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JP2000139471A - 発酵法によるｌ−メチオニンの製造法 - Google Patents

発酵法によるｌ−メチオニンの製造法

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JP2000139471A
JP2000139471A JP10326717A JP32671798A JP2000139471A JP 2000139471 A JP2000139471 A JP 2000139471A JP 10326717 A JP10326717 A JP 10326717A JP 32671798 A JP32671798 A JP 32671798A JP 2000139471 A JP2000139471 A JP 2000139471A
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methionine
gene
leu
ala
microorganism
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Yoshihiro Usuda
佳弘 臼田
Osamu Kurahashi
修 倉橋
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Ajinomoto Co Inc
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｌ−メチオニン生産能を有する微生物を育種
し、同微生物を用いて発酵法によりＬ−メチオニンを製
造する。 【解決手段】 Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサー
を欠損し、及び／又は、細胞内のホモセリントランスサ
クシニラーゼ活性が増強され、好ましくは、さらに細胞
内のＳ−アデノシルメチオニンシンテテース活性が弱化
し、Ｌ−スレオニン要求性を示し、細胞内のシスタチオ
ニンγ−シンテース活性及びアスパルトキナーゼ−ホモ
セリンデヒドロゲナーゼII活性が増強された微生物を培
地に培養し、培地中にＬ−メチオニンを生成蓄積せし
め、これを該培地から採取することにより、Ｌ−メチオ
ニンを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、発酵法によるＬ−
メチオニンの製造法に関する。Ｌ−メチオニンは、医薬
等として重要なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】メチオニンは、工業的には化学合成によ
り製造されるＤＬ体が中心となっている。Ｌ体が必要な
場合は、このＤＬ体をアセチル化してＮ−アセチル−Ｄ
Ｌ−メチオニンとし、酵素的にＬ体だけを脱アセチル化
することによって製造される。
【０００３】一方、発酵法によるＬ−メチオニンの製造
については、メチオニンアナログ耐性変異株を用いる方
法が報告されているが、生産量は少なく、またＬ−メチ
オニン生産に影響を与える因子は明らかではないため、
最も発酵生産が困難なアミノ酸の一つである。例えば、
エシェリヒア・コリ（Escherichia coli（E. coli））K
-12株を用いる方法が、公開特許公報昭５６−３５９９
２あるいは文献（Chattapadhyay, M. K. et al., Med.
Sci. Res. 23, 775 (1995)、Chattapadhyay, M. K. et
al., Biotechnol. Lett. 17, 567-570 (1995)）に報告
されているが、いずれもＬ−メチオニンの生産量は工業
的に用いるには不十分であった。
【０００４】E. coliにおいては、Ｌ−メチオニンの生
合成経路は、Ｌ−スレオニンの生合成経路と一部共通で
あり、Ｌ−ホモセリンが共通の中間体となっている。Ｌ
−ホモセリンからＬ−メチオニンへの固有経路の第一段
階は、ホモセリントランスサクシニラーゼ（ＨＴＳ）に
よって触媒されるが、同酵素は最終生産物であるＬ−メ
チオニンとＬ−メチオニンの代謝物であるＳ−アデノシ
ルメチオニンにより協奏的な阻害を受けることが知られ
ている（Lee, L.-W. et al., J. Biol. Chem.241, 5479
-5480 (1966)）。
【０００５】E. coliのホモセリントランスサクシニラ
ーゼをコードする遺伝子であるmetA配列は、ダクロスら
により報告されており（Duclos, B. et al., Nucleic A
cidsRes. 17, 2856 (1989)）、metAの変異株の取得につ
いても、Ｌ−メチオニンのアナログであるα−メチル−
ＤＬ−メチオニン（ＭＭ）に対する耐性を利用した方法
が知られている（Chattopadhyay, M. K. et al., J. Ge
n. Microbiol. 137,685-691 (1991)）。しかし、ＭＭ耐
性株のmetA遺伝子産物であるホモセリントランスサクシ
ニラーゼが、Ｌ−メチオニンとＳ−アデノシルメチオニ
ン（ＳＡＭ）による阻害解除型となるという報告は、サ
ルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）
においてなされているが（Lawrence, D. A. et al., J.
Bacteriol. 109, 8-11 (1972)）、変異型metA遺伝子の
塩基配列の報告はない。さらに、metAの単独変異株は、
Ｌ−メチオニンを排出しないと報告されている（Chatto
padhyay, M. K. et al., J. Gen. Microbiol. 137, 685
-691 (1991)）。
【０００６】metAを含めて、ホモセリントランスサクシ
ニラーゼによる反応以降のＬ−メチオニンの固有生合成
経路の酵素遺伝子の発現は、metJ遺伝子産物であるリプ
レッサーによる抑制を受けることも明らかとなっている
（Greene, R. C., Biosynthesis of Methionine. in "E
scherichai coli and Salmonella Cellular and Molecu
lar Biology/Second Edition", ed. Neidhardt, F. D.,
ASM Press, pp. 542-560 (1996).）。metJ遺伝子は、
Ｌ−メチオニンへの固有生合成経路の第二の酵素シスタ
チオニンγ−シンテースをコードするmetB遺伝子と、ア
スパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII（Ａ
Ｋ−ＨＤII）をコードするmetLとからなるmetBLオペロ
ンと、逆向きに隣接していることが知られている（Duch
ange, N.et al., J. Biol. Chem. 258, 14868-14871 (1
983)）。
【０００７】Ｌ−メチオニンからＳ−アデノシルメチオ
ニンへの代謝反応を触媒するＳ−アデノシルメチオニン
合成酵素をコードするmetKは、必須遺伝子であることが
示唆されている（Greene, R. C., Biosynthesis of Met
hionine. in "Escherichai coli and Salmonella Cellu
lar and Molecular Biology/Second Edition", ed. Nei
dhardt, F. D., ASM Press, pp. 542-560 (1996)）。ま
た、metKの変異株は、ＤＬ−ノルロイシンやエチオニン
などのメチオニンアナログ耐性により得られることが知
られているとともに（Chattopadhyay, M. K. et al.,
J. Gen. Microbiol. 137, 685-691 (1991)）、Ｌ−メチ
オニンへの固有生合成経路の酵素の発現を上昇させるこ
とがと報告されている（Greene, R. C. et al., J. Bac
teriol.115, 57-67 (1973)。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】上記のように、Ｌ−メ
チオニン生合成に関与する酵素やその遺伝子について、
ある程度の報告はあるが、Ｌ−メチオニンの発酵生産に
直接結びつく知見はほとんど得られておらず、Ｌ−メチ
オニン生産菌育種への応用もほとんどなされていない。
【０００９】本発明は、上記現状に鑑みなされたもので
あり、Ｌ−メチオニン生産に影響を与える因子を明らか
にしてＬ−メチオニン生産菌を育種し、発酵法によるＬ
−メチオニンの生産を可能とすることを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成
するに至った。すなわち本発明は、以下のとおりであ
る。
【００１１】（１）Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッ
サーを欠損し、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有する微
生物。 （２）細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性
が増強され、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有する微生
物。 （３）Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサーを欠損
し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性が
増強され、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有する微生
物。
【００１２】（４）さらに細胞内のＳ−アデノシルメチ
オニンシンテテース活性が弱化した前記（１）〜（３）
のいずれかの微生物。 （５）ホモセリントランスサクシニラーゼ活性の増強
が、前記微生物細胞内のホモセリントランスサクシニラ
ーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は
同遺伝子の発現調節配列を増強することによるものであ
る（２）〜（４）の微生物。 （６）Ｌ−メチオニンとＳ−アデノシルメチオニンによ
る協奏阻害が解除されたホモセリントランスサクシニラ
ーゼを保持する（１）又は（４）に記載の微生物。 （７）Ｌ−スレオニン要求性を示すことを特徴とする
（１）〜（６）のいずれかの微生物。 （８）細胞内のシスタチオニンγ−シンテース活性及び
アスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII活
性が増強された（１）〜（７）のいずれかの微生物。 （９）エシェリヒア属に属することを特徴とする（１）
〜（８）のいずれかの微生物。
【００１３】（１０）前記（１）〜（１０）のいずれか
の微生物を培地に培養し、培地中にＬ−メチオニンを生
成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴と
するＬ−メチオニンの製造法。
【００１４】（１１）配列番号２６に示すアミノ酸配列
において、27位のアルギニンがシステインに置換する変
異、296位のイソロイシンがセリンに置換する変異、298
位のプロリンがロイシンに置換する変異、27位のアルギ
ニンがシステインに置換しかつ296位のイソロイシンが
セリンに置換する変異、296位のイソロイシンがセリン
に置換しかつ298位のプロリンがロイシンに置換する変
異、298位のプロリンがロイシンに置換しかつ27位のア
ルギニンがシステインに置換する変異、又は、27位のア
ルギニンがシステインに置換し、296位のイソロイシン
がセリンに置換しかつ298位のプロリンがロイシンに置
換する変異のいずれかに相当する変異を有するアミノ酸
配列を有し、Ｌ−メチオニンとＳ−アデノシルメチオニ
ンによる協奏阻害が解除されたホモセリントランスサク
シニラーゼをコードするＤＮＡ。
【００１５】本明細書において、Ｓ−アデノシルメチオ
ニンを「ＳＡＭ」、α-メチル-DL-メチオニンを「Ｍ
Ｍ」、DL-ノルロイシンを「ＮＬ」と呼ぶことがある。
また、Ｓ−アデノシルメチオニンシンテテースを「ＳＡ
Ｍ合成酵素」、ホモセリントランスサクシニラーゼを
「ＨＴＳ」ということがある。また、E. coliのmetB遺
伝子産物シスタチオニンγ-シンテースを「シスタチオ
ニン合成酵素」、metL遺伝子産物「アスパルトキナーゼ
−ホモセリンデヒドロゲナーゼII」をＡＫ−ＨＤIIと呼
ぶことがある。
【００１６】本発明において「Ｌ−メチオニン生産能」
とは、本発明の微生物を培地に培養したときに、培地中
にＬ−メチオニンを蓄積する能力をいう。
【００１７】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の微生物は、Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッ
サーを欠損し、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有する微
生物、又は、細胞内のホモセリントランスサクシニラー
ゼ活性が増強され、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有す
る微生物である。本発明の微生物は、Ｌ−メチオニン生
合成系のリプレッサーを欠損し、かつ、細胞内のホモセ
リントランスサクシニラーゼ活性が増強されていること
が好ましい。さらに、本発明の微生物は、細胞中のＳＡ
Ｍ合成酵素活性が弱化していることが好ましい。
【００１８】上記のような微生物としては、Ｌ−ホモセ
リンからアシル転移反応により生じるＯ−アシルホモセ
リンを経てＬ−メチオニン及びＳＡＭを産生する経路を
有し、該アシル転移酵素の発現がリプレッサーによる抑
制によって制御されるものであれば、特に制限されな
い。そのような微生物としては、エシェリヒア属細菌、
コリネ型細菌、バチルス属細菌等の細菌が挙げられる
が、エシェリヒア属細菌、例えばE. coliが好ましい。
【００１９】また、本発明の微生物は、E. coliのよう
に、それが保持するＨＴＳがＬ−メチオニン及びＳＡＭ
による協奏阻害を受けるものであれば、その阻害を解除
することによって、Ｌ−メチオニン生産能を向上させる
ことができる。
【００２０】メチオニン生合成の固有経路は、E. coli
等多くの微生物のようにシスタチニオンを経由するもの
と、ブレビバクテリウム・フラバムのようにシスタチオ
ニンを経由しないものがある（Ozaki, H. et al., J. B
iochem., 91, 1163, (1982)）が、本発明においては、
シスタチニオンを経由する経路を有するものが好まし
い。そのような微生物においては、細胞内のシスタチオ
ニン合成酵素活性を増強することにより、Ｌ−メチオニ
ン合成能を強化することができる。なお、ブレビバクテ
リウム・フラバムのような微生物であっても、Ｌ−メチ
オニン生合成系のリプレッサーの欠損又は／及びＨＴＳ
の増強によって、Ｌ−メチオニン生産能を高めることが
できる。
【００２１】さらに、上記微生物において、Ｌ−メチオ
ニン生合成及びＬ−スレオニン生合成の共通経路に関与
するアスパルトキナーゼ活性又はホモセリンデヒドロゲ
ナーゼ活性の少なくとも一方を増強することによって、
一層Ｌ−メチオニン生産能を高めることができる。
【００２２】上記の各特性の２以上を微生物に付与する
場合、その順序は特に制限されず、任意の順序で付与す
ることができる。また、複数の遺伝子を微生物に導入す
る場合、それらの遺伝子は同じベクターに搭載してもよ
く、複数の異なるベクターに別個に搭載してもよい。
尚、複数のベクターを用いる場合は、異なる薬剤マーカ
ー、及び異なる複製起点を有するベクターを用いること
が好ましい。以下に、上記の各特性を微生物に付与する
方法を説明する。
【００２３】＜１＞Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッ
サーの欠損 微生物のＬ−メチオニン生合成系のリプレッサーを欠損
させるには、微生物に変異処理を施し、同リプレッサー
を産生しなくなった株を選択することにより、行うこと
ができる。変異処理は、微生物の変異株の取得に通常用
いられている方法、例えば紫外線照射またはN−メチル
−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは
亜硝酸等の突然変異に用いられている変異剤により行う
ことができる。
【００２４】また、微生物の染色体ＤＮＡ上の前記リプ
レッサーをコードする遺伝子を破壊することによって
も、同リプレッサーを欠損させることができる。遺伝子
の破壊は、コード領域又は発現調節配列の少なくとも一
部を欠失した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子と
染色体上の遺伝子との相同組換えを起こさせ、染色体上
の遺伝子を欠失型遺伝子で置換することによって行うこ
とができる（遺伝子置換）。
【００２５】リプレッサー遺伝子は、例えば、E. coli
のＬ−メチオニン生合成系のリプレッサーをコードする
遺伝子（metJ）の塩基配列は知られているので（Duchan
ge,N. et al., J. Biol. Chem. 258, 14868-14871 (198
3)）、該塩基配列に基づいて作製したプライマーを用い
たＰＣＲにより、染色体ＤＮＡから単離することができ
る。こうして得られる遺伝子断片から一定の領域を制限
酵素により切り出し、コード領域又は発現調調節領域の
少なくとも一部を欠失させることによって、欠失型遺伝
子を作製することができる。
【００２６】遺伝子置換は、例えば次のようにして行う
ことができる。温度感受性複製起点を有するベクターに
欠失型遺伝子を搭載させて組換えベクターを調製し、同
組換えベクターで微生物を形質転換し、欠失型遺伝子と
染色体ＤＮＡ上の遺伝子との相同組換えにより染色体Ｄ
ＮＡ上の遺伝子に欠失型遺伝子を挿入させる。その後
に、形質転換株を前記ベクターが複製できない温度で培
養し、細胞質中のベクターを脱落させる。さらに、染色
体上の１コピーの遺伝子をベクターとともに脱落させる
ことにより、遺伝子が置換される。目的の遺伝子置換が
生じていることは、遺伝子置換株の染色体ＤＮＡをサザ
ン・ハイブリダイゼーションにより解析することによ
り、確認することができる。
【００２７】E. coli用の温度感受性複製起点を有する
ベクターとしては、例えば特願平９−１９４６０３号に
記載のプラスミドpMAN997等が、また、コリネ型細菌用
の温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例え
ば特開平５−７４９１号公報に記載のプラスミドpHSC4
等が挙げられるが、これらに限定されず、他のベクター
を用いることもできる。
【００２８】前述したようにE. coliでは、metJ遺伝子
は、metB遺伝子とmetL遺伝子とからなるmetBLオペロン
と、逆向きに隣接していることが知られている（Duchan
ge, N. et al., J. Biol. Chem. 258, 14868-14871 (19
83)）。したがって、欠失型metJ遺伝子に、適当なプロ
モーター配列を連結し、上記と同様に遺伝子置換を行う
ことによって、metJ遺伝子の破壊と、metBLオペロンの
プロモーター置換による発現改善とを、一度の相同組換
えによって行うことができる。metBLオペロンの発現が
向上すると、細胞内のシスタチオニン合成酵素活性及び
ＡＫ−ＨＤII活性が増強される。
【００２９】具体的には、E. coli、例えばW3110株染色
体DNAを鋳型とし、配列番号５及び配列番号６記載の塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとする
ＰＣＲ反応（polymerase chain reaction； White,T.J.
et al ;Trends Genet., 5,185(1989)）により得られる
metB遺伝子を含む約１ｋｂの断片と、配列番号７及び配
列番号８に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
をプライマーとするＰＣＲ反応により得られるmetJ遺伝
子の下流部分を含む約１ｋｂの断片と、配列番号９及び
配列番号１０に示すオリゴヌクレオチドをアニールして
得られるスレオニンオペロンのプロモーター配列を有す
る配列の三者を、適当なベクターに挿入して連結するこ
とによって、metJの構造遺伝子が欠失し、metBLオペロ
ンのプロモーターがスレオニンプロモーターに置換した
構造を有するＤＮＡ断片を含む組換えベクターを得るこ
とができる。
【００３０】上記のようにして調製した組換えベクター
を微生物に導入するには、これまでに報告されている形
質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・
コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細
胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方
法（Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53, 159(197
0)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されて
いるような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調
製してＤＮＡを導入する方法（Duncan, C. H. et al.,
Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・
ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているよ
うな、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取
り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態に
して組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chan
g, S. et al., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979);
Bibb, M. J. et al., Nature, 274, 398 (1978); Hinn
en, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929
(1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形質転
換は、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参
照）によって行うことができる。
【００３１】metJ、metBL、あるいは後述のmetA、metK
及びthrBC等の各遺伝子のクローニング等に用いるベク
ターとしては、例えばE. coli細胞内で自律複製可能な
プラスミド、具体的にはpUC19、pUC18、pBR322、pHSG29
9、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。また、
ファージベクターを用いてもよい。E. coli以外の微生
物を用いる場合は、同微生物及びE. coliにおいて自律
複製可能なシャトルベクターを用いることが好ましい。
例えば、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドとし
ては、以下のものが挙げられる。
【００３２】 ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９号公報参照 ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５号公報参照 ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−１９２９００号公報参照 ｐＡＪ ６１１ 同 上 ｐＡＪ １８４４ 同 上 ｐＣＧ １ 特開昭５７−１３４５００号公報参照 ｐＣＧ ２ 特開昭５８−３５１９７号公報参照 ｐＣＧ ４ 特開昭５７−１８３７９９号公報参照 ｐＣＧ １１ 同 上 ｐＨＫ４ 特開平５−７４９１号公報参照
【００３３】遺伝子断片とベクターを連結して組み換え
ＤＮＡを調製するには、遺伝子断片の末端に合うような
制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通であるその
他、染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブラリーの
作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤ
ＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、プライ
マーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法
は、当業者によく知られている通常の方法を採用するこ
とができる。これらの方法は、Sambrook, J. et al., "
Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edit
ion",Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等
に記載されている。
【００３４】＜２＞ＨＴＳ活性の増強、及び変異型ＨＴ
Ｓの付与 微生物細胞内のＨＴＳ活性は、前記微生物細胞内のＨＴ
Ｓをコードする遺伝子断片を、同微生物で機能するベク
ター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して
組み換えＤＮＡを作製し、これを前記微生物に導入して
形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のＨＴＳをコ
ードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、ＨＴＳ活性
が増強される。E. coliでは、ＨＴＳはmetA遺伝子にコ
ードされている。微生物としてエシェリヒア属細菌を用
いる場合、導入するＨＴＳ遺伝子は、エシェリヒア属細
菌由来の遺伝子を用いることが好ましいが、ホモセリン
トランスアセチラーゼを有するコリネ型細菌等の他の微
生物由来の遺伝子を使用することもできる。
【００３５】ＨＴＳ活性の増強は、ＨＴＳ遺伝子を微生
物宿主の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによ
っても達成できる。コリネバクテリウム属細菌に属する
微生物の染色体ＤＮＡ上にＨＴＳ遺伝子を多コピーで導
入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を
標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上
に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮ
Ａ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピ
ートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５
号公報に開示されているように、ＨＴＳ遺伝子をトラン
スポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に
多コピー導入することも可能である。いずれの方法によ
っても形質転換株内のＨＴＳ遺伝子のコピー数が上昇す
る結果、ＨＴＳ活性が増強される。
【００３６】ＨＴＳ活性の増強は、上記の遺伝子増強に
よる以外に、ＨＴＳ遺伝子の発現調節配列を増強するこ
とによっても達成される。具体的には、染色体ＤＮＡ上
又はプラスミド上のＨＴＳ遺伝子のプロモーター等の発
現調節配列を強力なものに置換する（特開平１−２１５
２８０号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、
ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロ
モーター、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロ
モーター等が強力なプロモーターとして知られている。
これらのプロモーターへの置換により、ＨＴＳ遺伝子の
発現が強化されることによってＨＴＳ活性が増強され
る。
【００３７】E. coliのＨＴＳ遺伝子（metA）は、その
塩基配列が知られているので（Blattner, F. R. et a
l., Science, 277, 1453-1462 (1997)）、該塩基配列に
基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲにより、染
色体ＤＮＡから単離することができる。そのようなプラ
イマーとして具体的には、配列番号２１及び配列番号２
２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げら
れる。
【００３８】上記のようにして微生物細胞内のＨＴＳ活
性を増強することによって、Ｌ−メチオニン生合成が強
化され、Ｌ−メチオニンの生成量を増加させることがで
きると考えられる。
【００３９】また、ＨＴＳは、Ｌ−メチオニンとＳＡＭ
による協奏的阻害を受けるので、この協奏阻害が解除さ
れたＨＴＳを微生物に保持させることによっても、Ｌ−
メチオニン生合成系を強化することができる。前記協奏
阻害が解除されたＨＴＳを微生物に保持させることは、
微生物に変異処理を施し、同協奏阻害が解除されたＨＴ
Ｓを産生する株を選択することにより、行うことができ
る。変異処理は、微生物の変異株の取得に通常用いられ
ている方法、例えば紫外線照射またはN−メチル−N'−
ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸
等の突然変異に用いられている変異剤により行うことが
できる。ここで、「Ｌ−メチオニンとＳＡＭによる協奏
阻害を解除されたＨＴＳ」とは、Ｌ−メチオニン及びＳ
ＡＭの非存在下でにおける酵素活性に対するＬ−メチオ
ニンもしくはＳＡＭ、又はＬ−メチオニン及びＳＡＭの
存在下での酵素活性の比（残存率）が、野生型ＨＴＳの
それよりも高いＨＴＳをいう。具体的には、例えば、１
mMのＬ−メチオニン存在下での残存率が４０％以上、好
ましくは８０％以上、１mMのSAM存在下での残存率が１
０％以上、好ましくは５０％以上、又は、それぞれ0.1m
MのＬ−メチオニン及びSAMの存在下での活性が１５％以
上、好ましくは６０％以上であるＨＴＳは、Ｌ−メチオ
ニンとＳＡＭによる協奏阻害を解除されたＨＴＳであ
る。
【００４０】上記のような変異型ＨＴＳを保持する変異
株は、親株をα-メチル-DL-メチオニン（ＭＭ）存在下
で、例えば１g/lのＭＭを含む培地で培養し、生育する
株を選択することにより、取得することができる。ＭＭ
による選択は、複数回繰り返してもよい。
【００４１】変異型ＨＴＳを保持する変異株は、上記の
ようにして得られるＨＴＳ変異株から変異型ＨＴＳ遺伝
子（変異型metA）をクローニングし、同変異型遺伝子で
微生物を形質転換することによっても、取得することが
できる。変異型ＨＴＳ遺伝子の単離、及び同遺伝子の微
生物への導入は、前記の野生型ＨＴＳ遺伝子と同様にし
て行うことができる。変異型metA遺伝子として具体的に
は、配列番号２６に示すアミノ酸配列において、27位の
アルギニンがシステインに置換する変異、296位のイソ
ロイシンがセリンに置換する変異、又は298位のプロリ
ンがロイシンに置換する変異のいずれかに相当する変異
を有するＨＴＳが挙げられる。また、これらの変異の任
意の２種又は３種を有するＨＴＳも、好ましい変異型Ｈ
ＴＳである。
【００４２】＜３＞ＳＡＭ合成酵素活性の弱化 さらに、細胞内のＳＡＭ合成酵素活性を弱化させること
により、微生物のＬ−メチオニン生産能を上昇させるこ
とができる。ＳＡＭ合成酵素活性を欠損させることによ
っても、微生物のＬ−メチオニン生産能を上昇させるこ
とができるが、その場合は微生物を培養する培地にＳＡ
Ｍを含有させる必要があるので、ＳＡＭ合成酵素活性を
弱化させることが好ましい。ここで、「ＳＡＭ合成酵素
活性を弱化させる」とは、微生物細胞タンパク質当たり
のＳＡＭ合成酵素の比活性が、野生型ＳＡＭ合成酵素を
保持する株よりも低いことをいう。具体的には、弱化の
程度は、野生株のＳＡＭ合成酵素に比べて８０〜５０
％、好ましくは５０〜３０％、より好ましくは３０〜１
０％程度が挙げられる。E. coliでは、ＳＡＭ合成酵素
の比活性が１０％より低下すると、細胞分裂が阻害され
ることが示唆されている（Newman, E. B. et al., J. B
acteriol., 180, 3614-3619 (1998)）。
【００４３】ＳＡＭ合成酵素活性が弱化した微生物は、
酵素タンパク質当たりの比活性が低下したＳＡＭ合成酵
素（弱化型ＳＡＭ合成酵素）を産生するものであっても
よいし、ＳＡＭ合成酵素遺伝子の転写効率又は翻訳効率
が低下したことにより、酵素の発現効率が低下したもの
であってもよい。
【００４４】ＳＡＭ合成酵素活性が弱化した変異株は、
親株をDL-ノルロイシン（ＮＬ）存在下で、例えば0.1g/
lのＮＬを含む培地で培養し、生育する株を選択するこ
とにより、取得することができる。ＮＬによる選択は、
複数回繰り返してもよい。また、DL-ノルロイシンの代
わりにエチオニン又はγ−グルタミルメチルエステルを
用いることも可能である。
【００４５】弱化型ＳＡＭ合成酵素を保持する変異株
は、上記のようにして得られるＳＡＭ合成酵素弱化株か
ら弱化型ＳＡＭ合成酵素遺伝子をクローニングし、同変
異型遺伝子で微生物染色体上の野生型ＳＡＭ合成酵素遺
伝子を置換することによっても、取得することができ
る。ＳＡＭ合成酵素遺伝子の遺伝子置換は、前記のmetJ
遺伝子と同様にして行うことができる。E. coliのＳＡ
Ｍ合成酵素遺伝子（metK）は、その塩基配列が知られて
いるので（Blattner, F. R. et al., Science, 277, 14
53-1462 (1997)）、該塩基配列に基づいて作製したプラ
イマーを用いたＰＣＲにより、染色体ＤＮＡから単離す
ることができる。そのようなプライマーとして具体的に
は、配列番号１１及び配列番号１２に示す塩基配列を有
するオリゴヌクレオチドが挙げられる。得られたmetK遺
伝子に変異が生じていることは、該遺伝子の塩基配列を
決定し、公知の野生型metK遺伝子の塩基配列と比較する
ことにより、確認することができる。
【００４６】弱化型ＳＡＭ合成酵素をコードする遺伝子
として具体的には、配列番号１８に示すアミノ酸配列に
おいて、３０３番目のイソロイシンがロイシンに置換す
る変異、１８５番目のバリンがグルタミン酸に置換する
変異、３７８番目のアルギニン以降がアラニン−メチオ
ニン−ロイシン−プロリン−バリン（配列番号２９）か
らなる配列に変化する変異のいずれかに相当する変異を
有するＳＡＭ合成酵素が挙げられる。
【００４７】＜４＞Ｌ−スレオニン要求性 微生物にＬ−スレオニン要求性を付与することにより、
Ｌ−メチオニン生産能を向上させることができる。Ｌ−
スレオニン要求性を示す微生物として具体的には、Ｌ−
ホモセリンからＬ−スレオニンに至るＬ−スレオニン生
合成の固有経路に関与する酵素にいずれかが欠損した微
生物が挙げられる。E. coliにおいては、Ｌ−スレオニ
ンの生合成に関与する酵素の遺伝子は、スレオニンオペ
ロン（thrABC）として存在し、thrBC部分を欠失させる
ことによってＬ−ホモセリン以降の生合成能を失ったＬ
−スレオニン要求株を取得することができる。尚、thrA
遺伝子はＬ−メチオニン及びＬ−スレオニンの共通経路
の酵素であるアスパルトキナーゼのアイソザイムの一つ
をコードしており、欠失させないことが好ましい。
【００４８】thrBCを欠失させるには、染色体ＤＮＡ上
のスレオニンオペロン中のthrBC部分を破壊すればよ
い。thrBCの破壊は、一部を欠失したthrBCで微生物染色
体上のthrBC部分を置換することによって行うことがで
きる。thrBCの遺伝子置換は、前記metJ遺伝子の遺伝子
置換と同様に行えばよい。欠失を含むthrBCは、E. coli
染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１及び２に示す塩基
配列を有するプライマーを用いてＰＣＲによりthrB遺伝
子の上流部分を含む約１ｋｂの断片を増幅し、同様に配
列番号３及び４に示す塩基配列を有するプライマーを用
いてＰＣＲによりthrC遺伝子の下流部分を含む約１ｋｂ
の断片を増幅し、これらの増幅断片を連結することによ
って取得することができる。
【００４９】＜５＞Ｌ−メチオニンの製造 上記のようにして得られるＬ−メチオニン生産能を有す
る微生物を培地に培養し、該培地中にＬ−メチオニンを
生産蓄積せしめ、これを該培地から採取することによ
り、Ｌ−メチオニンを製造することができる。
【００５０】使用する培地は、微生物に応じて従来より
用いられてきた周知の培地を用いてかまわない。つま
り、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他
の有機成分を含有する通常の培地である。本発明を実施
するための特別な培地は必要とされない。
【００５１】炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解
物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアル
コール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸
類等を用いることができる。
【００５２】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。
【００５３】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、
Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵
母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの
他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウ
ム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００５４】培養は、利用される微生物に応じて従来よ
り用いられてきた周知の条件で行ってかまわない。例え
ば、好気的条件下で１６〜１２０時間培養を実施するの
がよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５
〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の
酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を
使用することができる。
【００５５】培養終了後の培地液からのＬ−メチオニン
の採取は、本願発明において特別な方法が必要とされる
ことはない。すなわち、本発明は従来より周知となって
いるイオン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を組み合わ
せることにより実施できる。
【００５６】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。
【００５７】
【実施例１】 エシェリヒア・コリW3110株からのL-ス
レオニン要求株及びmetJ欠損株の取得 ＜１＞欠失を有するthrBC構造遺伝子を含む組換え用プ
ラスミドの調製 ゲノムDNA精製キット（アドバンスドジェネティクテク
ノロジー社製）を用い、その指示に従ってE. coliの野
生型K-12株の誘導体であるW3110株から染色体DNAを調製
した。配列表の配列番号１及び配列番号２に記載の塩基
配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。これをプ
ライマーとし、前記染色体ＤＮＡを鋳型として、エルリ
ッチらの方法（PCR Technology-Principles and Applic
ations for DNA Amplification, ed. Erlich, H. A., S
tockton Press）に従って、ＰＣＲ反応を行い、thrB遺
伝子の上流部分を含む約１ｋｂの断片の増幅を行った。
この増幅断片は、両端にプライマーに由来するEcoRI及
びSalIの認識配列が導入されている。得られた増幅断片
を、導入した認識部位を切断する制限酵素で切断した。
【００５８】同様に、配列番号３及び配列表番号４に記
載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマー
としてＰＣＲ反応を行い、thrC遺伝子の下流部分を含む
約１ｋｂの断片の増幅を行った。この増幅断片は、両端
にプライマーに由来するSalI及びHindIIIの認識配列が
導入されている。得られた増幅断片を、導入した認識部
位を切断する制限酵素で切断した。上記２つの増幅断片
と、EcoRI及びHindIIIで切断したpHSG398（宝酒造社
製）とを、ライゲーションキット（宝酒造）を用いて連
結し、E. coli JM109コンピテントセル（宝酒造）を形
質転換した。形質転換体からプラスミドを、プラスミド
抽出機PI-50（倉敷紡績社製）を用いてアルカリ法（Boi
rnboim, H. C. et al., Nucleic Acids Res., 7, 1513-
1523 (1979)）に基づいて調製した。得られた組換えプ
ラスミドから、EcoRI及びHindIII認識部位に２つの断片
がSalI認識部位を介して挿入されたプラスミドを、挿入
断片の長さによって選択した。このプラスミドは、thrB
Cの構造遺伝子の上流と下流を含んでおり、thrBCの構造
遺伝子のほぼ全長が欠失した遺伝子断片を含んでいる。
【００５９】＜２＞遺伝子組換えによるthrBC構造遺伝
子欠損株の作製 上記プラスミドと、特願平９−１９４６０３号に記載の
温度感受性複製起点を有するプラスミドpMAN997を、Eco
RI及びHindIIIで切断した後、これらを連結し、得られ
た組換えプラスミドでE. coli JM109株を形質転換し
た。形質転換体からプラスミドを抽出し、pMAN997にthr
BC欠失遺伝子断片が挿入された構造を有するものを選択
し、pMANΔBCとした。このプラスミドを用いてW3110株
を形質転換し、常法に従って遺伝子組換えを行った。す
なわち、組換え株の選択は、Ｍ９培地（Sambrook, J. e
t al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual/Seco
nd Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press,
A.3 (1989)）におけるL-スレオニン要求性によって行
い、得られたL-スレオニン要求株をWΔBC株とした。
【００６０】＜３＞W3110株及びWΔBC株からのmetJ欠損
株の作製 次に、W3110株染色体DNAを鋳型とし、配列番号５及び配
列番号６記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを
プライマーとしてＰＣＲ反応を行い、metB遺伝子を含む
約１ｋｂの断片の増幅を行った。この増幅断片は、両端
にEcoRI及びSphIの認識配列が導入されている。得られ
た増幅断片を、導入した認識部位を切断する制限酵素で
切断した。
【００６１】同様に配列番号７及び配列番号８に記載の
塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとし
てＰＣＲ反応を行い、metJ遺伝子の下流部分を含む約１
ｋｂの断片の増幅を行った。この増幅断片は、両端にHi
ndIII及びEcoRIの認識配列が導入されている。得られた
増幅断片を、導入した認識部位を切断する制限酵素で切
断した。
【００６２】次に、配列番号９に示した、両端にSphI及
びHindIII認識部位を有し、スレオニンオペロンのプロ
モーター配列を有する配列を、配列番号１０に示した相
補鎖とともに合成し、これらをアニールさせた後に、制
限酵素SphI及びHindIIIで切断した。このようにして得
たスレオニンプロモーター断片と、EcoRIで切断したpHS
G298（宝酒造社製）と、前記２つのPCR増幅断片とを混
合した後、連結反応を行った。この連結反応液で、JM10
9株を形質転換し、形質転換体からプラスミドを抽出し
た。得られた組換えプラスミドから、４者が連結された
プラスミドを選択した。このプラスミドは、metJの構造
遺伝子が欠失し、metBLオペロンのプロモーターがスレ
オニンプロモーターに置き換わった構造を有している。
【００６３】上記で得られたプラスミド、及び特願平９
−１９４６０３号に記載の温度感受性複製起点を有する
プラスミドpMAN997をEcoRIで切断し、ライゲーションを
行い、pMAN997にmetJ欠失断片が挿入された構造を有す
るものを選択し、pMANΔJとした。このプラスミドを用
いてW3110株及びWΔBC株を形質転換し、常法に従って遺
伝子組換えを行った。得られた組換え株は、菌体から調
製したＤＮＡを鋳型とし、配列番号６及び配列番号８に
示したオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法
による増幅産物の長さで選択した。W3110株及びWΔBC株
から得られたmetJ欠失株を、それぞれWΔJ株及びWΔBC
ΔJ株とした。
【００６４】組換えによるmetJ欠失の効果を確認するた
め、菌体から粗酵素抽出液を調製し、ＨＴＳ及びシスタ
チオニン合成酵素の活性を測定した。W3110株とWΔJ株
を２mlのLB培地に植菌し、37℃で一晩培養した。この培
養液１mlを5,000rpmで10分間遠心分離し、菌体を0.9%の
食塩水で２度洗浄した。得られた菌体を１mlの0.9%食塩
水に懸濁し、そのうちの0.5mlを、50mlの5mMのL-メチオ
ニンを含むデイビス−ミンジオリ最少培地（Davis, B.
D., and Mingioli, E. S., J. Bacteriol. 60,17-28 (1
950)）に植菌した。これを37℃で24時間培養し、培養液
を8,000rpmで10分間遠心分離し、菌体を0.9%食塩水で２
度洗浄した。菌体を3mlの１mMジチオスレイトールを含
む50mMリン酸カリウムバッファー（pH7.5）に懸濁し
た。この懸濁液を超音波破砕機（久保田社製）を用い
て、４℃にて150Wで５分間細胞破砕処理を行った。破砕
液を15,000rpmで30分間遠心処理した上清をセファデッ
クスG-50カラム（ファルマシア社製）にて脱塩処理した
ものを粗酵素抽出液とした。粗酵素抽出液中のＨＴＳ活
性とシスタチオニン合成酵素の活性を測定した。
【００６５】ＨＴＳ活性は、粗酵素抽出液5μlを0.1Mリ
ン酸カリウム（pH7.5）、１mMサクシニルコエンザイムA
（シグマ社製）、0.2nM DL-[14C]ホモセリン（室町化学
工業社製）、及び0.2mM L-ホモセリンからなる反応液に
加えて50μlとし、30℃で10分間反応を行った。反応液1
μlを、セルロースプレート（メルク社製）にスポット
し、アセトン、ブタノール、水、ジエチルアミンを１
０：１０：５：２の割合で含む添加溶媒で展開した。プ
レートを風乾した後、イメージアナライザー（富士写真
工業社製）にてオートラジオグラフィーを行った。
【００６６】シスタチオニン合成酵素は、Ｌ−システイ
ン非存在下ではＯ−サクシニルホモセリンをα−ケト酪
酸、アンモニア及びコハク酸を生じることが知られてお
り、簡便な検出方法として利用できる（Holbrook, E.
L. et al., Biochemistry 29,435-442 (1990)）。粗酵
素抽出液１００μlを、0.2Mトリス−塩酸（pH8）、5mM
Ｏ−サクシニルホモセリン（シグマ社製）、及び0.25mM
ピリドキサルリン酸（シグマ社製）からなる反応液に加
え1mlとし、37℃で20分間反応を行った後氷冷した。こ
の反応液中のＯ−サクシニルホモセリンを逆相ＨＰＬＣ
（ジーエルサイエンス社製）で定量し、粗酵素抽出液非
添加の反応液から減少したＯ−サクシニルホモセリン量
を算出した。ピリドキサルリン酸非添加の反応を同時に
行い、ピリドキサルリン酸依存のＯ−サクシニルホモセ
リン減少を、シスタチオニン合成酵素活性とした。
【００６７】上記のようにして測定したＨＴＳ活性とシ
スタチオニン合成酵素のそれぞれの比活性の測定結果を
表１に示した。ＨＴＳ活性はW3110株ではL-メチオニン
添加の効果によりほとんど検出されないが、WΔJ株にお
いては顕著な活性を示した。シスタチオニン合成酵素活
性も、WΔJ株においてはW3110株に比して顕著な増大が
認められた。これらの結果から組換えによるmetJ欠失と
metBLオペロンのプロモーター置換の効果が確認され
た。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【実施例２】 W3110株からのmetK変異株の取得 W3110株をＬＢ培地（Sambrook, J. et al., "Molecular
Cloning A Laboratory Manual/Second Edition", Cold
Spring Harbor Laboratory Press, A.1 (1989)）にて3
7℃で一晩培養した。培養した培養液１mlを5,000rpmで1
0分間遠心分離し、菌体を0.9%の食塩水で２度洗浄し
た。得られた菌体を100μlの0.9%食塩水に懸濁し、その
うちの10μlを５mlの0.1g/lのDL-ノルロイシン（ＮＬ）
を含むデイビス−ミンジオリ最少培地に植菌した。これ
を３７℃で５日間培養した。
【００７０】生育してきたコロニーの幾つかをLB寒天培
地上でコロニー分離し、再度0.1g/lのＮＬを含むデイビ
ス−ミンジオリ最小培地での生育を確認し、12株のＮＬ
耐性株を選抜した。これらの耐性株から染色体DNAを調
製した。これを鋳型として配列番号１１及び１２に示す
配列を有する２種のプライマーを用いてPCR反応を行いm
etK遺伝子の増幅を行った。この増幅断片の塩基配列
を、配列番号１１及び１２に示した増幅用プライマー、
及び配列番号１３、１４、１５、及び１６に示す配列を
有するプライマーを用いて決定した。塩基配列の決定は
ダイターミネーターサイクルシークエンシングキット
（パーキンエルマー社製）を用いて、373S型DNAシーク
エンサー（パーキンエルマー社製）にてそれぞれの指示
に従って行った。対照として決定した野生株W3110の塩
基配列はブラットナーらが報告しているmetKの配列（Bl
attner, F. R. et al., Science, 277, 1453-1462 (199
7)）と完全に一致した。この配列を配列番号１７に示し
た。また、この配列がコードし得るＳＡＭ合成酵素のア
ミノ酸配列を配列番号１８に示した。
【００７１】ＮＬ耐性株のうち、metKの構造遺伝子中に
変異点が見いだされたものは１２株の内３株あり、これ
らをWNL2、WNL24、及びWNL32と名付けた。これらの変異
株のmetK塩基配列は、配列番号１７に示す野生型の塩基
配列上で、WNL2株では９０７番目のアデニンがシトシン
に、WNL24株では５５４番目のチミンがアデニンに、WNL
32株では1132番目のシトシン塩基の欠失が認められた。
この結果、配列番号１８に示したＳＡＭ合成酵素のアミ
ノ酸配列において、WNL2株のＳＡＭ合成酵素は３０３番
目のイソロイシンがロイシンに、WNL24株では１８５番
目のバリンがグルタミン酸に、WNL32株では１塩基欠失
によって３７８番目のアルギニン以降がアラニン−メチ
オニン−ロイシン−プロリン−バリンからなる配列に変
化していることが明らかとなった。これらの株はＳＡＭ
合成酵素活性が弱化していることが推定された。
【００７２】
【実施例３】metK変異の導入と野生型metA遺伝子の増幅
によるL-メチオニン生産 （１）WΔBCΔJ株へのmetK変異の導入 metK遺伝子変異株であるWNL2株、WNL24株、及びWNL32株
の染色体DNAを鋳型とし、配列番号１９及び配列番号２
０記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ
反応を行い、metK遺伝子を含む約2.5kbの断片の増幅を
行った。この増幅断片は両端にHindIIIの認識配列が導
入されている。得られた増幅断片をそれぞれHindIIIで
切断した。HindIIIで切断したpSTV28（宝酒造社製）及
びPCR増幅断片を混合後連結反応を行い、JM109株を形質
転換した。形質転換体からプラスミドを抽出した。得ら
れた組換えプラスミドからPCR増幅断片が挿入されたプ
ラスミドを選択した。これらのプラスミドはmetKの構造
遺伝子に変異を有していることを塩基配列を決定し確認
した。
【００７３】これらのプラスミドのHindIII切断断片
を、HindIIIで切断したpMAN997にクローニングし、それ
ぞれpMANK-2，pMANK-24，pMANK-32と名付けた。これら
のプラスミドを用いてWΔBCΔJ株を形質転換し、常法に
従って遺伝子組換えを行った。組換え株から染色体DNA
を抽出して鋳型とし、配列番号１１及び配列番号１２に
示したオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法
による増幅産物の塩基配列を調べた。それぞれの変異が
認められたものを選択した。得られたWΔBCΔJ株由来の
metK変異株をそれぞれWΔBCΔJK-2株、WΔBCΔJK-24
株、及びWΔBCΔJK-32株とした。
【００７４】（２）metA遺伝子の増幅 W3110株染色体DNAを鋳型とし、配列番号２１及び配列番
号２２記載の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライ
マーとしてＰＣＲ反応を行い、metA遺伝子を含む約１kb
の断片の増幅を行った。この増幅断片は両端にそれぞれ
SphI及びSalIの認識配列が導入されている。得られた増
幅断片を、導入した認識部位を切断する制限酵素で切断
した。これをSphI及びSalIで切断したpHSG398にクロー
ニングした。挿入断片の塩基配列を配列番号２１及び２
２に示した増幅用プライマー、並びに配列番号２３及び
２４に示す配列を有するプライマーを用いて決定した。
決定した野生株W3110のmetAの塩基配列はブラットナー
らが報告しているmetAの配列（Blattner, F. R. et a
l., Science, 277, 1453-1462 (1997)）と完全に一致し
た。この配列を配列番号２５に示した。また、この配列
がコードし得るＨＴＳのアミノ酸配列を配列番号２６に
示した。
【００７５】このプラスミドのSphI及びSalIによる切断
物、実施例１に記載のスレオニンプロモーターのHindII
I及びSphIによる切断物、及びHindIII及びSalIで切断し
たpMW118（日本ジーン社製）を混合後、連結反応を行っ
た。この反応液でJM109株を形質転換し、形質転換体か
らプラスミドを抽出した。得られた組換えプラスミドか
ら３者が連結されたプラスミドを選択した。このプラス
ミドはスレオニンプロモーターの下流にmetA遺伝子が配
置されており、スレオニンプロモーターによりmetAが発
現する構造をとっている。このプラスミドをpMWPthmetA
-Wと名付けた。このプラスミドを用いてW3110株、WΔBC
株、WΔBCΔJ株、WΔBCΔJK-2株、WΔBCΔJK-24株、及
びWΔBCΔJK-32株を形質転換し、形質転換体を得た。
【００７６】各形質転換体を50mg/lのアンピシリンを含
むLBプレート上、37℃で一晩培養した。菌体をグルコー
ス40g/l、硫酸マグネシウム1g/l、硫安16g/l、リン酸二
水素カリウム１g/l、酵母抽出物（Bacto Yeast-Extract
(Difco)）2g/l、硫酸マンガン0.01g/l、硫酸鉄0.01g/
l、炭酸カルシウム30g/l、アンピシリン50mg/l、Ｌ−ス
レオニン0.5g/lを含むpH7の培地20mlに植菌し、37℃で4
8時間培養した。
【００７７】培養物から菌体を除き、アミノ酸分析計
（日立社製）にてＬ−メチオニン量を測定した。この結
果を表３に示した。W3110株では認められなかったＬ−
メチオニンが、WΔBC株、WΔBCΔJ株において増加し
た。metKの変異は、WΔBCΔJK-2株ではＬ−メチオニン
量は低下したものの、WΔBCΔJK-32株においては同等、
WΔBCΔJK-24株では上昇が認められ、Ｌ−メチオニン生
産に効果が認められた。プラスミドpMWPthrmetA-Wを保
持したWΔBCΔJK-24株は、プライベートナンバーAJ1342
5が付与され、平成１０年５月１４日より、通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566
日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託され
ており、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６８０８が付与され
ている。
【００７８】
【表２】
【００７９】
【実施例４】metA変異株及び阻害解除型metA遺伝子の取
得 W3110株を２mlのLB培地に植菌し、37℃で８時間培養し
た。この培養液１mlを5,000rpmで10分間遠心分離し、菌
体を0.9%の食塩水で２度洗浄した。得られた菌体を１０
０μlの０．９%食塩水に懸濁し、そのうちの５μlを５m
lの１g/lのα-メチル-DL-メチオニン（ＭＭ）を含むデ
イビス−ミンジオリ最少培地に植菌した。これを37℃で
３日間培養した。この培養液を適当に希釈の後、１g/l
のＭＭを含むデイビス−ミンジオリ最少培地に塗布し、
37℃で一晩培養した。生育してきたコロニーの幾つかを
LB寒天培地上でコロニー分離し、再度１g/lのＭＭを含
むデイビス−ミンジオリ最小培地での生育を確認した。
この操作を９回独立に行い、６個の独立した耐性株を得
て，それぞれをWMM4、WMM5、WMM6、WMM7、WMM8、及びWM
M9と名付けた。
【００８０】これらの耐性株から染色体DNAを調製し
た。これを鋳型として配列番号２１及び２２に示す配列
を有するプライマーを用いてＰＣＲ反応を行いmetA遺伝
子の増幅を行った。この増幅断片の塩基配列を配列番号
２１及び２２に示した増幅用プライマー、並びに配列番
号２３及び２４に示す配列を有するプライマーを用いて
決定した。耐性株のmetA塩基配列は、配列番号２５に示
す野生型metAの塩基配列上で、WMM4株では887番目のチ
ミンがグアニンに、WMM5株では893番目のシトシンがチ
ミンに、WMM6株では野生型、WMM7及びWMM8株では886番
目から890番目の塩基に相当するATCTCなる配列が反復し
て存在しその間に約1300塩基からなるIS2と呼ばれる挿
入配列（Ghosal, D. et al., Nucleic Acids Res. 6, 1
111-1122 (1979)）が存在し、WMM9株では79番目のシト
シンがチミンに変化していた。この結果、配列番号２６
に示したＨＴＳのアミノ酸配列において、WMM4株のＨＴ
Ｓは296番目のイソロイシンがセリンに、WMM5株では298
番目のプロリンがロイシンに、WMM7及びWMM8株では挿入
配列によって298番目のプロリン以降がアルギニン−ロ
イシン−アラニン−プロリンからなる配列に、WMM9株で
は27番目のアルギニンがシステインに変化していること
が明らかとなった。
【００８１】metA構造遺伝子に変異が認められたWMM4、
WMM5、WMM9、及びWMM7株をLB培地にて37℃で一晩試験管
培養した培養液１mlを5,000rpmで10分間遠心した後、１
mlの0.9%の食塩水で２度洗浄した。これを１mlの0.9%の
食塩水に懸濁し、0.5mlを50mlの最少培地に植菌し、37
℃で一日培養した。培養液を8,000rpmで10分間遠心した
後、１mlの0.9%の食塩水で２度洗浄した。得られた菌体
を３mlの50mMリン酸カリウム（pH7.5）、１mMジチオス
レイトールからなる緩衝液に懸濁し、実施例１に示した
のと同じ操作を行い粗酵素抽出液を得た。粗酵素抽出液
中のＨＴＳ活性を、阻害剤の存在下で実施例１に記載の
反応組成で測定した結果を、表２に示した。WMM7株につ
いては活性を検出することが出来なかったが，これは挿
入配列によるアミノ酸配列の変化により比活性が大きく
低下したものと考えられた。それ以外の株の比活性は野
生株の約１／４程度であった。ＭＭによる阻害はWMM4、
WMM5、及びWMM9株のいずれにおいても解除されており、
L-メチオニンによる阻害もかなり緩和していた。ＳＡＭ
による阻害はWMM9株でほとんど解除が認められなかった
が、WMM4及びWMM5株では解除する傾向が認められた。野
生株ＨＴＳ活性に最も強力な阻害を示したL-メチオニン
及びＳＡＭの組合わせもWMM4及びWMM5株で顕著な緩和が
認められた。
【００８２】
【表３】
【００８３】
【実施例５】変異型metAの導入によるL-メチオニン生産 実施例４で得られたmetAの変異株のうち、WMM9株、WMM4
株、及びWMM5株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号２１
及び配列番号２２記載の配列を有するオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとしてそれぞれＰＣＲ反応を行い、metA
遺伝子を含む断片を増幅した。この増幅断片は、両端に
SphI及びSalIの認識配列が導入されている。この増幅断
片の両端をSphI及びSalIで切断し、SphI及びSalIで切断
したpHSG398にクローニングした。挿入断片の塩基配列
を決定し、変異点を確認した。このプラスミドのSphI及
びSalIによる切断物、実施例１に記載のスレオニンプロ
モーターのHindIII及びSphIによる切断物、及びHindIII
及びSalIで切断したpMW118（日本ジーン社製）を混合
後、連結反応を行った。この反応液でJM109株を形質転
換し、形質転換体からプラスミドを抽出した。得られた
組換えプラスミドから３者が連結されたプラスミドを選
択した。これらをそれぞれpMWPthrmetA-9、pMWPthrmetA
-4、及びpMWPthrmetA-5と名付けた。
【００８４】さらに各変異型metA遺伝子の変異点を組合
わせるため、部位特異的変異導入をMutan-Super Expres
s Km（宝酒造社製）を用いてその指示に従って行った。
配列番号２７記載の配列を有するオリゴヌクレオチドを
用いて、metA-4変異にmetA-9変異を組合わせてpMWPthrm
etA-9+4を作製した。同様にmetA-5変異にmetA-9変異を
組合わせてpMWPthrmetA-9+5を作製した。さらに配列番
号２８記載の配列を有するオリゴヌクレオチドを用い
て、metA-9変異にmetA-4及びmetA-5変異を組合わせてpM
WPthrmetA-9+4+5を作製した。
【００８５】これらのプラスミドを用いてWΔBCΔJK-32
株を形質転換し、形質転換体を得た。各形質転換体を、
50mg/lのアンピシリンを含むLBプレート上、37℃で一晩
培養した。菌体をグルコース40g/l、硫酸マグネシウム
１g/l、硫安16g/l、リン酸二水素カリウム１g/l、酵母
抽出物（Bacto Yeast-Extract (Difco) 2g/l、硫酸マン
ガン0.01g/l、硫酸鉄0.01g/l、炭酸カルシウム30g/l、
アンピシリン50mg/l、Ｌ−スレオニン0.5g/lを含むpH7
の培地20mlに植菌し、37℃で48時間培養した。培養物か
ら菌体を除き、アミノ酸分析計（日立社製）にてＬ−メ
チオニン量を測定した。この結果を表４に示した。Ｌ−
メチオニン蓄積量は、野生型metAを導入した株に比べ
て、変異型のmetAを導入した株では数倍増加した。さら
に変異を組合わせることによって、Ｌ−メチオニン生産
量のさらなる増加が認められた。
【００８６】
【表４】
【００８７】
【発明の効果】本発明により、Ｌ−メチオニン生産能を
有する微生物が提供される。同微生物は、Ｌ−メチオニ
ン生産菌として、また、Ｌ−メチオニン生産菌の育種の
材料として利用することができる。本発明の変異型metA
遺伝子は、Ｌ−メチオニン及びＳＡＭによる協奏阻害が
解除されているので、Ｌ−メチオニン生産菌の育種に利
用することができる。
【００８８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Ltd） <120> 発酵法によるＬ−メチオニンの製造法（Method for Producing L-Methion ine by Fermentation） <130> P-6041 <141> 1998-11-17 <160> 29 <170> PatentIn Ver. 2.0
【００８９】 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 1 gggaattctg gcaggaggaa ctggcgca 28
【００９０】 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 2 gggtcgacgc tcatattggc actggaag 28
【００９１】 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 gggtcgacat cagtaaaatc tattcatt 28
【００９２】 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 ggaagcttgc ccgagggaaa gatctgta 28
【００９３】 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 gggcatgccc agggaacttc atcacatg 28
【００９４】 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 gggaattctc atggttgcgg cgtgagag 28
【００９５】 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 7 ggaagcttgc gtgagatggg gattaacc 28
【００９６】 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 8 gggaattcta ctgctagctg ctcttgcg 28
【００９７】 <210> 9 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 9 ggaagcttaa aattttattg acttaggtca ctaaatactt taaccaatat aggcatagcg 60 cacagacgca tgccc 75
【００９８】 <210> 10 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 10 gggcatgcgt ctgtgcgcta tgcctatatt ggttaaagta tttagtgacc taagtcaata 60 aaattttaag cttcc 75
【００９９】 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 11 caacagtttg agctaacc 18
【０１００】 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 12 gcggtttttt tgccggatgc 20
【０１０１】 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 13 tcggctacgc aactaatg 18
【０１０２】 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 14 gagaatgcac cgccaccg 18
【０１０３】 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 15 tggcgcgtca cggtggcg 18
【０１０４】 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 16 gcacgtcggt ttcattag 18
【０１０５】 <210> 17 <211> 1155 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(1152) <400> 17 atg gca aaa cac ctt ttt acg tcc gag tcc gtc tct gaa ggg cat cct 48 Met Ala Lys His Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Ser Glu Gly His Pro 1 5 10 15 gac aaa att gct gac caa att tct gat gcc gtt tta gac gcg atc ctc 96 Asp Lys Ile Ala Asp Gln Ile Ser Asp Ala Val Leu Asp Ala Ile Leu 20 25 30 gaa cag gat ccg aaa gca cgc gtt gct tgc gaa acc tac gta aaa acc 144 Glu Gln Asp Pro Lys Ala Arg Val Ala Cys Glu Thr Tyr Val Lys Thr 35 40 45 ggc atg gtt tta gtt ggc ggc gaa atc acc acc agc gcc tgg gta gac 192 Gly Met Val Leu Val Gly Gly Glu Ile Thr Thr Ser Ala Trp Val Asp 50 55 60 atc gaa gag atc acc cgt aac acc gtt cgc gaa att ggc tat gtg cat 240 Ile Glu Glu Ile Thr Arg Asn Thr Val Arg Glu Ile Gly Tyr Val His 65 70 75 80 tcc gac atg ggc ttt gac gct aac tcc tgt gcg gtt ctg agc gct atc 288 Ser Asp Met Gly Phe Asp Ala Asn Ser Cys Ala Val Leu Ser Ala Ile 85 90 95 ggc aaa cag tct cct gac atc aac cag ggc gtt gac cgt gcc gat ccg 336 Gly Lys Gln Ser Pro Asp Ile Asn Gln Gly Val Asp Arg Ala Asp Pro 100 105 110 ctg gaa cag ggc gcg ggt gac cag ggt ctg atg ttt ggc tac gca act 384 Leu Glu Gln Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr 115 120 125 aat gaa acc gac gtg ctg atg cca gca cct atc acc tat gca cac cgt 432 Asn Glu Thr Asp Val Leu Met Pro Ala Pro Ile Thr Tyr Ala His Arg 130 135 140 ctg gta cag cgt cag gct gaa gtg cgt aaa aac ggc act ctg ccg tgg 480 Leu Val Gln Arg Gln Ala Glu Val Arg Lys Asn Gly Thr Leu Pro Trp 145 150 155 160 ctg cgc ccg gac gcg aaa agc cag gtg act ttt cag tat gac gac ggc 528 Leu Arg Pro Asp Ala Lys Ser Gln Val Thr Phe Gln Tyr Asp Asp Gly 165 170 175 aaa atc gtt ggt atc gat gct gtc gtg ctt tcc act cag cac tct gaa 576 Lys Ile Val Gly Ile Asp Ala Val Val Leu Ser Thr Gln His Ser Glu 180 185 190 gag atc gac cag aaa tcg ctg caa gaa gcg gta atg gaa gag atc atc 624 Glu Ile Asp Gln Lys Ser Leu Gln Glu Ala Val Met Glu Glu Ile Ile 195 200 205 aag cca att ctg ccc gct gaa tgg ctg act tct gcc acc aaa ttc ttc 672 Lys Pro Ile Leu Pro Ala Glu Trp Leu Thr Ser Ala Thr Lys Phe Phe 210 215 220 atc aac ccg acc ggt cgt ttc gtt atc ggt ggc cca atg ggt gac tgc 720 Ile Asn Pro Thr Gly Arg Phe Val Ile Gly Gly Pro Met Gly Asp Cys 225 230 235 240 ggt ctg act ggt cgt aaa att atc gtt gat acc tac ggc ggc atg gcg 768 Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly Gly Met Ala 245 250 255 cgt cac ggt ggc ggt gca ttc tct ggt aaa gat cca tca aaa gtg gac 816 Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser Lys Val Asp 260 265 270 cgt tcc gca gcc tac gca gca cgt tat gtc gcg aaa aac atc gtt gct 864 Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Tyr Val Ala Lys Asn Ile Val Ala 275 280 285 gct ggc ctg gcc gat cgt tgt gaa att cag gtt tcc tac gca atc ggc 912 Ala Gly Leu Ala Asp Arg Cys Glu Ile Gln Val Ser Tyr Ala Ile Gly 290 295 300 gtg gct gaa ccg acc tcc atc atg gta gaa act ttc ggt act gag aaa 960 Val Ala Glu Pro Thr Ser Ile Met Val Glu Thr Phe Gly Thr Glu Lys 305 310 315 320 gtg cct tct gaa caa ctg acc ctg ctg gta cgt gag ttc ttc gac ctg 1008 Val Pro Ser Glu Gln Leu Thr Leu Leu Val Arg Glu Phe Phe Asp Leu 325 330 335 cgc cca tac ggt ctg att cag atg ctg gat ctg ctg cac ccg atc tac 1056 Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Gln Met Leu Asp Leu Leu His Pro Ile Tyr 340 345 350 aaa gaa acc gca gca tac ggt cac ttt ggt cgt gaa cat ttc ccg tgg 1104 Lys Glu Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg Glu His Phe Pro Trp 355 360 365 gaa aaa acc gac aaa gcg cag ctg ctg cgc gat gct gcc ggt ctg aag 1152 Glu Lys Thr Asp Lys Ala Gln Leu Leu Arg Asp Ala Ala Gly Leu Lys 370 375 380 taa 1155
【０１０６】 <210> 18 <211> 384 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 18 Met Ala Lys His Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Ser Glu Gly His Pro 1 5 10 15 Asp Lys Ile Ala Asp Gln Ile Ser Asp Ala Val Leu Asp Ala Ile Leu 20 25 30 Glu Gln Asp Pro Lys Ala Arg Val Ala Cys Glu Thr Tyr Val Lys Thr 35 40 45 Gly Met Val Leu Val Gly Gly Glu Ile Thr Thr Ser Ala Trp Val Asp 50 55 60 Ile Glu Glu Ile Thr Arg Asn Thr Val Arg Glu Ile Gly Tyr Val His 65 70 75 80 Ser Asp Met Gly Phe Asp Ala Asn Ser Cys Ala Val Leu Ser Ala Ile 85 90 95 Gly Lys Gln Ser Pro Asp Ile Asn Gln Gly Val Asp Arg Ala Asp Pro 100 105 110 Leu Glu Gln Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr 115 120 125 Asn Glu Thr Asp Val Leu Met Pro Ala Pro Ile Thr Tyr Ala His Arg 130 135 140 Leu Val Gln Arg Gln Ala Glu Val Arg Lys Asn Gly Thr Leu Pro Trp 145 150 155 160 Leu Arg Pro Asp Ala Lys Ser Gln Val Thr Phe Gln Tyr Asp Asp Gly 165 170 175 Lys Ile Val Gly Ile Asp Ala Val Val Leu Ser Thr Gln His Ser Glu 180 185 190 Glu Ile Asp Gln Lys Ser Leu Gln Glu Ala Val Met Glu Glu Ile Ile 195 200 205 Lys Pro Ile Leu Pro Ala Glu Trp Leu Thr Ser Ala Thr Lys Phe Phe 210 215 220 Ile Asn Pro Thr Gly Arg Phe Val Ile Gly Gly Pro Met Gly Asp Cys 225 230 235 240 Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly Gly Met Ala 245 250 255 Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser Lys Val Asp 260 265 270 Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Tyr Val Ala Lys Asn Ile Val Ala 275 280 285 Ala Gly Leu Ala Asp Arg Cys Glu Ile Gln Val Ser Tyr Ala Ile Gly 290 295 300 Val Ala Glu Pro Thr Ser Ile Met Val Glu Thr Phe Gly Thr Glu Lys 305 310 315 320 Val Pro Ser Glu Gln Leu Thr Leu Leu Val Arg Glu Phe Phe Asp Leu 325 330 335 Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Gln Met Leu Asp Leu Leu His Pro Ile Tyr 340 345 350 Lys Glu Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg Glu His Phe Pro Trp 355 360 365 Glu Lys Thr Asp Lys Ala Gln Leu Leu Arg Asp Ala Ala Gly Leu Lys 370 375 380
【０１０７】 <210> 19 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 19 ggaagcttaa gcagagatgc agagtgcg 28
【０１０８】 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 20 ggaagcttgg tgcggtataa gaggccac 28
【０１０９】 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 21 gggcatgctg tagtgaggta atcaggtt 28
【０１１０】 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 22 gggtcgactt aatccagcgt tggattca 28
【０１１１】 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 23 tgtctgctgg gcggtaca 18
【０１１２】 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 24 agagagtttt tcggtgcg 18
【０１１３】 <210> 25 <211> 930 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(927) <400> 25 atg ccg att cgt gtg ccg gac gag cta ccc gcc gtc aat ttc ttg cgt 48 Met Pro Ile Arg Val Pro Asp Glu Leu Pro Ala Val Asn Phe Leu Arg 1 5 10 15 gaa gaa aac gtc ttt gtg atg aca act tct cgt gcg tct ggt cag gaa 96 Glu Glu Asn Val Phe Val Met Thr Thr Ser Arg Ala Ser Gly Gln Glu 20 25 30 att cgt cca ctt aag gtt ctg atc ctt aac ctg atg ccg aag aag att 144 Ile Arg Pro Leu Lys Val Leu Ile Leu Asn Leu Met Pro Lys Lys Ile 35 40 45 gaa act gaa aat cag ttt ctg cgc ctg ctt tca aac tca cct ttg cag 192 Glu Thr Glu Asn Gln Phe Leu Arg Leu Leu Ser Asn Ser Pro Leu Gln 50 55 60 gtc gat att cag ctg ttg cgc atc gat tcc cgt gaa tcg cgc aac acg 240 Val Asp Ile Gln Leu Leu Arg Ile Asp Ser Arg Glu Ser Arg Asn Thr 65 70 75 80 ccc gca gag cat ctg aac aac ttc tac tgt aac ttt gaa gat att cag 288 Pro Ala Glu His Leu Asn Asn Phe Tyr Cys Asn Phe Glu Asp Ile Gln 85 90 95 gat cag aac ttt gac ggt ttg att gta act ggt gcg ccg ctg ggc ctg 336 Asp Gln Asn Phe Asp Gly Leu Ile Val Thr Gly Ala Pro Leu Gly Leu 100 105 110 gtg gag ttt aat gat gtc gct tac tgg ccg cag atc aaa cag gtg ctg 384 Val Glu Phe Asn Asp Val Ala Tyr Trp Pro Gln Ile Lys Gln Val Leu 115 120 125 gag tgg tcg aaa gat cac gtc acc tcg acg ctg ttt gtc tgc tgg gcg 432 Glu Trp Ser Lys Asp His Val Thr Ser Thr Leu Phe Val Cys Trp Ala 130 135 140 gta cag gcc gcg ctc aat atc ctc tac ggc att cct aag caa act cgc 480 Val Gln Ala Ala Leu Asn Ile Leu Tyr Gly Ile Pro Lys Gln Thr Arg 145 150 155 160 acc gaa aaa ctc tct ggc gtt tac gag cat cat att ctc cat cct cat 528 Thr Glu Lys Leu Ser Gly Val Tyr Glu His His Ile Leu His Pro His 165 170 175 gcg ctt ctg acg cgt ggc ttt gat gat tca ttc ctg gca ccg cat tcg 576 Ala Leu Leu Thr Arg Gly Phe Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser 180 185 190 cgc tat gct gac ttt ccg gca gcg ttg att cgt gat tac acc gat ctg 624 Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu 195 200 205 gaa att ctg gca gag acg gaa gaa ggg gat gca tat ctg ttt gcc agt 672 Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser 210 215 220 aaa gat aag cgc att gcc ttt gtg acg ggc cat ccc gaa tat gat gcg 720 Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala 225 230 235 240 caa acg ctg gcg cag gaa ttt ttc cgc gat gtg gaa gcc gga cta gac 768 Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp 245 250 255 ccg gat gta ccg tat aac tat ttc ccg cac aat gat ccg caa aat aca 816 Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr 260 265 270 ccg cga gcg agc tgg cgt agt cac ggt aat tta ctg ttt acc aac tgg 864 Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp 275 280 285 ctc aac tat tac gtc tac cag atc acg cca tac gat cta cgg cac atg 912 Leu Asn Tyr Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Met 290 295 300 aat cca acg ctg gat taa 930 Asn Pro Thr Leu Asp 305
【０１１４】 <210> 26 <211> 309 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 26 Met Pro Ile Arg Val Pro Asp Glu Leu Pro Ala Val Asn Phe Leu Arg 1 5 10 15 Glu Glu Asn Val Phe Val Met Thr Thr Ser Arg Ala Ser Gly Gln Glu 20 25 30 Ile Arg Pro Leu Lys Val Leu Ile Leu Asn Leu Met Pro Lys Lys Ile 35 40 45 Glu Thr Glu Asn Gln Phe Leu Arg Leu Leu Ser Asn Ser Pro Leu Gln 50 55 60 Val Asp Ile Gln Leu Leu Arg Ile Asp Ser Arg Glu Ser Arg Asn Thr 65 70 75 80 Pro Ala Glu His Leu Asn Asn Phe Tyr Cys Asn Phe Glu Asp Ile Gln 85 90 95 Asp Gln Asn Phe Asp Gly Leu Ile Val Thr Gly Ala Pro Leu Gly Leu 100 105 110 Val Glu Phe Asn Asp Val Ala Tyr Trp Pro Gln Ile Lys Gln Val Leu 115 120 125 Glu Trp Ser Lys Asp His Val Thr Ser Thr Leu Phe Val Cys Trp Ala 130 135 140 Val Gln Ala Ala Leu Asn Ile Leu Tyr Gly Ile Pro Lys Gln Thr Arg 145 150 155 160 Thr Glu Lys Leu Ser Gly Val Tyr Glu His His Ile Leu His Pro His 165 170 175 Ala Leu Leu Thr Arg Gly Phe Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser 180 185 190 Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu 195 200 205 Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser 210 215 220 Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala 225 230 235 240 Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp 245 250 255 Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr 260 265 270 Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp 275 280 285 Leu Asn Tyr Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Met 290 295 300 Asn Pro Thr Leu Asp 305
【０１１５】 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 27 ccagacgcac aagaagttgt c 21
【０１１６】 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 28 tagatcgtat agcgtgctct ggtagac 27
【０１１７】 <210> 29 <211> 309 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 29 Ala Met Leu Pro Val 5
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｐ 13/12 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 BA71 CA02 CA06 DA05 DA06 EA04 4B050 CC04 DD02 LL01 4B064 AE16 CA02 CA19 CD13 DA01 DA16 4B065 AA26X AA26Y AB01 AC14 BA02 CA17 CA44

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサー
    を欠損し、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有する微生
    物。
  2. 【請求項２】 細胞内のホモセリントランスサクシニラ
    ーゼ活性が増強され、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有
    する微生物。
  3. 【請求項３】 Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサー
    を欠損し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ
    活性が増強され、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有する
    微生物。
  4. 【請求項４】 さらに細胞内のＳ−アデノシルメチオニ
    ンシンテテース活性が弱化した請求項１〜３のいずれか
    一項に記載の微生物。
  5. 【請求項５】 ホモセリントランスサクシニラーゼ活性
    の増強が、前記微生物細胞内のホモセリントランスサク
    シニラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めるこ
    と、又は同遺伝子の発現調節配列を増強することによる
    ものである請求項２〜４記載の微生物。
  6. 【請求項６】 Ｌ−メチオニンとＳ−アデノシルメチオ
    ニンによる協奏阻害が解除されたホモセリントランスサ
    クシニラーゼを保持する請求項１又は４に記載の微生
    物。
  7. 【請求項７】 Ｌ−スレオニン要求性を示すことを特徴
    とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物。
  8. 【請求項８】 細胞内のシスタチオニンγ−シンテース
    活性及びアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナ
    ーゼII活性が増強された請求項１〜７のいずれか一項に
    記載の微生物。
  9. 【請求項９】 エシェリヒア属に属することを特徴とす
    る請求項１〜８のいずれか一項に記載の微生物。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか一項に記載の
    微生物を培地に培養し、培地中にＬ−メチオニンを生成
    蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とす
    るＬ−メチオニンの製造法。
  11. 【請求項１１】 配列番号２６に示すアミノ酸配列にお
    いて、27位のアルギニンがシステインに置換する変異、
    296位のイソロイシンがセリンに置換する変異、298位の
    プロリンがロイシンに置換する変異、27位のアルギニン
    がシステインに置換しかつ296位のイソロイシンがセリ
    ンに置換する変異、296位のイソロイシンがセリンに置
    換しかつ298位のプロリンがロイシンに置換する変異、2
    98位のプロリンがロイシンに置換しかつ27位のアルギニ
    ンがシステインに置換する変異、又は、27位のアルギニ
    ンがシステインに置換し、296位のイソロイシンがセリ
    ンに置換しかつ298位のプロリンがロイシンに置換する
    変異のいずれかに相当する変異を有するアミノ酸配列を
    有し、Ｌ−メチオニンとＳ−アデノシルメチオニンによ
    る協奏阻害が解除されたホモセリントランスサクシニラ
    ーゼをコードするＤＮＡ。
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