JP2002296281A - 改良された均一系イムノアッセイ法 - Google Patents
改良された均一系イムノアッセイ法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 かなり低濃度のアナライトの検出にうまく使
用できる多価の、特に多目的の担体試薬と同一の担体試
薬を用いた、約10-6Mという濃度範囲の上限でのアナラ
イトの測定を改良するための方法を探索し、提供する。 【解決手段】 サンプル中のアナライトを、多価担体試
薬と、該担体に結合したまたは結合可能なアナライト-
誘導体と、アナライト特異的結合パートナー(R1)とのア
ナライト依存型集合または凝集に基づいて検出するため
の均一系アッセイ法であって、該結合パートナー(R1)が
オリゴマーであるか、または(R1)に対する結合部位を少
なくとも２つ有する試薬(R2)によってオリゴマー化され
ていることを特徴とする、前記アッセイ法。
用できる多価の、特に多目的の担体試薬と同一の担体試
薬を用いた、約10-6Mという濃度範囲の上限でのアナラ
イトの測定を改良するための方法を探索し、提供する。 【解決手段】 サンプル中のアナライトを、多価担体試
薬と、該担体に結合したまたは結合可能なアナライト-
誘導体と、アナライト特異的結合パートナー(R1)とのア
ナライト依存型集合または凝集に基づいて検出するため
の均一系アッセイ法であって、該結合パートナー(R1)が
オリゴマーであるか、または(R1)に対する結合部位を少
なくとも２つ有する試薬(R2)によってオリゴマー化され
ていることを特徴とする、前記アッセイ法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、サンプル中のアナ
ライトを、多価担体試薬と、該担体に結合したまたは結
合可能なアナライト-誘導体と、アナライト特異的結合
パートナー(R1)とのアナライト依存型の集合または凝集
に基づいて検出するための改良された均一系アッセイ法
に関する。本発明は、特に、結合パートナー(R1)がオリ
ゴマーであるか、または該R1に対する結合部位を少なく
とも２つ有する試薬(R2)によりオリゴマー化されている
ことを特徴とするアッセイに関する。
ライトを、多価担体試薬と、該担体に結合したまたは結
合可能なアナライト-誘導体と、アナライト特異的結合
パートナー(R1)とのアナライト依存型の集合または凝集
に基づいて検出するための改良された均一系アッセイ法
に関する。本発明は、特に、結合パートナー(R1)がオリ
ゴマーであるか、または該R1に対する結合部位を少なく
とも２つ有する試薬(R2)によりオリゴマー化されている
ことを特徴とするアッセイに関する。
【０００２】
【従来の技術】結合アッセイ、特に免疫学的結合アッセ
イは、現在、研究現場や臨床上および／または診断上の
ルーチン作業を行う検査室において広く使用されてい
る。
イは、現在、研究現場や臨床上および／または診断上の
ルーチン作業を行う検査室において広く使用されてい
る。
【０００３】全く異なる範囲の濃度で存在する多くの種
類のアナライトを、かかる手法により信頼をもって測定
しなければならない。
類のアナライトを、かかる手法により信頼をもって測定
しなければならない。
【０００４】様々な免疫学的測定法は、均一系法と不均
一系法に分類されうる。標識化成分が結合したものを標
識化成分が結合していないものから分離するために、不
均一系法の一部として固相反応が常に行なわれる。この
タイプの手法では、標識は容易に測定可能である。しか
し、不均一反応に長時間要し、洗浄ステップが必要であ
るという欠点がある。
一系法に分類されうる。標識化成分が結合したものを標
識化成分が結合していないものから分離するために、不
均一系法の一部として固相反応が常に行なわれる。この
タイプの手法では、標識は容易に測定可能である。しか
し、不均一反応に長時間要し、洗浄ステップが必要であ
るという欠点がある。
【０００５】均一系法では、結合標識は非結合標識から
分離されないので、結合標識と非結合標識の識別は別の
方法で行なう必要がある。そのようなアッセイを行なう
ための多くの様々な方法が知られており、その中でも競
合的均一系イムノアッセイが広く使用されている。
分離されないので、結合標識と非結合標識の識別は別の
方法で行なう必要がある。そのようなアッセイを行なう
ための多くの様々な方法が知られており、その中でも競
合的均一系イムノアッセイが広く使用されている。
【０００６】多くの競合的均一系凝集イムノアッセイの
欠点は、原材料について、非常に時間のかかるパラメー
ター特異的な(parameter-specific)最適化が必要である
ということである。これらの試験全てにおいて、最適識
別と最適感度には相反する必要条件がある。なぜなら、
一方では凝集粒子を含む試薬の濃度をサンプルとの競争
反応を促進するために限定する必要があり、他方では、
単位時間当たりの凝集およびシグナルにおける十分な変
化を得るために、この試薬を高濃度で使用する必要があ
りかつ高度に標識する必要があるからである。これらの
必要条件を釣り合わせると、感度が限定され、妨害物質
(interferences)(これは特定のサンプル前処理によって
のみ排除可能である場合が多い)の影響を受けやすくな
る。
欠点は、原材料について、非常に時間のかかるパラメー
ター特異的な(parameter-specific)最適化が必要である
ということである。これらの試験全てにおいて、最適識
別と最適感度には相反する必要条件がある。なぜなら、
一方では凝集粒子を含む試薬の濃度をサンプルとの競争
反応を促進するために限定する必要があり、他方では、
単位時間当たりの凝集およびシグナルにおける十分な変
化を得るために、この試薬を高濃度で使用する必要があ
りかつ高度に標識する必要があるからである。これらの
必要条件を釣り合わせると、感度が限定され、妨害物質
(interferences)(これは特定のサンプル前処理によって
のみ排除可能である場合が多い)の影響を受けやすくな
る。
【０００７】試薬全てを検査中のいずれかのアナライト
に対して個別に最適化するという問題は、最近、アナラ
イト非依存型の結合ペアの使用に基づいたアッセイ法を
用いることによってかなり改善されてきている。このア
ナライト非依存型の結合ペア、例えばビオチン-ストレ
プトアビジンペアは、広く利用可能な担体材料、例えば
ラテックスビーズ、に対するアナライト特異的反応を媒
介するために使用される。そのような方法の詳細は、特
に、米国特許第5,858,803号および米国特許第5,362,655
号に記載されている。
に対して個別に最適化するという問題は、最近、アナラ
イト非依存型の結合ペアの使用に基づいたアッセイ法を
用いることによってかなり改善されてきている。このア
ナライト非依存型の結合ペア、例えばビオチン-ストレ
プトアビジンペアは、広く利用可能な担体材料、例えば
ラテックスビーズ、に対するアナライト特異的反応を媒
介するために使用される。そのような方法の詳細は、特
に、米国特許第5,858,803号および米国特許第5,362,655
号に記載されている。
【０００８】様々なアナライトは、中〜低濃度範囲の場
合、高分子のストレプトアビジン、特にストレプトアビ
ジン被覆ラテックスビーズの使用に基づいた均一系凝集
アッセイによってうまく分析することができることが分
かっている。このような多価かつ広く利用可能な（多目
的）担体試薬は大きな利点を有し、例えば、そのような
担体試薬は大量に生産でき、そして該試薬に基づく試験
開発は一般により簡便かつ安価である。なぜなら、様々
なアナライトの検出のために異なるアナライト特異的試
薬を使用するにもかかわらず、少なくとも担体に関して
は、同様の問題解決法がこれらの試験系に当てはまるか
らである。
合、高分子のストレプトアビジン、特にストレプトアビ
ジン被覆ラテックスビーズの使用に基づいた均一系凝集
アッセイによってうまく分析することができることが分
かっている。このような多価かつ広く利用可能な（多目
的）担体試薬は大きな利点を有し、例えば、そのような
担体試薬は大量に生産でき、そして該試薬に基づく試験
開発は一般により簡便かつ安価である。なぜなら、様々
なアナライトの検出のために異なるアナライト特異的試
薬を使用するにもかかわらず、少なくとも担体に関して
は、同様の問題解決法がこれらの試験系に当てはまるか
らである。
【０００９】しかし、多価の、特に多目的の担体に基づ
く異なるアナライトの試験系も、一つの重大な欠点を有
する。使用の簡便さおよび様々なアナライトに対するそ
の広範な適合性は、しばしば、そのような多価担体に基
づく試験系によってカバーできるアナライトの濃度範囲
の縮小という犠牲を伴う。換言すると、低濃度で存在す
るアナライトの検出および高濃度で存在するアナライト
の検出の両方に同じ多価担体を使用することは困難であ
ることが判明した。
く異なるアナライトの試験系も、一つの重大な欠点を有
する。使用の簡便さおよび様々なアナライトに対するそ
の広範な適合性は、しばしば、そのような多価担体に基
づく試験系によってカバーできるアナライトの濃度範囲
の縮小という犠牲を伴う。換言すると、低濃度で存在す
るアナライトの検出および高濃度で存在するアナライト
の検出の両方に同じ多価担体を使用することは困難であ
ることが判明した。
【００１０】かかる問題は、この多価担体の量は、限ら
れた範囲内、例えば臨床的化学分析装置のハードウェア
による制限内のみで変動可能であるという事実によって
容易に説明される。同様のハードウェアによる制限は、
ピペットで計量されるサンプルの容量にも当てはまる。
別の問題は、アナライト特異的モノクローナル抗体のよ
うな免疫学的試薬の利用可能性が限られていることであ
る。
れた範囲内、例えば臨床的化学分析装置のハードウェア
による制限内のみで変動可能であるという事実によって
容易に説明される。同様のハードウェアによる制限は、
ピペットで計量されるサンプルの容量にも当てはまる。
別の問題は、アナライト特異的モノクローナル抗体のよ
うな免疫学的試薬の利用可能性が限られていることであ
る。
【００１１】臨床上関連のあるアナライトは、かなり様
々な濃度でサンプル中に存在することが知られている。
濃度範囲の下限でジゴキシンのようなアナライトを検出
しなければならない。これは臨床的に関連のあるサンプ
ル中にかなり低濃度で存在し、１×10-10M未満で信頼を
もって測定しなければならない。別のアナライト、例え
ばフェノバルビツール酸またはゲンタマイシンは、３×
10-6Mという高さの濃度範囲で存在し、バルプロ酸は２
×10-5Mという高さであり得る。
々な濃度でサンプル中に存在することが知られている。
濃度範囲の下限でジゴキシンのようなアナライトを検出
しなければならない。これは臨床的に関連のあるサンプ
ル中にかなり低濃度で存在し、１×10-10M未満で信頼を
もって測定しなければならない。別のアナライト、例え
ばフェノバルビツール酸またはゲンタマイシンは、３×
10-6Mという高さの濃度範囲で存在し、バルプロ酸は２
×10-5Mという高さであり得る。
【００１２】アッセイ最適化の様々なステップにより、
近年、非常に低濃度で存在するアナライト、例えばジゴ
キシンを競合的均一系イムノアッセイで検出できること
を実証することが可能になった(Scholer, Aら, Clin. C
hem. 43(1997) 92-99)。
近年、非常に低濃度で存在するアナライト、例えばジゴ
キシンを競合的均一系イムノアッセイで検出できること
を実証することが可能になった(Scholer, Aら, Clin. C
hem. 43(1997) 92-99)。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】濃度範囲の下限では、
完全に最適化された試薬を用いた場合にのみ、より高い
感度が得られる。しかし、特に多目的担体を使用する場
合、これは、濃度範囲の上限における測定精度を犠牲に
して達成されるものであった。したがって、本発明の課
題は、かなり低濃度、例えば１×10-10M未満の濃度のア
ナライトの検出にうまく使用できる多価の、特に多目的
の担体試薬と同一の担体試薬を用いた、約10-6Mという
濃度範囲の上限でのアナライトの測定を改良するための
方法を探索し、提供することである。
完全に最適化された試薬を用いた場合にのみ、より高い
感度が得られる。しかし、特に多目的担体を使用する場
合、これは、濃度範囲の上限における測定精度を犠牲に
して達成されるものであった。したがって、本発明の課
題は、かなり低濃度、例えば１×10-10M未満の濃度のア
ナライトの検出にうまく使用できる多価の、特に多目的
の担体試薬と同一の担体試薬を用いた、約10-6Mという
濃度範囲の上限でのアナライトの測定を改良するための
方法を探索し、提供することである。
【００１４】
【課題を解決するための手段】上記課題は、サンプル中
のアナライトを、多価担体試薬と、該担体に結合したま
たは結合可能なアナライト-誘導体と、アナライト特異
的結合パートナー(R1)とのアナライト依存型集合または
凝集に基づいて検出するための改良された均一系アッセ
イ法であって、該結合パートナー(R1)がオリゴマー化さ
れていることを特徴とするアッセイ法によって解決され
ることが見出された。この方法では、より高濃度のアナ
ライトについて、較正曲線とその対応する測定範囲とを
調整することが可能であり、したがって低濃度で存在す
るアナライトの高感度検出に用いられる担体と同一の多
価または多目的担体を用いたその正確かつ信頼できる測
定が可能になる。
のアナライトを、多価担体試薬と、該担体に結合したま
たは結合可能なアナライト-誘導体と、アナライト特異
的結合パートナー(R1)とのアナライト依存型集合または
凝集に基づいて検出するための改良された均一系アッセ
イ法であって、該結合パートナー(R1)がオリゴマー化さ
れていることを特徴とするアッセイ法によって解決され
ることが見出された。この方法では、より高濃度のアナ
ライトについて、較正曲線とその対応する測定範囲とを
調整することが可能であり、したがって低濃度で存在す
るアナライトの高感度検出に用いられる担体と同一の多
価または多目的担体を用いたその正確かつ信頼できる測
定が可能になる。
【００１５】要約すると、本発明は、サンプル中のアナ
ライトを、多価担体試薬と、該担体に結合したまたは結
合可能なアナライト-誘導体と、アナライト特異的結合
パートナー(R1)とのアナライト依存型の集合または凝集
に基づいて検出するための改良された均一系アッセイ法
であって、該結合パートナー(R1)がオリゴマーであるこ
とを特徴とするアッセイ法に関する。(R1)のオリゴマー
形態は、(R1)モノマーを化学架橋することによって得ら
れ、あるいは(R1)に対する結合部位を少なくとも２つ有
する試薬(R2)によってオリゴマー化される。
ライトを、多価担体試薬と、該担体に結合したまたは結
合可能なアナライト-誘導体と、アナライト特異的結合
パートナー(R1)とのアナライト依存型の集合または凝集
に基づいて検出するための改良された均一系アッセイ法
であって、該結合パートナー(R1)がオリゴマーであるこ
とを特徴とするアッセイ法に関する。(R1)のオリゴマー
形態は、(R1)モノマーを化学架橋することによって得ら
れ、あるいは(R1)に対する結合部位を少なくとも２つ有
する試薬(R2)によってオリゴマー化される。
【００１６】今や、特定の臨床上関連のあるサンプル中
にかなり高濃度で存在することが知られているアナライ
トをより正確に測定することができ、しかもかかる測定
に必要な高価な免疫学的試薬はより少量ですむ。
にかなり高濃度で存在することが知られているアナライ
トをより正確に測定することができ、しかもかかる測定
に必要な高価な免疫学的試薬はより少量ですむ。
【００１７】また本発明は、臨床上関連のある濃度範囲
が少なくとも100倍離れている少なくとも２種の異なる
アナライトを、担体試薬と、該担体に結合可能なアナラ
イト-誘導体と、アナライト特異的結合パートナー(R1)
とのアナライト依存型の集合または凝集に基づいて信頼
をもって測定するための均一系集合または凝集アッセイ
における、多価の多目的担体材料の使用であって、より
高濃度のアナライトを、結合パートナー(R1)の存在下で
測定し、かつ該結合パートナー(R1)がオリゴマーである
か、または(R1)に対する結合部位を少なくとも２つ有す
る試薬(R2)によってオリゴマー化されていることを特徴
とする、使用も含む。
が少なくとも100倍離れている少なくとも２種の異なる
アナライトを、担体試薬と、該担体に結合可能なアナラ
イト-誘導体と、アナライト特異的結合パートナー(R1)
とのアナライト依存型の集合または凝集に基づいて信頼
をもって測定するための均一系集合または凝集アッセイ
における、多価の多目的担体材料の使用であって、より
高濃度のアナライトを、結合パートナー(R1)の存在下で
測定し、かつ該結合パートナー(R1)がオリゴマーである
か、または(R1)に対する結合部位を少なくとも２つ有す
る試薬(R2)によってオリゴマー化されていることを特徴
とする、使用も含む。
【００１８】
【発明の実施の形態】多価担体試薬の有効性は、より高
感度のアッセイ、特にイムノアッセイの発達を大いに促
してきた。しかし、かなり低濃度で存在するアナライト
の測定と、かなり高濃度で存在するアナライトの測定の
両方について同一または類似の多価担体試薬を使用する
には問題があった。
感度のアッセイ、特にイムノアッセイの発達を大いに促
してきた。しかし、かなり低濃度で存在するアナライト
の測定と、かなり高濃度で存在するアナライトの測定の
両方について同一または類似の多価担体試薬を使用する
には問題があった。
【００１９】驚いたことに、かかる問題は、今や、サン
プル中のアナライトを、多価担体試薬と、該担体に結合
したまたは結合可能なアナライト-誘導体と、アナライ
ト特異的結合パートナー(R1)とのアナライト依存型の集
合または凝集に基づいて検出するための改良された均一
系アッセイ法であって、該結合パートナー(R1)がオリゴ
マーであるか、または(R1)に対する結合部位を少なくと
も２つ有する試薬(R2)によってオリゴマー化されている
ことを特徴とするアッセイ法を適用することによって解
決されることが見出された。
プル中のアナライトを、多価担体試薬と、該担体に結合
したまたは結合可能なアナライト-誘導体と、アナライ
ト特異的結合パートナー(R1)とのアナライト依存型の集
合または凝集に基づいて検出するための改良された均一
系アッセイ法であって、該結合パートナー(R1)がオリゴ
マーであるか、または(R1)に対する結合部位を少なくと
も２つ有する試薬(R2)によってオリゴマー化されている
ことを特徴とするアッセイ法を適用することによって解
決されることが見出された。
【００２０】均一系イムノアッセイを実施するための様
々な原理が当技術分野で多数知られている(David Wild,
The Immunoassay Handbook, 第２版 (2000)177-194)。
濁度測定または比濁評価によって評価可能な均一系イム
ノアッセイが広く使用されている(Whicher, J.T.ら, Cr
it Rev Clin Lab Sci(1983) 213-60)。本発明は、多価
担体試薬を使用する均一系イムノアッセイに関する。そ
のような多価担体試薬は、利便性、適用の簡便さ、なら
びにかかる試薬を用いると良好なアッセイ感度が得られ
るなどの理由のために使用される(米国特許第5,858,803
号、米国特許第5,362,655号)。
々な原理が当技術分野で多数知られている(David Wild,
The Immunoassay Handbook, 第２版 (2000)177-194)。
濁度測定または比濁評価によって評価可能な均一系イム
ノアッセイが広く使用されている(Whicher, J.T.ら, Cr
it Rev Clin Lab Sci(1983) 213-60)。本発明は、多価
担体試薬を使用する均一系イムノアッセイに関する。そ
のような多価担体試薬は、利便性、適用の簡便さ、なら
びにかかる試薬を用いると良好なアッセイ感度が得られ
るなどの理由のために使用される(米国特許第5,858,803
号、米国特許第5,362,655号)。
【００２１】多くの種類の多価担体試薬が当技術分野で
開示されている。タンパク質(例えばウシ血清アルブミ
ン)、デキストランおよびその誘導体、核酸および核酸
誘導体のような高分子の生体分子または粒状の担体材料
に基づく多価担体試薬が最も適切であり、それに結合ペ
アのメンバーの一方が結合または被覆されている。
開示されている。タンパク質(例えばウシ血清アルブミ
ン)、デキストランおよびその誘導体、核酸および核酸
誘導体のような高分子の生体分子または粒状の担体材料
に基づく多価担体試薬が最も適切であり、それに結合ペ
アのメンバーの一方が結合または被覆されている。
【００２２】好ましくは、粒状の担体材料、特に直径50
〜1000nmのラテックスビーズが使用され、結合ペアの一
方のパートナーが化学結合または吸着によって付着され
ている。
〜1000nmのラテックスビーズが使用され、結合ペアの一
方のパートナーが化学結合または吸着によって付着され
ている。
【００２３】多価担体の特別かつ好ましい形態は多目的
担体である。これは、アナライト非依存型の結合ペアの
一方のパートナーを担体に付着させることによって得ら
れる。このアナライト非依存型の結合ペアは、担体への
アナライト特異的結合パートナーの結合を媒介するのに
有利に使用できる。担体に付着されるアナライト非特異
的またはアナライト非依存型の結合ペアの一方のメンバ
ーは、ハプテンまたはハプテン様分子に結合可能である
のが最も好ましい。
担体である。これは、アナライト非依存型の結合ペアの
一方のパートナーを担体に付着させることによって得ら
れる。このアナライト非依存型の結合ペアは、担体への
アナライト特異的結合パートナーの結合を媒介するのに
有利に使用できる。担体に付着されるアナライト非特異
的またはアナライト非依存型の結合ペアの一方のメンバ
ーは、ハプテンまたはハプテン様分子に結合可能である
のが最も好ましい。
【００２４】ハプテンは、それ自体では免疫原性を持た
ない小分子である。しかし、適切な担体分子に結合した
場合、その結合体を用いてそれらを免疫原性にすること
ができ、よって適切な免疫応答を生じさせることができ
る。様々な種類のハプテンに対するポリクローナル抗体
およびモノクローナル抗体が当技術分野でよく知られて
いる。よく知られたハプテンは、例えば、フルオレセイ
ンジニトロフェニルリン酸、ステロイド性ホルモン、多
くの低分子量薬物、ジゴキシンおよびジゴキシゲニンで
ある。
ない小分子である。しかし、適切な担体分子に結合した
場合、その結合体を用いてそれらを免疫原性にすること
ができ、よって適切な免疫応答を生じさせることができ
る。様々な種類のハプテンに対するポリクローナル抗体
およびモノクローナル抗体が当技術分野でよく知られて
いる。よく知られたハプテンは、例えば、フルオレセイ
ンジニトロフェニルリン酸、ステロイド性ホルモン、多
くの低分子量薬物、ジゴキシンおよびジゴキシゲニンで
ある。
【００２５】ハプテン様分子という用語は、非免疫学的
結合ペアの一部である小分子を記述するために用いられ
る。そのような結合ペアの中でよく知られた例は、特
に、酵素の補欠分子団と酵素、基質誘導体と対応する酵
素、ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトア
ビジンである。好ましくは、そのようなハプテン様分子
は、分子量が10kD未満、より好ましくは5kD未満、さら
に好ましくは2kD未満、最も好ましくは1kD未満であるこ
とを特徴とする。ハプテンまたはハプテン様分子を含
み、かつかなり高い親和性を示す結合ペアが好ましい。
そのような親和性は、好ましくは少なくとも10-9M/l、
より好ましくは10-10M/lであり、最も好ましくは10-11M
/l以上である。
結合ペアの一部である小分子を記述するために用いられ
る。そのような結合ペアの中でよく知られた例は、特
に、酵素の補欠分子団と酵素、基質誘導体と対応する酵
素、ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトア
ビジンである。好ましくは、そのようなハプテン様分子
は、分子量が10kD未満、より好ましくは5kD未満、さら
に好ましくは2kD未満、最も好ましくは1kD未満であるこ
とを特徴とする。ハプテンまたはハプテン様分子を含
み、かつかなり高い親和性を示す結合ペアが好ましい。
そのような親和性は、好ましくは少なくとも10-9M/l、
より好ましくは10-10M/lであり、最も好ましくは10-11M
/l以上である。
【００２６】本発明の「アナライト-誘導体」は、アナ
ライト非特異的結合ペアの第２のメンバーに結合したア
ナライト自体またはその類似体である。最も好ましく
は、アナライト-誘導体は、アナライトまたはその類似
体とハプテンまたはハプテン様分子とを含む化学結合体
である。
ライト非特異的結合ペアの第２のメンバーに結合したア
ナライト自体またはその類似体である。最も好ましく
は、アナライト-誘導体は、アナライトまたはその類似
体とハプテンまたはハプテン様分子とを含む化学結合体
である。
【００２７】「アナライト類似体」は、特に、共有結合
を可能にするように修飾されたアナライト分子、ならび
により一般的にはアナライトと免疫学的に等価な構造体
を含む。免疫学的に等価な構造体は、例えば、大型分子
のエピトープに相当するペプチドである。そのようなペ
プチドは、今や、高価な大型タンパク質が必要な場合に
代わりに広く使用されている。いわゆる疑似構造体もよ
く知られており、例えば欧州特許741869号に記載されて
いる。
を可能にするように修飾されたアナライト分子、ならび
により一般的にはアナライトと免疫学的に等価な構造体
を含む。免疫学的に等価な構造体は、例えば、大型分子
のエピトープに相当するペプチドである。そのようなペ
プチドは、今や、高価な大型タンパク質が必要な場合に
代わりに広く使用されている。いわゆる疑似構造体もよ
く知られており、例えば欧州特許741869号に記載されて
いる。
【００２８】アナライト-誘導体は、反応混合物へのサ
ンプルの添加前または添加中に多価担体に結合され得
る。次いで、この多価担体を用いて、サンプル中のアナ
ライトを検出する。多価担体は、サンプルおよび／また
はアッセイ実施時に反応混合物を形成するのに必要なそ
の他の試薬と混合される。サンプルと混合される試薬
は、サンプル中に存在するアナライトの濃度に直接的ま
たは間接的に相関する程度まで集合または凝集を可能に
するように最適化されている。集合または凝集は、標準
的な手順および装置にしたがって濁度測定または比濁測
定を行なうことによって測定される。
ンプルの添加前または添加中に多価担体に結合され得
る。次いで、この多価担体を用いて、サンプル中のアナ
ライトを検出する。多価担体は、サンプルおよび／また
はアッセイ実施時に反応混合物を形成するのに必要なそ
の他の試薬と混合される。サンプルと混合される試薬
は、サンプル中に存在するアナライトの濃度に直接的ま
たは間接的に相関する程度まで集合または凝集を可能に
するように最適化されている。集合または凝集は、標準
的な手順および装置にしたがって濁度測定または比濁測
定を行なうことによって測定される。
【００２９】臨床上での日常適用のための均一系イムノ
アッセイは、ピペッティング操作ステップなどの必要な
ハンドリングが、できるだけ少なくなるように設計され
る。これはユーザーにとって非常に都合がよく、そのよ
うなアッセイを行なう際の過誤の機会が低減される。最
も進んだアッセイでは、反応混合物は、アナライト特異
的結合パートナー(R1)と、多目的の多価担体試薬と、該
多目的試薬に結合するアナライト誘導体と、分析に供さ
れるサンプルとを含む。
アッセイは、ピペッティング操作ステップなどの必要な
ハンドリングが、できるだけ少なくなるように設計され
る。これはユーザーにとって非常に都合がよく、そのよ
うなアッセイを行なう際の過誤の機会が低減される。最
も進んだアッセイでは、反応混合物は、アナライト特異
的結合パートナー(R1)と、多目的の多価担体試薬と、該
多目的試薬に結合するアナライト誘導体と、分析に供さ
れるサンプルとを含む。
【００３０】驚いたことに、今や、上記の均一系法を用
いた、特定の関連のあるサンプル中により高濃度で存在
することが知られている臨床上関連のあるアナライトの
測定範囲の調節およびより正確な検出が、オリゴマーで
ある結合パートナー(R1)または(R1)に対する結合部位を
少なくとも２つ有する結合パートナー(R2)によってオリ
ゴマー化されている(R1)を用いることにより可能である
ことが見出された。
いた、特定の関連のあるサンプル中により高濃度で存在
することが知られている臨床上関連のあるアナライトの
測定範囲の調節およびより正確な検出が、オリゴマーで
ある結合パートナー(R1)または(R1)に対する結合部位を
少なくとも２つ有する結合パートナー(R2)によってオリ
ゴマー化されている(R1)を用いることにより可能である
ことが見出された。
【００３１】好ましい実施形態は、サンプル中のアナラ
イトを、多価担体試薬と、該担体に結合したまたは結合
可能なアナライト-誘導体と、アナライト特異的結合パ
ートナー(R1)とのアナライト依存型の集合または凝集に
基づいて検出するための均一系アッセイ法であって、該
結合パートナー(R1)がオリゴマーであることを特徴とす
るアッセイ法である。
イトを、多価担体試薬と、該担体に結合したまたは結合
可能なアナライト-誘導体と、アナライト特異的結合パ
ートナー(R1)とのアナライト依存型の集合または凝集に
基づいて検出するための均一系アッセイ法であって、該
結合パートナー(R1)がオリゴマーであることを特徴とす
るアッセイ法である。
【００３２】「オリゴマー」という用語は、結合パート
ナー(R1)が化学架橋されていることを示すために使用さ
れる。結合パートナー(R1)を化学架橋するには、当技術
分野で知られている数多くの様々な手法が使用できる。
架橋オリゴマー分子を、通常の分子篩クロマトグラフィ
ーによって精製し、適切なオリゴマー画分を回収し、所
期の均一系アッセイで試験する。結合パートナー(R1)は
アナライトに特異的に結合している。アナライトの種類
に依存して、この結合パートナーは、例えば核酸、受容
体に対するリガンド、受容体、抗原、糖、レクチン、ま
たは抗体、ならびにそれらと等価な構造またはその等価
な断片である。
ナー(R1)が化学架橋されていることを示すために使用さ
れる。結合パートナー(R1)を化学架橋するには、当技術
分野で知られている数多くの様々な手法が使用できる。
架橋オリゴマー分子を、通常の分子篩クロマトグラフィ
ーによって精製し、適切なオリゴマー画分を回収し、所
期の均一系アッセイで試験する。結合パートナー(R1)は
アナライトに特異的に結合している。アナライトの種類
に依存して、この結合パートナーは、例えば核酸、受容
体に対するリガンド、受容体、抗原、糖、レクチン、ま
たは抗体、ならびにそれらと等価な構造またはその等価
な断片である。
【００３３】好ましくは、アナライトは低分子量、すな
わち5000D未満である。アナライトは、好ましくは、例
えば、表１に示したアナライトのリストから選択するこ
とができる。
わち5000D未満である。アナライトは、好ましくは、例
えば、表１に示したアナライトのリストから選択するこ
とができる。
【００３４】5000Dを超える分子量のアナライトの場
合、かかるアナライトの部分構造、例えばペプチドエピ
トープを、高価なタンパク質が必要な場合に代わりに使
用することができる。5000Dを超える分子量を有するア
ナライトの場合、類似体、例えばそのようなアナライト
における対象となるエピトープに相当するペプチドまた
はミミトープ(mimitopes)を使用するのが好ましい。
合、かかるアナライトの部分構造、例えばペプチドエピ
トープを、高価なタンパク質が必要な場合に代わりに使
用することができる。5000Dを超える分子量を有するア
ナライトの場合、類似体、例えばそのようなアナライト
における対象となるエピトープに相当するペプチドまた
はミミトープ(mimitopes)を使用するのが好ましい。
【００３５】好ましい実施形態では、アッセイはイムノ
アッセイであり、試薬(R1)は化学的または免疫学的に架
橋されている抗体である。
アッセイであり、試薬(R1)は化学的または免疫学的に架
橋されている抗体である。
【００３６】好ましくは、抗体を化学架橋して、２〜30
個のモノマー免疫グロブリンからなる免疫グロブリンオ
リゴマーを得る。好ましくは、オリゴマー免疫グロブリ
ンは２〜20個の免疫グロブリンモノマーを含み、より好
ましくは２〜10個の免疫グロブリンモノマーを含み、最
も好ましくは２〜６個の免疫グロブリンモノマーを含
む。好ましくは、免疫グロブリンはGクラスの免疫グロ
ブリン(IgG)である。
個のモノマー免疫グロブリンからなる免疫グロブリンオ
リゴマーを得る。好ましくは、オリゴマー免疫グロブリ
ンは２〜20個の免疫グロブリンモノマーを含み、より好
ましくは２〜10個の免疫グロブリンモノマーを含み、最
も好ましくは２〜６個の免疫グロブリンモノマーを含
む。好ましくは、免疫グロブリンはGクラスの免疫グロ
ブリン(IgG)である。
【００３７】化学架橋は、例えばP.Tijssen, "Laborato
ry techniques in biochemistryandmolecular biolog
y", 第11章(巨大分子コンジュゲーション)(1985)または
その最新版に記載されているような当技術分野で公知の
手法にしたがってホモおよびヘテロ二官能性試薬によっ
て行なうことができる。当業者は、重合される抗体の抗
原結合特性に影響を与えない試薬を選択するだろう。架
橋された抗体は、適切なクロマトグラフィー手法により
そのサイズにしたがって分離される。
ry techniques in biochemistryandmolecular biolog
y", 第11章(巨大分子コンジュゲーション)(1985)または
その最新版に記載されているような当技術分野で公知の
手法にしたがってホモおよびヘテロ二官能性試薬によっ
て行なうことができる。当業者は、重合される抗体の抗
原結合特性に影響を与えない試薬を選択するだろう。架
橋された抗体は、適切なクロマトグラフィー手法により
そのサイズにしたがって分離される。
【００３８】好ましくは、架橋(R1)試薬は、0.1〜200μ
g/ml、より好ましくは１〜100μg/ml、最も好ましくは
２〜50μg/mlの濃度で使用される。
g/ml、より好ましくは１〜100μg/ml、最も好ましくは
２〜50μg/mlの濃度で使用される。
【００３９】したがって、化学架橋された免疫グロブリ
ンを含むオリゴマー試薬をさらなる特徴とする本発明の
方法は、もう１つの好ましい実施形態に相当する。最も
好ましくは、架橋免疫グロブリンはGクラスの免疫グロ
ブリン(IgG)である。
ンを含むオリゴマー試薬をさらなる特徴とする本発明の
方法は、もう１つの好ましい実施形態に相当する。最も
好ましくは、架橋免疫グロブリンはGクラスの免疫グロ
ブリン(IgG)である。
【００４０】さらなる好ましい実施形態は、サンプル中
のアナライトを、多価担体試薬と、該担体に結合したま
たは結合可能なアナライト-誘導体と、アナライト特異
的結合パートナー(R1)とのアナライト依存型の集合また
は凝集に基づいて検出するための均一系アッセイ法であ
って、該結合パートナー(R1)が、(R1)に対する結合部位
を少なくとも２つ有する試薬(R2)によってオリゴマー化
されていることを特徴とするアッセイ法である。
のアナライトを、多価担体試薬と、該担体に結合したま
たは結合可能なアナライト-誘導体と、アナライト特異
的結合パートナー(R1)とのアナライト依存型の集合また
は凝集に基づいて検出するための均一系アッセイ法であ
って、該結合パートナー(R1)が、(R1)に対する結合部位
を少なくとも２つ有する試薬(R2)によってオリゴマー化
されていることを特徴とするアッセイ法である。
【００４１】試薬(R2)によって「オリゴマー化された」
という用語は、モノマーの結合パートナー(R1)が、(R2)
とインキュベートすることによってオリゴマーになるこ
とを表すために使用される。(R2)試薬は、(R1)に対する
結合部位を少なくとも２つ有する。(R2)は(R1)に結合す
ることによって(R1)をオリゴマーにする。日常実験によ
って、検査中のアナライトまたはアッセイに適した(R1)
および(R2)の濃度が選択される。
という用語は、モノマーの結合パートナー(R1)が、(R2)
とインキュベートすることによってオリゴマーになるこ
とを表すために使用される。(R2)試薬は、(R1)に対する
結合部位を少なくとも２つ有する。(R2)は(R1)に結合す
ることによって(R1)をオリゴマーにする。日常実験によ
って、検査中のアナライトまたはアッセイに適した(R1)
および(R2)の濃度が選択される。
【００４２】測定に供されるアナライトに依存して、(R
1)と(R2)の両方の試薬の濃度は0.1μg/ml〜300μg/mlで
変動可能である。交差力価測定法で、(R1)と(R2)の両方
の最適濃度が選択される。
1)と(R2)の両方の試薬の濃度は0.1μg/ml〜300μg/mlで
変動可能である。交差力価測定法で、(R1)と(R2)の両方
の最適濃度が選択される。
【００４３】好ましくは、少なくとも２価の(R2)試薬に
よってオリゴマー化されるモノマーの(R1)試薬は、0.1
〜500μg/ml、好ましくは１〜200μg/ml、より好ましく
は２〜100μg/ml、最も好ましくは３〜50μg/mlの濃度
範囲で使用される。
よってオリゴマー化されるモノマーの(R1)試薬は、0.1
〜500μg/ml、好ましくは１〜200μg/ml、より好ましく
は２〜100μg/ml、最も好ましくは３〜50μg/mlの濃度
範囲で使用される。
【００４４】試薬(R2)は、(R1)に関して使用される。(R
2)１部に対して(R1)10部から、(R2)５部に対して(R1)１
部までの範囲の相対モル濃度が好ましい。より好ましく
は、(R2)と(R1)比は、5:1〜1:3の範囲であり、最も好ま
しくは、(R2)と(R1)比は、3:1〜1:2の範囲である。
2)１部に対して(R1)10部から、(R2)５部に対して(R1)１
部までの範囲の相対モル濃度が好ましい。より好ましく
は、(R2)と(R1)比は、5:1〜1:3の範囲であり、最も好ま
しくは、(R2)と(R1)比は、3:1〜1:2の範囲である。
【００４５】好ましくは、試薬(R2)は、(R1)と反応性の
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む免
疫学的試薬である。最も好ましい(R2)はポリクローナル
抗体である。各抗体は、その抗原に対する結合部位を少
なくとも２つ有するので、(R1)に対する抗体は、必然的
に、(R1)のオリゴマー化に必要な結合部位を少なくとも
２つ含む。
モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を含む免
疫学的試薬である。最も好ましい(R2)はポリクローナル
抗体である。各抗体は、その抗原に対する結合部位を少
なくとも２つ有するので、(R1)に対する抗体は、必然的
に、(R1)のオリゴマー化に必要な結合部位を少なくとも
２つ含む。
【００４６】図１〜３に示したように、オリゴマー(R1)
の使用により、R1が化学的にオリゴマー化されている
か、少なくとも二価の試薬(R2)によってオリゴマー化さ
れているかとは無関係に、示された標準曲線で例示され
る測定範囲の調節がもたらされる。調節された標準曲線
は、低濃度範囲で勾配がより小さくなっており、高濃度
範囲で勾配がより大きくなっている。
の使用により、R1が化学的にオリゴマー化されている
か、少なくとも二価の試薬(R2)によってオリゴマー化さ
れているかとは無関係に、示された標準曲線で例示され
る測定範囲の調節がもたらされる。調節された標準曲線
は、低濃度範囲で勾配がより小さくなっており、高濃度
範囲で勾配がより大きくなっている。
【００４７】標準曲線の勾配が大きくなればなるほど、
対応する濃度範囲での測定がより正確になることは当技
術分野では一般的に知られている。図１〜３に示した例
では、高濃度範囲で勾配がより大きくなった曲線によっ
て、より豊富なアナライトの測定が改良される。このこ
とは、２つの異なるアナライト、すなわち図１および２
のHbAlcならびに図３のゲンタマイシンでそれぞれ実証
されている。
対応する濃度範囲での測定がより正確になることは当技
術分野では一般的に知られている。図１〜３に示した例
では、高濃度範囲で勾配がより大きくなった曲線によっ
て、より豊富なアナライトの測定が改良される。このこ
とは、２つの異なるアナライト、すなわち図１および２
のHbAlcならびに図３のゲンタマイシンでそれぞれ実証
されている。
【００４８】本発明は、対象のサンプル中に10-7M以上
の濃度で存在することが知られているアナライトの測定
に広く適用可能である。
の濃度で存在することが知られているアナライトの測定
に広く適用可能である。
【００４９】表１に列挙した診断上関心のあるアナライ
トは、生物学的サンプル中にかなり様々な濃度で存在す
るということが表１から明らかである。例えば、要求さ
れるアッセイ感度(LDL=下方検出限界)は、ジゴキシンに
ついての1.9×10-10Mからバルプロ酸についての2.1×10
-5Mまでの範囲である。オリゴマー(R1)が10-7以上のLDL
を必要とするアナライトの測定にきわめて有用であるこ
とが分かった。当業者は測定範囲を認識しているので、
アッセイのLDLは、医者にとって関連のある濃度に適合
するように調節される。
トは、生物学的サンプル中にかなり様々な濃度で存在す
るということが表１から明らかである。例えば、要求さ
れるアッセイ感度(LDL=下方検出限界)は、ジゴキシンに
ついての1.9×10-10Mからバルプロ酸についての2.1×10
-5Mまでの範囲である。オリゴマー(R1)が10-7以上のLDL
を必要とするアナライトの測定にきわめて有用であるこ
とが分かった。当業者は測定範囲を認識しているので、
アッセイのLDLは、医者にとって関連のある濃度に適合
するように調節される。
【００５０】好ましい実施形態においては、本発明は、
対象のサンプル中に10-7M以上の濃度で存在することが
知られているアナライトの評価に使用される。
対象のサンプル中に10-7M以上の濃度で存在することが
知られているアナライトの評価に使用される。
【００５１】さらに好ましくは、本発明の方法は、２×
10-7〜２×10-5Mの範囲のLDLを必要とするアナライトに
使用される。
10-7〜２×10-5Mの範囲のLDLを必要とするアナライトに
使用される。
【００５２】
【表１】
【００５３】好ましい実施形態においては、改良された
均一系アッセイは、競合イムノアッセイ法に基づくもの
である。競合型のアッセイでは、サンプル中のアナライ
トは、限られた数の(R1)結合部位に対して、担体に結合
したまたは結合可能なアナライトもしくはアナライト類
似体と競合する。サンプル中に存在するアナライトが多
ければ多いほど、担体結合(または結合可能な)アナライ
ト(または誘導体)に結合しうる(R1)は少なくなる。結果
として、集合または凝集と、アナライト濃度は間接的に
相関する。
均一系アッセイは、競合イムノアッセイ法に基づくもの
である。競合型のアッセイでは、サンプル中のアナライ
トは、限られた数の(R1)結合部位に対して、担体に結合
したまたは結合可能なアナライトもしくはアナライト類
似体と競合する。サンプル中に存在するアナライトが多
ければ多いほど、担体結合(または結合可能な)アナライ
ト(または誘導体)に結合しうる(R1)は少なくなる。結果
として、集合または凝集と、アナライト濃度は間接的に
相関する。
【００５４】オリゴマーのアナライト特異的結合パート
ナー(R1)の使用を含む本発明の方法は、より高い濃度範
囲でのより正確な測定が要求されるときはいつでも、多
価担体に基づく均一系アッセイに適用可能である。
ナー(R1)の使用を含む本発明の方法は、より高い濃度範
囲でのより正確な測定が要求されるときはいつでも、多
価担体に基づく均一系アッセイに適用可能である。
【００５５】好ましい実施形態では、多価担体試薬は、
アナライト非依存型の結合ペアのメンバーで被覆された
多目的試薬である。好ましくは、本発明の方法は、アビ
ジンまたはストレプトアビジンを含む多価の多目的担体
試薬に基づく。ストレプトアビジンが最も好ましい。
アナライト非依存型の結合ペアのメンバーで被覆された
多目的試薬である。好ましくは、本発明の方法は、アビ
ジンまたはストレプトアビジンを含む多価の多目的担体
試薬に基づく。ストレプトアビジンが最も好ましい。
【００５６】多価の多目的担体材料または試薬、例えば
ストレプトアビジンを含む担体、特にストレプトアビジ
ンで被覆されたラテックス粒子は、様々な異なるアナラ
イトに対して、アッセイの開発およびコスト削減におい
て有利に使用される。本発明に基づくそのような多価の
多目的担体材料は、今や、関連のある臨床サンプル中に
かなり様々な濃度で存在する種々のアナライトの信頼で
きる検出に使用することができる。換言すると、これら
の多目的担体材料は、本発明にしたがって使用する場
合、LDLが少なくとも100倍離れた複数のアナライトに対
して使用可能である。したがって、さらに好ましい実施
形態は、臨床上関連のある濃度範囲が少なくとも100倍
離れている少なくとも２種の異なるアナライトを、担体
試薬と、該担体に結合可能なアナライト-誘導体と、ア
ナライト特異的結合パートナー(R1)とのアナライト依存
型の集合または凝集に基づいて信頼をもって測定するた
めの均一系集合または凝集アッセイにおける、多価の多
目的担体材料の使用であって、より高濃度のアナライト
を結合パートナー(R1)の存在下で測定し、かつ該結合パ
ートナー(R1)がオリゴマーであるか、または(R1)に対す
る結合部位を少なくとも２つ有する試薬(R2)によってオ
リゴマー化されていることを特徴とする、使用である。
ストレプトアビジンを含む担体、特にストレプトアビジ
ンで被覆されたラテックス粒子は、様々な異なるアナラ
イトに対して、アッセイの開発およびコスト削減におい
て有利に使用される。本発明に基づくそのような多価の
多目的担体材料は、今や、関連のある臨床サンプル中に
かなり様々な濃度で存在する種々のアナライトの信頼で
きる検出に使用することができる。換言すると、これら
の多目的担体材料は、本発明にしたがって使用する場
合、LDLが少なくとも100倍離れた複数のアナライトに対
して使用可能である。したがって、さらに好ましい実施
形態は、臨床上関連のある濃度範囲が少なくとも100倍
離れている少なくとも２種の異なるアナライトを、担体
試薬と、該担体に結合可能なアナライト-誘導体と、ア
ナライト特異的結合パートナー(R1)とのアナライト依存
型の集合または凝集に基づいて信頼をもって測定するた
めの均一系集合または凝集アッセイにおける、多価の多
目的担体材料の使用であって、より高濃度のアナライト
を結合パートナー(R1)の存在下で測定し、かつ該結合パ
ートナー(R1)がオリゴマーであるか、または(R1)に対す
る結合部位を少なくとも２つ有する試薬(R2)によってオ
リゴマー化されていることを特徴とする、使用である。
【００５７】下記の実施例、参考文献および図面は、特
許請求の範囲に記載した本発明の範囲の理解を促すため
に提供されるものである。本発明の範囲を逸脱すること
なく明示した手順に変更修正がなされ得ることは理解さ
れるだろう。
許請求の範囲に記載した本発明の範囲の理解を促すため
に提供されるものである。本発明の範囲を逸脱すること
なく明示した手順に変更修正がなされ得ることは理解さ
れるだろう。
【００５８】図面の説明 図１は、二次抗体の添加によるHbAlc-アッセイにおける
感度の調節を示す図である。様々な量のポリクローナル
ヒツジ抗マウス免疫グロブリンγ鎖抗体(=PAb<M-Fcg>S-
IgG)を反応混合物に加えた。例えば20μgについての上
方の較正曲線は、より高濃度範囲において傾きが大きく
なっており、例えばPab<MFcg>S-IgGを添加していない急
勾配の較正曲線から読み取った測定値と比較して、高濃
度で存在するアナライトを含むサンプルの測定をより正
確かつ信頼できるものにする。
感度の調節を示す図である。様々な量のポリクローナル
ヒツジ抗マウス免疫グロブリンγ鎖抗体(=PAb<M-Fcg>S-
IgG)を反応混合物に加えた。例えば20μgについての上
方の較正曲線は、より高濃度範囲において傾きが大きく
なっており、例えばPab<MFcg>S-IgGを添加していない急
勾配の較正曲線から読み取った測定値と比較して、高濃
度で存在するアナライトを含むサンプルの測定をより正
確かつ信頼できるものにする。
【００５９】図２は、化学架橋された抗体の使用による
HbAlc-アッセイにおける感度の調節を示す図である。こ
の場合、ポリマー(R1)試薬として、ヒツジから免疫精製
した、化学重合されたポリクローナル抗HbAlc抗体(=PAB
<HbAlc>S-IgG(IS)-ポリマー)を10〜40μg/mlで加えた。
30〜40μg/mlのポリマーPABの存在下では、40μg/mlの
モノマー(=PAB<HbAlc>S-IgG(IS)-モノマー)R1抗体を用
いて行なったアッセイと比較して、アッセイの較正曲線
が有意に相違している、すなわち調節されていることは
明らかである。
HbAlc-アッセイにおける感度の調節を示す図である。こ
の場合、ポリマー(R1)試薬として、ヒツジから免疫精製
した、化学重合されたポリクローナル抗HbAlc抗体(=PAB
<HbAlc>S-IgG(IS)-ポリマー)を10〜40μg/mlで加えた。
30〜40μg/mlのポリマーPABの存在下では、40μg/mlの
モノマー(=PAB<HbAlc>S-IgG(IS)-モノマー)R1抗体を用
いて行なったアッセイと比較して、アッセイの較正曲線
が有意に相違している、すなわち調節されていることは
明らかである。
【００６０】図３は、二次抗体の使用によるゲンタマイ
シンアッセイにおける感度の調節を示す図である。二価
の(R2)試薬(PAb<M-Fcg>S-IgG)の添加量を増大させるに
つれて、示されたアッセイの場合ゲンタマイシンのアッ
セイ感度の減少が生じた。
シンアッセイにおける感度の調節を示す図である。二価
の(R2)試薬(PAb<M-Fcg>S-IgG)の添加量を増大させるに
つれて、示されたアッセイの場合ゲンタマイシンのアッ
セイ感度の減少が生じた。
【００６１】
【実施例】実施例１：二次抗体の添加によるHbAlc-アッ
セイにおける感度の調節 a) SALTINIA法の原理 SALTINIA法を用いて、HbAlcアッセイを開発した。SALTI
NIAは、ストレプトアビジンラテックス比濁阻害イムノ
アッセイ(Streptavidin latex turbidimetricinhibitio
n immunoassay)を意味する。この方法は、米国特許第5,
858,803号に詳細に記載されている。この技術において
は、直径約130nmの「万能」(すなわち多価かつ多目的)
のSA被覆ラテックス粒子を使用した。
セイにおける感度の調節 a) SALTINIA法の原理 SALTINIA法を用いて、HbAlcアッセイを開発した。SALTI
NIAは、ストレプトアビジンラテックス比濁阻害イムノ
アッセイ(Streptavidin latex turbidimetricinhibitio
n immunoassay)を意味する。この方法は、米国特許第5,
858,803号に詳細に記載されている。この技術において
は、直径約130nmの「万能」(すなわち多価かつ多目的)
のSA被覆ラテックス粒子を使用した。
【００６２】SALTINIAアッセイは競合または阻害型のア
ッセイである。これは、サンプル中のアナライトが、二
価の抗アナライト抗体への結合に対して、ビオチン-ア
ナライト結合体と競合することを意味する。ビオチン-
ハプテン結合体が抗体に結合する場合、三次元複合体が
形成される。これは、複数のビオチン-ハプテン結合体
が、ラテックス粒子に被覆されているストレプトアビジ
ンに対し、ビオチン側により結合するからである。サン
プル中に存在する(競合する)アナライトが多ければ多い
ほど、形成される三次元複合体または凝集体は少なくな
る。
ッセイである。これは、サンプル中のアナライトが、二
価の抗アナライト抗体への結合に対して、ビオチン-ア
ナライト結合体と競合することを意味する。ビオチン-
ハプテン結合体が抗体に結合する場合、三次元複合体が
形成される。これは、複数のビオチン-ハプテン結合体
が、ラテックス粒子に被覆されているストレプトアビジ
ンに対し、ビオチン側により結合するからである。サン
プル中に存在する(競合する)アナライトが多ければ多い
ほど、形成される三次元複合体または凝集体は少なくな
る。
【００６３】b) HbAlc-試薬 HbAlcに対する抗体を、米国特許第4,247,533号(ポリク
ローナル抗体)または欧州特許316306号および欧州特許2
01187号(モノクローナル抗体)に記載の手順にしたがっ
て産生させた。ヘモグロビンβ鎖の４個のN末端アミノ
酸を含み、C末端がビオチン化されており、かつN末端に
グリケート(glycated)バリンを含むビオチン化グリケー
トHbAlc-ペプチド(bi-HbAlc)を使用した。ビオチン化ペ
プチドを、例えば米国特許第5,804,371号またはFields
およびNoble, Int. J.Peptide Res.35(1990)161-214に
記載されたような通常の固相合成手順にしたがって合成
し、その後、0.2Mのリン酸ナトリウムバッファー(pH7.
4)中、室温にて20倍モル過剰のグルコースとともに21日
間インキュベートすることによってグリケート化した。
ローナル抗体)または欧州特許316306号および欧州特許2
01187号(モノクローナル抗体)に記載の手順にしたがっ
て産生させた。ヘモグロビンβ鎖の４個のN末端アミノ
酸を含み、C末端がビオチン化されており、かつN末端に
グリケート(glycated)バリンを含むビオチン化グリケー
トHbAlc-ペプチド(bi-HbAlc)を使用した。ビオチン化ペ
プチドを、例えば米国特許第5,804,371号またはFields
およびNoble, Int. J.Peptide Res.35(1990)161-214に
記載されたような通常の固相合成手順にしたがって合成
し、その後、0.2Mのリン酸ナトリウムバッファー(pH7.
4)中、室温にて20倍モル過剰のグルコースとともに21日
間インキュベートすることによってグリケート化した。
【００６４】c) アッセイ手順 測定を行なうために、２μlのサンプルまたはキャリブ
レータをピペッティング操作により日立アナライザーの
キュベットに入れ、ビオチン化HbAlc-結合体を含む200
μlのR1試薬を加え、混合した。５分後、50μlの第２の
試薬R2(この試薬R2はHbAlc特異的抗体とSA被覆ラテック
ス粒子を含む)を加えた。ただちに反応混合物を撹拌
し、凝集反応を開始させた。５分間反応させた後、濁度
を546nmの波長で測定した。アナライト濃度の計算のた
めに、反応開始時の濁度シグナルと５分後の濁度シグナ
ルの差を使用した。
レータをピペッティング操作により日立アナライザーの
キュベットに入れ、ビオチン化HbAlc-結合体を含む200
μlのR1試薬を加え、混合した。５分後、50μlの第２の
試薬R2(この試薬R2はHbAlc特異的抗体とSA被覆ラテック
ス粒子を含む)を加えた。ただちに反応混合物を撹拌
し、凝集反応を開始させた。５分間反応させた後、濁度
を546nmの波長で測定した。アナライト濃度の計算のた
めに、反応開始時の濁度シグナルと５分後の濁度シグナ
ルの差を使用した。
【００６５】下記の試薬を使用した：
【００６６】マウスIgGに対して誘導されたポリクロー
ナル抗体の添加により、マルチマー<HbAlc>-抗体凝集体
がその場で(in situ)形成され、これは、0-キャリブレ
ータの濁度シグナルを高めかつ較正曲線の傾きを減らす
ことができる（図１）。
ナル抗体の添加により、マルチマー<HbAlc>-抗体凝集体
がその場で(in situ)形成され、これは、0-キャリブレ
ータの濁度シグナルを高めかつ較正曲線の傾きを減らす
ことができる（図１）。
【００６７】実施例２：PAb<HbAlc>S-IgG(IS)のIg-Gの
架橋 合成で得たHbAlc-ペプチド(例えば実施例1b)をウシ血清
アルブミンに化学的に結合させた。このハプテン-担体
結合体を用いてヒツジを免疫し、ポリクローナルヒツジ
抗HbAlc(=PAb<HbAlc>S-IgG)をCNBr活性化セファロース
に結合したHbAlc-ペプチドを用いて免疫精製した。免疫
吸着後のこのポリクローナル抗体を、PAb<HbAlc>S-IgG
(IS)と呼ぶ。
架橋 合成で得たHbAlc-ペプチド(例えば実施例1b)をウシ血清
アルブミンに化学的に結合させた。このハプテン-担体
結合体を用いてヒツジを免疫し、ポリクローナルヒツジ
抗HbAlc(=PAb<HbAlc>S-IgG)をCNBr活性化セファロース
に結合したHbAlc-ペプチドを用いて免疫精製した。免疫
吸着後のこのポリクローナル抗体を、PAb<HbAlc>S-IgG
(IS)と呼ぶ。
【００６８】50mgのPAb<HbAlc>S-IgG(IS)を0.05モル/リ
ットルのリン酸カリウムバッファー(pH7.5)2mlに溶解
し、ジオキサンに溶解したスベリン酸ジスクシンイミジ
ル(Pierce製、7.4mg/ml)0.4mlを撹拌しながら加えた。2
5℃で２時間インキュベートした後、リシン塩酸塩(0.1
モル/リットル)を0.2ml加えることによって反応を停止
させた。反応バッチを0.2mlのリン酸カリウムバッファ
ー(前掲)0.2mlで希釈し、遠心分離にかけた。上清をUlt
rogel AcA202カラム(LKB, Grafelfing, ドイツ連邦共和
国)で脱塩し、45mgのタンパク質を含む11.3mlが得られ
た。この調製物の一部を、Superose-6-カラム(Deutsche
Pharmacia GmbH)で、リン酸カリウムバッファー(pH7.
0、0.05モル/リットル)中0.5ml/分の流量にて分画し、
約300,000〜1.5×106の分子量を有する画分をさらに使
用した。
ットルのリン酸カリウムバッファー(pH7.5)2mlに溶解
し、ジオキサンに溶解したスベリン酸ジスクシンイミジ
ル(Pierce製、7.4mg/ml)0.4mlを撹拌しながら加えた。2
5℃で２時間インキュベートした後、リシン塩酸塩(0.1
モル/リットル)を0.2ml加えることによって反応を停止
させた。反応バッチを0.2mlのリン酸カリウムバッファ
ー(前掲)0.2mlで希釈し、遠心分離にかけた。上清をUlt
rogel AcA202カラム(LKB, Grafelfing, ドイツ連邦共和
国)で脱塩し、45mgのタンパク質を含む11.3mlが得られ
た。この調製物の一部を、Superose-6-カラム(Deutsche
Pharmacia GmbH)で、リン酸カリウムバッファー(pH7.
0、0.05モル/リットル)中0.5ml/分の流量にて分画し、
約300,000〜1.5×106の分子量を有する画分をさらに使
用した。
【００６９】実施例３：化学架橋された抗体の使用によ
るHbAlc-アッセイにおける感度の調節 アッセイ条件は実施例１に記載した条件と同一である。
この実験では、R1試薬におけるPAB<M-Fcγ>S-IgG(IS)の
添加によってポリマー抗HbAlc抗体は形成しない。この
場合、モノマーMAB抗HbAlcの代わりに、実施例２にした
がって様々な濃度で産生させたポリマーPAB抗HbAlcを用
いた。図２に示したように、この化学架橋されたポリマ
ー抗体を用いることにより、同じモノマー抗体と比較し
て較正曲線の傾きが要求に応じて調節されていた。例え
ば、30μg/mlのR1を用いることにより、低濃度範囲では
傾きは小さくなるものの、かなり低濃度のアナライトの
測定にも依然として完全に適合しており、高濃度範囲で
は曲線の傾きが大きくなり、よってその濃度範囲での正
確な測定に非常に適合していた。
るHbAlc-アッセイにおける感度の調節 アッセイ条件は実施例１に記載した条件と同一である。
この実験では、R1試薬におけるPAB<M-Fcγ>S-IgG(IS)の
添加によってポリマー抗HbAlc抗体は形成しない。この
場合、モノマーMAB抗HbAlcの代わりに、実施例２にした
がって様々な濃度で産生させたポリマーPAB抗HbAlcを用
いた。図２に示したように、この化学架橋されたポリマ
ー抗体を用いることにより、同じモノマー抗体と比較し
て較正曲線の傾きが要求に応じて調節されていた。例え
ば、30μg/mlのR1を用いることにより、低濃度範囲では
傾きは小さくなるものの、かなり低濃度のアナライトの
測定にも依然として完全に適合しており、高濃度範囲で
は曲線の傾きが大きくなり、よってその濃度範囲での正
確な測定に非常に適合していた。
【００７０】実施例４：二次抗体の使用によるゲンタマ
イシンアッセイにおける感度の調節 このアッセイにもSALTINIA法を使用した。HbAlc試薬の
代わりにゲンタマイシン特異的試薬を用いた。アッセイ
バッファーおよびアッセイ条件は実施例２と比べて下記
のように若干変更した：
イシンアッセイにおける感度の調節 このアッセイにもSALTINIA法を使用した。HbAlc試薬の
代わりにゲンタマイシン特異的試薬を用いた。アッセイ
バッファーおよびアッセイ条件は実施例２と比べて下記
のように若干変更した：
【００７１】ゲンタマイシンアッセイにおいて、3μlの
サンプルまたはキャリブレータをピペッティング操作に
より日立アナライザーのキュベットに入れ、ビオチン化
ゲンタマイシンを含むR1-試薬180μlを加えた。撹拌
し、５分間インキュベートした後、MAB抗ゲンタマイシ
ンおよびSA被覆ラテックス粒子を含む試薬2(R2)80μlを
加えた。ただちに反応混合物を撹拌し、凝集反応を開始
させた。5分間反応させた後、濁度を546nmの波長で測定
した。アナライト濃度の計算のために、反応開始時の濁
度シグナルと５分後の濁度シグナルの差を使用した。
サンプルまたはキャリブレータをピペッティング操作に
より日立アナライザーのキュベットに入れ、ビオチン化
ゲンタマイシンを含むR1-試薬180μlを加えた。撹拌
し、５分間インキュベートした後、MAB抗ゲンタマイシ
ンおよびSA被覆ラテックス粒子を含む試薬2(R2)80μlを
加えた。ただちに反応混合物を撹拌し、凝集反応を開始
させた。5分間反応させた後、濁度を546nmの波長で測定
した。アナライト濃度の計算のために、反応開始時の濁
度シグナルと５分後の濁度シグナルの差を使用した。
【００７２】オリゴマー抗体を用いるHbAlcアッセイと
同様に、ゲンタマイシンアッセイにおいて、マルチマー
抗ゲンタマイシン抗体凝集体を、マウスIgGに対して誘
導されたポリクローナル抗体の添加によりその場で形成
した。その場で形成したマルチマー抗ゲンタマイシン凝
集体は、要求に応じて較正曲線の傾きを調整することが
できた。これによって、より高濃度のゲンタマイシンで
は曲線の傾きがより大きくなり(図３)、高濃度のアナラ
イトを含むサンプル中でのゲンタマイシンの測定がより
正確なものになる。
同様に、ゲンタマイシンアッセイにおいて、マルチマー
抗ゲンタマイシン抗体凝集体を、マウスIgGに対して誘
導されたポリクローナル抗体の添加によりその場で形成
した。その場で形成したマルチマー抗ゲンタマイシン凝
集体は、要求に応じて較正曲線の傾きを調整することが
できた。これによって、より高濃度のゲンタマイシンで
は曲線の傾きがより大きくなり(図３)、高濃度のアナラ
イトを含むサンプル中でのゲンタマイシンの測定がより
正確なものになる。
【００７３】参考文献一覧 米国特許第5,362,655号 欧州特許第741869号 米国特許第5,858,803号 米国特許第5,804,371号 欧州特許第201187号 欧州特許第316306号 米国特許第4,247,533号 Scholer, A.ら, Clin. Chem. 43(1997)92-99 Tijssen, "Laboratory techniques in biochemistry an
d molecular biology",第11章(巨大分子コンジュゲーシ
ョン)(1985) David Wild, The Immunoassay Handbook, 第２版 (2000
年11月)177-194 Whicher, J.T.ら, Crit Rev Clin Lab Sci(1983) 213-6
0 Fields, G.B.およびNoble R.L., Int. J.Peptide Res.3
5(1990)161-214
d molecular biology",第11章(巨大分子コンジュゲーシ
ョン)(1985) David Wild, The Immunoassay Handbook, 第２版 (2000
年11月)177-194 Whicher, J.T.ら, Crit Rev Clin Lab Sci(1983) 213-6
0 Fields, G.B.およびNoble R.L., Int. J.Peptide Res.3
5(1990)161-214
【図１】二次抗体の添加によるHbAlc-アッセイにおける
感度の調節を示すグラフである。
感度の調節を示すグラフである。
【図２】化学架橋された抗体の使用によるHbAlc-アッセ
イにおける感度の調節を示すグラフである。
イにおける感度の調節を示すグラフである。
【図３】二次抗体の使用によるゲンタマイシンアッセイ
における感度の調節を示すグラフである。
における感度の調節を示すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１４年３月７日（２００２．３．７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/531 Ｇ０１Ｎ 33/531 Ｂ (72)発明者 ヨハン，カール ドイツ連邦共和国 ディー−82380 パイ センベルグ，ベルト−シュラッツルゼーア −シュトラーセ ７ (72)発明者 アニータ，マイヤー ドイツ連邦共和国 ディー−82327 トラ ウビング，リードシュトラーセ 70
Claims (9)
- 【請求項１】 サンプル中のアナライトを、多価担体試
薬と、該担体に結合したまたは結合可能なアナライト-
誘導体と、アナライト特異的結合パートナー(R1)とのア
ナライト依存型集合または凝集に基づいて検出するため
の均一系アッセイ法であって、該結合パートナー(R1)が
オリゴマーであるか、または(R1)に対する結合部位を少
なくとも２つ有する試薬(R2)によってオリゴマー化され
ていることを特徴とする、前記アッセイ法。 - 【請求項２】 イムノアッセイ法であることを特徴とす
る、請求項１に記載のアッセイ法。 - 【請求項３】 オリゴマーの試薬(R1)が化学架橋された
免疫グロブリンG(IgG)を含むことを特徴とする、請求項
１または２に記載のアッセイ法。 - 【請求項４】 試薬(R2)がポリクローナル抗体であるこ
とを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の
アッセイ法。 - 【請求項５】 アナライトが、対象となるサンプル中に
10-7M以上の濃度で存在することが知られていることを
特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアッ
セイ法。 - 【請求項６】 均一系イムノアッセイが競合イムノアッ
セイ手法に基づくものであることを特徴とする、請求項
１〜５のいずれか１項に記載のアッセイ法。 - 【請求項７】 担体試薬が多目的試薬であることを特徴
とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアッセイ
法。 - 【請求項８】 多価担体試薬がストレプトアビジンを含
むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記
載のアッセイ法。 - 【請求項９】 臨床上関連のある濃度範囲が少なくとも
100倍離れている少なくとも２種の異なるアナライト
を、担体試薬と、該担体に結合可能なアナライト-誘導
体と、アナライト特異的結合パートナー(R1)とのアナラ
イト依存型集合または凝集に基づいて信頼をもって測定
するための均一系集合または凝集アッセイにおける、多
価の多目的担体材料の使用であって、より高濃度のアナ
ライトを結合パートナー(R1)の存在下で測定し、かつ該
結合パートナー(R1)がオリゴマーであるか、または(R1)
に対する結合部位を少なくとも２つ有する試薬(R2)によ
ってオリゴマー化されていることを特徴とする、前記使
用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01105307 | 2001-03-07 | ||
| EP01105307.1 | 2001-03-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002296281A true JP2002296281A (ja) | 2002-10-09 |
Family
ID=8176679
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002062627A Pending JP2002296281A (ja) | 2001-03-07 | 2002-03-07 | 改良された均一系イムノアッセイ法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP2002296281A (ja) |
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| JP2007212343A (ja) * | 2006-02-10 | 2007-08-23 | Nitto Boseki Co Ltd | 抗原の測定法およびそれに用いるキット |
| JP2007530947A (ja) * | 2004-03-23 | 2007-11-01 | バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレーティッド | 試料中の分析物化学種の濃度の範囲を縮小させる方法 |
| WO2009072385A1 (ja) * | 2007-12-07 | 2009-06-11 | Alfresa Pharma Corporation | 微小粒子の凝集反応を用いる検体の免疫学的測定方法および測定用キット |
| WO2010125932A1 (ja) * | 2009-04-28 | 2010-11-04 | コニカミノルタホールディングス株式会社 | 融合タンパク質含有集合体、その製造方法及び該集合体を用いたアッセイ法 |
| US8685611B2 (en) | 2008-07-25 | 2014-04-01 | Canon Kabushiki Kaisha | Electrophotographic photosensitive member and electrophotographic apparatus |
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| JP2007512543A (ja) * | 2003-12-01 | 2007-05-17 | デイド・ベーリング・マルブルク・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | ホモジニアスな検出方法 |
| JP5426881B2 (ja) * | 2005-11-12 | 2014-02-26 | プラットフォーム・ダイアグノスティクス・リミテッド | 凝集アッセイ |
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| US9733242B2 (en) | 2012-10-07 | 2017-08-15 | Sevident, Inc. | Devices for capturing analyte |
| EP2504702A4 (en) * | 2009-11-24 | 2014-12-17 | Argos Inc | DEVICES FOR DETECTING ANALYTES |
| MX2016012055A (es) | 2014-03-20 | 2017-04-13 | Bio Rad Laboratories Inc | Ensayos de proteinas glicosiladas. |
| CN103940816B (zh) * | 2014-04-18 | 2016-04-06 | 安徽大千生物工程有限公司 | 一种测定人体甘胆酸含量的试剂盒及制备方法 |
| CN107490677A (zh) * | 2017-07-21 | 2017-12-19 | 王贤俊 | 一种羧基胶乳微球与糖化血红蛋白抗体的交联组合液及其交联方法 |
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| DE3822750A1 (de) * | 1988-07-05 | 1990-01-11 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz |
| DE3829245A1 (de) * | 1988-08-29 | 1990-03-01 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur bestimmung einer spezifisch bindefaehigen substanz |
| DE4011601A1 (de) * | 1990-04-10 | 1991-10-17 | Boehringer Mannheim Gmbh | Hapten-biotin-konjugate und ihre verwendung |
| DE69331570T2 (de) * | 1992-10-21 | 2002-10-02 | Dade Behring Inc., Deerfield | Agglutinationstest unter Anwendung eines multivalenten Liganden |
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-
2002
- 2002-03-07 US US10/093,836 patent/US20030003602A1/en not_active Abandoned
- 2002-03-07 JP JP2002062627A patent/JP2002296281A/ja active Pending
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