
SEQUENCE LISTING <110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Dong Kook Pharmaceutical Co. LEE, Sangki CHOI, Euisung KANG, Hyunah SOHN, Junghoon BAE, Junghoon KIM, Moowoong AG
APHONOV, Michael KIM, Myungkuk <120> Hansenula polymorpha mutants and process for the preparation of r
ecombinant proteins using the same <130> YL001103JP/PCT <150> KR 10-1999-7177 <151> 1999-03-04 <150> KR 10-2000-10743 <151> 2000-03-03 <150> PCT/KR00/00173 <151> 2000-03-04 <160> 3 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 2046 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha DL1 <400> 1 ctcgagtatg attactttgt cttaattttt atttggtgta attttttact accattttaa 60
tgacgtggtg tacgggtgtg aatacataaa cacctcagta gccatagcag ctaccatgga 120
tgatagggca cttttggaaa aggaatctga aaacaagaag aagcacggca tacggtggtc 180
aacagctcaa gaaaggccaa tgcgataaat ctcattttta tacgaacacc caccgaagcc 240
cttatcggtc ttttgacgca gcagcttaat tatctgaggc tggttatcaa tttttgcctt 300
ccagataaaa tatattttcc ctatttatat tccatccgtt tatcctaggc aatcgtccaa 360
aaaaacaaga attctgttat atttcaattc ccattatgaa gctctcgatg tctattctgg 420
ccctagtggc cactagcatt gggtcggcgc aagccgctgc catcaaaaaa gataccgcgg 480
ggcaacaccc cctcggaatg aactccaact ttggcgatgt tttcgtggag aaaggcaagt 540
ctttgctcga ccgtgtttct gaggttgtga gcgagtcgtc caagaatatt tccccagaat 600
tgagggacat ttggaatgaa atggaggcca agttcccaga taccctcaga aacatgaagc 660
tcaagtcaga gccggcagtc aaaattacaa agaaacctgc cgatttttgg gacttcaatg 720
ttctcaatga gaagttctcc aactacaagc tgagggttaa gaagaccgac ccgggagcat 780
tgggactgga ccacacaaga cagtactctg gatacttgga tgtggaggac gaagacaagc 840
atttcttcta ttggatgttt gagtccagaa atgacccggt caacgaccct gtgattctgt 900
ggctcaacgg tggtccagga tgctcttcct tgactggaat gctttttgag ctcggctctg 960
cttctatcgg tccagatctc aagccaatca acaacccata ttcgtggaat tccaatgcca 1020
ctgtgatttt ccttgaccag cctgtcaatg ttggattctc gtactcttcc aagtctgttt 1080
ctaacacggt cgcagctggt aaagacgtct atgctttctt ggagttgttc taccagcaat 1140
tcccacactt gctgaagaac gacttccaca tcgccggcga gtcgtacggt ggtcattaca 1200
tcccagtgtt tgcctccgag attctcaccc atgctgacag atctttcaac ctcacttcgg 1260
tgttgattgg taacggtttg accgacccac ttaaccagta cccattctac gagagaatgg 1320
catgctctac tgatggtggc tatgagcaac cctggacgag tctgagtgcg aaggaatgtt 1380
tggagacctt gcctagatgt ttgtcattga ttgaatcatg ctacagctcg cagtctgtgt 1440
tctcatgtgt cccggcctcc atctactgca acaacgcaca acttggacca ttccaaaaga 1500
ccggcagaaa cgtctacgac gttagaaaga tgtgcgaggg aactctgtgc tacaaagaca 1560
tggaatacat tgaccaatat ttgaaccagg actttgtcaa ggaaaaggtt ggcgctgagg 1620
ttgacactta cgagtcgtgt aatttcgacg tgaacagaaa cttcctgttt gctggtgatt 1680
ggatgaaacc ttaccacaag aacgttatca atctgctgga gcaaggtctt cctgtcctga 1740
tttacgcagg agacaaggat ttcatctgca attggctcgg aaaccaagcc tggtccaatg 1800
agctcccttg gtctggacac gatgaattcg agtcccccga gctgtacaac ctcaccttga 1860
aggatggcac taaggtcggc gaggtcaaga atgctggcaa gttcaccttt gctagaatgt 1920
ttgatggagg acacatggtt ccatacgacc agcctgagag ctctttggct atggtcaata 1980
gatggatagc tggtgactac tccttgggaa ccaagaaata aaaagctcat gaaaacatta 2040
tgtcat 2046 <210> 2 <211> 2046 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha DL1 <400> 2 gagctcagct accttttggg agccatggca cggtggcctt gattgtacgt tgctcctgca 60
atggtacaaa tgggattaca acaaaggtac cgtcaaatct cccgaaatag aagcacccgc 120
gatgagaaga gaaagtatat ctgcggagaa ttacatcaaa ctgaaaaagt caaagtcgcc 180
tgccacaggg tcagcattca ttaaaatccc aatgtccccg catcacgttc gcaagctgag 240
tgaaaacacg ccactgtcgc ctatcgactt tcttctggac gactatatgg cgaaccacaa 300
ctttacaagg gcaaaaaaca gttcgatgag gttttgaagc tgtcaaacta cggatcgata 360
tcttaatcag atcacttgcc tattctggaa gccgcaccag tactagttgg gatagcgtaa 420
atgctcaaaa ctgatgtgtt tatgtgtgac gcactaccta aaatatgagg gtggcaaaga 480
gagtaaaatt tggggttcat taagtaggtt ccataattta caaacctgtt ctgaatagag 540
agtcaccaat ccagttgccc caaaaccttg tcaaaatcat tagcatcgtg agcatctatt 600
ataaacaaag cgaatctcaa agatgaaact ctctttccca accctttact cgcttgctct 660
tgtgcttgga ttggtctccc tggccgatgc caaggtccac aaagctccca tcaaaaaagc 720
tcctgcacag gctacttacc aggatgttac tgtcggcgat tatgttgagt cgttgaagca 780
aaagtatgtt acaacttaca acaagtttat cgccgcccaa cagaatgacc agcaaattat 840
ctcgatcggc aagcgttctg acgagagtgc aagctcgggt cacaacactc ctttgaccaa 900
ctatctcaat gcccaatact tcaccgagat tcaattgggc actcctggcc aatcgttcaa 960
ggttatcctc gacaccggtt cctctaacct gtgggttcct agtagcgatt gcacgtcctt 1020
ggcctgttac ttgcatacta aatacgacca cgatgagtcg tccacttacc agaagaacgg 1080
ttcttcgttt gctattcaat atggctcggg ttccctcgag ggttacgttt cccaagacac 1140
actgactatt ggtgaccttg tcatccctaa acaggatttc gccgaggcta ctagcgagcc 1200
tggcttggct tttgcttttg gaaagtttga cggtattctg ggtctggctt acgacacgat 1260
ctcggtcaac agaatcgttc ctccaattta caatgctatc aatttgggat tgctggacac 1320
cccacaattc ggattttacc ttggtgacac ttcgaagtcc gagcaggatg gaggagaggc 1380
tacctttggt ggatacgatg tgtctaagta cacaggcgat atcacctggt tgccagtcag 1440
aagaaaggct tattgggaag tgaagtttag tggtatgccc ttggtgacga atacgctcca 1500
ttggagaaca ccgggagctg ccattgatac cggaacctct ttgattgctc ttccatctca 1560
attggctgag attttgaact ctcaaattgg tgccgagaag tcatggtctg gacagtacca 1620
gatcgattgt gacaagagag actcactgcc tgacctcact ttcaacttcg atggttacaa 1680
ctttaccatc tcgccttatg actacacttt ggaagtttct ggttcttgta tttctgcatt 1740
cactccaatg gacctcccag ccccaattgg tccaatggcc atcattggtg acgctttcct 1800
cagaagatac tactctgtct atgaccttgg cagagacgct gtcggattgg ctaaggctgt 1860
gtaatgcaag gcagttacgt attagtttca acttgctagc atgaatttct atcgggtacg 1920
gttgcttgac aacgattttc tttgtgtctc tattactgct ataaaacatg aaaagattgg 1980
atttttttga cagtttctag taattgctta aatctgctct tttccttttg ttgatcccgt 2040
gctgct 2046 <210> 3 <211> 3550 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha DL1 <400> 3 gaattctata ggaatggtgc aaaacgaagg atcgtgtgga ctcatgaatg tgctatattt 60
gtggctaaaa agcctgccag agctcgcagg agataagagg tctggcgtcg tgctgcgcaa 120
aatgatcgcc ttgataaaat tcctcaatct cgatcatgaa tcagggttca agtattttgg 180
ttttttcttt caagacgagt atgaactgga acacgctctc gagtcctaga cgaccaggac 240
atcaagcagg cggccgcact cgaagatctc gccgcttttg atttccaaca ctttgacgtc 300
gtggaggttg accagaccct tttcgatgcc tatgagctcg agctcggtct cgaacaggtt 360
tcctgggtct aacgtgaatt tcaggttgtt ggtaagagaa atcagcccca ctttgctgaa 420
ctcgtgttgg aaagcccgca ccagctggtt gaggccgtaa agcgggacgg gatctgcctt 480
gttggcgttc tggatcggaa ttggtggcac agatttttcg tattgtttgt tgatcgatga 540
ttgaatgtac agtatgagcg ataacgagtc gttcgacttg ttgataaatt gtagcttcca 600
tttgaacacc tcgccgagct tgactttagt ctggcccgaa actgaaatgc tgaggttctt 660
cttggagtgg ttgagagtca ccgacgagtt ggatcgtagt ttatttttct taggcaaatt 720
cagagcagag ttggtcgact tggatttaaa taccccgaga ctaggcgacg cgattggggg 780
cacggtgggg gccgccataa aatccacatt tgtagtccat cgtgtcacga tttttctatt 840
cccgttgacc gtgcaatgga tggtgacaaa aaccggctta acccacttga tgtcgttgtt 900
tgttagtctg tacgtgagcg acagaataga atggttctgc aacaccaatg gatactttac 960
caccgagtag ccggcacaca gacagtttct gatgtccata tctaccgact cgattctcac 1020
cgacacttct gacgcccgga cctgtccaga aagagccact tccaaagagg ccatggtttt 1080
ctccgtcttg atggtcttga accgcatctg gaatacgggg ctgatccgca gcgacgtgtc 1140
ggccgttacg agttcgtaaa ggtccacatg cttcgtcagc acagtgttgc ctatagtgac 1200
tgtatcctgc aactctaaat tttctatctt tctcgactgt tgtcgaaacg aggctttgat 1260
ctgcaattga tttgaaagtt tgtcaggcac cacggtcgtt tccagtatcc atacggcctc 1320
agaccctatg acgactttgg aatcgagcac ttttctcgct gtgttttgca agttgtatac 1380
caggtcgacc tcgacctgtg tcacagacga cggagtgtac accacgactt ggatgtcctc 1440
gtcgaaatag gcaatgtcca gcgtgtcgca ctggcgcagc tgttccacgg agcccagcac 1500
atcagcagaa acccgggttt tcggaacaag cacaccaaac attggaaaca acacttatcg 1560
acgcgggtgt gtttaaaaaa taatattaga tcgactgctc ctactctttt aaattcttta 1620
tttatcccag gcttagacag cacagagcta accatgagtc ggtatttttt actagcgtgc 1680
acattggctc tgcaatgtgt cgcggcctcc caggaggact acatagtcaa ggatttgcct 1740
ggactctcga atattcctgc cgtggtgagg ccagtgatgc atgccggaca ccttgaaata 1800
gatgaggaac acaacaccga gctgtttttc tggcgattcc agaatccgaa gaacaacggg 1860
acacaccaaa cgctccaccg caatgagctg atcgtctggc tgaacggtgg ccctggctgc 1920
tcgtcgatgg atggagccat gatggaaaca ggccccctgc gggtgtcaga caagttggag 1980
gtggagctca acccgggatc ctggacacag gtggccgata tcttgtttgt ggatcagccg 2040
gccggaattt tgagaaagtg gagtgcgtca aaatattcca tagtattttg gctgccagta 2100
gagacgaaac caagcctgcc aaagaacaat gtgtcaacat gtacgactac cgcaaacatg 2160
attacttccc tgcatgcgga tccaattggc cagaaggcct gcccaccgtg actaaatttc 2220
tgaatctgga tgctgtgcaa aaagccctga acctgaaatc ggcgaagaga tggcacgagt 2280
gtgacggaaa agtcgaattc tttttccagc cagagcactc tgtcaagtcg ttcgacctgc 2340
tgccaaaact actggagaaa atgaaaatcg cgctgtttgc tggcgacaag gacattatct 2400
gcaaccacaa atcaatagaa atggtgattg aaaaattgca aattacacca ggacaattcg 2460
gtttcacaaa cagcagaaag tctggctgga tctacgacgg gcaggaagtg ggtgaggttg 2520
agacacagtc gaacctcacg tatatcaagg tgttcaattc gtcgcatatg gtgccttacg 2580
acctgccgga ggtgagcaga ggactattcg atataatcac aaactctatt gaaaaacggt 2640
cgacagacat tgtgacgccc gtttatgaca gcagaggcaa ctacaagttt gtggaggaga 2700
agcaggacac cgaccagaac gaggaagaag agaaggagaa acctcccaag caccatcata 2760
gtctcacgtt ttacgtggca gaggtggcga ttctggcagt gctagcatat ctgctttaca 2820
gcttctacaa atcgttcgcc aaatcgcgta agtctgcatt tttgtcactc tcttccaaga 2880
agaagaagaa gcaggtgcac tggtttgacg agagcgacat aggaatggac caggaagctg 2940
gcgaggcaga tcataagcct aagagcatgc tggagtcggt gttcaacaag ctgggctatg 3000
gaggacagta tgacacggta caggacggcc gtgacatcga gatggcgccg gtcgaagaac 3060
acgaagacca atttattatt caaagcgacg aggaagagtt tggccacaga tagagtacga 3120
ttatataata tccacgaaaa attagtttcc aattatttcg ctcctgattg taatgtctca 3180
aagttggatc ctctggaagc ggtccctgat taccggcggt ggaattattg gaagcggtgt 3240
gctactgtac aaattcacga ctcctaccga ggaacagttg atcgctaaat tatcccccga 3300
gctgagagca gactatgaac gcaacaaaga attgcggagg aaagaacagg agatgttgat 3360
ggagatcgtc aaacagacgg cagcgtcgaa cgatccggtg tggaagacag ggccgattgt 3420
gtcgccgtgg gaccgggact ttacgccatc gagggaaagt ttattagtga agagagagcg 3480
atttgagaaa gagcaggcgg agaaaaaaca gcgcgaagag ctcgagcgtc tgaaagccga 3540
ggccaagctt 3550
【図面の簡単な説明】
【図１】ハンセヌラポリモルパPRC1遺伝子の制限酵素地図である。
【図２】ハンセヌラポリモルパPEP4遺伝子の制限酵素地図である。
【図３】ハンセヌラポリモルパKEX1遺伝子の制限酵素地図である。
【図４】LEU2遺伝子を利用してディスラプションされたハンセヌラポリモルパ
PRC1遺伝子からなるプラスミドの製作過程（このプラスミドは宿主ゲノムにおい
てPRC1遺伝子をディスラプションするのに有用である）、およびその制限酵素地
図である。
【図５】URA3遺伝子を利用してディスラプションされたハンセヌラポリモルパ
PRC1遺伝子からなるプラスミドの製作過程（このプラスミドは宿主ゲノムにおい
てPRC1遺伝子をディスラプションするのに有用である）、およびその制限酵素地
図である。
【図６】LEU2遺伝子を利用してディスラプションされたハンセヌラポリモルパ
パPEP4遺伝子からなるプラスミドの製作過程（このプラスミドは宿主ゲノムにお
いてパPEP4遺伝子をディスラプションするのに有用である）、およびその制限酵
素地図である。ハンセヌラポリモルパPEP4遺伝子をLEU2遺伝子を利用してディス
ラプションするために製作したプラスミドの制限酵素地図と製作過程である。
【図７】URA3遺伝子を利用してディスラプションされたハンセヌラポリモルパ
PEP4遺伝子からなるプラスミドの製作過程（このプラスミドは宿主ゲノムにおい
てパPEP4遺伝子をディスラプションするのに有用である）、およびその制限酵素
地図である。
【図８】URA3遺伝子を利用してディスラプションされたハンセヌラポリモルパ
KEX1遺伝子からなるプラスミドの製作過程（このプラスミドは宿主ゲノムにおい
てパKEX1遺伝子をディスラプションするのに有用である）、およびその制限酵素
地図である。
【図９】重要な遺伝子のディスラプションを確認するためのサザンブロッティ
ングの結果を示す。
【図１０】MOX-TRP3をディスラプションするためのベクターpMLT-deltaの製作
過程を示す。
【図１１】ベクターpMLT-deltaを用いる△mox変異体DLT2の製作に伴うゲノム
の変化を示す。
【図１２】MOX野生型(wild type)と△mox変異体(mutant)DLT2株が、ブドウ糖
(destrose)またはメタノールを主要な炭素源として含む様々な培地で生育するこ
とを示す。
【図１３】野生型から変異体への、そしてその逆の形質転換の実現可能性（fe
asibility）を示す：組換えタンパク質発現カセットの△mox変異体DLT2のMOX遺
伝子部位への導入(A)；形質転換されたDLT2からの発現カセットの取り出し（pop
ing out）(B)；およびMOX野生型への復帰(C)。
【図１４】MOX DL-1Lおよび△mox変異体DLT2でのアルブミン発現の柱状グラ
フである。
【図１５】超分泌(super-secretion)変異株を一般的な宿主株として組換えタ
ンパク質の製造用に開発するためのポップアウト技術(pop-out technique)を使
用する方法を示す
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１２月２８日（２０００．１２．２８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の名称】ハンセヌラポリモルパ変異体及びそれらを利用する組換え蛋白質
の製造方法
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】 技術分野 本発明はハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ
）変異体（ｍｕｔａｎｔ）及びそれらを使用する組換え蛋白質の製造方法に関す
る。より詳しくは、本発明は種々の蛋白質を完全な状態のものとして高収量で生
産できる宿主細胞として有用なハンセヌラポリモルパ変異体及びこれらを使用す
る組換え蛋白質の製造方法に関する。
【０００２】 背景技術 遺伝子組換え技術は、最近開発されて非常に発達した技術であり、これにより
高等生物由来の蛋白質の大量生産が、問題の遺伝子（ｇｅｎｅｓ ｏｆ ｉｎｔ
ｅｒｅｓｔ）を微生物に導入することにより可能になる。おおむね、医薬として
有用な蛋白質はそれらが高価値であることから重要である。高純度の蛋白質医薬
品に対する要求は、難治性疾患が続々と発見されているもののこれらの蛋白質医
薬品を用いて治療できることから、爆発的に増大することが予期される。このよ
うに、機能性組換え蛋白質を比較的低廉な費用で生体に無害な多種の微生物を用
いて製造できる技術が必要とされている。
【０００３】 酵母は、蛋白質の発現及び分泌を真核生物と同様に行う微生物であり、宿主と
して有用に利用され、これにより高等生物由来の組換え蛋白質を大規模に製造で
きる。典型的には、サッカロミセスセレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がこのような宿主として、酵母を用いる組換え蛋白質
の製造に関する研究に使用される。しかしながら、この菌株は今や次の見地にお
いて不適当であると見なされる：外来蛋白質（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｐｒｏｔｅ
ｉｎ）の有効な発現のための強力なプロモーターが存在しないのみならず酵母に
導入されたプラスミドが長期発酵過程で不安定であるため、産生される組換え蛋
白質が低収量である；この菌株を高濃度で培養するときにフェドバッチ発酵（ｆ
ｅｄ‐ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｎｏ）が必要である；そして、発現さ
れた外来蛋白質がハイパ−グリコシレ−ション（ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｏｓｉｌａ
ｔｉｏｎ）になる（Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，８，４２３，
１９９２）。上記問題を克服するための外来蛋白質発現システムは、メタノール
同化酵母（ｍｅｔｈａｎｏｌ‐ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｎｇ）であるピチアパスト
リス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）で開発された（Ｓｕｄｂｅｒｙ ｅｔ
ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，１０，１７０７，１９９４；Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．
，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：４７９，１９８７）。さらに、メタノー
ル同化酵母であるハンセヌラポリモルパを用いる外来蛋白質発現システムの開発
のために研究が活発に進められている（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂ
ｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．９，２９１，１９９１；Ｊａｎｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ
．，Ｙｅａｓｔ，７：４３１，１９９１）。ハンセヌラポリモルパは、新規宿主
細胞として組換え蛋白質を産生するための長所を備えており、メタノールを炭素
源として利用し、そのため簡便に大量培養することが可能である。さらに、この
酵母株は、そのメタノール代謝に係る幾つかの遺伝子に対する強力なプロモータ
ーを含んでおり、そして外来遺伝子をそのゲノムＤＮＡに多重導入（ｍｕｌｔｉ
ｃｏｐｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）できるため高濃度で培養するときでもプラ
スミドが安定的に維持され得る。
【０００４】 組換え蛋白質を酵母を利用して生産するとき、収量の増加のために効率的な発
現及び分泌システムが必要であるのみならず、プロテアーゼを妨げることにより
発現されそして分泌された外来蛋白質を分解させないことも非常に重要である。
通常、組換え酵母を発酵槽で長期間培養するとき、宿主細胞から培地中に自然的
に分泌されたり又は細胞のライシス（ｌｙｓｉｓ）を通じて培地に出たプロテア
ーゼが、生産された組換え蛋白質を分解して組換え蛋白質の生産量を低下させる
という問題がある。事実、例えばＨＰＬＣやＭＳにより分析した結果、組換え蛋
白質、例えば組換えサッカロミセスセレビジアエ（Ｇｅｏｒｇｅ‐Ｎａｓｃｉｍ
ｅｎｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：７９７，１９８８）
やピチアパストリス（Ｃｌａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １０５：２０５，
１９９１）細胞からそれらの培養培地に分泌されたヒト上皮細胞成長因子（Ｅｐ
ｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、の相当の部分がそれらのカル
ボキシ末端で分解されていることが明らかになった。これは宿主細胞のカルボキ
シペプチダ−ゼにより、分泌された組換え蛋白質のカルボキシ末端から１〜２個
のアミノ酸が除去されたと考えられた。
【０００５】 高等細胞のリソゾーム（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）に相当するサッカロミセスセレビ
ジアエの液胞（ｖａｃｕｏｌｅ）は、多種のプロテアーゼを含有しており、栄養
分枯渇時の蛋白質分解を担っている。特に、カルボキシペプチダ−ゼＹは多様な
蛋白質基質を加水分解する能力によりカルボキシ末端アミノ酸分析に利用されて
おり、蛋白質のソーティング（ｓｏｒｔｉｎｇ）やターゲティングに関する進行
中の広範な研究におけるモデル蛋白質である（Ｒｏｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，
Ｃｅｌｌ，４７，１０４１，１９８６；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌ
ｌ，４８，８７５，１９８７；Ｖａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉ
ｏｌ．，１１１，３６１，１９９２）。さらに、外来蛋白質の過剰発現時に発生
するカルボキシ末端の分解は、カルボキシペプチダ−ゼＹに起因するものと知ら
れている。カルボキシペプチダ−ゼＹ遺伝子は、サッカロミセスセレビジアエ、
カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ピチアパストリ
ス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｈｉｚ
ｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）でクローニングされて報告されて
いる（Ｖａｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４８，８８７，１９８７；Ｍｕｋ
ｈｔａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１２１，１７３，１９９２；Ｏｈｉ ｅｔ
ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，１２，３１，１９９６；Ｔａｂｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．
，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９，４１７９，１９９７）。
【０００６】 カルボキシペプチダーゼＹに加えて、サッカロミセスセレビジアエ プロテア
ーゼＡが液胞中に存在し、蛋白質を加水分解する役割を果たしている。その上、
プロテアーゼＡは液胞のプロテアーゼ、例えばプロテアーゼＢ、カルボキシペプ
チダ−ゼＹ、及びアミノペプチダ−ゼＹ、のみならず液胞の加水解酵素（ｖａｃ
ｕｏｌａｒ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、例えばＲＮａｓｅ，アルカリホスファター
ゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、及び酸トレハラーゼ（ａｃ
ｉｄ ｔｒｅｈａｌａｓｅ）、の蛋白質分解過程（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｐ
ｒｏｃｅｓｓ）に関与する（Ｈ．Ｂ．Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｈａｚｅｌ ｅｔ ａｌ
．，Ｙｅａｓｔ．１２，１，１９９６）。特に、遺伝子ＰＥＰ４が分断（ｄｉｓ
ｒｕｐｔｉｏｎ）された菌株ではカルボキシペプチダ−ゼＹの活性が著しく減少
する。それに応じて、ＰＥＰ４遺伝子が分断されたハンセヌラポリモルパにおい
て、カルボキシペプチダ−ゼＹの活性が著しく減少するため、ＰＥＰ４遺伝子を
ゲノム上で分断すると、カルボキシペプチダーゼＹを含む多種のリアーゼ（ｌｙ
ａｓｅ）の酵素活性を低減させることが可能である。遺伝子ＰＥＰ４はサッカロ
ミセスセレビジアエ、カンジダアルビカンス、ニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕ
ｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）でクローニングされていくつかの文書で開示さ
れている（Ａｍｍｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６
，２４９０，１９８６；Ｗｏｏｌｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．
Ｂｉｏｌ．，６，２５，１９８６；Ｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７，１７７９，１９８９；Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ
．，Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ３６４７１）。
【０００７】 酵母の遺伝子ＫＥＸ１は、キラー毒素（Ｋｉｌｌｅｒ ｔｏｘｉｎ）Ｋ１、Ｋ
２とα‐因子（交配フェロモン（ｍａｔｉｎｇ ｐｈｅｒｏｍｅｎｅ））前躯体
のプロセシングに関与するカルボキシペプチダーゼ αをコードするものとして
知られている（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５０，５７３，
１９８７）。カルボキシペプチダーゼαは消化酵素であり、ポリペプチド鎖のカ
ルボキシ末端ペプチド結合を加水分解する。加水分解は、カルボキシ末端残基が
塩基性アミノ酸、例えばアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）又はリジン（Ｌｙｓｉ
ｎｅ）、であるときに最も特異的に生ずることが知られている。しかしながら、
トロンビン阻害剤であるヒルジン（ｈｉｒｕｄｉｎ）をサッカロミセスセレビジ
アエで発現させると、カルボキシペプチダーゼαのカルボキシ末端での特異性が
塩基性アミノ酸に限定されず、非塩基性アミノ酸、例えばチロシン（Ｔｙｒｏｓ
ｉｎｅ）、ロイシン（Ｌｅｕｃｉｎｅ）、及びグルタミン（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ
）、にも及ぶことが明らかになった（Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｍ，１５５−１６４，１９９４）。
【０００８】 使用されているピチアパストリスの発現システムは一般に、遺伝子ＡＯＸ１又
はＨＩＳ４の部位で相同的組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａ
ｔｉｏｎ）により挿入され得るトランケート（ｔｒｕｎｃａｔｅ）された発現ベ
クターをこの微生物中に導入することにより開発された。ＡＯＸ１プロモーター
及びターミネーターからなる発現カセットが遺伝子ＡＯＸ１部位に挿入されると
、遺伝子ＡＯＸ１において分断が起こりａｏｘ１形質転換体が生じる。正常株は
メタノール培養すると大量のＡＯＸ１酵素を生産するが、ａｏｘ１株はもはやＡ
ＯＸ１酵素を生産することができず、非常に遅い増殖速度を示す（メタノール消
費が遅い：ＭｕｔＳ）。従って、この変異体は、野生型が生長できるより希薄な
酸素雰囲気中でさえも生長し得るという点で、ＡＯＸ１野生型（Ｍｕｔ＋）を超
える利点を有する。ＭｕｔＳ組換え株とＭｕｔ＋株を使用した発酵による組換え
蛋白質生産量において、ＭｕｔＳ組換え株のＭｕｔ＋株に対する優位性を示すい
くつかの報告があり、ＭｕｔＳ株はある組換え蛋白質の大量生産により有用であ
ることが示唆される（Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ ５：４７９，１９８７；Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ
９：９０１，１９９１）。
【０００９】 それに反して、従来のハンセヌラポリモルパの発現システムは、外来遺伝子の
多重コピーが直列にゲノムの非特異的部位に導入されるという現象を生かして開
発された。それゆえ、完全な発現ベクター、切断されず環状であるもの、が宿主
中に導入される（Ｊａｎｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，７：４３１，
１９９１；Ｇｅｌａｌｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ．１０：４１３，１９９２；Ｇａｔｚｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：８４４，１９９５）。この場合、この従来の発現シ
ステムでは重要な問題が生じるが、その問題は、発現ベクターが挿入される宿主
ゲノム部位に依存して発現効率が様々に異なるため、問題の組換え蛋白質の最も
生産性の良いものを選別するためにおびただしい数の形質転換体の発現量を分析
するという無駄な探索処置が必要なことである。さらに、相同的組換えの頻度が
高いピチアパストリス発現システムとは異なり、ハンセヌラポリモルパ システ
ムでは、ＭＯＸプロモーター及びＭＯＸターミネーターを用いても、外来遺伝子
は、そのほとんどの部分について、宿主ゲノムの非特異的部位に挿入される。そ
の上、外来遺伝子がＭＯＸ遺伝子部位に低頻度で挿入されるときでも、ベクター
は完全な状態で取り込まれ、そのため形質転換体のＭＯＸ遺伝子は傷害を受けな
い。メタノール培養培地中で、これらのＭＯＸ＋形質転換体が示す問題の組換え
蛋白質の発現量は期待したものより乏しいが、それは栄養として与えたメタノー
ルのほとんどが、高活性のＭＯＸ酵素の基質として消費されるためである（Ｋｉ
ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．１８：４１７，１９９６
）。メタノール中で培養されたＭＯＸ野生型の中では、さらに、発現されたＭＯ
Ｘ蛋白質は総発現蛋白質の３０〜４０％程度になり（Ｇｕｉｓｅｐｐｉｎ ｅｔ
ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．３２：５７７，１９８８）、
その結果、問題の組換え蛋白質の発現効率がかなり減少する。
【００１０】 ハンセヌラポリモルパについては、宿主ゲノムに挿入された発現カセットを後
ではじき出す（ｐｏｐ ｏｕｔ）（ポップアウト）ことができる技術は未だに開
発されていない。それゆえ、ホジキンスらの報告（Ｈｏｄｇｋｉｎｓ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｙｅａｓｔ ９：６２５）に示されているように、特定の組換え蛋白質用
の発現カセットを担持している形質転換体を母株として用いて所望の変異体が得
られた後でも、先在する発現ベクターを宿主ゲノムからポップアウトできず、そ
してそのため宿主ゲノムに新規な発現カセットを導入することができないので、
困難の末に得た変異体を種々の組換え蛋白質を発現する一般的な宿主として使用
できない。
【００１１】 発明の開示 ハンセヌラポリモルパですべての組換え蛋白質を製造するために、プロテアー
ゼについて欠失したハンセヌラポリモルパ変異株を開発する。まず、カルボキシ
ペプチダーゼＹ、カルボキシペプチダーゼα、及びプロテアーゼＡをそれぞれコ
ードする遺伝子、ＰＲＣ１、ＫＥＸ１、及びＰＥＰ４をクローン化する。これら
のクローン化された遺伝子を利用して、カルボキシペプチダーゼＹ欠失変異株、
カルボキシペプチダーゼα欠失変異株、プロテアーゼＡ欠失変異株、及び多重欠
失変異株（ｍｕｌｔｉ−ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｕｔａｎ
ｔ）を開発する。これらの変異株から産生された外来蛋白質は、そのカルボキシ
末端領域におけるアミノ酸分解の顕著な低減が認められる。本発明では、サッカ
ロミセスセレビジアエ遺伝子を利用して、ハンセヌラポリモルパから問題の遺伝
子をクローン化する。サッカロミセスセレビジアエのカルボキシペプチダーゼＹ
遺伝子（ＰＲＣ１）をＰＣＲにより得て、これをプローブとして用いサザンブロ
ッティングによりハンセヌラポリモルパ ＰＲＣ１を検出する。ハンセヌラポリ
モルパ ＤＬ−１ゲノムを種々の制限酵素で消化し、そして繰り返しサザンブロ
ッティングに付し、ハンセヌラポリモルパ ＰＲＣ１の塩基配列を決定する。こ
の方法は、ハンセヌラポリモルパ ＤＬ−１のプロテアーゼＡをコードする遺伝
子ＰＥＰ４の塩基配列を決定することに適用できる。ハンセヌラポリモルパ Ｋ
ＥＸ１遺伝子のクローニングについては、プライマーを各菌株間の相同性の高い
領域に基づいて合成し、そしてＫＥＸ１遺伝子の一部をＰＣＲによりハンセヌラ
ポリモルパ ゲノムを鋳型として供して増幅するために用いる。このＰＣＲ産物
はプローブとしてサザンブロッティングに用い、ハンセヌラポリモルパの全ＫＥ
Ｘ１遺伝子をクローン化する。
【００１２】 ハンセヌラポリモルパ ＬＥＵ２遺伝子をプラスミド ｐＨＤＹ２及びｐＨＤ
Ｐ４に挿入し、プラスミドｐＨＹＬ及びｐＨＰＬをそれぞれ構築する。構築され
たプラスミドｐＨＹＬ及びｐＨＰＬを用いて、ハンセヌラポリモルパ ＵＲ２を
形質転換し、それぞれカルボキシペプチダーゼＹ変異体及びプロテアーゼＡ変異
体とする。これら変異体のカルボキシペプチダーゼ活性の検討及びサザンブロッ
ティング分析により、ハンセヌラポリモルパ ＰＲＣ１及びＰＥＰ４遺伝子の分
断を確認する。
【００１３】 ハンセヌラポリモルパ ＤＬ１株のＫＥＸ１遺伝子を分断するために、ハンセ
ヌラポリモルパ ＵＲＡ３遺伝子ポップアウト カセットをプラスミドｐＫＨ３
．９に挿入してプラスミドｐＫＵＺを構築し、そしてハンセヌラポリモルパ Ｄ
Ｌ１株を形質転換してカルボキシペプチダーゼα変異株とするために使用する。
ハンセヌラポリモルパ ＵＲＡ３遺伝子ポップアウト株について選別を行い、こ
れらのゲノムをついで野生型のゲノムと共にサザンブロッティングに付してＫＥ
Ｘ１遺伝子の分断を確認する。さらに、ハンセヌラポリモルパ ＤＬ１株の遺伝
子ＰＲＣ１及びＰＥＰ４を両方とも分断する。これに関して、ハンセヌラポリモ
ルパ ＵＲＡ３遺伝子ポップアウト カセットをプラスミドｐＨＤＹ２及びｐＨ
ＤＰ４に挿入し、プラスミドｐＨＴＵＺ及びｐＨＰＵＺをそれぞれ構築する。Ｋ
ＥＸ１遺伝子の分断と同様に、形質転換及びポップアウトを繰り返し行い、プロ
テアーゼＡ／カルボキシペプチダーゼＹ変異体、カルボキシペプチダーゼα／カ
ルボキシペプチダーゼＹ変異体、及びプロテアーゼＡ／カルボキシペプチダーゼ
α／カルボキシペプチダーゼＹ変異体を作製する。
【００１４】 本発明において、メタノールオキシダーゼ（メタノール同化ハンセヌラポリモ
ルパのメタノール代謝における最初の酵素である）をコードするＭＯＸ遺伝子と
該ＭＯＸ遺伝子の近傍のＴＲＰ３遺伝子とを同時に分断することのできるベクタ
ーも構築される。このベクターを用いてＭＯＸ遺伝子が分断された新規変異体Ｄ
ＬＴ２を作製する。この新規変異体ＤＬＴ２は宿主として供することができ、こ
れにより問題の組換え蛋白質を高い収量で、メタノールを継続的に供給せずに、
低濃度のメタノールで発現を誘導し得るプロモーターを担持する発現カセットの
助けにより、生産することができる。その上、ポップアウト方法が開発され、そ
れにより組換え蛋白質発現カセットが変異体のＭＯＸ遺伝子部位に挿入され、そ
してそこからポップアウトされることができ、それゆえこの変異体は種々の問題
の蛋白質の製造において一般使用のための宿主として利用される。
【００１５】 従って、本発明の目的は、ハンセヌラポリモルパ由来のカルボキシペプチダ−
ゼＹ、カルボキシペプチダーゼα及びプロテアーゼＡをそれぞれコードする遺伝
子塩基配列を提供することにある。
【００１６】 本発明の別の目的は、カルボキシペプチダ−ゼＹ、カルボキシペプチダーゼα
、プロテアーゼＡ、及びこれらの組み合わせを欠失した変異株を提供することで
あり、これらはハンセヌラポリモルパから、分断されたカルボキシペプチダ−ゼ
ＹをコードするＰＲＣ１遺伝子、分断されたカルボキシペプチダーゼαをコード
するＫＥＸ１遺伝子、分断されたプロテアーゼＡをコードするＰＥＰ４遺伝子、
及びこれらの組み合わせを含有するベクターにより形質転換されたものである。
【００１７】 本発明のさらなる目的は、組換え蛋白質の製造方法を提供することにあり、こ
こで前記プロテアーゼ変異株は宿主細胞として利用されカルボキシ末端の分解の
無い組換え蛋白質が製造される。
【００１８】 本発明のまたさらなる目的は、組換え蛋白質を高収量で製造するための方法を
提供することであり、ここでハンセヌラポリモルパ変異体（メタノール同化能を
欠損させられメタノールを炭素源として利用できない）は高収量の宿主として使
用され、メタノールを継続的に供給せずに、低濃度のメタノールで発現を誘導し
うるプロモーターを担持する発現カセットの助けにより、組換え蛋白質が製造さ
れる。
【００１９】 本発明のまた別の目的はポップアウト方法を提供することであり、ここで組換
え蛋白質発現カセットは変異体のＭＯＸ遺伝子部位に挿入され、そしてそこから
ポップアウトされることができ、それゆえこの変異体は種々の問題の蛋白質の製
造において一般使用のための宿主として利用される。
【００２０】 本発明の上記の及びさらにほかの目的、特徴及びその他の利点は、以下の詳細
な説明とそれに連携して含まれる添付の図面から、より明確に理解されるであろ
う。
【００２１】 発明を実施するための最良の形態 サッカロミセスセレビジアエ カルボキシペプチダ−ゼＹ遺伝子（ＰＲＣ１）
をＰＣＲにより増幅する。このＰＣＲ産物をプローブとして用いて、相応するハ
ンセヌラポリモルパ遺伝子（ＰＲＣ１）をサザンブロッティングにより検出する
。最初に、ハンセヌラポリモルパＤＬ−１のゲノムを制限酵素で処理し、プロー
ブとハイブリダイゼーションさせる。ＤＮＡのバンドが３ｋｂのＰｓｔＩ ＤＮ
Ａ断片から検出されるので、該ＤＮＡ断片を次いでプラスミドに挿入してＤＮＡ
ライブラリーを作成する。包括的な（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）サザンブロッティン
グ処理後に、ハンセヌラポリモルパＰＲＣ１遺伝子を担持するプラスミドを選別
した。ＤＮＡ断片を２．２ｋｂのＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ断片に短縮し、ついでこれ
を使用してプラスミドｐＨＤＹ２を構築する。この遺伝子の塩基配列は配列１に
記載の通りであると推定される。
【００２２】 周知のサッカロミセスセレビジアエ ＰＥＰ４遺伝子に基づいて、２つからな
る１組のプライマーを合成する。ＰＣＲでプライマーの助けにより増幅した後、
サッカロミセスセレビジアエ ＰＥＰ４遺伝子断片をプローブとして用いてサザ
ンブロッティングを行う。最初に、ハンセヌラポリモルパＤＬ−１のゲノムを制
限酵素で処理し、プローブとハイブリダイゼーションさせる。ＤＮＡのバンドが
８ｋｂのＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片から検出されるので、該ＤＮＡ断片を次いでプ
ラスミドに挿入してＤＮＡライブラリーを作成する。包括的な（ｅｘｔｅｎｓｉ
ｖｅ）サザンブロッティング処理後に、ハンセヌラポリモルパＰＥＰ４遺伝子を
担持するプラスミドを選別した。
【００２３】 多くの菌株のカルボキシペプチダーゼαの周知のアミノ酸配列を分析し、相同
性の高い領域を選別する。相同性の高い領域のアミノ酸配列に基いて、プライマ
ーを設計する。これらプライマーを用いたＰＣＲにより、３０６ｂｐ長のＫＥＸ
１ ＤＮＡ断片が、ハンセヌラポリモルパＤＬ−１ゲノムから増幅された。この
ＰＣＲ産物をプローブとして使用して、ハンセヌラポリモルパの遺伝子ＫＥＸ１
全体をサザンブロッティングにより検出する。最初に、ハンセヌラポリモルパＤ
Ｌ−１のゲノムを制限酵素で処理し、プローブとハイブリダイゼーションさせる
。ＤＮＡのバンドが４．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片から検出されるの
で、該ＤＮＡ断片を次いでプラスミドに挿入してＤＮＡライブラリーを作成する
。包括的な（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）サザンブロッティング処理後に、ハンセヌラ
ポリモルパＫＥＸ１遺伝子を担持するプラスミドを選別した。ＤＮＡ断片を３．
９ｋｂのＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片に縮小し、ついでこれを使用してプラ
スミドｐＫＨ３．９を構築する。この遺伝子の塩基配列は配列３に記載の通りで
あると推定される。
【００２４】 クローン化したカルボキシペプチダーゼＹ遺伝子（ＰＲＣ１）及びプロテアー
ゼＡ遺伝子（ＰＥＰ４）を利用して、ハンセヌラポリモルパＤＬ−１のゲノム上
のこれらに相当する遺伝子を分断する。この目的のために、ハンセヌラポリモル
パＬＥＵ２遺伝子をプラスミドｐＨＤＹ２及びｐＨＤＰ４に挿入し、ｐＨＹＬ及
びｐＨＰＬをそれぞれ構築する。これらのプラスミドを使用して、ハンセヌラポ
リモルパＵＲ２株（ｌｅｕ２，ｈＥＧＦ，ＰＲＣ１，ＰＥＰ４，ＫＥＸ１）を形
質転換し、それぞれカルボキシペプチダーゼα変異株（ｈＥＧＦ，ｐｒｃ１：：
ＬＥＵ２，ＰＥＰ４，ＫＥＸ１）及びプロテアーゼ変異株（ｈＥＧＦ，ｐｅｐ４
：：ＬＥＵ２、ＰＲＣ１，ＫＥＸ１）とする。問題の遺伝子の分断は、得られる
変異体をカルボキシペプチダーゼＹの活性について分析することにより、及び変
異体と野生型との間のゲノム サザンハイブリダイゼーションにより確認するこ
とができる。
【００２５】 ＫＥＸ１、ＰＥＰ４、及びＰＲＣ１の多重分断（ｍｕｌｔｉ−ｄｉｓｒｕｐｔ
ｉｏｎ）のために、ハンセヌラポリモルパＵＲＡ３遺伝子ポップアウトカセット
をプラスミドｐＫＨ３．９、ｐＨＤＹ、ｐＨＤＰ４に導入して、プラスミドｐＫ
ＵＺ、ｐＨＹＵＺ、及びｐＨＰＵＺをそれぞれ構築する。プラスミドｐＫＵＺを
用いて、ハンセヌラポリモルパＤＬ−１株（ｌｅｕ２，ｕｒａ３，ＫＥＸ１，Ｐ
ＥＰ４，ＰＲＣ１）を形質転換してカルボキシペプチダーゼα変異株（ｌｅｕ２
，ｋｅｘ１：：ＵＲＡ３，ＰＥＰ４，ＰＲＣ１）とし、ついでＵＲＡ３遺伝子を
ポップアウトする。同様に、プラスミドｐＨＹＵＺ及びｐＨＰＵＺを使用して、
カルボキシペプチダーゼＹ変異株及びプロテアーゼＡ変異株をそれぞれ作製した
。問題の遺伝子の分断は変異体と野生型との間のゲノム サザンハイブリダイゼ
ーションにより確認することができる。
【００２６】 問題の組換え蛋白質、例えば、ｈＥＧＦはカルボキシペプチダーゼＹ／プロテ
アーゼＡ変異株中で発現される。この蛋白質は、蛋白質にシグナルペプチドを付
加することにより簡単に得ることができる。この場合、組換え蛋白質は細胞培養
して遠心分離するだけで得ることができる。ＨＰＬＣ分析は、この組換え蛋白質
がそのカルボキシ末端で分解されているかどうかを確認するために有用である。
【００２７】 さらに、本発明の態様において、メタノール オキシダーゼ遺伝子（ＭＯＸ）
が分断されたハンセヌラポリモルパ変異株を使用する組換え蛋白質の製造方法が
提供される。この方法では、ハンセヌラポリモルパ ゲノム上でＭＯＸ遺伝子と
その近傍のＴＲＰ３遺伝子を分断するためのベクターを構築して宿主に導入し、
Δｍｏｘ変異体を作製する。この変異体では、組換え蛋白質発現カセットはゲノ
ムに挿入又はポップアウトされ得る。問題の遺伝子を有するΔｍｏｘ変異体をメ
タノール培地中で培養すると、それに相当する組換え蛋白質が高収量で生産され
る。ハンセヌラポリモルパ ゲノム上でＭＯＸ遺伝子とＴＲＰ３遺伝子とを一度
に分断するためのベクターとして、ｐＭＬＴ−デルタ（ｐＭＬＴ−ｄｅｌｔａ）
が開発されて、Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ）
に、受託番号（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．）ＫＣＴＣ ０７２７ＢＰとして２
０００年２月１０日に寄託された。このベクターを使用して、ゲノムのＭＯＸ及
びＴＲＰ３遺伝子が分断されたハンセヌラポリモルパ変異体ＤＬＴ２も開発され
て、Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
ｏｆ Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓ
ｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ）に、受託番
号ＫＣＴＣ ０７２８ＢＰとして２０００年２月１０日に寄託された。新規変異
体ＤＬＴ２は宿主として供することができ、これにより問題の組換え蛋白質を高
い収量で、メタノールを継続的に供給せずに、低濃度のメタノールで発現を誘導
し得るプロモーターを担持した発現カセットの助けにより、製造することができ
る。
【００２８】 さらに、本発明の別の態様において、ポップアウト方法が提供され、ここにお
いて組換え蛋白質発現カセットは変異体のＭＯＸ遺伝子部位に挿入され、そして
そこからポップアウトされ得るため、この変異体は種々の、問題の蛋白質の製造
において一般使用のための宿主として利用される。
【００２９】 本発明の一層の理解は、説明するために記載される以下の実施例により得られ
るが、これは本発明を限定するものではない。
【００３０】
【実施例１】 ハンセヌラポリモルパのプロテアーゼ遺伝子分断変異体の作製 実験例１：カルボキシペプチダ−ゼＹをコードするＰＲＣ１、プロテアーゼＡを
コードするＰＥＰ４及びカルボキシペプチダーゼαをコードするＫＥＸ１の遺伝
子の同定 第一段階：ハンセヌラポリモルパ遺伝子ＰＲＣ１、ＰＥＰ４及びＫＥＸ１をクロ
ーニングするためのプローブの構築 サッカロミセスセレビジアエＰＲＣ１遺伝子を得るために、下記プライマーを
用いた。 プライマーＣ１：５'−ATG AAA GCA TTC ACC AG−３' プライマーＣ２：５'−TTA TAA GGA GAA ACC AC−３' プライマーＣ１及びＣ２の助けにより、９４℃で３０秒の変性段階（ｄｅｎａｔ
ｕｒｉｎｇ ｓｔｅｐ）、５５℃で３０秒のアニーリング段階（ａｎｎｅａｌｉ
ｎｇ ｓｔｅｐ）、及び７２℃で２分の伸長段階（ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ｓｔｅ
ｐ）の条件で２５サイクルのＰＣＲを行い、１．６ｋｂ長のサッカロミセスセレ
ビジアエＰＲＣ１遺伝子を、サッカロミセスセレビジアエのゲノムＤＮＡを酵素
の鋳型として用いて取得した。ＤＩＧ−ラベル及び検出キット（ＤＩＧ−ｌａｂ
ｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ社製品）を用いて、製品マニュアルの指示に従い、ＰＣＲ産物を
ラベルしてハンセヌラポリモルパのＰＲＣ１遺伝子クローニング用のプローブを
製作した。
【００３１】 サッカロミセスセレビジアエＰＥＰ４遺伝子の増幅のために、下記プライマー
を合成した。 プライマーＰ１：５'−ATG TTC AGC TTG AAA GC−３' プライマーＰ２：５'−TCA AAT TGC TTT GGC C−３' サッカロミセスセレビジアエの１．２２ｋｂ長のＰＥＰ４遺伝子は、サッカロミ
セスセレビジアエ ゲノムＤＮＡから、９４℃で３０秒の変性段階、５５℃で３
０秒のアニーリング段階、７２℃で２分の伸長段階の条件での２５サイクルのＰ
ＣＲにより得た。このＰＥＰ４遺伝子を前記ハンセヌラポリモルパＰＲＣ１遺伝
子におけるのと同じ方法でラベルして、ハンセヌラポリモルパＰＥＰ４遺伝子ク
ローニング用プローブを製作した。
【００３２】 ハンセヌラポリモルパＫＥＸ１遺伝子を見いだすためのプローブを、下記プラ
イマーを用いてＰＣＲにより得た。 プライマーＫ１：５'−TGG YTS AAC GGH CCW GGH TGY TCB TCB −３' プライマーＫ２：５'−WGG RAT GTA YTG WCC RGC GTA VGA CTC DCC−３' これについて、９４℃で３０秒の変性段階、５０℃で３０秒のアニーリング段
階、７２℃で３０秒の伸長段階の条件で５サイクルのＰＣＲを行い、ついで９４
℃で３０秒の変性段階、５５℃で３０秒のアニーリング段階、７２℃で３０秒の
伸長段階の条件で加熱状態下において２０サイクルのＰＣＲを行い、３０６ｂｐ
のハンセヌラポリモルパＫＥＸ１ ＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片は前
記ハンセヌラポリモルパＰＲＣ１遺伝子クローニング用のプローブ作製と同じ方
法でラベルした。
【００３３】 第二段階：ハンセヌラポリモルパＤＬ−１のゲノムＤＮＡ単離 ジョンストン（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ）の方法（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ，ｐｐ．１０７−１２３，ＩＲＬ Ｐｒ
ｅｓｓ，１９９８）に準じて、ＹＥＰＤ培地（ペプトン２％、酵母抽出物１％、
ブドウ糖２％）中で培養したハンセヌラポリモルパＤＬ−１からゲノムＤＮＡを
単離した。
【００３４】 第三段階：プラスミドｐＨＤＹ２の構築 ハンセヌラポリモルパのゲノムＤＮＡからＰＲＣ１遺伝子を見いだすために、
第一段階で作製したプローブを用いてサザンブロッティングを行った。まず、第
二段階で得たゲノムＤＮＡの６アリコート（ａｌｉｑｕｏｔ）を制限酵素Ｂａｍ
ＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、及びＳａｌＩでそ
れぞれ処理し、得られたＤＮＡ断片を０．９％アガロースゲル上で電気泳動によ
り分画した。分離したＤＮＡ分子をＮｙｔｒａｎ メンブラン（Ｓｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社製品）にブロッティングにより移し、ハイブリダ
イゼーションに適した条件下で、ラベルされたプローブとサザンブロッティング
した。このハイブリダイゼーションには、ハイブリッド緩衝液（５× ＳＳＣ，
０．１％ Ｎ−ラウリルサルコシン，０．０２％ ＳＤＳ，２％ ブロッキング
剤，３０％ ホルムアミド）を用い、ベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社の製品マニュアルの指示通り４２℃で６時間処理
した。このメンブランに、アルカリホスファターゼが結合された抗体を添加した
後、ＢＣＩＰとＸ−リン酸塩（Ｘ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を添加して、色素反応
を行った。青色に染色されたバンドが、制限酵素ＰｓｔＩにより約３ｋｂ長に切
断されたＤＮＡ断片中に認められた。
【００３５】 次に、ＤＮＡ断片を青色のバンドが現れた箇所から分離して、プラスミドｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩ＋に連結し、これを用いて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ
）ＤＨ５を形質転換してＤＮＡライブラリを作成した。このＤＮＡライブラリー
を対象としてサザンブロッティングを繰り返し行い、ＰＲＣ１遺伝子を担持する
プラスミドを選別し、プラスミドｐＨＤＹ１とした。制限酵素ＸｈｏＩ／Ｐｓｔ
Ｉで二重消化（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）して、ＤＮＡ断片を約３ｋ
ｂから約２．２ｋｂに短縮した。このＸｈｏＩ／ＰｓｔＩ ＤＮＡ断片を含有す
るプラスミドをｐＨＤＹ２とした。これは、大韓民国タイプカルチャーコレクシ
ョン（ＫＣＴＣ：Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕ
ｌｔｕｒｅ）（所在：Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏ
ｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ
），＃５２，Ｏｕｎ−ｄｏｎｇ，Ｙｕｓｏｎｇ−ｋｕ，Ｔａｅｊｏｎ ３０５−
３３３，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）に、２０００年２月１８日に寄
託され、受託番号ＫＣＴＣ ０７３２ＢＰとして受託された。ハンセヌラポリモ
ルパＤＬ１ ＰＲＣ１遺伝子の制限酵素地図作成と塩基配列決定は図１に示すよ
うに行った。ＰＲＣ１遺伝子の塩基配列は配列１に示す。このＤＮＡ配列はＧｅ
ｎＢａｎｋにＵ６７１７４として１９９６年８月１７日に登録された。この塩基
配列の分析によれば、ハンセヌラポリモルパＤＬ１ ＰＲＣ１遺伝子は１，６２
６ｂｐ長であり、イントロンをもたず、サッカロミセスセレビジアエＰＲＣ１遺
伝子の塩基配列と５４％の相同性を示すことが明らかである。配列１から類推す
ると、ハンセヌラポリモルパＤＬ１ ＰＲＣ１遺伝子のアミノ酸配列はサッカロ
ミセスセレビジアエのカルボキシペプチダ−ゼＹと５０％の相同性を示す。その
上、高い相同性が、セリンプロテアーゼ（ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ）の
活性部位（ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ）中で触媒基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｇｒｏ
ｕｐ）として作用するセリンであると同定されている２６３番目のアミノ酸残基
の周辺領域において認められる。
【００３６】 第四段階：プラスミドｐＨＤＰ４の構築 ハンセヌラポリモルパのゲノムＤＮＡからＰＥＰ４遺伝子を得るために、第一
段階で作製したプローブを用いてサザンブロッティングを行った。まず、第二段
階で得たゲノムＤＮＡの６アリコート（ａｌｉｑｕｏｔ）を制限酵素ＢａｍＨＩ
、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、及びＳａｌＩでそれぞ
れ処理し、得られたＤＮＡ断片を０．９％アガロースゲル上で電気泳動により分
画した。分離したＤＮＡ分子をＮｙｔｒａｎ メンブラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社製品）にブロッティングにより移し、ハイブリダイゼ
ーションに適した条件下で、ラベルされたプローブとサザンブロッティングした
。ハイブリダイゼーションは第三段階におけるのと同じ方法で行った。青色に染
色されたバンドが、制限酵素ＢａｍＨＩにより約８ｋｂ長に切断されたＤＮＡ断
片中に認められた。次に、ＤＮＡ断片を青色のバンドが表れた箇所から分離し、
これを用いて第三段階におけるのと同じ方法でＤＮＡライブラリーを作成した。
このＤＮＡライブラリーを対象としてサザンブロッティングを繰り返し行い、Ｐ
ＲＣ１遺伝子を担持するプラスミドを選別し、ｐＨＤＰ３とした。制限酵素Ｓａ
ｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて二重消化（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）
により、ＤＮＡ断片を約８ｋｂから約２．０ｋｂに短縮した。ＳａｃＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ ＤＮＡ断片を含有するプラスミドをｐＨＤＹ４とした。これは、大韓
民国タイプカルチャーコレクション（ＫＣＴＣ：Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）（所在：Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ），＃５２，Ｏｕｎ−ｄｏｎｇ，Ｙｕｓｏｎｇ−
ｋｕ，Ｔａｅｊｏｎ ３０５−３３３，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）
に、２０００年２月１８日に寄託され、受託番号ＫＣＴＣ ０７３３ＢＰとして
受託された。ハンセヌラポリモルパＤＬ１ ＰＥＰ４遺伝子の制限酵素地図作成
と塩基配列決定は図２に示すように行った。ＰＥＰ４遺伝子の塩基配列は配列２
に示す。このＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋにＵ６７１７３として１９９６年８月
１７日に登録された。この塩基配列の分析によれば、ハンセヌラポリモルパＤＬ
１ ＰＥＰ４遺伝子は１，２４２ｂｐ長であり、イントロンをもたず、サッカロ
ミセスセレビジアエＰＲＣ１遺伝子の塩基配列と５２．４％の相同性を示すこと
が明らかである。配列２から類推すると、ハンセヌラポリモルパＤＬ１ ＰＥＰ
４遺伝子のアミノ酸配列はサッカロミセスセレビジアエのプロテアーゼＡと５０
％の相同性を示す。その上、高い相同性が、アスパルチルプロテアーゼ（ａｓｐ
ａｒｔｙｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ）の活性部位（ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ）中で触
媒基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｇｒｏｕｐ）として作用するアスパラギン酸（ａｓ
ｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）であると同定されている１１７番目のアミノ酸残基に
おいて認められる。
【００３７】 第五段階：プラスミドｐＫＨ３．９の構築 ハンセヌラポリモルパのゲノムＤＮＡからＫＥＸ１遺伝子を得るために、第一
段階で作製したプローブを用いてサザンブロッティングを行った。まず、第二段
階で得たゲノムＤＮＡの６アリコート（ａｌｉｑｕｏｔ）を制限酵素ＢａｍＨＩ
、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩでそれぞれ処
理し、得られたＤＮＡ断片を０．９％アガロースゲル上で電気泳動により分画し
た。分離したＤＮＡ分子をＮｙｔｒａｎ メンブラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ
＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社製品）にブロッティングにより移し、ハイブリダイゼーシ
ョンに適した条件下で、ラベルされたプローブとサザンブロッティングした。ハ
イブリダイゼーションは第三段階におけるのと同じ方法で行ったが、組成を変更
したハイブリッド液（５× ＳＳＣ，０．１％ Ｎ−ラウリルサルコシン，０．
０２％ ＳＤＳ，２％ ブロッキング剤，５０％ ホルムアミド）を用いた。青
色に染色されたバンドが、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにより約４．５ｋｂ長に切断
されたＤＮＡ断片中に認められた。
【００３８】 次に、ＤＮＡ断片を青色のバンドが現れた箇所から分離し、これを用いて第三
段階におけるのと同じ方法でＤＮＡライブラリーを作成した。このＤＮＡライブ
ラリーを対象としてサザンブロッティングを繰り返し、ＰＲＣ１遺伝子を担持す
るプラスミドを選別し、プラスミドｐＫＨ４．５とした。プラスミドｐＫＨ４．
５は、大韓民国タイプカルチャーコレクション（ＫＣＴＣ：Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）（所在：Ｋｏｒｅａ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ），＃５２，Ｏｕｎ−ｄｏｎｇ，Ｙｕ
ｓｏｎｇ−ｋｕ，Ｔａｅｊｏｎ ３０５−３３３，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋ
ｏｒｅａ）に、２０００年２月１８日に寄託され、受託番号ＫＣＴＣ ０７３１
ＢＰとして受託された。制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて二重消化
（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）により、ＤＮＡ断片を約４．５ｋｂから
約３．９ｋｂに短縮した。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片を含有する
プラスミドをｐＫＨ３．９とした。ハンセヌラポリモルパＤＬ１ ＰＲＣ１遺伝
子の制限酵素地図作成と塩基配列決定は図３に示すように行った。ＰＲＣ１遺伝
子の塩基配列は配列３に示す。このＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋにＡＦ０９０３
２５として１９９８年９月４日に登録された。この塩基配列の分析によれば、ハ
ンセヌラポリモルパＤＬ１ ＫＥＸ１遺伝子は１，８３３ｂｐ長であり、イント
ロンをもたないことが明らかである。配列２から類推すると、ハンセヌラポリモ
ルパＤＬ１ ＫＥＸ１遺伝子のアミノ酸配列はサッカロミセスセレビジアエのカ
ルボキシペプチダーゼαと２０％程度の非常に低い相同性を示す。しかしながら
、セリンプロテアーゼ（ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ）の活性部位（ａｃｔ
ｉｖｅ ｓｉｔｅ）中で触媒基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｇｒｏｕｐ）として作用
するセリンであると同定されている１７６番目のアミノ酸残基については、カル
ボキシペプチダ‐ゼＹのみならずカルボキシペプチダ−ゼαとも高い相同性が認
められる。Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅの方法（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．，１７３：２４３，１９８４）に準じてアミノ酸分析した結果、１８
個のアミノ酸残基からなるシグナルペプチドの存在が明らかになった。
【００３９】 実験例２：分断されたプラスミドを用いる変異株の作製 第一段階：分断されたプラスミドｐＨＹＬの構築 ハンセヌラポリモルパＬＥＵ２遺伝子を、実験例１で構築されたプラスミドｐ
ＨＤＹ２中にクローン化されたＰＲＣ１遺伝子に、図４に示すように挿入した。
この目的のために、ハンセヌラポリモルパの１．２ｋｂ ＬＥＵ２遺伝子断片を
まず制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断することにより得て、その相対する
末端（ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｅｎｄｓ）をクレノウ処理（Ｋｌｅｎｏｗ ｔｒｅａ
ｔｍｅｎｔ）により平滑にした。この平滑末端化されたＬＥＵ２遺伝子断片をプ
ラスミドｐＨＤＹ２のＰＲＣ１遺伝子のＳｍａＩ部位に挿入してプラスミドｐＨ
ＹＬを構築し、その後これを用いてハンセヌラポリモルパＤＬ−１ゲノム上でカ
ルボキシペプチダーゼＹをコードするＰＲＣ１遺伝子を分断した。
【００４０】 第二段階：分断されたプラスミドｐＨＰＬの構築 ハンセヌラポリモルパＬＥＵ２遺伝子を、実験例１で構築されたプラスミドｐ
ＨＤＰ４中にクローン化されたＰＥＰ４遺伝子に、図６に示すように挿入した。
この目的のために、ハンセヌラポリモルパの１．０５ｋｂ ＤＮＡ断片をプラス
ミドｐＨＤＰ４中のＰＥＰ４遺伝子から、制限酵素ＥｃｏＲＶを使用して除去し
、一方、ハンセヌラポリモルパの１．２ｋｂ ＬＥＵ２遺伝子断片を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断することにより得て、その相対する末端をクレノウ
処理により平滑にした。ついで、この平滑末端化されたＬＥＵ２遺伝子断片を、
トランケートされたプラスミドｐＨＤＰ４に挿入してＰＥＰ４遺伝子の除去され
た部分と置換し、プラスミドｐＨＰＬを作成し、その後これを用いてハンセヌラ
ポリモルパＤＬ−１ゲノム上でプロテアーゼＡをコードするＰＥＰ４遺伝子を分
断した。
【００４１】 第三段階：分断されたプラスミドｐＫＵＺ、ｐＨＹＵＺ、ｐＨＰＵＺの構築 ハンセヌラポリモルパＤＬ−１のクローン化されたＫＥＸ１遺伝子を分断する
ために、ハンセヌラポリモルパＵＲＡ３遺伝子が選択マーカーとして繰り返し使
用されるように構成されたポップアウトカセット（ｐｏｐ‐ｏｕｔ ｃａｓｓｅ
ｔｔｅ）を図８に示すように構築した。このために、２１１ｂｐのＢａｍＨＩ／
ＰｖｕＩＩ ＬａｃＺ ＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１９から得て、１，３２
３ｂｐのハンセヌラポリモルパＵＲＡ３遺伝子の両端（ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｅｎ
ｄｓ）それぞれに同じ方向になるように連結してポップアウト プラスミドｐＬ
ａｃＵＲ３を作製した。
【００４２】 別途、プラスミドｐＫＨ３．９を制限酵素ＳｍａＩとＥｃｏＲＩで消化し、プ
ロモーターとコード領域の一部を含む１，１４８ｂｐ断片を除去した。ｐＬａｃ
ＵＲ３を制限酵素ＰｖｕＩＩとＥｃｏＲＩで切断し、２１１ｂｐのＬａｃＺ遺伝
子のダイレクト リピート（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔｓ）２つを含む１，７
３５ｂｐのハンセヌラポリモルパＵＲＡ３遺伝子断片を生じた。このハンセヌラ
ポリモルパＵＲＡ３遺伝子を、トランケートされたプラスミドｐＫＨ３．９に連
結して１，１４８ｂｐ断片と置換し、プラスミドｐＫＵＺを構築した。
【００４３】 プラスミドｐＫＵＺの構築におけるのと同じに、図５に示すように、ポップア
ウト プラスミドｐＬａｃＵＲ３を制限酵素ＰｖｕＩＩとＥｃｏＲＩで処理して
１，７３５ｂｐのハンセヌラポリモルパＵＲＡ３遺伝子断片を得、ついでこれを
プラスミドｐＨＤＹ２に挿入して、ＳｍａＩとＥｃｏＲＩとの処理によりプラス
ミドｐＨＤＹ２から除去されていた、コード領域の一部分を含む１，０５５ｂｐ
断片と置換した。得られたプラスミドをｐＨＹＵＺとした。
【００４４】 同様に、ｐＨＤＰ４中のハンセヌラポリモルパＤＬ−１のクローン化されたＰ
ＥＰ４遺伝子をポップアウトカセットを使用して分断した。図７に示すように、
１，８００ｂｐ長のハンセヌラポリモルパＵＲＡ３遺伝子断片をポップアウト
プラスミドｐＬａｃＵＲ３を制限酵素ＰｖｕＩＩとＳａｌＩで処理することによ
って得、プラスミドｐＨＤＰ４に挿入して、ＸｈｏＩとＥｃｏＲＶによりプラス
ミドｐＨＤＰ４から除去されていた、コード領域の一部分を含む３０３ｂｐ断片
と置換した。得られたプラスミドをｐＨＰＵＺとした。
【００４５】 第四段階：分断したプラスミドを用いる形質転換 上記で構築したプラスミドｐＫＵＺを使用して、ハンセヌラポリモルパＤＬ−
１株（ｌｅｕ２，ｕｒａ３，ＫＥＸ１，ＰＥＰ４，ＰＲＣ１）を形質転換してカ
ルボキシペプチダーゼα変異株（ｌｅｕ２，ｋｅｘ１：：ＵＲＡ３，ＰＥＰ４，
ＰＲＣ１）とし、ついでこれを５‐フルオロオロト酸（５−Ｆｌｕｏｒｏｏｒｏ
ｔｉｃ ａｃｉｄ）が０．１％含まれた最小固体培地（ｍｉｎｉｍａｌ ｓｏｌ
ｉｄ ｍｅｄｉｕｍ）（０．７％ アミノ酸欠乏酵母基質（ＹＮＢ）、２％ ブ
ドウ糖、ウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）５０μｇ／ｍＬ，ロイシン（ｌｅｕｃｉｎｅ
）５０μｇ／ｍＬ，２％ 寒天（ａｇａｒ））上で７２時間以上培養して、ハン
セヌラポリモルパからＵＲＡ３遺伝子ポップアウト株（ｌｅｕ２，ｕｒａ３，ｋ
ｅｘ１：：ＬａｃＺ，ＰＥＰ４，ＰＲＣ１）を選別した。ハンセヌラポリモルパ
ＤＬ−１／Δｋｅｘ１は大韓民国タイプカルチャーコレクション（ＫＣＴＣ：Ｋ
ｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）（所在
：Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ），＃５２，Ｏｕｎ
−ｄｏｎｇ，Ｙｕｓｏｎｇ−ｋｕ，Ｔａｅｊｏｎ ３０５−３３３，Ｒｅｐｕｂ
ｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）に、２０００年２月１８日に寄託され、受託番号Ｋ
ＣＴＣ ０７３６ＢＰとして受託された。この変異株はプラスミドｐＨＹＵＺで
再度形質転換してカルボキシペプチダーゼα／カルボキシペプチダーゼＹ変異株
（ｌｅｕ２，ｋｅｘ１：：ＬａｃＺ，ｐｒｃ１：：ＵＲＡ３，ＰＥＰ４）とした
。このカルボキシペプチダーゼα／カルボキシペプチダ−ゼＹ変異株を５‐フル
オロオロト酸が０．１％含まれた最小固体培地上で培養することにより、ＵＲＡ
３遺伝子ポップアウト株、（ｌｅｕ２，ｕｒａ３，ｋｅｘ１：：ＬａｃＺ，ｐｒ
ｃ１：：ＬａｃＺ，ＰＥＰ４）の選別を為し得た。上記と同様の形質転換と培養
により、ＵＲＡ３遺伝子がポップアウトされた、カルボキシペプチダーゼα／カ
ルボキシペプチダ−ゼＹ変異株（ｌｅｕ２，ｕｒａ３，ｋｅｘ１：：ＬａｃＺ，
ｐｒｃ１：：ＬａｃＺ，ＰＥＰ４）を、ＵＲＡ３遺伝子ポップアウト株、カルボ
キシペプチダーゼα／カルボキシペプチダ−ゼＹ／プロテアーゼＡ変異株（ｌｅ
ｕ２，ｕｒａ３，ｋｅｘ１：：ＬａｃＺ，ｐｒｃ１：：ＬａｃＺ，ｐｅｐ４：：
ｌａｃＺ）に、プラスミドｐＨＰＵＺの助けにより転換した。
【００４６】 同様に、プラスミドｐＨＹＵＺとｐＨＰＵＺの組み合わせを用いて、カルボキ
シペプチダ−ゼＹ／プロテアーゼＡ変異株（ｌｅｕ２，ｕｒａ３，ｐｒｃ１：：
ＬａｃＺ，ｐｅｐ４：：ｌａｃＺ，ＫＥＸ１）を作製し、一方、プラスミドｐＫ
ＵＺとｐＨＰＵＺの組み合わせによりカルボキシペプチダーゼα／プロテアーゼ
Ａ変異株（ｌｅｕ２，ｕｒａ３，ｋｅｘ１：：ＬａｃＺ、ｐｅｐ４：：ｌａｃＺ
、ＰＲＣ１）を作製した。
【００４７】 ハンセヌラポリモルパの形質転換はリチウム酢酸法により行った。ｈＥＧＦの
生産性が高いハンセヌラポリモルパＵＲ２（ｌｅｕ２）株をＹＥＰＤブロス（ペ
プトン ２％、酵母抽出物 １％、ブドウ糖 ２％）中でＯＤ６０００＝０．５
程度まで培養した。細胞を回収してＬｉＴＥ溶液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，
ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＬｉＡｃ，ｐＨ７．５）で洗浄し
、ついで０．０１容量のＬｉＴＥ溶液に懸濁してコンピテント細胞（ｃｏｍｐｅ
ｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を作製した。１００μｌのコンピテント細胞に０．５ｇの
問題のプラスミド、運搬ＤＮＡとして作用する１０μｇの鮭精子ＤＮＡ、及び０
．６ｍＬのＰＥＧ／ＬｉＡｃ溶液（４０％ ＰＥＧ４０００，０．１Ｍ Ｔｒｉ
ｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＬｉＡｃ，ｐＨ７．５
）を添加した。得られた細胞混合物を３０℃で３０分間静置し、７０μｌのＤＭ
ＳＯを添加して再び４２℃で１５分間静置した後、氷で急速に冷却した。この細
胞を、回収後に最小固体培地（０．６７％ アミノ酸欠乏酵母基質、２％ ブド
ウ糖、２％ 寒天）上で３７℃にて７２時間培養した。プラスミドｐＨＹＬは制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｃｏＩを用いて、プラスミドｐＫＵＺはＸｈｏＩを用
いて、プラスミドｐＨＹＵＺはＸｈｏＩ／ＰｓｔＩを用いて、そしてプラスミド
ｐＨＰＵＺはＳｐｅＩ／ＳｎａＢＩを用いて線形化し、形質転換に用いた。
【００４８】 実施例３：カルボキシペプチダ−ゼＹ変異株及びプロテアーゼＡ変異株のカル
ボキシペプチダーゼＹ活性測定並びに該菌株から産生されたｈＥＧＦの分析 第一段階：カルボキシペプチダ−ゼＹ変異株及びプロテアーゼＡ変異株のカル
ボキシペプチダーゼＹ活性測定 ジメルホルムアミド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ）中で２．５ｍｇ
／ｍＬのＮ−ベンゾイル−Ｌ−チロシン−ｐ−ニトロアニリド（Ｎ‐ｂｅｎｚｏ
ｙｌ‐Ｌ‐ｔｙｒｏｓｉｎｅ‐Ｐ‐ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ）と０．１Ｍ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）とを１：４の容量比で混合し、得られた溶液の０
．２ｍＬを９６ウエルマイクロタイタ−プレ−ト（９６Ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｔ
ｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）の各ウエルに分注した。実験例２で得られた形質転換体
を該ウエルに播種して３７℃で１６時間インキュベートした。細胞培養は、活性
があるカルボキシペプチダ−ゼαの酵素作用により黄色を帯びるのに対し、活性
のあるカルボキシペプチダーゼがない、又は不活性のカルボキシペプチダーゼを
含む細胞培養は無色に近いという現象に基づき、４５０ｎｍの吸光度を測定して
ＰＲＣ１遺伝子が効果的に分断された菌株を選別した。また、プロテアーゼＡ変
異株ではカルボキシペプチダ−ゼＹのプロセシングが阻害されるため、カルボキ
シペプチダ−ゼＹの活性を測定することによりＰＥＰ４遺伝子が分断された菌株
を選別した。
【００４９】 結果は下記の表１に示した。表１に示した通り、カルボキシペプチダ−ゼＹ変
異株でカルボキシペプチダ−ゼの活性は殆ど検出されず、一方プロテアーゼＡ変
異株ではカルボキシペプチダ−ゼＹの活性が６０％以上低減された。これらの結
果により、本発明においてクローン化されたＰＲＣ１とＰＥＰ４遺伝子がそれぞ
れハンセヌラポリモルパのカルボキシペプチダ−ゼＹとプロテアーゼＡをコード
すると目された。その上、ＰＲＣ１及び／又はＰＥＰ４遺伝子が分断された変異
株でカルボキシペプチダ−ゼの活性が著しく低減されたことが確認された。形質
転換されたハンセヌラポリモルパＤＬ１／Δｃｐｙ及びハンセヌラポリモルパＤ
Ｌ１／Δｐｅｐ４は大韓民国タイプカルチャーコレクション（ＫＣＴＣ：Ｋｏｒ
ｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）（所在：Ｋ
ｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃ
ｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ），＃５２，Ｏｕｎ−ｄ
ｏｎｇ，Ｙｕｓｏｎｇ−ｋｕ，Ｔａｅｊｏｎ ３０５−３３３，Ｒｅｐｕｂｌｉ
ｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）に、２０００年２月１８日に寄託され、それぞれ受託番
号ＫＣＴＣ ０７３５ＢＰ及びＫＣＴＣ ０７３４ＢＰとして受託された。
【００５０】
【表１】カルボキシペプチダ−ゼＹ変異株でのカルボキシペプチダ−ゼ活性 ┌──────────┬──────────┬────────────┐ │ 菌株 │ 遺伝子型 │カルボキシペプチダーゼＡ│ │ │ │ 活性（Ａｂｓ） │ ├──────────┼──────────┼────────────┤ │ハンセヌラポリモルパ│leu2,PEP4,PRC1,hEGF │ ２．９７ │ │ＵＲ２ │ │ │ ├──────────┼──────────┼────────────┤ │ＰＥＰ４変異株 │pep4::LEU2,PRC1,hEGF│ １．００ │ ├──────────┼──────────┼────────────┤ │ＰＲＣ１変異株 │prc1::LEU2,PEP4,hEGF│ ０．１０ │ └──────────┴──────────┴────────────┘
【００５１】 第二段階：サザンブロッティングによる分断の確認 ハンセヌラポリモルパ遺伝子ＬＥＵ２によるハンセヌラポリモルパ遺伝子ＰＲ
Ｃ１及びＰＥＰ４の分断並びにハンセヌラポリモルパ遺伝子ＵＲＡ３によるハン
セヌラポリモルパ遺伝子ＫＥＸ１の分断を確認するためにサザンブロッティング
を行った。実験例３の第四段階で選別した形質転換体それぞれをＹＥＰＤ培地に
接種して３７℃で１８〜２０時間振盪培養した。細胞を、遠心分離して回収した
後、１．５ｍＬチューブ内でＳＴＥＳ溶液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍ
ＥＤＴＡ、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ７．６中に１％ ＳＤＤ）３０μｌ
に懸濁し、直径０．４ｍｍのガラスビーズを０．８容量添加した後、５分間攪拌
した。ついで、各チューブにＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．
０中に１ｍＭ ＥＤＴＡ）２００μｌとフェノ−ル／クロロホルム／イソアミル
アルコール（２５：２４：１）２００μｌとを添加して２分間攪拌した後、１２
，０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄液に２．５容量のエタノールを添加してゲ
ノムＤＮＡを沈殿させた。ゲノムＤＮＡ２〜３μｇを脱イオン水に溶解した。
【００５２】 このＤＮＡ溶液を制限酵素で処理した。ＰＲＣ１遺伝子分断株のゲノムＤＮＡ
には制限酵素ＥｃｏＲＩを、ＰＥＰ４遺伝子分断株のゲノムＤＮＡには制限酵素
ＥｃｏＲＶを、そしてＫＥＸ１遺伝子分断株のゲノムＤＮＡには制限酵素Ｘｈｏ
Ｉを用いた。制限酵素で切断されたＤＮＡ分子を、０．８％アガロースゲルで電
気泳動により分画した。図１、２、及び３にそれぞれ示した遺伝子ＰＲＣ１、Ｐ
ＥＰ４、及びＫＥＸ１をプローブとして用いてサザンブロッティングし、その結
果を図９に示した。
【００５３】 図９のブロッティングバンド内に見られるように、カルボキシペプチダ−ゼＹ
変異株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで処理したとき、０．６５ｋｂ長の
ＰＲＣ１断片にＬＥＵ２遺伝子が挿入されて１．８５ｋｂ長の融合ＤＮＡ断片が
得られた。プロテアーゼ変異株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＶで処理した
ときは、ＬＥＵ２遺伝子をＰＥＰ４遺伝子の１．１ｋｂのＥｃｏＲＶ断片に置換
する過程でＥｃｏＲＶ認識部位が除去されたため、１０ｋｂの大きさに相当する
単一バンドが検出された。カルボキシペプチダ−ゼα変異株のゲノムＤＮＡを制
限酵素ＸｈｏＩで切断したときは、ＫＥＸ１遺伝子の３．５ｋｂ断片にＵＲＡ３
遺伝子が挿入されて４ｋｂ長の融合ＤＮＡ断片が得られた。他方、この伸長され
たＤＮＡ断片は、ポップアウト株においてはＵＲＡ３遺伝子が除去されるので、
２．５ｋｂ長に短縮された。従ってこれらの結果から、遺伝子の分断が、ＰＲＣ
１及びＰＥＰ４遺伝子においてハンセヌラポリモルパのＬＥＵ２遺伝子により、
並びにＫＥＸ１遺伝子においてハンセヌラポリモルパのＵＲＡ３遺伝子により、
なされたのが確認された。
【００５４】 第三段階：変異株から分泌されたｈＥＧＦの分析 変異体からＹＰ‐メタノール培地（酵母抽出物１％、ペプトン２％、メタノー
ル２％）に分泌されたｈＥＧＦの分析のために、培養液を遠心分離した。その上
澄液を、セプ‐パック カートリッジ（Ｓｅｐ‐Ｐａｋ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）
（Ｃ１８、Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）により部分精製し、そしてＨ
ＰＬＣで分析した。部分精製に関して、セプ‐パック カートリッジはそれぞれ
１０ｍｌずつの水、メタノール、０．１％トリフロロ酢酸、及び２０％アセトニ
トリル／０．１％トリフロロ酢酸で処理して活性化し、２０％アセトニトリル及
び０．１％トリフロロ酢酸で調整された培養上澄液を、この活性化されたセプ‐
パック カートリッジに通過させて蛋白質を該カートリッジに吸着させた後、２
０％アセトニトリルと０．１％トリフロロ酢酸でカートリッジを洗浄して不純物
を除去した。吸着されたｈＥＧＦは１ｍＬの５０％アセトニトリルと０．１％ト
リフロロ酢酸で３回溶出した。ｈＥＧＦを含む溶出液は凍結乾燥して濃縮した。
【００５５】 部分精製された試料は、試料の分離のために４．６×２５０ｍｍ、５μｍ‐Ｃ
４カラム（Ｖｙｄａｃ社）を用いて、逆相ＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｍｏｄｅ
ｌ １２６ Ｓｙｓｔｅｍ）によって分析した。移動相は流速０．８ｍＬ／分で
、濃度を２０％アセトニトリル及び０．１％トリフロロ酢酸から６０％アセトニ
トリル及び０．１％トリフロロ酢酸に３５分かけて増加させて、移動させた。試
料分離の識別のため２１５ｍｍでの吸光度を測定した。ＨＰＬＣから分離された
試料がｈＥＧＦを含んでいるか否かを確認するために、各ピークの画分について
ＥＬＩＳＡを行った。このため、まずそれぞれの試料を抗原コーティング緩衝液
（０．１Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ９．６）で適宜に希釈し、該希釈液を
１００μｌ量ずつマイクロタイタープレートウエル（Ｎｕｎｃ‐ｉｍｍｕｎｏｍ
ｏｄｕｌｅ）の各ウエルに加えて３７℃で２時間反応させた。該ウエルをＰＢＳ
Ｔ（リン酸緩衝生理食塩水＋０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した後、０．０
５％ ゼラチンを含むＰＢＳの１００μｌをそれぞれのウエルに加えて３７℃で
３０分間静置した。前記ウエルをＰＢＳＴで洗浄し、ｈＥＧＦに対するモノクロ
ーナル抗体（ＵＢＩ ＃０５−１０９）を０．０５％ゼラチンを含むＰＢＳで１
０，０００倍に希釈して得られた抗体溶液を１００μｌずつ添加した。各ウエル
内で抗原抗体反応を３７℃で２時間行わせた後、更にＰＢＳＴで洗浄した。西洋
わさびが結合されたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ‐ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ）（Ｂｉｏ‐Ｒａ
ｄ社）を０．０５％ゼラチンを含むＰＢＳ溶液で３，０００倍に希釈して、ウエ
ル当たり１００μｌずつ加えて３７℃で１時間反応させた。該ウエルは再度ＰＢ
ＳＴで洗浄して発色反応させた。発色のためにＴＭＢ基質キット（Ｐｉｅｒｃｅ
社）をパーオキシダーゼ基質として用いた。この基質を、０．０４％ＴＭＢ（３
，３’，５，５’ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ Ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）とクエン酸緩
衝液と混合物中で０．０２％の過酸化水素溶液と、１：１の比率で混合してウエ
ル当たりに１００μｌ量ずつ加えた。１５分後に２Ｍの硫酸１００μｌで、各ウ
エル内の反応を停止させた。発色反応完了後、発色定量分析を９６−ウエル プ
レート オートリーダー（９６‐ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ
：ＴＨＥＲＭＯ ｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＵＳＡ）で４
５０ｎｍでの吸光度を測定することにより行った。対照として、組換えｈＥＧＦ
（ＵＢＩ ＃０１−１０７）を、０．２５から５ｎｇ／ウエルの範囲の量で使用
した。定量分析の結果、発現されたｈＥＧＦは２つの画分中で検出された。
【００５６】 これらの画分を、定性分析のために凍結乾燥した。これら二種類のｈＥＧＦは
、Ｎ−末端アミノ酸配列と分子量について、大韓民国基礎科学支援研究所（Ｋｏ
ｒｅａ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で分析された。二
つのピークからｈＥＧＦ活性が検出された。それらのうち、比較的に親水性のピ
ークはＭＡＬＤＩ−Ｍａｓｓ分析により測定されたとき、分子量が６，２０５で
あることが判明した。従って、これは５３アミノ酸残基からなる完全なｈＥＧＦ
であった。他方、より高いアセトニトリル濃度で溶出された、比較的に疎水性の
ピークのｈＥＧＦは分子量が６，０５３であり５２アミノ酸残基からなるものと
測定された。アミノ酸配列分析により、この二種類のｈＥＧＦのＮ−末端領域に
おいてＡｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−の配列が読み取れ、このこと
から両方のｈＥＧＦ分子がＫＥＸ２によりシグナルペプチドから間違いなく分離
されることが明らかになった。従って、５２アミノ酸残基からなるｈＥＧＦは全
長ｈＥＧＦのＣ−末端から１アミノ酸残基が分離したものである。すなわち、全
長ｈＥＧＦはそのＣ−末端領域に−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ配
列を有するので、完全長のｈＥＧＦからアルギニン残基が分離すると、その結果
５２アミノ酸残基からなるｈＥＧＦがより疎水性となる。
【００５７】 前記分析により得られたＨＰＬＣのピークに関する情報で、ハンセヌラポリモ
ルパＵＲ株から分泌されたｈＥＧＦとプロテアーゼ欠損株から分泌されたそれと
を比較した。ｈＥＧＦの総量は、プロテアーゼＡ変異株でＵＲ２株におけるより
低かったが、これらの間でＣ−末端の分解に著しい変化は見いだされなかった。
他方、カルボキシペプチダ−ゼＹ変異株では、著しいカルボキシペプチダ−ゼＹ
分断効果が生じた。Ｃ−末端領域ｈＥＧＦにおいて分解されていないｈＥＧＦで
あって完全なもの、すなわち５３アミノ酸残基からなるｈＥＧＦは、ＵＲ２株か
ら分泌されたｈＥＧＦの３７％に達するが、カルボキシペプチダ−ゼＹ変異株で
は５７％に増加した。
【００５８】
【実施例２】 メタノールオキシダーゼ（ＭＯＸ）遺伝子が分断されたハンセヌラポリモルパ
変異株の作製 実験例１：ＭＯＸ−ＴＲＰ３遺伝子を分断するためのｐＭＬＴ−デルタ ベクタ
ーの構築 サッカロミセスセレビジアエを含む種々の酵母を、特定の遺伝子が分断された
変異株へ転換することは、導入された選択性のあるマーカーカセットが問題の遺
伝子部位で相同的二重交差によりゲノムに挿入された形質転換体を選別すること
により一般的に達成される（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．
１０１：２０２，１９８３）。他方、導入された選択性のあるマーカーカセット
は、ほとんどが、非相同的組換えによりハンセヌラポリモルパのゲノムの非特定
の部位に挿入される。従って、選択性のあるマーカーカセットがＭＯＸ遺伝子の
位置で相同的二重交差によりゲノムに挿入されてＭＯＸ遺伝子が分断されるｍｏ
ｘ変異体ハンセヌラポリモルパ株の作製の成功は非常に低い効率でしかない。
【００５９】 ＭＯＸ遺伝子が分断されたΔｍｏｘ変異体ハンセヌラポリモルパ株を助長する
ために、ＭＯＸ遺伝子と該ＭＯＸ遺伝子のすぐ隣りに接しているＴＲＰ３遺伝子
とを、本発明者らの以前の研究結果（Ａｇａｐｈｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅ
ａｓｔ １１：１２４１，１９９５）、これはＴＲＰ遺伝子（Ｒｅｉｄ Ｇ．Ａ
．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６，６２３６）が相同的組換えにより２
％程度まで分断され得ること及びＭＯＸプロモーターとＴＲＰ３遺伝子のＤＮＡ
断片とを担持する発現カセットが相同的組換えによりＭＯＸプロモーターとＴＲ
Ｐ３遺伝子の部位でゲノムに挿入されてＴＲＰ＋形質転換体を選択し得ることを
開示している、に基づいて両方とも分断した。この目的のために、まず、良く知
られているベクターｐＳＭ１（Ａｇａｐｈｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ
１１：１２４１，１９９５）をＥｃｏ４７ＩＩＩ／ＥｃｏＲＶで消化してＭＯ
Ｘプロモーターの一部分、全長ウロキナーゼ遺伝子、及びＴＲＰ３遺伝子の一部
分からなる２．５ｋｂのＤＮＡ断片を欠失させた。別途、公知のベクターＹＥｐ
１３（Ｂｒｏａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８，１２１，１９７９）をＨｐ
ａＩ／ＳａｌＩで消化してサッカロミセス由来のＬＥＵ２遺伝子を担持した２ｋ
ｂのＤＮＡ断片を切除した。欠失させた２．５ｋｂのＤＮＡ断片を入れ替えて、
得られた２ｋｂのＤＮＡ断片を、線形化したｐＳＭ１ベクターにライゲーション
し、ＭＯＸ遺伝子とＴＲＰ３遺伝子を一度に分断することのできるベクター ｐ
ＭＬＴ−デルタを構築した。この構築概要を図１０に示す。図１０に示すように
、ｐＭＬＴ−デルタは、ハンセヌラポリモルパに対する選択性のあるマーカーと
して、ＭＯＸプロモーターの一部分とＴＲＰ３遺伝子の一部分とに隣接する（ｆ
ｌａｎｋｅｄ）サッカロミセスセレビジアエ ＬＥＵ２遺伝子を有する（ｍｏｘ
（ｐ）：：Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＬＥＵ２：：ｔｒｐ３）。
【００６０】 ベクター ｐＭＬＴ−デルタを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αはＭＯＸ
−ＴＲＰ３遺伝子を分断するのに有用であり、Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙの大韓民国タイプカルチャーコレクションに受託番号ＫＣＴＣ ０７
２７ＢＰとして２０００年２月１０日に寄託された。
【００６１】 実験例２：新規Δｍｏｘ変異体ＤＬＴ２の構築及び特徴 ＭＯＸ−ＴＲＰ３遺伝子分断変異体を作製するための母株として、ｌｅｕ−栄
養要求性ハンセヌラポリモルパＤＬ−１（ＡＴＣＣ ２６０１２）由来変異体、
ＤＬ１−Ｌ（ｌｅｕ２）を用いた。
【００６２】 上記で得られたベクター ｐＭＬＴ−デルタを制限酵素ＸｈｏＩとＳａｃＩで
切断してＨｉｌｌ法（Ｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ
．，１９：５７９１，１９９１）に従ってハンセヌラポリモルパＤＬ１−Ｌ（ｌ
ｅｕ２）に導入し、ついでこれをトリプトファンを含む最小固体培地（２％ ブ
ドウ糖、０．６７％アミノ酸欠乏酵母基質、２０ｍｇ／Ｌ トリプトファン）上
で培養してＬＥＵ＋形質転換体をまず選別した。ｍｏｘ（ｐ）：：Ｓ．ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ ＬＥＵ２：：ｔｒｐ３ カセットがＭＯＸプロモーターとＴＲＰ
３遺伝子の位置に相同的組換えにより挿入されたｔｒｐ−、ｍｏｘ−形質転換体
（図１１）を選別する目的で、これらＬＥＵ＋形質転換体が唯一の炭素源として
メタノールを含むトリプトファン欠乏培地上で生育できるかどうか観察した。Ｍ
ＯＸプロモーターとＴＲＰ３遺伝子断片とをプローブとして用いるサザンブロッ
ティングにより、選択されたｔｒｐ−、ｍｏｘ−形質転換体をＭＯＸ遺伝子の大
部分とＴＲＰ３遺伝子の一部分がそれらのゲノム上で分断されたかどうかについ
て調べた。最後に、選択された変異体をＤＬＴ２（ｌｅｕ２ ｍｏｘ ｔｒｐ：
：ＬＥＵ２）と呼称した。ＤＬＴ２はゲノム上でのＭＯＸ遺伝子の分断のため、
もはやメタノールオキシダーゼを生産することができないので、そのメタノール
消費速度はＭＯＸ野生型ＤＬ１−Ｌと比較して非常に低減されており、そのため
図１２Ａ及び１２Ｂの結果から明白なように、ＤＬＴ２は唯一の炭素源としてメ
タノールを含む培地中で生育することが実質的に不可能となる。その上、図１２
Ｃ、１２Ｄ及び１２Ｅに見られるように、変異体は、ＴＲＰ３遺伝子の分断のた
めにトリプトファン欠乏培地又はＹＰＤ培地（２％ ブドウ糖、２％ ペプトン
、１％ 酵母抽出物）中で生育することができない。
【００６３】 このΔｍｏｘ変異体ＤＬＴ２は、Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉ
ｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
の大韓民国タイプカルチャーコレクションに受託番号ＫＣＴＣ ０７２８ＢＰと
して２０００年２月１０日に寄託された。
【００６４】 実験例３：ＤＬＴ２のＭＯＸ遺伝子領域への発現ベクターの挿入及びそれからの
ポップアウト（Ｐｏｐ−ｏｕｔ） ハンセヌラポリモルパは主に非相同的組換えにより形質転換され、その結果、
導入された発現ベクターの大部分がゲノム上の非特異的領域に挿入される。しか
しながら、ＭＯＸプロモーターとＴＲＰ３遺伝子の一部分とをそれぞれその反対
側の末端において含む発現ベクターを、Δｔｒｐに加えてΔｍｏｘであるＤＬＴ
２宿主に導入したときには、ゲノム上のＭＯＸプロモーターとＴＲＰ３遺伝子部
位における相同的組換えの結果としてＴＲＰ＋形質転換体を得ることができた。
すなわち、発現カセットがＭＯＸ遺伝子部位に挿入された形質転換体（図１３Ａ
）は、比較的容易に選別され得た。
【００６５】 さらに、挿入された発現ベクターを後にポップアウトするとき、上記実験例２
でＤＬＴ２の作製に使用した、ＸｈｏＩとＳａｃＩとで切断されたベクター ｐ
ＭＬＴ−デルタを、組換えＤＬＴ２株に再度導入してＬＥＵ＋形質転換体を選別
した。該形質転換体が、ｍｏｘ−、ｔｒｐ−形質であり、先在している組換え蛋
白質を発現したかどうかに関する同定を行い、図１３Ｂに示したように、先在し
ている組換え発現ベクターがゲノムから相同的組換えにより除去されていること
を確認した。この方法により、古い発現ベクターを担持しているＤＬＴ２形質転
換体を、ＭＯＸプロモーターとＴＲＰ３遺伝子の一部分とを含む新規発現ベクタ
ーをそのＭＯＸ部位において上述のように受け入れられる本来のＤＬＴ２に戻す
ことができる。
【００６６】 さらに、ＭＯＸ遺伝子とＴＲＰ３遺伝子とを含む３．５ｋｂ ＤＮＡ断片を、
ｐＭＯＸ３６１６（ＫＲＩＢＢ 報告書 ＢＳＫＧ １０５０−８８５−３）を
制限酵素ＰｓｔＩ／ＸｂａＩで切断することにより得て、ＤＬＴ２形質転換体に
導入した。それらのうち、メタノールとロイシンとを添加した合成培地上で急速
に生育した形質転換体を選択した。すなわち、ＭＯＸ遺伝子に挿入された先在し
ている発現ベクターをポップアウトしてＭＯＸ遺伝子を復活させ、これにより図
１３Ｃに示したように、ＤＬＴ２形質転換体をＭＯＸ＋株へ転換した。
【００６７】 その結果、ＤＬＴ２形質転換体が変異された後に、予め挿入された発現ベクタ
ーが除去されて宿主ゲノム上の新規発現ベクターと置換され得る。別途、所望の
表現型の変異体をＭＯＸ＋野生型を背景として作製し得る。従って、宿主ゲノム
に挿入された発現ベクターについてのポップアウト方法により、以前に開発され
た変異株を種々の組換え蛋白質を製造するための宿主として使用できる。
【００６８】 実験例４：ＭＯＸ野生型とΔｍｏｘ変異体との間の組換え蛋白質発現効率の比較 ＭＯＸ野生型の組換え蛋白質発現効率をΔｍｏｘ変異株のそれと比較するため
に、ＤＬ１−ＬをＭＯＸ野生型として使用し、上記実験例２で作製したＤＬＴ２
を変異株として選択した。問題の組換え蛋白質はヒト尿中プラスミノゲンキナー
ゼ（ｕ−ＰＡ）であり、単にウロキナーゼと称した。ＤＬＴ２株（ｌｅｕ２ ｍ
ｏｘ−ｔｒｐ３：：ＳｃＬＥＵ２）のＭＯＸ遺伝子部位に、ｕ−ＰＡ遺伝子がＭ
ＯＸプロモーターにリンクされたｕ−ＰＡ発現カセットを担持するｐＳＭ１ベク
ター（Ａｇａｐｈｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓｔ １１：１２４１，１９
９５）を導入し、ｕ−ＰＡを発現できるΔｍｏｘ形質転換体を得た。一方、ｕ−
ＰＡを発現することのできるＭＯＸ形質転換体を、同様のｕ−ＰＡ発現カセット
を担持するが、ＨＬＥＵ２−ｄ（Ａｇａｐｈｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｓ
ｔ １５：５４１，１９９９）を選択マーカーとして使用しているベクターｐＫ
ＳＭ８（Ａｇａｐｈｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，未公開結果）を、ＤＬ１−Ｌ（ｌ
ｅｕ２）に導入し、そしてＬＥＵ＋形質転換体を選別することにより作製した。
【００６９】 ＹＰＤ培地（酵母抽出物 １％、バクト−ペプトン ２％、ブドウ糖 ２％）
中で１８ｈ時間培養した後、選別した形質転換体をＩＭ培地（酵母抽出物 １％
、バクト−ペプトン ３％、メタノール ２％）中に１７％の量で接種し、そし
て７０時間振盪培養した。細胞培養の中に分泌されたｕ−ＰＡは、Ａｓｔｒｕｐ
法（Ａｓｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｉｙ
ｓ．４０：３４６，１９５２）に準じ、フィブリンプレートを補助に用い、活性
を調べた。Δｍｏｘ形質転換体は、メタノールを主な炭素源として含むＩＭ培地
中ではＭＯＸ形質転換体より低速度で生長するので、７０時間培養後に得られた
細胞培養のｕ−ＰＡ活性は細胞蛋白質総量と比較して調整し、そしてｍｇ総細胞
蛋白質当たりの国際単位（ＩＵ／ｍｇ総蛋白質）（ＩＵ／ｍｇ ｏｆ ｔ．ｃ．
ｐ．）で表示した。結果は、下記の表２に示す。表２のデータから明らかなよう
に、Δｍｏｘ形質転換体のｕ−ＰＡ発現効率はＭＯＸ形質転換体のそれの４倍で
あり、ＤＬＴ２株がｕ−ＰＡ産生宿主として卓越していることが明らかである。
【００７０】
【表２】ハンセヌラポリモルパＭＯＸ野生型（ＤＬ１−Ｌ）とΔｍｏｘ変異体（
ＤＬＴ２）をフラスコ中で振盪培養した後のウロキナーゼの発現効率 ┌──┬────┬────┬──────────┬─────────┐ │番号│ＭＯＸ │U-PA活性│ 比活性 │ 平均値 │ │ │の状態 │(IU／ml)│ (IU/mg of t.c.p.) │ (IU/mg of t.c.p.)│ ├──┼────┼────┼──────────┼─────────┤ │１ │ ＭＯＸ │ １９ │ ６．８ │ ７．６ │ ├──┤ ├────┼──────────┤ │ │２ │ │ ２５ │ ９．２ │ │ ├──┤ ├────┼──────────┤ │ │３ │ │ ２２ │ ６．９ │ │ ├──┼────┼────┼──────────┼─────────┤ │４ │Δｍｏｘ│ ２８ │ ２８ │ ２９．６ │ ├──┤ ├────┼──────────┤ │ │５ │ │ １８ │ ２３ │ │ ├──┤ ├────┼──────────┤ │ │６ │ │ ２９ │ ３６ │ │ ├──┤ ├────┼──────────┤ │ │７ │ │ ２５ │ ３４ │ │ ├──┤ ├────┼──────────┤ │ │８ │ │ ２６ │ ２７ │ │ └──┴────┴────┴──────────┴─────────┘
【００７１】 実験例５：組換えアルブミンのΔｍｏｘ変異体ＤＬＴ２での産生 ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を用い、組換え発現効率についてＭＯＸ野生型
とΔｍｏｘ形質転換との間でさらに比較を行った。このために、まず、ヒト血清
アルブミンをコードする遺伝子がＭＯＸプロモーターとＴＲＰ３遺伝子断片との
間に挿入された組換えアルブミン発現カセットを構築した。Δｍｏｘ変異体ＤＬ
Ｔ２のＭＯＸ遺伝子部位に該アルブミンカセットを導入することにより、形質転
換体ＤＬＴ２／ＨＳＡを作製し（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，未公表）、そしてＫ
ｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ
Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ）に受託番号ＫＣＴ
Ｃ ０７４０ＢＰとして２０００年３月２日に寄託した。該アルブミン発現カセ
ットがＭＯＸ野生型のＭＯＸ遺伝子部位に挿入された形質転換体として、以前の
研究で作製されているＤＬ１−Ｌ／Ｔ７（大韓民国特許出願第１３３１９０号）
を使用した。これらの形質転換体は、ＹＰＧ培地（酵母抽出物 １％、バクト−
ペプトン ２％、グリセロール ２％）中で１６〜２０時間種培養し、ついで発
現誘導ＹＰＭ培地（酵母抽出物 １％、バクト−ペプトン ２％、メタノール２
％）が入っている２５０ｍｌのバッフル付き（ｂａｆｆｌｅｄ）フラスコ中で振
盪しながら７２時間培養した。アルブミン定量のために、細胞培養の中に分泌さ
れたアルブミンをウエスタンブロッティング（Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８，４２，１９９８）により測定し
、現れたバンドの濃度をデンシトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，モデル ＧＳ−７
００）を使用して読み取った。
【００７２】 Δｍｏｘ変異体ＤＬＴ２は、上記実験例２及び４に記載したように、メタノー
ルを唯一の炭素源として使用するＹＰＭ培地中ではほとんど生育しないので、比
較のために該形質転換体を２段階で培養した。詳しくは、まず該形質転換体をグ
リセロールを添加した５０ｍｌのＹＰＧ培地中で培養し、ついで遠心により回収
した全細胞を２５ｍｌのＹＰＭ培地中に高密度で接種した。このようなメタノー
ル培地の培養条件下で、接種物はもはや生育しなかったが、アルブミン産生はＭ
ＯＸプロモーターの存在のおかげで引き続き行われた。Δｍｏｘ形質転換体ＤＬ
１−Ｌ／ＨＳＡについては、図１４に示すように、フラスコ中の２％メタノール
含有ＹＰＭ培地中で培養したとき約１２０ｍｇ／Ｌの量でアルブミンを産生した
。これは、ＭＯＸ形質転換体ＤＬ１−１／Ｔ７を高密度で培養したときに産生さ
れたアルブミン量より約２倍多く、組換え蛋白質の大量製造のために大規模発酵
槽中で高密度で培養するときでも、Δｍｏｘ株がＭＯＸ野生型よりもより組換え
蛋白質の生産力がある可能性が示唆された。特に、メタノール濃度を０．５％に
減じたときに、ＤＬ１−Ｌ／ＨＳＡのアルブミン産生は減少するよりむしろ増加
したが、一方ＤＬ１−１／Ｔ７は、メタノールが炭素源として急速に消費された
ため、アルブミン発現効率が著しく低下した。従って、Δｍｏｘ株は組換え蛋白
質を継続的にメタノールを供給せずに高効率で得ることができ、そして発酵方法
が比較的単純であることにおいて、ＭＯＸ野生型を超える進歩性を有する。
【００７３】 実験例６：新規変異株を種々の組換え蛋白質を製造することに一般的に使用する
ための宿主として開発するためのポップアウト方法（ｐｏｐ−ｏｕｔ ｔｅｃｈ
ｎｉｑｕｅ）の使用 発現ベクターの宿主細胞からの除去を促進するためのプラスミド組換え方法は
伝統的な酵母サッカロミセス セレビジアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にお
いてかなり開発されており、ここで大多数の発現カセットは染色体外複製能があ
るエピゾーマルベクター中に保持されている（Ｂｏｅｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅ
ｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，１６４，１９８７）。この方法はサッカロミセ
ス セレビジアエ発現システムに、親である組換え菌株由来の変異株が種々の異
種蛋白質の製造において一般的に有用な宿主菌株として開発されるようになるた
めの強力な手段をもたらす。レポーター蛋白質を発現している菌株であり、容易
に分析し得る組換えサッカロミセス セレビジアエは、所望の形質、例えば超分
泌（ｓｕｐｅｒ−ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）、のために突然変異を起こさせそして選
別することができる。得られたサッカロミセス セレビジアエの変異株から先在
する発現ベクターを除去後に、別の組換え蛋白質類を発現するために別種の発現
ベクターを該変異株に導入できる。それに反して、この種の方法はハンセヌラポ
リモルパシステムにおいては、主に宿主染色体ＤＮＡへの発現ベクターの非特異
的融合（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）により実施されることができない。
【００７４】 しかしながら、本発明のＤＬＴ２はハンセヌラポリモルパシステムに、宿主染
色体に融合された（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）組換え蛋白質発現カセットが、上記
実験例３に示したように、それから効率的にポップアウトされ得るポップアウト
方法をもたらす。Ｕ−ＰＡの活性もプレート試験により容易に分析され得る。従
って、上記実験例４で構築されたｕ−ＰＡを発現している組換えＤＬＴ２／ｕ−
ＰＡ（ｌｅｕ２ ｍｏｘ−ｔｒｐ３：：ｕ−ＰＡ）を親株として使用して、それ
から超分泌変異株を単離し、そして得られた変異株を別の組換え蛋白質の製造の
ための一般的宿主株として開発するための実験を実施した（図１５）。分泌能が
亢進した変異株を得るため、組換えＤＬＴ２／ｕ−ＰＡに化学的突然変異原、エ
チルメタンスルホネート（ＥＭＳ）によりもたらされる突然変異生成を為した。
３．５％ＥＭＳ溶液中で３０分間インキュベーションし、続いて６％チオ硫酸ニ
トリウム（ｔｈｉｏｓｕｌｆａｔｅ ｎｉｔｒｉｕｍ）で中和後、突然変異がな
された細胞をフィブリンプレート（Ａｇａｐｈｏｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａ
ｓｔ １５，５４１，１９９９）に播種し、そして親株ＤＬＴ２／ｕ−ＰＡとｕ
−ＰＡ分泌能について比較した。少なくとも２倍以上の分泌亢進を示す個々別々
の超分泌変異体のうち、ｕ−ＰＡ分泌が３倍亢進しているＤＬＴ−９０−２０／
ｕ−ＰＡ（ｌｅｕ２ ｍｏｘ−ｔｒｐ３：：ｕ−ＰＡ ｏｐｕ９０−２０）と命
名された変異体を選択し、これを別の異種蛋白質製造のための一般的宿主株とし
て開発した。上記実験例３の図１３Ｂに記載したように、ＸｈｏＩ／ＳａｃＩで
切断したｐＭＬＴ−デルタをＤＬＴ−９０−２０／ｕ−ＰＡ変異株に再導入し、
ＬＥＵ＋形質転換体を選別した。続いて、該ｍｏｘ−、ｔｒｐ−形質転換体をそ
れから選択し、そしてｕ−ＰＡ発現カセットのポップアウトをフィブリンプレー
ト上で確認した。この方法において、ＤＬＴ９０−２０変異株は本来の菌株ＤＬ
Ｔ２と同様にＳｃＬＥＵ２カセットで分断されたＭＯＸ−ＴＲＰ３遺伝子を有す
るように転換された。得られた超分泌変異体ＤＬＴ９０−２０（ｌｅｕ２ ｍｏ
ｘ−ｔｒｐ３：：ＳｃＬＥＵ２ ｏｐｕ９０−２０） を別の組換え蛋白質類を
製造するための宿主として利用するために、ＨＳＡ発現カセットをＤＬＴ９０−
２０のＭＯＸ遺伝子部位に上記実験例５に示した方法に従って挿入した。結果と
して得られた組換え菌株ＤＬＴ９０−２０／ＨＳＡを、上記実験例５で構築され
たＤＬＴ２／ＨＳＡと、ＨＳＡの産生能について比較した。ＤＬＴ９０−２０／
ＨＳＡはＨＳＡ分泌において、ＤＬＴ２／ＨＳＡより１５０％の向上を示し、こ
のことは超分泌変異体９０−２０がＨＳＡの製造にも有用であることを示唆する
。本結果により確認されたことは、以前のハンセヌラポリモルパの宿主株類をし
のぐ、本発明におけるＤＬＴ２株のもう一つの重要な利点はポップアウト方法の
実現可能性であり、これにより、得られた新規変異株がハンセヌラポリモルパ発
現システムにおいて種々の組換え蛋白質製造のための一般的な宿主株として利用
されるようになることである。
【００７５】
【発明の効果】 以上に記載したように、本発明は、発酵方法の簡略化に加えて、ハンセヌラポ
リモルパによる組換え蛋白質製造システムの発現効率に著しい向上をもたらすこ
とができる。その上、本発明はハンセヌラポリモルパが種々の蛋白質を製造する
ための一般的な宿主として使用されるようになる方法を提供する。
【００７６】 カルボキシペプチダ−ゼＹをコードする遺伝子ＰＲＣ１が分断されたハンセヌ
ラポリモルパ カルボキシペプチダ−ゼＹ変異株は、外来蛋白質、例えばｈＥＧ
Ｆのカルボキシ末端分解が野生型と比較して４０％も低減されていることが見い
だされる。カルボキシペプチダ−ゼＹをコードする遺伝子ＰＲＣ１に加えてカル
ボキシペプチダーゼαをコードする遺伝子ＫＥＸ１が分断されたハンセヌラポリ
モルパ株は、外来蛋白質のカルボキシ末端分解がさらに低減される。プロテアー
ゼＡをコードする遺伝子ＰＥＰ４が分断されたハンセヌラポリモルパ プロテア
ーゼＡ変異株については、ｈＥＧＦのカルボキシ末端分解の減少は示さないが、
別の外来蛋白質のカルボキシ末端での分解が著しく低減される。その上、ＭＯＸ
及びＴＲＰ３遺伝子を分断するために有用なベクター ｐＭＬＴ−デルタで形質
転換されたハンセヌラポリモルパΔｍｏｘ変異体は、発現カセットにより組換え
蛋白質の発現が低濃度のメタノールを含む培地中で高効率に誘導され得るため、
種々の蛋白質をメタノールを継続的に供給しないで製造することにおいて、宿主
として卓越した役割を果たすことができる。さらに、Δｍｏｘ変異株のゲノムの
ＭＯＸ遺伝子部位に挿入された発現カセットが効果的にポップアウトされ得る。
そのため、Δｍｏｘ形質転換体中で突然変異が生じた後、新規な発現ベクターを
予め挿入されていた発現ベクターと置換して再挿入することができるし、又は所
望の形質の変異体をＭＯＸ＋野生型を背景として作製することができる。従って
、予め開発された変異体を、種々の蛋白質を製造することに一般的に使用するた
めの宿主として充分に活用し得る。
【００７７】 本発明は例証的方法で記載されており、使用された専門用語は制約よりは説明
の性質を帯びることを意図されていると理解される。上記説示内容を鑑みて、本
発明の数々の改変及び変形が可能である。従って、請求項の範囲内において、本
発明は特に記載されているのとは違った方法で実践されうると理解される。
【００７８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, Dong Kook Pharmaceutical Co. <120> Hansenula polymorpha mutants and process for the preparation of r
ecombinant proteins using the same <130> NP00-1153 <150> KR 10-1999-7177 <151> 1999-03-04 <150> KR 10-2000-10743 <151> 2000-03-03 <150> PCT/KR00/00173 <151> 2000-03-04 <160> 3 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 2046 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha DL1 <400> 1 ctcgagtatg attactttgt cttaattttt atttggtgta attttttact accattttaa 60
tgacgtggtg tacgggtgtg aatacataaa cacctcagta gccatagcag ctaccatgga 120
tgatagggca cttttggaaa aggaatctga aaacaagaag aagcacggca tacggtggtc 180
aacagctcaa gaaaggccaa tgcgataaat ctcattttta tacgaacacc caccgaagcc 240
cttatcggtc ttttgacgca gcagcttaat tatctgaggc tggttatcaa tttttgcctt 300
ccagataaaa tatattttcc ctatttatat tccatccgtt tatcctaggc aatcgtccaa 360
aaaaacaaga attctgttat atttcaattc ccattatgaa gctctcgatg tctattctgg 420
ccctagtggc cactagcatt gggtcggcgc aagccgctgc catcaaaaaa gataccgcgg 480
ggcaacaccc cctcggaatg aactccaact ttggcgatgt tttcgtggag aaaggcaagt 540
ctttgctcga ccgtgtttct gaggttgtga gcgagtcgtc caagaatatt tccccagaat 600
tgagggacat ttggaatgaa atggaggcca agttcccaga taccctcaga aacatgaagc 660
tcaagtcaga gccggcagtc aaaattacaa agaaacctgc cgatttttgg gacttcaatg 720
ttctcaatga gaagttctcc aactacaagc tgagggttaa gaagaccgac ccgggagcat 780
tgggactgga ccacacaaga cagtactctg gatacttgga tgtggaggac gaagacaagc 840
atttcttcta ttggatgttt gagtccagaa atgacccggt caacgaccct gtgattctgt 900
ggctcaacgg tggtccagga tgctcttcct tgactggaat gctttttgag ctcggctctg 960
cttctatcgg tccagatctc aagccaatca acaacccata ttcgtggaat tccaatgcca 1020
ctgtgatttt ccttgaccag cctgtcaatg ttggattctc gtactcttcc aagtctgttt 1080
ctaacacggt cgcagctggt aaagacgtct atgctttctt ggagttgttc taccagcaat 1140
tcccacactt gctgaagaac gacttccaca tcgccggcga gtcgtacggt ggtcattaca 1200
tcccagtgtt tgcctccgag attctcaccc atgctgacag atctttcaac ctcacttcgg 1260
tgttgattgg taacggtttg accgacccac ttaaccagta cccattctac gagagaatgg 1320
catgctctac tgatggtggc tatgagcaac cctggacgag tctgagtgcg aaggaatgtt 1380
tggagacctt gcctagatgt ttgtcattga ttgaatcatg ctacagctcg cagtctgtgt 1440
tctcatgtgt cccggcctcc atctactgca acaacgcaca acttggacca ttccaaaaga 1500
ccggcagaaa cgtctacgac gttagaaaga tgtgcgaggg aactctgtgc tacaaagaca 1560
tggaatacat tgaccaatat ttgaaccagg actttgtcaa ggaaaaggtt ggcgctgagg 1620
ttgacactta cgagtcgtgt aatttcgacg tgaacagaaa cttcctgttt gctggtgatt 1680
ggatgaaacc ttaccacaag aacgttatca atctgctgga gcaaggtctt cctgtcctga 1740
tttacgcagg agacaaggat ttcatctgca attggctcgg aaaccaagcc tggtccaatg 1800
agctcccttg gtctggacac gatgaattcg agtcccccga gctgtacaac ctcaccttga 1860
aggatggcac taaggtcggc gaggtcaaga atgctggcaa gttcaccttt gctagaatgt 1920
ttgatggagg acacatggtt ccatacgacc agcctgagag ctctttggct atggtcaata 1980
gatggatagc tggtgactac tccttgggaa ccaagaaata aaaagctcat gaaaacatta 2040
tgtcat 2046 <210> 2 <211> 2046 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha DL1 <400> 2 gagctcagct accttttggg agccatggca cggtggcctt gattgtacgt tgctcctgca 60
atggtacaaa tgggattaca acaaaggtac cgtcaaatct cccgaaatag aagcacccgc 120
gatgagaaga gaaagtatat ctgcggagaa ttacatcaaa ctgaaaaagt caaagtcgcc 180
tgccacaggg tcagcattca ttaaaatccc aatgtccccg catcacgttc gcaagctgag 240
tgaaaacacg ccactgtcgc ctatcgactt tcttctggac gactatatgg cgaaccacaa 300
ctttacaagg gcaaaaaaca gttcgatgag gttttgaagc tgtcaaacta cggatcgata 360
tcttaatcag atcacttgcc tattctggaa gccgcaccag tactagttgg gatagcgtaa 420
atgctcaaaa ctgatgtgtt tatgtgtgac gcactaccta aaatatgagg gtggcaaaga 480
gagtaaaatt tggggttcat taagtaggtt ccataattta caaacctgtt ctgaatagag 540
agtcaccaat ccagttgccc caaaaccttg tcaaaatcat tagcatcgtg agcatctatt 600
ataaacaaag cgaatctcaa agatgaaact ctctttccca accctttact cgcttgctct 660
tgtgcttgga ttggtctccc tggccgatgc caaggtccac aaagctccca tcaaaaaagc 720
tcctgcacag gctacttacc aggatgttac tgtcggcgat tatgttgagt cgttgaagca 780
aaagtatgtt acaacttaca acaagtttat cgccgcccaa cagaatgacc agcaaattat 840
ctcgatcggc aagcgttctg acgagagtgc aagctcgggt cacaacactc ctttgaccaa 900
ctatctcaat gcccaatact tcaccgagat tcaattgggc actcctggcc aatcgttcaa 960
ggttatcctc gacaccggtt cctctaacct gtgggttcct agtagcgatt gcacgtcctt 1020
ggcctgttac ttgcatacta aatacgacca cgatgagtcg tccacttacc agaagaacgg 1080
ttcttcgttt gctattcaat atggctcggg ttccctcgag ggttacgttt cccaagacac 1140
actgactatt ggtgaccttg tcatccctaa acaggatttc gccgaggcta ctagcgagcc 1200
tggcttggct tttgcttttg gaaagtttga cggtattctg ggtctggctt acgacacgat 1260
ctcggtcaac agaatcgttc ctccaattta caatgctatc aatttgggat tgctggacac 1320
cccacaattc ggattttacc ttggtgacac ttcgaagtcc gagcaggatg gaggagaggc 1380
tacctttggt ggatacgatg tgtctaagta cacaggcgat atcacctggt tgccagtcag 1440
aagaaaggct tattgggaag tgaagtttag tggtatgccc ttggtgacga atacgctcca 1500
ttggagaaca ccgggagctg ccattgatac cggaacctct ttgattgctc ttccatctca 1560
attggctgag attttgaact ctcaaattgg tgccgagaag tcatggtctg gacagtacca 1620
gatcgattgt gacaagagag actcactgcc tgacctcact ttcaacttcg atggttacaa 1680
ctttaccatc tcgccttatg actacacttt ggaagtttct ggttcttgta tttctgcatt 1740
cactccaatg gacctcccag ccccaattgg tccaatggcc atcattggtg acgctttcct 1800
cagaagatac tactctgtct atgaccttgg cagagacgct gtcggattgg ctaaggctgt 1860
gtaatgcaag gcagttacgt attagtttca acttgctagc atgaatttct atcgggtacg 1920
gttgcttgac aacgattttc tttgtgtctc tattactgct ataaaacatg aaaagattgg 1980
atttttttga cagtttctag taattgctta aatctgctct tttccttttg ttgatcccgt 2040
gctgct 2046 <210> 3 <211> 3550 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha DL1 <400> 3 gaattctata ggaatggtgc aaaacgaagg atcgtgtgga ctcatgaatg tgctatattt 60
gtggctaaaa agcctgccag agctcgcagg agataagagg tctggcgtcg tgctgcgcaa 120
aatgatcgcc ttgataaaat tcctcaatct cgatcatgaa tcagggttca agtattttgg 180
ttttttcttt caagacgagt atgaactgga acacgctctc gagtcctaga cgaccaggac 240
atcaagcagg cggccgcact cgaagatctc gccgcttttg atttccaaca ctttgacgtc 300
gtggaggttg accagaccct tttcgatgcc tatgagctcg agctcggtct cgaacaggtt 360
tcctgggtct aacgtgaatt tcaggttgtt ggtaagagaa atcagcccca ctttgctgaa 420
ctcgtgttgg aaagcccgca ccagctggtt gaggccgtaa agcgggacgg gatctgcctt 480
gttggcgttc tggatcggaa ttggtggcac agatttttcg tattgtttgt tgatcgatga 540
ttgaatgtac agtatgagcg ataacgagtc gttcgacttg ttgataaatt gtagcttcca 600
tttgaacacc tcgccgagct tgactttagt ctggcccgaa actgaaatgc tgaggttctt 660
cttggagtgg ttgagagtca ccgacgagtt ggatcgtagt ttatttttct taggcaaatt 720
cagagcagag ttggtcgact tggatttaaa taccccgaga ctaggcgacg cgattggggg 780
cacggtgggg gccgccataa aatccacatt tgtagtccat cgtgtcacga tttttctatt 840
cccgttgacc gtgcaatgga tggtgacaaa aaccggctta acccacttga tgtcgttgtt 900
tgttagtctg tacgtgagcg acagaataga atggttctgc aacaccaatg gatactttac 960
caccgagtag ccggcacaca gacagtttct gatgtccata tctaccgact cgattctcac 1020
cgacacttct gacgcccgga cctgtccaga aagagccact tccaaagagg ccatggtttt 1080
ctccgtcttg atggtcttga accgcatctg gaatacgggg ctgatccgca gcgacgtgtc 1140
ggccgttacg agttcgtaaa ggtccacatg cttcgtcagc acagtgttgc ctatagtgac 1200
tgtatcctgc aactctaaat tttctatctt tctcgactgt tgtcgaaacg aggctttgat 1260
ctgcaattga tttgaaagtt tgtcaggcac cacggtcgtt tccagtatcc atacggcctc 1320
agaccctatg acgactttgg aatcgagcac ttttctcgct gtgttttgca agttgtatac 1380
caggtcgacc tcgacctgtg tcacagacga cggagtgtac accacgactt ggatgtcctc 1440
gtcgaaatag gcaatgtcca gcgtgtcgca ctggcgcagc tgttccacgg agcccagcac 1500
atcagcagaa acccgggttt tcggaacaag cacaccaaac attggaaaca acacttatcg 1560
acgcgggtgt gtttaaaaaa taatattaga tcgactgctc ctactctttt aaattcttta 1620
tttatcccag gcttagacag cacagagcta accatgagtc ggtatttttt actagcgtgc 1680
acattggctc tgcaatgtgt cgcggcctcc caggaggact acatagtcaa ggatttgcct 1740
ggactctcga atattcctgc cgtggtgagg ccagtgatgc atgccggaca ccttgaaata 1800
gatgaggaac acaacaccga gctgtttttc tggcgattcc agaatccgaa gaacaacggg 1860
acacaccaaa cgctccaccg caatgagctg atcgtctggc tgaacggtgg ccctggctgc 1920
tcgtcgatgg atggagccat gatggaaaca ggccccctgc gggtgtcaga caagttggag 1980
gtggagctca acccgggatc ctggacacag gtggccgata tcttgtttgt ggatcagccg 2040
gccggaattt tgagaaagtg gagtgcgtca aaatattcca tagtattttg gctgccagta 2100
gagacgaaac caagcctgcc aaagaacaat gtgtcaacat gtacgactac cgcaaacatg 2160
attacttccc tgcatgcgga tccaattggc cagaaggcct gcccaccgtg actaaatttc 2220
tgaatctgga tgctgtgcaa aaagccctga acctgaaatc ggcgaagaga tggcacgagt 2280
gtgacggaaa agtcgaattc tttttccagc cagagcactc tgtcaagtcg ttcgacctgc 2340
tgccaaaact actggagaaa atgaaaatcg cgctgtttgc tggcgacaag gacattatct 2400
gcaaccacaa atcaatagaa atggtgattg aaaaattgca aattacacca ggacaattcg 2460
gtttcacaaa cagcagaaag tctggctgga tctacgacgg gcaggaagtg ggtgaggttg 2520
agacacagtc gaacctcacg tatatcaagg tgttcaattc gtcgcatatg gtgccttacg 2580
acctgccgga ggtgagcaga ggactattcg atataatcac aaactctatt gaaaaacggt 2640
cgacagacat tgtgacgccc gtttatgaca gcagaggcaa ctacaagttt gtggaggaga 2700
agcaggacac cgaccagaac gaggaagaag agaaggagaa acctcccaag caccatcata 2760
gtctcacgtt ttacgtggca gaggtggcga ttctggcagt gctagcatat ctgctttaca 2820
gcttctacaa atcgttcgcc aaatcgcgta agtctgcatt tttgtcactc tcttccaaga 2880
agaagaagaa gcaggtgcac tggtttgacg agagcgacat aggaatggac caggaagctg 2940
gcgaggcaga tcataagcct aagagcatgc tggagtcggt gttcaacaag ctgggctatg 3000
gaggacagta tgacacggta caggacggcc gtgacatcga gatggcgccg gtcgaagaac 3060
acgaagacca atttattatt caaagcgacg aggaagagtt tggccacaga tagagtacga 3120
ttatataata tccacgaaaa attagtttcc aattatttcg ctcctgattg taatgtctca 3180
aagttggatc ctctggaagc ggtccctgat taccggcggt ggaattattg gaagcggtgt 3240
gctactgtac aaattcacga ctcctaccga ggaacagttg atcgctaaat tatcccccga 3300
gctgagagca gactatgaac gcaacaaaga attgcggagg aaagaacagg agatgttgat 3360
ggagatcgtc aaacagacgg cagcgtcgaa cgatccggtg tggaagacag ggccgattgt 3420
gtcgccgtgg gaccgggact ttacgccatc gagggaaagt ttattagtga agagagagcg 3480
atttgagaaa gagcaggcgg agaaaaaaca gcgcgaagag ctcgagcgtc tgaaagccga 3540
ggccaagctt 3550
【図面の簡単な説明】
【図１】ハンセヌラポリモルパＰＲＣ１遺伝子の制限酵素地図である。
【図２】ハンセヌラポリモルパＰＥＰ４遺伝子の制限酵素地図である。
【図３】ハンセヌラポリモルパＫＥＸ１遺伝子の制限酵素地図である。
【図４】ＬＥＵ２遺伝子により分断されたハンセヌラポリモルパＰＲＣ１遺伝
子を含むプラスミドの製作過程（このプラスミドは宿主ゲノムにおいてＰＲＣ１
遺伝子を分断するのに有用である）、及びその制限酵素地図である。
【図５】ＵＲＡ３遺伝子により分断されたハンセヌラポリモルパＰＲＣ１遺伝
子を含むプラスミドの製作過程（このプラスミドは宿主ゲノムにおいてＰＲＣ１
遺伝子を分断するのに有用である）、及びその制限酵素地図である。
【図６】ＬＥＵ２遺伝子により分断されたハンセヌラポリモルパＰＥＰ４遺伝
子を含むプラスミドの製作過程（このプラスミドは宿主ゲノムにおいてＰＥＰ４
遺伝子を分断するのに有用である）、及びその制限酵素地図である。
【図７】ＵＲＡ３遺伝子により分断されたハンセヌラポリモルパＰＥＰ４遺伝
子を含むプラスミドの製作過程（このプラスミドは宿主ゲノムにおいてＰＥＰ４
遺伝子を分断するのに有用である）、及びその制限酵素地図である。
【図８】ＵＲＡ３遺伝子により分断されたハンセヌラポリモルパＫＥＸ１遺伝
子を含むプラスミドの製作過程（このプラスミドは宿主ゲノムにおいてＫＥＸ１
遺伝子を分断するのに有用である）、及びその制限酵素地図である。
【図９】問題の遺伝子の分断を確認するためのサザンブロッティングの結果を
示す。
【図１０】ＭＯＸ−ＴＲＰ３遺伝子を分断するためのベクター ｐＭＬＴ−デ
ルタの製作過程、及びその制限酵素地図を示す。
【図１１】ベクター ｐＭＬＴ−デルタを用いるΔｍｏｘ変異体ＤＬＴ２の製
作に伴うゲノムの変化を示す。
【図１２】ＭＯＸ野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）とΔｍｏｘ変異体ＤＬＴ２株
が、ブドウ糖（ｄｅｘｔｒｏｓｅ）又はメタノールを主要な炭素源として含む様
々な培地で生育することを示す。
【図１３】野生型から変異体への、そしてその逆の形質転換の実現可能性（ｆ
ｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ）を示す：組換え蛋白質発現カセットをΔｍｏｘ変異体Ｄ
ＬＴ２のＭＯＸ遺伝子部位中へ導入（Ａ）；形質転換されたＤＬＴ２からの発現
カセットの取り出し（ｐｏｐｐｉｎｇ ｏｕｔ）（Ｂ）；及びＭＯＸ野生型への
復帰（Ｃ）。
【図１４】ＭＯＸ ＤＬ−１Ｌ及びΔｍｏｘ変異体ＤＬＴ２でのアルブミン発
現の柱状グラフである。
【図１５】ポップアウト法（ｐｏｐ−ｏｕｔ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を使用し
て、超分泌（ｓｕｐｅｒ−ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ）変異株を組換え蛋白質製造用の
一般的な宿主株として開発するための方法を示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図８】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３】
【手続補正書】
【提出日】平成１３年１月１５日（２００１．１．１５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】 カルボキシペプチダーゼＹに加えて、サッカロミセスセレビジアエ プロテア
ーゼＡが液胞中に存在し、蛋白質を加水分解する役割を果たしている。その上、
プロテアーゼＡは液胞のプロテアーゼ、例えばプロテアーゼＢ、カルボキシペプ
チダ−ゼＹ、及びアミノペプチダ−ゼＹ、のみならず液胞の加水分解酵素（ｖａ
ｃｕｏｌａｒ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、例えばＲＮａｓｅ，アルカリホスファタ
ーゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、及び酸トレハラーゼ（ａ
ｃｉｄ ｔｒｅｈａｌａｓｅ）、の蛋白質分解過程（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ
ｐｒｏｃｅｓｓ）に関与する（Ｈ．Ｂ．Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｈａｚｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｙｅａｓｔ．１２，１，１９９６）。特に、遺伝子ＰＥＰ４が分断（ｄｉ
ｓｒｕｐｔｉｏｎ）された菌株ではカルボキシペプチダ−ゼＹの活性が著しく減
少する。それに応じて、ＰＥＰ４遺伝子が分断されたハンセヌラポリモルパにお
いて、カルボキシペプチダ−ゼＹの活性が著しく減少するため、ＰＥＰ４遺伝子
をゲノム上で分断すると、カルボキシペプチダーゼＹを含む多種のリアーゼ（ｌ
ｙａｓｅ）の酵素活性を低減させることが可能である。遺伝子ＰＥＰ４はサッカ
ロミセスセレビジアエ、カンジダアルビカンス、ニューロスポラクラッサ（Ｎｅ
ｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）でクローニングされていくつかの文書で開示
されている（Ａｍｍｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，
６，２４９０，１９８６；Ｗｏｏｌｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．，６，２５，１９８６；Ｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７，１７７９，１９８９；Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｕ３６４７１）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】 クローン化したカルボキシペプチダーゼＹ遺伝子（ＰＲＣ１）及びプロテアー
ゼＡ遺伝子（ＰＥＰ４）を利用して、ハンセヌラポリモルパＤＬ−１のゲノム上
のこれらに相当する遺伝子を分断する。この目的のために、ハンセヌラポリモル
パＬＥＵ２遺伝子をプラスミドｐＨＤＹ２及びｐＨＤＰ４に挿入し、ｐＨＹＬ及
びｐＨＰＬをそれぞれ構築する。これらのプラスミドを使用して、ハンセヌラポ
リモルパＵＲ２株（ｌｅｕ２，ｈＥＧＦ，ＰＲＣ１，ＰＥＰ４，ＫＥＸ１）を形
質転換し、それぞれカルボキシペプチダーゼＹ変異株（ｈＥＧＦ，ｐｒｃ１：：
ＬＥＵ２，ＰＥＰ４，ＫＥＸ１）及びプロテアーゼＡ変異株（ｈＥＧＦ，ｐｅｐ
４：：ＬＥＵ２、ＰＲＣ１，ＫＥＸ１）とする。問題の遺伝子の分断は、得られ
る変異体をカルボキシペプチダーゼＹの活性について分析することにより、及び
変異体と野生型との間のゲノム サザンハイブリダイゼーションにより確認する
ことができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】 第四段階：プラスミドｐＨＤＰ４の構築 ハンセヌラポリモルパのゲノムＤＮＡからＰＥＰ４遺伝子を得るために、第一
段階で作製したプローブを用いてサザンブロッティングを行った。まず、第二段
階で得たゲノムＤＮＡの６アリコート（ａｌｉｑｕｏｔ）を制限酵素ＢａｍＨＩ
、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、及びＳａｌＩでそれぞ
れ処理し、得られたＤＮＡ断片を０．９％アガロースゲル上で電気泳動により分
画した。分離したＤＮＡ分子をＮｙｔｒａｎ メンブラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社製品）にブロッティングにより移し、ハイブリダイゼ
ーションに適した条件下で、ラベルされたプローブとサザンブロッティングした
。ハイブリダイゼーションは第三段階におけるのと同じ方法で行った。青色に染
色されたバンドが、制限酵素ＢａｍＨＩにより約８ｋｂ長に切断されたＤＮＡ断
片中に認められた。次に、ＤＮＡ断片を青色のバンドが表れた箇所から分離し、
これを用いて第三段階におけるのと同じ方法でＤＮＡライブラリーを作成した。
このＤＮＡライブラリーを対象としてサザンブロッティングを繰り返し行い、Ｐ ＥＰ４遺伝子を担持するプラスミド を選別し、ｐＨＤＰ３とした。制限酵素Ｓａ
ｃＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて二重消化（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）
により、ＤＮＡ断片を約８ｋｂから約２．０ｋｂに短縮した。ＳａｃＩ／Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ ＤＮＡ断片を含有するプラスミドをｐＨＤＰ４とした。これは、大韓
民国タイプカルチャーコレクション（ＫＣＴＣ：Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）（所在：Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ），＃５２，Ｏｕｎ−ｄｏｎｇ，Ｙｕｓｏｎｇ−
ｋｕ，Ｔａｅｊｏｎ ３０５−３３３，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ）
に、２０００年２月１８日に寄託され、受託番号ＫＣＴＣ ０７３３ＢＰとして
受託された。ハンセヌラポリモルパＤＬ１ ＰＥＰ４遺伝子の制限酵素地図作成
と塩基配列決定は図２に示すように行った。ＰＥＰ４遺伝子の塩基配列は配列２
に示す。このＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋにＵ６７１７３として１９９６年８月
１７日に登録された。この塩基配列の分析によれば、ハンセヌラポリモルパＤＬ
１ ＰＥＰ４遺伝子は１，２４２ｂｐ長であり、イントロンをもたず、サッカロ
ミセスセレビジアエＰＥＰ４遺伝子の塩基配列と５２．４％の相同性を示すこと
が明らかである。配列２から類推すると、ハンセヌラポリモルパＤＬ１ ＰＥＰ
４遺伝子のアミノ酸配列はサッカロミセスセレビジアエのプロテアーゼＡと５０
％の相同性を示す。その上、高い相同性が、アスパルチルプロテアーゼ（ａｓｐ
ａｒｔｙｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ）の活性部位（ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ）中で触
媒基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｇｒｏｕｐ）として作用するアスパラギン酸（ａｓ
ｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ）であると同定されている１１７番目のアミノ酸残基に
おいて認められる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】 次に、ＤＮＡ断片を青色のバンドが現れた箇所から分離し、これを用いて第三
段階におけるのと同じ方法でＤＮＡライブラリーを作成した。このＤＮＡライブ
ラリーを対象としてサザンブロッティングを繰り返し、ＫＥＸ１遺伝子を担持す るプラスミド を選別し、プラスミドｐＫＨ４．５とした。プラスミドｐＫＨ４．
５は、大韓民国タイプカルチャーコレクション（ＫＣＴＣ：Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）（所在：Ｋｏｒｅａ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ），＃５２，Ｏｕｎ−ｄｏｎｇ，Ｙｕ
ｓｏｎｇ−ｋｕ，Ｔａｅｊｏｎ ３０５−３３３，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋ
ｏｒｅａ）に、２０００年２月１８日に寄託され、受託番号ＫＣＴＣ ０７３１
ＢＰとして受託された。制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて二重消化
（ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）により、ＤＮＡ断片を約４．５ｋｂから
約３．９ｋｂに短縮した。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ断片を含有する
プラスミドをｐＫＨ３．９とした。ハンセヌラポリモルパＤＬ１ ＫＥＸ１遺伝 子の制限酵素地図作成と塩基配列決定 は図３に示すように行った。ＫＥＸ１遺伝 子の塩基配列 は配列３に示す。このＤＮＡ配列はＧｅｎＢａｎｋにＡＦ０９０３
２５として１９９８年９月４日に登録された。この塩基配列の分析によれば、ハ
ンセヌラポリモルパＤＬ１ ＫＥＸ１遺伝子は１，８３３ｂｐ長であり、イント
ロンをもたないことが明らかである。配列３から類推すると、ハンセヌラポリモ
ルパＤＬ１ ＫＥＸ１遺伝子のアミノ酸配列はサッカロミセスセレビジアエのカ
ルボキシペプチダーゼαと２０％程度の非常に低い相同性を示す。しかしながら
、セリンプロテアーゼ（ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ）の活性部位（ａｃｔ
ｉｖｅ ｓｉｔｅ）中で触媒基（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｇｒｏｕｐ）として作用
するセリンであると同定されている１７６番目のアミノ酸残基については、カル
ボキシペプチダ‐ゼＹのみならずカルボキシペプチダ−ゼαとも高い相同性が認
められる。Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅの方法（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．，１７３：２４３，１９８４）に準じてアミノ酸分析した結果、１８
個のアミノ酸残基からなるシグナルペプチドの存在が明らかになった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】 部分精製された試料は、試料の分離のために４．６×２５０ｍｍ、５μｍ‐Ｃ
４カラム（Ｖｙｄａｃ社）を用いて、逆相ＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｍｏｄｅ
ｌ １２６ Ｓｙｓｔｅｍ）によって分析した。移動相は流速０．８ｍＬ／分で
、濃度を２０％アセトニトリル及び０．１％トリフロロ酢酸から６０％アセトニ
トリル及び０．１％トリフロロ酢酸に３５分かけて増加させて、移動させた。試
料分離の識別のため２１５ｍｍでの吸光度を測定した。ＨＰＬＣから分離された
試料がｈＥＧＦを含んでいるか否かを確認するために、各ピークの画分について
ＥＬＩＳＡを行った。このため、まずそれぞれの試料を抗原コーティング緩衝液
（０．１Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ９．６）で適宜に希釈し、該希釈液を
１００μｌ量ずつマイクロタイタープレートウエル（Ｎｕｎｃ‐ｉｍｍｕｎｏｍ
ｏｄｕｌｅ）の各ウエルに加えて３７℃で２時間反応させた。該ウエルをＰＢＳ
Ｔ（リン酸緩衝生理食塩水＋０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄した後、０．０
５％ ゼラチンを含むＰＢＳの１００μｌをそれぞれのウエルに加えて３７℃で
３０分間静置した。前記ウエルをＰＢＳＴで洗浄し、ｈＥＧＦに対するモノクロ
ーナル抗体（ＵＢＩ ＃０５−１０９）を０．０５％ゼラチンを含むＰＢＳで１
０，０００倍に希釈して得られた抗体溶液を１００μｌずつ添加した。各ウエル
内で抗原抗体反応を３７℃で２時間行わせた後、更にＰＢＳＴで洗浄した。西洋
わさびパーオキシダーゼが結合されたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｈｏｒｓｅ ｒ
ａｄｉｓｈ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ‐ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ
）（Ｂｉｏ‐Ｒａｄ社）を０．０５％ゼラチンを含むＰＢＳ溶液で３，０００倍
に希釈して、ウエル当たり１００μｌずつ加えて３７℃で１時間反応させた。該
ウエルは再度ＰＢＳＴで洗浄して発色反応させた。発色のためにＴＭＢ基質キッ
ト（Ｐｉｅｒｃｅ社）をパーオキシダーゼ基質として用いた。この基質を、０．
０４％ＴＭＢ（３，３’，５，５’ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ Ｂｅｎｚｉｄｉｎ
ｅ）とクエン酸緩衝液と混合物中で０．０２％の過酸化水素溶液と、１：１の比
率で混合してウエル当たりに１００μｌ量ずつ加えた。１５分後に２Ｍの硫酸１
００μｌで、各ウエル内の反応を停止させた。発色反応完了後、発色定量分析を
９６−ウエル プレート オートリーダー（９６‐ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ａｕ
ｔｏｒｅａｄｅｒ：ＴＨＥＲＭＯ ｍａｘ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ
ｓ，ＵＳＡ）で４５０ｎｍでの吸光度を測定することにより行った。対照として
、組換えｈＥＧＦ（ＵＢＩ ＃０１−１０７）を、０．２５から５ｎｇ／ウエル
の範囲の量で使用した。定量分析の結果、発現されたｈＥＧＦは２つの画分中で
検出された。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】 本発明は例証的方法で記載されており、使用された専門用語は制約よりは説明
の性質を帯びることを意図されていると理解される。上記説示内容を鑑みて、本
発明の数々の改変及び変形が可能である。従って、特許請求の範囲内において、
本発明は特に記載されているのとは違った方法で実践されうると理解される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:78） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 チョイ ユイスング 大韓民国 タエジョン 305−335 ユーソ ング−ク グーング−ドング ＃395−３ グソル エピーティー． 102−507 (72)発明者 カング ヒュナハ 大韓民国 タエジョン 305−345 ユーソ ング−ク シンスング−ドング ハナ エ ピーティー． 102−1202 (72)発明者 ソーン ジュンクホーン 大韓民国 タエジョン 302−280 セオ− ク ウォルピイング−ドング ヌリ エピ ーティー． 103−506 (72)発明者 バエ ユングホーン 大韓民国 タエジョン 305−345 ユーソ ング−ク シンスング−ドング ＃120− ２ 302 (72)発明者 キム ムーウーグ 大韓民国 タエジョン 305−333 ユーソ ング−ク オウン−ドング ＃101−２ アートビラ 201 (72)発明者 ミハイル アガフォノフ ロシア連邦 モスクワ 121552 サード チェレプコフスカヤ ストリート 15Ａ カーディオロジー リサーチ センター インスティチュート オブ エクスペリメ ンタル カーディオロジー (72)発明者 キム ミュングクック 大韓民国 ソウル 134−033 カングドン グ−ク スングナエ−３−ドング ＃419 −１ ドーンチョイイエオク チュンググ エーピーティー 102−901 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 BA01 CA04 DA11 EA04 FA02 FA20 GA11 HA01 HA20 4B064 AG01 AG13 CA05 CA19 CC24 DA20 4B065 AA57X AA93Y AB01 AC20 BA01 CA24 4H045 AA20 BA10 CA40 DA20 FA72 FA74

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha)ＤＬ１（ATCC26012）由来のカ
    ルボキシペプチダ−ゼY(Carboxypeptidase Y)をコードする配列１記載の塩基配
    列を担持するPRC1遺伝子。
  2. 【請求項２】 PRC1遺伝子をディスラプトさせて、配列１のPRC1遺伝子を担持するプラスミド
    pHDY2（KCTC0732BP)にハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha)ＬＥＵ２
    遺伝子を挿入させて構築したベクターpHYL。
  3. 【請求項３】 PRC1遺伝子をディスラプトさせて、配列１のPRC1遺伝子を担持するプラスミド
    pHDY2（KCTC0732BP)にハンセヌラポリモルパ(Hansenula polymorpha)ＵＲＡ３
    遺伝子ポップアウトカセットを挿入させて構成したベクターpHYUZ。
  4. 【請求項４】 ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＵＲ２株が請求項２のベク
    ターpHYLによって形質転換されたカルボキシぺプチダ−ゼY変異株。
  5. 【請求項５】 ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１株が請求項３のベク
    ターpHYUZで形質転換されたカルボキシぺプチダ−ゼY変異株、ハンセヌラポリモ
    ルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１/△ｃｐｙ（KCTC0735BP)。
  6. 【請求項６】 請求項４のカルボキシぺプチダ−ゼY変異株に外来タンパク質をコードする遺
    伝子を導入し、該細胞を培養培地中で培養することを含む組替えタンパク質の製
    造方法。
  7. 【請求項７】 請求項５のカルボキシぺプチダ−ゼY変異株に外来タンパク質をコードする遺
    伝子を導入し、該細胞を培養培地中で培養することを含む組替えタンパク質の製
    造方法。
  8. 【請求項８】 請求項６又は７の製造方法によって生産される組換えタンパク質。
  9. 【請求項９】 プロテアーゼＡをコードする配列２の塩基配列を担持する、ハンセヌラポリモ
    ルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１（ATCC26012)由来のＰＥＰ４遺伝子。
  10. 【請求項１０】 PEP4遺伝子をディスラプトさせて、配列２の遺伝子PEP4を担持するプラスミド
    pHDP4（KCTC0733BP)にハンセヌラポリモルパLEU2遺伝子を挿入して構築されたベ
    クターpHPL。
  11. 【請求項１１】 PEP4遺伝子をディスラプトさせて、配列２の遺伝子PEP4を担持するプラスミド
    pHDP4（KCTC0733BP)にハンセヌラポリモルパＵＲＡ３遺伝子ポプアウトカッセト
    を挿入して構築されたベクターpHPUZ。
  12. 【請求項１２】 ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＵＲ２株が請求項１０のベク
    ターpHPLで形質転換されたプロテアーゼＡ変異株。
  13. 【請求項１３】 ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１株が請求項１１のベ
    クターpHPUZで形質転換されたプロテアーゼA変異株、ハンセヌラポリモルパ（Ha
    nsenula polymorpha）ＤＬ１／△ｐｅｐ４(KCTC0734BP)。
  14. 【請求項１４】 請求項１２のプロテアーゼＡ変異株に外来タンパク質をコードする遺伝子を導
    入し、該細胞を培養培地中で培養することを含む組替えタンパク質の製造方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１３のプロテアーゼＡ変異株に外来タンパク質をコードする遺伝子を導
    入し、該細胞を培養培地中で培養することを含む組替えタンパク質の製造方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１２又は１３の製造方法によって生産される組換えタンパク質。
  17. 【請求項１７】 カルボキシぺプチダ−ゼαをコードする配列３の塩基配列を担持するハンセヌ
    ラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＤＬ１(ATCC26012
    )由来のＫＥＸ１遺伝子。
  18. 【請求項１８】 ＫＥＸ１遺伝子をディスラプトさせて、配列３の遺伝子ＫＥＸ１を担持するプ
    ラスミドpKH3.9にハンセヌラポリモルパＵＲＡ３遺伝子ポプアウトカッセトを挿
    入して構築されたベクターpKUZ。
  19. 【請求項１９】 ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１株が請求項１８のベ
    クターpKUZで形質転換されたカルボキシぺプチダ−ゼα変異株、ハンセヌラポリ
    モルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１／△ｋｅｘ１(KCTC0736BP)。
  20. 【請求項２０】 請求項１９のカルボキシぺプチダ−ゼα変異株に外来タンパク質をコードする
    遺伝子を導入し、該細胞を培養培地中で培養することを含む組替えタンパク質の
    製造方法。
  21. 【請求項２１】 請求項２０の方法で生産される組換えタンパク質。
  22. 【請求項２２】 ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１株が請求項３のベク
    ターpHYUZ及び請求項１１のベクターpHPUZで形質転換されたカルボキシぺプチダ
    −ゼＹ/プロテアーゼＡ変異株。
  23. 【請求項２３】 請求項２２のカルボキシぺプチダ−ゼＹ/プロテアーゼＡ変異株に外来タンパ
    ク質をコードする遺伝子を導入し、該細胞を培養培地中で培養することを含む組
    替えタンパク質の製造方法。
  24. 【請求項２４】 請求項２３の方法で生産される組換えタンパク質。
  25. 【請求項２５】 ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１株が請求項３のベク
    ターpHYUZ及び請求項１８のベクターpKUZで形質転換されたカルボキシぺプチダ
    −ゼＹ/カルボキシぺプチダ−ゼα変異株。
  26. 【請求項２６】 請求項２５のカルボキシぺプチダ−ゼＹ/カルボキシぺプチダ−ゼα変異株に
    外来タンパク質をコードする遺伝子を導入し、該細胞を培養培地中で培養するこ
    とを含む組替えタンパク質の製造方法。
  27. 【請求項２７】 請求項２６の方法で生産される組換えタンパク質。
  28. 【請求項２８】 組換えタンパク質が、ヒトエピダーマルグロースファクター（hEGF)である請
    求項２７の組換えタンパク質。
  29. 【請求項２９】 ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１株が請求項１１のベ
    クターpHPUZ及び請求項１８のベクターpKUZで形質転換されたプロテアーゼＡ/カ
    ルボキシぺプチダ−ゼα変異株。
  30. 【請求項３０】 請求項２９のプロテアーゼＡ/カルボキシぺプチダ−ゼα変異株に外来タンパ
    ク質をコードする遺伝子を導入し、該細胞を培養培地中で培養することを含む組
    替えタンパク質の製造方法。
  31. 【請求項３１】 請求項３０の方法で生産される組換えタンパク質。
  32. 【請求項３２】 ハンセヌラポリモルパ（Hansenula polymorpha）ＤＬ１株が請求項３のベク
    ターpHYUZ、請求項１１のベクターpHPUZ及び請求項１８のベクターpKUZで形質転
    換されたカルボキシぺプチダ−ゼＹ/プロテアーゼＡ/カルボキシぺプチダ−ゼα
    変異株。
  33. 【請求項３３】 請求項３２のカルボキシぺプチダ−ゼＹ/プロテアーゼＡ/カルボキシぺプチダ
    −ゼα変異株に外来タンパク質をコードする遺伝子を導入し、該細胞を培養培地
    中で培養することを含む組替えタンパク質の製造方法。
  34. 【請求項３４】 請求項３３の方法で生産される組換えタンパク質。
  35. 【請求項３５】 ＭＯＸプロモーターの部位とＴＲＰ３遺伝子の部位を含むＤＮＡ断片の間に挿
    入されたSaccharomyces cerevisiae LEU2をハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓ
    ｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）の選択マーカーとして担持する（mox(p):: S.cerevisiae LEU ::trp3)ベクターpMLT-delta(KCTC0727BP)。
  36. 【請求項３６】 ハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のＭＯ Ｘ−ＴＲＰ３ 遺伝子をディスラプトさせて、ハンセヌラポリモルパ(Hansenula
    polymorpha)に請求項３５のベクターpMLT-deltaを導入させて調製したハンセヌ
    ラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）△mox変異株。
  37. 【請求項３７】 ハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）が、ハ
    ンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＤＬ１株で
    ある請求項３６のハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒ
    ｐｈａ）△mox変異株。
  38. 【請求項３８】 ハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）のＭ ＯＸ−ＴＲＰ３ 遺伝子をディスラプトさせて、ハンセヌラポリモルパ(Hansenula
    polymorpha)ＤＬ１−Ｌに請求項３５のベクターpMLT-deltaを導入させて調製
    したハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）△mo
    x変異株ＤＬＴ２（KCTC0728BP)。
  39. 【請求項３９】 請求項３６〜３８の何れか一に記載のハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕ
    ｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）△mox変異株が発現カセットで形質転換され、メ
    タノール培地中で培養され、組換えタンパク質発現宿主として機能し、該発現カ
    セットはその発現がメタノールで誘導されるプロモーターを含む、組換えタンパ
    ク質の生産方法。
  40. 【請求項４０】 まずハンセヌラポリモルパ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）△
    mox変異株を炭素源としてグリセロールを含む培地中で高濃度へ培養し、次いで
    炭素源としてメタノールを含む培地中で培養する請求項３９の生産方法。
  41. 【請求項４１】 請求項３９又は４０の方法で生産される組換えタンパク質。
  42. 【請求項４２】 △mox変異株ＤＬＴ２のＭＯＸ遺伝子部位にインテグレートされた発現カセッ
    トをポッピングアウトする方法。
  43. 【請求項４３】 請求項４２のポッピングアウト技術を使い種々の組換えタンパク質の生産に一
    般的な使用のための宿主であって、請求項３８で調製された組換えＤＬＴ２株由
    来の新規変異株を調製する方法。
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