JP2001346578A

JP2001346578A - アミノ酸生産菌及びアミノ酸の製造法

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Publication number: JP2001346578A
Application number: JP2001117409A
Authority: JP
Inventors: Vitaliy Arkadievich Livshits; アルカディエヴィッチリフシッツヴィタリ; Vera G Dorchenko; ゲオルギエヴナドロシェンコヴェーラ; Sergei Vladimirovich Mashko; ヴラジミロヴィッチマシュコセルゲイ; Akhverdyan Valery Zavenovich; ザヴェノヴィッチアフヴェルジャンヴァレリ; Yuri Ivanovich Kozlov; イヴァノヴィッチコズロフユーリー
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2000-04-26
Filing date: 2001-04-16
Publication date: 2001-12-18
Also published as: DE60129995D1; EP1149911A2; EP1318196A1; DE60129877D1; US7179623B2; EP1149911B1; EP1318196B1; DE60129877T8; DE60129877T2; US20010049126A1; US20060030009A1; RU2212447C2; DE60129995T2; EP1149911A3; US6960455B2

Abstract

(57)【要約】【課題】スクロース資化のための非ＰＴＳ代謝経路を
コードする遺伝子群を保持するエシェリヒア・コリ菌株
を用いたアミノ酸の製造法を提供することを課題とす
る。【解決手段】スクロース非資化性のエシェリヒア属細
菌を親株として構築され、スクロース非ＰＴＳ及びＰＴ
Ｓ遺伝子群を有し、アミノ酸産生能を有するエシェリヒ
ア属細菌を用いて、スレオニン、ホモセリン、イソロイ
シン、リジン、バリン及びトリプトファン等のアミノ酸
を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、バイオテクノロジ
ーに関し、詳しくは、スクロースを唯一の炭素源として
資化し得るエシェリヒア属細菌のアミノ酸生産菌を用い
た発酵法によるアミノ酸の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】スクロース及びスクロースを含む基質
（糖蜜等）は、アミノ酸、ビタミン類及び有機酸等の工
業製品の微生物による生産の出発点として、多くの場合
に用いられている。炭水化物からのアミノ酸の製造法
は、炭水化物の炭素骨格を目的産物に変換する効率を最
適化することに努力が払われている。

【０００３】スクロース資化細菌の大半は、ホスホエノ
ールピルビン酸依存性のスクロース−６−ホスホトラン
スフェラーゼ系（スクロースＰＴＳ）によりスクロース
の取り込み及びリン酸化を行い、細胞内にスクロース−
６−リン酸を生成させる。このリン酸化物は、スクロー
ス−６−リン酸ヒドロラーゼ（インベルターゼ又はスク
ラーゼ）により、Ｄ−グルコース−６−リン酸とＤ−フ
ルクトースに加水分解される。Ｄ−フルクトースは、Ａ
ＴＰ−Ｄ−フルクトース−６−リン酸ホスホトランスフ
ェラーゼ（フルクトキナーゼ）によりリン酸化される。
このような代謝経路は、グラム陽性細菌バチルス・サブ
チリス及びストレプトコッカス・ミュータンス（Debarb
ouille et al., 1991. Res. Microbiol, 142: 757-764;
Sato etal., 1989. J. Bacteriol., 171: 263-27
1）、及びグラム陰性細菌では、分子レベルで調べられ
てきた。また、腸内細菌由来のプラスミドによってコー
ドされるｐＵＲ４００系（Aulkemeyer et al. (1991) M
ol. Microbiol. 5: 2913-2922;Schmid et al., 1988. M
ol. Microbiol 2: 1-8; Schmid et al., 1991. Mol. Mi
crobiol 5: 941-950）も報告されている。

【０００４】単離されたエシェリヒア・コリ野生株の約
５０％は、スクロース資化性であるが、現在工業的に重
要な生産菌の育種に使用されているエシェリヒア・コリ
Ｋ−１２株、Ｂ株、Ｃ株のような研究室株は、スクロー
スを資化できない。しかし、この性質は、スクロース資
化性エシェリヒア・コリ又はサルモネラ属細菌から、接
合、トランスダクション、又はクローニング手法によっ
て、スクロース資化遺伝子群を導入することによって、
容易に付与され得る（Wohlhieter et al., 1975. J. Ba
cteriol., 122:401-406; Parsell and Smith, 1975. J.
Gen. Microbiol. 87: 129-137; Alaeddinoglu and Char
les, 1979. J.Gen.Microbiol., 110:47-59; Livshits e
t al., 1982. In: Metabolic plasmids. P.132-134; Ga
rsia, 1985. Mol.Gen.Genet. 201:575-577; 米国特許第
5,175,107）。

【０００５】ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）は、
いくつかの生合成経路の主要な基礎単位の一つである。
ＰＥＰは、二酸化炭素と結合し、オキサロ酢酸を形成す
る。オキサロ酢酸は、アスパラギン酸、アスパラギン、
スレオニン、イソロイシン、メチオニン及びリジンの炭
素骨格として働く。一方、等モルのＰＥＰはエリスロー
ス−４−リン酸と縮合し、芳香族経路の共通部分の初発
中間体である３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロン
酸−７−リン酸（ＤＡＨＰ）を生成する。この代謝経路
から、トリプトファン、フェニルアラニン、及びチロシ
ンのような工業的に重要なアミノ酸が得られる。これら
の代謝産物は、ＰＥＰの利用可能性によって制限される
可能性がある。

【０００６】解糖を通して、２モルのグルコースから４
モルのＰＥＰが生成し、そのうち半ルのＰＥＰが、グル
コースの取り込みのエネルギーを供給するために必然的
に消費される。スクロースの取り込みの場合には、１モ
ルのスクロースから生じる２モルのヘキソース（グルコ
ース及びフルクトース）が同様に４モルのＰＥＰを生成
させるが、１モルのＰＥＰだけがスクロースの輸送に消
費され、生合成の炭素骨格原として利用可能なＰＥＰの
量が１．５倍に増加する。したがって、エシェリヒア・
コリのアミノ酸生産菌にスクロース資化能を付与し、ス
クロース又はスクロースを含む基質を炭素源として利用
することにより、アミノ酸生産性を向上させることが可
能となる。

【０００７】今のところ、このような技術として、スク
ロース資化能を有するエシェリヒア・コリＫ−１２に基
づくスレオニン生産菌VKPM B-3996が知られている（米
国特許第5,705,371）。VKPM B-3996株からクローニング
されたスクロース遺伝子群の制限酵素解析及び塩基配列
解析によって、これらの遺伝子は、ＰＴＳによるスクロ
ース輸送及び代謝系をコードするｐＵＲ４００（access
ion numbers: EMBL X61005; EMBL X67750, GB M38416）
とほぼ同一であることが示されている（Lengeler et a
l., 1982. J.Bacteriol.,151: 468-471; Schmid et a
l., 1988, Mol.Microbiol., 2:1-8; Schmid et al., 19
91）。

【０００８】エシェリヒア・コリでは、クロモゾームに
コードされる、スクロース資化に関する非ＰＴＳ代謝経
路も見出されている（Bockmann et al., 1992. Mol.Ge
n.Genet., 235:22-32）。この経路は、プロトン共輸送
移送系（LacY型パーミアーゼ）、インベルターゼ、フル
クトキナーゼ及びスクロース特異的リプレッサーを含ん
でいる。この非ＰＴＳ代謝系を利用して、ＰＥＰ前駆体
に由来するアミノ酸の産生をさらに向上させることがで
きる。なぜなら、スクロースの細胞内への移送がＰＥＰ
と連携していないからである。しかし、アミノ酸生産菌
の改良に対するこのようなアプローチは、未だ利用され
ていない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、スクロース
資化のための代謝経路をコードする遺伝子群、特に、ス
クロース資化のための非ＰＴＳ代謝経路を保持するエシ
ェリヒア・コリ菌株を用いたアミノ酸の製造法を提供す
ることを課題とする。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、スクロー
ス非ＰＴＳ遺伝子群をアミノ酸生産能を有するエシェリ
ヒア属細菌に導入すると、スクロースから効率よくアミ
ノ酸を生産することができることを見出し、本発明を完
成するに至った。すなわち本発明は以下のとおりであ
る。

【００１１】（１）スクロース非資化性のエシェリヒア
属細菌を親株として構築され、スクロースＰＴＳ遺伝子
群を保持し、かつ、スレオニン以外のアミノ酸生産能を
有するエシェリヒア属細菌。（２）エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである
（１）に記載のエシェリヒア属細菌。（３）アミノ酸がホモセリン、イソロイシン、リジン、
バリン、又はトリプトファンから選ばれることを特徴と
する（１）又は（２）に記載の細菌。（４）スクロース非資化性のエシェリヒア属細菌を親株
として構築され、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群を保持
し、かつ、アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属細
菌。（５）スクロース非ＰＴＳ遺伝子群が、少なくともプロ
トン共輸送移送系、フルクトキナーゼ及びインベルター
ゼをコードする遺伝子を含む（４）記載のエシェリヒア
属細菌。（６）エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリである
（４）又は（５）に記載のエシェリヒア属細菌。（７）アミノ酸がスレオニン、ホモセリン、イソロイシ
ン、リジン、バリン又はトリプトファンから選ばれるこ
とを特徴とする（４）〜（６）のいずれか一項に記載の
エシェリヒア属細菌。（８）（１）〜（７）のいずれか一項に記載の細菌を培
養し、アミノ酸を培地中に生成蓄積せしめ、該培地から
アミノ酸を採取することを特徴とするアミノ酸の製造
法。

【００１２】本発明において特記しない限り、アミノ酸
はＬ−アミノ酸である。

【００１３】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のエシェリヒア属細菌は、スクロース非資化性の
エシェリヒア属細菌を親株として構築され、スクロース
遺伝子群、特にスクロース非ＰＴＳ遺伝子群を保持し、
かつ、アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属細菌であ
る。

【００１４】スクロース非資化性のエシェリヒア属細菌
としては、アミノ酸生産能を有するか、アミノ酸生産能
を付与しうるものであれば特に制限されない。例えば、
エシェリヒア・コリＫ−１２株、Ｂ株又はＣ株又はそれ
らの誘導株が、具体的には、後述のアミノ酸生産菌等が
挙げられる。

【００１５】上記のようなアミノ酸生産能を有するエシ
ェリヒア属細菌にスクロースＰＴＳスクロースＰＴＳ遺
伝子群又はスクロース非ＰＴＳ遺伝子群を導入すると、
本発明のエシェリヒア属細菌が得られる。また、本発明
の細菌は、スクロースＰＴＳ遺伝子群、又はスクロース
非ＰＴＳ遺伝子群を導入されたエシェリヒア細菌に、ア
ミノ酸生産能を付与することによっても得ることができ
る。

【００１６】スクロース非ＰＴＳ遺伝子群は、エシェリ
ヒア属細菌で機能し得るものであれば特に制限されない
が、例えば、エシェリヒア・コリEC3132（Bockmann et
al.,1992. Mol.Gen.Genet., 235:22-32）が保持するス
クロース非ＰＴＳ遺伝子群（csc）が挙げられる。同遺
伝子群は、エシェリヒア・コリK-12 W3350csc株から調
製することができる。W3350csc株は、ルシアン・ナショ
ナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイク
ロオーガニズムス（VKPM）・デポジタリー GNIIgenetik
a（Russian National Collection of Industrial Micro
organisms（VKPM）Depositary, GNIIgenetika）（住
所：1, Dorozhny Proezd., 1, 113545, Moscow, Russi
a）に、ブダペスト条約に基づき、VKPM B-7914の登録番
号で国際寄託されている。

【００１７】前記csc遺伝子群には、プロトン共輸送移
送系（LacY型パーミアーゼ）、フルクトキナーゼ、イン
ベルターゼ、及び及びスクロース特異的リプレッサーを
コードする遺伝子が含まれている。本発明においては、
これらのうち、少なくともパーミアーゼ、フルクトキナ
ーゼ及びインベルターゼをコードする遺伝子が必要であ
る。

【００１８】尚、スクロースＰＴＳをアミノ酸生産能を
有するエシェリヒア属細菌に導入することによっても、
スクロースからアミノ酸を効率よく生産することができ
る。スクロースＰＴＳ遺伝子群としては、腸内細菌由来
のプラスミドによってコードされるｐＵＲ４００系（Au
lkemeyer et al. (1991) Mol. Microbiol. 5: 2913-292
2; Schmid et al., 1988. Mol. Microbiol 2: 1-8; Sch
mid et al., 1991. Mol. Microbiol 5: 941-950）に含
まれる遺伝子群（scr）が挙げられる。また、スクロー
スＰＴＳ遺伝子群は、トランスポゾンTn2555（Doroshen
ko et al., 1988.Molec. Biol., 22:645-658）から調製
することもできる。

【００１９】スクロース非ＰＴＳ遺伝子群又はスクロー
スＰＴＳ遺伝子群をエシェリヒア属細菌に導入するに
は、例えば、目的の遺伝子群を保持する組換えベクター
をエシェリヒア属細菌の細胞に導入することによって行
うことができる。すなわち、目的の遺伝子群を保持する
プラスミド、ファージ、トランスポゾン（Berg, D. E.a
nd Berg, C. M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)）等を
エシェリヒア属細菌の細胞に導入することによって行う
ことができる。

【００２０】ベクターとしては、pBR322、pMW118、pUC1
9等のプラスミドベクター、P1_virファージ、pMu4041の
ようなmini-Mud等のファージベクターが挙げられる。ま
た、トランスポゾンとしては、Mu、Tn10、Tn5等が挙げ
られる。

【００２１】エシェリヒア属細菌へのＤＮＡの導入は、
D.A.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326
(1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理し
てＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,
J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等により行うことができ
る。また、ＤＮＡの導入は、ファージベクターを用いた
トランスダクションによって行うこともできる。

【００２２】アミノ酸生産性を有するエシェリヒア属細
菌において、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群又はスクロー
スＰＴＳ遺伝子群を導入すると、スクロースからアミノ
酸を生産させることができる。スクロース非ＰＴＳ遺伝
子群又はスクロースＰＴＳ遺伝子群を導入するエシェリ
ヒア属細菌としては、目的とするアミノ酸を産生する能
力を有する菌株を用いる。また、スクロース非ＰＴＳ遺
伝子群又はスクロースＰＴＳ遺伝子群が導入されたエシ
ェリヒア属細菌に、アミノ酸生産性を付与してもよい。
以下に、エシェリヒア属に属するアミノ酸生産菌を例示
する。

【００２３】（１）スレオニン生産菌スレオニン生産性のエシェリヒア属細菌としては、MG44
2株（Gusyatiner et al., Genetika(in Russian), 14,
947-956 (1978)参照）、VL643及びVL2055（実施例２及
び３を参照）が挙げられる。

【００２４】（２）ホモセリン生産菌ホモセリン生産性のエシェリヒア属細菌としては、NZ10
及びNZ10rhtA23/pAL4株が挙げられる。NZ10株は、公知
のC600株（Appleyard R.K., Genetics, 39, 440-452 (1
954)参照）からLeu⁺復帰変異株として得られたものであ
る。NZ10rhtA23/pAL4株は、NZ10株から構築されたもの
である（実施例４参照）。

【００２５】（３）イソロイシン生産菌イソロイシン生産細菌としては、エシェリヒア・コリ44
-3-15、KX141（VKPM B-4781）(欧州特許出願公開第519,
113号参照）、TDH-6/pVIC40,pMWD5（WO97/08333）が挙
げられる。

【００２６】（４）リジン生産菌リジン生産性の細菌としては、エシェリヒア・コリVL61
2が好ましい（実施例５を参照）。さらに、リジン生産
性のエシェリヒア属細菌としては、リジンアナログに耐
性を有する変異株が例示できる。このリジンアナログ
は、エシェリヒア属細菌の増殖を阻害するようなもので
あるが、その抑制はリジンが培地中に共存すれば、全体
的又は部分的に解除されるようなものである。例えば、
オキサリジン、リジンハイドロキサメート、（Ｓ）−２
−アミノエチル−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）、γ−メチ
ルリジン、クロロカプロラクタム等がある。これらのリ
ジンアナログに耐性を有する変異株は、通常の人工変異
操作をエシェリヒア属の微生物に施すことにより得られ
る。リジン製造に用いる菌株として、具体的には、エシ
ェリヒア・コリＡＪ１１４４２（ＦＥＲＭＢＰ−１５
４３、ＮＲＲＬＢ−１２１８５；特開昭５６−１８５
９６号及び米国特許第４３４６１７０号参照）、エシェ
リヒア・コリ VL611が挙げられる。ＡＪ１１４４２株
は、１９８１年５月１日に、工業技術院（現産業技術総
合研究所）生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５
日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、受託番号
FERM P-5084として寄託されており、１９８７年１０月
２９日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際
寄託へ移管され、FERM BP-1543として寄託されている。
以上の微生物のアスパルトキナーゼは、リジンによるフ
ィードバック阻害が解除されている。

【００２７】その他にも、たとえばスレオニン生産菌が
挙げられる。スレオニン生産菌も、一般的にはそのアス
パルトキナーゼのリジンによる阻害が解除されているか
らである。エシェリヒア・コリのスレオニン生産菌とし
ては、エシェリヒア・コリ MG442（Gusyatiner et al.,
Genetika(in Russian), 14, 947-956 (1978)参照）が
挙げられる。

【００２８】上記のリジン生産菌において、リジン生合
成系酵素遺伝子を強化してもよい。そのような遺伝子と
しては、例えば、アスパラギン酸によるフィードバック
阻害を解除する変異を有するホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼをコードする遺伝子（特公平７−８３
７１４号公報参照）が挙げられる。

【００２９】（５）バリン生産菌バリン生産性のエシェリヒア属細菌として具体的には、
エシェリヒア・コリ VL1970（VKPM B-4411）(欧州特許
出願公開第519,113号参照）及びVL1971(実施例６参照)
が挙げられる。

【００３０】その他にも、制御機構が実質的に解除され
たバリン生合成系遺伝子を保持するエシェリヒア属細菌
が挙げられる。このようなエシェリヒア属細菌は、例え
ば、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロン、好ましくはスレオニン
デアミナーゼ活性を発現せず、アテニュエーションが解
除されたｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンをエシェリヒア属細
菌に導入することによって得られる（特開平８−４７３
９７号公報参照）。

【００３１】ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの全塩基配列は
明らかにされている（Nucleic Acids Res. 15, 2137 (1
987)）ので、この配列に基づいて調製したオリゴヌクレ
オチドを用いたコロニーハイブリダイゼーション又はＰ
ＣＲにより、エシェリヒア・コリ染色体ＤＮＡから取得
することができる。ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンを含むＤ
ＮＡ断片のエシェリヒア・コリへの導入は、前述のプラ
スミド、ファージ、トランスポゾンを用いた方法によっ
て行うことができる。

【００３２】（６）トリプトファン生産菌トリプトファン生産細菌としては、具体的には、エシェ
リヒア・コリSV164(pGH5)（実施例７を参照）、AGX17(p
GX44)〔NRRL B-12263〕及びAGX6(pGX50)aroP〔NRRL B-1
2264〕（いずれも米国特許第 4,371,614号参照）、AGX1
7/pGX50,pACKG4-pps(WO 97/08333)等が挙げられる。

【００３３】（７）フェニルアラニン生産菌フェニルアラニン生産細菌としては、エシェリヒア・コ
リ AJ 12604（FERM BP-3579)(欧州特許出願公開第 488,
424号参照）が挙げられる。

【００３４】上記のようにしてスクロース非ＰＴＳ遺伝
子群又はスクロースＰＴＳ遺伝子群が導入されたエシェ
リヒア属細菌であってアミノ酸生産能を有するものをス
クロースを含む培地で培養し、該培養物中にアミノ酸を
生産蓄積せしめ、該培養物からアミノ酸を採取すること
により、スクロースからアミノ酸を効率よく製造するこ
とができる。好適なアミノ酸としては、スレオニン、ホ
モセリン、イソロイシン、リジン、バリン、メチオニ
ン、チロシン、トリプトファン又はフェニルアラニンが
挙げられる。これらの中では、スレオニン、イソロイシ
ン、ホモセリン、リジン、バリン、トリプトファンが好
適である。

【００３５】本発明のアミノ酸の製造法におけるエシェ
リヒア属細菌の培養及び培養液からのアミノ酸の採取、
精製等は、従来の微生物を用いた発酵法によるアミノ酸
の製造法と同様にして行えばよい。培養に使用する培地
としては、炭素源、窒素源、無機物を含有し、必要があ
れば使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有する
ものであれば、合成培地でも天然培地でもよい。炭素源
としてはスクロースを主たる炭素源として用いる。スク
ロース以外の炭素源が副炭素源として少量含まれていて
もよい。窒素源としては、アンモニアや、硫酸アンモニ
ウム等の各種のアンモニウム塩類や、アミン類その他の
窒素化合物や、ペプトン、大豆加水分解物、発酵菌体分
解物等の天然窒素源を用いることができる。無機物とし
ては、燐酸一カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリ
ウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウム等が
用いられる。

【００３６】培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気
的条件下で行うことが好ましく、培養温度は２０〜４０
℃で、好ましくは３０〜３８℃の範囲で行う。培地のｐ
Ｈは通常５〜９の範囲であり、６．５〜７．２の範囲が
好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウ
ム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整するこ
とができる。通常、１〜３日の培養によって、培養液中
に目的とするアミノ酸が蓄積する。

【００３７】培養終了後、培養液から菌体などの固形物
を遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮
法、晶析法等によって目的とするアミノ酸を採取、精製
することができる。

【００３８】

【実施例】以下、本発明を詳細に説明する。

【００３９】

【実施例１】スクロースＰＴＳ遺伝子群及び非ＰＴＳ遺
伝子群供与体の調製（１）スクロースＰＴＳ遺伝子群 VD1株を、スクロース資化遺伝子群の供与体として使用
した。この菌株は、後述のようにして得た。トランスポ
ゾンTn2555は、スクロース資化遺伝子群（scr）を保持
している（Doroshenko et al., 1988. Molec. Biol., 2
2:645-658）。Tn2555のscr遺伝子群は、制限酵素解析及
び部分配列決定により、ＰＴＳ系を介してスクロース輸
送を制御するpUR400（accession numbers: EMBL X6100
5; EMBL X67750, GB M38416）のそれらとほとんど同一
であることが明らかになっている。

【００４０】Tn2555のscr遺伝子群を、mini-Mud 4041ベ
クターの誘導体であり、トランスポゼース及びリプレッ
サー遺伝子をコードするMnファージの欠失よって得られ
るpM1(M.Faelen. Useful Mu and mini-Mu derivatives.
In: Phage Mu. Symonds etal., eds. Cold Spring Har
bor Laboratory, New York, 1987, pp.309-316)にクロ
ーン化した。これは、次の２工程により行った。最初の
工程では、scrYABR遺伝子群及びscrK遺伝子の一部を含
むpBRS5.2（pBR325::Tn2555）（Doroshenko et al., 19
88. Molek.Biol. 22: 645-658）のSspI断片を、PvuIIで
消化したpM1に挿入して、pM1中のkan遺伝子と置き換え
た。上記プラスミドpM1は、次のようにして得られた
（図１）。プラスミドpMu4041は、Muファージのトラン
スポゼースをコードする遺伝子A、B及び負の制御因子を
コードするner遺伝子を切り出すため、HindIIIにより切
断し、再環状化した。この様にしてプラスミドpMD4041
が得られた。つぎに、Muファージのリプレッサーである
cts62を除去するため、pMD4041をAvaIII及びHindIIIで
切断し、T4 DNAポリメラーゼにより平滑末端化し、再環
状化した。二番目の工程では、得られたプラスミドのBa
mHI断片を、pBRS5.2のBamHI断片で置き換え、scrK遺伝
子を復帰させた。こうして、Tn2555のスクロースクラス
ター全体を、アンピシリン耐性（ampＲ）マーカー及びM
uファージ末端を含むプラスミドにクローン化した。こ
のpMS1と命名されたプラスミドは、転移可能なmini-Mu-
scrKYABR断片を含んでいる（図２）。

【００４１】mini-Mu-scrKYABRの細菌染色体への組み込
みは、標準的な方法によって行った。pMS1を、MG1655
（pMH10）の細胞に導入した。形質転換後、直ちに４２
℃での１５分のインキュベーションによってpMH10（pAC
YC177の誘導体でKm^R遺伝子、Muトランスポゼースをコー
ドするMuファージA及びB遺伝子、Muリプレッサーをコー
ドするcts62遺伝子及びラムダファージリプレッサー遺
伝子であるcI857を保持する）がコードするMuトランス
ポゼースを誘導した。スクロース資化性（Scr⁺）のクロ
ーンを、０．２％スクロースを唯一の炭素源として含む
Ｍ９寒天平板培地上で、３０℃で選択した。これを洗浄
し、抗生物質を含まないＬＢ培地(J. Miller. Experime
nts in molecular genetics. Cold Spring Harbor labo
ratory, NewYork, 1972)上で４８−７２時間培養した。
培地を適当に希釈し、０．２％スクロースを含むＭ９寒
天平板培地上に殖菌した。数１０株のアンピシリン及び
カナマイシン感受性（Amp^S, Km^S）株をつり上げ、試験
した。それらの株は、プラスミドを含んでいなかった。
それらの中から、原栄養性の、生育が速いスクロース資
化性株として、VD1株（MG1655::mini-Mu-scrKYABR）を
選択した。

【００４２】さらに、トランスポゾンTn2555(Molecular
Genetics, Microbiology and Virology, No.6, 23-28
(1987))中に、スクロース遺伝子を含むプラスミドpVG47
8を保持するVL478株を、scr遺伝子の供与株として用い
た。VL478株は、Russian National Collection of Indu
strial Microorganisms (VKPM)に、寄託番号VKPM B-791
5として寄託されている。

【００４３】上記の株は、以下の実施例において、scr
遺伝子群の供与体として用いた。（２）スクロース非ＰＴＳ遺伝子群スクロース非ＰＴＳ遺伝子群（csc）の供与原として、
エシェリヒア・コリK-12 W3350csc株を用いた。この株
は、エシェリヒア・コリEC3132（Bockmann et al.,199
2. Mol.Gen.Genet., 235:22-32）のcsc遺伝子群を保持
している。W3350株は、Russian National Collection o
f Industrial Microorganisms (VKPM)に、寄託番号VKPM
B-7914として寄託されている。このcsc遺伝子群には、
パーミアーゼ、フルクトキナーゼ、インベルターゼ、及
びリプレッサーをコードする遺伝子が含まれている。

【００４４】

【実施例２】スクロース資化性を有するエシェリヒア・
コリのスレオニン生産菌の構築及びそれを用いたスレオ
ニンの生産（１） PTS遺伝子群導入の受容菌株として、以下のようにして
エシェリヒア・コリVL643を新たに構築した。VL643株を
得るため、公知のエシェリヒア・コリMG442(Guayatiner
et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (197
8), VKPM B-1628)に、472T23/pYN7株のrhtA23変異を形
質導入した。rhtA23は、高濃度のスレオニン(40mg/ml以
上)又はホモセリン(50mg/ml以上)への耐性を付与する変
異であり、スレオニン生産を向上する(ABSTRACTS of 17
^th International Congress of Biochemistry and Molc
ular Biology in Congress of Biochemistry and Molec
ular Biology, San Francisco, Calfornia August 24-2
9, 1997, abstract No. 457)。

【００４５】得られたスレオニン生産菌株VL643を、供
与株VL478株上で生育させたファージP1_virに感染させ
た。形質導入株は、0.2%スクロースを唯一の炭素源とし
て含むＭ９寒天平板培地上で選択した。こうして、VL64
4株を得た。この株と親株をニュートリエントブロスで
３７℃で１８時間培養した。得られた培養液から0.3ml
を、20x200mm試験管中の下記組成の発酵培地3mlに接種
し、３７℃で７２時間、ロータリーシェーカーで培養し
た。培養後、培地中のスレオニンの蓄積量及び培地の56
0nmの吸光度を、公知の方法で測定した。結果を表１に
示した。

【００４６】〔発酵培地の組成（g/L）〕スクロース（又はグルコース） 50 (NH₄)₂SO₄ 10 K₂HPO₄ 1 NaCl 1 MgSO₄・7H₂O 0.8 FeSO₄・7H₂O 0.02 MnSO₄・5H₂0 0.02 塩酸チアミン 0.002 CaCO₃ 20 （MgSO₄・7H₂O及びCaCO₃は別殺菌した)

【００４７】

【表１】

【００４８】表１に示すように、VL643及びVL644株はグ
ルコースを含む培地で培養したときは、同様の生育特性
を有し、同量のスレオニンを蓄積した。しかし、VL644
株はスクロースを含む培地で培養したときに、より高い
生育特性を有し、より高い収率でスレオニンを蓄積し
た。

【００４９】

【実施例３】スクロース資化性を有するエシェリヒア・
コリのスレオニン生産菌の構築及びそれを用いたスレオ
ニンの生産（２） PTS遺伝子群導入の受容菌株として、エシェリヒア・コ
リVL2055を新たに構築した。同菌株は、公知のエシェリ
ヒア・コリVKPM B-3996株（米国特許第5,705,371）から
誘導された。

【００５０】B-3996株の宿主菌は、エシェリヒア・コリ
TDH-6株であり、thrC遺伝子を欠損し、スクロース資化
性を有し、ilvA遺伝子がリーキー変異を有している。そ
してB-3996株は、スレオニンによる阻害が実質的に解除
されたAKI-HDIをコードするthrA^*遺伝子を含むthrA^*BC
オペロンがRSF1010由来のベクターに挿入されて得られ
たプラスミドpVIC40を保持している。

【００５１】VL2055をB-3996株から次の２工程により構
築した。まず、VKPM B-3996株のプラスミドpVIC40を自
然除去させ、プラスミド非保持誘導体であるTDH-6を選
択した。次に、TDH-6株のtdh遺伝子に挿入されたTn5ト
ランスポゾンのカナマイシン耐性遺伝子（kan）を不活
化する変異体を、公知の方法（NTG変異誘導）によって
得た。そして、得られた株のスクロース資化の遺伝的因
子を除去し、スクロース非資化誘導体を得た。こうし
て、VL2053株を得た。

【００５２】一方、エシェリヒア・コリVKPM B-5318が
持つプラスミドpPRT614（EP 0593792）をHindIIIとBamH
Iで切断し、ラムダファージP_Rプロモーター下流のスレ
オニンオペロンを含む断片を切り出した。このスレオニ
ンオペロンは、アスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒド
ロゲナーゼＩにスレオニンによるフィードバック阻害に
対する耐性を付与する変異（thrA^*）をthrA遺伝子内に
持っている。得られた断片を、pMu4041（mini-Mud 404
1、Faelen, M. Useful Mu and mini-Mu derivatives. I
n: Phage Mu. Symonds et al.,eds.. Cold Spring Harb
or Laboratory, New York, 1987, pp.309-316）の誘導
体ベクターであるpM1にクローン化し、pMT2を得た(図
３)。

【００５３】さらに、pMT2に、pACYC184から得たTn9の
クロラムフェニコール耐性を付与するcat遺伝子をクロ
ーン化した。こうして、Mu末端に挟まれたPR-thrA＊BC
及びcat遺伝子（mini-Mu-thrA＊BC-cat）の転移可能な
構造体を含むプラスミドpMT1を得た（図３）。このプラ
スミドは、エシェリヒア・コリC600（pMH10）に導入し
た。形質転換後、直ちに４２℃で１５分インキュベート
して、pMH10（pACYC177の誘導体であって、KmＲ遺伝
子、MuトランスポゼースをコードするMuファージのＡ及
びＢ遺伝子、負の制御因子をコードするner遺伝子、Mu
リプレッサーをコードするcts62遺伝子を保持する。
（図４）によりコードされるMuトランスポゼースを誘導
した。クロラムフェニコール耐性（CmＲ）株を、15mg/L
のクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天平板培地上で、
３０℃で選択した。数１０株のカナマイシン感受性（Km
ｓ）株をつり上げ、試験した。それらの株のほとんど
は、プラスミドを含んでいなかった。次に、選択された
C600 Thr＋ CmＲ株の１つの染色体から、mini-Mu-thr
A＊BC-cat遺伝子を、P1virを用いてVL2053株に形質導入
した。こうして、プラスミドを保持しない新規なスレオ
ニン生産菌VL2055を得た。

【００５４】スレオニン生産菌VL2055株を、供与株であ
るVD1株及びW3350csc株上で生育させたP1virファージを
感染させた。形質導入株は、50mg/Lのイソロイシン及び
０．２％スクロースを唯一の炭素源として含むＭ９最少
培地で選択した。こうして、VL2055 Scr株及びVL2055 C
sc株を得た。これらの株を、それぞれニュートリエント
ブロスで３７℃で１８時間培養した。得られた培養液0.
3mlを、20×200mm試験管中の下記組成の発酵培地3mlに
接種し、３７℃で７２時間、ロータリーシェーカーで培
養した。培養後、培地中のスレオニンの蓄積量及び培地
の560nmの吸光度を、公知の方法で測定した。結果を表
２に示す。

【００５５】〔発酵培地の組成（g/L）〕スクロース（又はグルコース） 80 イソロイシン 0.1 (NH₄)₂SO₄22 K₂HPO₄2 NaCl 0.8 MgSO₄・7H₂O 0.8 FeSO₄・7H₂O 0.02 MnSO₄・5H₂0 0.02 塩酸チアミン 0.2 酵母エキス 1.0 CaCO₃30 （MgSO₄・7H₂O及びCaCO₃は別殺菌した)

【００５６】

【表２】

【００５７】表２に示すように、VL2055 Scr及びVL2055
Cscのスクロース資化性両株ともに、グルコースを含む
培地で培養したときはそれらの親株であるVL2055比べ
て、同様の生育特性を有し、同等のスレオニンを蓄積し
た。しかし、両株ともに、スクロースを含む培地で培養
したときに、より高い収率でスレオニンを蓄積した。こ
の条件では、VL2055 Csc株（スクロース非ＰＴＳ系を保
持する）の方が、VL2055Scr株（スクロースＰＴＳ系を
保持する）よりも高い生産性を示した。

【００５８】

【実施例４】スクロース資化性を有するエシェリヒア
・コリのホモセリン生産株の構築及びそれを用いたホモ
セリンの生産 PTS遺伝子群導入のホモセリン生産受容菌株として、エ
シェリヒア・コリNZ10rhtA23/pAL4をNZ10株を誘導させ
て構築した。エシェリヒア・コリNZ10(thrB)株は、エシ
ェリヒア・コリC600(thrB, leuB)株(appleyard R.K., G
enetics, 39, 440-452(1954))のleuB+復帰株として得ら
れる。実施例２に記載の方法で、rhtA23変異導入を行
い、NZ10 rhtA23株を得た。この株を、アスパルトキナ
ーゼ-ホモセリンデヒドロゲナーゼ IをコードするthrA
遺伝子を導入したpBR322ベクターであるプラスミドpAL4
で形質導入した。

【００５９】得られたホモセリン生産株であるNZ10 rht
A23/pAL4株を、供与株VD1株上で生育させたファージP1
_virに感染させた。形質導入株は、スレオニン50mg/lを
含み、0.2%スクロースを唯一の炭素源として含むＭ９最
小培地上で選択した。こうして、NZ10 rhtA23 scr/pAL4
株を得た。この株と親株ををニュートリエントブロスで
３７℃で１８時間培養した。得られた培養液から0.3ml
を、20x200mm試験管中の下記組成の発酵培地3mlに接種
し、３７℃で４８時間、ロータリーシェーカーで培養し
た。発酵培地は、スレオニン0.2g/lをイソロイシンの代
わりに加える以外は、実施例３に記載のものと同じであ
る。培養後、培地中のホモセリンの蓄積量及び培地の56
0nmの吸光度を、公知の方法で測定した。結果を表３に
示した。

【００６０】

【表３】

【００６１】表３に示すように、NZ10 rhtA23 Scr/pAL4
及びその親株NZ10 rhtA23/pAL4の両株ともに、グルコー
スを含む培地で培養したときは、同様の生育特性を有
し、同等のホモセリンを蓄積した。しかし、NZ10 rhtA2
3 Scr/pAL4株は、スクロースを含む培地で培養したとき
に、より高い収率でホモセリンを蓄積した。

【００６２】

【実施例５】スクロース資化性を有するエシェリヒア・
コリのイソロイシン生産菌の構築及びそれを用いたイソ
ロイシンの生産エシェリヒア属に属するイソロイシン生産菌として、エ
シェリヒア・コリK-12の誘導体である44-3-15株を用い
た。この株は、次のようにして構築した。エシェリヒア
・コリK-12の野生株VKPM B-7を、親株として用いた。Ｎ
ＴＧ変異誘導及びバリン、４−アザ−ＤＬ−ロイシン及
び３−ヒドロキシ−ＤＬ−ロイシン耐性の選択の連続処
理により、No.44株を得た。この株は、ilvGMEDAオペロ
ン中に、少なくとも２つの変異、すなわち、アセトヒド
ロキシ酸シンターゼII活性を復帰させるilvG遺伝子の変
異（ilvG^*）、及びスレオニンデアミナーゼにイソロイ
シンによるフィードバック阻害に対する耐性を付与する
ilvA遺伝子の変異（ilvA^*）を持っている。この株は、
いくらかのイソロイシンを産生する。

【００６３】一方、ilvG₅MEDA₇₄₃₄YC遺伝子を保持する
プラスミドpVR4の誘導体であるプラスミドpVR72(Gavril
ova et al., 1988, Biotechnologiya (in Russian), 4:
600-608)へ、BamHIリンカーをDraIII及びXmaIIIサイト
に導入した。次に、プロモーターとアテニュエーターを
欠損したilvG₅MEDA₇₄₃₄YC遺伝子を含むpVR72のBamHIフ
ラグメントを、mini-MudベクターであるpMu4041誘導体
でラムダファージのP_Rプロモーターを含むpM2へ導入し
た。得られたプラスミドは、上記のように、mini-Mu-PR
-ilvG^*MEDA^*YC構造体のNo.44（pMH10）の染色体への導
入に用いた。Muトランスポゼースの誘導操作後、種々の
クローンのイソロイシン生産能を調べた。それらのう
ち、最も生産能の高い株として、44-3株を選択した。最
後に、上記のようにして、C600 Thr⁺ Cm^R からmini-Mu-
PR-thrA^*BC-cat構造体を、44-3株に導入し、44-3-15株
を得た。

【００６４】得られたイソロイシン生産株である44-3-1
5株を、供与株VD1又はW3350csc株上で生育させたファー
ジP1_virに感染させた。形質導入株は、0.2%スクロース
を唯一の炭素源として含むＭ９最小培地上で選択した。
こうして、44-3-15 scr及び44-3-15 csc株を得た。

【００６５】これらの株と親株をニュートリエントブロ
スで３７℃で１８時間培養した。得られた培養液から0.
3mlを、20x200mm試験管中の下記組成の発酵培地3mlに接
種し、３７℃で７２時間、ロータリーシェーカーで培養
した。発酵培地は、イソロイシンを加えないことを除い
ては、実施例３に記載のものと同様である。培養後、培
地中のスレオニンの蓄積量及び培地の560nmの吸光度
を、公知の方法で測定した。結果を表４に示した。

【００６６】

【表４】

【００６７】表４に示すように、44-3-15 Scr及び44-3-
15 Cscの両スクロース資化性株ともに、グルコースを含
む培地で培養したときはそれらの親株である44-3-15に
比べて、同様の生育特性を有し、同等のスレオニンを蓄
積した。しかし、両株ともに、スクロースを含む培地で
培養したときに、より高い収率でイソロイシンを蓄積し
た。この条件では、44-3-15 Csc株（スクロース非ＰＴ
Ｓ系を保持する）の方が、44-3-15 Scr株（スクロース
ＰＴＳ系を保持する）よりも高い生産性を示した。

【００６８】

【実施例６】スクロース資化性を有するエシェリヒア・
コリのリジン生産菌の構築及びそれを用いたリジンの生
産リジン生産受容菌として、エシェリヒア・コリVL612を
用いた。この株は、公知のエシェリヒア・コリGif102株
(Theze, J. and Saint Girons., J. Bacteriol., 118,
990-998, 1974)から２工程を経て得られる。始めの工程
として、S-(2-アミノエチル)-L-システイン 2mg/mlの耐
性変異株を選択した。それらの中からリジン生産能を有
するVL611株を得た。次の工程として、rhtA23変異をVL6
11株へ上記のように導入し、VL612株を得た。

【００６９】VL612株を、供与株であるVL478株上で生育
させたP1_virファージで感染させた。形質導入株は、ホ
モセリン 50mg/lを含む０．２％スクロースを唯一の炭
素源として含むＭ９最少培地で選択した。こうして、VL
613株(VKPM B-3423)を得た。この株と親株を、それぞれ
ニュートリエントブロスで３７℃で１８時間培養した。
得られた培養液0.3mlを、20×200mm試験管中の発酵培地
3mlに接種し、３７℃で７２時間、ロータリーシェーカ
ーで培養した。発酵培地は、ホモセリン 0.2g/lを加え
ることを除いては実施例2記載のものと同様である。培
養後、培地中のリジンの蓄積量及び培地の560nmの吸光
度を、公知の方法で測定した。結果を表５に示す。

【００７０】

【表５】

【００７１】表５に示すように、VL612及びVL613の両株
ともに、グルコースを含む培地で培養したときは、同様
の生育特性を有し、同等のリジンを蓄積した。しかし、
VL613は、スクロースを含む培地で培養したときに、よ
り高い収率でリジンを蓄積した。

【００７２】

【実施例７】スクロース資化性を有するエシェリヒア・
コリバリン生産菌株の構築及びそれを用いたバリンの生
産バリン生産性を有するエシェリヒア属細菌として、エシ
ェリヒア・コリVL1971を用いた。この株は、実施例１記
載のrhtA23変異を導入した公知のエシェリヒア・コリVL
1970株(VKPM B-4411, US Patent No.5,658,766)から得
られる。

【００７３】VL1971株を、供与株であるVL478株上で生
育させたP1_virファージで感染させ、０．２％スクロー
スを唯一の炭素源として含むＭ９最少培地で培養した。
形質導入株を４０時間培養後、つり上げ、精製し、これ
らの中からスクロース資化性を有すバリン生産菌株VL19
72(VKPM B-4413)を選択した。VL1971及びVL1972株を、
それぞれニュートリエントブロスで３７℃で１８時間培
養した。得られた培養液0.3mlを、20×200mm試験管中の
発酵培地3mlに接種し、３７℃で７２時間、ロータリー
シェーカーで培養した。発酵培地は、実施例３記載のも
のと同様である。培養後、培地中のバリンの蓄積量及び
培地の560nmの吸光度を、公知の方法で測定した。結果
を表６に示す。

【００７４】

【表６】

【００７５】表６に示すように、VL1971及びVL1972の両
株ともに、グルコースを含む培地で培養したときは、同
様の生育特性を有し、同等のバリンを蓄積した。しか
し、VL1972は、スクロースを含む培地で培養したとき
に、より高い収率でバリンを蓄積した。ホスホエノール
ピルビン酸は、バリン合成には必要ではないにも係わら
ず、ＰＴＳスクロース遺伝子が高い生産性をバリン生産
株に付与することは、特記すべきである。

【００７６】

【実施例８】スクロース資化性を有するエシェリヒア・
コリのトリプトファン生産菌の構築及びそれを用いたト
リプトファンの生産エシェリヒア属細菌の受容菌として、エシェリヒア属細
菌SV164(pGH5)(WO94/08031)を用いた。

【００７７】トリプトファン過剰生産菌株であるSV164
(pGH5)株を、供与株であるVD1又はW3550csc株上で生育
させたP1_virファージで感染させた。形質導入株は、チ
ロシン50mg/l、フェニルアラニン50mg/ml、テトラサイ
クリン15mg/lを含む０．２％スクロースを唯一の炭素源
とするＭ９最少培地で選択した。SV164scr(pGH5)及びSV
164csc(pGH5)をそれぞれ得た。これらの株と親株を、そ
れぞれニュートリエントブロスで２９℃で１８時間培養
した。得られた培養液0.3mlを、20×200mm試験管中の以
下記載の組成を有する発酵培地3mlに接種し、２９℃で
４０時間、ロータリーシェーカーで培養した。

【００７８】〔発酵培地の組成（g/L）〕グルコース（又はスクロース） 40 フェニルアラニン 0.1 チロシン 0.1 (NH₄)₂SO₄ 15 K₂HPO₄ 1.5 NaCl 0.5 MgSO₄・7H₂O 0.3 CaCl₂・2H₂O 0.015 FeSO₄・7H₂O 0.075 Na₃-citrate 1 NaMoO₄・2H₂O 0.00015 H₃BO₃ 0.0025 CoCl₂・6H₂O 0.0007 CuSO₄・5H₂O 0.00025 MnCl₂・4H₂O 0.0016 ZnSO₄・7H₂O 0.0003 塩酸チアミン 0.005 ピリドキシン 0.03 固体コーンスティープ 2 （味の素） CaCO₃ 30 テトラサイクリン 0.015

【００７９】培養後、培地中のトリプトファンの蓄積量
及び培地の560nmの吸光度を、公知の方法で測定した。
結果を表７に示す。

【００８０】表７に示すように、SV164scr(pGH5)及びSV
164csc(pGH5)の両スクロース資化性菌株は、グルコース
を含む培地で培養したときは、それらの親株であるSV16
4(pGH5)と同様の生育特性を有し、同等のトリプトファ
ンを蓄積した。しかし、これらの株は、スクロースを含
む培地で培養したときに、高い収率でより多くのトリプ
トファンを蓄積した。さらに、この条件下では、SV164c
sc(pGH5)（非ＰＴＳ遺伝子群を保持する）は、SV164scr
(pGH5)（スクロースPTS遺伝子群を保持する）より高い
生産性を示した。

【００８１】

【表７】

【００８２】

【発明の効果】本発明により、親株がスクロース非資化
性のエシェリヒア属細菌であっても、スクロースから効
率よくアミノ酸を生産することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 mini-Mud 4041の誘導体であるpM1及びpM2の
構築過程を示す図。

【図２】 pM1上のscr遺伝子群の単離過程を示す図。

【図３】プラスミドpMT1及びpMT2の構築過程を示す
図。

【図４】 Km^R遺伝子、Muトランスポゼースをコードす
るMuファージA及びB、負のリプレッサーをコードするne
r遺伝子、Muリプレッサーをコードするcts62遺伝子を保
持するプラスミドpMH10の構築過程を示す図。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｄ 13/22 Ａ 13/22 (Ｃ１２Ｐ 13/06 //(Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/08 (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ａ (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者セルゲイヴラジミロヴィッチマシュコロシア連邦、105043、モスクワ市、ニージュニャヤペルヴォマイスカヤ通り５番地、16号室 (72)発明者ヴァレリザヴェノヴィッチアフヴェルジャンロシア連邦、117593、モスクワ市、ソロヴィヌイ通り２番地、274号室 (72)発明者ユーリーイヴァノヴィッチコズロフロシア連邦、117574、モスクワ市、ゴルビンスカヤ通り７番地、178号室Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA10 BA71 BA72 BA73 BA75 CA02 DA06 EA04 GA11 GA19 HA01 4B064 AE05 AE07 AE09 AE10 AE25 AE34 CA02 CA19 CC24 CD09 4B065 AA26X AA26Y AB01 AC14 BA02 BA25 BB15 BB16 CA17 CA29

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】スクロース非資化性のエシェリヒア属細
菌を親株として構築され、スクロースＰＴＳ遺伝子群を
保持し、かつ、スレオニン以外のアミノ酸生産能を有す
るエシェリヒア属細菌。
【請求項２】エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コリ
である請求項１に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項３】アミノ酸がホモセリン、イソロイシン、
リジン、バリン、又はトリプトファンから選ばれること
を特徴とする請求項１又は２に記載の細菌。
【請求項４】スクロース非資化性のエシェリヒア属細菌
を親株として構築され、スクロース非ＰＴＳ遺伝子群を
保持し、かつ、アミノ酸生産能を有するエシェリヒア属
細菌。
【請求項５】スクロース非ＰＴＳ遺伝子群が、少なく
ともプロトン共輸送移送系、フルクトキナーゼ及びイン
ベルターゼをコードする遺伝子を含む請求項４記載のエ
シェリヒア属細菌。
【請求項６】エシェリヒア属細菌がエシェリヒア・コ
リである請求項４又は５に記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項７】アミノ酸がスレオニン、ホモセリン、イ
ソロイシン、リジン、バリン又はトリプトファンから選
ばれることを特徴とする請求項４〜６のいずれか一項に
記載のエシェリヒア属細菌。
【請求項８】請求項１〜７のいずれか一項に記載の細
菌を培養し、アミノ酸を培地中に生成蓄積せしめ、該培
地からアミノ酸を採取することを特徴とするアミノ酸の
製造法。