KR101291241B1

KR101291241B1 - 효모에서 인체 상피세포 성장인자를 대량 생산하는 방법

Info

Publication number: KR101291241B1
Application number: KR1020110114818A
Authority: KR
Inventors: 손정훈; 배정훈; 김미진; 김현진; 박순호; 임광묵
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2010-11-04
Filing date: 2011-11-04
Publication date: 2013-08-01
Anticipated expiration: 2031-11-04
Also published as: US20130323785A1; WO2012060666A2; US8986956B2; KR20120047838A; WO2012060666A3

Abstract

본 발명은 야생형과 동일한 활성을 가지는 hEGF(human epidermal growth factor)를 고농도 및 고순도로 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 서열번호 14의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 포함된 hEGF 발현벡터, 상기 발현벡터가 형질전환된 숙주세포, 및 상기 발현벡터를 제조하고, 이를 KEX1 유전자가 결손된 효모에 형질전환하는 단계를 포함하는 hEGF의 생산방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면 인간 유래 EGF와 동일한 크기, 활성을 가지는 인간 유래의 EGF를 대량생산할 수 있으며, 이는 의료용, 화장품 등 다양하게 이용될 수 있다.

Description

효모에서 인체 상피세포 성장인자를 대량 생산하는 방법{A method for production of human epidermal growth factor in yeast}

본 발명은 야생형과 동일한 활성을 가지는 hEGF(human epidermal growth factor)를 고농도 및 고순도로 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 서열번호 14의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 포함된 hEGF 발현벡터, 상기 발현벡터가 형질전환된 숙주세포, 및 상기 발현벡터를 제조한 후 이를 KEX1 유전자가 결손된 효모에 형질전환하는 단계를 포함하는 hEGF의 생산방법에 관한 것이다.

EGF(Epidermal growth factor)는 53개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드로서 쥐의 턱밑샘에서 분비되는 것이 최초로 확인되었다. 이후 hEGF(human epidermal growth factor)는 인체의 다양한 조직에서 상피, 표피 등의 피부 세포의 성장을 촉진시키는 기능 외에도 각막, 폐 기관의 상피 세포의 성장과 분화를 촉진하는 것으로 알려졌다(Carpenter, G. Handbook of Experimental Pharmacology, 1981, 57, 89). 이러한 기능으로 인하여 EGF는 상처 치료제로 개발되어 광범위하게 사용되고 있으며 최근에는 EGF의 주름 개선이나 노화 방지 효과가 증명되어 기능성 화장품 원료로도 각광 받고 있다(Brown, G. L, US patent, 5,618,544). 초기에는 인간의 태반이나 소변에서 추출하였기 때문에 생산성에 한계가 있었으나, 유전공학 기술의 발달로 재조합 hEGF 생산 시스템이 개발되어 화장품 원료로 사용될 수 있을 정도로 생산성이 개선되었다. hEGF의 사용 범위가 늘어남에 따라 수요도 점차 늘어나고 있으나, hEGF의 높은 생산 비용으로 인하여 기능성 화장품의 가격을 높이는 주요인이 되고 있다. 따라서 기능성 화장품의 대중화와 hEGF 제품의 시장 확대를 위해서는 hEGF의 생산단가 문제를 반드시 해결하여야 한다.

원하는 단백질의 재조합 발현은 연구 또는 치료 목적, 기타 상업적 목적으로 단백질을 대량생산하기 위한 방법으로 널리 사용된다. 재조합 단백질을 대량으로 생산하기 위해서는 다양한 벡터와 숙주들이 이용되고 있으며 일반적으로 대장균을 이용한 방법 등이 널리 사용되고 있다. 현재 생산되는 대부분의 hEGF는 합성된 인간 EGF 유전자를 대장균에서 발현시켜 생산한 것이며, 효모에서 발현하는 경우도 보고된 바 있다(Urdea, N.S. et al. P.N.A.S., 1983, 86, 7461; 한국특허 1990-0022194). 대장균에서 발현하는 경우는 피브로넥틴 콜라겐 결합 도메인(fibronectin collagen binding domain (Ishikawa, T. et al., J. Biochem., 2001, 129, 627)), 돼지 성장인자의 아미노 말단(Xial, CJ et al., J. Mol. Endocrinol., 1996, 16, 89)이나 대장균의 TrpE 단백질의 일부분(Allen, G, et al., J. Cell Sci. Suppl., 1985, 3, 29)과 연결하여 융합 단백질 형태로 발현하거나 단순히 6개의 히스티딘(Histidine) 아미노산만 첨가하여 발현한 경우이다(Lee, J.Y et al Biotechnol. Appl. Biochem., 2000, 31, 245).

이러한 방법은 단백질의 발현양은 높으나 비활성 봉입체 형태로 발현되기 때문에 hEGF 단백질과 같이 3개의 시스틴 결합을 가진 3차 구조를 형성하여 활성을 갖도록 하기 위해서는 정제과정에서 활성화 단계를 반드시 거쳐야하며, 순도가 높은 hEGF를 얻기 위해서는 여러 단계의 정제 공정을 거쳐야 하므로 비용이 많이 드는 단점이 있다.

한편, 진핵 미생물인 효모 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae)는 인체에 대해 안전성이 입증된 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물로서, 유전자 조작이 용이하며 다양한 발현시스템이 개발되어 있고 대량배양이 용이하다. 뿐만 아니라 인체 단백질과 같은 고등세포 유래의 단백질을 재조합 생산할 때 단백질을 세포 밖으로 분비할 수 있는 분비기능과 글리코실화 등과 같은 단백질의 번역 후 수식 기능을 수행할 수 있는 장점을 제공한다. 목표 단백질의 분비생산을 위해서는 단백질 분비 시그날과 목표 단백질을 인위적으로 융합(fusion)함으로써 세포외 분비가 가능하며, 단백질의 분비과정을 통해서 단백질의 폴딩이나 이황화 결합의 형성 및 당쇄 부가과정이 진행된다. 따라서 생물학적으로 완전한 활성을 갖는 재조합 단백질을 생산할 수 있는 장점을 제공한다. 또한, 이는 생물학적 활성을 갖는 단백질을 세포를 깨지 않고 배지로부터 직접 회수할 수 있으며, 재접힘 단계를 필요로 하지 않아 매우 경제적이다(Eckart and Bussineau, Curr. Opin. Biotechnol., 1996, 7, 525).

그러나 효모 사카로마이세스 세레비시애는 활성형의 EGF 생산성이 대장균에 비해 낮기 때문에 EGF 생산균주로서 주목을 받지 못하고 있다.

이에, 본 발명자들은 효모에서 활성형의 hEGF를 고농도 및 고순도로 생산하기 위해서 예의 노력한 결과, VOA1 유전자 유래의 특정 아미노산 서열을 갖는 HL(hydrophilic domain) 펩타이드와 융합한 hEGF를 KEX1 유전자가 결손된 균주에서 발현시 야생형과 동일한 형태와 활성을 가지는 hEGF를 대량생산할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 야생형과 동일한 활성을 가지는 hEGF(human epidermal growth factor)를 고농도 및 고순도로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 야생형과 동일한 형태 및 활성을 가지는 hEGF의 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 hEGF의 발현벡터가 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 ⅰ) 서열번호 14의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 포함된 hEGF(human epidermal growth factor) 발현벡터를 제조하는 단계; 및 ⅱ) 상기 ⅰ) 단계의 발현벡터를 KEX1 유전자가 결손된 효모에 형질전환하는 단계를 포함하는, hEGF의 생산방법을 제공한다.

본 발명은 서열번호 14의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산서열을 포함하는 hEGF 발현 벡터를 KEX1 유전자가 결손된 효모에 형질전환함으로써, 상기 핵산서열을 포함하지 않은 hEGF 발현벡터를 야생형의 효모에 형질전환한 경우보다 야생형과 동일한 형태 및 활성을 갖는 hEGF가 5배 이상 증가되어 생산하는 것을 특징으로 한다.

따라서, 상기 방법에 의해 생산되는 hEGF는 야생형과 동일한 활성을 갖는 것으로서, 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 발현벡터에는 친화성 태그를 코딩하는 핵산 서열, 프로테아제 인식 서열을 코딩하는 핵산 서열, 또는 둘다가 추가로 포함될 수 있다.

상기 벡터에 친화성 태그를 추가로 포함함으로 인해서, 효모에서 생산된 서열번호 14의 폴리펩티드와 hEGF가 융합된 형태의 생산물 정제를 용이하게 할 수 있다. 또한, 상기 프로테아제 인식 서열을 추가로 포함시키면, 정제된 서열번호 14의 폴리펩티드와 hEGF가 융합된 형태의 생산물에 프로테아제를 처리하여, 서열번호 14의 폴리펩티드와 hEGF를 용이하게 분리할 수 있다.

다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 14의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 및 hEGF를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결된 hEGF 발현벡터를 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 벡터가 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

hEGF는 상처 치료제, 또는 주름 개선 또는 노화 방지용 화장품 원료로 각광받고 있으나, 이를 다량으로 생산하는데 어려움이 있고 생산 비용이 고가인 관계로, 대중적인 사용에 한계가 있었다.

이에 하나의 양태로서, 본 발명은 야생형과 동일한 활성을 가지는 hEGF(human epidermal growth factor)를 고농도 및 고순도로 생산하는 방법을 제공한다.

구체적으로, ⅰ) 서열번호 14의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 포함된 hEGF(human epidermal growth factor) 발현벡터를 제조하는 단계; 및 ⅱ) 상기 ⅰ) 단계의 발현벡터를 KEX1 유전자가 결손된 효모에 형질전환하는 단계를 포함하는, hEGF의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 hEGF 생산방법에서, 상기 제ⅰ) 단계는 상기 서열번호 14의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산서열 및 hEGF를 코딩하는 핵산서열이 포함된 벡터를 제조하는 단계이다.

상기 서열번호 14의 폴리펩티드는 C 말단이 제거된 효모 VOA1(YGR106C) 유전자로부터 유래된 것으로서, VOA1 단백질 부위 중 친수성 아미노산으로 구성되어 전하가 가장 높은 부위인 HL 펩타이드(HydrophiLic domain, HL)의 일부 영역이다.

본 발명에서 용어, "폴리펩티드"는 둘 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 나타내며, 생성물의 구체적인 길이를 나타내는 것은 아니다. 따라서, 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 아미노산 쇄, 또는 둘 이상의 아미노산의 쇄 또는 쇄들을 나타내기 위해 사용된 임의의 다른 용어는 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되며, 용어 "폴리펩티드"는 임의의 이들 용어 대신에, 또는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 또한 용어 "폴리펩티드"는, 여기에 제한되지 않지만, 공지된 보호/차단기에 의한 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 유도체화, 단백질분해성 절단, 또는 자연적으로 발생하지 않는 아미노산에 의한 변형을 비롯한 폴리펩티드의 발현 후 변형의 생성물도 포함될 수 있다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래되거나 또는 재조합 기술에 의해 제조될 수 있으나, 지정된 핵산 서열로부터 필수적으로 번역되는 것은 아니다. 이는 화학 합성에 의한 것을 비롯한 임의의 방식으로 생성될 수 있다.

본 발명에서 용어, "핵산"은 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 절편, 예를 들어, DNA 또는 RNA 단편을 나타낸다. 상기 "폴리뉴클레오티드"는 단수형 핵산뿐만 아니라 복수형 핵산도 포함하는 것으로, 단리된 핵산 분자 또는 작제물, 예를 들어, 메신저 RNA (mRNA), 바이러스-유래 RNA, 또는 플라스미드 DNA (pDNA)를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 통상적 인산디에스테르 결합 또는 비-통상적 결합 (예를 들어, 아미드 결합, 예컨대 펩티드 핵산 (PNA)에서 발견됨)을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "EGF"란 주로 인체의 다양한 조직에서 상피, 표피 등의 피부 세포의 성장을 촉진시키는 기능을 하는 상피세포 성장인자를 의미한다.

본 발명의 벡터는 선별된 숙주 세포에서 기능적인 모든 벡터를 포함한다. 본 발명에서 용어, "벡터" 란 연결되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 하나의 유형인 "플라스미드"는 그 안에 추가적으로 DNA 조각을 연결시킬수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 말한다. 벡터의 또다른 유형인 바이러스 벡터는 추가적인 DNA를 바이러스 게놈 안에 연결시킬 수 있다. 어떤 벡터는 숙주세포내로 도입되었을 때 자가복제가 가능하다(예컨대, 복제원점을 가지는 박테리아 벡터 및 포유동물 에피솜 벡터). 어떤 벡터들은 숙주 세포 내로 도입되었을 때 숙주세포 게놈 안으로 삽입되어(예컨대, 포유동물 비-에피솜 벡터) 숙주 게놈과 함께 복제된다. 본 발명의 벡터는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는데, 이러한 벡터를 "발현 벡터"라고 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에 있어서 발현 벡터는 플라스미드 형태이다. 본 발명에서 "플라스미드" 와 "벡터"는 플라스미드를 뜻하는 용어로서 서로 바꾸어쓸 수 있는 용어이고, 벡터 형태로 가장 일반적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 바이러스 벡터(예컨대, 복제결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노바이러스의존바이러스)와 같이 동일한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터들도 포함한다. 원핵생물에서 단백질의 발현은 목적 단백질과 리포터 단백질의 융합단백질 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 백터에 의해 수행될 수 있다. 효모 균주에서의 발현에 적합한 효모 발현 벡터는 pYepSecl(Baldari et al, EMBO J, 5:229-234, 1987), pMFa(Kurjan et al, Cell 30:933-943, 1982), pJRY88 (Schultz et al, Gene 54:113-123, 1987), pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) 및 picZ (Invitrogen Corp, San Diego, CaL)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

곤충 세포에서의 발현에는 배큘로바이러스(baculovirus)가 사용될 수 있다. 배큘로바이러스는 pAc 시리즈(Smith et al, MoI. Cell. Biol. 5:2156-2165, 1983) 및 pVL 시리즈 (Lucklow et al, Virology 770:31-39,1989)를 포함하는 배양된 곤충 세포에서의 단백질 발현에 이용될 수 있다. 또 다른 구체적 예로서, 숙주세포는 포유동물세포이고 벡터는 포유동물 발현 벡터일 수 있다. 포유동물 발현 벡터의 예로는 pCDM8(Seed, Nature 329:840, 1987)) 및 pMT2PC(Kaufinan et al., EMBO J. 6: 187-195, 1987)를 포함한다. 포유동물에서 사용되었을 때, 발현 벡터의 통제 기능은 바이러스 조절 서열에 의해 제공되기도 한다. 예컨대, 일반적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스 및 SV40(simian virus 40) 유래의 프로모터이다. 원핵세포 및 진핵세포에 모두 적용되는 기타의 적합한 발현 시스템의 예들은 예컨대 MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL(Sambrook et al, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.)을 참조할 수 있다. 바람직한 벡터로는 플라스미드, 파아지, 코스미드, 에피솜, 바이러스 파티클 또는 바이러스 및 삽입가능한 DNA 단편(즉, 상동재조합에 의해 숙주세포 게놈 안으로 삽입가능한 단편)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 바이러스 파티클은 아데노바이러스, 배큘로바이러스, 파보바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 아데노바이러스 의존바이러스, 셈리키 포리스트 바이러스, 백시니아 바이러스 및 레트로바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현 벡터는 pcDNA3(Invitrogen) 및 pSVL(Pharmacia Biotech)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 기타 발현 벡터로서 pSPORT^TM벡터, pGEM^TM 벡터(Promega), pPROEX벡터^TM(LTI, Bethesda, MD), Bluescript^TM벡터(Stratagene), pQE^TM벡터(Qiagen), pSE420^TM(Invitrogen) 및 pYES2^TM(Invitrogen)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

구체적인 일례로서, 발현 벡터는 hEGF를 코딩하는 핵산 서열이 적절한 숙주에 hEGF 단백질을 효과적으로 발현시킬 수 있는 적절한 조절 서열(control sequence)과 작동 가능하도록 연결된 복제가능한 DNA 작제물이다.

본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 DNA 영역은 다른 영역과 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예컨대, 프로모터가 서열의 전사를 조절할 수 있는 코딩 서열과 작동가능하게 연결된다. 벡터의 증폭은 조절 도메인의 발현과는 관계가 없고, 보통 복제원점에 의해 일어나는 숙주에서의 복제 능력 및 형질 전환체의 인지를 용이하게 하는 선별 유전자와 관계가 있다. 발현 벡터에서 조절 서열의 필요성은 숙주의 종류 및 형질전환 방법의 종류에 따라 달라진다. 일반적으로, 조절서열은 전사 프로모터, 인핸서, 전사 조절을 위한 선택적인 오퍼레이터 서열, 폴리아데닐화 신호, 리보솜에 결합하는 적절한 mRNA 코딩 서열, 및 전사와 번역의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 조절 서열은, 예컨대 GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185 (Goeddel, Academic Press, San Diego, Calif, 1990)에 기술되어 있다. 조절 서열은 많은 유형의 숙주세포에 있어서 핵산 서열의 직접적인 구성적 발현(constitutive expression), 및 일부 숙주 세포에서의 핵산 서열의 직접적인 발현(예컨대, 조직 특이적 조절 서열)을 포함한다. 또한, 당업자는 형질전환시킬 숙주 세포의 선택이나 단백질의 바람직한 발현 수준 등의 요소를 고려하여 벡터를 설계할 수 있다.

본 발명의 목적상, 상기 발현벡터는 효모에서 발현할 수 있는 벡터를 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 발현벡터는 목적 단백질로서 hEGF를 발현하는 것이며, 상기 hEGF는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

상기 발현벡터는 숙주 세포내로 도입되어 본 발명에서 기술되는 핵산서열에 의해 코딩된 융합 단백질 또는 펩타이드 등의 단백질 또는 펩타이드를 생산할 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 숙주 생물체에 의해 인지되는 프로모터를 함유할 수 있다. 본 발명의 프로모터 서열은 원핵 또는 진핵 또는 바이러스 기원일 수 있다. 원핵 유래의 서열의 예로는 박테리오파지 람다(The bacteriophage Lambda, Hershey, A. D., Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1973; Lambda II, Hendrix, R. W., Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1980)의 PR 및 PL 프로모터; E. coli의 trp, recA, heat shock 및 lacZ 프로모터, 및 SV40 초기 프로모터(Benoist et at, Nature, 290:304-310, 1981)를 포함한다. 효모에 적절한 프로모터는 GAPDH, PGK, ADH, PHO5, GAL1 및 GAL10를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 그 외에 프로모터는 마우스종양바이러스 (Mouse Mammary Tumor Virus, MMTV), 인간면역결핍바이러스의 긴 말단 반복(long terminal repeat, LTR), 말로니 바이러스(maloney virus), 사이토메갈로바이러스 즉시 초기 프로모터(cytomegalovirus immediate early promoter), 엡스타인바 바이러스(Epstein Barr virus), 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus), 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 및 인간 메탈로티오네인을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 벡터는 추가적인 조절 서열을 포함할 수 있다. 적절한 조절 서열의 예는 파지 MS-2의 레플리카아제 유전자의 샤인-달가노 서열 및 박테리오파지 람다의 cⅡ의 샤인-달가노 서열이 대표적이다.

구체적으로 본 발명의 바람직한 실시 양태에서, 상기 프로모터는 GAL10이다.

또한, 바람직한 발현 벡터는 형질전환된 숙주세포를 선별하는데 필요한 적절한 마커를 포함할 수 있다. 숙주의 형질전환은 당업계에 널리 알려진 다양한 기술 및 Sambrook 의 문헌에 기술되어 있는 기술 중 하나를 사용하여 이루어질 수 있다. 복제원점은 외래의 기원을 포함하는 벡터의 구성에 의해 제공될 수 있고, 또한 숙주세포 염색체 복제 메커니즘에 의해 제공될 수도 있는데, 벡터가 숙주 세포 염색체 내로 통합되면 후자는 충족된다. 한편, 바이러스 복제 원점을 함유하는 벡터를 사용하는 것 대신에, 당업자는 선별 마커 및 목적 단백질 DNA로 공동 형질전환시키는 방법에 의하여 포유동물을 형질전환시킬 수도 있다.

또한 본 발명의 벡터에서는 목적 단백질의 정제 효율을 높이기 위하여 친화성 태그(affinity tag)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 친화성 태그는 GST, MBP, NusA, 티오레독신(thioredoxin), 유비퀴틴, FLAG, BAP, 6HIS, STREP, CBP, CBD, 및 S-태그로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로 본 발명의 바람직한 실시 양태에서, 상기 친화성 태그는 6HIS이다.

아울러, 단백질 분비융합 인자와 목적 단백질의 분리를 위하여 특정 효소가 인식하는 부위를 삽입함으로써 목적 단백질의 효율적인 정제가 일어날 수 있다. 상기 효소는 프로테아제가 바람직하다. 상기 프로테아제 인식 서열은 효모 kex2p, 포유동물의 퓨린, Factor Xa, 엔테로키나아제, 서브틸리신, 담배식각바이러스 프로테아제, 트롬빈, 및 유비퀴틴 가수분해효소로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 구체적인 실시 양태에서는 상기 특정 효소는 엔테로키나아제(enterokinase)이며, 엔테로키나아제가 인식할 수 있는 아미노산 서열은 서열번호 16으로 표시되는 서열을 포함할 수 있다.

따라서, 본 발명의 hEGF 발현벡터는 서열번호 14의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 친화성 태그를 코딩하는 핵산 서열, 프로테아제 인식 서열을 코딩하는 핵산 서열, hEGF를 코딩하는 핵산 서열이 순차적으로 작동가능하게 연결된 벡터일 수 있다. 또한, 상기 벡터에 MFα pre-pro leader 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열이 추가로 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 MFα pre-pro leader 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열, 서열번호 14의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 친화성 태그를 코딩하는 핵산 서열, 프로테아제 인식 서열을 코딩하는 핵산 서열, 및 hEGF를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결된 hEGF 발현벡터를 사용하였다. 또한 AASASAGLALDKR 서열(서열번호 18)을 링커 펩타이드로 사용하여 MFα pre-pro leader 펩타이드(서열번호 17)와 HL 펩타이드가 연결되도록 하였다.

본 발명의 바림직한 발현 벡터는 도 1에 도시된 pYG-hlEGF이다.

본 발명의 hEGF 생산방법에서, 상기 ⅱ) 단계는, ⅰ)단계에서 제조된 서열번호 14의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 포함된 hEGF 발현벡터를 KEX1 유전자가 결손된 효모에 형질전환하는 단계이다.

상기 단계는 야생형의 hEGF와 동일한 활성을 가지는 hEGF를 생산하기 위하여 KEX1 유전자가 결손된 효모에 상기 벡터를 형질전환하는 것이다. 본 발명의 일 실시예에서는 야생형의 효모에 상기 벡터를 형질전환하는 경우, 야생형의 hEGF와 다른 분자량을 가지는 hEGF가 생산되었으나, KEX1 유전자가 결손된 효모에 상기 벡터를 형질전환한 경우 야생형과 동일한 분자량의 hEGF가 생산되고, 세포 재생 또는 콜라겐 합성 촉진 등의 본래 hEGF의 활성을 갖는 것으로 확인되었다.

본 발명에서 용어, "형질전환" 또는 "트랜스펙션"이란 외래 핵산(예컨대, DNA)을 숙주세포에 도입하는 당업계의 기술을 말하며, 인산칼슘 또는 염화칼슘 공침전법, 전기천공법, DEAE-덱스트란 매개법 또는 리포펙션 등을 포함한다. 숙주세포에 형질전환 또는 트랜스펙션시키는 것은 당업계에 잘 알려져 있는 적절한 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들어, Sambrook 등의 문헌(MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), 및 기타 실험 매뉴얼에 잘 기술되어 있다.

포유동물 세포로의 안정적인 트랜스펙션은 사용된 발현 벡터 및 트랜스펙션 기술에 달려있다고 알려져 있고, 일부 세포만이 외래 DNA를 자신의 게놈에 삽입시킬 수 있다. 이러한 삽입체를 확인하고 선별하기 위하여 선별 마커(예컨대, 항생제 저항성)를 코딩하는 유전자를 관심 있는 유전자와 함께 숙주 세포에 도입할 수 있다. 다양한 선별 마커는 약물 저항성을 부여하는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트 를 포함한다. 선별 마커를 코딩하는 핵산은 목적 단백질을 코딩하는 핵산과 같은 벡터 또는 다른 벡터에 연결되어 도입될 수 있다. 안정적으로 트랜스펙션된 세포는 약물 선별에 의해 확인될 수 있다(예컨대, 선별 마커를 가지는 세포는 생존하고, 그렇지 않은 세포는 죽을 것이다).

본 발명에서 사용되는 숙주 세포는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포 어떤 것이나 쓸 수 있으며, 박테리아, 곰팡이(예컨대, 효모), 식물 또는 동물(예컨대, 포유동물 또는 곤충) 세포를 포함한다. 상기 동물세포로는 인간, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 원숭이 및 곤충을 포함한다. 예컨대, CHO, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10, 및 Sf9 세포를 포함한다.

바람직하게, 본 발명에서 상기 숙주세포는 효모이며, 보다 바람직하게는 KEX1 유전자가 결손된 효모이다.

KEX1 유전자를 결손하는 방법은 당업계에 공지된 유전자 결손 방법을 사용할 수 있으며, 방법에는 제한이 없다. 보다 구체적인 본 발명의 일 실시예에서는 URA3 pop-out 벡터를 이용하여 실시하였다.

상기 효모는 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로이야(Yarrowia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 또는 아르술라(Arxula) 종을 포함한다. 구체적인 종의 예로는 캔디다 유틸리스(Candida utilis), 캔디다 보이디니(Candida boidinii), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 스키조카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로이야 리포폴리티카(Yarrowia lipolytica), 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) 또는 아르술라 아데니니모란스(Arxula adeninivorans)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 hEGF 생산방법에서, 상기 형질전환된 효모를 유가식 발효 배양시켜 hEGF 단백질을 생산 및 분비시키는 단계를 추가로 포함될 수 있다. 보다 구체적인 일 예는, 200ml의 최소배지에서 배양한 균주를 1.8L 발효배지(2% 포도당, 4% 효모추출물, 1% 펩톤)가 포함된 5L 규모의 발효기에 접종하였다. 포도당이 완전히 소모되면 공급배지(30% 포도당, 30% 갈락토스, 15% 효모추출물)를 균체의 성장에 따라 시간당 2g/L에서 20g/L로 점차로 추가하면서 50시간 동안 발효를 진행할 수 있다.

또한, 본 발명의 hEGF 생산방법에서, 당업계에 잘 알려진 정제 방법이 추가적으로 포함될 수 있다. 예컨대,면역친화성 크로마토그래피, 수용체친화성 크로마토그래피, 소수성 작용 크로마토그래피, 렉틴 친화성 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 및 역상 HPLC 등을 포함하는 종래의 크로마토그래피 방법에 의해 숙주 세포가 자라는 배지에서 분리될 수 있다. 또한, 원하는 단백질이 특이적 태그, 라벨 또는 킬레이트 모이어티를 가지는 융합 단백질이어서 특이적 결합 파트너 또는 제제에 의해 인식하여 정제하는 방법이 있다. 정제된 단백질은 원하는 단백질 부분으로 절단되거나 그 자체로 남아있을 수 있다. 융합 단백질의 절단으로 절단 과정에서 부가적인 아미노산을 가지는 원하는 단백질 형태가 만들어질 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 14의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산서열을 포함하는 hEGF 발현벡터를 KEX1 유전자가 결손된 효모에 형질전환하여 배양한 후, 상기 효모에서 분비된 hEGF를 분리 정제한 경우, 상기 서열번호 14의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산서열이 포함되지 않은 hEGF 발현벡터를 야생형의 효모에 형질전환하여 hEGF를 분리 정제한 경우(대조군)보다 분비되는 hEGF의 양이 약 5배 이상 증가되었다. 또한, 대조군에서는 야생형의 hEGF와 분자량이 상이하여 활성형의 hEGF를 생산하지 못하였으나, 본 발명의 생산방법에서는 야생형의 hEGF와 동일한 분자량의 hEGF가 다량으로 생산되었고, 상품화된 정제 EGF와 유사하게 세포 성장 촉진 및 콜라겐 합성 촉진의 활성이 나타남을 확인하였다(도 6, 및 7). 따라서, 본 발명의 방법을 사용하면, 활성형의 hEGF를 다량으로 생산할 수 있는 효과가 있다.

상기 발현벡터에는 친화성 태그 및/또는 프로테아제 인식 서열이 포함될 수 있으며, 상기 친화성 태그는 6개의 히스티딘(histidine)이 바람직하며, 상기 프로테아제 인식 서열은 엔테로키나아제의 인식 서열이 바람직하며, 보다 바람직하게는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다.

상기 발현벡터에서는 프리-프로 리더로서, MFα 프리-프로 리더(pre-pro leader) 펩타이드를 코딩하는 핵산서열이 추가로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 17로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것이다. 또한 본 발명의 벡터에서 MFα 프리-프로 리더 (pre-pro leader) 펩타이드를 코딩하는 핵산서열은 링커(linker) DNA에 의해 제18항의 HL(hydrophilic domain) 펩타이드를 코딩하는 핵산서열과 연결되는 것이 바람직하며, 상기 링커 DNA는 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열로 코딩되는 핵산을 포함하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 발현벡터는 도 1에 도시된 pYG-hlEGF이다.

또 다른 양태로서 본 발명은 상기 발현벡터가 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.

상기 숙주세포는 효모 세포가 바람직하며, 보다 바람직하게는 KEX1 유전자가 결손된 효모세포이다.

KEX1 유전자를 결손하는 방법은 당업계에 공지된 유전자 결손 방법을 사용할 수 있으며, 방법에는 제한이 없다.

상기 설명한 발현벡터가 형질전환된 KEX1 유전자가 결손된 효모 세포는 활성형의 hEGF를 세포 외로 다량으로 분비할 수 있다.

효모에 대한 설명은 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에 의하면, 야생형의 hEGF와 동일한 크기, 활성을 가지는 hEGF를 대량으로 생산할 수 있으므로, 기존에 낮은 생산성으로 재조합 단백질 발현에 널리 사용되지 못한 효모 발현 시스템의 문제점을 보다 효율적으로 개선시키는 효과가 있다. 또한 본 발명의 방법을 사용할 경우 hEGF를 손쉽게 과량 생산할 수 있으며, 이는 의료용, 화장품 등 다양하게 이용될 수 있다.

도 1은 hEGF의 발현 벡터인 pYG-hlEGF의 구조와 HL 펩타이드의 아미노산 서열을 나타낸 그림이다.
도 2는 YGaMF-EGF와 pYG-hlEGF 벡터로 형질전환된 효모의 hEGF 생산성을 비교한 그림이다(레인 1: YGaMF-EGF 발현 균주 상등액, 레인 2: pYG-hlEGF 발현 균주 상등액, 레인 M: 단백질 크기 표지자).
도 3은 pYG-hlEGF 벡터로 형질전환된 효모를 발효하여 상등액을 분석한 SDS-PAGE 결과이다(레인 1- 11: 발효 상등액, 레인 12: 단백질 크기 표지자).
도 4는 pYG-hlEGF 벡터로 형질전환된 효모를 발효하여 상등액을 정제하고, HL 펩타이드를 제거한 후 순수한 hEGF를 정제한 결과이다. 위 그림은 MPLC 크로마토그램이고, 아래 그림은 크로마토그램상의 피크에 해당하는 fraction을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다(레인 1: 정제된 HL-hEGF 융합 단백질, 레인 2: EK 처리된 HL-hEGF 융합 단백질, 레인 3-13: EK 처리된 HL-hEGF 융합 단백질을 MPLC로 분리한 fraction, 레인 14: 단백질 크기 표지자).
도 5는 KEX1 유전자 결손 균주 제작과정을 나타낸 그림이다.
도 6은 본 발명의 방법으로 정제된 hEGF 단백질의 분자량 측정결과를 나타낸 그림이다.
도 7은 본 발명의 방법으로 정제된 hEGF와 HL-hEGF에 대한 세포 성장촉진 및 콜라겐 합성 촉진 활성을 분석한 그림이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> VOA1 ( YGR106C ) 유전자의 친수성 부위( HL )를 분비융합인자로 이용 한 EGF 발현 균주제작

본 발명자들은 C-말단이 제거된 효모 VOA1 (YGR106C) 유전자가 세포밖으로 과량 분비됨을 확인하여 이를 분비융합인자로 활용하였다. 특히, VOA1 단백질 부위중 친수성 아미노산으로 구성되어 VOA1 단백질에서 전하가 가장 높은 부위인 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성된 HL 펩타이드(HydrophiLic domain, HL) 부위를 hEGF의 분비 융합인자의 최적 부위로 선택하여 사용하였다(서열번호 14: VINSLGWAFEDEDGDDEYATEETLS).

hEGF를 서열번호 14의 아미노산 서열로 구성된 HL 펩타이드와 융합하여, hEGF 발현벡터인 pYG-hlEGF를 제조하였다(도 1). 먼저 GAL100 프라이머(서열번호 1)와 DDK-R(서열번호 2)로 MFα의 pre-pro leader 펩타이드 유전자와 연결된 HL 펩타이드 유전자를 증폭하였으며, DDK-R 프라이머와 상보적 서열 및 hEGF 유전자 서열을 포함하는 센스 프라이머 H410(서열번호 3)과 GAL7 전사 종결자(transcription terminator)를 인식하는 GT50R 프라이머(서열번호 4) 서열을 일부 포함하는 안티센스 프라이머 H411(서열번호 5)을 사용하여 hEGF 유전자를 증폭하였다. 중합효소 연쇄반응(PCR)은 94℃에서 5분 동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 3분간, 72℃ 1분간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회 수행하였다. 증폭된 각각의 PCR 산물을 GAL100/GT50R 프라이머로 중복 연장 중합효소 연쇄반응을 하여 MFα의 pre-pro leader 펩타이드 유전자, HL 펩타이드 유전자, hEGF 유전자를 순서대로 연결하였다. 이러한 방법을 사용하여 MFα pre-pro leader 펩타이드와 HL 펩타이드가 AASASAGLALDKR 서열(서열번호 18)의 링커 펩타이드로 연결되었다. 링커에 포함된 KR 아미노산 서열은 효모 KEX2 단백질 분해효소의 인식 부위로 작용하여 분비과정에서 MFαpre-pro leader 펩타이드를 HL 펩타이드와 융합된 hEGF 단백질로부터 분리될 수 있도록 작용하였다. HL 펩타이드 말단에는 히스티딘(histidine) 아미노산 잔기가 6개 포함되어 정제시 친화성 표지로 작용하였다. 또한, HL 펩타이드와 hEGF를 분리할 수 있도록 HL 펩타이드와 hEGF사이에는 Enterokinase(EK) 인식부위인 DDDDK 아미노산 서열(서열번호 16)을 첨가하였다. EK는 DDDDK서열의 카르복시말단을 절단하므로 융합 단백질을 EK로 처리하면 완전한 형태의 hEGF 단백질이 생성될 수 있었다.

융합 연결된 유전자 단편 및 pYG-hlEGF 벡터를 EcoRI/SalI으로 처리하여 EGF 유전자가 제거된 벡터를 효모 Y2805 균주에 함께 형질전환하여, 세포내 유전자 재조합(in vivo recombination)을 유도하는 방법으로 pYG-hlEGF 벡터로 형질전환된 균주를 제조하였다. 효모 사카로마이세스 세레비시애는 상동 유전자간의 재조합 효율이 매우 높기 때문에 양 말단에 동일한 염기서열을 30 base 이상 포함하는 선형화된 벡터와 유전자 단편을 동시에 형질전환하면 세포내에서 상동부위 유전자 재조합이 발생하여 유전자 단편과 선형화된 벡터가 연결된 환상(circular form)의 벡터가 만들어질 수 있었다. 이렇게 제조된 pYG-hlEGF 벡터는 GAL10 프로모터, MFα pre-pro leader 펩타이드, 링커, HL 펩타이드, 6 히스티딘, EK 절단부위, hEGF, GAL7 종결자(terminator) 순서로 연결된 구조이기 때문에, GAL10 프로모터의 강력한 발현 유도로 만들어진 전사체는 리보좀에서 MFα pre-pro leader 펩타이드, 링커, HL 펩타이드, hEGF가 순서대로 연결된 융합 단백질 형태로 합성된다. 그런 후, MFα pre 펩타이드에 의하여 분비 경로에 들어서면 먼저 소포체에서 MFα pre 펩타이드가 제거되고, MFα pro 펩타이드와 HL 펩타이드의 도움을 받아 최적의 구조로 형성될 수 있었다. 이렇게 만들어진 hEGF 융합 단백질은 골지체로 이동하여 MFα pro 펩타이드를 분리시킨 후, HL 펩타이드와 hEGF만 연결된 융합단백질 형태로 세포밖으로 분비된다.

< 실시예 2> HL 펩타이드에의한 hEGF 생산성 증가 확인

서열번호 14의 아미노산 서열로 구성된 HL 펩타이드가 hEGF 생산성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 HL 펩타이드를 포함하지 않고, MFα pre-pro 펩타이드에 직접 연결된 hEGF를 발현하는 벡터(YGaMF-EGF)를 실시예 1과 동일한 방법을 사용하여 제조하였다. YGaMF-EGF 벡터와 pYG-hlEGF 벡터로 형질전환된 효모 균주를 시험관에서 배양하여 분비된 hEGF와 HL-hEGF 융합 단백질의 양을 비교하였다. 각각의 균주를 YPDG 배지(효모 추출액 1%, 펩톤 2%, 포도당 1%, 갈락토스 1%)가 포함된 시험관에서 30℃에서 40시간 배양한 후 배양액 0.6ml에 0.4ml의 아세톤을 첨가하여 침전시켰다. 이를 완충용액(buffer)에 녹인 후 SDS-PAGE분석을 통하여 분비된 단백질의 크기와 양을 비교하였다.

그 결과, hEGF는 HL-hEGF 융합단백질 형태로 발현하면(Lane2), 단독 분비 생산하는 경우(Lane1)에 비해 hEGF의 발현양이 5배 정도 증가되는 것을 확인하였다(도 2).

< 실시예 3> hEGF 생산을 위한 발효 및 정제

실시예 2에서 확인된 pYG-hlEGF로 형질전환된 균주의 hEGF 생산성을 확인하기 위하여 동 균주를 사용하여 유가식 발효배양을 수행하였다. 200ml의 최소배지에서 배양한 균주를 1.8L 발효배지(2% 포도당, 4% 효모추출물, 1% 펩톤)가 포함된 5L 규모의 발효기에 접종하였다. 포도당이 완전히 소모되면 공급배지(30% 포도당, 30% 갈락토스, 15% 효모추출물)를 균체의 성장에 따라 시간당 2g/L에서 20g/L로 점차로 추가하면서 50시간 동안 발효를 진행하였다.

도 3에 나타낸 것처럼 발효 배양액을 농축하지 않고 10㎕를 직접 SDS-PAGE로 분석한 결과 발효 종료시에 약 500mg/L이상의 융합 단백질이 분비되는 것을 확인하였다.

발효배지로 분비된 hEGF 융합단백질을 정제하기 위하여 우선 필터(Satorious)를 사용하여 1차 정제 후 30,000 MWCO Quick-stand (Amersham-Pharmacia Biotech, NJ)로 발효배지를 5배 농축하였으며, 곧바로 Ni-NTA 칼럼에 적용할 수 있도록 하기 위하여 농축과정에서 농축액의 조성을 50mM Tris-Cl(pH8.0), 0.5M NaCl로 조정하였다. 50ml의 발효 농축액을 20ml의 Ni-NTA 칼럼에 적용하여 융합 단백질을 Ni-NTA 레진에 결합시킨 후 MPLC(Medium Pressure Liquid Chromatography, Bio-rad)를 이용하여 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.5 M NaCl, 0.5 M 이미다졸(imidazole) 용액을 농도구배를 두고 흘려주어 HL-hEGF 융합단백질을 정제하였다. 정제된 융합단백질로부터 HL 펩티드를 제거하기 위하여 정제된 용액의 조성을 5,000 MWCO Amicon Ultra centrifugal filter device(Millipore)를 이용하여 엔테로키나아제(enterokinase, EK) 작용 조건인 20 mM Tric-HCl(pH 8.0), 50mM NaCl, 및 2mM CaCl₂ 이 되도록 조정하였다. 1㎍의 융합 단백질 당 1unit의 EK를 16℃에서 15시간 이상 처리하였다. EK로 처리된 단백질을 다시 상기한 방법과 동일한 방법으로 MPLC와 Ni-NTA 칼럼을 이용하여 정제하였다.

그 결과, 도 4와 같은 고순도의 hEGF 단백질이 정제되었다.

< 실시예 4> 활성형 hEGF 생산을 위한 KEX1 유전자 결손 효모 균주제조

실시예 3에서 정제된 hEGF 단백질을 확인하기 위하여 아미노 말단의 서열과 분자량을 측정하였다(한국기초과학 지원연구원). 아미노 말단의 아미노산 서열은 hEGF와 완벽히 일치하였으나, 분자량 측정결과 53개 아미노산으로 형성된 온전한 형태의 hEGF 단백질의 분자량 6,214 Da 보다 작은 6,064 Da으로 나타났다. 6064 Da의 분자량은 카르복시 말단의 라이신(lysine) 아미노산이 하나 제거된 52개 아미노산으로 구성된 hEGF와 크기가 일치한다. hEGF의 카르복시 말단이 잘리는 이유가 KEX1 단백질 분해효소의 작용에 의하여 발생할 수 있음을 가정하고, KEX1 유전자가 결손된 균주를 제작하였다.

KEX1 유전자의 결손은 URA3 pop-out 벡터를 이용하여 실시하였다.

먼저 KEX1 유전자의 5'부위 500bp와 3'부위 500bp를 프라이머 H464(서열번호 6)/H468(서열번호 7), H469(서열번호 8)/H467(서열번호 9)를 이용하였으며, 중합효소 연쇄반응(PCR)은 94℃에서 5분 동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 30초간, 72℃ 3분간, 72℃ 1분간 반응을 25회; 72℃에서 7분간 1회 수행하여 각각 증폭하였고, URA3 pop-out 카세트는 pTcURA 벡터를 주형으로 TcF(서열번호 10)/U200R(서열번호 11), U200F(서열번호 12)/TcR(서열번호 13)로 나누어 각각 증폭하였다(도 5). TcF/U200R 프라이머로 증폭한 카세트의 5'쪽에 KEX1 유전자의 5'부위 500bp를 H464/U200R 프라이머 세트를 사용하여 중복 연장 중합효소 연쇄반응을 수행하여 하나의 단편으로 연결하였다. H468 프라이머는 TcF 프라이머와 상보적인 서열을 포함하고 있기 때문에 두 개의 단편은 PCR에 의하여 하나의 단편으로 연결될 수 있다. 마찬가지 방법으로 U200F/TcR 프라이머로 증폭한 카세트의 3'쪽에 KEX1 유전자의 3'부위 500bp를 U200F/H467 프라이머 세트를 사용하여 하나의 단편으로 연결하였다. 연결된 단편을 효모 사카로마이세스 세레비시에 Y2805(Mat a ura3 INV2 pep4 :: HIS3) 균주에 형질전환하여 우라실이 없는 선택배지에서 형질전환체 Y2805Δkex(Mat a kex1::Tc190URA3 pep4 :: HIS3)를 선별하였다. KEX1 유전자 부위에 삽입된 URA3 유전자를 제거하여 URA3 유전자를 선별마커로 재사용하기 위하여 상기 균주를 불화오르틱산(5-fluoroorotic acid, 5-FOA)배지에서 배양하여 URA3 유전자가 pop-out된 균주 Y2805Δkex(Mat a, ura3 , kex1 :: Tc190 pep4 :: HIS3)를 선별하였다. 염색체상의 KEX1 유전자가 예상한 바와 같이 결실되고 URA3 유전자가 다시 pop-out 되었음을 PCR을 통해서 확인하였다.

< 실시예 5> KEX1 결손 균주를 이용한 hEGF 생산 및 활성분석

실시예 4에서 제작한 KEX1 결손 균주에 실시예 1에서 제작된 pYG-hlEGF 벡터를 형질전환하여 hEGF 발현 균주를 제작한 후 실시예 3과 동일한 방법으로 발효 및 정제를 실시하였다.

일반적으로 단백질 분해효소가 결손된 균주에서 재조합 단백질을 생산하면 재조합 단백질의 생산성이 감소하는 경향이 있으나, 본 발명에서는 KEX1 유전자가 결손된 균주와 야생형 균주는 hEGF 생산성에서 차이를 나타내지 않았다. 정제된 hEGF 단백질의 정성적 분석을 위하여 한국기초과학 지원연구원에 의뢰하여 분자량을 측정한 결과, 야생형 균주에서는 hEGF 단백질이 52개의 아미노산으로 구성된 6064Da크기 였으나, KEX1 유전자가 결손된 균주에서는 대부분이 완전한 크기의 53개의 아미노산으로 형성된 6221Da으로 나타났다(도 6). 생산된 효모 유래의 hEGF의 활성을 분석하기 위하여 정제된 두가지 타입의 hEGF인 HL이 융합된 hEGF(HL-hEGF)와 HL이 제거된 hEGF(hEGF)를 경희대학교 피부생명공학센터에 의뢰하여 세포 성장촉진(MTT assay)과 콜라겐(collagen) 합성 촉진 여부를 분석하였다(도 7). 결과에서 보는 바와 같이 정제된 두 종류의 단백질 모두 상품화된 정제 EGF와 유사한 활성을 나타내어 효모에서 분비 생산된 hEGF 및 HL-hEGF 모두 활성형으로 생산되었음을 확인하였다.

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Claims

ⅰ) 서열번호 14의 분리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 포함된 hEGF(human epidermal growth factor) 발현벡터를 제조하는 단계; 및
ⅱ) 상기 ⅰ)단계의 발현벡터를 KEX1 유전자가 결손된 효모에 형질전환하는 단계를 포함하는, hEGF의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 생산되는 hEGF는 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 것인 hEGF의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 발현벡터는 GST, MBP, NusA, 티오레독신(thioredoxin), 유비퀴틴, FLAG, BAP, 6HIS, STREP, CBP, CBD, 및 S-태그로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 친화성 태그(affinity tag)를 코딩하는 핵산서열을 추가로 포함하는 것인 hEGF의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 발현벡터는 효모 kex2p-인식 서열, 포유동물 퓨린-인식 서열, Factor Xa-인식 서열, 엔테로키나아제-인식 서열, 서브틸리신-인식 서열, 담배식각바이러스 프로테아제-인식 서열, 트롬빈-인식 서열, 및 유비퀴틴 가수분해효소-인식 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프로테아제 인식 서열을 코딩하는 핵산서열을 추가로 포함하는 것인 hEGF의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 발현벡터는 서열번호 14의 분리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열, 친화성 태그를 코딩하는 핵산 서열, 프로테아제 인식 서열을 코딩하는 핵산 서열, hEGF를 코딩하는 핵산 서열이 순차적으로 작동가능하게 연결된 것인 hEGF의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 1에 도시된 개열지도를 갖는 것인 hEGF의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 효모는 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로이야(Yarrowia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 슈완니오마이세스(Schwanniomyces) 및 아르술라(Arxula) 종으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것인 hEGF의 생산방법.
제7항에 있어서, 상기 효모는 캔디다 유틸리스(Candida utilis), 캔디다 보이디니(Candida boidinii), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아 스티피티스(Pichia stipitis), 스키조카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로이야 리포폴리티카(Yarrowia lipolytica), 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis) 및 아르술라 아데니니모란스(Arxula adeninivorans)로 이루어진 그룹에서 선택되는 것인 hEGF의 생산방법.
제5항에 있어서, 엔테로키나아제(enterokinase)를 처리하여 서열번호 14의 폴리펩티드와 hEGF를 분리시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 hEGF의 생산방법.
분리된 서열번호 14의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 및 hEGF를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결된 hEGF 발현벡터.
제10항에 있어서, 상기 발현벡터는 도 1에 도시된 개열지도를 갖는 것인 hEGF 발현벡터.
제10항 또는 제11항의 벡터가 형질전환된 숙주 세포.
제12항에 있어서, 상기 세포는 KEX1 유전자가 결손된 효모 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.