JP2001037494A

JP2001037494A - 変異型イソプロピルマレートシンターゼをコードするｄｎａ、ｌ−ロイシン生産性微生物、および、ｌ−ロイシンの製造法

Info

Publication number: JP2001037494A
Application number: JP2000198835A
Authority: JP
Inventors: Mikhail Markovich Gusyatiner; ミハイルマルコヴィッチグシャチネル; Maria Grigorievna Lunts; マリヤグリゴリエヴナルンツ; Yury Ivanovich Kozlov; ユーリーイヴァノヴィッチコズロフ; Lirina Valerievna Ivanovskaya; リリナヴァレリエヴナイヴァノフスカヤ; Elvira Borisovna Voroshilova; エリヴィラボリソヴナヴォロシロヴァ
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1999-07-09
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2001-02-13
Anticipated expiration: 2020-06-30
Also published as: EP1067191A3; DE60040178D1; CN1211399C; JP4501014B2; EP1568776A2; EP1067191B1; US6403342B1; EP1067191A2; RU2201454C2; CN1280135A; EP1568776B1; DE60025976T2; DE60025976D1; EP1568776A3

Abstract

(57)【要約】【課題】Ｌ−ロイシン生産能に優れた微生物を提供
し、そして安価かつ効率的なＬ−ロイシンの製造法を提
供する。【解決手段】Ｌ−ロイシン生産能を有し、かつＬ−ロ
イシンによる阻害が解除されたα−イソプロピルリンゴ
酸シンターゼをコードするＤＮＡにより形質転換された
微生物を培地で培養し、該培地中にＬ−ロイシンを生成
蓄積せしめ、該培地からＬ−ロイシンを採取することに
よって、Ｌ−ロイシンを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、変異型α−イソプ
ロピルマレートシンターゼをコードするＤＮＡに関す
る。また、本発明は、変異型α−イソプロピルマレート
シンターゼを有するＬ−ロイシン生産性微生物およびそ
れを用いたＬ−ロイシンの製造法に関する。Ｌ−ロイシ
ンは、食品及び飼料用の栄養添加物、医療、製薬及び化
学工業における試薬、あるいはリジンのような他のアミ
ノ酸の製造に用いられる微生物の成長因子として用いら
れる必須アミノ酸である。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｌ−ロイシンは、主としてブレビ
バクテリウム属、コリネバクテリウム属またはセラチア
属に属するＬ−ロイシン生産菌またはそれらの変異株を
用いた発酵法により製造されている（アミノ酸発酵、学
会出版センター、３９７〜４２２頁、１９８６年）。最
も高いレベルでＬ−ロイシンを蓄積するのは、ブレビバ
クテリウム・フラバム VKPM B-2736である。この株は、
研究用ファーメンターで、スクロース含有培地を用いた
７２時間の醗酵で、Ｌ−ロイシンを２６ｇ／Ｌまで生産
する（ＵＳＳＲ発明者証第１３９４７１１号）。また、
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム３４株は、
グルコースを含む培地でＬ−ロイシンを３４ｇ／Ｌまで
生産する（Appl. Environ. Microbiol., 51, p.1024 (1
986)）。

【０００３】上記のように、微生物のＬ−ロイシンの生
産性はかなり高まってはいるが、今後のＬ−ロイシンの
需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効
率的な製造法の開発が求められている。

【０００４】ところで、エシェリヒア（Escherichia）
属に属する微生物は、その増殖速度の速さ並びに遺伝子
解析の進み方、遺伝子材料の豊富さ等から優れたＬ−ロ
イシン生産菌として利用される可能性を有しているが、
エシェリヒア属細菌によるＬ−ロイシン生産の報告は少
ない。Ｌ−ロイシン生産性を有するエシェリヒア属細菌
としては、β−チエニルアラニン耐性を有する微生物、
β−チエニルアラニン耐性及びβ−ヒドロキシロイシン
耐性を有する微生物（以上、特公昭62-34397号公報）、
４−アザロイシン耐性又は５，５，５−トリフルオロロ
イシン耐性を有する微生物（特開平8-70879号公報）が
知られている。しかし、Ｌ−ロイシン耐性を有するエシ
ェリヒア属細菌及びエシェリヒア属細菌におけるＬ−ロ
イシン耐性とＬ−ロイシン生産性との関係については知
られていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記観点か
ら、Ｌ−ロイシン生産能に優れた微生物を提供し、そし
て、安価かつ効率的なＬ−ロイシンの製造法を提供する
ことを課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、α−イソプロ
ピルマレートシンターゼ（以下、ＩＰＭＳと略す）のＬ
−ロイシンによる阻害の解除が、Ｌ−ロイシン生産性に
寄与することを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００７】すなわち本発明は、以下の（Ａ）又は
（Ｂ）のタンパク質をコードするＤＮＡ（以下、本発明
のＤＮＡともいう）を提供する。（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、下記
（ａ）〜（ｅ）から選ばれる置換を有するアミノ酸配列
を有するタンパク質。（ａ）４８２位のスレオニン残基の他のアミノ酸残基へ
の置換。（ｂ）３８６位のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基
への置換。（ｃ）４２８位のプロリン残基の他のアミノ酸残基への
置換。（ｄ）４７９位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への
置換。（ｅ）４６２位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への
置換。（Ｂ）（Ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、Ｉ
ＰＭＳ活性を有し且つその活性のＬ−ロイシンによる阻
害が（Ａ）のタンパク質と同等に解除されているタンパ
ク質。

【０００８】本発明のＤＮＡは、好ましくは、前記置換
が下記（ａ’）〜（ｅ’）から選ばれる置換であるもの
である。（ａ’）４８２位のスレオニン残基のイソロイシン残基
への置換。（ｂ’）３８６位のグルタミン酸残基のリジン残基への
置換。（ｃ’）４２８位のプロリン残基のロイシン残基への置
換。（ｄ’）４７９位のグリシン残基のシステイン残基への
置換。（ｅ’）４６２位のグリシン残基のアスパラギン酸残基
への置換。

【０００９】本発明のＤＮＡの具体例としては、配列番
号１に示す塩基配列において下記（ｉ）〜（ｖ）から選
ばれる変異を有する塩基配列を有するものが挙げられ
る。（ｉ）1445位のシトシンのチミンへの変異。（ii）1156位のグアニンのアデニンへの変異。（iii）1283位のシトシンのチミンへの変異。（iv）1435位のグアニンのチミンへの変異。（ｖ）1385位のグアニンのアデニン残基への変異。

【００１０】本発明は、また、本発明のＤＮＡにより形
質転換され、かつＬ−ロイシン生産能を有する微生物
（以下、本発明の微生物ともいう）を提供する。また、
本発明の微生物は、好ましくは、エシェリヒア属細菌で
あり、より好ましくは、エシェリヒア・コリ(E. coli)
である。

【００１１】本発明は、さらに、本発明の微生物を培地
で培養し、該培地中にＬ−ロイシンを生成蓄積せしめ、
該培地からＬ−ロイシンを採取することを特徴とするＬ
−ロイシンの製造法を提供する。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１３】＜１＞本発明のＤＮＡ本発明のＤＮＡは、野生型ＩＰＭＳをコードするＤＮＡ
において、コードされるＩＰＭＳのＬ−ロイシンによる
フィードバック阻害が解除される変異を有するものであ
る。

【００１４】本発明において「Ｌ−ロイシンによるフィ
ードバック阻害が解除される」とは、そのフィードバッ
ク阻害の程度が低下していることを意味する。フィード
バック阻害の程度の低下は、Ｌ−ロイシンの存在による
ＩＰＭＳ活性の低下を測定し、野生株または親株と比較
することによって評価することができる。

【００１５】ＩＰＭＳとしては、エシェリヒア属細菌由
来のもの、特にE. coli由来のＩＰＭＳが挙げられる。
また、ＩＰＭＳのＬ−ロイシンによるフィードバック阻
害を解除する変異としては、配列番号２に記載されるＩ
ＰＭＳのアミノ酸配列中の以下の置換が挙げられる。（ａ）４８２位のスレオニン残基の他のアミノ酸残基へ
の置換。（ｂ）３８６位のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基
への置換。（ｃ）４２８位のプロリン残基の他のアミノ酸残基への
置換。（ｄ）４７９位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への
置換。（ｅ）４６２位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への
置換。

【００１６】これらの置換は、好ましくは、以下の通り
である。（ａ’）４８２位のスレオニン残基のイソロイシン残基
への置換。（ｂ’）３８６位のグルタミン酸残基のリジン残基への
置換。（ｃ’）４２８位のプロリン残基のロイシン残基への置
換。（ｄ’）４７９位のグリシン残基のシステイン残基への
置換。（ｅ’）４６２位のグリシン残基のアスパラギン酸残基
への置換。

【００１７】野生型ＩＰＭＳをコードするＤＮＡとして
は、エシェリヒア属細菌由来のＩＰＭＳをコードするも
のが挙げられ、より具体的には配列番号２に示すアミノ
酸配列をコードするＤＮＡが挙げられ、さらに具体的に
は配列番号１に示す塩基配列が挙げられる。これらの配
列において、上記アミノ酸残基の置換を起こすような塩
基配列の変異を有するものが、本発明のＤＮＡに含まれ
る。なお、置換されたアミノ酸残基に対応するコドン
は、そのアミノ酸残基をコードするものであれば種類は
特に問わない。

【００１８】本発明のＤＮＡの具体例としては、配列番
号１に示す塩基配列において下記（ｉ）〜（ｖ）から選
ばれる変異を有する塩基配列を有するものが挙げられ
る。（ｉ）1445位のシトシンのチミンへの変異。（ii）1156位のグアニンのアデニンへの変異。（iii）1283位のシトシンのチミンへの変異。（iv）1435位のグアニンのチミンへの変異。（ｖ）1385位のグアニンのアデニン残基への変異。

【００１９】また、菌種や菌株の違いにより保持するＩ
ＰＭＳの配列がわずかに相異することが予想されるが、
このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残
基の置換、欠失あるいは挿入を有するものをコードする
ＤＮＡも本発明のＤＮＡに含まれる。すなわち、上記変
異型ＩＰＭＳのアミノ酸配列において、１若しくは数個
のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミ
ノ酸配列からなるタンパク質であって、ＩＰＭＳ活性を
有し且つその活性のＬ−ロイシンによる阻害が上記変異
型ＩＰＭＳと同等に解除されているタンパク質をコード
するＤＮＡも、本発明の変異型ＩＰＭＳをコードするＤ
ＮＡに包含される。このようなＤＮＡには、上記のよう
なアミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加には、ＩＰＭＳ
を保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合
などの天然に生じ得る変異を有するもの（mutant又はva
riant）も含まれる。

【００２０】（１）野生型ＩＰＭＳ遺伝子の取得野生型ＩＰＭＳ遺伝子あるいは他の変異を有するＩＰＭ
Ｓ遺伝子を含有するDNAの供与菌としては、好ましくは
エシェリヒア属に属する微生物が挙げられる。具体的に
はナイトハルトらの著書（Neidhardt, F.C. et.al., Es
cherichia coliand Salmonella Typhimurium, American
Society for Microbiology, Washington D.C., 1208,
table 1）にあげられるものが利用できる。例えば、E.
coli K-12株、JM109株、MC1061株などがあげられる。Ｉ
ＰＭＳ遺伝子を含有するDNAの供与菌として野生株を用
いた場合、野生型のＩＰＭＳ遺伝子を含むDNAが取得で
きる。

【００２１】以下に、ＩＰＭＳ遺伝子を含有するDNAの
調製例について述べる。まず、野生型のＩＰＭＳ遺伝子
をもつE. coli例えばK-12株を培養して培養物を得る。
上記微生物を培養するには、通常の固体培養法で培養し
ても良いが、集菌の際の効率を考慮すると液体培養法を
採用して培養するのが好ましい。また、培地としては、
例えば酵母エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティ
ープリカーまたは大豆もしくは小麦の浸出液等の１種類
以上の窒素源に、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリ
ウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、塩化マグネ
シウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄または硫酸マンガン等
の無機塩類の１種以上を添加し、更に必要に応じて糖質
原料、ビタミン等を適宜添加した物が用いられる。な
お、培地の初発ｐＨは、６〜８に調整するのが適当であ
る。また培養は３０〜４２℃、好ましくは３７℃前後で
４〜２４時間、通気攪拌深部培養、振盪培養または静置
培養等により行う。

【００２２】このようにして得られた培養物を、例えば
3,000 r.p.m.で５分間遠心分離してE. coli K-12株の菌
体を得る。この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法（Bi
ochem. Biophys. Acta., 72, 619, (1963)）、K. S. Ki
rbyの方法（Biochem. J., 64,405, (1956)）等の方法に
より染色体DNAを得ることができる。

【００２３】こうして得られた染色体ＤＮＡからＩＰＭ
Ｓ遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリー
を作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部
分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間等を
調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵
素が使用できる。例えば、Sau3AIを、温度３０℃以上、
好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／mlで様
々な時間（１分〜２時間）染色体ＤＮＡに作用させてこ
れを消化する。

【００２４】ついで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、
エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターDN
Aに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染
色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素Sau3AＩと相補的な
末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばBamHＩを、
温度３０℃以上、酵素濃度１〜100ユニット／mlの条件
下で１時間以上、好ましくは１〜３時間、ベクターＤＮ
Ａに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次い
で、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切
断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリ
ガーゼ、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜１
６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／mlの条件下で１時
間以上、好ましくは４〜２４時間作用させて組換えＤＮ
Ａを得る。

【００２５】得られた組換えＤＮＡを用いて、エシェリ
ヒア属の微生物、例えば大腸菌K-12株、好ましくはJE76
27 株（ponB704, dacB12, pfv⁺, tonA2, dapA, lysA, s
tr,malA38, metB1, ilvH611, leuA371, proA3, lac-3,
tsx-76）のようなＩＰＭＳ欠損変異株を形質転換して染
色体ＤＮＡライブラリーを作製する。この形質転換は
D. M. Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 32
6 (1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理
してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M.and Higa,
A., J. Mol. Biol., 53, 159(1970)）等により行うこと
ができる。なお、JE7627株は国立遺伝学研究所（日本国
静岡県三島市）より入手可能である。

【００２６】得られた染色体ＤＮＡライブラリーの中か
ら、ＩＰＭＳ活性が増大した株あるいはＩＰＭＳ遺伝子
欠損に起因する栄養要求性が相補された株よりＩＰＭＳ
遺伝子の組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。例えば、ＩＰ
ＭＳ欠損変異株はＬ−ロイシン要求性であるので、ＩＰ
ＭＳ欠損変異株を宿主に用いた場合は、Ｌ−ロイシンを
含有しない培地上で生育可能となった菌株を単離し、該
菌株から組換えＤＮＡを回収することにより、ＩＰＭＳ
遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得ることができる。

【００２７】ＩＰＭＳ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを
もつ候補株が、実際にＩＰＭＳ遺伝子がクローニング
された組換えＤＮＡを保持するかどうかを確認するに
は、候補株から細胞抽出液を調製し、それより粗酵素液
を調製してＩＰＭＳ活性が増大していることを確認する
ことにより達成できる。ＩＰＭＳの酵素活性測定法は、
Kohlhawらの方法（J. Biol. Chem., 244, 2218(1969)）
により行うことができる。

【００２８】そして、上記菌株より、ＩＰＭＳ遺伝子を
含有するＤＮＡがベクターＤＮＡに挿入された組換えＤ
ＮＡを、例えば P. Guerry らの方法（J. Bacteriol.,
116,1064, (1973)）、D. B. Clewell の方法（J. Bacte
riol., 110, 667(1972)）などにより単離することがで
きる。

【００２９】野生型ＩＰＭＳ遺伝子の取得は、染色体上
にＩＰＭＳ遺伝子を有する株から、斎藤、三浦の方法等
により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメラーゼチェインリ
アクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction；
White, T.J. et al, TrendsGenet., 5, 185(1989)参
照）により、ＩＰＭＳ遺伝子を増幅することによっても
行える。増幅反応に用いるＤＮＡプライマーは、ＩＰＭ
Ｓ遺伝子の全領域あるいは一部領域を含有するＤＮＡ二
重鎖の両３’末端に相補するものを用いる。ＩＰＭＳ遺
伝子の一部領域だけを増幅した場合には、該ＤＮＡ断片
をプライマーとして全領域を含むＤＮＡ断片を染色体Ｄ
ＮＡライブラリーよりスクリーニングする必要がある。
ＩＰＭＳ遺伝子の全領域を増幅した場合には、増幅され
たＩＰＭＳ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を含むＰＣＲ反
応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、目的のＤＮ
Ａ断片を抽出することによってＩＰＭＳ遺伝子を含有
するＤＮＡ断片を回収できる。

【００３０】ＤＮＡプライマーとしては、例えばE. col
iにおいて既知となっている配列（EMBL accession numb
er No. D10483又はNo. AE000117）を基にして適宜作成
すればよいが、具体的には、ＩＰＭＳ遺伝子をコードす
る1572塩基からなる領域を増幅できるプライマーが好ま
しい。プライマーＤＮＡの合成は、ホスホアミダイト法
（Tetrahedron Letters, 22, 1859(1981)参照）等の常
法により、市販のＤＮＡ合成装置（例えば、Applied Bi
osystems社製ＤＮＡ合成機 model 380B等）を用いて行
うことができる。また、PCR反応は、市販のＰＣＲ反応
装置（宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ200
0型等）を使用し、TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造（株）
より供給されている）を用い、供給者により指定された
方法に従って行うことができる。

【００３１】ＰＣＲ法により増幅されたＩＰＭＳ遺伝子
は、エシェリヒア属細菌細胞内において自律複製可能な
ベクターＤＮＡに接続し、エシェリヒア属細菌細胞に導
入することによって、ＩＰＭＳ遺伝子への変異の導入な
どの操作がしやすくなる。用いられるベクターＤＮＡと
形質転換法、さらにＩＰＭＳ遺伝子の存在の確認方法
は上述した方法と同じである。

【００３２】なお、ＩＰＭＳ遺伝子の単離に関する報告
としては、Hertberg, K.M. et al.,Gene, 8, 135-152(1
980)、Davis, M.G. et al., J. Bacteriol., 129, 1078
-1090(1977)などがある。

【００３３】上記のＩＰＭＳ遺伝子の取得法は、野生型
ＩＰＭＳを有する微生物を変異処理し、変異型ＩＰＭＳ
を生産する変異株を創成した後、該変異株から変異型遺
伝子を取得する場合の、変異型遺伝子の取得にも用いる
ことができる。

【００３４】（２）ＩＰＭＳ遺伝子への変異の導入上記のようにして得られたＩＰＭＳ遺伝子に、アミノ酸
残基の置換、挿入および欠失等の変異を実施する方法と
しては、リコンビナントＰＣＲ法（Higuchi, R., 61, i
n PCR Technology (Erlich, H.A.Eds., Stockton press
(1989))）、部位特異的変異法（Kramer, W. and Frits,
H.J., Meth. in Enzymol., 154, 350(1987)); Kunkel,
T.A. et.al., Meth. in Enzymol., 154, 367(1987)）
などがある。これらの方法を用いると、目的部位に目的
の変異を起こすことができる。

【００３５】また、目的遺伝子を化学合成する方法によ
れば、目的部位への変異、あるいはランダムな変異を導
入することができる。

【００３６】さらに、染色体もしくはプラスミド上のＩ
ＰＭＳ遺伝子を直接ヒドロキシルアミンで処理する方法
（Hashimoto, T. and Sekiguchi, M., J. Bacteriol.,
159,1039(1984)）がある。また、ＩＰＭＳ遺伝子を保有
する微生物を紫外線照射する方法またはN−メチル−N'
−ニトロソグアニジンもしくは亜硝酸などの化学薬剤処
理による方法を用いてもよい。これらの方法によれば、
ランダムに変異を導入できる。

【００３７】変異型遺伝子の選択方法としては、まずＩ
ＰＭＳ遺伝子を含有するＤＮＡ断片とベクターＤＮＡか
らなる組換えＤＮＡを、直接ヒドロキシルアミン等で変
異処理し、これで例えば E. coli W3110 株を形質転換
する。次にＬ−ロイシンのアナログである、４−アザ−
Ｄ，Ｌ−ロイシンまたは３−ヒドロキシ−Ｄ，Ｌ−ロイ
シンを含む最少培地、例えばM9に形質転換株を培養す
る。野生型のＩＰＭＳ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを
保持する株は、その組換えＤＮＡにより発現されるＩＰ
ＭＳがＬ−ロイシンのアナログにより阻害されるため
に、Ｌ−ロイシンの合成が出来なくなり生育が抑えられ
る。これに対し、Ｌ−ロイシンによる阻害の解除された
ＩＰＭＳ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを保持する株
は、同組換えＤＮＡ中のＩＰＭＳ遺伝子にコードされる
変異酵素がＬ−ロイシンのアナログによる阻害を受けな
いので、Ｌ−ロイシンのアナログが添加された最少培地
上での生育が可能になるはずである。この現象を利用
し、生育が、Ｌ−ロイシンのアナログに耐性となってい
る株、すなわち阻害の解除された変異型ＩＰＭＳ遺伝子
を含有する組換えＤＮＡを保持する株を選択することが
できる。

【００３８】こうして得られた該変異型遺伝子を、組換
えＤＮＡとして適当な宿主微生物に導入し、発現させる
ことによりフィードバック阻害が解除されたＩＰＭＳを
保有する微生物を取得できる。宿主としては、エシェリ
ヒア属に属する微生物が好ましく、例えば大腸菌（E. c
oli）が挙げられる。

【００３９】また、組換えＤＮＡから変異型ＩＰＭＳ遺
伝子断片を取り出し、他のベクターＤＮＡに挿入したも
のを使用してもよい。本発明において用いることのでき
ることのできるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベ
クターＤＮＡが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR32
2、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pM
W119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にも
ファージＤＮＡのベクターも利用できる。

【００４０】さらに、変異型ＩＰＭＳ遺伝子の発現を効
率的に実施するために、変異型ＩＰＭＳをコードするＤ
ＮＡ配列の上流に、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内
で働く他のプロモーターを連結してもよく、ＩＰＭＳ遺
伝子に含まれるプロモーターをそのまま、あるいは増幅
して用いてもよい。

【００４１】また、上記のように、変異型遺伝子を自律
複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主に導入
し、プラスミドのように染色体外ＤＮＡとして宿主に保
持させてもよいが、変異型遺伝子を、トランスダクショ
ン、トランスポゾン（Berg,D.E. and Berg, C.M., Bio/
Technol., 1, 417(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−
１０９９８５号公報）または相同性組換え（Experiment
s in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab.(1
972)）を用いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んで
もよい。

【００４２】＜２＞本発明の微生物本発明の微生物は、本発明のＤＮＡにより形質転換さ
れ、かつＬ−ロイシン生産能を有する微生物である。

【００４３】本発明のＤＮＡによる形質転換は、公知の
方法により行うことができる。例えば、本発明ＤＮＡを
含む断片を、宿主（形質転換される微生物）で機能する
ベクターと連結して組換えＤＮＡを作成し、これを宿主
に導入することによって行うことができる。ベクター
は、宿主に合わせて適切に選択される。組換えＤＮＡの
導入は、これまでに報告されている方法に従って行うこ
とができる。例えば、エシェリヒア・コリK-12について
報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで
処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M. and H
iga, A., J. Mol.Biol., 53, 159 (1970)）があり、バ
チルス・ズブチリスについて報告されているような、増
殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを
導入する方法（Duncan, C.H., Wilson, G.A. and Youn
g, F.E., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バ
チルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られ
ているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを
容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラスト
の状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方
法（Chang, S. and Choen, S.N., Molec. Gen. Genet.,
168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. and Hopwo
od, O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen,A., Hick
s, J.B. and Fink, G.R., Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、電気パルス
法（特開平２−２０７７９１号公報参照）も使用でき
る。この導入法は、宿主に合わせて適切に選択される。
具体的には、上記＜１＞（２）において説明したような
ベクター及び方法が挙げられる。

【００４４】本明細書において、「Ｌ−ロイシン生産能
を有する」とは、培地中にＬ−ロイシンを蓄積すること
を意味し、好ましくは、培地からのＬ−ロイシンの採取
が容易な量で蓄積することを意味する。

【００４５】本発明の微生物は、好ましくはエシェリヒ
ア属細菌である。エシェリヒア属細菌として具体的に
は、エシェリヒア・コリが挙げられる。Ｌ−ロイシン生
産能を有するエシェリヒア属細菌としては、例えば特公
昭62-34397号公報、特開平8-70879号公報に記載される
ようなβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイ
シン、４−アザロイシン及び５，５，５−トリフルオロ
ロイシン等のロイシンアナログに対する耐性を有するも
のや、WO96/06926号国際公開パンフレットに記載される
ような遺伝子組換え技術によって育種されるもの等が挙
げられる。

【００４６】エシェリヒア属細菌において、Ｌ−ロイシ
ンは、Ｌ−バリン生合成系の最終中間体（２−ケトイソ
吉草酸）から分岐するＬ−ロイシン固有の生合成経路を
通って生合成される。エシェリヒア属細菌では、Ｌ−バ
リン生合成の最終段階の反応はｉｌｖＧＭＥＤＡオペロ
ンによってコードされている酵素群によって、Ｌ−ロイ
シン固有の生合成反応はｌｅｕＡＢＣＤオペロンによっ
てコードされている酵素群によって、それぞれ行われて
いる。

【００４７】ｌｅｕＡＢＣＤオペロンは、ｌｅｕＡ、ｌ
ｅｕＢ、ｌｅｕＣ及びｌｅｕＤの各遺伝子を有してお
り、ｌｅｕＡがＩＰＭＳ、ｌｅｕＢがβ−イソプロピル
マレートデヒドロゲナーゼ、ｌｅｕＣ及びｌｅｕＤがα
−イソプロピルマレートイソメラーゼをコードしてい
る。これらの酵素のうち、ＩＰＭＳはα−ケトイソ吉草
酸からα−イソプロピルリンゴ酸への合成反応を、α−
イソプロピルマレートイソメラーゼはα−イソプロピル
リンゴ酸からβ−イソプロピルリンゴ酸への異性化反応
を、β−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼはβ−
イソプロピルリンゴ酸からＬ−ロイシン生合成の最終中
間体であるα−ケトイソカプロン酸への脱水素反応を、
各々触媒する。

【００４８】上記のＬ−ロイシン生合成経路の反応のう
ち律速段階であるのは、α−ケトイソ吉草酸からα−イ
ソプロピルリンゴ酸への合成反応であり、この反応を触
媒するＩＰＭＳは、Ｌ−ロイシンによるフィードバック
阻害を受ける。従って、このフィードバック阻害が解除
されたＩＰＭＳをコードするＤＮＡによる形質転換によ
り、微生物にＬ−ロイシン生産能を付与したり、微生物
のＬ−ロイシン生産能を向上できる。

【００４９】本発明のエシェリヒア属細菌は、さらに、
通常の突然変異処理又は遺伝子工学的手法により、Ｌ−
ロイシン生合成に関与する酵素の活性を増強してもよ
い。そのような酵素の活性の増強は、例えば、ｉｌｖＧ
ＭＥＤＡオペロン又は／及びｌｅｕＡＢＣＤオペロン、
又はこれらの一部を有するＤＮＡ断片をプラスミド、フ
ァージ又はトランスポゾンに挿入し、得られる組換えＤ
ＮＡをエシェリヒア属細菌に導入することによって行う
ことができる。

【００５０】ｌｅｕＡＢＣＤオペロンの塩基配列解析に
ついては、Nucleic Acid Res., 20,3305-3308 (1992)に
記載されており、全塩基配列はデータベース（DDBJ acc
ession no. D10483、DDBJのインターネットアドレス：h
ttp://www.ddbj.nig.ac.jp）に登録されている。ｌｅｕ
ＡＢＣＤオペロンは、これらに記載されている配列を基
に作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、エシ
ェリヒア属細菌染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ（ポリ
メラーゼ・チェイン・リアクション、White,T.J. et a
l.; Trends Genet., 5, 185 (1989)参照）によって、ｌ
ｅｕＡＢＣＤオペロンを含むＤＮＡ断片を増幅すること
によって取得できる。また、ｌｅｕＡＢＣＤオペロン
は、前記文献に記載されている配列を基に作製したオリ
ゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーショ
ンによりエシェリヒア属細菌染色体ＤＮＡライブラリー
をスクリーニングすることによっても、取得することが
できる。

【００５１】また、ｉｌｖＧＭＥＤＡオペロンの全塩基
配列及び該オペロンの上流域の塩基配列は、それぞれ N
ucleic Acid Res., 15, 2137-2155 (1987)及び Gene, 9
7, 21-27 (1991)に記載されている。ｉｌｖＧＭＥＤＡ
オペロンは、これらに記載されている配列を基に作製し
たプローブ又はプライマーを用いたＰＣＲ又はハイブリ
ダイゼーションによって取得することができる。尚、ｉ
ｌｖＧＭＥＤＡオペロンの取得にエシェリヒア・コリK-
12株又はその誘導体を用いる場合には、アセトヒドロキ
シ酸シンターゼ活性が回復するように、ｉｌｖＧ遺伝子
の復帰変異株を用いることが好ましい。ｉｌｖＧＭＥＤ
Ａオペロンの取得法及びトランスポゾンを用いて該オペ
ロンをエシェリヒア属細菌細胞内で増幅する方法は、そ
れぞれWO96/06926国際公開パンフレット、フランス特許
公開第2627508号に詳細に記載されている。

【００５２】＜３＞Ｌ−ロイシンの製造法上記のようにして得られるエシェリヒア属細菌を培地で
培養し、該培地中にＬ−ロイシンを生成蓄積せしめ、該
培地からＬ−ロイシンを採取することにより、Ｌ−ロイ
シンを効率よく製造することができる。

【００５３】本発明の製造法におけるエシェリヒア属細
菌の培養および培養液からのＬ−ロイシンの採取、精製
等は、従来の微生物を用いた発酵法によるアミノ酸の製
造法と同様にして行えばよい。培養に使用する培地とし
ては、炭素源、窒素源、無機物を含有し、必要があれば
使用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するする
ものであれば、合成培地でも天然培地でもよい。炭素源
としては、グルコースやシュークロースをはじめとする
各種炭水化物、各種有機酸があげられる。また使用する
微生物の資化性によってはエタノールやグリセロール等
のアルコールを用いることが出来る。窒素源としては、
アンモニアや、硫酸アンモニウム等の各種のアンモニウ
ム塩類や、アミン類その他の窒素化合物や、ペプトン、
大豆加水分解物、発酵菌体分解物等の天然窒素源を用い
ることが出来る。無機物としては、燐酸一カリウム、硫
酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マ
ンガン、炭酸カルシウム等が用いられる。

【００５４】培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気
的条件下で行うことが好ましく、培養温度は２０〜４０
℃で、好ましくは３０〜３８℃の範囲で行う。培地のｐ
Ｈは通常５〜９の範囲であり、６．５〜７．２の範囲が
好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウ
ム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整するこ
とができる。通常、１〜３日の培養によって、培養液中
にＬ−ロイシンが蓄積する。

【００５５】培養終了後、培養液から菌体などの固形物
を遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮
法、晶析法等によってＬ−ロイシンを採取、精製するこ
とが出来る。

【００５６】以上に説明したように、本発明の、Ｌ−ロ
イシンによる阻害が解除されたＩＰＭＳをコードするＤ
ＮＡは、Ｌ−ロイシン生産微生物育種に利用することが
できる。このＤＮＡで形質転換された微生物を用いるこ
とによって、効率よくＬ−ロイシンを製造することがで
きる。

【００５７】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。

【００５８】

【実施例１】変異型ＩＰＭＳをコードするＤＮＡの取
得＜１＞Ｌ−ロイシン生産株の取得エシェリヒア・コリ(E. coli)のＬ−ロイシン生産株
を、標準的な研究用野生株E. coli K-12から以下のよう
な選択により得た。E. coli K-12の細胞を、2 mg/mlの
Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを
含む変異原溶液により、37℃で30分間処理した。次い
で、細胞を0.8% NaCl溶液で２回洗浄し、1 mg/mlのＬ−
ロイシンアナログ(４−アザロイシン)を含むＭ９寒天培
地ディッシュに塗沫した。37℃でのインキュベーション
で５日後に生じたコロニーを選び取り、そしてそれらの
ロイシン生産能を評価した。Ｎｏ．９、Ｎｏ．６８、Ｎ
ｏ．５８、Ｎｏ．５５及びＮｏ．１５の株がＬ−ロイシ
ンを生産した。

【００５９】＜２＞Ｌ−ロイシン生産株からのｌｅｕＡ
遺伝子の取得得られたロイシン生産性変異株Ｎｏ．５５及び野生株E.
coli K-12のleuA遺伝子を、欠陥バクテリオファージMu
d5005を用いるin vivoクローニング法（Groisman, E.
A. et al., J. Bactriol., 168, 357(1986)）によりク
ローニングした。次いで、クローニングしたleuA遺伝子
の、オーバーラップする複数の断片を、表１に示すＤＮ
Ａプライマー（LeuA1及びLeuA2、LeuA3及びLeuA4、LeuA
5及びLeuA6、LeuA7及びLeuA8、LeuA9及びLeuA10）を用
いるＰＣＲによって増幅した。

【００６０】

【表１】表１ＰＣＲに用いたプライマー ───────────────────────── プライマー名配列(5'->3') 配列番号 ───────────────────────── LeuA1 ccaataccgtcccccggc 3 LeuA2 ggtgaaatacagcctgacc 4 LeuA3 gtgatgcggttaattgcctg 5 LeuA4 tgacctctcgttcggggcgt 6 LeuA5 gattcagctggatttggttc 7 LeuA6 cgacgatttgggcctggcg 8 LeuA7 ggcatgtaccgccgccagtga 9 LeuA8 gaagccttccgtattcatacc 10 LeuA9 cagcttggtggcgatgtgc 11 LeuA10 gcccgaagcgaggcgctct 12 ─────────────────────────

【００６１】同じＤＮＡプライマーを、予備的クローニ
ングなしで、Ｎｏ．９、Ｎｏ．６８、Ｎｏ．５８および
Ｎｏ．１５の各株の染色体からのleuA遺伝子の増幅に用
いた。断片の塩基配列はジデオキシチェーンターミネー
ション法で決定した。

【００６２】Ｎｏ．９、Ｎｏ．６８、Ｎｏ．５８、Ｎ
ｏ.５５およびＮｏ．１５の各株由来のleuA遺伝子は、
表２に示す変異を有していた。

【００６３】各株の細胞を、6%グルコース、1.5%硫酸ア
ンモニウム、0.2%リン酸二水素カリウム、0.1%硫酸マグ
ネシウム、2.5%チョークおよび0.1 mg/mlチアミンを含
む培地中32℃で10時間増殖させた。超音波処理および硫
安沈殿により無細胞抽出液を得、これを酵素調製物とし
て用いた。ＩＰＭＳ比活性は、Kohlhawらの方法（J.Bio
l. Chem., 244, 2218(1969)）により測定した。Ｉ
₅₀は、酵素活性の５０％阻害を生じるロイシン濃度であ
る。Ｌ−ロイシン生産は、上記の培地中で４８時間培養
した後に測定した。

【００６４】以上の結果をまとめて表２に示す。

【００６５】

【表２】表２ロイシン生産株の性質 ──────────────────────────────────── 菌株アミノ酸置換ＩＰＭＳロイシン生産 (塩基置換) 比活性Ｉ₅₀ (nmol/min/mg (mM) (g/l) protein) ──────────────────────────────────── Ｋ−１２（野生株）なし 9 0.2 0.0 (なし) ９ Thr₄₈₂→Ile 25 1.4 0.8 (C₁₄₄₅→T) ６８ Glu₃₈₆→Lys 21 1.4 2.3 (G₁₁₅₆→A) ５８ Pro₄₂₈→Leu 29 2.5 1.0 (C₁₂₈₃→T) ５５ Gly₄₇₉→Cys 10 8.2 5.2 (G₁₄₃₅→T) １５ Gly₄₆₂→Asp 9 >10.0 1.0 (G₁₃₈₅→A) ────────────────────────────────────

【００６６】

【実施例２】形質転換体によるＬ−ロイシンの製造 C600株（leu^-）(Appleyard R.K., Genetics, 39, 440-4
52 (1954))に対して、ロイシン生産株Ｎｏ．９、Ｎｏ．
６８、Ｎｏ．５８、Ｎｏ．５５およびＮｏ．１５並びに
E. coli K-12で増殖させたＰ１ファージにより形質導入
を行った。leu⁺形質導入体が得られ、Ｌ−ロイシン生産
能について試験した。結果を表３に示す。

【００６７】

【表３】表３形質導入体によるＬ−ロイシン生産 ──────────────────────────────────── 供与菌株ロイシン生産^* (g/l) ──────────────────────────────────── E. coli K-12 ０９０．５５６８０．６５８０．３１５１．０５５１．３ ──────────────────────────────────── * Ｌ−ロイシン生産は、32℃で48時間培養した後に測定した。生産のデータは、それぞれ、１０形質導入体の平均値である。

【００６８】

【発明の効果】Ｌ−ロイシン生産能に優れた微生物が提
供され、また、安価かつ効率的なＬ−ロイシンの製造法
が提供される。

【００６９】

【配列表】 <110> 味の素株式会社(Ajinomoto Co., Inc.) <120> 変異型イソプロピルマレートシンターゼをコードするＤＮＡ、Ｌ−ロイシン生産性微生物、および、Ｌ−ロイシンの製造法 <130> P-6082F <150> RU 99114325 <151> 1999-07-09 <160> 12 <210> 1 <211> 1572 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(1569) <400> 1 atg agc cag caa gtc att att ttc gat acc aca ttg cgc gac ggt gaa 48 Met Ser Gln Gln Val Ile Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu 1 5 10 15 cag gcg tta cag gca agc ttg agt gtg aaa gaa aaa ctg caa att gcg 96 Gln Ala Leu Gln Ala Ser Leu Ser Val Lys Glu Lys Leu Gln Ile Ala 20 25 30 ctg gcc ctt gag cgt atg ggt gtt gac gtg atg gaa gtc ggt ttc ccc 144 Leu Ala Leu Glu Arg Met Gly Val Asp Val Met Glu Val Gly Phe Pro 35 40 45 gtc tct tcg ccg ggc gat ttt gaa tcg gtg caa acc atc gcc cgc cag 192 Val Ser Ser Pro Gly Asp Phe Glu Ser Val Gln Thr Ile Ala Arg Gln 50 55 60 gtt aaa aac agc cgc gta tgt gcg tta gct cgc tgc gtg gaa aaa gat 240 Val Lys Asn Ser Arg Val Cys Ala Leu Ala Arg Cys Val Glu Lys Asp 65 70 75 80 atc gac gtg gcg gcc gaa tcc ctg aaa gtc gcc gaa gcc ttc cgt att 288 Ile Asp Val Ala Ala Glu Ser Leu Lys Val Ala Glu Ala Phe Arg Ile 85 90 95 cat acc ttt att gcc act tcg cca atg cac atc gcc acc aag ctg cgc 336 His Thr Phe Ile Ala Thr Ser Pro Met His Ile Ala Thr Lys Leu Arg 100 105 110 agc acg ctg gac gag gtg atc gaa cgc gct atc tat atg gtg aaa cgc 384 Ser Thr Leu Asp Glu Val Ile Glu Arg Ala Ile Tyr Met Val Lys Arg 115 120 125 gcc cgt aat tac acc gat gat gtt gaa ttt tct tgc gaa gat gcc ggg 432 Ala Arg Asn Tyr Thr Asp Asp Val Glu Phe Ser Cys Glu Asp Ala Gly 130 135 140 cgt aca ccc att gcc gat ctg gcg cga gtg gtc gaa gcg gcg att aat 480 Arg Thr Pro Ile Ala Asp Leu Ala Arg Val Val Glu Ala Ala Ile Asn 145 150 155 160 gcc ggt gcc acc acc atc aac att ccg gac acc gtg ggc tac acc atg 528 Ala Gly Ala Thr Thr Ile Asn Ile Pro Asp Thr Val Gly Tyr Thr Met 165 170 175 ccg ttt gag ttc gcc gga atc atc agc ggc ctg tat gaa cgc gtg cct 576 Pro Phe Glu Phe Ala Gly Ile Ile Ser Gly Leu Tyr Glu Arg Val Pro 180 185 190 aac atc gac aaa gcc att atc tcc gta cat acc cac gac gat ttg ggc 624 Asn Ile Asp Lys Ala Ile Ile Ser Val His Thr His Asp Asp Leu Gly 195 200 205 ctg gcg gtc gga aac tca ctg gcg gcg gta cat gcc ggt gca cgc cag 672 Leu Ala Val Gly Asn Ser Leu Ala Ala Val His Ala Gly Ala Arg Gln 210 215 220 gtg gaa ggc gca atg aac ggg atc ggc gag cgt gcc gga aac tgt tcc 720 Val Glu Gly Ala Met Asn Gly Ile Gly Glu Arg Ala Gly Asn Cys Ser 225 230 235 240 ctg gaa gaa gtc atc atg gcg atc aaa gtt cgt aag gat att ctc aac 768 Leu Glu Glu Val Ile Met Ala Ile Lys Val Arg Lys Asp Ile Leu Asn 245 250 255 gtc cac acc gcc att aat cac cag gag ata tgg cgc acc agc cag tta 816 Val His Thr Ala Ile Asn His Gln Glu Ile Trp Arg Thr Ser Gln Leu 260 265 270 gtt agc cag att tgt aat atg ccg atc ccg gca aac aaa gcc att gtt 864 Val Ser Gln Ile Cys Asn Met Pro Ile Pro Ala Asn Lys Ala Ile Val 275 280 285 ggc agc ggc gca ttc gca cac tcc tcc ggt ata cac cag gat ggc gtg 912 Gly Ser Gly Ala Phe Ala His Ser Ser Gly Ile His Gln Asp Gly Val 290 295 300 ctg aaa aac cgc gaa aac tac gaa atc atg aca cca gaa tct att ggt 960 Leu Lys Asn Arg Glu Asn Tyr Glu Ile Met Thr Pro Glu Ser Ile Gly 305 310 315 320 ctg aac caa atc cag ctg aat ctg acc tct cgt tcg ggg cgt gcg gcg 1008 Leu Asn Gln Ile Gln Leu Asn Leu Thr Ser Arg Ser Gly Arg Ala Ala 325 330 335 gtg aaa cat cgc atg gat gag atg ggg tat aaa gaa agt gaa tat aat 1056 Val Lys His Arg Met Asp Glu Met Gly Tyr Lys Glu Ser Glu Tyr Asn 340 345 350 tta gac aat ttg tac gat gct ttc ctg aag ctg gcg gac aaa aaa ggt 1104 Leu Asp Asn Leu Tyr Asp Ala Phe Leu Lys Leu Ala Asp Lys Lys Gly 355 360 365 cag gtg ttt gat tac gat ctg gag gcg ctg gcc ttc atc ggt aag cag 1152 Gln Val Phe Asp Tyr Asp Leu Glu Ala Leu Ala Phe Ile Gly Lys Gln 370 375 380 caa gaa gag ccg gag cat ttc cgt ctg gat tac ttc agc gtg cag tct 1200 Gln Glu Glu Pro Glu His Phe Arg Leu Asp Tyr Phe Ser Val Gln Ser 385 390 395 400 ggc tct aac gat atc gcc acc gcc gcc gtc aaa ctg gcc tgt ggc gaa 1248 Gly Ser Asn Asp Ile Ala Thr Ala Ala Val Lys Leu Ala Cys Gly Glu 405 410 415 gaa gtc aaa gca gaa gcc gcc aac ggt aac ggt ccg gtc gat gcc gtc 1296 Glu Val Lys Ala Glu Ala Ala Asn Gly Asn Gly Pro Val Asp Ala Val 420 425 430 tat cag gca att aac cgc atc act gaa tat aac gtc gaa ctg gtg aaa 1344 Tyr Gln Ala Ile Asn Arg Ile Thr Glu Tyr Asn Val Glu Leu Val Lys 435 440 445 tac agc ctg acc gcc aaa ggc cac ggt aaa gat gcg ctg ggt cag gtg 1392 Tyr Ser Leu Thr Ala Lys Gly His Gly Lys Asp Ala Leu Gly Gln Val 450 455 460 gat atc gtc gct aac tac aac ggt cgc cgc ttc cac ggc gtc ggc ctg 1440 Asp Ile Val Ala Asn Tyr Asn Gly Arg Arg Phe His Gly Val Gly Leu 465 470 475 480 gct acc gat att gtc gag tca tct gcc aaa gcc atg gtg cac gtt ctg 1488 Ala Thr Asp Ile Val Glu Ser Ser Ala Lys Ala Met Val His Val Leu 485 490 495 aac aat atc tgg cgt gcc gca gaa gtc gaa aaa gag ttg caa cgc aaa 1536 Asn Asn Ile Trp Arg Ala Ala Glu Val Glu Lys Glu Leu Gln Arg Lys 500 505 510 gct caa cac aac gaa aac aac aag gaa acc gtg tga 1572 Ala Gln His Asn Glu Asn Asn Lys Glu Thr Val 515 520 <210> 2 <211> 523 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Ser Gln Gln Val Ile Ile Phe Asp Thr Thr Leu Arg Asp Gly Glu 1 5 10 15 Gln Ala Leu Gln Ala Ser Leu Ser Val Lys Glu Lys Leu Gln Ile Ala 20 25 30 Leu Ala Leu Glu Arg Met Gly Val Asp Val Met Glu Val Gly Phe Pro 35 40 45 Val Ser Ser Pro Gly Asp Phe Glu Ser Val Gln Thr Ile Ala Arg Gln 50 55 60 Val Lys Asn Ser Arg Val Cys Ala Leu Ala Arg Cys Val Glu Lys Asp 65 70 75 80 Ile Asp Val Ala Ala Glu Ser Leu Lys Val Ala Glu Ala Phe Arg Ile 85 90 95 His Thr Phe Ile Ala Thr Ser Pro Met His Ile Ala Thr Lys Leu Arg 100 105 110 Ser Thr Leu Asp Glu Val Ile Glu Arg Ala Ile Tyr Met Val Lys Arg 115 120 125 Ala Arg Asn Tyr Thr Asp Asp Val Glu Phe Ser Cys Glu Asp Ala Gly 130 135 140 Arg Thr Pro Ile Ala Asp Leu Ala Arg Val Val Glu Ala Ala Ile Asn 145 150 155 160 Ala Gly Ala Thr Thr Ile Asn Ile Pro Asp Thr Val Gly Tyr Thr Met 165 170 175 Pro Phe Glu Phe Ala Gly Ile Ile Ser Gly Leu Tyr Glu Arg Val Pro 180 185 190 Asn Ile Asp Lys Ala Ile Ile Ser Val His Thr His Asp Asp Leu Gly 195 200 205 Leu Ala Val Gly Asn Ser Leu Ala Ala Val His Ala Gly Ala Arg Gln 210 215 220 Val Glu Gly Ala Met Asn Gly Ile Gly Glu Arg Ala Gly Asn Cys Ser 225 230 235 240 Leu Glu Glu Val Ile Met Ala Ile Lys Val Arg Lys Asp Ile Leu Asn 245 250 255 Val His Thr Ala Ile Asn His Gln Glu Ile Trp Arg Thr Ser Gln Leu 260 265 270 Val Ser Gln Ile Cys Asn Met Pro Ile Pro Ala Asn Lys Ala Ile Val 275 280 285 Gly Ser Gly Ala Phe Ala His Ser Ser Gly Ile His Gln Asp Gly Val 290 295 300 Leu Lys Asn Arg Glu Asn Tyr Glu Ile Met Thr Pro Glu Ser Ile Gly 305 310 315 320 Leu Asn Gln Ile Gln Leu Asn Leu Thr Ser Arg Ser Gly Arg Ala Ala 325 330 335 Val Lys His Arg Met Asp Glu Met Gly Tyr Lys Glu Ser Glu Tyr Asn 340 345 350 Leu Asp Asn Leu Tyr Asp Ala Phe Leu Lys Leu Ala Asp Lys Lys Gly 355 360 365 Gln Val Phe Asp Tyr Asp Leu Glu Ala Leu Ala Phe Ile Gly Lys Gln 370 375 380 Gln Glu Glu Pro Glu His Phe Arg Leu Asp Tyr Phe Ser Val Gln Ser 385 390 395 400 Gly Ser Asn Asp Ile Ala Thr Ala Ala Val Lys Leu Ala Cys Gly Glu 405 410 415 Glu Val Lys Ala Glu Ala Ala Asn Gly Asn Gly Pro Val Asp Ala Val 420 425 430 Tyr Gln Ala Ile Asn Arg Ile Thr Glu Tyr Asn Val Glu Leu Val Lys 435 440 445 Tyr Ser Leu Thr Ala Lys Gly His Gly Lys Asp Ala Leu Gly Gln Val 450 455 460 Asp Ile Val Ala Asn Tyr Asn Gly Arg Arg Phe His Gly Val Gly Leu 465 470 475 480 Ala Thr Asp Ile Val Glu Ser Ser Ala Lys Ala Met Val His Val Leu 485 490 495 Asn Asn Ile Trp Arg Ala Ala Glu Val Glu Lys Glu Leu Gln Arg Lys 500 505 510 Ala Gln His Asn Glu Asn Asn Lys Glu Thr Val 515 520 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 3 ccaataccgt cccccggc 18 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 4 ggtgaaatac agcctgacc 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 5 gtgatgcggt taattgcctg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 6 tgacctctcg ttcggggcgt 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 7 gattcagctg gatttggttc 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 8 cgacgatttg ggcctggcg 19 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 9 ggcatgtacc gccgccagtg a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 10 gaagccttcc gtattcatac c 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 11 cagcttggtg gcgatgtgc 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 12 gcccgaagcg aggcgctct 19

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者コズロフユーリーイヴァノヴィッチロシア連邦、モスクワ、117574、ゴルビンスカヤ７／２アパートメント178 (72)発明者イヴァノフスカヤリリナヴァレリエヴナロシア連邦、モスクワ、113525、ドニエプロペトロフスカヤ29 アパートメント124 (72)発明者ヴォロシロヴァエリヴィラボリソヴナロシア連邦、モスクワ、113535、ロソシャンスカヤ11／３アパートメント59

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を
コードするＤＮＡ。（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、下記
（ａ）〜（ｅ）から選ばれる置換を有するアミノ酸配列
を有するタンパク質。（ａ）４８２位のスレオニン残基の他のアミノ酸残基へ
の置換。（ｂ）３８６位のグルタミン酸残基の他のアミノ酸残基
への置換。（ｃ）４２８位のプロリン残基の他のアミノ酸残基への
置換。（ｄ）４７９位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への
置換。（ｅ）４６２位のグリシン残基の他のアミノ酸残基への
置換。（Ｂ）（Ａ）のタンパク質のアミノ酸配列において、１
若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付
加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、α
−イソプロピルマレートシンターゼ活性を有し且つその
活性のＬ−ロイシンによる阻害が（Ａ）のタンパク質と
同等に解除されているタンパク質。
【請求項２】前記置換が下記（ａ’）〜（ｅ’）から
選ばれる置換である請求項１記載のＤＮＡ。（ａ’）４８２位のスレオニン残基のイソロイシン残基
への置換。（ｂ’）３８６位のグルタミン酸残基のリジン残基への
置換。（ｃ’）４２８位のプロリン残基のロイシン残基への置
換。（ｄ’）４７９位のグリシン残基のシステイン残基への
置換。（ｅ’）４６２位のグリシン残基のアスパラギン酸残基
への置換。
【請求項３】配列番号１に示す塩基配列において下記
（ｉ）〜（ｖ）から選ばれる変異を有する塩基配列を有
する請求項２記載のＤＮＡ。（ｉ）1445位のシトシンのチミンへの変異。（ii）1156位のグアニンのアデニンへの変異。（iii）1283位のシトシンのチミンへの変異。（iv）1435位のグアニンのチミンへの変異。（ｖ）1385位のグアニンのアデニン残基への変異。
【請求項４】請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤ
ＮＡにより形質転換され、かつＬ−ロイシン生産能を有
する微生物。
【請求項５】エシェリヒア属細菌である請求項４記載
の微生物。
【請求項６】エシェリヒア・コリである請求項５記載
の微生物。
【請求項７】請求項４〜６のいずれか一項に記載の微
生物を培地で培養し、該培地中にＬ−ロイシンを生成蓄
積せしめ、該培地からＬ−ロイシンを採取することを特
徴とするＬ−ロイシンの製造法。