KR100371269B1 - 한세눌라 폴리모르파 유전자 및 이들 유전자가 결핍된 균주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한세눌라 폴리모르파 유전자 및 이들 유전자가 결핍된 균주의 제조에 있어서, 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)DL1 유래의 카르복시펩티다아제 Y를 코딩하는 유전자PRC1,프로티아제 A를 코딩하는 유전자PEP4유전자 및 카르복시펩티다아제 α를 코딩하는 유전자KEX1을 클로닝한 다음 이 유전자들중,PRC1과PEP4유전자를LEU유전자에 의해 디스럽션(disruption)시켜 제작한 벡터로 형질전환된 한세눌라 폴리모르파 UR2 카르복시펩티다아제 Y, 프로티아제 A 변이주를 제조하고 또PRC1, PEP4, KEX1유전자를 한세눌라 폴리모르파 URA3 유전자 팝아웃 카세트(pop-out cassette)에 의해 디스럽션시켜 제작한 벡터로 형질전환된 한세눌라 폴리모르파 DL1 카르복시펩티다아제 Y, 프로티아제 A, 카르복시펩티다아제 α변이주와 중복 변이주에 관한 것으로, 상기 제조한 균주들은 외래단백질 발현시 숙주세포로 사용하여 카르복시말단 분해가 감소된 외래 단백질을 제조하는 효과가 있고 또한 한세눌라 폴리모르파 유래의 분비 시그널 펩티드로서 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

한세눌라 폴리모르파 유전자 및 이들 유전자가 결핍된 균주 {Hansenula polymorpha gene and strain lacking of the same}

본 발명은 한세눌라 폴리모르파 유전자 및 이들 유전자가 결핍된 균주에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)DL1 유래의 카르복시펩티다아제 Y를 코딩하는 유전자PRC1, 프로티아제 A를 코딩하는PEP4유전자, 카르복시펩티다아제 α를 코딩하는KEX1유전자 및 이 유전자를 디스럽션(disruption)하여 제조한 카르복시 펩티다아제 Y, 프로티아제 A, 카르복시펩티다아제 α 결핍 균주에 관한 것이다.

재조합 단백질 생산 기술은 비교적 최근에 발달한 유전자 재조합 기술을 통하여 고등생물 유래의 유전자를 다양한 미생물로부터 대량 발현 생산하여 자연적으로 생산량이 한정된 고부가가치 의료용 단백질을 비교적 저렴한 비용으로 생산하는 기술로서 앞으로 난치성 질환의 증가와 국민 의료 수준의 제고에 따라 고 순도의 단백질성 의약품의 수요가 급증할 것으로 예상된다. 따라서 인체에 무해한 다양한 미생물을 이용하여 신 기능성 재조합 단백질을 비교적 저렴한 비용으로 대량 생산할 수 있는 기술개발 연구가 필요하다.

효모를 숙주세포로 이용한 재조합 단백질생산 연구는 주로 전통효모 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)를 이용하였으나 효율적인 외래단백질 발현을 위한 강력한 프로모터의 부재나 장시간 발효시에 야기되는 플라스미드의 불안정성 등의 이유로 재조합 단백질의 생산효율이 떨어지며 고농도 배양시fed-batch 발효(fermentation)가 필요하며 발현된 이종 단백질들이 하이퍼글라이코실레이션(hyperglycosylation)이 된다는 점에서 비적절한 숙주로 간주되고 있다(Romanos, et al., Yeast, 8, 423, 1992). 이와 같은 단점을 보완하는 외래단백질 발현 시스템이 메탄올 자화 효모인 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 개발되었으며(Sudbery et al., Yeast, 10, 1707, 1994 ; Cregg et al., Bio/Technol. 5, 479, 1987) 최근에는 또다른 메탄올 자화 효모인 한세눌라 폴리모르파를 이용한 이종 단백질 발현 시스템의 개발 연구가 활발히 진행되고 있다(Gellissen et al., Bio/Technol. 9, 291, 1991; Janowicz et al., Yeast 7, 431, 1991). 새로운 대체숙주효모 중의 하나인 메탄올 자화 효모 한세눌라 폴리모르파는 값싼 원료물질인 메탄올을 탄소원으로 이용하여 비교적 쉽게 고농도 배양이 가능하며 메탄올 대사에 관련된 몇 가지 유전자 유래의 강력한 프로모터가 존재하고 또한 외래 유전자를 숙주세포의 염색체 DNA에 다중도입(multicopy integration)할 수 있어 고농도 배양동안에도 안정하게 유지되는 장점이 있다.

효모를 이용하여 재조합 단백질을 생산할 때 생산성의 증가를 위해서는 효율적인 발현 및 분비 시스템의 사용은 필수적이지만 생산 분비된 외래단백질을 단백질 분해효소 등으로부터의 분해를 방지하는 것도 매우 중요하다. 재조합 효모를 발효조에서 장시간 배양할 때 숙주세포로부터 자연적으로 분비되거나 또는 세포내에 존재하는 단백질 분해효소가 세포의 라이시스(lysis)를 통해서 배지로 나와 생산된 재조합 단백질을 분해함으로써 전체적인 재조합 단백질의 생산성을 저하하는 문제가 있다. 재조합 단백질 생산 한세눌라 폴리모르파 세포 배양액에 분비된 재조합단백질을 HPLC, MS 등을 통해 분석한 결과 상당부분의 재조합 단백질 카르복시 말단 분해산물이 나타났고 이는 숙주세포의 카르복시펩티다아제에 의해 재조합 단백질 카르복시말단의 아미노산이 1-2개 제거된 산물임이 관찰되었다.

사카로마이세스 세레비지아에의 액포(vacuole)는 고등세포의 리소좀(lysosome)에 해당하는 기관으로서 여러 가지 단백질 분해효소를 함유하고 있으며 영양분 고갈시 단백질분해 시스템을 담당하고 있다. 특히 카로복시펩티다아제 Y는 다양한 기질의 단백질을 분해할 수 있는 능력으로 인하여 카르복시말단 아미노산 분석에 이용되고 있으며 단백질의 분류나 위치를 연구하는 모델 단백질로서 많은 연구가 진행되어 있다(Rothman et al., Cell, 47, 1041, 1986 ; Johnson et al., Cell, 48, 875, 1987 ; Valls et al., J. Cell. Biol., 111, 361, 1992). 또한 외래 단백질의 과량 발현시 발생하는 카르복시말단의 분해는 카로복시펩티다아제 Y에 기인하는 것으로 알려져 있다. 카르복시펩티다아제 Y 유전자는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 등에서 클로닝되어 공지되어 있다(Valls et al., Cell, 48, 887, 1987; Mukhtar et al., Gene, 121, 173, 1992; Ohi et al., Yeast, 12, 31, 1996; Tabuchi et al., J. Bacteriol., 179, 4179, 1997). 또 사카로마이세스 세레비지아에 프로티아제 A는 카로복시펩티다아제 Y와 함께 액포에 존재하는 단백질 분해효소이다. 프로티아제 A는 액포에 존재하는 프로티아제 B, 카로복시펩티다아제 Y, 아미노펩티다아제 Y 같은 단백질 분해효소 뿐만 아니라RNase, 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 산 트레할라아제(acid trehalase)와 같은 액포 가수분해제(vacuolar hydrolase)의 단백질 가수분해 프로세싱(proteolytic processing)에 관여한다(H.B. Van Den Hazel et al.,Yeast.,12, 1, 1996). 특히PEP4유전자가 디스럽션 된 균주에서는 카르복시펩티다아제 Y의 활성도가 현저하게 감소하기 때문에 한세눌라 폴리모르파PEP4유전자를 클로닝하여 디스럽션 하면 카로복시펩티다아제 Y를 포함한 여러 분해효소의 활성을 저하시킬 수 있다.PEP4유전자는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)등에서 클로닝되어 공지되어있다(Ammerer et al., Mol. Cell. Biol., 6, 2490, 1986; Woolford et al, Mol. Cell. Biol., 6, 25,1986; Lott et al., Nucleic Acids Res., 17, 1779, 1989; Bowman et al., Genbank accession No U36471).

효모의KEX1유전자는 K1, K2 killer toxin 과 α-factor(mating pheromone) 전구체의 프로세싱(processing)에 관여하는 카르복시펩티다아제α를 코딩하는 것으로 알려져 있다(Alexandra et al., Cell, 50. 573, 1987). 카르복시펩티다아제α는 아르기닌(Arginine), 리신(Lysine)과 같은 염기성 아미노산으로 구성된 단백질의 카르복시말단을 특이적으로 분해하는 것으로 알려져 있으나 트롬빈 억제제인 히루딘(hirudin)을 사카로마이세스 세레비지아에에서 발현하였을 경우 카르복시말단이 염기성 아미노산인 경우뿐 아니라 티로신(Tyrosine), 류신(Leucine), 글루타민(Glutamine)과 같은 비염기성 아미노산으로 구성된 경우에도 카르복시펩티다아제α에 의하여 카르복시말단이 분해되는 것이 밝혀졌다(Hinnen et al., GeneExpression in recombinant microorganism, 155-164, 1994). 따라서 한세눌라 폴리모르파에서도 사카로마이세스 세레비지아에의 경우와 동일한 기능을 수행 할 것으로 사료되어 한세눌라 폴리모르파 카르복시펩티다아제 α 유전자를 클로닝하여 카르복시펩티다아제 α 결핍 균주를 제조하고자 하였다.KEX1유전자는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)등에서 클로닝되어 공지되어있다(Bjourson et al., Cell, 50, 573, 1987., Boehm et al., Genbank accession No: AF095574., Lyne et al, Genbank accession No: AL023554., Tanguy-Rougeau et al., FEBS Lett, 234, 464, 1988)

인체 표피 성장인자(human epidermal growth factor ; hEGF)는 53개의 아미노산으로 구성된 6 kDa의 단일 펩티드로 구성된 단백질로 표피 성장의 촉진 이외에 DNA와 단백질의 합성, 칼슘 전달에 의한 이온 수송, 위산 분비의 억제 등의 역할을 한다. 이러한 작용상의 특성에 의해 현재 창상이나 화상 치료, 각막 표층의 상처의 치료, 각막 이식 수술 후의 치료, 그리고 위궤양의 치료용으로 개발되고 있다. 따라서 이러한 약리학적 중요성과 동물 세포에서 극소량만이 추출되는데 착안하여 메탄올 자화 효모인 한세눌라 폴리모르파에서 대량으로 발현하여 분비시킨 후 카르복시 말단의 분해여부를 확인하였다. 종래에는 한세눌라 폴리모르파에서 인체 표피 성장인자(hEGF)를 효과적으로 발현시키기 위하여, 먼저 hEGF 유전자를 포함하는 플라스미드 pUREGF를 제조하였다. pUREGF는 사카로마이세스 세레비지아에URA3유전자를 표지유전자로 사용하고 한세눌라 폴리모르파의 자기 복제 서열인 HARS36을 포함하고 있으며 메탄올 산화 효소(methanol oxidase)의 프로모터와 사카로마이세스 세레비지아에의 교배 인자 α 유래의 분비 신호인 프리프로 리더(pre-pro leader sequence), hEGF의 구조 유전자 및 메탄올 산화 효소의 터미네이터(terminator)가 순서대로 연결되어있는 플라스미드이다. pUREGF는 선택 표지유전자로 사카로마이세스 세레비지아에URA3유전자를 사용하기 때문에 hEGF 유전자의 다중도입을 유도할 수 있으며 메탄올 배지에서 가장 강력하게 유도되는 메탄올 산화 효소(methanol oxidase)의 프로모터를 사용하여 hEGF의 발현을 강력하게 유도할 수 있다. 또한 사카로마이세스 세레비지아에의 교배 인자 α 유래의 프리프로 리더뒤에 hEGF 유전자를 연결하여 발현된 hEGF 단백질을 세포 밖으로 분비시키는 특징이 있다. 한세눌라 폴리모르파 UR2 균주는 한세눌라 폴리모르파 DL1(leu,ura)균주를 플라스미드 pUREGF로 형질전환하여 hEGF 고 생산성 균주로 선별된 균주이다(대한민국 특허출원 제 97-54925호) .

본 발명자들은 재조합 단백질 생산 한세눌라 폴리모르파에서 완전한 형태의 단백질을 생성하기 위해서 단백질 분해효소 결핍 변이균주를 개발하고자 하였다. 세포내에서 외래단백질의 카르복시 말단의 분해는 주로 카르복시펩티다아제 Y 및 카르복시펩티다아제 α에 의해서 행해지며 또한 카르복시펩티다아제 Y는 프로티아제 A에 의해서 진행(processing)되는 것으로 알려져 있으므로(Van Den Hazel et al., Yeast, 12, 1, 1996) 카르복시펩티다아제 Y, 카르복시펩티다아제 α와 프로티아제 A를 코딩하는 유전자인PRC1, KEX1과PEP4유전자를 각각 클로닝하였으며 클로닝된 이들 유전자를 이용하여 카르복시펩티다아제 Y, 카르복시펩티다아제 α, 프로티아제 A 결핍 변이주와 중복 변이주를 각각 제조하였다. 이들 변이주에서 외래단백질인 인체 표피 성장인자(Human epidermal growth factor : hEGF)를 발현하였을 때 카르복시말단이 분해된 단백질이 감소함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 한세눌라 폴리모르파 유래의 카르복시펩티다아제 Y, 카르복시펩티다아제 α 및 프로티아제 A를 코딩하는 유전자 염기서열을 동정하여 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 외래단백질 생산 한세눌라 폴리모르파 균주의 카르복시펩티다아제 Y를 코딩하는 유전자PRC1,카르복시펩티다아제 α를 코딩하는 유전자KEX1및 프로티아제 A를 코딩하는PEP4유전자가 각각 디스럽션된 벡터에 의해 형질전환된 카르복시펩티다아제 Y 변이주, 카르복시펩티다아제 α 변이주 및 프로티아제 A 변이주와 함께 이들 단백질분해효소가 중복하여 디스럽션된 균주를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 단백질분해효소 변이주를 숙주세포로 이용하여 카르복시 말단의 분해가 거의 발생하지 않은 외래 단백질 생산방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 사카로마이세스 세레비지아에 카르복시펩티다아제 Y 유전자(PRC1)를 PCR을 이용하여 클로닝하고 이를 프로브로 이용하여 한세눌라 폴리모르파 DL-1의 염색체를 제한효소처리하여 서던블럿을 반복수행하므로써 한세눌라폴리모르파PRC1유전자의 염기서열을 결정한 후 같은 방법으로 한세눌라 폴리모르파의 DL-1의 한세눌라 폴리모르파 DL-1의 프로티아제 A를 코딩하는 유전자(PEP4) 염기서열을 결정하고 한세눌라 폴리모르파KEX1유전자를 클로닝하기 위하여 균주간에 유사성이 높은 부위를 바탕으로 프라이머를 합성한 후 한세눌라 폴리모르파 염색체를 주형으로 PCR을 수행하여 한세눌라 폴리모르파KEX1유전자 단편을 클로닝 한 후 이를 프로브로 사용하여PRC1과 동일한 방법으로 한세눌라 폴리모르파KEX1전체 유전자를 클로닝한 다음 한세눌라 폴리모르파 UR2 균주의PRC1과PEP4의 유전자를 각각 디스럽션하기 위해 한세눌라 폴리모르파LEU2 유전자를 플라스미드 pHDY2, pHDP4에 각각 삽입하여 플라스미드 pHYL과 pHPL를 제조하고 이 플라스미드 pHYL과 pHPL로 한세눌라 폴리모르파 UR2 균주를 형질전환하여 카르복시펩티다아제 Y 변이주와 프로티아제 A 변이주를 얻고 이 변이주들의 카르복시펩티다아제의 활성을 측정한 후 서던블럿 분석으로 한세눌라 폴리모르파PRC1과PEP4유전자의 디스럽션을 확인하고 또 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주의KEX1유전자를 디스럽션하여 하기 위해 한세눌라 폴리모르파URA3유전자 팝아웃 카세트을 플라스미드 pKH3.9에 삽입하여 플라스미드 pKUZ를 제조한 다음 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주를 형질전환하여 카르복시펩티다아제 α 변이주를 얻고 한세눌라 폴리모르파 URA3 유전자가 팝아웃된 균주를 선별한 다음 야생타입 균주와 상기 선별한 변이균주의 염색체를 게놈서던 블럿하여KEX1유전자의 디스럽션을 확인하므로써 달성하였다. 또한 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주의PRC1, PEP4유전자를 중복하여 디스럽션하기 위하여URA3유전자 팝아웃 카세트을 플라스미드 pHDY2와 pHDP4에 각각 삽입하여 플라스미드 pHTUZ와 pHPUZ를 각각 제조하고KEX1유전자 디스럽션과 같은 방법으로 형질전환과 팝아웃을 반복하여 프로티아제 A·카르복시펩티다아제 α변이주, 프로티아제 A·카르복시펩티다아제 Y 변이주, 카르복시펩티다아제 α·카르복시펩티다아제 Y 변이주, 프로티아제 A·카르복시펩티다아제 α·카르복시펩티다아제 Y 변이주를 각각 제조하였다.

이하 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

도 1은 한세눌라 폴리모르파PRC1유전자의 제한효소지도이다.

도 2는 한세눌라 폴리모르파PEP4유전자의 제한효소지도이다.

도 3은 한세눌라 폴리모르파KEX1유전자의 제한효소지도이다.

도 4는 한세눌라 폴리모르파PRC1유전자를LEU2유전자를 이용하여 디스럽션하기 위하여 제작한 플라스미드의 제한효소 지도와 제작과정이다.

도 5는 한세눌라 폴리모르파PRC1유전자를URA3유전자를 이용하여 디스럽션하기 위하여 제작한 플라스미드의 제한효소 지도와 제작과정이다.

도 6은 한세눌라 폴리모르파PEP4유전자를LEU2유전자를 이용하여 디스럽션하기 위하여 제작한 플라스미드의 제한효소 지도와 제작과정이다.

도 7은 한세눌라 폴리모르파PEP4유전자를URA3유전자를 이용하여 디스럽션하기 위하여 제작한 플라스미드의 제한효소 지도와 제작과정이다.

도 8은 한세눌라 폴리모르파KEX1유전자를 디스럽션하기 위하여 제작한 플라스미드의 제한효소 지도와 제작과정이다.

도 9는 디스럽션된 유전자을 확인하기 위한 서던블럿 결과를 나타낸 사진도이다.

본 발명은 공지의 사카로마이세스 세레비지아의 카로복시펩티다아제 Y를 코딩하는 유전자(PRC1)를 PCR을 이용하여 클로닝하고 이를 프로브로 이용하여 한세눌라 폴리모르파 DL-1의 염색체를 몇 가지 제한효소로 처리한 후 게놈 서던 하이브리디제이션(genomic Southern hybridization)함으로써 제한효소PstI으로 절단된 염색체의 3kb 위치에서PRC1유전자를 함유하는 DNA 밴드를 확인하였으며, 플라스미드에 삽입하여 라이브러리를 제조하고 서던블럿을 반복수행하여 한세눌라 폴리모르파PRC1유전자를 포함하는 플라스미드를 선별한 후 2.2kb의XhoI/PstI 단편으로 좁힌 플라스미드 pHDY2를 다시 선별한 다음PRC1유전자의 염기서열을 결정하는 단계; 공지의 사카로마이세스 세레비지아에PEP4유전자를 바탕으로 프라이머를 합성하고 PCR을 수행하여 사카로마이세스 세레비지아에PEP4유전자를 클로닝한 후 이를 프로브로 이용하여 한세눌라 폴리모르파 DL-1의 염색체를 몇 가지 제한효소로 처리한 다음 상기PRC1클로닝 방법과 동일한 방법으로 게놈 서던 하이브리디제이션(genomic Southern hybridization)을 실시하여 제한효소BamHI으로 절단된 염색체의 8kb 위치에서PEP4유전자를 함유하는 DNA 밴드를 확인하고 플라스미드에 삽입하여 라이브러리를 제조한 후 서던블럿을 반복 수행하여 한세눌라 폴리모르파PEP4유전자를 클로닝하는 단계; 여러 균주에서 밝혀진 카르복시펩티다아제 α의 아미노산 서열을 분석하여 균주간에 유사성이 높은 부위를 선별하고 그 부위를 바탕으로 프라이머를 합성한 후 한세눌라 폴리모르파 DL-1의 염색체를 주형으로 PCR을 수행하여 306bp 크기의 한세눌라 폴리모르파KEX1유전자 단편을 클로닝한 후 이를 프로브로 이용하여 한세눌라 폴리모르파 DL-1의 염색체를 몇 가지 제한효소로 처리한 다음 게놈 서던 하이브리디제이션(genomic Southern hybridization)하고 제한효소HindIII으로 절단된 염색체의 4.5kb 위치에서KEX1유전자를 함유하는 DNA 밴드를 확인하였으며, 플라스미드에 삽입하여 라이브러리를 제조하고 서던블럿을 반복수행하여 한세눌라 폴리모르파KEX1유전자를 포함하는 플라스미드를 선별한 후 3.9kb의EcoRI/HindIII 단편으로 좁힌 플라스미드 pKH3.9를 다시 선별한 다음KEX1유전자의 염기서열을 결정하는 단계; 상기 클로닝된 한세눌라 폴리모르파 DL-1의 카로복시펩티다아제 Y(PRC1) 및 프로티아제 A(PEP4) 유전자를 이용하여 염색체상의 이들 유전자들을 디스럽션(disruption)하기 위해 한세눌라 폴리모르파LEU2 유전자를 플라스미드 pHDY2 및 pHDP4에 각각 삽입하여 pHYL 및 pHPL을 제조한 후 플라스미드 pHYL과 pHPL을 한세눌라 폴리모르파 UR2 균주(leu2, hEGF,PRC1, PEP4,KEX1)에 형질전환하여 카르복시펩티다아제 Y 변이주(hEGF,prc1::LEU2,PEP4, KEX1)와 프로티아제 A 변이주(hEGF,pep4::LEU2,PRC1, KEX1)를 각각 제조하고 상기 제조한 카르복시펩티다아제 Y 변이주와 프로티아제 A 변이주 각각에 대해서 카르복시펩티다아제 Y 활성을 조사하고 야생 타입 균주와 상기 변이균주의 염색체를 게놈 서던 블럿하여 각각의 유전자가LEU2 유전자에 의해 디스럽션되었음을 확인하는 단계:KEX1, PEP4및PRC1유전자를 중복 디스럽션하기 위하여 한세눌라 폴리모르파URA3유전자 팝아웃 카세트을 플라스미드 pKH3.9, pHDY2, pHDP4에 각각 삽입하여 플라스미드pKUZ, pHYUZ, pHPUZ를 각각 제조하고 플라스미드 pKUZ을 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주(leu2, ura3, KEX1, PEP4, PRC1)에 형질전환하여 카로복시펩티다아제α 변이주(leu2, kex1::URA3, PEP4, PRC1)를 제조한 후URA3유전자를 팝아웃하여 제거하고 순차적으로 pHYUZ와 pHPUZ를 형질전환하여 카르복시펩티다아제Y, 프로티아제A 변이 균주를 제조한 후 야생균주와 변이균주의 염색체를 이용하여 게놈 서던 블럿팅하여KEX1, PEP4, PRC1유전자가URA3유전자에 의해 디스럽션되었음을 확인하는 단계 및; 카르복시펩티다아제 Y 와 프로티아제 A 변이주에서 hEGF를 발현시킨 후 배양액을 원심 분리하고 HPLC 분석하여 상기 변이주의 세포밖으로 분비된 hEGF의 카르복시말단의 분해여부를 확인하는 단계로 구성된다.

본 발명에서 형질전환된 카르복시펩티다아제 Y, 프로티아제 A 변이주 및 카르복시펩티다아제 α 변이주는 생명공학연구소내 유전자은행에 기탁하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 카르복시펩티다아제 Y를 코딩하는 유전자 PRC1 , 프로티아제 A를 코딩하는 PEP4 유전자 및 카르복시펩티다아제 α를 코딩하는 유전자 KEX1 의 분리

제 1단계: 한세눌라 폴리모르파 PRC1 , PEP4, KEX1 유전자 클로닝을 위한 프로브 제작

본 단계에서는 하기 프라이머를 사용하여 사카로마이세스 세레비지아PRC1유전자를 클로닝하였다.

프라이머 C1 ; 5'-ATG AAA GCA TTC ACC AG-3'

프라이머 C2 ; 5'-TTA TAA GGA GAA ACC AC-3'

즉, 상기 합성한 프라이머와 사카로마이세스 세레비지아의 염색체를 주형으로 94℃ 30초, 72℃ 2분 조건으로 25사이클의 PCR을 수행하여 1.6kb의 사카로마이세스 세레비지아PRC1유전자를 분리하였다. DIG-라벨링 검출 킷트(labeling and detection kit, Boehringer Mannheim사 제품)를 사용하여 제품 매뉴얼에 따라 라벨링하여 프로브를 제작하였다. 또 하기 프라이머를 사용하여 사카로마이세스 세레비지아PEP4유전자를 클로닝하였다.

프라이머 P1 ; 5'-ATG TTC AGC TTG AAA GC-3'

프라이머 P2 ; 5'-TCA AAT TGC TTT GGC C-3'

즉, 상기 합성한 프라이머와 사카로마이세스 세레비지아의 염색체를 주형으로 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 2분 조건으로 25사이클의 PCR을 수행하여 1.22kb의 사카로마이세스 세레비지아에PEP4유전자를 분리하였다. 상기 한세눌라 폴리모르파PRC1유전자 클로닝과 동일한 방법으로 라벨링하여 프로브를 제작하였다. 또 하기 프라이머를 사용하여 한세눌라 폴리모르파KEX1유전자를 클로닝하였다.

프라이머 K1 ;5'-TGG YTS AAC GGH CCW GGH TGY TCB TCB-3'

프라이머 K2 ;5'-WGG RAT GTA YTG WCC RGC GTA VGA CTC DCC-3'

즉, 상기 합성한 프라이머와 한세눌라 폴리모르파 염색체를 주형으로로 94℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 30초 조건으로 5 사이클, 94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초 조건으로 20 사이클의 PCR을 수행하여 306bP의 한세눌라 폴리모르파KEX1유전자단편을 분리하였다. 상기 한세눌라 폴리모르파PRC1유전자 클로닝과 동일한 방법으로 라벨링하여 프로브를 제작하였다.

제 2단계: 한세눌라 폴리모르파 DL1의 게놈 DNA 추출

존스톤의 방법 (Yeast Genetics, molecular aspects, pp.107-123, IRL Press, 1988)으로 YEPD 배지 (펩톤 2%, 효모추출물 1%, 포도당 2%)에서 배양한 한세눌라 폴리모르파 DL1 으로부터 게놈 DNA를 추출하였다.

제 3단계: 플라스미드 pHDY2의 제작

상기 2단계에서 얻은 게놈 DNA를 제한효소BamHI,EcoRI,EcoRV,HindIII,PstI,SalI으로 각각 처리하고, 0.9% 아가로스 겔에서 전기영동한 다음 Nytran membrane(Schleicher Schuell사 제품)으로 옮겨, 제 1단계에서 제조한 사카로마이세스 세레비지아PRC1유전자를 이용하여 제조한 프로브와 서던블럿하였다. 서던블럿 조건은 하이브리드액 (5X SSC, 0.1% N-lauryl sarcosine, 0.02% SDS, 2% blocking agent, 30% formamide)을 사용하여 42℃에서 6시간 반응시키는 것으로, Boehringer Mannheim사의 제품 매뉴얼에 따라 처리하였다. 알칼라인 포스파타제가결합된 항체를 투여한 다음, BCIP와 X-phosphate를 첨가하여 보라색으로 염색된 밴드를 관찰하였다.PstI로 처리한 3kb 크기의 DNA에서 양성반응을 나타냈다. 밴드가 나타난 위치의 DNA를 추출하여 플라스미드 pBluescriptKSII+에 연결시킨 후 대장균 DH5α에 형질전환하여 라이브러리를 제조한 후 이 라이브러리를 대상으로 서던블럿을 반복하여PRC1유전자를 포함하는 플라스미드를 선별하였고 2.2 kb크기의XhoI/PstI 단편으로 축소하여 플라스미드 pHDY2을 제조하였다.PRC1유전자의 제한효소 지도와 염기서열 결정방법은 도 1에 나타내었고PRC1유전자의 염기서열을 결정한 결과는 서열 1에 나타내었다. DNA 서열은 GenBank에 U67174(96. 8. 17)로 등록하였다. 염기서열을 분석한 결과 한세눌라 폴리모르파 DL1PRC1유전자는 1,626 bp 크기로 인트론은 없으며 사카로마이세스 세레비지아에PRC1유전자와 54%의 유사성이 있으며, 염기서열을 바탕으로 유추한 아미노산 서열은 사카로마이세스 세레비지아에 카로복시펩티다아제 Y와 50%의 유사성을 나타내었다. 또한 세린 프로테아제(serine protease)의 활성 부위(active site)인 263번째 세린(serine) 잔기 부위에서도 높은 유사성을 나타내었다.

제 4단계: 플라스미드 pHDP4의 제작

상기 2단계의 DNA를 제한효소BamHI,EcoRI,EcoRV,HindIII,PstI,SalI으로 각각 처리하고, 0.9% 아가로스 겔에서 전기영동한 다음 Nytran membrane(Schleicher Schuell사 제품)으로 옮겨, 제 1 단계에서 제조한 사카로마이세스 세레비지아PEP4유전자를 이용하여 제조한 프로브를 사용하여 제 3단계와동일한 방법으로 서던블럿 하였다.BamHI로 처리한 8kb 크기의 DNA에서 양성반응을 나타냈다. 밴드가 나타난 위치의 DNA를 추출하여 제 3단계와 동일한 방법으로 라이브러리를 제조한 후 이 라이브러리를 대상으로 서던블럿을 반복하여PEP4유전자를 포함하는 플라스미드 pHDP3를 선별하였고 2.0kb크기의SacI/HindIII 단편으로 축소하여 플라스미드 pHDP4를 제조하였다.PEP4유전자의 제한효소 지도와 염기서열 결정방법은 도 2에 나타내었고PEP4유전자의 염기서열을 결정한 결과는 서열 2에 나타내었다. DNA 서열은 GenBank에 U67173(96. 8. 17)으로 등록하였다. 염기서열을 분석한 결과 한세눌라 폴리모르파 DL1PEP4유전자는 1,242 bp크기로 인트론은 없으며 사카로마이세스 세레비지아에PEP1유전자와 52.4 %의 유사성이 있으며, 염기서열을 바탕으로 유추한 아미노산 서열은 사카로마이세스 세레비지아에 프로티아제 A와 59%의 유사성을 나타내었다. 또한 아스파틸 프로테아제(aspartyl protease)의 활성 부위(active site)로 추정되는 117번째 아스파르트산(aspartic acid) 잔기 부위에서도 높은 유사성을 나타내었다.

제 5단계: 플라스미드 pKH3.9의 제작

상기 2단계의 DNA를 제한효소BamHI,EcoRI,EcoRV,HindIII,PstI,SalI으로 각각 처리하고, 0.9% 아가로스 겔에서 전기영동한 다음 Nytran membrane(Schleicher Schuell사 제품)으로 옮겨, 제 1 단계에서 한세눌라 폴리모르파KEX1유전자를 이용하여 제조한 프로브를 사용하여 하이브리드액 조성을 (5X SSC, 0.1% N-lauryl sarcosine, 0.02% SDS, 2% blocking agent, 50% formamide)로변경한 후 제 3단계와 동일한 방법으로 서던블럿하였다.HindⅢ로 처리한 4.5kb 크기의 DNA에서 양성반응을 나타냈다. 밴드가 나타난 위치의 DNA를 추출하여 제 3단계와 동일한 방법으로 라이브러리를 제조한 후 이 라이브러리를 대상으로 서던블럿을 반복하여KEX1유전자를 포함하는 플라스미드 pKH4.5를 선별하였고 3.9 kb크기의EcoRI/HindIII 단편으로 축소하여 플라스미드 pKH3.9를 제조하였다.KEX1유전자의 제한효소 지도와 염기서열 결정방법은 도 3에 나타내었고KEX1 유전자의 염기서열을 결정한 결과는 서열 3에 나타내었다. DNA 서열은 GenBank에 AF090325(98. 9. 4)으로 등록하였다. 염기서열을 분석한 결과 한세눌라 폴리모르파 DL1KEX1유전자는 인트론이 없는 1,833 bp 크기로 구성되어 있으며, 염기서열을 바탕으로 유추한 아미노산 서열은 사카로마이세스 세레비지아에 카르복시펩티다아제 α와 20%의 낮은 유사성을 나타내었다. 그러나 세린 프로테아제(serine protease)의 활성부위(active site)인 176번째 세린(serine) 잔기 부위에서는 카르복시펩티다아제 α 뿐만 아니라 카르복시펩티다아제 Y와도 높은 유사성을 나타내었으며 Von Heijne방법(Von Heijne, J. Mol. Biol., 173, 243, 1984)에 따라 아미노산 서열을 분석한 결과 18개의 시그널펩티드(signal-peptide)를 포함하고 있었다.

실시예 2: 디스럽션된 플라스미드로 변이주 제조

제 1단계: 디스럽션된 플라스미드 pHYL의 제작

클로닝된 한세눌라 폴리모르파 DL-1의 카르복시펩티다아제 Y의 유전자인PRC1을 이용하여 염색체상의PRC1유전자를 디스럽션하기 위하여 도 4 에서 보는바와 같이 한세눌라 폴리모르파LEU2유전자가PRC1유전자에 삽입된 플라스미드 pHYL을 제조하였다. 먼저 제한효소EcoRI과BamHI으로 절단하여 추출한 1.2kb크기의 한세눌라 폴리모르파LEU2유전자를 Klenow 효소로 처리하여 평활 말단이 되도록 한 후PRC1유전자의 제한효소SmaI위치에 삽입하여 플라스미드 pHYL을 제작하였다.

제 2단계: 디스럽션된 플라스미드 pHPL의 제작

한세눌라 폴리모르파 DL-1의 프로티아제 A의 유전자인PEP4를 디스럽션 하기 위하여 도 6에 나타낸 바와같이 한세눌라 폴리모르파LEU2유전자로PEP4유전자의 일부분을 치환한 플라스미드 pHPL을 제조하였다. 먼저PEP4유전자를 제한효소EcoRV로 처리하여 1.05kb의PEP4유전자 단편을 제거한 후 제한효소EcoRI과BamHI으로 절단하여 추출한 1.2kb크기의 한세눌라 폴리모르파LEU2유전자를 Klenow 효소로 처리하여 평활 말단이 되도록 한 후 교체하여 플라스미드 pHPL을 제작하였다.

제 3단계: 디스럽션된 플라스미드 pKUZ, pHYUZ, pHPUZ의 제작

클로닝된 한세눌라 폴리모르파 DL-1의KEX1유전자를 디스럽션하기 위하여 도 5에 나타낸 바와 같이 한세눌라 폴리모르파URA3유전자를 선택유전자로 반복 사용하기 위한 팝아웃 카세트(pop-out cassette)를 제조하였다. 먼저 플라스미드 pUC19로부터 회수한 211bp의BamHI/PvuIILacZ유전자 단편을 1,323bp 크기의 한세눌라 폴리모르파URA3유전자 양 끝에 같은 방향이 되도록 연결하여 팝아웃 플라스미드 pLacUR3를 제조하였다. 플라스미드 pKH3.9를SmaI과EcoRI으로 처리하여 프로모터와 코딩부위를 일부 포함하는 1,184bp 단편을 제거하고 플라스미드 pLacUR3를PvuII와EcoRI으로 처리하여 얻은 211bp크기의 LacZ 유전자 다이렉트 리피트(direct repeats)를 포함하는 1,735bp 크기의 한세눌라 폴리모르파URA3유전자로 교체하여 플라스미드 pKUZ을 제조하였고, 플라스미드 pHDY2를SmaI과EcoRI으로 처리하여 코딩부위를 포함하는 1,055bp 단편을 제거하고 플라스미드 pLacUR3를PvuII와EcoRI으로 처리하여 얻은 1,735bp 크기의 한세눌라 폴리모르파URA3유전자로 교체하여 플라스미드 pHYUZ을 제조하였고, 플라스미드 pHDP4를XhoI과EcoRV으로 처리하여 코딩부위를 포함하는 303bp 단편을 제거하고 플라스미드 pLacUR3를PvuII와SalI으로 처리하여 얻은 1,800bp 크기의 한세눌라 폴리모르파URA3유전자로 교체하여 플라스미드 pHPUZ을 제조하였다. 먼저 플라스미드, pKUZ을 한세눌라 폴리모르파 DL1 균주(leu2, ura3, KEX1, PEP4, PRC1)에 형질전환하여 카르복시펩티다아제α 변이주(leu2, kex1::URA3, PEP4, PRC1)를 제조한 후 5-플루오로오로트산(5-Fluoroorotic acid)이 0.1 % 포함된 최소 고체배지(0.7% 아미노산이 결핍된 효모 기질(YNB), 2% 포도당, 0.1 % 5-플루오로오로트산(5-Fluoroorotic acid), 우라실(Uracil) 50㎍/mL, 로이신(Leucine) 50㎍/mL, 2% 아가)에서 72시간 이상 배양하여 한세눌라 폴리모르파URA3유전자가 팝아웃된 균주(leu2, ura3, kex1::LacZ, PEP4, PRC1)를 선별하였고 이 균주를 플라스미드 pHYUZ로 형질전환하여 카르복시펩티다아제α·카르복시펩티다아제Y 변이주(leu2,kex1:: LacZ, prc1::URA3, PEP4)를 제조하였다 이균주를 다시 5-플루오로오로트산이 0.1 % 포함된 최소 고체배지에서URA3유전자가 팝아웃된 균주(leu2, ura3, kex1:: LacZ, prc1::LacZ, PEP4)를 선별하였고 플라스미드 pHPUZ를 사용하여 위와 같은 방법으로 카르복시펩티다아제α·카르복시펩티다아제Y·프로티아제 A 변이주(leu2, ura3, kex1::LacZ, prc1::LacZ, pep4::lacZ)를 제조하였다. 또한 플라스미드 pHYUZ와 pHPUZ를 사용하여 카르복시펩티다아제Y·프로티아제 A 변이주(leu2, ura3, prc1::LacZ, pep4::lacZ, KEX1)를, 플라스미드 pKUZ와 pHPUZ를 사용하여 카르복시펩티다아제α·프로티아제 A 변이주(leu2, ura3, kex1:: LacZ, pep4::lacZ, PRC1)를 각각 제조하였다.

제 4단계: 형질전환

한세눌라 폴리모르파의 형질전환은 리튬 초산법에 따라 수행하였다. 즉, 한세눌라 폴리모르파 hEGF 고생산 균주인 UR2(leu2) 균주를 YEPD 액체배지(펩톤 2%, 효모 추출물 1%, 포도당 2%)에서 OD600=0.5까지 배양하고 세포를 회수하여 LiTE 용액(0.1 M Tris-Cl, pH8.0, 10mM EDTA, 10mM LiAc, pH7.5)으로 세척하였다. 다시 1/100부피의 LiTE 용액에 현탁하여 컴페턴트 세포(competent cell)를 제조하였다. 100μL의 컴페턴트 세포(competent cell)에 0.5μg의 플라스미드, 운반 DNA로 작용하는 10μg의 연어 정자 DNA와 0.6mL의 PEG/LiAc 용액(40 % PEG 4000, 0.1 M Tris-Cl, pH8.0, 10mM EDTA, 10mM LiAc, pH7.5)을 첨가하고 30℃에서 30분간 방치하였다. 70μL의 DMSO 용액을 첨가하고 42℃에서 15분간 반응 후 얼음에서 급속 냉각시키고 세포를 회수하여 최소 고체 배지(0.67% 아미노산이 결핍된 효모 기질, 2% 포도당, 2% 아가)에서 37℃로 72시간 배양하였다. 플라스미드 pHYL은 제한 효소XhoI/PstI으로 처리하여 선형화하고 플라스미드 pHPL은 제한 효소HindⅢ/NcoI으로, pKUZ는XhoI으로, pHYUZ는XhoI/PstI으로 pHPUZ는SpeI/SnaBI으로 선형화하여 형질전환에 사용하였다.

실시예 3: 카르복시펩티다아제 Y 변이주, 프로티아제 A 변이주의 카르복시펩티다아제 Y 활성도 측정 및 이 균주로부터 생성된 hEGF 분석

제 1단계: 카르복시펩티다아제 Y, 프로티아제 A 변이주의 카르복시펩티다아제 Y 활성도 측정

디메틸포름아미드(Dimethylformamide)에 2.5 mg/mL로 녹인 N-벤조일-L-티로신-p-니트로아닐리드(N-benzoyl-L- tyrosine-p-nitroanilide)와 0.1M Tris-HCl (pH 7.5)를 1:4로 섞은 용액을 96웰 마이크로타이터플레이트(96 well microtiterplate)에 0.2 mL씩 분주한 후 각각의 웰에 실시예 2에서 얻은 형질전환체들을 접종하여 37℃에서 16시간동안 방치하였다. 카르복시펩티다아제의 활성이 있는 세포의 용액은 노란색을 띠며 활성이 없는 세포의 용액은 무색에 가까우므로 450nm에서 흡광도를 측정하여PRC1유전자가 효과적으로 디스럽션된 균주를 선별하였다. 또한 프로티아제 A 변이주에서는 카르복시펩티다아제 Y의 프로세싱(processing)이 저해되기 때문에 카르복시펩티다아제의 활성을 측정함으로써PEP4유전자가 디스럽션된 균주를 선별하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이 카르복시펩티다아제 Y 변이주에서 카르복시펩티다아제의 활성은 거의 나타나지 않았고, 프로티아제 A 변이주에서는 카르복시펩티다아제의 활성이 60%이상 감소하였다. 이로써 본 발명자들이 클로닝한PRC1과PEP4유전자가 한세눌라 폴리모르파 카르복시펩티다아제 Y, 프로티아제 A를 코딩하는 유전자임을 확인하였으며PRC1과PEP4유전자가 디스럽션된 균주에서 카르복시펩티다아제의 활성이 현저히 감소함을 확인하였다.

카르복시펩티다아제 Y 변이주에서 카르복시펩티다아제의 활성

균주	Genotype	카르복시펩티다아제 활성도(Abs)
UR2	Ieu2, PEP4, PRC1,hEGF	2.97
PEP4변이주	pep4::LEU2, PRC1,hEGF	1.00
PRC1변이주	prc1::LEU2, PEP4,hEGF	0.10

제 2단계: 서던블럿에 의한 디스럽션 확인

한세눌라 폴리모르파LEU2유전자에 의한 한세눌라 폴리모르파PRC1과PEP4유전자의 디스럽션 및 한세눌라 폴리모르파URA3유전자에 의한 한세눌라 폴리모르파KEX1유전자의 디스럽션을 확인하기 위하여 서던블럿을 수행하였다. 실시예 2의 4단계에서 선발한 형질전환체 각각을 YEPD 배지에 접종하여 37℃에서 18 ~ 20시간 진탕배양한 다음, 원심분리하여 세포를 회수하고, 1.5mL 튜브에 옮겼다. 세포를 STES 용액 (0.5M NaCl, 0.01M EDTA, 1% SDS in 0.2M Tris-Cl, pH 7.6) 30㎕에 현탁하고, 지름 0.4mm의 유리알을 0.8 부피만큼 첨가한 다음, 5분간 교반하고, TE 완충액 (1mM EDTA in 10mM Tris-Cl, pH 8.0) 200μL과 페놀/ 클로로포름/ 이소아밀알콜 (25:24:1) 200μL을 첨가하여 2분간 교반한 다음, 12,000rpm에서 원심분리하였다. 상등액에 2.5배 부피의 에탄올을 첨가하여 게놈 유전자를 침전시키고, 건조하였다. 게놈 유전자 2 ~ 3μg을 증류수 50μL에 녹이고, PRC1디스럽션 균주의 게놈 유전자는 제한효소EcoRI으로 처리하고PEP4디스럽션 균주의 게놈 유전자는 제한효소EcoRV으로 처리하고KEX1디스럽션 균주의 게놈 유전자는XhoI으로 처리한 후 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동 하였다. 도 4, 도 6, 도 8에 표시한PRC1,PEP4, KEX1유전자를 프로브로 사용하여 서던블럿하여 밴드를 도 9에서 확인하였다. 카르복시펩티다아제 Y 변이주의 게놈 DNA를 제한효소EcoRI 으로 처리한 경우 0.65kb 크기의PRC1유전자 단편에LEU2유전자가 삽입되어 1.85kb크기로 증가하였다. 프로티아제 A 변이주의 게놈 DNA를 제한효소EcoRV로 처리한 경우PEP4유전자의 1.1kb의EcoRV 단편을LEU2유전자로 교체하는 과정에서EcoRV 인식부위가 제거되었기 때문에 10kb크기의 위치에서 단일 밴드를 확인할 수 있었다. 카르복시펩티다아제 α 변이주의 게놈 DNA를XhoI으로 처리한 경우 3.5kb 크기의KEX1유전자 단편에URA3유전자가 삽입되어 4kb크기로 증가하였으며 팝아웃된 균주에서는URA3유전자가 제거됨에 따라 2.5kb로 작아짐을 확인할 수 있었다. 따라서PRC1, PEP4유전자가 한세눌라 폴리모르파LEU2유전자에 의하여 디스럽션되었고KEX1유전자가URA3유전자에 의하여 디스럽션되었음을 확인하였다.

제 3단계: 본 발명 변이균주에서 분비된 hEGF의 분석

YP-메탄올 배지(효모 추출물 1%, 펩톤 2 %, 메탄올 2 %)에서 발현 분비된 hEGF의 분석을 위하여 배양액을 원심 분리하여 상등액을 분리하였다. 분리된 배양상등액은 셉-팩 카트리지(Sep-Pak Cartridge, C18, Waters, Millipore사)에 의한 부분 정제를 거쳐 HPLC로 분석하였다. 셉-팩 부분 정제는 각각 10mL씩의 물, 메탄올, 0.1% 트리플로로아세트산, 20% 아세토니트릴/0.1% 트리플로로아세트산으로 처리하여 활성화된 Sep-Pak 카트리지에 20% 아세토니트릴/0.1% 트리플로로아세트산이 되도록 조정된 배양 상등액을 통과시켜 단백질을 흡착시킨 후, 20% 아세토니트릴, 0.1% 트리플로로아세트산으로 카트리지를 세척하여 불순물을 제거하였다. 흡착된 hEGF는 1mL의 50% 아세토니트릴/0.1% 트리플로로아세트산으로 3회에 거쳐 추출하였다. hEGF를 포함하는 추출액은 동결 건조하여 농축하였다. 부분 정제된 시료는 역상 HPLC(Beckman Model 126 System)를 이용하여 분석하였고, 시료의 분리를 위한 칼럼(column)은 4.6 × 250mm, 5㎛-C4 칼럼(Vydac사)을 사용하였다. 이동상의 유속은 0.8mL/분이었으며, 35분동안 20% 아세토니트릴/0.1% 트리플로로아세트산에서 60% 아세토니트릴/0.1% 트리플로로아세트산으로 농도를 증가 시켜 분리하였다. 이때 시료의 분리도는 215nm에서 흡광도를 측정하였다. HPLC에서 분리된 시료는 hEGF를 포함하고있는 피크(peak)를 확인하기 위하여 각 피크(peak)의 분획을 채취한 후, ELISA를 수행하였다. 채취한 시료를 항원 코팅 완충액(0.1M sodium carbonate buffer pH 9.6)에 적절히 희석하여 희석액 100μL씩을 마이크로타이터 플레이트웰(Nunc-immunomodule)에 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응 시켰다. 웰을 PBST(PBS : phosphate buffered saline + 0.1% 트윈 20)로 씻어낸 후 PBS에 0.05%로 녹인 젤라틴을 웰당 100㎕씩 넣어 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 웰을 PBST로 씻어내고 hEGF의 단일 클론 항체(monoclonal antibody : UBI #05-109)를0.05% 젤라틴이 들어있는 PBS 용액에 1:10,000의 비율로 희석하여 웰당 100μL씩 넣어 37℃에서 2시간동안 반응시킨 후 다시 PBST로 씻어내고 여기에 서양 고추냉이 퍼옥시다제가 결합된 이차 항체(Horse radish peroxidase conjugated goat anti-mouse IgG : Bio-Rad사)를 0.05% 젤라틴이 들어있는 PBS 용액에 1:3,000의 비율로 희석하여 웰당 100μL씩 넣어 37℃에서 1시간동안 반응시킨 후 PBST로 씻어내고 발색시켰다. 발색은 Pierce사의 퍼옥시다제 반응 기질인 TMB 기질 키트(Substrate Kit)를 사용하였는데, 0.04% TMB(3,3',5,5'tetramethyl benzidine)와 시트르산 완충액에 0.02%로 희석한 과산화수소를 1:1로 섞어 웰당 100μL씩 넣은 다음 약 15분 후 2M 황산을 100μL씩 넣어 반응을 정지시켰다. 발색시킨 후의 정량은 96-웰 플레이트 오토리더(96-well plate autoreader : THERMO max, Molecular Devices, USA)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였으며, 정량을 위한 표준 hEGF 시료(recombinant hEGF : UBI #01-107)는 0.25ng/웰에서 5ng/웰까지 각각 희석하여 반응 시켰다. 실험결과, 두 개의 분획이 발현된 hEGF를 포함하고 있었으므로 이들의 정성분석을 위하여 채취한 분획을 동결건조 하였다. 두 가지 형태의 hEGF에 대하여 기초과학 지원 연구소에 N-말단 아미노산 서열 분석과 분자량 분석을 의뢰하였다. 분석 결과 두 개의 피크가 hEGF의 활성이 있는 것으로 나타났고, 두 개의 피크 가운데 비교적 친수성을 나타내는 피크는 MALDI-Mass 분석 결과 분자량이 6,205였으므로 53개의 아미노산으로 이루어진 완전한 hEGF였으며, 보다 더 높은 아세토니트릴 농도에서 용출되는, 완전한 hEGF보다는 소수성을 띠는 피크의 hEGF는 분자량이 6,053으로 측정되어 52개의 아미노산으로 이루어진 것으로 확인되었다. 이 두가지의 hEGF는 N-말단 아미노산 서열 분석 결과 모두 Asn-Ser-Asp-Ser-Glu-로 이루어져 있으므로 시그널 펩티드로부터KEX2에 의해 정확하게 분리되었다. 이로부터 52개의 아미노산으로 이루어진 hEGF는 C-말단의 아미노산 한 개가 유리되어 형성된 것임을 알 수 있었으며, 이는C-말단의 아미노산 서열이 Arg-Leu-Glu-Trp-Trp-이므로 53개 아미노산의 완전한 hEGF에서 아르기닌이 유리되어 52개 아미노산의 hEGF가 되면 더 강한 소수성을 나타냄을 알 수 있었다. 상기 분석에 따라 HPLC 피크에 대한 정보를 확인한 후 한세눌라 폴리모르파 UR2 균주와 단백질 분해효소 결핍균주에서 분비된 hEGF의 조성을 비교하면, 프로티아제 A 변이주에서 발현된 hEGF는 UR2에서 발현된 hEGF에 비교할 때 전체적인 생성량이 감소하였으며 카르복시말단의 분해정도도 큰 변화를 확인할 수 없었다. 반면에 카르복시펩티다아제 Y 변이주에서는 카르복시펩티다아제 Y 디스럽션 효과를 확인할 수 있었다. UR2 균주에서 분비된 hEGF중 카르복시말단이 분해되지 않은 완전한 형태의 53개의 아미노산으로 구성된 hEGF은 37%이나 카르복시펩티다아제 Y 변이주에서는 53개의 아미노산으로 구성된 hEGF의 비율이 57%로 증가하였다.

상기의 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 카르복시펩티다아제 Y를 코딩하는 유전자PRC1과 프로티아제 A를 코딩하는 유전자PEP4및 카르복시펩티다아제 α를 코딩하는 유전자KEX1를 디스럽션한 유전자로 형질전환된 카르복시펩티다아제 Y 변이주, 프로티아제 A 변이주 및 카르복시펩티다아제 α 변이주 중, 카르복시펩티다아제 Y 변이주는 야생균주에 비하여 외래단백질인 hEGF의 카르복시말단 분해 능력을 40 %이상 감소시키고 카르복시펩티다아제 α 유전자가 추가로 디스럽션된 균주에서는 카르복시말단 분해 효과를 더 향상시킬 수 있는 효과가 있으며 프로티아제 A 변이주는 hEGF의 카르복시말단 분해 저하능력은 없지만 다른 외래단백질의 경우 카르복시말단 분해 저하 효과를 기대할 수 있는 뛰어난 효과가 있다. 그 뿐만 아니라 본 발명 재조합 카르복시펩티다아제 Y, 프로티아제 A, 카르복시펩티다아제 α는 한세눌라 폴리모르파 유래의 분비 시그널 펩티드로서 사용 가능한 효과가 있으므로 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (7)

1. 한세눌라 폴리모르파 DL1(ATCC 26012) 유래의 카르복시펩티다아제 α를 코딩하는 서열 3에 기재된KEX1유전자.
2. 제 1항 기재의KEX1유전자가 코딩하는 재조합 카르복시펩티다아제 α(Carboxypeptidase α)단백질.
3. 제 2항에 있어서, 재조합 카르복시펩티다아제 α 단백질은 그 펩티드가 분비 시그널로 사용될 수 있음을 특징으로 하는 재조합 카르복시펩티다아제 α 단백질.
4. 서열 3의 유전자KEX1이 포함된 플라스미드 pKH3.9에 한세눌라 폴리모르파URA3유전자 팝아웃카세트를 삽입하여 상기KEX1유전자가 디스럽션 되도록 제작한 재조합 벡터 pKUZ.
5. 제 4항에 기재된 재조합 벡터 pKUZ에 의해 형질전환된 한세눌라 폴리모르파 DL1 카르복시펩티다아제 α 변이주.
6. 제 5항에 기재된 재조합 벡터 pKUZ에 의해 형질전환된 한세눌라 폴리모르파 DL1 카르복시펩티다아제 α 변이주에 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 도입하여메탄올 배지에서 배양함을 특징으로 하는 외래 단백질 발현방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 외래 단백질이 인간표피성장인자(hEGF)임을 특징으로 하는 외래 단백질 발현방법.