【発明の詳細な説明】
ブタ膵臓カルボキシペプチダーゼＢをコードするＤＮＡ配列
カルボキシペプチダーゼとして知られる酵素群は当該分野でよく知られている
。本発明は、カルボキシペプチダーゼＢ発現系を作製するためのブタカルボキシ
ペプチダーゼＢをコードするｃＤＮＡ分子、このｃＤＮＡからなるベクターなら
びにこのベクターで形質転換した宿主細胞、およびカルボキシペプチダーゼＢを
製造するためのこの発現ベクターの利用法に関する。
一般に、用語「カルボキシペプチダーゼＢ」は、蛋白のカルボキシ末端から塩
基性残基を優先的に開裂させるメタロエクソペプチダーゼを表す。ラット、ヒト
およびウシ組織のプロカルボキシペプチダーゼのアミノ酸配列は類似している。
D.L.Eaton，Journal of Biological Chemistry，266:21833-21838(1991)参照。
様々な組換えＤＮＡ発現系がカルボキシペプチダーゼＢおよび酵素活性を有す
るその変種の様なポリペプチド生成物を発現させるのに適しており、これらを本
発明において示す。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは好ましい発現系であるが
、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の様な細菌の発現系、バクロウイルス発現系の様な昆
虫の発現系および哺乳動物の発現系を含む多くの他の発現系を、目的とする無数
のポリペプチド産物の発現に用い得ることが当該分野で知られている。
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは酵母であるため、目的とする遺伝子操作産
物を製造するための宿主細胞として有利である。細菌発現系を用いて目的とする
遺伝子操作産物を製造する場合には、しばしば細菌から顆粒の形で産物を回収し
、これを可溶化し、次いでこれから放出された物質をホールディングさせること
により生物活性を示すのに必要な三次および四次構造を持った分子を生成する必
要がある。Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．中で産生される蛋白は可溶化およびホールデ
ィングを必要としない。シグナルペプチドの遺伝子操作により、培地中に生物活
性型の所望の産物を分泌させるPichia発現系を提供することができる。
Ｐｉｃｈｉａ発現系は当該分野でよく知られており、ヒト血清アルブミン、ヒ
ト上皮成長因子、肝炎抗原、ウシリソザイム、ヒトリソザイム、ヒトインスリン
様成長因子Ｉ、アプロチン、インターロイキン２、ストレプトキナーゼ、ヒト組
織プラスミノーゲン活性化因子、ＨＩＶのｇｐ１２０抗原、ＳＩＶのｇｐ１２０
抗原、パータクチン、テタヌスＣ、ネズミ上皮成長因子、およびヒト組織壊死因
子を製造するのに利用されている。G.B.BuckholzおよびM.A.G.Gleesonの、Biote
chnology,9:1067-1072(1991)参照。
本発明は、カルボキシペプチダーゼＢ発現系を作製するために、ブタプロカル
ボキシペプチダーゼＢならびにＴｙｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−プロブタ膵臓カルボキ
シペプチダーゼＢをコードするｃＤＮＡ分子、これらのｃＤＮＡからなるベクタ
ーならびにこれらのベクターで形質転換されたＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
細胞、およびブタカルボキシペプチダーゼＢおよびそのＮ−末端伸長同等物を製
造するためのＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ発現系の利用法を提供する。細菌
、昆虫および哺乳動物の発現系も本発明の酵素を製造するのに用いることができ
、これらも本発明の範囲内に含まれる。
本発明はブタプロカルボキシペプチダーゼＢとブタＴｙｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−
プロカルボキシペプチダーゼＢを発現させるための組換えＤＮＡ発現ベクターお
よびそれを用いて形質転換された宿主細胞を提供する。
Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔ−ブタプロカルボキシペプチダーゼＢをコードする本
発明の二本鎖ｃＤＮＡ配列およびそれによってコードされるアミノ酸配列は下記
の式Ｉに示す。式Ｉのセンス鎖に対応する一本鎖ＤＮＡ配列も配列番号１に示し
ている。式１のアミノ酸配列は配列番号２に示す。式１は本発明のベクターを構
築するために利用する制限エンドヌクレアーゼ部位を参照するのに便利であり、
また同時に、それぞれのコドンによってコードされるアミノ酸配列を提供するの
で、配列番号の項を補足するものである。
式ＩのＤＮＡ配列およびそれに対応するアミノ酸配列は、Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｍ
ｅｔのアミノ−末端（Ｎ−末端）伸長部を有するブタプロカルボキシペプチダー
ゼＢをコードするｃＤＮＡ配列を表す。プロカルボキシペプチダーゼＢおよびそ
のＮ−末端伸長変種はトリプシン処理によって容易にカルボキシペプチダーゼＢ
に変換され、アミノ酸９８〜９９個からなる式１のポリペプチドに開裂する。ブ
タカルボキシペプチダーゼのコード配列を配列番号３に示し、対応する翻訳産物
を配列番号４に示す。
プラスミドｐＦＪ４７４はＴｙｒ−Ｈｉｓ−Ｍｅｔブタプロカルポキシペプチ
ダーゼＢのコード配列を含んでいる（式Ｉ）。プラスミドｐＦＪ４７４はNorthe
rn Regional Reseach Laboratory(NRRL)(Peoria,IL)に寄託されており、本出願
が発行に伴って受託番号ＮＲＲＬＢ−２１０３２で一般に利用可能となるであろ
う。
プラスミドｐＦＪ４８９はブタプロカルボキシペプチダーゼＢのコード配列を
含む（式ＩのそれぞれＹ、ＨおよびＭをコードする最初の３コドンを欠く）。プ
ラスミドｐＦＪ４８９はNorthern Regional Reseach Laboratory(NRRL)(Peoria,
IL)に寄託されており、本出願の発行に伴って受託番号ＮＲＲＬＢ−２１０２８
で一般に利用可能となるであろう。
本発明のカルボキシペプチダーゼＢを発現させるための好ましい宿主細胞はＰ ｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ（以後、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓと略す）である。
細菌、昆虫および哺乳動物の発現系が当該分野で知られており、これらも本発明
の酵素を製造するのに用いることができ、本発明の範囲内に含まれる。
目的とするポリペプチド産物を発現させるのにＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓが有用で
あることは当該分野で知られている。米国特許第５１０２７８９号、第５００４
６８８号、第４８８２２７９号、および第５０３２５１６号は、P.pastorisに関
する基本的情報とPichiaの遺伝子操作に使用する無数のベクターの詳細を開示し
ている。前記特許の内容は本明細書の一部を構成する。P.pastorisの特に好まし
い株はＧＴＳ１１５である。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＴＳ１１５は１９８４年
８月３１日にNorthern Regional Reseach Laboratory(NRRL)(Peoria,IL)に寄託
された。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＴＳ１１５は受託番号Ｙ１５８５１でＮＲＲ
Ｌから利用可能である。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＴＳ１１５はＮＲＲＬ Ｙ−
１１４３０のニトロソグアナジンによる突然変異誘発によって生じたものであり
、遺伝子ＨＩＳ４によってコードされるヒスチジノールデヒドロゲナーゼ活性が
欠損している。ＧＴＳ１１５はＹＰＤの様な複雑な培地、およびＭＭＨ、ＭＤＨ
またはＹＧＭＨの様なヒスチジンを添加した最小培地上で増殖する。ＨＩＳ４の
欠損はＰｉｃｈｉａまたは他の酵母由来のＨＩＳ４遺伝子からなるベクターを簡
単
に選別する手段を提供する。ＧＴＳ１１５は文献によってＧＳ１１５と記されて
いることもある。
Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの他の多くの株はＮＲＲＬおよびAmerican T
ype Culture Collection（ＡＴＣＣ）（12301 Parklawn Drive,Rockville,MD）
を含む供給源から公に利用できる。例えば、1990 ATCC Catlog of YeastsにはＰ
．ｐａｓｔｏｒｉｓ８株が記載されている。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＴＳ１１
５株が好ましいが、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの他の株も本発明のベクターと互換性
があるのでこれらも本発明の範囲内である。
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの遺伝子操作では、当該分野で知られている酵母中で機
能する多くの調節ユニットおよび選択可能なマーカーが利用できる。本明細書に
開示し、特許請求しているベクターは当該分野で知られているいくつかの要素を
利用している。ベクターは、本発明のベクターを構築するために使用する、多く
のプロモーター、シグナルペプチド、抗生物質耐性マーカー、コード配列、統合
機能および他の要素の便利な供給源として寄託されている。寄託された材料は表
Ｉにまとめている。
本発明のベクターには自己複製ベクターおよび自己統合ベクターが含まれる。
この統合ベクターはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ染色体中でホモロガスな組換えを行う
ために５’ＡＯＸ１および３’ＡＯＸ１を利用する。ＡＯＸはＰ．ｐａｓｔｏｒ ｉｓ
のアルコールオキシダーゼ遺伝子を表し、５’と３’を明示することによっ
てこれらの配列がＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ染色体上でアルコールオキシダーゼ遺伝
子ＡＯＸ１の上流または下流のいずれにあるかを図示している。ＡＯＸ２はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ
ゲノムの第二アルコールオキシダーゼ遺伝子を表すが、本発明
で例示したベクター中での発現には利用されず、そのフランクキング領域は組換
えに利用されないため、これについてはこれ以上触れない。米国特許第５１６６
３２９号はＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓのアルコールオキシダーゼ遺伝子およびその調
節ユニットについて記載している。
ＡＯＸ２も発現に有用と思われるが、ＡＯＸ１が本発明の目的のために好まし
いメタノール誘発性プロモーターであることは、当業者なら明らかであろう。前
記のアルコールオキシダーゼフランキング配列を介するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ染
色体中への部位選択的挿入は米国特許第４８８２２７９号に記載されており、そ
の内容は本明細書の一部を構成する。５’および３’ＡＯＸ１配列が宿主染色体
中のホモロガスな組換えを介した部位特異的統合を生じることは、当業者なら明
らかであろう。実施例および図の内容は組換えが２つの異なる組換えによって多
くのベクターに生じ得ることを示しているが、ＨＩＳ４配列がＰｉｃｈｉａ染色
体中に組込まれる断片上に存在しない限り、ＧＴＳ１１５の様なヒスタジン欠損
株において選別のために使用されるヒスタジノール欠乏培地を使用することによ
って検出されないであろうことは理解されよう。ヒスチジン栄養要求体でないＰ
ｉｃｈｉａ株を用いる場合は、両変種の組換え体が生じるであろうことも理解さ
れよう。当該分野で知られているＰＡＲＳ１配列は自己複製ベクターを構築する
ために使用される。統合型のベクターが好ましい。
本発明の多くのベクターは、大腸菌中での複製と選別を許す要素からなる。ア
ンピシリン（ＡｍｐRまたはＡｐ）耐性マーカーは大腸菌における選別に有用で
ある。カナマイシン耐性遺伝子（ＫａｎＲ）は大腸菌における選別を許す。
様々なプロモーターがＰｉｃｈｉａの様な酵母において操作可能である。アル
コールオキシダーゼプロモーター（ｐＡＯＸ）はメタノールによって誘発できる
。ｐＡＯＸ１はｐＬＧＤ２０のコンポーネントとして利用可能である（ＮＲＲＬ
受託番号Ｂ−２１０３４）。ｐＬＧＤ２０の制限部位および機能マップは図９に
示
す。グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼプロモーター（ｐ
ＧＡＰＤＨおよびｐＧＡＰ）はｐＬＧＤ２３のコンポーネントとしてＮＲＲＬに
寄託されており、受託番号Ｂ−２１０２９で本発明の発行に伴って公に利用可能
となるであろう。ｐＬＧＤ２３の制限部位および機能マップは図４に示している
。ホスホグリセレートキナーゼプロモーター（ｐＰＧＫ）は米国特許第４６１５
９７４号に開示されており、その内容は本明細書の一部を構成する。
本発明の好ましい発現系には、所望の産物（ブタカルボキシペプチダーゼまた
はそのＮ−末端伸長同等物）を分泌させるためのシグナルペプチド（シグナル）
が含まれる。Hitzemanらの、米国特許第４７７５６２２号は酵母によるヘテロガ
スな蛋白の発現、プロセッシングおよび分泌を開示しており、シグナルの多様性
と有用性に関する優れた考察を提供している。Hitzemanらの、米国特許第４７７
５６２２号は本明細書の一部を構成する。Changらの、米国特許第５０１０００
３号は酵母のホモロガスなシグナルを用いるヘテロガスな蛋白の分泌を開示して
いる。米国特許第５０１０００３号のすべての内容は本明細書の一部を構成する
。プレプロ−αメイティング因子は好ましいシグナルペプチドである。プラスミ
ドｐＦＪ４７４（ＮＲＲＬ Ｂ−２１０３２、図７）およびｐＬＧＤ２０（ＮＲ
ＲＬ Ｂ−２１０３４、図９）はプレプロ−αメイティング因子シグナルを含ん
でいる。これらのベクターは本発明の発行に伴って公に利用可能となり、本発明
の他のベクターを構築するためのαメイティング因子シグナル配列の便利な供給
源となるであろう。酸ホスファターゼシグナルペプチド（ＰＨＯ１）は当該分野
で知られている。ヒト血清アルブミンのシグナルペプチドはｐＬＧＤ２３のコン
ポーネントとして寄託され（ＮＲＲＬ Ｂ−２１０２９、図４）、本出願の発行
に伴ってＮＲＲＬから公に利用可能となろう。実施例および図中のＨＰＩはヒト
プロインスリンのシグナルペプチドの略号である。ＨＰＩはｐＬＧＤ３６のコン
ポーネントとして寄託されている。ｐＬＧＤ３６（ＮＲＲＬ Ｂ−２１０３１、
図６）は本出願の発行に伴って公に利用可能となろう。プレＭＦａ、プレαメイ
ティング因子はプラスミドｐＦＪ４８９のコンポーネントであり、ＮＲＲＬに受
託番号Ｂ−２１０２８で寄託されており、本出願の発行に伴って公に利用可能と
なろ
う。図３はプラスミドｐＦＪ４８９の制限部位と機能マップを示す。実施例およ
び図中のＣｐＢはブタカルボキシペプチダーゼＢのシグナルペプチドの略号であ
る。ＣｐＢはプラスミドｐＬＧＤ２７（ＮＲＲＬ Ｂ−２１０２７）から容易に
製造することができ、本出願の発行と共に公に利用可能となろう。プラスミドｐ
ＬＧＤ２７の制限部位と機能マップを図２に示す。ＴＲＰＧＥＮはウシトリプシ
ノーゲンのシグナルペプチドに対して用いられる名称である。ＴＲＰＧＥＮはプ
ラスミドｐＦＪ４６９（ＮＲＲＬ Ｂ−２１０２５）から容易に得ることができ
、本出願の発行に伴って公に利用可能となろう。プラスミドｐＦＪ４８９の制限
部位と機能マップを図３に示す。プラスミドｐＦＪ４７１はヒトグルカゴンのシ
グナルペプチドからなる。プラスミドｐＦＪ４７１はＮＲＲＬに寄託されており
、本出願の発行に伴って受託番号Ｂ−２１０３３で公に利用可能となろう。プラ
スミドｐＦＪ４７１の制限部位と機能マップを図８に示す。
Ｐｉｃｈｉａはシグナルペプチドを開裂させる内在性酵素を持っている。Ｋｅ
ｘ２は塩基性ジペプチドユニットを含む配列中の第二塩基性残基後をプロセッシ
ングする。即ち、アルギニンおよび／またはリジンのいかなる組み合せをも含む
適切に露出したジペプチドはＫｅｘ２酵素によって開裂する。本発明のベクター
はＫｅｘ２系によって開裂するポリペプチドを例示する。ＡｒｇＡｒｇ−ＨＳＡ
シグナルおよびＬｙｓＡｒｇ−ＭＦαを利用する構築物を提供することによって
、プロセッシング酵素としてのＫｅｘ２の使用を例示する。大量のＫｅｘ２を製
造するための組換えＤＮＡの使用は米国特許第４９２９５５３号に記載されてお
り、その内容は本明細書の一部を構成する。
ＳＥＣ１１遺伝子によってコードされるシグナルペプチドは当該分野で知られ
ている。ＳＥＣ１１遺伝子産物はＸがアミノ酸であるＡｌａ−Ｘ−Ａｌａを開裂
させるため、プレＭＦＡシグナルからなる構築物から「プレ」領域を除去するの
に有用である。
実施例を記載する前に、多くの実施例に共通しているプロトコールを示す。プ
ロトコールは、当業者が本発明の実施するのに好都合なように科学文献および特
許文献を適切に引用して示している。
プロトコールプロトコール１
．エレクトロポーレーションによるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒ ｉｓ
の形質転換
ＹＰＤ培地１００ｍＬに、寒天培地上に増殖した所望のＰｉｃｈｉａ ｐａｓ ｔｏｒｉｓ
株の１白金耳を接種する。ＹＰＤ培地は水９００ｍＬにＢａｃｔｏイ
ーストエキス１０ｇとペプトン２０ｇを溶解して（ＹＰＤ斜面または平板にはさ
らにＢａｃｔｏアガー２０ｇを添加する）調製し、２０分間オートクレーブにか
け、次いで滅菌２０％（ｗ／ｖ）Ｄ−グルコース１００ｍＬを加える。ＹＰＤ培
地に適切なＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ株を接種し、シェイカーバス中、３
０℃で４８時間インキュベーションする。次にこのブロス１０μＬ、３０μＬま
たは１００μＬの試料をＹＰＤ１００ｍＬに接種してＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ ｒｉｓ
を２次培養し、次いでシェイカーバス中、３０℃で一夜インキュベーショ
ンする。光学濃度０．８〜１．５（波長６００ｎｍ、培地をブランクとした）の
一夜培養が好ましい。次に、適切な光学濃度の培養物を遠心して細胞のペレット
を得る。上清をデカントし、冷滅菌水２０ｍＬを各チューブに加える。細胞を遠
心してペレットとする。次に、ペレットをさらに冷滅菌水２０ｍＬで洗浄し、遠
心して細胞を回収する。遠心した後、冷１Ｍ ＳｏｒｂｉｔｏｌTM（Ｓｉｇｍａ
）２０ｍＬを各チューブに加え、ペレットを再懸濁して別のチューブに移す。遠
心して培養物をペレットとし、ペレットに冷１Ｍ ＳｏｒｂｉｔｏｌTM４００μ
Ｌを加える。チューブを静かに振り、ピペットチップを用いて静かにペレットを
分離することにより、ペレットを再懸濁する。
次に、濃度１μｇ／μＬに調製したリニアベクター約１０μＬを、先に調製し
たＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓレシピエント株５０μＬに加える。ＤＮＡ／Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ調製物を、氷上で２５分間インキュベーション
した後、冷却した０．２ｃｍエレクトロポーレーション用キュベット（ＢｉｏＲ
ａｄ）に移す。次に、エレクトロポーレーション用混合物をＢｉｏＲａｄ Ｇｅ
ｎｅ Ｐｕｌｓａｒ Ｓｙｓｔｅｍエレクトロポーレーションシステムを用いて
２．０ＫＶ、２５μＦ、２００Ωでパルスする。ＹＰＤ培地５００μＬをエレク
トロポーレーション試料に加え、次いでこの混合物の全量を５ｍＬ遠心管に移し
、全ての試料をパルスしてエレクトロポーレーションが完了するまで、氷上でイ
ンキュベーションする。次に、エレクトロポーレーション試料を、シェーカーバ
ス中、３０℃で３０分間インキュベーションした。次に、エレクトロポーレーシ
ョン試料を１００μＬまでの容量でＭＤ平板上にまく。ＭＤ寒天平板は１０Ｘ
ＹＮＢ（濾過滅菌水１００ｍＬ中にアミノ酸を含まない酵母窒素ベース６．７ｇ
）１００ｍＬ、５００Ｘビオチン（濾過滅菌水１００ｍＬ中にビオチン２０ｍｇ
）２ｍＬ、および１０Ｘ Ｄ−グルコース１００ｍＬとオートクレーブした水８
００ｍＬを混合して調製した（平板はＢａｃｔｏアガー１５ｇを含む）。次に、
平板を３０℃で４日間インキュベーションする。
次に、ＨＩＳ＋形質転換体がＭＤおよびＹＰＤ平板上にパッチを形成する。Ｍ
ＤおよびＹＰＤ平板を３０℃で４８時間インキュベーションするが、この時点で
すでにコロニーが識別できる。プロトコール２
．Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの通常の形質転換
米国特許第５１６６３２９号の９〜１０頁には、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓのスフ
ェロプラスト化と通常の形質転換を行うためのプロトコールが開示されている。
この内容は本明細書の一部を構成する。プロトコール３
．Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓによる蛋白のメタノール誘発発現
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ中のアルコールオキシダーゼプロモーターによって誘導
されたメタノール誘発転写は米国特許第５１３５８６８号に開示されており、こ
の内容は本明細書の一部を構成する。
実施例１
ｐＬＧＤ４３の構築
オリゴヌクレオチドＤＰＧ５９（配列番号５）およびＤＰＧ６０（配列番号６
）
を合成し、アニールさせ、次いでリン酸化した。オリゴヌクレオチドの乾燥ペレ
ットを水に再懸濁し（０．５μｇ／μＬ）、次いで７０℃で１５分間インキュベ
ーションした。相補性オリゴヌクレオチドのＤＰＧ５９／６０ ２０μＬを混合
し、７０℃で１５分間インキュベーションし、次いで５５℃から室温（２５℃）
に１時間冷却した。相補性オリゴヌクレオチドリンカーＤＮＡ８．７５μｇを１
ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ８）、ポリヌクレオチドキナーゼ（New Ingland Biolabs、
以後ＮＥＢと略す）２．５単位、およびリガーゼ緩衝液（Boehringer-Mannheim
、以後ＢＭと略す）を含む反応物２５μＬ中で、３７℃で３０分間リン酸化した
。キナーゼを７０℃で１０分間インキュベーションすることにより加熱不活化し
た。
プラスミドｐＬＧＤ２３（ＮＲＲＬ Ｂ２１０２９）１０μｇを、緩衝液Ｈ（
ＢＭ）中の制限酵素ＮｓｉＩ ５０単位で消化した。反応物を３７℃で１時間イ
ンキュベーションした。５’−末端のホスフェートを、子ウシ腸アルカリホスフ
ァターゼ（ＣＩＡＰ）１単位を加え、３７℃で３０分間インキュベーションして
除去した。７０℃で１０分間インキュベーションして酵素を加熱不活化した。
ＤＰＧ５９／６０ ０．３５μｇを、ＮｓｉＩで消化し脱リン酸化したｐＬＧ
Ｄ２３ ０．１μｇと混合する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位、リガーゼ緩衝液（
ＢＭ）およびＴＥを終量が１５μＬとなるように加えた。ライゲーション反応物
を１５℃で１６時間インキュベーションし、次いでこれを用いてＥ．ｃｏｌｉ
Ｋ１２ ＭＭ２９４細胞を形質転換する。形質転換体を、アンピシリン５０μｇ
／ｍＬを含むＬ−寒天上で選別する。所望のベクターｐＩＮＴ１の配列番号をヌ
クレオチドシークエンシングによって確認する。
ｐＦＪ４７４（ＮＲＲＬ受託番号Ｂ−２１０３２、図７）２０μｇを、緩衝液
Ｂ中の制限エンドヌクレアーゼＮｃｏＩおよびＮｒｕＩ １００単位を用い、３
７℃で１時間消化した。１．５ｋｂのＤＮＡ断片を１％ＴＢＥアガロースゲルお
よびＤＥＡＥペーパーを用いてゲル精製した。
プラスミドｐＩＮＴ１ ２０μｇを、緩衝液Ｈ中の制限エンドヌクレアーゼＳ
ｐｅＩおよびＸｂａＩ １００単位を用い、３７℃で１時間消化した。ｐＰＣｐ
Ｂ遺伝子を含む５．６ｋｂのＤＮＡ断片を、Sambrook,J.,Fritsch,I.およびMani
atis,T.らの、Molecular Coning A Laboratory Manual、第２版、１９８９（Col
d Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor，N.Y.）の記載に従って、１％ア
ガロースゲル、Ｔｒｉｓホウ酸緩衝液（ＴＢＥ）およびＤＥＡＥペーパーを用い
てゲル精製した。
プラスミドｐＩＮＴ１ １０μｇを緩衝液Ｂ（ＢＭ）中の制限酵素ＮｃｏＩお
よびＮｒｕＩ ５０単位で消化した。３Ｍ酢酸ナトリウム０．１容および１００
％ＥｔＯＨ ２．５容を加えてＤＮＡを沈澱させる。凍結乾燥したＤＮＡを、制
限酵素ＳｐｅＩおよびＸｂａＩ ５０単位、緩衝液Ｈ（ＢＭ）およびＴＥ（０．
０１Ｍ（ｐＨ７．４）Ｔｒｉｓ緩衝液中の１．０ｍＭエチレンジアミン四酢酸）
を含む反応容量１００μＬ中に再懸濁し、次いで３７℃で１時間インキュベーシ
ョンした。５’−末端のホスフェートを、子ウシ腸アルカリホスファターゼ（Ｃ
ＩＡＰ）１単位を加え、３７℃で３０分間インキュベーションして除去した。７
０℃で１０分間インキュベーションして酵素を加熱不活化した。
ゲル精製したプラスミドｐＩＮＴ１約０．５μｇおよびゲル精製したｐＦＪ４
７４ＤＮＡ０．５μｇを、記述のごとくＳｐｅＩ、ＸｂａＩ、ＮｒｕＩおよびＮ
ｃｏＩで消化し、脱リン酸化されたプラスミドｐＩＮＴ１ ＤＮＡ ０．１μｇと
混合した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１単位、リガーゼ緩衝液（ＢＭ）およびＴＥを終
量が１５μＬとなるように加えた。ライゲーション反応物を１５℃で１６時間イ
ンキュベーションし、次いでこれを用いてＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＤＨ５α細胞
を形質転換した。形質転換体を、アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含むＬ−寒天上
で選別する。所望のｐＬＧＤ４３構築物を含むアンピシリン耐性形質転換体をス
クリーニングし、制限酵素分析によって同定した。
配列番号１ ブタＴｙｒ−Ｈｉｓ−ＭｅｔプロカルボキシペプチダーゼＢの配列
配列番号２ プレプロカルボキシペプチダーゼＢ
配列番号３ ブタカルボキシペプチダーゼＢの配列
配列番号４ ブタカルボキシペプチダーゼＢ
配列番号５ （長さ：１１塩基）（ＤＰＧ５９）
配列番号６ （長さ：１１塩基）（ＤＰＧ６０）
図の説明
図１はプラスミドｐＦＪ４６９の制限部位と機能マップである。
図２はプラスミドｐＬＧＤ２７の制限部位と機能マップである。ｐＬＧＤ２７
は約９４９２塩基対を含む。
図３はプラスミドｐＦＪ４８９の制限部位と機能マップである。ｐＦＪ４８９
は約１０７６９塩基対を含む。
図４はプラスミドｐＬＧＤ２３の制限部位と機能マップである。ｐＬＧＤ２３
は約１１２５７塩基対を含む。
図５はプラスミドｐＦＪ４５７の制限部位と機能マップである。ｐＦＪ４５７
は約９８０３塩基対を含む。
図６はプラスミドｐＬＧＤ３６の制限部位と機能マップである。
図７はプラスミドｐＦＪ４７４の制限部位と機能マップである。ｐＦＪ４７４
は約９７２１塩基対を含む。
図８はプラスミドｐＦＪ４７１の制限部位と機能マップである。
図９はプラスミドｐＬＧＤ２０の制限部位と機能マップである。ｐＬＧＤ２０
は約９７１０塩基対を含む。
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フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ
Ｎ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ
，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，
ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，Ｎ
Ｚ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ
，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 ハーシュバーガー、チャールズ・リー
アメリカ合衆国46140インディアナ、グリ
ーンフィールド、ハーモニー・トライル・
ウエスト1475番
(72)発明者 ラーソン、ジェフレイ・リン
アメリカ合衆国46260インディアナ、イン
ディアナポリス、フーバー・レーン8210番
(72)発明者 スターナー、ジェーン・ラーロウ
アメリカ合衆国46236インディアナ、イン
ディアナポリス、ドウ・レーン12479番
(72)発明者 ザン、ハイチャオ
アメリカ合衆国60085イリノイ、パーク・
シティ、アパートメント303、グリーンリ
ーフ・コート4118番