JP2002522451A - 免疫学的単純ヘルペスウイルス抗原とその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、HSV感染症の予防および治療に関して有用であるHSV抗原を提供する。ヘルペス病変または子宮頸部に由来するT細胞によって認識されることが確認された抗原および／またはその構成エピトープを本明細書において開示する。本発明の抗原に対して特異性を有するT細胞は、ウイルスがコードするペプチドエピトープを負荷した細胞に対して、そして多くの場合HSVに感染した細胞に対して細胞障害活性を示した。T細胞の特異性の原因となる免疫原性抗原の同定によって、改善された抗ウイルス療法および予防方法が得られる。本発明の抗原または抗原をコードするポリヌクレオチドを含む組成物は、HSV感染症の予防および治療にとって有効にターゲティングされるワクチンを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、いずれも1998年
８月７日に出願された米国特許仮出願第60/095,723号および第60/095,724号の恩
典を主張する。

【０００２】 本明細書に開示の本発明は、国立衛生研究所から供与された助成金番号AI3461
6の下で政府の支援を受けて行った。政府は本発明において一定の権利を有する
。

【０００３】 本出願を通じて、様々な出版物を引用する。これらの出版物の開示は本発明が
属する技術分野をより詳しく説明するために、その全文が参照として本明細書に
組み入れられる。

【０００４】発明の技術分野 本発明は、単純ヘルペスウイルス（HSV）感染症の治療および予防のために用
いることができる分子、組成物、および方法に関する。より詳しく述べると、本
発明は、HSV特異的免疫を刺激、または増強する方法、分子、および組成物を開
発するために用いることができるHSV蛋白質のエピトープを同定する。

【０００５】発明の背景 １型および２型HSVについてわかっている完全なDNA配列は約160 kbであり、約
85の遺伝子をコードし、そのそれぞれが少なくとも１つの蛋白質をコードする。
これらの蛋白質の中で知られていないのは、免疫学的エピトープであり、それぞ
れのエピトープは長さがアミノ酸約９〜12個であり、ウイルス感染症に対して有
効なT細胞免疫応答を誘発することができる。

【０００６】 細胞免疫応答は、ヒトにおける再発性HSV感染症の重症度を制限するために必
要である。HSV特異的CD4 T細胞は、ウイルス感染細胞に対して細胞障害性となり
うる（ヤスカワ（M. Yasukawa）ら、1991、J. Immunol. 146：1341〜1347；ヤス
カワ（M. Yasukawa）ら、1984、J. Immunol. 133：2736〜42）。HSV特異的T細胞
はまた、HSVに感染したHLA-マッチ細胞におけるHSV複製の力価を減少させ、抗ウ
イルス活性もしくは免疫調節活性を有するリンフォカインを産生する、または抗
ウイルス抗体反応の増強に役立つ特異的B細胞を提供することができる。HSV特異
的T細胞の抗原特異性に関連した参考文献には：ランゲンベルグ（A.G. Langenbe
rg）ら（1995、Ann. Int. Med. 122：889〜898）；ミクロスカ（A. Mikloska）
ら（1998、J. Gen. Virol. 79：353〜361）；トルセス（Torseth）ら（1987、J.
Virol. 61：1532〜1539）；ヤスカワ（M. Yasukawa）ら（1985、J. Immunol. 1
34：2679〜2687）が含まれる。

【０００７】 HSV感染症に対して有効な免疫応答を誘発することができる特異的エピトープ
を同定する必要がある。そのような情報があれば、HSV感染症の予防および治療
にとって有用なより有効な免疫原性抗原を同定することができる。

【０００８】発明の概要 本発明は、HSV抗原、HSV抗原を含むポリペプチド、該ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチド、ベクター、および該ポリヌクレオチドを含む組換え型ウイ
ルス、該ポリペプチドを提示する抗原提示細胞（APC）、HSVに対して産生された
免疫細胞、ならびに薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、予防的および治
療的のいずれにも用いることができる。本発明の抗原はヘルペス病変から採取し
たT細胞によって認識される。本発明はさらに、HSV感染症を予防および治療する
方法、抗ウイルスおよび／または免疫調節リンフォカインの分泌を増強する方法
、ならびにHSV特異的抗体産生を増強する方法を含む方法を提供する。HSV感染症
を予防および治療するため、抗ウイルスおよび／または免疫調節リンフォカイン
の分泌を増強するため、HSV特異的抗体産生を増強するため、および一般的にHSV
-特異的免疫を刺激および／または増強するために、本方法は、本発明のポリペ
プチド、ポリヌクレオチド、組換え型ウイルス、APC、免疫細胞または組成物を
被験者に投与することを含む。HSV感染細胞を死滅させる方法、およびウイルス
複製を阻害する方法は、HSV感染細胞を本発明の免疫細胞に接触させる段階を含
む。本発明の免疫細胞は、本発明の抗原、または本発明の抗原を提示するAPCに
よって刺激される細胞である。そのような免疫細胞を産生する方法も、本発明に
よって提供される。本方法は、本発明の抗原を提示するように改変されたAPC、
特に樹状細胞に免疫細胞を接触させる段階を含む。好ましい態様において、免疫
細胞はCD4+またはCD8+ T細胞のようなT細胞である。

【０００９】 一つの態様において、本発明は、HSVポリペプチドのU_L19、U_L21、U_L49、もし
くはU_L50蛋白質もしくはその断片、または以下からなる群より選択されるポリペ
プチド：U_L19のアミノ酸1078〜1319位；U_L21のアミノ酸148〜181位；U_L49のアミ
ノ酸105〜190位もしくは177〜220位；U_L50のアミノ酸118〜312位；糖蛋白質E（g
E）のアミノ酸1〜273位；VP16のアミノ酸185〜197位、209〜221位、もしくは430
〜449位；および上記の置換変異体を含みうる。同様に、本発明のポリペプチド
をコードする単離ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む組成物も提供
する。本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子改変
された組換え型ウイルス、および組換え型ウイルスを含む組成物を提供する。好
ましい態様において、ウイルスは、ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイ
ルス、HSV、レンチウイルス、レトロウイルスまたはアデノウイルスである。本
発明の組成物は薬学的組成物となりうる。組成物は選択的に、薬学的に許容され
る担体および／またはアジュバントを含みうる。

【００１０】 本発明は、さらにウイルス、細菌、または寄生虫のような感染性微生物の免疫
原性エピトープを同定する方法を提供する。一つの態様において、本方法は生物
のゲノムのランダム断片の集合体を調製する段階を含む。本方法はさらに、集合
体の断片によってコードされるポリペプチドを発現する段階および発現されたポ
リペプチドを回収する段階を含む。好ましくは、ポリペプチドは不溶性の封入体
として発現される。一つの態様において、ポリペプチドは例えば、不溶性のβガ
ラクトシダーゼ融合蛋白質を発現するためにpUEXベクターを用いて融合蛋白質と
して発現される。次に、ポリペプチドが細胞性免疫応答を誘発することができる
か否かをアッセイする。細胞性免疫応答の誘発能が認められれば、免疫原性エピ
トープが存在することを示している。

【００１１】 上記の段階はゲノム断片の小断片によって繰り返すことができる。本方法はさ
らに、ゲノムの断片をシークエンシングする段階を含む。一つの態様において、
アッセイする段階はT細胞増殖アッセイ法を実施する段階を含む。アッセイする
段階は、感染性微生物に暴露された被験者に由来する免疫細胞について実施する
ことができる。好ましい態様において、細胞は感染した被験者の皮膚、子宮頸部
、または血液のような能動的感染部位に由来する。

【００１２】 本発明はさらに、本発明の方法によって同定された免疫原性エピトープ、エピ
トープを含むポリペプチド、およびポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
を提供する。適した感染性微生物には、細菌、寄生虫およびウイルスが含まれる
。ウイルスの例には、いずれも二本鎖および一本鎖であるDNAおよびRNAウイルス
が含まれる。本発明の方法は、微生物の核酸配列が既知である必要がないことか
ら、有意な多様性を示す生物を含む多様な感染性微生物に対抗するための方法を
提供する。

【００１３】発明の詳細な説明 本発明は、HSV感染症の予防および治療のために有用であるHSV抗原を提供する
。ヘルペス領域に由来するT細胞によって認識されることが確認された抗原およ
び／またはその構成エピトープを本明細書において開示する。幾つかの態様にお
いて、本発明の抗原に対する特異性を有するT細胞は、ウイルス感染細胞に対し
て細胞障害活性を示した。T細胞の特異性に関与する免疫原性抗原の同定によっ
て、改善された抗ウイルス療法および予防方法の開発が容易となる。抗原または
本発明の抗原をコードするポリヌクレオチドを含む組成物により、HSV感染症を
予防および治療するために有効にターゲティングされるワクチンが提供される。

【００１４】定義 本出願において用いられた全ての科学技術用語は、特に明記していなければ当
技術分野で一般的に用いられている意味を有する。本出願において用いられるよ
うに、以下の用語または句は、明記された意味を有する。

【００１５】 本明細書において用いられるように、「ポリペプチド」には、天然起源から単
離された、組換え技術によって産生された、または化学合成されたか否かによら
ず、蛋白質、蛋白質の断片、およびペプチドが含まれる。本発明のポリペプチド
は、典型的にアミノ酸を少なくとも約８個含む。

【００１６】 本明細書において用いられるに、「HSVポリペプチド」には、特に明記してい
なければHSV-1およびHSV-2が含まれる。HSV蛋白質またはポリペプチドのアミノ
酸について言及する場合、ドラン（A. Dolan）ら（1998、J. Virol. 72(3）：20
10〜2021）に記述のようなHSV-2に関するゲノム配列情報に基づいている。

【００１７】 本明細書において用いられるように、「置換変異体」とは、免疫細胞によって
認識される能力を保持しているが、表示のアミノ酸配列に１つまたはそれ以上の
アミノ酸置換または欠失を有する分子を意味する。分子が免疫細胞によって認識
されうるか否かを決定する一つの方法は、コエル（D.M. Koelle）ら（1994、J.
Virol. 68(5）：2803〜2810）に記述の増殖アッセイ法である。

【００１８】 本明細書において用いられるように、「ベクター」とは、宿主細胞において関
係する１つまたは複数の遺伝子または配列を輸送、および好ましくは発現するこ
とができる構築物を意味する。ベクターの例には、ウイルスベクター、裸のDNA
もしくはRNA発現ベクター、プラスミド、コスミド、もしくはファージベクター
、陽イオン濃縮剤に結合したDNAもしくはRNA発現ベクター、リポソームに封入さ
れたDNAもしくはRNA発現ベクター、およびプロデューサー細胞のような特定の真
核細胞が含まれるがこれらに限定しない。

【００１９】 本明細書において用いられるように、「発現調節配列」とは、核酸の転写を指
示する核酸配列を意味する。発現調節配列は、構成的もしくは誘導型プロモータ
ーのようなプロモーター、またはエンハンサーとなりうる。発現調節配列は転写
される核酸配列に機能的に結合している。

【００２０】 「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖もしくは二本鎖の
いずれかの形でのデオキシリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドを意味し
、特に限定されなければ、天然に存在するヌクレオチドと同様に核酸にハイブリ
ダイズする天然のヌクレオチドの既知の類似体を含む。

【００２１】 本明細書において用いられるように、「抗原提示細胞」または「APC」とは、
抗原を処理することができ、抗原をリンパ球に提示することができる細胞を意味
する。APCの例には、マクロファージ、ランゲルハンス樹状細胞、濾胞樹状細胞
、B細胞、単球、繊維芽細胞および繊維嚢胞が含まれるがこれらに限定されない
。樹状細胞は好ましいタイプの抗原提示細胞である。樹状細胞は多くの非リンパ
様組織において認められるが、求心性リンパまたは血流を通じてリンパ様臓器の
T依存的領域に移動することができる。非リンパ様臓器では、樹状細胞にはラン
ゲルハンス島および間質樹状細胞が含まれる。リンパおよび血液において、それ
らはそれぞれ、求心性のリンパに隠された細胞および血液樹状細胞を含む。リン
パ様臓器において、それらはリンパ様樹状細胞および互いに入り組んだ細胞を含
む。本明細書において用いられるように、特に明記していない限り、これらの細
胞タイプのそれぞれとその前駆細胞のそれぞれを「樹状細胞」と呼ぶ。

【００２２】 本明細書において用いられるように、エピトープを提示する場合に「改変され
た」とは、天然または組換え的方法によってエピトープを提示するように操作さ
れた抗原提示細胞（APC）を意味する。例えば、APCは単離された抗原の単独もし
くは混合物の一部としての暴露、ペプチド負荷によって、または１つもしくはそ
れ以上のエピトープを含むポリペプチドを発現するようにAPCを遺伝子改変する
ことによって、改変することができる。

【００２３】 本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される塩」とは、親化合
物の所望の生物活性を保持し、如何なる望ましくない毒性作用も付与しない塩を
意味する。そのような塩の例には、（a）無機酸から形成された酸付加塩、例え
ば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、燐酸、硝酸等；および例えば、酢酸、シュウ酸、
酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、
アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモン酸（pamoic acid）、アルギン
酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリ
ガラクツロン酸のような、有機酸から形成された酸；（b）亜鉛、カルシウム、
ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、
カドミウム等のような多価金属陽イオンの塩；または（c）N,N'-ジベンジルエチ
レンジアミンまたはエチレンジアミンから形成された有機陽イオンと共に形成さ
れた塩；または（d）（a）および（b）または（c）の組合せ、例えばタンニン酸
の亜鉛塩等が含まれるがこれらに限定されない。好ましい酸付加塩は、トリフル
オロ酢酸塩および酢酸塩である。

【００２４】 本明細書において用いられる「薬学的に許容される担体」とは、活性成分と組
みあわせた場合に、該成分の生物活性を保持させ、且つ被験者の免疫系と反応し
ない任意の物質を意味する。例には、燐酸緩衝生理食塩水、水、油／水乳剤のよ
うな乳剤、および様々なタイプの湿潤剤が含まれるがこれらに限定されない。エ
アロゾルまたは非経口投与用の好ましい希釈剤は、燐酸緩衝生理食塩水または通
常（0.9％）生理食塩水である。

【００２５】 そのような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって調製される（例え
ば、レミントンの製薬科学、第43章、第14版、マック出版社、イーストン、ペン
シルバニア州18042、アメリカを参照のこと）。

【００２６】 本明細書において用いられるように、「アジュバント」とは、免疫応答の刺激
を促進するために、当技術分野で一般的に用いられるアジュバントを含む。アジ
ュバントの例には、ヘルパーペプチド；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）
、または燐酸アルミニウムのようなアルミニウム塩；フロイントの不完全アジュ
バントおよび完全アジュバント（ディフコラボラトリーズ、デトロイト、ミシガ
ン州）；メルクアジュバント65（メルクアンドカンパニーインク、ラーウェイ、
ニュージャージー州）；AS-2（スミスクライン・ビーチャム）；QS-21（アキラ
）；MPLまたは3d-MPL（リビイムノケムリサーチインク、ハミルトン、モンタナ
州）；LEIF；カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液
；アシル化糖；陽イオンまたは陰イオン誘導体多糖類；ポリフォスファゼン；生
体分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピッドAおよびクイルA(quil A)；ム
ラミルトリペプチドホスファチジルエタノールアミン、またはサイトカイン（例
えば、GM-CSFまたはインターロイキン-2、-7、もしくは-12）および免疫刺激DNA
配列を含む、免疫刺激複合体が含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレ
オチドワクチンを使用する場合のような幾つかの態様において、ヘルパーペプチ
ドまたはサイトカインのようなアジュバントは、アジュバントをコードするポリ
ヌクレオチドを介して提供することができる。

【００２７】 本明細書において用いられるように、「１つの(aまたはan）」とは、明らかに
そうでないことを明記している場合を除き、少なくとも１つの意味である。

【００２８】HSVポリペプチド 一つの態様において、本発明は、ポリペプチドがU_L19（主なカプシド抗原、VP
5）、U_L21、U_L49（VP22）、もしくはU_L50蛋白質またはその断片を含む単離され
た単純ヘルペスウイルス（HSV）ポリペプチドを提供する。別の態様において、
本発明は、以下からなる群より選択される単離HSVポリペプチドを提供する：U_L1
9のアミノ酸1078〜1319位；U_L21のアミノ酸148〜181位；U_L49のアミノ酸105〜19
0位または177〜220位；U_L50のアミノ酸118〜312位；糖蛋白質E（gE；US8）のア
ミノ酸1〜273位；VP16のアミノ酸185〜197位、209〜221位、または430〜449位；
および上記ポリペプチドの置換変異体。アミノ酸残基に関しては、ドラン（A. D
olan）ら（1998、J. Virol. 72(3）：2010〜2021）に記述のHSV-2ゲノムの蛋白
質を参考とする。

【００２９】 ポリペプチドは融合蛋白質となりうる。一つの態様において、融合蛋白質は可
溶性である。本発明の可溶性の融合蛋白質は、被験者に注射するためおよび免疫
応答を誘発するために適当となりうる。特定の態様において、ポリペプチドは、
本明細書に記述の多数のポリペプチドを含む融合蛋白質、または本明細書に記述
の少なくとも１つのポリペプチドと無関係な配列とを含む融合蛋白質となりうる
。融合の相手は、例えば、Tヘルパーエピトープ（免疫学的融合パートナー）、
好ましくはヒトによって認識されるTヘルパーエピトープの提供を補助するもの
でもよく、または本来の組換え型蛋白質より高い収量で蛋白質（発現エンハンサ
ー）が発現されるように補助するものでもよい。特定の好ましい融合パートナー
は、免疫および発現をいずれも増強する融合パートナーである。蛋白質の溶解性
を増加させるため、または所望の細胞内分画への蛋白質の標的輸送を可能にする
ために、他の融合パートナーを選択してもよい。なおさらに別の融合パートナー
は、蛋白質の精製を容易にするアフィニティタグを含んでもよい。

【００３０】 融合蛋白質は一般的に、化学結合を含む標準的な技術を用いて調製してもよい
。好ましくは、融合蛋白質は組換え型蛋白質として発現され、非融合蛋白質と比
較して発現系において増加したレベルで存在する。簡単に説明すると、ポリペプ
チド成分をコードするDNA配列を個々に集めて、適当な発現ベクターにライゲー
ションしてもよい。１つのポリペプチド成分をコードするDNA配列の3'末端を、
配列の読みとり枠の相が一致するように、ペプチドリンカーと共に、またはペプ
チドリンカーを用いないで、第二のポリペプチド成分をコードするDNA配列の5'
末端にライゲーションする。これによって、双方の構成ポリペプチドの生物活性
を保持する単一の融合蛋白質へと翻訳される。

【００３１】 ペプチドリンカー配列を用いて、第一および第二のポリペプチド成分を、それ
ぞれのポリペプチドがその二次および三次構造へと確実に折り畳まれるために十
分な距離離してもよい。そのようなペプチドリンカー配列は、当技術分野で周知
の標準的な技術を用いて融合蛋白質に組み入れられる。適したペプチドリンカー
配列は以下の要因に基づいて選択してもよい：（1）柔軟な伸長した構造をとる
ことができること；（2）第一および第二のポリペプチド上の機能的エピトープ
と相互作用しうる二次構造をとることができないこと；ならびに（3）ポリペプ
チドの機能的エピトープと反応する疎水性または荷電残基がないこと。好ましい
ペプチドリンカー配列は、グリシン、アスパラギン、およびセリン残基を含む。
トレオニンおよびアラニンのような他のほぼ中性のアミノ酸もリンカー配列に用
いてもよい。リンカーとして有用に用いられるアミノ酸配列には、マラテア（Ma
ratea）ら（1985、Gene 40：39〜46）；マーフィー（Murphy）ら（1986、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83：8258〜8262）；米国特許第4,935,233号および米国特
許第4,751,180号に開示される配列が含まれる。リンカー配列は一般的に長さが
アミノ酸約１〜50個であってもよい。リンカー配列は、第一および第二のポリペ
プチドが、機能的ドメインを分離させて、立体妨害を防止するために用いること
ができる非必須N-末端アミノ酸領域を有する場合には必要ではない。

【００３２】 ライゲーションしたDNA配列は適した転写または翻訳調節エレメントに機能的
に結合する。DNAの発現に関与する調節エレメントは、第一のポリペプチドをコ
ードするDNA配列の5'に存在する。同様に、翻訳を終了させるために必要な停止
コドンおよび転写終了シグナルは、第二のポリペプチドをコードするDNA配列の3
'に存在する。

【００３３】 無関係な免疫原性蛋白質と共に本発明のポリペプチドを含む融合蛋白質も提供
する。好ましくは、免疫原性蛋白質はリコール反応（recall response）を誘発
することができる。そのような蛋白質の例には、破傷風、結核および肝炎蛋白質
が含まれる（例えば、ストウト（Stoute）ら、1997、New Engl. J. Med. 336：8
69を参照のこと）。

【００３４】 好ましい態様において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性細菌であるB
型インフルエンザ菌の表面蛋白質であるプロテインD（国際公開公報第91/18926
号）に由来する。好ましくは、プロテインD誘導体は蛋白質のおおよそ最初の３
分の１（例えば、最初のN末端アミノ酸100〜110個）を含み、プロテインD誘導体
に脂質を付加してもよい。特定の好ましい態様において、ポリペプチドにさらな
る外因性T-細胞エピトープを提供するため、および大腸菌における発現レベルを
増加させるために、リポ蛋白質D融合パートナーの最初の109残基をN-末端上に含
む（したがって、発現エンハンサーとして機能する）。脂質テール部分によって
、抗原提示細胞に対する抗原の最適な提示が確実になる。他の融合パートナーは
、インフルエンザウイルスからの非構造蛋白質、NS1（血液凝集素）を含む。典
型的には、N末端のアミノ酸81個が用いられるが、Tヘルパーエピトープを含む異
なる断片を用いてもよい。

【００３５】 もう一つの態様において、免疫学的融合パートナーはLYTAとして知られる蛋白
質またはその一部である（好ましくはC-末端部分）。LYTAは、肺炎連鎖球菌（St
reptococcus pneumoniae）に由来し、これはアミダーゼLYTA（LytA遺伝子によっ
てコードされる；Gene 43：265〜292、1986）として知られるN-アセチルL-アラ
ニンアミダーゼを合成する。LYTAは、ペプチドグリカン骨格において特定の結合
を特異的に分解する自己溶解素である。LYTA蛋白質のC-末端ドメインはコリンま
たはDEAEのような幾つかのコリン類似体に対する親和性に寄与している。この特
性は、融合蛋白質の発現に有用な大腸菌のC-LYTA発現プラスミドの作製に利用さ
れている。アミノ末端でC-LYTA断片を含むハイブリッド蛋白質の精製が記述され
ている（Biotechnology 10：795〜798、1992を参照のこと）。好ましい態様にお
いて、LYTAの反復部分を融合蛋白質に組み入れてもよい。反復部分は残基178位
から始まるC末端領域に認められる。特に好ましい反復部分は、残基188〜305位
を含む。

【００３６】 幾つかの態様において、治療物質と本発明のポリペプチドとをカップリングさ
せること、または本発明の１つ以上のポリペプチドとカップリングさせることが
望ましいと考えられる。例えば、１つ以上の物質またはポリペプチドが、本発明
の第一のポリペプチドに直接カップリングしてもよく、または多数の結合部位を
提供するリンカーを用いることができる。または、担体を用いることができる。
VP22（エリオット＆オヘール（Elliott and O'Hare）、1997、Cell 88：223〜23
3；同様にキム（Kim）ら、1997、J. Immunol. 159：1666〜1668を参照；ロジャ
ス（Rojas）ら、1998、Nature Biotechnology 16：370；カトウ（Kato）ら、199
8、FEBS Lett. 427(2)：203〜208；バイブス（Vives）ら、1997、J. Biol. Chem
. 272(25)：16010〜7；ナガハラ（Nagahara）ら、1998、Nature Med. 4(12)：14
49〜1452）を含むがこれに限定されない幾つかの分子は、細胞内移動および蛋白
質輸送にとって特に適している。

【００３７】 担体は、直接またはリンカー基のいずれかによる共有結合を含む、多様な方法
によって物質またはポリペプチドを有してもよい。適した担体には、アルブミン
（例えば、カトウ（Kato）らに対する米国特許第4,507,234号）のような蛋白質
、ペプチド、およびアミノデキストランのような多糖類（例えば、シー（Shih）
らに対する米国特許第4,699,784号）が含まれる。担体はまた、非共有結合によ
って、またはリポソーム小胞内部など封入によって物質を有してもよい（例えば
、米国特許第4,429,008号および第4,873,088号）。

【００３８】 一般的に、本明細書に記載のポリペプチド（融合蛋白質を含む）およびポリヌ
クレオチドは、単離されている。「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレ
オチドとは、その当初の環境から切り離されたものである。例えば、天然に存在
する蛋白質が、天然の系において共存する物質の幾つかまたは全てから分離され
ている場合に、単離されている。好ましくは、そのようなポリペプチドは少なく
とも約90％純粋であり、より好ましくは少なくとも約95％純粋で、最も好ましく
は少なくとも約99％純粋である。ポリヌクレオチドは、例えば天然の環境の一部
ではないベクターにクローニングされている場合、単離されたと見なされる。

【００３９】 ポリペプチドは、その天然に存在する型から単離する、組換え手段によって産
生する、または化学合成することができる。本明細書に記述のDNA配列によって
コードされる組換え型ポリペプチドは、当技術分野で既知の多様な如何なる発現
ベクターを用いてもDNA配列から容易に調製することができる。発現は、組換え
型ポリペプチドをコードするDNA分子を含む発現ベクターによって形質転換され
た、またはトランスフェクトさせた適当な宿主細胞において行ってもよい。適し
た宿主細胞には、原核細胞、酵母および高等真核細胞が含まれる。好ましくは用
いられる宿主細胞には、大腸菌、酵母、またはCOSもしくはCHOのような哺乳類の
細胞株が含まれる。組換え型蛋白質またはポリペプチドを培養培地中に分泌する
可溶性の宿主／ベクター系からの上清はまず、市販の濾紙を用いて濃縮してもよ
い。濃縮後、濃縮物をアフィニティマトリクスまたはイオン交換樹脂のような適
した精製マトリクスに適用してもよい。最後に、１つまたはそれ以上の逆相HPLC
段階を用いて、組換え型ポリペプチドをさらに精製することができる。

【００４０】 アミノ酸約100個未満、一般的にアミノ酸約50個未満を有する断片およびその
他の変異体も同様に、当業者に周知の技術を用いて合成手段によって作製しても
よい。例えば、そのようなポリペプチドは、伸長しつつあるアミノ酸鎖にアミノ
酸を連続的に加えるメリフィールド固相合成法のような市販の固相技術を用いて
合成してもよい（メリフィールド（Merrifield）、1963、J. Am. Chem. Soc. 85
：2146〜2149）。ポリペプチドの自動合成装置はパーキンエルマー／アプライド
バイオシステムズ部門（フォスターシティ、カリフォルニア州）のような供給元
から販売されており、製造元の指示に従って操作してもよい。

【００４１】 本発明に従って用いられるポリペプチドの変異体は、HSVまたはHSV感染細胞に
対する免疫応答の誘発能を保持するポリペプチドが得られることを示す、アミノ
酸配列における１つまたはそれ以上のアミノ酸置換、欠失、付加および／または
挿入を有しうる。そのような変異体は、本明細書に記述のポリペプチド配列の１
つを改変すること、および本明細書に記述のT細胞アッセイ法のような既知のア
ッセイ法を用いて改変されたポリペプチドの反応性を評価することによって同定
してもよい。ポリペプチド変異体は好ましくは、同定されたポリペプチドに対し
て少なくとも約70％、より好ましくは少なくとも約90％、および最も好ましくは
少なくとも約95％の同一性を示す。これらのアミノ酸置換には、「保存的」とし
て当技術分野において既知のアミノ酸置換が含まれるが必ずしもこれらに限定さ
れない。

【００４２】 「保存的」置換とは、ペプチド化学の当業者によってポリペプチドの二次構造
およびハイドロパシー特性が実質的に不変であると予想されるように、アミノ酸
が類似の特性を有するもう一つのアミノ酸に置換されている置換である。アミノ
酸置換は、残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒
性特徴における類似性に基づいて一般的に行ってもよい。例えば、陰性荷電アミ
ノ酸には、アスパラギン酸とグルタミン酸が含まれ；陽性荷電アミノ酸にはリジ
ンとアルギニンが含まれる；および類似の親水性値を有する非荷電極性ヘッド基
を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、およびバリン；グリシンおよ
びアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フ
ェニルアラニン、およびチロシンが含まれる。保存的置換を示しうるその他のア
ミノ酸グループには：（1）アラニン、プロリン、グリシン、グルタミン酸、ア
スパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン；（2）システ
イン、セリン、チロシン、トレオニン；（3）バリン、イソロイシン、ロイシン
、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン；（4）リジン、アルギニン、ヒス
チジン；および（5）フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジ
ンが含まれる。変異体も同様にまたは別法として非保存的置換を含んでもよい。
好ましい態様において、変異体ポリペプチドはアミノ酸５個またはそれより少な
い置換、欠失、または付加によって本来の配列とは異なる。変異体は同様に、（
または）例えばポリペプチドの免疫原性、二次構造およびハイドロパシー特性に
及ぼす影響がほとんどないアミノ酸の欠失または付加によって改変してもよい。

【００４３】ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞および組換え型ウイルス 本発明は、本発明の１つまたは複数のポリペプチドをコードするポリヌクレオ
チドを提供する。ポリヌクレオチドはベクターに含めることができる。ベクター
はさらに、本発明のポリヌクレオチドに機能的に結合した発現調節配列を含む。
幾つかの態様において、ベクターは、関係する他の分子をコードする１つまたは
複数のポリヌクレオチドを含む。一つの態様において、本発明のポリヌクレオチ
ドとさらなるポリヌクレオチドとを、融合蛋白質をコードするように結合するこ
とができる。

【００４４】 特定の態様において、ポリヌクレオチドを、哺乳類の細胞への侵入およびその
中での発現が可能であるように調製してもよい。そのような製剤は、下記のよう
に治療目的のために特に有用である。当業者は、標的細胞においてポリヌクレオ
チドを発現させるための多くの方法が存在すること、そして如何なる適した方法
を用いてもよいことを認識していると思われる。例えば、ポリヌクレオチドはア
デノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、またはワクシニアもしく
はその他のポックスウイルス（例えば、トリポックスウイルス）のような、しか
しこれらに限定されないウイルスベクターに組み入れてもよい。DNAをそのよう
なベクターに組み入れる技術は当業者に周知である。レトロウイルスベクターは
さらに、ベクターを標的特異的にするために、選択マーカー（形質導入した細胞
の同定または選択を補助するため）および／または特定の標的細胞上の受容体に
対するリガンドをコードする遺伝子のようなターゲティング部分に対する遺伝子
を移入または組み入れてもよい。ターゲティングは同様に、当業者に公知の方法
によって、抗体を用いて行ってもよい。

【００４５】 本発明はまた、本発明のベクターによって形質転換された宿主細胞を提供する
。形質転換された宿主細胞は、本発明のポリペプチドを生産する方法において用
いることができる。本方法は、宿主細胞を培養し、それにより産生されたポリペ
プチドを回収する段階を含む。回収されたポリペプチドは、培養上清から精製す
ることができる。

【００４６】 本発明のベクターは、インビボ、エクスビボまたはインビトロのいずれかで細
胞を遺伝子改変するために用いることができる。直接的またはレトロウイルス・
プロデューサー細胞を介するウイルスベクターを用いた形質導入または感染、レ
シピエント細胞とDNAを含む細菌プロトプラストとの融合、DNAを含むリポソーム
またはミクロスフェアによるレシピエント細胞の処理、DEAEデキストラン、受容
体媒介エンドサイトーシス、電気穿孔、マイクロインジェクション、および当業
者に公知のその他の多くの技術を含む、細胞を遺伝子改変する幾つかの方法が既
知である。例えば、サムブルック（Sambrook）らの「分子クローニング、実験マ
ニュアル（Molecular Cloning, A Laboratory Manual）」、第二版1〜3、1989；
「分子生物学の現行プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）
」、アウスユベール（F.M. Ausubel）ら編、グリーンパブリッシングアソシエー
ツインク、およびジョン・ウィリー＆サンズインク（1994増刊）を参照のこと。

【００４７】 ウイルスベクターの例には、例えばHIV、SIV、マウスレトロウイルス、テナガ
ザル白血病ウイルス、ならびにアデノ関連ウイルス（AAV）およびアデノウイル
スのような他のウイルスに基づくレトロウイルスベクターが含まれるがこれらに
限定されない。（ミラー（Miller）ら、1990、Mol. Cell Biol. 10：4239；コル
バーグ（J. Kolberg）、1992、NIH Res. 4：43；およびコルネッタ（Cornetta）
ら、1991、Hum. Gene Ther. 2：215）。広く用いられているレトロウイルスベク
ターには、マウス白血病ウイルス（MuLV）、テナガザル白血病ウイルス（GaLV）
、環境栄養性レトロウイルス、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒト免疫不全ウ
イルス（HIV）に基づくベクター、およびその組合せが含まれる。例えば、ブク
シャー（Buchscher）ら、1992、J. Virol. 66(5)：2731〜2739；ジョアン（Joha
nn）ら、1992、J. Virol. 66(5)：1635〜1640；ソマーフェルト（Sommerfelt）
ら、1990、Virol. 176：58〜59；ウィルソン（Wilson）ら、1989、J. Virol. 63
：2374〜2378；ミラー（Miller）ら、1991、J. Virol. 65：2220〜2224、および
ローゼンバーグ＆ファウシ（Rosenberg and Fauci）、1993、「基礎免疫学（Fun
damental Immunology）」、第三版、ポール（W.E. Paul）編、レーブンプレス、
ニューヨークおよびそれらに含まれる参考文献；ミラー（Miller）ら、1990、Mo
l. Cell Biol. 10：4239；コルバーグ（R. Kolberg）、1992、J. NIH Res. 4：4
3；ならびにコルネッタ（Cornetta）ら、1991、Hum. Gene Ther. 2：215を参照
のこと。

【００４８】 発現ベクターにサブクローニングする配列を増幅するために適したインビトロ
増幅技術は公知である。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、リガーゼ連鎖反応（LCR
）、Qβ-レプリカーゼ増幅およびその他のRNAポリメラーゼ媒介技術（例えば、N
ASBA）を含む、そのようなインビトロ増幅方法の例は、サムブルック（Sambrook
）ら、1989、「分子クローニング、実験マニュアル（Molecular Cloning, A Lab
oratory Manual）」、第二版、1〜3；および米国特許第4,683,202号；PCRプロト
コール：方法と応用の手引き（PCR Protocols：A Guide to Methods and Applic
ations）」、イニス（Innis）ら編、アカデミックプレスインク、サンジエゴ、
カリフォルニア州、1990に見られる。インビトロで増幅した核酸をクローニング
する改善された方法は米国特許第5,426,039号に記載されている。

【００４９】 本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを発現するように遺伝子改変され
た組換え型微生物を提供する。組換え型微生物はワクチンとして有用となりえて
、弱毒化生ワクチンを調製するために当技術分野で公知の技術を用いて調製する
ことができる。生ワクチンとして用いられる微生物の例にはウイルスおよび細菌
が含まれるがこれらに限定されない。好ましい態様において、組換え型微生物は
ウイルスである。適したウイルスの例には、ワクシニアウイルス、カナリアポッ
クスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、HSVおよびアデノウイルスが
含まれるがこれらに限定されない。

【００５０】組成物 本発明は、HSV感染症を治療および予防するために有用である組成物を提供す
る。組成物はウイルス複製を阻害するために、そしてウイルス感染細胞を死滅さ
せるために用いることができる。一つの態様において、組成物は薬学的組成物で
ある。組成物は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、組換え型ウイルス
、APC、または免疫細胞の治療的または予防的有効量を含みうる。有効量は、例
えばT細胞を活性化することによって、免疫応答を誘起または増強するために十
分な量である。T細胞の活性化の一つの測定法は、コエル（D.M. Koelle）ら（19
94、J. Virol. 68(5)：2803〜2810）の記述のような増殖アッセイ法である。幾
つかの態様において、組成物はワクチンである。

【００５１】 本組成物は、薬学的に許容される担体のような担体を選択的に含みうる。薬学
的に許容される担体は、投与される特定の組成物と共に、組成物の投与に用いら
れる特定の方法によって部分的に決定される。したがって、本発明の薬学的組成
物の多様な適した製剤が存在する。例えば関節内（関節内）、静脈内、筋肉内、
皮内、腹腔内、および皮下経路による非経口投与に適した組成物には、抗酸化剤
、緩衝剤、静菌薬、および目的とするレシピエントの血液と製剤を等張にする溶
質を含みうる等張滅菌注射水溶液、ならびに懸濁剤、溶解補助剤、濃縮剤、安定
化剤、保存剤、リポソーム、ミクロスフェア、および乳剤を含みうる水性および
非水性滅菌懸濁剤が含まれる。

【００５２】 本発明の組成物はさらに、１つまたは複数のアジュバントを含みうる。アジュ
バントの例には、ヘルパーペプチド、ミョウバン、フロイントアジュバント、ム
ラミルトリペプチドホスファチジルエタノールアミン、またはサイトカインを含
む免疫刺激複合体が含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドワク
チンを使用する場合のような幾つかの態様において、ヘルパーペプチドまたはサ
イトカインのようなアジュバントは、アジュバントをコードするポリヌクレオチ
ドによって提供することができる。ワクチン製剤は一般的に、例えば、パウエル
＆ニューマン（M.F. Powell and M.J. Newman）編、「ワクチンのデザイン（サ
ブユニットとアジュバントアプローチ）（Vaccine Design（the subunit and ad
juvant approach））」、プレナムプレス（ニューヨーク、1995）に記載されて
いる。本発明の範囲内である薬学的組成物およびワクチンはまた、生物学的に活
性であっても不活性であってもよい他の化合物を含みうる。例えば、その他のウ
イルス抗原の１つまたは複数の免疫原性部分が、融合ポリペプチドとして、また
は個別の化合物として組成物またはワクチン内に存在してもよい。

【００５３】 薬学的組成物またはワクチンは、ポリペプチドがインサイチューで形成される
ように、本発明の１つまたは複数のポリペプチドをコードするDNAを含んでもよ
い。

【００５４】 上記のように、DNAは核酸発現系、細菌およびウイルス発現系を含む、当業者
に既知の多様な送達系のいずれの中に存在してもよい。多数の遺伝子送達技術が
当技術分野で周知であり、例えば、ローランド（Rolland）（1998、Crit. Rev.
Therap. Drug Carrier Systems 15：143〜198）およびその中で引用されている
参考文献に記載されている。適当な核酸発現系は、患者において発現するために
必要な（適したプロモーターおよび終結シグナルのような）DNA配列を含む。細
菌送達系は、その細胞表面上にポリペプチドの免疫原性部分を発現する、または
そのようなエピトープを分泌する細菌（カルメットゲラン杆菌（Bacillus-Calme
tte-Gerrin）のような）の投与を含む。好ましい態様において、DNAは、非病原
性（欠損）、複製コンピテントウイルスの使用を含んでもよいウイルス発現系（
例えば、ワクシニアもしくはその他のポックスウイルス、レトロウイルス、また
はアデノウイルス）を用いて導入してもよい。適した系は、例えば、フィッシャ
ーホック（Fisher-Hoch）ら（1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86：317〜321
）；フレクスナー（Flexner）ら（1989、Ann. My Acad. Sci、569：86〜103）；
フレクスナー（Flexner）ら（1990、Vaccine 8：17〜21）；米国特許第4,603,11
2号、第4,769,330号、及び第5,017,487号；国際公開公報第89/01973号；米国特
許第4,777,127号；英国特許第2,200,651号；欧州特許第0,345,242号；国際公開
公報第91102805号；バークナー（Berkner）（1998、Biotechniques 6：616〜627
）；ローゼンフィールド（Rosenfield）ら（1991、Science 252：431〜434）；
コールズ（Kolls）ら（1994、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91：215〜219；カス
・アイスラー（Kass-Eisler）ら（1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：1149
8〜11502）；グズマン（Guzman）ら（1993、Circulation 88：2838〜2848）；お
よびグズマン（Guzman）ら（1993、Cir. Res. 73：1202〜1207）に開示されてい
る。そのような発現系にDNAを組み入れる技術は、当業者に周知である。DNAはま
た、例えば、ウルマー（Ulmer）ら（1993、Science 259：1745〜1749）によって
記述され、コーエン（Cohen）（1993、Science 259：1691〜1692）が論評してい
るように、「裸（naked）」であってもよい。裸のDNAの取り込みは、細胞内に効
率よく取り込まれる生体分解性のビーズ上にDNAをコーティングすることによっ
て増加させてもよい。

【００５５】 当業者に既知の如何なる適した担体も本発明の薬学的組成物において用いるこ
とができるが、担体のタイプは投与様式によって異なると考えられる。本発明の
組成物は例えば局所、経口、鼻腔内、静脈内、頭蓋内、腹腔内、皮下、または筋
肉内投与を含む適当な投与用式のために製剤化してもよい。皮下注射のような非
経口投与に関しては、担体は好ましくは水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ロ
ウ、または緩衝液を含む。経口投与に関しては、上記の担体、またはマンニトー
ル、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タル
ク、セルロース、グルコース、蔗糖、および炭酸マグネシウムを含む固相担体の
いずれを用いてもよい。生体分解性のミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ポリグ
リコール酸）も同様に本発明の薬学的組成物の担体として用いてもよい。適した
生体分解性のミクロスフェアは、例えば米国特許第4,897,268号および第5,075,1
09号に開示されている。

【００５６】 そのような組成物はまた、緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水または燐酸緩
衝生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、蔗糖またはデキ
ストラン）、マンニトール、蛋白質、ポリペプチド、もしくはグリシンのような
アミノ酸、抗酸化剤、EDTAのようなキレート剤もしくはグルタチオン、アジュバ
ント（例えば、水酸化アルミニウム）および／または保存剤を含んでもよい。ま
たは、本発明の組成物は凍結乾燥物として製剤化してもよい。化合物はまた、周
知の技術を用いてリポソーム内に封入してもよい。

【００５７】 如何なる多様なアジュバントも本発明のワクチンに用いることができる。ほと
んどのアジュバントは、水酸化アルミニウムまたは鉱油のような、急速な異化か
ら抗原を保護するようにデザインされた物質、およびリピッドA、百日咳（Borta
della pertussis）または結核菌（Mycobacterium tuberculosis）に由来する蛋
白質のような免疫応答の刺激物質を含む。適したアジュバントは、例えばフロイ
ントの不完全アジュバントおよび完全アジュバント（ディフコラボラトリーズ、
デトロイト、ミシガン州）；メルクアジュバント65（メルク＆カンパニーインク
、ラーウェイ、ニュージャージー州）；水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）
または燐酸アルミニウムのようなアルミニウム塩；カルシウム、鉄、または亜鉛
の塩；アシル化チロシンアシル化糖の不溶性懸濁液；陽イオンまたは陰イオン誘
導体化多糖類；ポリホスファゼン生体分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリ
ピッドAおよびクイルAとして販売されている。GM CSFまたはインターロイキン-2
、-7、もしくは-12のようなサイトカインも同様にアジュバントとして用いても
よい。

【００５８】 本明細書に提供したワクチンにおいて、アジュバント組成物は好ましくはTh1
型の免疫応答を主に誘導するようデザインされる。高レベルのTh1型サイトカイ
ン（例えば、IFN-γ、IL-2およびIL-12）は、投与した抗原に対する細胞性免疫
応答の誘導に都合がよい傾向がある。対照的に、高レベルのTh2型サイトカイン
（例えば、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10およびTNF-β）は、液性免疫応答の誘導に
都合がよい傾向がある。本明細書に提供するワクチンを適用した後、患者はTh1
型およびTh2型反応を含む免疫応答を支持されると思われる。反応が主にTh1型で
ある好ましい態様において、Th1型サイトカインのレベルはTh2型サイトカインの
レベルより大きい程度に増加するであろう。これらのサイトカインのレベルは標
準的なアッセイ法を用いて容易に評価することができる。サイトカインファミリ
ーの論評に関しては、モスマン＆コフマン（Mosmann and Coffman、1989、Ann.
Rev. Immunol. 7：145〜173）を参照のこと。

【００５９】 主にTh1型反応を誘起するよう用いられる好ましいアジュバントには、例えば
、モノホスホリルリピッドA、好ましくは3-デ-O-アシル化モノホスホリルリピッ
ドA（3D-MPL）をアルミニウム塩と共に併用することが含まれる。MPLアジュバン
トは、リビイムノケムリサーチインク（ハミルトン、モンタナ州）から入手でき
る（米国特許第4,436,727号；第4,877,611号；第4,866,034号および第4,912,094
号を参照のこと）。CpG含有オリゴヌクレオチド（この中でCpGジヌクレオチドが
非メチル化されている）も同様に、主にTh1反応を誘導する。そのようなオリゴ
ヌクレオチドは周知であり、例えば、国際公開公報第96/02555号に記載されてい
る。もう一つの好ましいアジュバントはサポニン、好ましくはQS21であり、これ
は単独または他のアジュバントと組みあわせて用いてもよい。例えば、増強され
た系は、国際公開公報第94/00153号に記載のQS21と3D-MPLの併用のような、3D-M
PLモノホスホリルリピッドAとサポニン誘導体との併用を含み、または国際公開
公報第96/33739号に記載のように、QS21をコレステロールに変更した場合にはよ
り反応性が低い組成物が得られる。その他の好ましい製剤は、水中油型乳剤およ
びトコフェロールを含む。QS21、3D-MPL、およびトコフェロールを水中油型乳剤
として含む特に強力なアジュバント製剤は、国際公開公報第95/17210号に記載さ
れている。用いてもよいもう一つのアジュバントは、AS-2である（スミスクライ
ンビーチャム社）。抗原、免疫応答増強剤および適した担体または賦形剤の組合
せとなる本明細書に提供した如何なるワクチンも、周知の方法を用いて調製して
もよい。

【００６０】 本明細書に記述した組成物は、徐放製剤（すなわち、投与後に化合物を徐々に
放出するカプセルまたはスポンジのような製剤）の一部として投与してもよい。
そのような製剤は、周知の技術を用いて一般的に調製し、例えば、経口、直腸、
もしくは皮下植え込み、または所望の標的部位での埋め込みによって投与しても
よい。徐放性製剤は、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体を担体マトリ
クスに分散させて含んでもよく、および／または速度制御膜によって取り囲まれ
たリザーバー内に含んでもよい。そのような製剤に用いられる担体は生体適合性
であり、そして同様に生体分解性であってもよい；好ましくは製剤は、活性成分
を比較的一定レベルで放出する。徐放製剤内に含まれる活性化合物の量は、埋め
込み部位、放出の速度および予想される期間、ならびに治療または予防すべき疾
患の特性に依存する。

【００６１】 HSV感染細胞を標的とする抗原特異的免疫応答の産生を促進する多様な輸送媒
体のいずれも、薬学的組成物およびワクチン内で用いてもよい。輸送媒体には、
樹状細胞、マクロファージ、B細胞、単球、および効率的なAPCとなるように操作
されるその他の細胞のような抗原提示細胞（APC）が含まれる。そのような細胞
は抗原提示能を増加するように、T細胞反応の活性化および／または維持を改善
するために、それ自身抗ウイルス作用を有するように、および／または受ける側
と免疫学的に適合するように（すなわち、マッチしたHLAハプロタイプ）遺伝子
改変してもよいが、必ずしもその必要はない。APCは一般的に、腫瘍および腫瘍
周辺組織を含む多様な生体液および臓器のいずれかから単離してもよく、自家、
同種異系、同系、または異種細胞であってもよい。

【００６２】 本発明の特定の好ましい態様は、抗原提示細胞として樹状細胞またはその前駆
細胞を使用する。樹状細胞は非常に強力なAPC（バンチェリュー＆スタインマン
（Banchereau and Steinman）、Nature 392：245〜251）であり、予防または治
療免疫を誘起するための生理学的アジュバントとして有効であることが示されて
いる（チマーマン＆レビー（Timmerman and Levy）、Ann. Rev. Med. 50：507〜
529、1999を参照のこと）。一般的に、樹状細胞は他の典型的な形状（インサイ
チューで星状、インビトロで著しい細胞質突起（樹状突起））に基づいて、そし
て標準的なアッセイ法を用いて決定されるように、B細胞（CD19およびCD20）、T
細胞（CD3）、単球（CD14）、およびナチュラルキラー細胞（CD56）の分化マー
カーがないことに基づいて同定してもよい。樹状細胞は当然、インビボまたはエ
クスビボにおいて樹状細胞上に一般的に認められない特異的細胞表面受容体、ま
たはリガンドを発現するように操作してもよく、そのように改変された樹状細胞
も本発明に含まれる。樹状細胞の代用として、分泌された小胞抗原負荷樹状細胞
（エキソソームと呼ぶ）をワクチンにおいて用いてもよい（チトフォーゲル（Zi
tvogel）ら、1998、Nature Med. 4：594〜600）。

【００６３】 樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周囲組織浸潤
細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、またはその他の如何なる適した組織もし
くは体液から得てもよい。例えば、樹状細胞はGM-CSF、IL-4、IL-13および／ま
たはTNFαのようなサイトカインの組合せを末梢血から回収された単球の培養に
加えることによってエクスビボで分化させてもよい。または、末梢血、臍帯血も
しくは骨髄から回収されたCD34陽性細胞は、培養培地にGM-CSF、IL-3、TNFα、C
D40リガンド、LPS、flt3リガンドおよび／または樹状細胞の成熟および増殖を誘
導する他の化合物を加えることによって、樹状細胞に分化させてもよい。

【００６４】 樹状細胞は従来、「未成熟」および「成熟」細胞として分類され、これによっ
て、２つの十分に特徴付けされた表現型を単純な方法で識別することが可能であ
る。しかし、この命名法は、分化の可能な中間段階を全て排除するように構築し
てはならない。未成熟な樹状細胞は、抗原の取り込み能とプロセシング能が高い
ことからAPCとして特徴付けされるが、これはFcγ受容体、マンノース受容体、
およびDEC-205マーカーの高い発現と相関する。成熟表現型は典型的に、これら
のマーカーの発現がより低いが、クラスIおよびクラスII MHC、接着分子（例え
ば、CD54およびCD11）、ならびに共刺激分子（例えば、CD40、CD80、およびCD86
）のようなT細胞活性化に関与する細胞表面分子の発現が高いという特徴を有す
る。APCは、一般的に、ポリペプチド、またはその免疫原性部分が細胞表面に発
現されるように、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにトランスフェク
トさせてもよい。そのようなトランスフェクションはエクスビボで起こってもよ
く、そのようなトランスフェクトした細胞を含む組成物またはワクチンを、本明
細書に記述のように治療目的で用いてもよい。または、樹状細胞もしくはその他
の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達媒体を患者に投与して、その結果インビ
ボでトランスフェクションが起こるようにしてもよい。樹状細胞のインビボおよ
びエクスビボトランスフェクションは、例えば、一般的に国際公開公報第94/244
47号に記載の方法、またはマービ（Mahvi）ら（1997、Immunology and Cell Bio
logy 75：456〜460）に記述の遺伝子銃アプローチのような当技術分野で既知の
如何なる方法を用いて実施してもよい。樹状細胞の抗原負荷は、樹状細胞もしく
は前駆細胞を、腫瘍ポリペプチド、DNA（裸、もしくはプラスミドベクター内で
）、またはRNAと共に；または抗原発現組換え型細菌もしくはウイルス（例えば
、ワクシニア、鶏痘、アデノウイルス、もしくはレンチウイルスベクター）と共
にインキュベートすることによって行ってもよい。負荷の前に、ポリペプチドは
T細胞の助けを提供する免疫学的パートナー（例えば、担体分子）に共有結合さ
せてもよい。または、樹状細胞は、個別に、またはポリペプチドの存在下で非結
合免疫学的パートナーによってパルスしてもよい。

【００６５】組成物の投与 治療には予防と治療法が含まれる。予防または治療は単回直接注射を１回また
は多数回行うことによって達成される。投与はまた、複数の部位にほぼ同時に行
うことができる。

【００６６】 患者または被験者には、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ブタ、およびヒツジ
動物のような哺乳類が含まれる。

【００６７】 組成物は典型的にインビボで非経口投与（例えば、静脈内、皮下、および筋肉
内）、または経頬／舌下、直腸、経口、点鼻、局所（経皮および点眼のような）
、膣内、肺内、動脈内、腹腔内、眼内、もしくは鼻腔内経路のような他の従来の
直接経路によって、または特定の組織に直接投与してもよい。

【００６８】 組成物は如何なる適した方法、しばしば薬学的に許容される担体と共に投与す
る。本発明の文脈において患者に細胞を投与する適した方法が利用可能であり、
特定の細胞組成物を投与するために１つ以上の経路を用いることができるが、特
定の経路はしばしば、もう一つの経路より即時的でより有効な反応を提供しうる
。

【００６９】 本発明の文脈において、患者に投与される用量は、患者において経時的に有益
な治療反応を示すために、または感染症もしくは感染症による疾患を阻止するた
めに十分でなければならない。このように、組成物は特定の抗原に対する有効な
免疫応答を誘起するために、および／または疾患もしくは感染症による症状およ
び／または合併症を緩和、減少、治癒、もしくは少なくとも部分的に阻止するた
めに十分な量で患者に投与される。これを行うために適当な量は「治療的有効量
」として定義される。

【００７０】 用量は、生産された組成物の活性および患者の状態と共に、治療すべき患者の
体重または体表面積によって決定される。用量の大きさは、特定の患者において
特定の組成物の投与に伴う有害な副作用の存在、性質、および程度によって決定
される。HSV感染症のような疾患の治療または予防において投与される組成物の
有効量を決定する場合、医師はウイルスに対する免疫応答の産生、疾患の進行お
よび治療に関連した如何なる毒性も評価する必要がある。

【００７１】 例えば、サブユニットHSV蛋白質を含むワクチンまたはその他の組成物は、１
用量あたりHSV蛋白質を１〜10,000 μgを含みうる。好ましい態様において、HSV
蛋白質の10〜1000 μgがそれぞれの用量に含まれ、より好ましい態様において、
１用量あたりHSV蛋白質10〜100 μgが含まれる。好ましくは用量は、１回の投与
で十分である、または複数回を数ヶ月間にわたって投与するように選択する。HS
Vポリヌクレオチドまたはペプチドを含む組成物では、１用量あたり類似の量を
投与する。

【００７２】 一つの態様において、１〜10用量を52週間にわたって投与してもよい。好まし
くは６用量を１ヶ月間隔で投与し、追加ワクチン接種をその後定期的に行っても
よい。別のプロトコールが個々の患者に適当であるかも知れない。適した用量は
上記のように投与した場合、抗ウイルス免疫応答を促進することができ、しかも
基礎（すなわち無処置）レベルから少なくとも10〜50％上である化合物の量であ
る。そのようなワクチンは同様に、非ワクチン接種患者と比較してワクチン接種
した患者では臨床転帰の改善に至る免疫応答を引き起こすことができるはずであ
る。一般的に、１つまたは複数のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチ
ンに関して、それぞれのポリペプチドの量は約100 μg〜５ mg/kg宿主の用量範
囲で存在する。好ましくは、量は約10〜約1000 μg／用量である。適した投与容
量は患者の体格、年齢、および免疫状態に応じて変化するが、典型的に、約0.1
ml〜約5 mlであり、約1 ml未満の容量が最も一般的である。

【００７３】 免疫細胞を含む組成物は好ましくは、組成物を投与する被験者から得られた免
疫細胞から調製する。または免疫細胞はHLA適合ドナーから調製することができ
る。免疫細胞は、当技術分野で既知の従来の技術を用いて被験者またはドナーか
ら得て、本発明のエピトープを提示するように改変されたAPCに暴露して、エク
スビボで増殖させ、被験者に投与する。エクスビボ療法のプロトコールは、ロー
ゼンバーグ（Rosenberg）ら（1990、New England J. Med. 9：570〜578）に記載
されている。さらに、組成物は本発明のエピトープを提示するように改変された
APCを含みうる。

【００７４】 免疫細胞は一般的に、本明細書に記述のようにインビトロでの増殖によって、
養子免疫療法にとって十分な量で得てもよい。単一の抗原特異的エフェクター細
胞を、抗原認識を保持しながら数十億個までインビボで増殖させるための増殖条
件は当技術分野で周知である。そのようなインビトロ培養条件は典型的に、しば
しばサイトカイン（IL-2のような）および非分裂フィーダー細胞の存在下で、抗
原による間欠的刺激を利用する。上記のように、本明細書に提供した免疫反応性
ポリペプチドを用いて、免疫療法にとって十分な細胞数が得られるように抗原特
異的なT細胞培養を濃縮および迅速に増殖させてもよい。特に、樹状細胞、マク
ロファージ、単球、繊維芽細胞および／またはB細胞のような抗原提示細胞を、
当技術分野で周知の標準的な技術を用いて、免疫反応性ポリペプチドによってパ
ルスしてもよく、または１つもしくは複数のポリヌクレオチドにトランスフェク
トさせてもよい。例えば、抗原提示細胞は、組換え型ウイルスまたはその他の発
現系において発現を増加させるために適当なプロモーターを有するポリヌクレオ
チドにトランスフェクトさせることができる。治療において用いられる培養エフ
ェクター細胞は、増殖して広く分布し、インビボで長期間生存することができな
ければならない。培養エフェクター細胞がインビボで増殖してIL-2を加えた抗原
による繰り返し刺激によって実質的な数で長期間生存するように誘導することが
できることは、研究によって示されている（例えば、チーバー（Cheever）ら、1
997、Immunological Reviews 157：177）。

【００７５】 本明細書に記載、または当技術分野で既知の多くの投与経路は、針、カテーテ
ル、または関連する装置を用いて、１回または複数回の直接投与によって単に行
ってもよい。

【００７６】同定された抗原のインビボ試験 従来の技術を用いて、同定されたHSV抗原のインビボ有効性を確認することが
できる。例えば、一つの技術はマウスチャレンジモデルを利用する。しかし、当
業者はこれらの方法が定常的なものであり、他のモデルを用いることができるこ
とを認識すると思われる。

【００７７】 試験すべき化合物または組成物が調製されたら、マウスまたは他の被験者を一
連の注射によって免疫する。例えば、10回までの注射を数ヶ月間にわたって投与
することができ、典型的には投与の間隔を１〜４週間あける。一連の最後の注射
の後、等しく致命的容量であることが確立されたウイルスの用量を被験者にチャ
レンジする。対照群にはプラセボを投与するが、実験群は能動的にワクチン接種
する。または、試験は致命的用量以下の用量を用いてデザインすることができる
。選択的に、用量反応試験を含むことができる。本試験において測定すべき終点
には、死亡および例えば脊髄歩行によって示されるような重度の神経障害が含ま
れる。生存動物を屠殺して、脊髄、脳、および注射部位を含む重要な臓器の定量
的なウイルス培養を行うことができる。組織試料中に基底として存在するウイル
ス量を測定することができる。組成物はまた、治療ワクチンとしての有効性を確
認するために、既に感染させた動物において再発が減少するか否かを調べること
ができる。

【００７８】 有効性はIC₅₀を計算することによって決定することができ、これは被験者の50
％を死亡から保護するために必要な体重１キログラムあたりのワクチンのマイク
ログラムを示す。IC₅₀は、用いるチャレンジ用量に左右される。さらに、ワクチ
ンの特定の用量を投与される被験者の半数を死亡させるために必要な感染単位数
を示す、IL₅₀を計算することができる。死後のウイルス力価を定量すれば、ウイ
ルス複製が免疫系によって制限されることが確認される。

【００７９】 次の試験段階は、膣内接種チャレンジであると考えられる。急性の保護試験で
は、マウスを用いることができる。モルモットは急性の防護および再発の予防の
双方について調べることができるため、モルモットは、ヒトでの作用を推定する
場合により生理学的に適切な被験体となる。このタイプのチャレンジでは、非致
死量を投与すると、モルモット被験体は病変を発症するが、これは治癒して再発
する。測定手段には急激な疾患の改善および病変の再発の双方が含まれうる。ワ
クチンまたは他の組成物による介入は、接種の前後に、予防と治療のいずれを調
べたいかに応じて行うことができる。

【００８０】方法 本発明は、被験体におけるHSV感染症を治療および／または予防する方法を提
供する。本方法は、本発明の組成物を被験体に投与することを含む。組成物は治
療的または予防的ワクチンとして用いることができる。一つの態様において、HS
VはHSV-2である。または、HSVはHSV-1である。本発明はさらに、HSV複製を阻害
する、HSV感染細胞を死滅させる、抗ウイルスおよび／または免疫調節活性を有
するリンフォカインの分泌を増加させる、ならびにヘルペス特異的抗体の産生を
増強する方法を提供する。本方法は、例えば、本明細書に提示した実施例に記述
のように、HSV感染細胞を、本発明の抗原に対して産生された免疫細胞に接触さ
せる段階を含む。接触させる段階は、インビトロで行うこともインビボで行うこ
ともできる。好ましい態様において、免疫細胞はT細胞である。T細胞には、CD4
およびCD8 T細胞が含まれる。本発明の組成物は、眼の疾患、例えばヘルペス角
膜炎のような免疫病理疾患に対して認容される物質として用いることができる。

【００８１】 さらに、本発明は、HSVに対して指向された免疫細胞を産生する方法を提供す
る。本方法は、抗原提示細胞が本発明のポリペプチドに含まれる抗原を提示する
ように改変される、免疫細胞を抗原提示細胞に接触させる段階を含む。好ましく
は、抗原提示細胞は樹状細胞である。細胞は例えば、ペプチドの負荷、またはポ
リペプチドをコードする核酸配列による遺伝子改変によって改変することができ
る。一つの態様において、免疫細胞はT細胞である。T細胞にはCD4およびCD8 T細
胞が含まれる。同様に、この方法によって産生される免疫細胞が提供される。免
疫細胞はHSV複製を阻害する、HSV感染細胞をインビトロもしくはインビボで死滅
させる、抗ウイルスおよび／または免疫調節活性を有するリンフォカインの分泌
を増加させる、ヘルペス特異的抗体産生を増強する、または被験体におけるHSV
感染症を治療または予防するために用いることができる。

【００８２】 本発明は、感染性生物に関連した免疫原性エピトープを同定する方法を提供す
る。一つの態様において、本方法は、生物のゲノムのランダムな断片の集合体を
調製する段階を含む。調製する段階は、完全なゲノムから始める必要はないが、
全ゲノムを消化する段階を含みうる。消化する段階は、好ましくは所望の範囲の
長さを有するランダム断片の集合体を得るために、ゲノムを１つまたは複数の制
限酵素に接触させる段階を含む。または、目的とするゲノムを含む材料を超音波
処理、霧状にする、またはその他の処理を行って、適当な大きさのゲル断片から
単離することができる。

【００８３】 消化する段階および制限酵素の選択は、平均的な長さのT細胞エピトープより
長いゲノム断片、例えば長さが約30ヌクレオチド以上を得るようにデザインされ
る。好ましくは、断片は遺伝子の停止がまれであるように十分に小さい、例えば
長さが約200〜約500塩基対である。関係する生物のゲノム配列または制限マップ
が既知であれば、ゲノムを分析して、適当な制限酵素によってターゲティングす
ると、適当な長さの断片が所望の数得られる制限部位を同定することができる。
制限酵素は同様に、用いるクローニングベクターと適合性である部位を標的とす
るように選択することができる。

【００８４】 ランダム断片を用いて、断片によってコードされるポリペプチドを発現するこ
とができる。断片は個別に発現することができ、または好ましくは単独のポリペ
プチドのプールとして、もしくは融合蛋白質としてのポリペプチドのプールとし
て発現することができる。当業者は、開始材料としてDNAまたはRNAのいずれかか
らポリペプチドを発現することができることを認識すると思われる。例えば、RN
Aウイルスからのポリペプチドの発現は、RNA断片からcDNAをまず調製し、次にcD
NAを用いてポリペプチドを発現させることによって行うことができる。好ましく
は、ポリペプチドは不溶性の封入体として発現される。ポリペプチドを不溶性の
封入体として発現させることによって、容易にプロセシングされ、APCによって
提示される形で大量のポリペプチドを発現することができる。封入体として発現
された蛋白質は精製が容易で、発現およびプロセシングにとって非常に効率的な
方法を提供し、シークエンシングされていない生物への方法の適用を容易にする
。

【００８５】 ポリペプチドは、ゲノムの断片を含むベクターから発現することができる。好
ましい態様において、ベクターは、pUEXベクターのようなプラスミドである。当
業者は、インサートからポリペプチドを発現させることができるその他のベクタ
ーを用いることができることを認識すると思われる。好ましくは、ポリペプチド
は融合蛋白質として発現される。好ましい融合蛋白質の１つの例は、不溶性のβ
-ガラクトシダーゼ融合蛋白質である。一つの態様において、発現する段階は、
ゲノムの断片を含むベクターによって形質転換された宿主細胞を培養する段階を
含む。本方法の好ましい態様において、断片は異なる３つの読みとり枠において
発現ベクターに、双方向でライゲーションされる。

【００８６】 本方法はさらに、発現されたポリペプチドを回収する段階を含む。例えば、培
養宿主細胞によって発現されたポリペプチドは、培養宿主細胞から上清を採取す
ることによって回収することができる。回収されたポリペプチドは、標準的な技
術を用いて上清からさらに精製することができる。不溶性の封入体として発現さ
れたポリペプチドは、例えば、ネオフィトウ（Neophytou）ら、1996、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 93：2014〜2018に記述のように、不溶性の封入体の超音波処
理、リゾチーム、および洗浄剤を用いた単離によって回収することができる。

【００８７】 本方法はさらに、発現されたポリペプチドの免疫応答誘発能をアッセイする段
階を含む。免疫応答の誘発能は、ポリペプチド内に免疫原性エピトープが存在す
ることを示す。一つの態様において、免疫応答は細胞性免疫応答である。アッセ
イする段階は、T細胞刺激または活性化を測定するアッセイ法を実施する段階を
含みうる。T細胞の例にはCD4およびCD8 T細胞が含まれる。

【００８８】 T細胞刺激アッセイ法の一つの例は、下記の実施例１、またはコエル（D.M. Ko
elle）ら（1994、J. Virol. 68(5）：2803〜2810に記載のような、T細胞増殖ア
ッセイ法である。T細胞増殖アッセイ法は、例えば、抗原提示細胞およびウイル
スに対して向けられたT細胞へ発現されたポリペプチドを接触する段階、ならび
にT細胞増殖を測定する段階を含みうる。T細胞増殖は、³H-チミジンの取り込み
またはその他の増殖マーカーを測定することによって測定することができる。増
殖アッセイ法は、対照抗原に反応したT細胞増殖と比較して、試験抗原に暴露し
たT細胞において増殖の増加が検出されれば、T細胞刺激を示す。増殖が増加して
いることの１つの例としての基準は、対照培養細胞と比較して、沈殿した試験核
酸調製物に取り込まれた³Hチミジンの液体シンチレーション計数に基づく１分間
あたりの数（cpm）の統計学的に有意な増加である。T細胞刺激または活性化を調
べるアッセイ法のもう一つの例は細胞溶解アッセイ法である。細胞溶解アッセイ
法の一つの例を、下記の実施例１に提供する。

【００８９】 アッセイ法は、活性部分を含むプールを同定するためにポリペプチドのプール
について実施することができる。次に、目的とするポリペプチドを単離するため
に当初のプールの漸減するサブセットについてさらなるアッセイ法を実施するこ
とができる。目的とする断片、例えばそのウイルスインサートを有するプラスミ
ドを含む材料を精製して、ウイルス断片をシークエンシングすることができる。
得られた配列情報に基づいて、同定された抗原のその後の試験および確認を行う
ために、合成ペプチドを調製することができる。断片のシークエンシングによっ
ても、新規遺伝子が同定されうる。

【００９０】 ゲノム断片の小断片が調製される、上記の方法の段階を繰り返すことができる
。最小のエピトープを決定するために、漸減する断片を発現させて試験すること
ができる。

【００９１】 本発明の方法は、細菌、寄生虫およびウイルスを含む多様な感染性微生物に適
用することができる。好ましいウイルスは、イントロンを含まないDNA、または
ほとんどがコード配列を含むウイルスである。ウイルスの例には、二本鎖DNAウ
イルス、一本鎖DNAウイルス、二本鎖RNAウイルスおよび一本鎖RNAウイルスが含
まれる。二本鎖DNAウイルスの例には、エプスタイン-バーウイルス（EBV）、サ
イトメガロウイルス（CMV）、単純ヘルペスウイルス-1（HSV-1）、HSV-2、水痘-
帯状疱疹ウイルス（VZV）、ヒトヘルペスウイルス-6（HHV-6）、HHV-7、HHV-8、
ポックスウイルスおよびアデノウイルスが含まれるがこれらに限定されない。一
本鎖DNAウイルスの例にはパルボウイルスが含まれるがこれらに限定されない。
二本鎖RNAウイルスの例には、レトロウイルスおよびレオウイルスが含まれるが
これらに限定されない。一本鎖RNAウイルスの例にはパラミクソウイルス、ミク
ソウイルス、およびフラビウイルスが含まれる。

【００９２】 本方法は、生物の核酸配列が既知である必要がないため、非常に大きな生物学
的多様性（例えば、HIVおよびHCV）を示す感染性生物に対抗するための方法を提
供する。高い多様性を示すウイルスに関して、特定の患者、特定の部位（例えば
、血液、皮膚、子宮頸部）、または既知の核酸配列のプロトタイプ系統とは異な
る可能性がある、特定の地理的地域または患者集団に分布する代表的なウイルス
株に由来するウイルス核酸材料源を用いることが有利である。

【００９３】 本発明はまた、診断アッセイ法を提供する。診断アッセイ法は、ヘルペス感染
症を有することが疑われる患者の免疫応答性を同定し、特定の治療経過に対する
被験者の反応性を予想するために用いることができる。アッセイ法は、適当なAP
Cに関連して、本発明の抗原に被験者のT細胞を暴露する段階、および例えば、IF
Nγ、増殖または細胞障害性を測定することによって免疫反応性を試験する段階
を含む。適したアッセイ法は、実施例においてより詳細に説明する。

【００９４】実施例 以下の実施例は、本発明を説明するため、そして当業者が本発明を実施および
用いる際に役立つように提供する。実施例はいずれにせよ本発明の範囲を制限す
るものではない。

【００９５】実施例１：HSV-2外皮蛋白質におけるウイルスエピトープの同定 本実施例は、T細胞抗原を同定するために、完全長のウイルスDNAによる発現ク
ローニングの使用を示す。発現クローニングによって見出された病変浸潤T細胞
によって認識された５つのHSVエピトープを本明細書に記述する。同様に、発現
クローニング以外の方法によって見出されたVP16の幾つかのエピトープも開示す
る。

【００９６】 ウイルスおよび細胞 HSV-1株E115（スプルアンス＆チョウ（S.L. Spruance＆F.S. Chow）、1980、J
. Infect. Dis. 142：671〜675）、HSV-2株333（キット（S. Kit）ら、1983、Bi
ochem. Biophys. Acta. 741：158〜170）、中間型組換え型ウイルスRS1G31（パ
ラ（M.F. Para）ら、1983、J. Virol. 45：1223〜1227）、DX32（プレストン（V
.G. Preston）ら、1978、J. Virol. 28：499〜517）、およびRP-2（コエル（D.M
. Koelle）ら、1994、J. Virol. 68：2803〜2810）を増殖させて、Vero細胞にお
いて力価を測定した（コエル（D.M. Koelle）、1993、J. Clin. Invest. 91：96
1〜968）。エプスタイン-バーウイルス形質転換リンパ球連続株（EBV-LCL）（コ
エル（D.M. Koelle）ら、1993、上記）には、性器ヘルペスを有するドナーから
の自家株、HLA DPB1^*0402 HOM2のホモ接合体であるAMAI、HLA DQB10501のホモ接
合体であるHOM2、HLA DQB1^*0201のホモ接合体であるMAT、およびHLA DPB1^*2001
のホモ接合体であるARENT、が含まれた（ボドマー（J.G. Bodmer）ら、1996、Ti
ssue Antigens 49：297〜321）。

【００９７】 HSV特異的T細胞を、機関調査委員会（Institutional Review Board）による承
認後に得た。ほとんどのクローンは抗原による二次的なインビトロ刺激を行うこ
となく得られた。ドナー１、２、および４は、既に記述した通りの番号であり（
コエル（D.M. Koelle）ら、1994、J. Virol. 68：2803〜2810）、それぞれ病変
由来クローン1.L3D5.10.8、2.3および4.2E1の起源であった；クローン2.3および
4.2E1については既に記述されている（コエル（D.M. Koelle）ら、1994、上記）
。さらなる病変由来クローンは、ドナーESから生じ、クローンESL2.20、ESL3.33
5、ESL4.34、およびESL4.9はその第二、第三、および第四の病変試料（それぞれ
１年間隔があいている）に由来し、そしてドナーRHおよびKMに由来した。クロー
ン2.3、4.2E1、ESL2.20、RH.13およびKM.17は、ヘルペス小胞液に直接由来した
（コエル（D.M. Koelle）ら、1994、J. Infect. Dis. 169：956〜961）。CD4 TC
C ESL4.9を誘導するために、再発性の性器HSV-2病変の生検（症状の３日目）を
実施して、バルク病変浸潤細胞を記述のように（コエル（D.M. Koelle）ら、199
8、J. Clin. Invest. 101：1500〜09）アシクロビルの存在下でPHAおよびIL-2（
シアペレリ・バイオシステムズ、コロンビア、メリーランド州）によって増殖さ
せた。16日後、細胞を１個／ウェルの割合でクローニングした（コエル（D.M. K
oelle）ら、1994、J. Infect. Dis. 169：956〜961）。既に記述されたVP16特異
的クローン1A.B.25、ESL3.334、およびESL4.34（ドハーティ（D.G. Doherty）ら
、1996、Human Immunol. 47：149）；ジェローム（K.R. Jerome）ら、1998、J.
Virol. 72：436〜441）；コエル（D.M. Koelle）ら（1997、Human Immunol. 53
：195〜205）についても同様に、バルク培養から誘導した。

【００９８】 幾つかのクローンは、抗原による二次的なインビトロ刺激を用いて誘導した。
さらなるTCCをドナー１から誘導するために（コエル（D.M. Koelle）ら、1994、
J. Virol. 68：2803〜2810）、クローン1A.B.25（上記）を誘導した再発後６年
目に得られた４つの2 mm生検のそれぞれからPHS由来バルク培養を調製した。16
日後、１つの生検培養からのバルクリンパ球1.5×10⁶個を、HSV-2 VP22 105-190
（下記参照）10 μg/mlおよびT細胞培地2 ml中で放射線照射した（3300 rad）自
家PBMCの同数を用いて刺激した。IL-2（32 U/ml）を６日目から加えた。TCC 1.L
3D5.10.8を、記述のようにこの株から12日目に単離した（コエル（D.M. Koelle
）ら、1994、上記）。IL-2（32 U/ml）は６日目から加え始めた。TCC 1.L3D5.10
.8を、記載に従って12日目にこの系統から単離した（D.M.Koelleら、1994、前記
）。PBMC由来TCCSB.17およびBM.17を作製するために、25ウェルプレートにおい
てHSV-2血清陽性ドナーSBおよびBMのPBMC 1.5×10⁶個をバキュロウイルス由来完
全長VP16の4 μg/mlによって12日間刺激して、反応した細胞を細胞１個／ウェル
の割合でクローニングした。TCCおよび株は、最後の刺激後10〜14日に用いた。

【００９９】 全ての細胞株は、ARENTを除きマイコプラズマ陰性であった。ARENTは、当初、
DNAプローブ試験（ゲンプローブ、サンジエゴ、カリフォルニア州）によってマ
イコプラズマ陽性であり、シプロフロキサシン10 μg/mlによって使用前２週間
処置したところ（ギグナック（Gignac）ら、1991、Leukemia 5：162〜165）、試
験は陰性に変換した。

【０１００】 フローサイトメトリー ヒトCD4（クローンSFCI 12T4D11）およびCD8（ヒトCD8のα鎖を認識するクロ
ーンSFC 21Thy 2D3）に対するマウスmAbの組合せをフローサイトメトリーに用い
た（コールター、ヒアレー、フロリダ州）。

【０１０１】 イムノブロット HSV-感染Vero細胞の溶解物を調製して、10％SDS-PAGEゲルによって電気泳動し
て、記載のようにニトロセルロース膜に移した（アシュレイ（R.A. Ashley）ら
、1988、J. Clin. Microbiol. 26：662〜667）。ブロットはPBS-0.05％ツイーン
20-１％脱脂紛乳によってブロックした。抗原は、U_L49の遺伝子産物VP22に対し
て特異的であるmAb P43の100倍希釈液（エリオット（G.D. Elliott）ら、1992、
J. Gene Virol. 73：723〜736）、アフィニティ精製ヤギ抗マウスIgM-ペルオキ
シダーゼ結合体（シグマ、セントルイス、ミズーリ州）、およびTMB基質系（カ
ークガード＆ペリー（Kirkegaard and Perry）、ガイサースバーグ、メリーラン
ド州）と共に順に連続的にインキュベーションして、各段階の間にPBS-ツイーン
による洗浄（５分を３回）を行うことによって、検出した。

【０１０２】 ウイルスDNAライブラリとクローニング サブゲノムDNAに関して、HSV-2株HG-52 BamHI w断片をBglII i断片からサブク
ローニングしてゲル精製した。ウイルスDNAをSma Iによって消化して、BamHI 末
端をクレノウDNAポリメラーゼによって平滑にし、DNA断片はフェノール抽出およ
びアルコール沈殿によって精製した。全ウイルスDNAに関しては、コンフルエン
トVero細胞をHSV-2株HG52に感染させた。150 cm²細胞培養物３個からの全核酸を
プロテイナーゼK消化、クロロホルム-フェノール抽出、およびイソプロパノール
沈殿によって調製した。得られた材料をレンジHによって処理して、再度抽出し
て沈殿させた。HG52 DNAの一部（１μg）をSma IまたはAlu Iによって消化して
、これらの消化物の80％を合わせて、発現ライブラリを作製するために上記のよ
うに回収した。

【０１０３】 発現クローニングはpUEXベクターを用いて実施した（ブレッサン（G.M. Bress
an）ら、1987、Nucleic Acids Res. 15：10056）。pUEX-1、-2、および-3 DNAを
Sma Iによって線状にして、仔ウシ腸ホスファターゼによって脱燐酸化してゲル
精製した。ベクター約100 ngおよびDNA断片500 ngをライゲーションしてエタノ
ール沈殿反応混合物の10％を用いて、１ mmキュベットで電気穿孔（BTX、サンジ
エゴ、カリフォルニア州）によって大腸菌株DH10エレクトロマス（Electromas）
（GIBCO）を形質転換した。SOC培地１ mlで１時間回収した後、一部をグリセロ
ール保存液（それぞれ100 μl）として凍結して、アンピシリンプレート上で30
℃で力価を測定するか（250 μl）、または融合蛋白質ライブラリを作製するよ
う蛋白質を誘導するために直接（250 μl）用いた。１形質転換あたりアンピシ
リン抵抗性コロニー数千個を単離した。ゲノムライブラリを増幅するために、グ
リセロール保存液を2YT-アンピシリンの存在下で30℃で一晩増殖させて、再度凍
結した。

【０１０４】 VP22 105-190、U_L50 118-312、およびU_L50 118-250の確認用サブクローニング
は、U_L49の262塩基対Sma I-Stu I断片、U_L50の583塩基対Sma I断片、またはU_L50
の397塩基対Sma I-Stu I断片を単離することによってそれぞれ実施した。断片は
、ほぼ直鎖状にした、ゲル精製pUEXベクターにクローニングして、蛋白質を大腸
菌DH51で発現させた。構築物はシークエンシングによって確認した。

【０１０５】 抗原 10⁸〜10⁹ pfu/mlを含む全ウイルス調製物を30分間のUV照射によって不活化し
て（ミクロスカ＆カニンガム（A. Mikloska and A.L. Cunningham）、1998、J.
Gen. Virol. 79：353〜361）、最終希釈率100倍の希釈液で用いた。VP22のペプ
チドは、記述通りに合成して（コエル（D.M. Koelle）ら、1997、Human Immunol
. 53：195〜205）、2 mg/ml のDMSO保存液として用いた。長さアミノ酸13個で４
つのアミノ酸が重なり合うU_L48のペプチド、いずれもバキュロウイルスに発現さ
せた、HSV-2アミノ酸１〜416位のVP16および完全長のVP16は、カイロンコーポレ
ーション、エメリービル、カリフォルニア州から得た。

【０１０６】 細菌由来蛋白質抗原発現は30℃で2YT-アンピシリンブロスにおいて、対数的に
増殖する細胞において（OD₆₀₀ 0.4〜0.6）42℃で２時間誘導した。蛋白質は記述
のように精製して（ネオフィトウ（P.I. Neophytou）ら、1996、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA 93：2014〜2018）、ゲル精製を省略した。50 ml（ライブラリ）ま
たは５〜10 ml培養液（プールおよびクローン）の細菌培養によって、PBS 200〜
400 μl中に微粒子懸濁液が得られた（カルシウム、マグネシウム不含）。蛋白
質濃度は、１％SDS中で60℃で10分間蛋白質を溶解した後、BCA（ピアス社、ロッ
クフォード、イリノイ州）によって決定した。幾つかの実験において、熱誘導細
菌をPBSおよびPBS/10 mM EDTAによって洗浄して、56℃で10分間加熱して、PBSで
洗浄してから抗原として使用した。

【０１０７】 ウイルスDNAの活性なライブラリを同定した後、抗原の同定には、サブゲノム
ウイルスDNA断片に関しては30〜60クローン、完全長のウイルスDNAに関しては2,
000〜3,000クローンを用いた。あまり複雑でないライブラリに関しては、それぞ
れのクローンの1 ml培養液を６〜８クローンのプールとして処理した。活性なプ
ール内の個々のプール、および既知のウイルスDNA断片を含む確認用サブクロー
ンを5 ml培養液として処理した。組合せ法（ネオフィトウ（P.I. Neophytou）ら
、1996、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：2014〜2018）を用いて全ウイルスDNA
からのライブラリをスクリーニングした。形質転換した細菌の増幅ライブラリの
グリセロール保存液をアンピシリンプレート上で力価を測定した；20〜30コロニ
ー／ウェルを回転シェーカー上で96ウェルプレートにおいて30℃で一晩培養した
。培養を１ ml培養液に100倍希釈して、融合蛋白質合成を上記のように誘導した
。培養の一部（400 μl）を蛋白質精製およびリンパ球増殖アッセイ法での評価
のために横の行と縦の列にプールした。１つ以上の行と列が陽性であれば、陽性
の行と陽性の列が交差するウェルを用いて５〜10 mlの培養から蛋白質を調製し
て陽性ウェルを明確に同定した。細菌の培養物（n＝96コロニー）は、陽性ウェ
ルから希釈したブロスを播種したアンピシリンプレートから誘導した。これらは
プール（細菌コロニー12個の）として評価して、その後個々のクローンとして評
価した。

【０１０８】 リンパ球機能アッセイ法 １試料あたり３本ずつの増殖アッセイウェルは、クローニングしたT細胞10⁴個
、抗原提示細胞（APC）として放射線照射した（3300 rad）PBMC 10⁵個または放
射線照射した（8000 rad）EBV-LCL 2.5×10⁴個、および抗原のT細胞培地200 μl
（コエル（D.M. Koelle）ら、1997、Human. Immunol. 53：195〜205）を96ウェ
ルU底プレートに含んでいた。熱殺菌した細菌を抗原として用いる場合、10⁵ cfu
/ウェル（不活化前）の等量を加えて、ゲンタマイシン（20 μg）を加えた。72
時間後、³Hチミジン１μCi/ウェルを18時間加えて、細胞を回収し、チミジンの
取り込みを液体シンチレーション計数によって評価した。標準偏差は平均値の10
％未満であった。結果は平均cpmまたはδcpm＝実験抗原の平均cpm−対照抗原の
平均cpmとして報告する。対照抗原は、全ウイルス抗原に関しては偽感染細胞溶
解物であり、組換え型蛋白質調製物に関してはpUEX2-由来β-ガラクトシダーゼ
であった。バルク培養病変由来T細胞の反応性を決定するために、融合蛋白質ま
たは対照β-ガラクトシダーゼを10 μg/mlで用いた。HSV-2の糖蛋白質BおよびD
ならびにVP16を１μg/mlで用いて、アッセイ法は既に記述されたように実施した
（コエル（D.M. Koelle）ら、1998、J. Clin. Invest. 101：1500〜09）。HLA制
限座を決定するために、HLA DR特異的mAb L243（プレストン（V.G. Preston）ら
、1978、J. Virol. 28：499〜517）、HLA-DP特異的mAb B7.21（ワトソン（A.J.
Watson）ら、1983、Nature 304：358〜360）、またはHLA-DQ特異的mAb SpV-L3（
スピッツ（H. Spits）ら、1984、Eur. J. Immunol. 14：299〜304）を記述通り
に用いた（コエル（D.M. Koelle）ら、1994、J. Virol. 68：2803〜2810）。

【０１０９】 細胞溶解アッセイ法は、記述のように（コエル（D.M. Koelle）ら、1998、J.
Clin. Invest. 91：961〜968）４時間の⁵¹Cr放出を用いて１試料あたり３本ずつ
実施した。標的EBV-LCLをHSV-3に感染多重度30で18時間感染させるか、または記
述のように洗浄前に90分間ペプチド1.0 μMをパルスした（クォク（W.W. Kwok）
ら、1996、J. Exp. Med. 183：1253〜1258）。エフェクター対標的比は、20：１
であった。自然発生放出は28％未満であった。

【０１１０】 DNAシークエンシング 活性蛋白質を生じる細菌のプラスミドにおけるウイルスインサートは、プライ
マーCATGGCTGAATATCGACGGT（配列番号：１；インサートの5'末端）およびCTAGAG
CCGGATCGATCCGGTC（配列番号：２；インサートの3'末端）ならびに必要に応じて
デザインされた内部プライマーから開始して双方向に完全にシークエンシングし
た（タックダイデオキシFSキット、パーキンエルマーABI、フォスターシティ、
カリフォルニア州）。

【０１１１】 HLAタイピング HLA DRおよびDQタイピングは血清学的方法によってクラスII対立遺伝子で、ま
たは逆ドットブロットハイブリダイゼーションによってDNAレベルで実施した（
マイケルソン（E. Mickelson）ら、1993、Tissue Antigens 41：86〜93）。HLA
DPタイピングはシークエンシングによって行った（HLA DPキット、パーキンエル
マーABI）。

【０１１２】 結果 T細胞エピトープの詳細な位置 発現クローニングに関してライブラリの複雑度を減少させるために、HSV-1×H
SV-2中間型組換え型ウイルス（IRV）を用いて部分的にマッピングした抗原を認
識するTCCを選択した。0.7マップ単位付近のHSV DNAは、VP16の他にT細胞抗原を
コードする。TCC 4.2EIおよび2.3に関するエピトープマッピング（コエル（D.M.
Koelle）、1994、J. Virol. 68：2803〜2810）は、IRV DX32によって改善した
（図1A）。このHSV-2に基づくウイルスは、0.7マップ単位付近でHSV-1 DNAのブ
ロックを含む（プレストン（V.G. Preston）ら、1978、J. Virol. 28：499〜517
）。U_L48遺伝子産物は、HSV-2型特異的、VP16特異的（コエル（D.M. Koelle）ら
、1994、J. Virol. 68：2803〜2810）T細胞クローン1A.B.25との反応性によって
示されるように、HSV-2表現型を有する。U_L49（図２）およびU_L50遺伝子産物（
ウィリアムス（M.V. Williams）、1987、Virology 156：282〜292；ウォールラ
ブ（F. Wohlrab）、1982、J. Virol. 43：935〜942）も同様にHSV-2表現型を有
する。したがって、IRV DX32に存在するHSV-2 DNAは、U_L48、U_L49、U_L50を含み
、その間にあるU_L49.5を含む可能性が最も高い。TCC 4.2E1および2.3は、RS1G31
およびDX32と反応するが、RP2とは反応せず（図1B）、U_L49、U_L49.5、またはU_L5
0を認識する可能性が最も高い。

【０１１３】 T細胞抗原を決定するための発現クローニング HSV-2のBamHI w断片は、U_L49、U_L49.5、およびU_L50コード配列のほとんどを含
むことから、これを発現クローニングに選択した（クレス＆トリーゼンバーグ（
A. Cress and S.J. Triezenberg）、1991、Gene 103：235〜238；エリオット＆
メレディス（G.D. Elliott and D.M. Meredith）、1992、J. Gen. Virol. 73：7
23〜736；メイトランド（N.J. Maitland）ら、1982、Infect. Immun.38：834〜8
42）。ランダムコロニーの70〜90％がインサートを含んだ；全てがウイルス起源
であった。それぞれのTCC（TCC 4.2E1に関してはpUEX1、TCC 2.3に関してはpUEX
）に関して最も活性なライブラリ（表１）を選択して、個々の反応性細菌クロー
ンをプールしたコロニーを調べ、続いて個々のコロニーを調べることによって検
出した（表２）。クローン1.1.3はTCC 4.2E1によって増殖を誘発する融合蛋白質
をコードする。このクローンはU_L49の逆行性80 bp Sma I断片、β-ガラクトシダ
ーゼに関して順方向（forward）でインフレームであってアミノ酸105〜190位を
コードすると予想されるHSV-2 U_L49 DNAの262 bp Sma I断片、ならびに262 bp S
ma I断片-242 bp Sma I断片接合部での単一のC残基の欠失により、順方向である
がフレーム外であるU_L49の246 bp Sma I断片を含む。クローン3.19は、U_L50のア
ミノ酸118〜312位をコードする583 bp Sma I断片を含み、これにU_L49の逆行性80
および96 bp Sma I断片が続く。

【表１】 HSV特異的TCCの増殖（[³H]チミジン取り込みの平均cpm）を誘発する
蛋白質ライブラリの同定。自家EBV-LCL（クローン4.2E1および2.3）またはPBMC
をAPCとして用い、ライブラリに由来する融合蛋白質抗原を300倍希釈した。デー
タは[³H]チミジン取り込みの平均cpmである。 ¹ ライブラリ名は、発現ベクター、HSV-2制限断片名または完全長のウイルスDN
Aの株、およびウイルスDNAを消化するために用いた制限酵素を記載する。² 放射線照射した（3300 rad）自家PBMC 10⁵個と、偽感染細胞溶解物またはUV
処置HSV抗原のいずれか。

【０１１４】 T細胞抗原の同定は、ターゲティングしたサブクローニングと重なり合うペプ
チドによって確認した。アミノ酸105〜190位をコードするHSV-2のU_L49の262 bp
Sma I断片をpUEX3にサブクローニングして、プラスミド49.262.12を得た。この
蛋白質はTCC 4.2E1を刺激した（表２）。HSV-2のVP22のペプチド105〜126位（GG
PVGAGGRSHAPPARTPKMTR；配列番号：３）のみが刺激性であった（図３）。U_L50の
118〜312位および118〜250位をコードするDNA断片をpUEX3にサブクローニングし
た。これらの断片を発現する融合蛋白質は活性であった（表２）。

【表２】 HSV-2反応性TCCの抗原特異性。細菌由来組換え型融合蛋白質抗原を90
0倍希釈で用いた。自家EBV-LCL（クローン4.2E1）またはPBMCをAPCとして用いた
。データは培地と比較したδcpm [³H]チミジンの取り込みであり、これはそれぞ
れの場合について500 cpm未満であった。 ¹ 配列データから順方向でβ-ガラクトシダーゼとインフレームであると予測さ
れるアミノ酸。² 順方向でpUEX3とインフレームであるU_L49 DNAの262 bp Sma I断片のみを含む
1.1.3の確認サブクローン。³ U_L50の583 bp Sma I断片または順方向でpUEX3とインフレームであるU_L50 DNA
の397 bp Sma I-Stu I断片を含む3.19の確認サブクローン。

【０１１５】 完全長のHSV-2 DNAライブラリからのランダムコロニーの評価から、80〜100％
がインサートを有するプラスミドを含むことが示され；インサートの80〜100％
はウイルス起源であった。

【０１１６】 TCC ESL 4.9およびESL 2.20の双方に関して、pUEX3蛋白質ライブラリのみがリ
ンパ球増殖を誘発した（表１）。ライブラリはBamHI w断片から作製したライブ
ラリより複雑であったため、細菌形質転換体2,000〜3,000個を組合せ法によって
スクリーニングした。予備実験において、熱殺菌して洗浄した細菌は、プール（
細菌クローン５〜12個）によるリンパ球増殖アッセイおよび最終アッセイ段階に
おいて蛋白質の封入体調製物の代用となることが判明した。

【０１１７】 陽性細菌におけるプラスミドのシークエンシングから、TCC ESL4.9がU_L49遺伝
子産物VP22のアミノ酸44個の断片（アミノ酸177〜220位）を認識するが、TCC ES
L 2.20はU_L21のアミノ酸34個の断片（アミノ酸148〜181位）を認識することが示
された（表２）。いずれの場合も、HSV-2 DNAの単一のAlu I断片をインフレーム
で順方向に挿入されていた。ペプチドマッピングによって、アミノ酸187〜206位
（図3C）がTCC ESL4.9を刺激することが判明した。

【０１１８】 バルク病変浸潤T細胞のプローブとしての融合蛋白質 新たに見出されたT細胞抗原を、病変浸潤T細胞のバルク培養を調べるためにプ
ローブとして用いられるHSV抗原のパネルに加えた。最初に入手した標本は、患
者１のHSV-2臀部再発部位から５日目（ウイルス培養陽性）に得られた４個一組
の生検（それぞれ２ mm）であった（コエル（D.M. Koelle）ら、1998、J. Clin.
Invest. 101：1500〜09；コエル（D.M. Koelle）ら、1994、J. Virol. 68：280
3〜2810）。４つの生検は全て、VP22の105〜190位に反応性を示したが、β-ガラ
クトシダーゼ、糖蛋白質BもしくはD、またはVP16には反応しなかった。TCCはVP2
2 105〜190融合蛋白質によって当初のバルク培養を１サイクル再刺激した後に誘
導された。VP22（105〜190）および構成ペプチドに対してTCC 1.L3D5.10.8（図3
B）の増殖反応が起こることから、アミノ酸125〜146位にVP22の第三のT細胞エピ
トープが含まれることが証明される。

【０１１９】 外皮蛋白質VP16におけるさらなるT細胞エピトープの定義 全てHSV-2タイプ特異的であるVP16（表３）内の３つのエピトープは既に同定
されており（ジェローム（K.R. Jerome）ら、1998、J. Virol. 72：436〜441）
、そして患者７人中４人（57％）から得た性器HSV-2病変浸潤リンパ球のバルク
培養において、完全長のVP16に対する増殖反応を検出した（コエル（D.M. Koell
e）ら、1998、J. Clin. Invest. 101：1500〜09）。VP16におけるさらなるペプ
チドエピトープを２つの方法によって求めた。最初の方法は、HSV-2の組換え型V
P16との反応性に関して病変小胞液から回収されたクローンのパネルをスクリー
ニングして、その後ペプチドによるエピトープマッピングを行うことを含んだ。
アミノ酸185〜197位ならびに重なり合う209〜221位と213〜225位との対を含むペ
プチドはそれぞれ、TCC RH.13およびKM.7に関して刺激性であった（表３）。そ
の他のVP16ペプチドは全て陰性であった（＜500 cpm）。第二の方法は、開始材
料としてPBMCを用いて、次に組換え型バキュロウイルス由来VP16によるインビト
ロ刺激を行うことを含んだ。２個体からのクローン（BM.17およびSB.17）は、β
-ガラクトシダーゼVP16融合蛋白質およびウイルス全体と共に、同じペプチド（
アミノ酸437〜449位）を認識した。新たに定義された３つのVP16エピトープは全
てタイプが共通で、配列データから予想されるように、HSV-1およびHSV-2の全ウ
イルス調製物が共有した（クレス＆トリーゼンバーグ（A. Cress and S.J. Trie
zenberg、1991、Gene 103：235〜238）。

【表３】 病変およびPBMC由来CD4 TCCによって認識されるHSV-2のVP16内のエピ
トープ。データは培地と比較したδcpm[³H]チミジン取り込みであり、培地のデ
ータはそれぞれの場合について500 cpm未満であった。 ¹ VP16 1〜492（バキュロウイルス由来）を１μg/mlで用いた。β-ガラクトシ
ダーゼ-VP16 180〜492位を1000倍希釈で用いた。² ペプチドは１μMで用いた。 na＝入手できない nd＝実施していない

【０１２０】 HLA制限 0.7マップ単位付近をコードするTCC認識抗原のHLA制限を詳細に決定した。VP2
2 105〜126に特異的なTCC 4.2E1の増殖は、抗DPによって84％阻害されるが、抗D
Rまたは抗DQ mAbでは20％未満であった。TCC 4.2E1はDPB1^*2001/DPB1^*0402ヘテ
ロ接合ドナーに由来する。DPB1^*2001を有する同種異系EBV-LCLは抗原を提示する
が、DPB1^*0402を有するものは抗原を提示せず（表４）、DPB1^*2001による制限が
確立された。U_L50に対して特異的であるTCC2.3の増殖は、抗DRによって阻害され
たが、抗DPまたは抗DQ mAbでは阻害されなかった。このクローンはDRB1^*0301/BR
B1^*0701ヘテロ接合ドナーに由来する。DRB1^*0301ドナーからの同種異系PBMCは抗
原を提示し、この対立遺伝子に対する抗原性ペプチドの結合と一致した。しかし
、連鎖したDR遺伝子産物DRw52またはDRw53が抗原を提示した可能性は除外できな
い。さらなるHLA制限試験を表５に要約する。

【表４】 病変由来CD4 TCC 4.2E1および2.3の制限HLA対立遺伝子の決定。抗原
は900倍希釈したβ-ガラクトシダーゼ融合蛋白質であった（表２）。データは培
地と比較したδcpm[³H]チミジン取り込みであり、培地でのデータはそれぞれの
場合について500 cpm未満であった。 ¹ mAbによる阻害によって決定したHLAクラスII座でのHLAタイプ。² 同じAPCによるpUEX2対照蛋白質（1000倍希釈）との比較、対照ではそれぞれ
の場合について[³H]チミジン取り込みは500 cpm未満であった。

【表５】 詳細な特異性とHLA制限と共に要約した病変由来外皮特異的CD4 TCCの
細胞溶解活性。結果は、ESL4.34（10：1）を除いてエフェクター対標的比20：１
での特異的放出百分率である。Auto＝標的細胞としての自家EBV-LCL；allo＝関
連するHLA座（既知であれば）がミスマッチまたはHLA DRおよびDQがミスマッチ
の同種異系EBV-LCL。 na＝エピトープマッピングは行っておらず、合成抗原性ペプチドを作製していな
いため、入手できない。 nd＝実施していない。¹ 選択したTCCに関するCTLアッセイ法における標的をローディングするために
用いられるペプチド（１μM）を示す。² HLA制限座および／または対立遺伝子の定義の最大範囲。被験者RHおよびKMは
血清学的にタイピングした；その他はDNAレベルでタイピングした。³ 被験者はHLA DRB1^*0402およびDRB1^*1301に関してヘテロ接合性であり、制限
対立遺伝子は決定していない。⁴ 被験者はHLA DRB1^*0301およびDRB1^*1102に関してヘテロ接合であり、制限対
立遺伝子は決定していない。

【０１２１】 TCC BM.17のHLA制限を詳細に調べた。TCC BM.17および類似のクローンSB.17の
増殖は、抗DQによって90％阻害されたが、抗DRまたは抗DP mAbでは25％未満であ
った。ドナーBMおよびSBはHLA DQB1^*0201/0501に関してヘテロ接合である。ペプ
チドの高濃度では、DQB1^*0201-およびDQB1^*0501ホモ接合EBV-LCLはいずれも、TC
C BM.17に抗原を提示するように思われた。しかし、DQB1^*0501ホモ接合細胞は、
DQB1^*0201ホモ接合細胞よりはるかに有効にペプチドを提示した（図４）。この
ように、VP16 431〜449における異なるが重なり合う３つのエピトープは、HLA D
QB1^*0302、DQB1^*0201およびDQB1^*0501によって提示される。

【０１２２】 外皮特異的CD4 T細胞クローンのCTL活性 新たにおよび既に同定された特異性を有するCD4 TCCの細胞障害活性をEBV-LCL
標的細胞を用いて調べた（表５）。調べた全てのクローンはペプチド負荷標的細
胞に対して細胞溶解活性を示した。HSV-2に感染させた標的細胞に対する細胞溶
解活性は多様な変動を示した。VP22特異的TCC 4.2E1は活性であったが、他のド
ナーからのVP22特異的TCCは活性ではなかった。調べた７つのVP16特異的T細胞ク
ローンの中で、６個がHSV-2感染標的細胞に対して10％以上の細胞障害性を示し
た。単一のU_L21およびU_L50特異的TCCは、ウイルス感染標的細胞に対して活性で
はなかった。

【０１２３】 考察 HSV-特異的T細胞は、再発性性器HSV-2病変に選択的に浸潤する（コエル（D.M.
Koelle）ら、1994、J. Infect. Dis 169：956〜961）。CD4およびCD8媒介成分
による局所CTL活性は、ウイルスの消失に関連している（コエル（D.M. Koelle）
ら、1998、J. Clin. Invest. 101：1500〜09）。局所HSV特異的T細胞によって認
識される抗原は多様であり、多くの場合未知である（コエル（D.M. Koelle）ら
、1994、J. Virol. 68：2803〜2810）。この例は、外皮蛋白質VP22およびU_L21な
らびにウイルスdUTPアーゼの認識を報告し、外皮蛋白質VP16に関して新しい情報
を提供する。

【０１２４】 本明細書に記述の発現クローニングシステムは、HSVに関して良好に作動する
。HSVゲノムではイントロンがまれであるために、ゲノムの二本鎖DNAを直接用い
ることができる。同じHSV-2株、HG52（ドラン（A. Dolan）ら、1998、J. Virol.
72：2010〜2021）を用いて、候補となる病変由来TCCをスクリーニングして、蛋
白質ライブラリを作製した。ドナーおよびHG52におけるHSV-2株の株多様性（ノ
ボトニー（M.J. Novotny）ら、1996、Virology 221：1〜13）の程度が比較的低
いために、インビボで認識されるエピトープを見逃すことはほとんどない；株の
多様性がより大きいウイルスに適用する場合、自家単離体を使用すれば利益が得
られると考えられる。

【０１２５】 注目すべきことに、ドナー２人からの病変浸潤TCCによる２つの独立した発現
クローニング実験において、VP22との反応性が検出された。VP22反応性は、バル
ク病変浸潤リンパ球培養の最初の利用可能な組をスクリーニングした際にも検出
された。患者３人からのさらなるクローン10個はU_L49、U_L21およびU_L50の開示さ
れた断片に関して陰性であった。

【０１２６】 外皮抗原は、それらが豊富に存在するために、病変浸潤CD4 T細胞の適した標
的となる可能性がある。VP16およびVP22は大量に存在する、すなわちVP16では分
子1.6×10³個の次数（ツァン＆マックナイト（Y. Zhang and J.L.C. McKnight）
、1993、J. Virol. 67：1482〜1492）、そしてVP22では分子2.5〜2.8×10³個（
レスリー（J. Leslie）ら、1996、Virology 220：60〜68）がHSV-1のそれぞれの
ビリオンに組み入れられる。U_L21に関して利用できる情報はこれより少ない（ベ
インズ（J.D. Baines）ら、1994、J. Virol. 68：2929〜2936；ブラホ（J.A. Bl
aho）ら、1994、J. Biol. Chem. 269：17401〜17410）。ウイルスdUTPアーゼは
、HSV特異的CD4 T細胞反応の標的であることが報告された最初の非ビリオン成分
である。この酵素はVP16およびVP22と同様に、HSV-2（HSV-1ではない）感染細胞
の核に局在する（ウォールラブ（F. Wohlrab）ら、1982、J. Virol. 43：935〜9
42）。インビボでの抗原提示は、感染細胞においてdUTPアーゼの内因性合成後に
、または感染した細胞の屑からのdUTPアーゼ抗原の除去後に起こってもよい。dU
TPアーゼ特異的TCC 4.2E1によるHSV-感染細胞の溶解は、少なくともインビトロ
で内因性抗原の提示が起こりうることを示している。

【０１２７】 VP22とのC-末端融合体として発現されるポリペプチドは、細胞に共輸送するこ
とができるため、VP22融合体としての蛋白質の発現は、アジュバント調製物の１
タイプとして重要となりうる。これはVP22におけるヘテロ接合エピトープの発現
によって調べることができる。HSV-1のVP16およびVP22は、免疫共沈殿によって
示されるように感染細胞において強く非共有結合している。これらの蛋白質は細
胞の核周囲領域に共に局在する（エリオット（G. Elliott）ら、1995、J. Virol
. 69：7932〜7941；エリオット（G.D. Elliott）ら、1992、J. Gen. Virol. 73
：723〜736）。この関連は、VP16に対する明らかに高レベルのCD4 T細胞反応を
刺激するために重要な役割を果たす可能性がある。

【０１２８】 要約すると、発現クローニングによって、新規HSV T細胞抗原が見出された。
病変における抗原特異的CD4 T細胞のインサイチュー濃縮によって、抗原による
二次的なインビトロ刺激によって影響を受けずに抗原の能力範囲を調べることが
可能となる。HSVゲノムの好ましい特徴によって、全ウイルスDNAのライブラリを
直接用いることができる。外皮蛋白質は、膜糖蛋白質と共にヒトにおけるHSVワ
クチンとして用いられる候補となる。

【０１２９】実施例２：さらなるHSV-2ウイルスエピトープの同定 上記の実施例１に記載した発現クローニング法を用いて、HSV-2のさらなるT細
胞抗原を同定した。結果からさらに２つの抗原が明らかになった。１つは、U_L19
のアミノ酸1078〜1319位で認められる。U_L19はまた、主なカプシド抗原、または
VP5としても知られている。もう一つの抗原は、糖蛋白質Eとしても知られるUS8
のアミノ酸１〜273位である。US8抗原は子宮頸部試料に由来するT細胞を用いて
同定された。

【０１３０】実施例３：完全長のU_L49およびU_L50の有効性 本実施例は、完全長のU_L49およびU_L50蛋白質がT細胞増殖の刺激に有効である
ことを示している。データは、大腸菌およびCos-7細胞に発現された完全長のU_L4
9の抗原性、ならびにCos-7細胞において発現された完全長のU_L50の抗原性を証明
する。これらの結果から、上記の抗原が正確に同定されたことが確認される。

【０１３１】 原核細胞系にHSV-2の完全長のU_L49蛋白質を発現させるために、遺伝子の5'末
端でのプライマーGGAAGATCTACCTCTCGCCGCTCCGTCA（配列番号：４）および遺伝子
の3'末端でのCCGGAATTCTTGTCTGTCGTCTGAACGCG（配列番号：５）を用いて、HSV２
型株HG52から調製したDNAからPCRによって遺伝子をクローニングした。PCR産物
をBgl IIおよびEcoR Iによって消化して、TAクローニングベクターpcR2.1-Topo
（インビトロゲン社）においてBgl IIおよびEcoR I部位にクローニングした。次
に遺伝子をベクターpTrcHisB（インビトロゲン社）にサブクローニングして、そ
の後pGEX-2T（ファルマシア社）にサブクローニングした。HSV-2 U_L49クローン
の配列は、公表された配列と比較して１つのコード変異を有した（ドラン（Dola
n）、1998）：アミノ酸244位がセリンからプロリンに変異していた。発現された
蛋白質の予想されるアミノ酸配列も同様に、最初のメチオニンを欠失している。
U_L49は、ベクターpGEX2Tに由来するN-末端融合ドメインを含む。このプラスミド
はpGEX2T-UL49HSV2と命名される。

【０１３２】 原核細胞に発現させたHSV-2の完全長のU_L49を作製するために、pGEX2TU-L49HS
V2または対照の空のベクターを、対数増殖期にある大腸菌株BL21細菌に形質転換
して、LB-アンピシリン培地においてOD₆₀₀が0.4となるように調節した。幾つか
の試験管にイソプロピルβ-Dチオガラクトピラノシド（IPTG）を0.3 mMとなるよ
うに加えた。細菌を37℃で回転させながら1.5時間培養した。細菌を遠心によっ
て回収して、１ mM EDTAを含むPBS中で３回洗浄して、65℃で10分間加熱し、PBS
によってさらに２回洗浄して、T細胞培地中で細菌約１×10⁹個/mlとなるように
再懸濁した。熱殺菌した細菌懸濁液を試験抗原として用いた。

【０１３３】 真核細胞系においてHSV-2の完全長のU_L49蛋白質を発現させるために、プルー
フリーディング機能を有する高忠実度DNAポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連
鎖反応により、遺伝子を個別に再度増幅した。同じプライマーおよび鋳型を用い
た。遺伝子は、pEGFP-C1（クロンテック社）のBgl IIおよびEcoR I部位に直接ク
ローニングした。全U_L49遺伝子をシークエンシングしたところ、公表された配列
と一致した。発現された蛋白質について予想されるアミノ酸配列は、アミノ酸１
位の最初のメチオニンが欠失していることを除いては、ウイルスU_L49に関して予
想された配列と同一である。ベクターpEGFP-C1に由来するN-末端融合ドメインも
また、発現されると予想される。このプラスミドをpEGFP-C1-UL49HSV2と命名す
る。

【０１３４】 真核生物に発現させたHSV-2の完全長のU_L49を作製するために、pEGFP-C1-UL49
HSV2プラスミドDNAまたはpEGFP-C1ベクター対照DNAを、リポフェクションによっ
てCos-7細胞にトランスフェクトさせた。48時間後、細胞をかき集めて、超音波
処理して上清および沈殿相を調製した。9.4 cm²皿からの細胞を用いて、上清300
μlを調製した。9.4 cm²皿からの沈殿物を培地300 μlに再懸濁した。上清およ
び沈殿調製物を試験抗原として用いた。

【０１３５】 真核生物系においてHSV-2の完全長のU_L50蛋白質を発現させるために、遺伝子
を、遺伝子の5'末端でのプライマーTAAGGTACCTATGAGTCAGTGGGGGCCC（配列番号：
６）および遺伝子の3'末端でAAACTGCAGGAGGCGCGGTCTAGATGC（配列番号：７）を
用いて、HSV２型HG52 DNAから調製したDNAから、プルーフリーディング機能を有
する高忠実度熱安定DNAポリメラーゼを用いたPCRによって遺伝子をクローニング
した。標的DNAはpUC9にクローニングしたBgl II i断片のクローンとして用いた
。PCR産物はKpn IおよびPst Iによって消化して、同様に消化したpcDBA3.1-myc-
his-B（インビトロゲン社）にクローニングした。配列はベクターとインサート
の接合部で確認した。プラスミドはpcDNA3.1-myc-his-B-UL50HSV2と命名する。
発現された蛋白質の推定アミノ酸配列は、ウイルスU_L50に関して予想された配列
と同一である。ベクターpcDNA3.1-myc-his-Bに由来するN-末端融合ドメインも同
様に発現されると予想される。真核細胞において発現されたHSV-2の完全長のU_L5
0を試験抗原として作製するために、Cos-7系をU_L49に関する上記の記述通りに正
確に用いた。U_L50に対する対照抗原はCos-7細胞をpcDNA3.1-myc-his-Bにトラン
スフェクトさせることによって作製した。

【０１３６】 これらの試験抗原を、放射線照射自家末梢血単核球（PMBC）１×10⁵個/ウェル
と、U_L49に関しては病変由来CD4-保有T細胞クローンESL 4.9、またはU_L50に関し
てはクローン2.3（コエル（Koelle）ら、1994および1998、ならびに原特許出願
書）１×10⁴個とを含むT細胞培地200 μlを加えたアッセイウェル（96ウェル、U
底）に加えた。アッセイ法は１試料あたり２本ずつ、または３本ずつ実施した。
３日後、³Hチミジン取り込みを実施例１に記載のように測定した。

【０１３７】 結果は、刺激指数（試験抗原の³Hチミジン取り込みの平均値cpm／培地対照の³ Hチミジン取り込みの平均値cpm）、およびδcpm（試験抗原の³Hチミジン取り込
みの平均値cpm−培地対照の³Hチミジン取り込みの平均値cpm）として表記する。
陽性および陰性対照抗原を表示のように、そして実施例１に記述のように実験に
加えた。

【表６】 原核細胞である大腸菌BL21に発現させた完全長のHSV-2 UL49の抗原性

【表７】 真核細胞であるCos-7細胞に発現させた完全長のHSV-2 UL49の抗原性

【表８】 真核細胞であるCos-7細胞において発現された完全長のHSV-2 UL50の
抗原性

【０１３８】 これらの結果は、HSV-2蛋白質U_L49およびU_L50が完全長の蛋白質として発現さ
れた場合も免疫原性を保持することを示している。U_L49は原核細胞および真核細
胞系において調べ、U_L50は真核細胞系において調べた。

【０１３９】実施例４：完全長のU_L21の有効性 真核細胞系にHSV-2の完全長のU_L21蛋白質を発現させるため、遺伝子の5'末端
でプライマーCTGGGATCCATGGAGCTCA GCTATGCCACC（配列番号：８）および遺伝子
の3'末端でCGCGAATTCTCACAC AGACTGGCCGTGCTG（配列番号：９）を用いて、HSV２
型株HG52 DNAから調製したDNAから、プルーフリーディング機能を有する高忠実
度熱安定DNAポリメラーゼを用いたPCRによって、遺伝子をクローニングした。PC
R産物はBamH IおよびEcoR Iによって消化して、同様に消化したpGEX-5Tにクロー
ニングした。そこから、これをBamH IおよびXho Iによって切断して、同様に消
化したpcDNA3.1-myc-his-C（インビトロゲン社）にクローニングした。配列をベ
クターとインサートとの接合部で確認した。プラスミドをpcDNA3.1-myc-his-C-U
L21HSV2と命名する。発現された蛋白質の推定アミノ酸配列はウイルスU_L21に関
して予想された配列と同一である。ベクターpcDNA3.1-myc-his-Bに由来するN-末
端融合ドメインも同様に発現されると予想される。真核生物で発現されたHSV-2
の完全長のU_L21を試験抗原として作製するために、Cos-7系をU_L49に関する記述
通りに正確に用いた。U_L21に関する対照抗原は、Cos-7細胞をpcDNA3.1-myc-his-
Bにトランスフェクトさせることによって作製した。

【０１４０】 これらのU_L21試験抗原を、１×10⁵個/ウェルの放射線照射自家末梢血単核球（
PMBC）と、１×10⁴個の病変由来CD4-保有T細胞クローンESL 2.20（コエル（Koel
le）ら、1994および1998、ならびに上記の実施例I）とを含むT細胞培地200 μl
を加えたアッセイウェル（96ウェル、U底）に加えた。アッセイ法は１試料あた
り３本ずつ実施した。３日後、³Hチミジン取り込みを実施例１に記載のように測
定した。結果は、刺激指数（試験抗原の³Hチミジン取り込みの平均値cpm／培地
対照の³Hチミジン取り込みの平均値cpm）、およびδcpm（試験抗原の³Hチミジン
取り込みの平均値cpm−培地対照の³Hチミジン取り込みの平均値cpm）として表記
する。陽性および陰性対照抗原を表示のように、詳細を実施例１に記述のように
行った。結果を表９に示す。

【表９】 真核生物であるCos-7細胞に発現させた完全長のHSV-2 UL21の抗原性

【０１４１】実施例４：集団における抗原の発生率 本実施例は、集団にこれらの抗原に対する反応が多く存在することを証明する
ことによって、本発明の抗原の予防的および治療的用途の有用性を支持する。こ
れを行うために、タイプ特異的血清学によってHSV-2に感染していることが証明
された７個体を調査した。これらの個体は、指標となるT細胞クローンをHSV-2病
変部から回収した個体とは異なる。

【０１４２】 それぞれの被験者について、PBMCを単離して24ウェルプレートにおいてT細胞
培地２ ml中に２×10⁶個/ウェルで播種して、UV不活化HSV-2株333の500倍希釈液
によってインビトロで５日間刺激した。この時、組換え型ヒトIL-2 40単位/mlを
さらに５〜６日間加えると、B1細胞株と呼ばれる短期間のHSV-特異的細胞株が得
られた。

【０１４３】 個々のHSV-2蛋白質に対する反応性を以下のように評価した。増殖アッセイ法
は96ウェル丸底マイクロタイタープレートにおいて準備して、それぞれの条件を
３本ずつ実施した。各ウェルに、放射線照射（γ線3300 rad）自家PBMC１×10⁵
個を抗原提示細胞として加えた。それぞれのウェルに、B1細胞１×10⁴個を加え
た。以下の対照物質を加えた：培地、500倍希釈したUV処置偽ウイルス調製物、5
00倍希釈したUV処置HSV-2株333、最終濃度４μg/mlのHSV-2（精製）の糖蛋白質B
もしくはD、またはVP16蛋白質。UV処置HSV-2に対する反応は、陽性であることが
予想され、細胞生存率および細胞の全体的な特異性に関する陽性対照として作用
した。糖蛋白質BおよびDならびにVP16は既にHSV-特異的T細胞の標的であること
が示された（コエル（D.M. Koelle）ら、1994、J. Virol. 68(5)：2803〜2810）
。

【０１４４】 新しく見出された抗原UL21、UL49、UL50に関して、真核生物Cos-7系における
完全長の遺伝子のクローニングおよびその発現は、上記の通りであり、空のベク
ターに基づいて対照抗原の調製と同じであった。新たに見出された抗原gE2（US8
）に関して、完全長の遺伝子は、遺伝子の5'末端でのプライマーCGGGGTACCTGCTC
GCGGGGCCGGGTTGGTG（配列番号：10）、および遺伝子の3'末端でのTGCTCTAGAGCCT
TACCAGCGGACGGACGG（配列番号：11）を用いて、HSV２型HG52 DNAから調製したDN
Aから、プルーフリーディング機能を有する高忠実度熱安定DNAポリメラーゼによ
って完全長の遺伝子をクローニングした。PCR産物をACC65 IおよびXba Iによっ
て消化し、同じように消化したpcDNA3.1-myc-his-B（インビトロゲン社）にクロ
ーニングした。プラスミドはpcDNA3.1-myc-his-B-US8と命名する。配列をベクタ
ーとインサートとの接合部で確認した。発現された蛋白質の推定アミノ酸配列は
、ウイルスUS8について予想された配列と同一であった。ベクターpcDNA3.1-myc-
hisに由来するN-末端融合ドメインも同様に発現されると予想される。真核細胞
で発現されたHSV-2の完全長のUS8を作製するために、Cos-7系を上記のように用
いた。４つの新しい抗原（UL21、UL49、UL50、およびUS8）ならびに対照のそれ
ぞれに関して、トランスフェクトしたCos-7細胞の超音波後の上清および沈殿物
を１試料あたり３本ずつの増殖アッセイにおいて最終希釈20倍で用いた。

【０１４５】 刺激指数（試験抗原に関する³Hチミジン取り込みの平均cpm／関連する対照抗
原に関する³Hチミジン取り込みの平均cpm）が4.0より大きいか、または等しい場
合、陽性反応であると採点された。UV HSV-2抗原に関して、関連する対照抗原は
UV偽ウイルスであった。gB2、gD2、およびVP16に関して、対照は培地であった。
Cos-7細胞に発現させた新しい抗原に関して、対照抗原は、対照の空のベクター
にトランスフェクトさせたCos-7細胞の沈殿物または上清のいずれかであった。
結果を表10に示す。新しく見出された抗原のそれぞれの反応性は少なくとも１人
の試験被験者において報告された。全体的に、UL49の反応性はより頻繁に認めら
れ、既知の抗原gB2およびgD2に関する反応性と類似であった。これらのデータは
、T細胞反応性が当初記述された指標となる被験者の他に、ヒト被験者が、これ
らの抗原性HSV由来蛋白質と反応することができることの根拠となる。

【表１０】 無作為に選択したHSV-2感染免疫コンピテントの成人７人の群にお
ける既知および新たに見出されたHSV-2抗原の抗原性

【０１４６】 当業者は前述の説明に開示された概念および特定の態様が本発明の同じ目的を
実施するためのその他の態様を改変またはデザインするための基礎として容易に
利用できることを認識すると思われる。当業者はまた、そのような同等の態様も
、添付の特許請求の範囲に記載する本発明の精神および範囲から逸脱しないこと
を認識すると思われる。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図1A】 0.67〜0.73マップユニットの領域におけるHSVゲノムの構築を示
す略図である。境界はおおよそである。HSV-1×HSV-2中間型組換え型ウイルス（
IRV）についても示す。HSV-2 DNAは実線で示す；HSV-1 DNAは破線で示し、そし
て決定不可能な領域は複数の線で示す。発現クローニングに用いられるHSV-2 Ba
mHI w断片も示す。

【図1B】 表示のIRVに対するT細胞クローン（TCC）の増殖反応を示す棒グ
ラフである。データは、それぞれの場合について500 cpm未満である培地単独と
比較したδCPM[³H]チミジン取り込みである。

【図２】 IRV DX32のU_L49遺伝子産物（VP22）のHSVウイルス表現型の決定
を示すイムノブロットである。偽感染細胞およびウイルス株DX32、HSV-1、また
はHSV-2に感染させた細胞の溶解物を、SDS-PAGEによって分離して、ブロッティ
ングを行って、VP22特異的mAbをプローブとして調べた。マーカー蛋白質の分子
量（kD）を右に示す。

【図3A】 TCC 4.2E1を用いた場合の、HSV-2のVP22において様々なペプチド
エピトープによって誘発されたT細胞増殖を示す棒グラフである。抗原提示細胞
（APC）は自家EBV-LCLである。抗原はβ-ガラクトシダーゼを含み、融合蛋白質
は10 μg/mlで用いて、ペプチドは3μMで用いた。データは、培地単独と比較し
たδcpm[³H]チミジン取り込みであり、培地単独ではそれぞれの場合について500
cpm未満であった。

【図3B】 TCC 1.L3D5.10.8を用いた場合の、HSV-2のVP22において様々なペ
プチドエピトープによって誘発されたT細胞増殖を示す棒グラフである。APCは自
家PBMCであった。抗原はβ-ガラクトシダーゼを含み、融合蛋白質は10 μg/mlで
用い、ペプチドは1μMで用いた。データは、培地単独と比較したδcpm[³H]チミ
ジン取り込みであり、培地単独ではそれぞれの場合について500 cpm未満であっ
た。

【図3C】 TCC ESL 4.9を用いた場合の、HSV-2のVP22において様々なペプチ
ドエピトープによって誘発されたT細胞増殖を示す棒グラフである。APCは自家PB
MCであった。抗原はβ-ガラクトシダーゼを含み、融合蛋白質は10 μg/mlで用い
、ペプチドは１ μMで用いた。データは、培地単独と比較したδcpm[³H]チミジ
ン取り込みであり、培地単独ではそれぞれの場合について500 cpm未満であった
。

【図４】 HSV-2のVP16のペプチド437〜449位に対するT細胞クローンBM.17
の反応のHLA制限エレメントを示す折れ線グラフである。増殖反応はウイルスペ
プチドの濃度に対してプロットした。抗原提示細胞は、自家（黒丸）、HLA DQB1 ^* 0501に対してホモ接合（白三角）、またはHLA DQB1^*0201に対してホモ接合（四
角）のいずれかであるEBL-LCLである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/035 Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８６ Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 ４Ｃ０８７ 1/19 1/21 ４Ｈ０４５ 1/21 7/00 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 7/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｎ 7/00 // Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｒ 1:93） (Ｃ１２Ｎ 5/10 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｄ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ， ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA32 CA01 DA02 DA06 EA02 EA04 GA13 GA14 GA18 GA19 4B064 AG31 CA02 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA90X AA92X AA95Y AB01 BA03 BA05 CA24 CA45 4C084 AA02 AA03 BA01 BA02 BA22 CA01 CA53 NA14 ZB33 4C085 AA03 BA78 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB33 4C087 AA01 AA02 BC83 NA14 ZB33 4H045 AA10 AA20 AA30 BA41 CA03 DA86 EA31 FA74 【要約の続き】

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリペプチドがU_L19、U_L21、U_L49、もしくはU_L50蛋白質、ま
   たはその断片と、薬学的に許容される担体とを含む、単離された単純ヘルペスウ
   イルス（HSV）ポリペプチドを含む薬学的組成物。
2. 【請求項２】 ポリペプチドが以下からなる群より選択されるアミノ酸配列
   を含む、単離HSVポリペプチドと薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成
   物： （a）U_L19のアミノ酸1078〜1319位； （b）U_L21のアミノ酸148〜181位； （c）U_L49のアミノ酸105〜190位、または177〜220位； （d）U_L50のアミノ酸118〜312位； （e）糖蛋白質E（gE）のアミノ酸１〜273位； （f）VP16のアミノ酸185〜197位、209〜221位、または430〜449位；および （g）（a）〜（f）の置換変異体。
3. 【請求項３】 ポリペプチドが融合蛋白質である、請求項１または２記載の
   組成物。
4. 【請求項４】 融合蛋白質が可溶性である、請求項３記載の組成物。
5. 【請求項５】 以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプ
   チドをコードするポリヌクレオチド： （a）U_L19のアミノ酸1078〜1319位； （b）U_L21のアミノ酸148〜181位； （c）U_L49のアミノ酸105〜190位、または177〜220位； （d）U_L50のアミノ酸118〜312位； （e）糖蛋白質E（gE）のアミノ酸１〜273位； （f）VP16のアミノ酸185〜197位、または209〜221位；および （g）（a）〜（f）の置換変異体。
6. 【請求項６】 請求項５記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載のベクターによって形質転換された宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項７記載の宿主細胞を培養する段階およびそのように生
   成されたポリペプチドを回収する段階を含む、HSVポリペプチドを生成する方法
   。
9. 【請求項９】 請求項８記載の方法によって生成されたHSVポリペプチド。
10. 【請求項１０】 ポリペプチドがU_L19、U_L21、U_L49、もしくはU_L50蛋白質、
    またはその断片と、薬学的に許容される担体とを含む、HSVポリペプチドをコー
    ドするポリヌクレオチドを含む薬学的組成物。
11. 【請求項１１】 請求項５記載のポリヌクレオチドと、薬学的に許容される
    担体とを含む薬学的組成物。
12. 【請求項１２】 U_L19、U_L21、U_L49、もしくはU_L50蛋白質、またはその断片
    を発現するように遺伝的に改変された組換え型ウイルス。
13. 【請求項１３】 請求項５記載のポリペプチドを発現するように遺伝的に改
    変された組換え型ウイルス。
14. 【請求項１４】 ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス、レンチ
    ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスである、請
    求項12または13記載のウイルス。
15. 【請求項１５】 請求項14記載のウイルスと、薬学的に許容される担体とを
    含む薬学的組成物。
16. 【請求項１６】 アジュバントをさらに含む、請求項１〜４、10〜11、また
    は15のいずれか一項記載の薬学的組成物。
17. 【請求項１７】 抗原提示細胞が、U_L19、U_L21、U_L49、もしくはU_L50蛋白質
    、または以下からなる群より選択されるポリペプチドに含まれるエピトープを提
    示するように改変される、免疫細胞を抗原提示細胞に接触させる段階を含む、HS
    Vに対して向けられた免疫細胞を生成する方法： （a）U_L19のアミノ酸1078〜1319位； （b）U_L21のアミノ酸148〜181位； （c）U_L49のアミノ酸105〜190位、または177〜220位； （d）U_L50のアミノ酸118〜312位； （e）糖蛋白質E（gE）のアミノ酸１〜273位； （f）VP16のアミノ酸185〜197位または209〜221位；および （g）（a）〜（f）の置換変異体。
18. 【請求項１８】 免疫細胞がT細胞である、請求項17記載の方法。
19. 【請求項１９】 T細胞がCD4+またはCD8+ T細胞である、請求項18記載の方
    法。
20. 【請求項２０】 請求項17〜19のいずれか一項記載の方法によって生成され
    た免疫細胞。
21. 【請求項２１】 HSV感染細胞を、請求項20記載の免疫細胞と接触させる段
    階を含む、HSV感染細胞を死滅させる方法。
22. 【請求項２２】 HSV感染細胞を、請求項20記載の免疫細胞と接触させる段
    階を含む、HSV複製を阻害する方法。
23. 【請求項２３】 請求項１〜４、10〜11、もしくは15〜16のいずれか一項記
    載の組成物、または請求項20記載の免疫細胞を被験者に投与する段階を含む、被
    験者においてHSV感染症を治療する方法。
24. 【請求項２４】 請求項１〜４、10〜11、もしくは15〜16のいずれか一項記
    載の組成物を被験者に投与する段階を含む、被験者におけるHSV感染症を予防す
    る方法。
25. 【請求項２５】 HSV感染細胞を請求項20記載の免疫細胞に接触させる段階
    を含む、抗ウイルスまたは免疫調節リンフォカインの分泌を増強する方法。
26. 【請求項２６】 被験者におけるHSV感染細胞を、請求項20記載の免疫細胞
    と接触させる段階を含む、HSV特異的抗体の生産を増強する方法。
27. 【請求項２７】 U_L19、U_L21、U_L49、もしくはU_L50蛋白質、または以下から
    なる群より選択されるポリペプチドに含まれるエピトープを提示するように改変
    された抗原提示細胞を被験者に投与する段階を含む、被験者におけるHSV感染症
    を治療または予防する方法： （a）U_L19のアミノ酸1078〜1319位； （b）U_L21のアミノ酸148〜181位； （c）U_L49のアミノ酸105〜190位、または177〜220位； （d）U_L50のアミノ酸118〜312位； （e）糖蛋白質E（gE）のアミノ酸１〜273位； （f）VP16のアミノ酸185〜197位、または209〜221位；および （g）（a）〜（f）の置換変異体。
28. 【請求項２８】 抗原提示細胞が、エピトープの発現を媒介することができ
    るウイルス、ペプチド、またはミクロスフェアによって改変される、請求項27記
    載の方法。
29. 【請求項２９】 HSVがHSV-2である、請求項１〜28のいずれか一項記載の方
    法。