JP4110641B2 - 発酵法によるｌ−メチオニンの製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発酵法によるＬ−メチオニンの製造法に関する。Ｌ−メチオニンは、医薬等として重要なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
メチオニンは、工業的には化学合成により製造されるＤＬ体が中心となっている。Ｌ体が必要な場合は、このＤＬ体をアセチル化してＮ−アセチル−ＤＬ−メチオニンとし、酵素的にＬ体だけを脱アセチル化することによって製造される。
【０００３】
一方、発酵法によるＬ−メチオニンの製造については、メチオニンアナログ耐性変異株を用いる方法が報告されているが、生産量は少なく、またＬ−メチオニン生産に影響を与える因子は明らかではないため、最も発酵生産が困難なアミノ酸の一つである。例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli（E. coli））K-12株を用いる方法が、公開特許公報昭５６−３５９９２あるいは文献（Chattapadhyay, M. K. et al., Med. Sci. Res. 23, 775 (1995)、Chattapadhyay, M. K. et al., Biotechnol. Lett. 17, 567-570 (1995)）に報告されているが、いずれもＬ−メチオニンの生産量は工業的に用いるには不十分であった。
【０００４】
E. coliにおいては、Ｌ−メチオニンの生合成経路は、Ｌ−スレオニンの生合成経路と一部共通であり、Ｌ−ホモセリンが共通の中間体となっている。Ｌ−ホモセリンからＬ−メチオニンへの固有経路の第一段階は、ホモセリントランスサクシニラーゼ（ＨＴＳ）によって触媒されるが、同酵素は最終生産物であるＬ−メチオニンとＬ−メチオニンの代謝物であるＳ−アデノシルメチオニンにより協奏的な阻害を受けることが知られている（Lee, L.-W. et al., J. Biol. Chem. 241, 5479-5480 (1966)）。
【０００５】
E. coliのホモセリントランスサクシニラーゼをコードする遺伝子であるmetA配列は、ダクロスらにより報告されており（Duclos, B. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2856 (1989)）、metAの変異株の取得についても、Ｌ−メチオニンのアナログであるα−メチル−ＤＬ−メチオニン（ＭＭ）に対する耐性を利用した方法が知られている（Chattopadhyay, M. K. et al., J. Gen. Microbiol. 137, 685-691 (1991)）。しかし、ＭＭ耐性株のmetA遺伝子産物であるホモセリントランスサクシニラーゼが、Ｌ−メチオニンとＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）による阻害解除型となるという報告は、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）においてなされているが（Lawrence, D. A. et al., J. Bacteriol. 109, 8-11 (1972)）、変異型metA遺伝子の塩基配列の報告はない。さらに、metAの単独変異株は、Ｌ−メチオニンを排出しないと報告されている（Chattopadhyay, M. K. et al., J. Gen. Microbiol. 137, 685-691 (1991)）。
【０００６】
metAを含めて、ホモセリントランスサクシニラーゼによる反応以降のＬ−メチオニンの固有生合成経路の酵素遺伝子の発現は、metJ遺伝子産物であるリプレッサーによる抑制を受けることも明らかとなっている（Greene, R. C., Biosynthesis of Methionine. in "Escherichai coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition", ed. Neidhardt, F. D., ASM Press, pp. 542-560 (1996).）。metJ遺伝子は、Ｌ−メチオニンへの固有生合成経路の第二の酵素シスタチオニンγ−シンテースをコードするmetB遺伝子と、アスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII（ＡＫ−ＨＤII）をコードするmetLとからなるmetBLオペロンと、逆向きに隣接していることが知られている（Duchange, N. et al., J. Biol. Chem. 258, 14868-14871 (1983)）。
【０００７】
Ｌ−メチオニンからＳ−アデノシルメチオニンへの代謝反応を触媒するＳ−アデノシルメチオニン合成酵素をコードするmetKは、必須遺伝子であることが示唆されている（Greene, R. C., Biosynthesis of Methionine. in "Escherichai coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition", ed. Neidhardt, F. D., ASM Press, pp. 542-560 (1996)）。また、metKの変異株は、ＤＬ−ノルロイシンやエチオニンなどのメチオニンアナログ耐性により得られることが知られているとともに（Chattopadhyay, M. K. et al., J. Gen. Microbiol. 137, 685-691 (1991)）、Ｌ−メチオニンへの固有生合成経路の酵素の発現を上昇させることがと報告されている（Greene, R. C. et al., J. Bacteriol. 115, 57-67 (1973)。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、Ｌ−メチオニン生合成に関与する酵素やその遺伝子について、ある程度の報告はあるが、Ｌ−メチオニンの発酵生産に直接結びつく知見はほとんど得られておらず、Ｌ−メチオニン生産菌育種への応用もほとんどなされていない。
【０００９】
本発明は、上記現状に鑑みなされたものであり、Ｌ−メチオニン生産に影響を与える因子を明らかにしてＬ−メチオニン生産菌を育種し、発酵法によるＬ−メチオニンの生産を可能とすることを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【００１１】
（１）Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサーを欠損し、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有する微生物。
（２）細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性が増強され、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有する微生物。
（３）Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサーを欠損し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性が増強され、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有する微生物。
【００１２】
（４）さらに細胞内のＳ−アデノシルメチオニンシンテテース活性が弱化した前記（１）〜（３）のいずれかの微生物。
（５）ホモセリントランスサクシニラーゼ活性の増強が、前記微生物細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は同遺伝子の発現調節配列を増強することによるものである（２）〜（４）の微生物。
（６）Ｌ−メチオニンとＳ−アデノシルメチオニンによる協奏阻害が解除されたホモセリントランスサクシニラーゼを保持する（１）又は（４）に記載の微生物。
（７）Ｌ−スレオニン要求性を示すことを特徴とする（１）〜（６）のいずれかの微生物。
（８）細胞内のシスタチオニンγ−シンテース活性及びアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII活性が増強された（１）〜（７）のいずれかの微生物。
（９）エシェリヒア属に属することを特徴とする（１）〜（８）のいずれかの微生物。
【００１３】
（１０）前記（１）〜（１０）のいずれかの微生物を培地に培養し、培地中にＬ−メチオニンを生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−メチオニンの製造法。
【００１４】
（１１）配列番号２６に示すアミノ酸配列において、27位のアルギニンがシステインに置換する変異、296位のイソロイシンがセリンに置換する変異、298位のプロリンがロイシンに置換する変異、27位のアルギニンがシステインに置換しかつ296位のイソロイシンがセリンに置換する変異、296位のイソロイシンがセリンに置換しかつ298位のプロリンがロイシンに置換する変異、298位のプロリンがロイシンに置換しかつ27位のアルギニンがシステインに置換する変異、又は、27位のアルギニンがシステインに置換し、296位のイソロイシンがセリンに置換しかつ298位のプロリンがロイシンに置換する変異のいずれかに相当する変異を有するアミノ酸配列を有し、Ｌ−メチオニンとＳ−アデノシルメチオニンによる協奏阻害が解除されたホモセリントランスサクシニラーゼをコードするＤＮＡ。
【００１５】
本明細書において、Ｓ−アデノシルメチオニンを「ＳＡＭ」、α-メチル-DL-メチオニンを「ＭＭ」、DL-ノルロイシンを「ＮＬ」と呼ぶことがある。また、Ｓ−アデノシルメチオニンシンテテースを「ＳＡＭ合成酵素」、ホモセリントランスサクシニラーゼを「ＨＴＳ」ということがある。また、E. coliのmetB遺伝子産物シスタチオニンγ-シンテースを「シスタチオニン合成酵素」、metL遺伝子産物「アスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII」をＡＫ−ＨＤIIと呼ぶことがある。
【００１６】
本発明において「Ｌ−メチオニン生産能」とは、本発明の微生物を培地に培養したときに、培地中にＬ−メチオニンを蓄積する能力をいう。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の微生物は、Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサーを欠損し、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有する微生物、又は、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性が増強され、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有する微生物である。本発明の微生物は、Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサーを欠損し、かつ、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性が増強されていることが好ましい。
さらに、本発明の微生物は、細胞中のＳＡＭ合成酵素活性が弱化していることが好ましい。
【００１８】
上記のような微生物としては、Ｌ−ホモセリンからアシル転移反応により生じるＯ−アシルホモセリンを経てＬ−メチオニン及びＳＡＭを産生する経路を有し、該アシル転移酵素の発現がリプレッサーによる抑制によって制御されるものであれば、特に制限されない。そのような微生物としては、エシェリヒア属細菌、コリネ型細菌、バチルス属細菌等の細菌が挙げられるが、エシェリヒア属細菌、例えばE. coliが好ましい。
【００１９】
また、本発明の微生物は、E. coliのように、それが保持するＨＴＳがＬ−メチオニン及びＳＡＭによる協奏阻害を受けるものであれば、その阻害を解除することによって、Ｌ−メチオニン生産能を向上させることができる。
【００２０】
メチオニン生合成の固有経路は、E. coli等多くの微生物のようにシスタチニオンを経由するものと、ブレビバクテリウム・フラバムのようにシスタチオニンを経由しないものがある（Ozaki, H. et al., J. Biochem., 91, 1163, (1982)）が、本発明においては、シスタチニオンを経由する経路を有するものが好ましい。そのような微生物においては、細胞内のシスタチオニン合成酵素活性を増強することにより、Ｌ−メチオニン合成能を強化することができる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムのような微生物であっても、Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサーの欠損又は／及びＨＴＳの増強によって、Ｌ−メチオニン生産能を高めることができる。
【００２１】
さらに、上記微生物において、Ｌ−メチオニン生合成及びＬ−スレオニン生合成の共通経路に関与するアスパルトキナーゼ活性又はホモセリンデヒドロゲナーゼ活性の少なくとも一方を増強することによって、一層Ｌ−メチオニン生産能を高めることができる。
【００２２】
上記の各特性の２以上を微生物に付与する場合、その順序は特に制限されず、任意の順序で付与することができる。また、複数の遺伝子を微生物に導入する場合、それらの遺伝子は同じベクターに搭載してもよく、複数の異なるベクターに別個に搭載してもよい。尚、複数のベクターを用いる場合は、異なる薬剤マーカー、及び異なる複製起点を有するベクターを用いることが好ましい。
以下に、上記の各特性を微生物に付与する方法を説明する。
【００２３】
＜１＞Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサーの欠損
微生物のＬ−メチオニン生合成系のリプレッサーを欠損させるには、微生物に変異処理を施し、同リプレッサーを産生しなくなった株を選択することにより、行うことができる。変異処理は、微生物の変異株の取得に通常用いられている方法、例えば紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の突然変異に用いられている変異剤により行うことができる。
【００２４】
また、微生物の染色体ＤＮＡ上の前記リプレッサーをコードする遺伝子を破壊することによっても、同リプレッサーを欠損させることができる。遺伝子の破壊は、コード領域又は発現調節配列の少なくとも一部を欠失した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子との相同組換えを起こさせ、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子で置換することによって行うことができる（遺伝子置換）。
【００２５】
リプレッサー遺伝子は、例えば、E. coliのＬ−メチオニン生合成系のリプレッサーをコードする遺伝子（metJ）の塩基配列は知られているので（Duchange, N. et al., J. Biol. Chem. 258, 14868-14871 (1983)）、該塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲにより、染色体ＤＮＡから単離することができる。こうして得られる遺伝子断片から一定の領域を制限酵素により切り出し、コード領域又は発現調調節領域の少なくとも一部を欠失させることによって、欠失型遺伝子を作製することができる。
【００２６】
遺伝子置換は、例えば次のようにして行うことができる。温度感受性複製起点を有するベクターに欠失型遺伝子を搭載させて組換えベクターを調製し、同組換えベクターで微生物を形質転換し、欠失型遺伝子と染色体ＤＮＡ上の遺伝子との相同組換えにより染色体ＤＮＡ上の遺伝子に欠失型遺伝子を挿入させる。その後に、形質転換株を前記ベクターが複製できない温度で培養し、細胞質中のベクターを脱落させる。さらに、染色体上の１コピーの遺伝子をベクターとともに脱落させることにより、遺伝子が置換される。目的の遺伝子置換が生じていることは、遺伝子置換株の染色体ＤＮＡをサザン・ハイブリダイゼーションにより解析することにより、確認することができる。
【００２７】
E. coli用の温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えば特願平９−１９４６０３号に記載のプラスミドpMAN997等が、また、コリネ型細菌用の温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えば特開平５−７４９１号公報に記載のプラスミドpHSC4等が挙げられるが、これらに限定されず、他のベクターを用いることもできる。
【００２８】
前述したようにE. coliでは、metJ遺伝子は、metB遺伝子とmetL遺伝子とからなるmetBLオペロンと、逆向きに隣接していることが知られている（Duchange, N. et al., J. Biol. Chem. 258, 14868-14871 (1983)）。したがって、欠失型metJ遺伝子に、適当なプロモーター配列を連結し、上記と同様に遺伝子置換を行うことによって、metJ遺伝子の破壊と、metBLオペロンのプロモーター置換による発現改善とを、一度の相同組換えによって行うことができる。metBLオペロンの発現が向上すると、細胞内のシスタチオニン合成酵素活性及びＡＫ−ＨＤII活性が増強される。
【００２９】
具体的には、E. coli、例えばW3110株染色体DNAを鋳型とし、配列番号５及び配列番号６記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ反応（polymerase chain reaction； White,T.J. et al ;Trends Genet., 5,185(1989)）により得られるmetB遺伝子を含む約１ｋｂの断片と、配列番号７及び配列番号８に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ反応により得られるmetJ遺伝子の下流部分を含む約１ｋｂの断片と、配列番号９及び配列番号１０に示すオリゴヌクレオチドをアニールして得られるスレオニンオペロンのプロモーター配列を有する配列の三者を、適当なベクターに挿入して連結することによって、metJの構造遺伝子が欠失し、metBLオペロンのプロモーターがスレオニンプロモーターに置換した構造を有するＤＮＡ断片を含む組換えベクターを得ることができる。
【００３０】
上記のようにして調製した組換えベクターを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan, C. H. et al., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang, S. et al., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J. et al., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形質転換は、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）によって行うことができる。
【００３１】
metJ、metBL、あるいは後述のmetA、metK及びthrBC等の各遺伝子のクローニング等に用いるベクターとしては、例えばE. coli細胞内で自律複製可能なプラスミド、具体的にはpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。また、ファージベクターを用いてもよい。E. coli以外の微生物を用いる場合は、同微生物及びE. coliにおいて自律複製可能なシャトルベクターを用いることが好ましい。例えば、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドとしては、以下のものが挙げられる。
【００３２】
ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９号公報参照
ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５号公報参照
ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−１９２９００号公報参照
ｐＡＪ ６１１ 同 上
ｐＡＪ １８４４ 同 上
ｐＣＧ １ 特開昭５７−１３４５００号公報参照
ｐＣＧ ２ 特開昭５８−３５１９７号公報参照
ｐＣＧ ４ 特開昭５７−１８３７９９号公報参照
ｐＣＧ １１ 同 上
ｐＨＫ４ 特開平５−７４９１号公報参照
【００３３】
遺伝子断片とベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、遺伝子断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である
その他、染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等に記載されている。
【００３４】
＜２＞ＨＴＳ活性の増強、及び変異型ＨＴＳの付与
微生物細胞内のＨＴＳ活性は、前記微生物細胞内のＨＴＳをコードする遺伝子断片を、同微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これを前記微生物に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のＨＴＳをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、ＨＴＳ活性が増強される。E. coliでは、ＨＴＳはmetA遺伝子にコードされている。微生物としてエシェリヒア属細菌を用いる場合、導入するＨＴＳ遺伝子は、エシェリヒア属細菌由来の遺伝子を用いることが好ましいが、ホモセリントランスアセチラーゼを有するコリネ型細菌等の他の微生物由来の遺伝子を使用することもできる。
【００３５】
ＨＴＳ活性の増強は、ＨＴＳ遺伝子を微生物宿主の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。コリネバクテリウム属細菌に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にＨＴＳ遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、ＨＴＳ遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のＨＴＳ遺伝子のコピー数が上昇する結果、ＨＴＳ活性が増強される。
【００３６】
ＨＴＳ活性の増強は、上記の遺伝子増強による以外に、ＨＴＳ遺伝子の発現調節配列を増強することによっても達成される。具体的には、染色体ＤＮＡ上又はプラスミド上のＨＴＳ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換する（特開平１−２１５２８０号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、ＨＴＳ遺伝子の発現が強化されることによってＨＴＳ活性が増強される。
【００３７】
E. coliのＨＴＳ遺伝子（metA）は、その塩基配列が知られているので（Blattner, F. R. et al., Science, 277, 1453-1462 (1997)）、該塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲにより、染色体ＤＮＡから単離することができる。そのようなプライマーとして具体的には、配列番号２１及び配列番号２２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３８】
上記のようにして微生物細胞内のＨＴＳ活性を増強することによって、Ｌ−メチオニン生合成が強化され、Ｌ−メチオニンの生成量を増加させることができると考えられる。
【００３９】
また、ＨＴＳは、Ｌ−メチオニンとＳＡＭによる協奏的阻害を受けるので、この協奏阻害が解除されたＨＴＳを微生物に保持させることによっても、Ｌ−メチオニン生合成系を強化することができる。前記協奏阻害が解除されたＨＴＳを微生物に保持させることは、微生物に変異処理を施し、同協奏阻害が解除されたＨＴＳを産生する株を選択することにより、行うことができる。変異処理は、微生物の変異株の取得に通常用いられている方法、例えば紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の突然変異に用いられている変異剤により行うことができる。ここで、「Ｌ−メチオニンとＳＡＭによる協奏阻害を解除されたＨＴＳ」とは、Ｌ−メチオニン及びＳＡＭの非存在下でにおける酵素活性に対するＬ−メチオニンもしくはＳＡＭ、又はＬ−メチオニン及びＳＡＭの存在下での酵素活性の比（残存率）が、野生型ＨＴＳのそれよりも高いＨＴＳをいう。具体的には、例えば、１mMのＬ−メチオニン存在下での残存率が４０％以上、好ましくは８０％以上、１mMのSAM存在下での残存率が１０％以上、好ましくは５０％以上、又は、それぞれ0.1mMのＬ−メチオニン及びSAMの存在下での活性が１５％以上、好ましくは６０％以上であるＨＴＳは、Ｌ−メチオニンとＳＡＭによる協奏阻害を解除されたＨＴＳである。
【００４０】
上記のような変異型ＨＴＳを保持する変異株は、親株をα-メチル-DL-メチオニン（ＭＭ）存在下で、例えば１g/lのＭＭを含む培地で培養し、生育する株を選択することにより、取得することができる。ＭＭによる選択は、複数回繰り返してもよい。
【００４１】
変異型ＨＴＳを保持する変異株は、上記のようにして得られるＨＴＳ変異株から変異型ＨＴＳ遺伝子（変異型metA）をクローニングし、同変異型遺伝子で微生物を形質転換することによっても、取得することができる。変異型ＨＴＳ遺伝子の単離、及び同遺伝子の微生物への導入は、前記の野生型ＨＴＳ遺伝子と同様にして行うことができる。変異型metA遺伝子として具体的には、配列番号２６に示すアミノ酸配列において、27位のアルギニンがシステインに置換する変異、296位のイソロイシンがセリンに置換する変異、又は298位のプロリンがロイシンに置換する変異のいずれかに相当する変異を有するＨＴＳが挙げられる。また、これらの変異の任意の２種又は３種を有するＨＴＳも、好ましい変異型ＨＴＳである。
【００４２】
＜３＞ＳＡＭ合成酵素活性の弱化
さらに、細胞内のＳＡＭ合成酵素活性を弱化させることにより、微生物のＬ−メチオニン生産能を上昇させることができる。ＳＡＭ合成酵素活性を欠損させることによっても、微生物のＬ−メチオニン生産能を上昇させることができるが、その場合は微生物を培養する培地にＳＡＭを含有させる必要があるので、ＳＡＭ合成酵素活性を弱化させることが好ましい。ここで、「ＳＡＭ合成酵素活性を弱化させる」とは、微生物細胞タンパク質当たりのＳＡＭ合成酵素の比活性が、野生型ＳＡＭ合成酵素を保持する株よりも低いことをいう。具体的には、弱化の程度は、野生株のＳＡＭ合成酵素に比べて８０〜５０％、好ましくは５０〜３０％、より好ましくは３０〜１０％程度が挙げられる。E. coliでは、ＳＡＭ合成酵素の比活性が１０％より低下すると、細胞分裂が阻害されることが示唆されている（Newman, E. B. et al., J. Bacteriol., 180, 3614-3619 (1998)）。
【００４３】
ＳＡＭ合成酵素活性が弱化した微生物は、酵素タンパク質当たりの比活性が低下したＳＡＭ合成酵素（弱化型ＳＡＭ合成酵素）を産生するものであってもよいし、ＳＡＭ合成酵素遺伝子の転写効率又は翻訳効率が低下したことにより、酵素の発現効率が低下したものであってもよい。
【００４４】
ＳＡＭ合成酵素活性が弱化した変異株は、親株をDL-ノルロイシン（ＮＬ）存在下で、例えば0.1g/lのＮＬを含む培地で培養し、生育する株を選択することにより、取得することができる。ＮＬによる選択は、複数回繰り返してもよい。また、DL-ノルロイシンの代わりにエチオニン又はγ−グルタミルメチルエステルを用いることも可能である。
【００４５】
弱化型ＳＡＭ合成酵素を保持する変異株は、上記のようにして得られるＳＡＭ合成酵素弱化株から弱化型ＳＡＭ合成酵素遺伝子をクローニングし、同変異型遺伝子で微生物染色体上の野生型ＳＡＭ合成酵素遺伝子を置換することによっても、取得することができる。ＳＡＭ合成酵素遺伝子の遺伝子置換は、前記のmetJ遺伝子と同様にして行うことができる。E. coliのＳＡＭ合成酵素遺伝子（metK）は、その塩基配列が知られているので（Blattner, F. R. et al., Science, 277, 1453-1462 (1997)）、該塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲにより、染色体ＤＮＡから単離することができる。そのようなプライマーとして具体的には、配列番号１１及び配列番号１２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。得られたmetK遺伝子に変異が生じていることは、該遺伝子の塩基配列を決定し、公知の野生型metK遺伝子の塩基配列と比較することにより、確認することができる。
【００４６】
弱化型ＳＡＭ合成酵素をコードする遺伝子として具体的には、配列番号１８に示すアミノ酸配列において、３０３番目のイソロイシンがロイシンに置換する変異、１８５番目のバリンがグルタミン酸に置換する変異、３７８番目のアルギニン以降がアラニン−メチオニン−ロイシン−プロリン−バリン（配列番号２９）からなる配列に変化する変異のいずれかに相当する変異を有するＳＡＭ合成酵素が挙げられる。
【００４７】
＜４＞Ｌ−スレオニン要求性
微生物にＬ−スレオニン要求性を付与することにより、Ｌ−メチオニン生産能を向上させることができる。Ｌ−スレオニン要求性を示す微生物として具体的には、Ｌ−ホモセリンからＬ−スレオニンに至るＬ−スレオニン生合成の固有経路に関与する酵素にいずれかが欠損した微生物が挙げられる。E. coliにおいては、Ｌ−スレオニンの生合成に関与する酵素の遺伝子は、スレオニンオペロン（thrABC）として存在し、thrBC部分を欠失させることによってＬ−ホモセリン以降の生合成能を失ったＬ−スレオニン要求株を取得することができる。尚、thrA遺伝子はＬ−メチオニン及びＬ−スレオニンの共通経路の酵素であるアスパルトキナーゼのアイソザイムの一つをコードしており、欠失させないことが好ましい。
【００４８】
thrBCを欠失させるには、染色体ＤＮＡ上のスレオニンオペロン中のthrBC部分を破壊すればよい。thrBCの破壊は、一部を欠失したthrBCで微生物染色体上のthrBC部分を置換することによって行うことができる。thrBCの遺伝子置換は、前記metJ遺伝子の遺伝子置換と同様に行えばよい。欠失を含むthrBCは、E. coli染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲによりthrB遺伝子の上流部分を含む約１ｋｂの断片を増幅し、同様に配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲによりthrC遺伝子の下流部分を含む約１ｋｂの断片を増幅し、これらの増幅断片を連結することによって取得することができる。
【００４９】
＜５＞Ｌ−メチオニンの製造
上記のようにして得られるＬ−メチオニン生産能を有する微生物を培地に培養し、該培地中にＬ−メチオニンを生産蓄積せしめ、これを該培地から採取することにより、Ｌ−メチオニンを製造することができる。
【００５０】
使用する培地は、微生物に応じて従来より用いられてきた周知の培地を用いてかまわない。つまり、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。本発明を実施するための特別な培地は必要とされない。
【００５１】
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類等を用いることができる。
【００５２】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００５３】
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００５４】
培養は、利用される微生物に応じて従来より用いられてきた周知の条件で行ってかまわない。例えば、好気的条件下で１６〜１２０時間培養を実施するのがよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【００５５】
培養終了後の培地液からのＬ−メチオニンの採取は、本願発明において特別な方法が必要とされることはない。すなわち、本発明は従来より周知となっているイオン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００５６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００５７】
【実施例１】
エシェリヒア・コリW3110株からのL-スレオニン要求株及びmetJ欠損株の取得
＜１＞欠失を有するthrBC構造遺伝子を含む組換え用プラスミドの調製
ゲノムDNA精製キット（アドバンスドジェネティクテクノロジー社製）を用い、その指示に従ってE. coliの野生型K-12株の誘導体であるW3110株から染色体DNAを調製した。配列表の配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。これをプライマーとし、前記染色体ＤＮＡを鋳型として、エルリッチらの方法（PCR Technology-Principles and Applications for DNA Amplification, ed. Erlich, H. A., Stockton Press）に従って、ＰＣＲ反応を行い、thrB遺伝子の上流部分を含む約１ｋｂの断片の増幅を行った。この増幅断片は、両端にプライマーに由来するEcoRI及びSalIの認識配列が導入されている。得られた増幅断片を、導入した認識部位を切断する制限酵素で切断した。
【００５８】
同様に、配列番号３及び配列表番号４に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、thrC遺伝子の下流部分を含む約１ｋｂの断片の増幅を行った。この増幅断片は、両端にプライマーに由来するSalI及びHindIIIの認識配列が導入されている。得られた増幅断片を、導入した認識部位を切断する制限酵素で切断した。上記２つの増幅断片と、EcoRI及びHindIIIで切断したpHSG398（宝酒造社製）とを、ライゲーションキット（宝酒造）を用いて連結し、E. coli JM109コンピテントセル（宝酒造）を形質転換した。形質転換体からプラスミドを、プラスミド抽出機PI-50（倉敷紡績社製）を用いてアルカリ法（Boirnboim, H. C. et al., Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523 (1979)）に基づいて調製した。得られた組換えプラスミドから、EcoRI及びHindIII認識部位に２つの断片がSalI認識部位を介して挿入されたプラスミドを、挿入断片の長さによって選択した。このプラスミドは、thrBCの構造遺伝子の上流と下流を含んでおり、thrBCの構造遺伝子のほぼ全長が欠失した遺伝子断片を含んでいる。
【００５９】
＜２＞遺伝子組換えによるthrBC構造遺伝子欠損株の作製
上記プラスミドと、特願平９−１９４６０３号に記載の温度感受性複製起点を有するプラスミドpMAN997を、EcoRI及びHindIIIで切断した後、これらを連結し、得られた組換えプラスミドでE. coli JM109株を形質転換した。形質転換体からプラスミドを抽出し、pMAN997にthrBC欠失遺伝子断片が挿入された構造を有するものを選択し、pMANΔBCとした。このプラスミドを用いてW3110株を形質転換し、常法に従って遺伝子組換えを行った。すなわち、組換え株の選択は、Ｍ９培地（Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, A.3 (1989)）におけるL-スレオニン要求性によって行い、得られたL-スレオニン要求株をWΔBC株とした。
【００６０】
＜３＞W3110株及びWΔBC株からのmetJ欠損株の作製
次に、W3110株染色体DNAを鋳型とし、配列番号５及び配列番号６記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、metB遺伝子を含む約１ｋｂの断片の増幅を行った。この増幅断片は、両端にEcoRI及びSphIの認識配列が導入されている。得られた増幅断片を、導入した認識部位を切断する制限酵素で切断した。
【００６１】
同様に配列番号７及び配列番号８に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、metJ遺伝子の下流部分を含む約１ｋｂの断片の増幅を行った。この増幅断片は、両端にHindIII及びEcoRIの認識配列が導入されている。得られた増幅断片を、導入した認識部位を切断する制限酵素で切断した。
【００６２】
次に、配列番号９に示した、両端にSphI及びHindIII認識部位を有し、スレオニンオペロンのプロモーター配列を有する配列を、配列番号１０に示した相補鎖とともに合成し、これらをアニールさせた後に、制限酵素SphI及びHindIIIで切断した。このようにして得たスレオニンプロモーター断片と、EcoRIで切断したpHSG298（宝酒造社製）と、前記２つのPCR増幅断片とを混合した後、連結反応を行った。この連結反応液で、JM109株を形質転換し、形質転換体からプラスミドを抽出した。得られた組換えプラスミドから、４者が連結されたプラスミドを選択した。このプラスミドは、metJの構造遺伝子が欠失し、metBLオペロンのプロモーターがスレオニンプロモーターに置き換わった構造を有している。
【００６３】
上記で得られたプラスミド、及び特願平９−１９４６０３号に記載の温度感受性複製起点を有するプラスミドpMAN997をEcoRIで切断し、ライゲーションを行い、pMAN997にmetJ欠失断片が挿入された構造を有するものを選択し、pMANΔJとした。このプラスミドを用いてW3110株及びWΔBC株を形質転換し、常法に従って遺伝子組換えを行った。得られた組換え株は、菌体から調製したＤＮＡを鋳型とし、配列番号６及び配列番号８に示したオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法による増幅産物の長さで選択した。W3110株及びWΔBC株から得られたmetJ欠失株を、それぞれWΔJ株及びWΔBCΔJ株とした。
【００６４】
組換えによるmetJ欠失の効果を確認するため、菌体から粗酵素抽出液を調製し、ＨＴＳ及びシスタチオニン合成酵素の活性を測定した。W3110株とWΔJ株を２mlのLB培地に植菌し、37℃で一晩培養した。この培養液１mlを5,000rpmで10分間遠心分離し、菌体を0.9%の食塩水で２度洗浄した。得られた菌体を１mlの0.9%食塩水に懸濁し、そのうちの0.5mlを、50mlの5mMのL-メチオニンを含むデイビス−ミンジオリ最少培地（Davis, B. D., and Mingioli, E. S., J. Bacteriol. 60, 17-28 (1950)）に植菌した。これを37℃で24時間培養し、培養液を8,000rpmで10分間遠心分離し、菌体を0.9%食塩水で２度洗浄した。菌体を3mlの１mMジチオスレイトールを含む50mMリン酸カリウムバッファー（pH7.5）に懸濁した。この懸濁液を超音波破砕機（久保田社製）を用いて、４℃にて150Wで５分間細胞破砕処理を行った。破砕液を15,000rpmで30分間遠心処理した上清をセファデックスG-50カラム（ファルマシア社製）にて脱塩処理したものを粗酵素抽出液とした。粗酵素抽出液中のＨＴＳ活性とシスタチオニン合成酵素の活性を測定した。
【００６５】
ＨＴＳ活性は、粗酵素抽出液5μlを0.1Mリン酸カリウム（pH7.5）、１mMサクシニルコエンザイムA（シグマ社製）、0.2nM DL-[14C]ホモセリン（室町化学工業社製）、及び0.2mM L-ホモセリンからなる反応液に加えて50μlとし、30℃で10分間反応を行った。反応液1μlを、セルロースプレート（メルク社製）にスポットし、アセトン、ブタノール、水、ジエチルアミンを１０：１０：５：２の割合で含む添加溶媒で展開した。プレートを風乾した後、イメージアナライザー（富士写真工業社製）にてオートラジオグラフィーを行った。
【００６６】
シスタチオニン合成酵素は、Ｌ−システイン非存在下ではＯ−サクシニルホモセリンをα−ケト酪酸、アンモニア及びコハク酸を生じることが知られており、簡便な検出方法として利用できる（Holbrook, E. L. et al., Biochemistry 29, 435-442 (1990)）。粗酵素抽出液１００μlを、0.2Mトリス−塩酸（pH8）、5mMＯ−サクシニルホモセリン（シグマ社製）、及び0.25mMピリドキサルリン酸（シグマ社製）からなる反応液に加え1mlとし、37℃で20分間反応を行った後氷冷した。この反応液中のＯ−サクシニルホモセリンを逆相ＨＰＬＣ（ジーエルサイエンス社製）で定量し、粗酵素抽出液非添加の反応液から減少したＯ−サクシニルホモセリン量を算出した。ピリドキサルリン酸非添加の反応を同時に行い、ピリドキサルリン酸依存のＯ−サクシニルホモセリン減少を、シスタチオニン合成酵素活性とした。
【００６７】
上記のようにして測定したＨＴＳ活性とシスタチオニン合成酵素のそれぞれの比活性の測定結果を表１に示した。ＨＴＳ活性はW3110株ではL-メチオニン添加の効果によりほとんど検出されないが、WΔJ株においては顕著な活性を示した。シスタチオニン合成酵素活性も、WΔJ株においてはW3110株に比して顕著な増大が認められた。これらの結果から組換えによるmetJ欠失とmetBLオペロンのプロモーター置換の効果が確認された。
【００６８】
【表１】
【００６９】
【実施例２】
W3110株からのmetK変異株の取得
W3110株をＬＢ培地（Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, A.1 (1989)）にて37℃で一晩培養した。培養した培養液１mlを5,000rpmで10分間遠心分離し、菌体を0.9%の食塩水で２度洗浄した。得られた菌体を100μlの0.9%食塩水に懸濁し、そのうちの10μlを５mlの0.1g/lのDL-ノルロイシン（ＮＬ）を含むデイビス−ミンジオリ最少培地に植菌した。これを３７℃で５日間培養した。
【００７０】
生育してきたコロニーの幾つかをLB寒天培地上でコロニー分離し、再度0.1g/lのＮＬを含むデイビス−ミンジオリ最小培地での生育を確認し、12株のＮＬ耐性株を選抜した。これらの耐性株から染色体DNAを調製した。これを鋳型として配列番号１１及び１２に示す配列を有する２種のプライマーを用いてPCR反応を行いmetK遺伝子の増幅を行った。この増幅断片の塩基配列を、配列番号１１及び１２に示した増幅用プライマー、及び配列番号１３、１４、１５、及び１６に示す配列を有するプライマーを用いて決定した。塩基配列の決定はダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（パーキンエルマー社製）を用いて、373S型DNAシークエンサー（パーキンエルマー社製）にてそれぞれの指示に従って行った。対照として決定した野生株W3110の塩基配列はブラットナーらが報告しているmetKの配列（Blattner, F. R. et al., Science, 277, 1453-1462 (1997)）と完全に一致した。この配列を配列番号１７に示した。また、この配列がコードし得るＳＡＭ合成酵素のアミノ酸配列を配列番号１８に示した。
【００７１】
ＮＬ耐性株のうち、metKの構造遺伝子中に変異点が見いだされたものは１２株の内３株あり、これらをWNL2、WNL24、及びWNL32と名付けた。これらの変異株のmetK塩基配列は、配列番号１７に示す野生型の塩基配列上で、WNL2株では９０７番目のアデニンがシトシンに、WNL24株では５５４番目のチミンがアデニンに、WNL32株では1132番目のシトシン塩基の欠失が認められた。この結果、配列番号１８に示したＳＡＭ合成酵素のアミノ酸配列において、WNL2株のＳＡＭ合成酵素は３０３番目のイソロイシンがロイシンに、WNL24株では１８５番目のバリンがグルタミン酸に、WNL32株では１塩基欠失によって３７８番目のアルギニン以降がアラニン−メチオニン−ロイシン−プロリン−バリンからなる配列に変化していることが明らかとなった。これらの株はＳＡＭ合成酵素活性が弱化していることが推定された。
【００７２】
【実施例３】
metK変異の導入と野生型metA遺伝子の増幅によるL-メチオニン生産
（１）WΔBCΔJ株へのmetK変異の導入
metK遺伝子変異株であるWNL2株、WNL24株、及びWNL32株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号１９及び配列番号２０記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、metK遺伝子を含む約2.5kbの断片の増幅を行った。この増幅断片は両端にHindIIIの認識配列が導入されている。得られた増幅断片をそれぞれHindIIIで切断した。HindIIIで切断したpSTV28（宝酒造社製）及びPCR増幅断片を混合後連結反応を行い、JM109株を形質転換した。形質転換体からプラスミドを抽出した。得られた組換えプラスミドからPCR増幅断片が挿入されたプラスミドを選択した。これらのプラスミドはmetKの構造遺伝子に変異を有していることを塩基配列を決定し確認した。
【００７３】
これらのプラスミドのHindIII切断断片を、HindIIIで切断したpMAN997にクローニングし、それぞれpMANK-2，pMANK-24，pMANK-32と名付けた。これらのプラスミドを用いてWΔBCΔJ株を形質転換し、常法に従って遺伝子組換えを行った。組換え株から染色体DNAを抽出して鋳型とし、配列番号１１及び配列番号１２に示したオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法による増幅産物の塩基配列を調べた。それぞれの変異が認められたものを選択した。得られたWΔBCΔJ株由来のmetK変異株をそれぞれWΔBCΔJK-2株、WΔBCΔJK-24株、及びWΔBCΔJK-32株とした。
【００７４】
（２）metA遺伝子の増幅
W3110株染色体DNAを鋳型とし、配列番号２１及び配列番号２２記載の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、metA遺伝子を含む約１kbの断片の増幅を行った。この増幅断片は両端にそれぞれSphI及びSalIの認識配列が導入されている。得られた増幅断片を、導入した認識部位を切断する制限酵素で切断した。これをSphI及びSalIで切断したpHSG398にクローニングした。挿入断片の塩基配列を配列番号２１及び２２に示した増幅用プライマー、並びに配列番号２３及び２４に示す配列を有するプライマーを用いて決定した。決定した野生株W3110のmetAの塩基配列はブラットナーらが報告しているmetAの配列（Blattner, F. R. et al., Science, 277, 1453-1462 (1997)）と完全に一致した。この配列を配列番号２５に示した。また、この配列がコードし得るＨＴＳのアミノ酸配列を配列番号２６に示した。
【００７５】
このプラスミドのSphI及びSalIによる切断物、実施例１に記載のスレオニンプロモーターのHindIII及びSphIによる切断物、及びHindIII及びSalIで切断したpMW118（日本ジーン社製）を混合後、連結反応を行った。この反応液でJM109株を形質転換し、形質転換体からプラスミドを抽出した。得られた組換えプラスミドから３者が連結されたプラスミドを選択した。このプラスミドはスレオニンプロモーターの下流にmetA遺伝子が配置されており、スレオニンプロモーターによりmetAが発現する構造をとっている。このプラスミドをpMWPthmetA-Wと名付けた。このプラスミドを用いてW3110株、WΔBC株、WΔBCΔJ株、WΔBCΔJK-2株、WΔBCΔJK-24株、及びWΔBCΔJK-32株を形質転換し、形質転換体を得た。
【００７６】
各形質転換体を50mg/lのアンピシリンを含むLBプレート上、37℃で一晩培養した。菌体をグルコース40g/l、硫酸マグネシウム1g/l、硫安16g/l、リン酸二水素カリウム１g/l、酵母抽出物（Bacto Yeast-Extract (Difco)）2g/l、硫酸マンガン0.01g/l、硫酸鉄0.01g/l、炭酸カルシウム30g/l、アンピシリン50mg/l、Ｌ−スレオニン0.5g/lを含むpH7の培地20mlに植菌し、37℃で48時間培養した。
【００７７】
培養物から菌体を除き、アミノ酸分析計（日立社製）にてＬ−メチオニン量を測定した。この結果を表３に示した。W3110株では認められなかったＬ−メチオニンが、WΔBC株、WΔBCΔJ株において増加した。metKの変異は、WΔBCΔJK-2株ではＬ−メチオニン量は低下したものの、WΔBCΔJK-32株においては同等、WΔBCΔJK-24株では上昇が認められ、Ｌ−メチオニン生産に効果が認められた。プラスミドpMWPthrmetA-Wを保持したWΔBCΔJK-24株は、プライベートナンバーAJ13425が付与され、平成１０年５月１４日より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６８０８が付与されている。
【００７８】
【表２】
【００７９】
【実施例４】
metA変異株及び阻害解除型metA遺伝子の取得
W3110株を２mlのLB培地に植菌し、37℃で８時間培養した。この培養液１mlを5,000rpmで10分間遠心分離し、菌体を0.9%の食塩水で２度洗浄した。得られた菌体を１００μlの０．９%食塩水に懸濁し、そのうちの５μlを５mlの１g/lのα-メチル-DL-メチオニン（ＭＭ）を含むデイビス−ミンジオリ最少培地に植菌した。これを37℃で３日間培養した。この培養液を適当に希釈の後、１g/lのＭＭを含むデイビス−ミンジオリ最少培地に塗布し、37℃で一晩培養した。生育してきたコロニーの幾つかをLB寒天培地上でコロニー分離し、再度１g/lのＭＭを含むデイビス−ミンジオリ最小培地での生育を確認した。この操作を９回独立に行い、６個の独立した耐性株を得て，それぞれをWMM4、WMM5、WMM6、WMM7、WMM8、及びWMM9と名付けた。
【００８０】
これらの耐性株から染色体DNAを調製した。これを鋳型として配列番号２１及び２２に示す配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ反応を行いmetA遺伝子の増幅を行った。この増幅断片の塩基配列を配列番号２１及び２２に示した増幅用プライマー、並びに配列番号２３及び２４に示す配列を有するプライマーを用いて決定した。耐性株のmetA塩基配列は、配列番号２５に示す野生型metAの塩基配列上で、WMM4株では887番目のチミンがグアニンに、WMM5株では893番目のシトシンがチミンに、WMM6株では野生型、WMM7及びWMM8株では886番目から890番目の塩基に相当するATCTCなる配列が反復して存在しその間に約1300塩基からなるIS2と呼ばれる挿入配列（Ghosal, D. et al., Nucleic Acids Res. 6, 1111-1122 (1979)）が存在し、WMM9株では79番目のシトシンがチミンに変化していた。この結果、配列番号２６に示したＨＴＳのアミノ酸配列において、WMM4株のＨＴＳは296番目のイソロイシンがセリンに、WMM5株では298番目のプロリンがロイシンに、WMM7及びWMM8株では挿入配列によって298番目のプロリン以降がアルギニン−ロイシン−アラニン−プロリンからなる配列に、WMM9株では27番目のアルギニンがシステインに変化していることが明らかとなった。
【００８１】
metA構造遺伝子に変異が認められたWMM4、WMM5、WMM9、及びWMM7株をLB培地にて37℃で一晩試験管培養した培養液１mlを5,000rpmで10分間遠心した後、１mlの0.9%の食塩水で２度洗浄した。これを１mlの0.9%の食塩水に懸濁し、0.5mlを50mlの最少培地に植菌し、37℃で一日培養した。培養液を8,000rpmで10分間遠心した後、１mlの0.9%の食塩水で２度洗浄した。得られた菌体を３mlの50mMリン酸カリウム（pH7.5）、１mMジチオスレイトールからなる緩衝液に懸濁し、実施例１に示したのと同じ操作を行い粗酵素抽出液を得た。粗酵素抽出液中のＨＴＳ活性を、阻害剤の存在下で実施例１に記載の反応組成で測定した結果を、表２に示した。WMM7株については活性を検出することが出来なかったが，これは挿入配列によるアミノ酸配列の変化により比活性が大きく低下したものと考えられた。それ以外の株の比活性は野生株の約１／４程度であった。ＭＭによる阻害はWMM4、WMM5、及びWMM9株のいずれにおいても解除されており、L-メチオニンによる阻害もかなり緩和していた。ＳＡＭによる阻害はWMM9株でほとんど解除が認められなかったが、WMM4及びWMM5株では解除する傾向が認められた。野生株ＨＴＳ活性に最も強力な阻害を示したL-メチオニン及びＳＡＭの組合わせもWMM4及びWMM5株で顕著な緩和が認められた。
【００８２】
【表３】
【００８３】
【実施例５】
変異型metAの導入によるL-メチオニン生産
実施例４で得られたmetAの変異株のうち、WMM9株、WMM4株、及びWMM5株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号２１及び配列番号２２記載の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてそれぞれＰＣＲ反応を行い、metA遺伝子を含む断片を増幅した。この増幅断片は、両端にSphI及びSalIの認識配列が導入されている。この増幅断片の両端をSphI及びSalIで切断し、SphI及びSalIで切断したpHSG398にクローニングした。挿入断片の塩基配列を決定し、変異点を確認した。このプラスミドのSphI及びSalIによる切断物、実施例１に記載のスレオニンプロモーターのHindIII及びSphIによる切断物、及びHindIII及びSalIで切断したpMW118（日本ジーン社製）を混合後、連結反応を行った。この反応液でJM109株を形質転換し、形質転換体からプラスミドを抽出した。得られた組換えプラスミドから３者が連結されたプラスミドを選択した。これらをそれぞれpMWPthrmetA-9、pMWPthrmetA-4、及びpMWPthrmetA-5と名付けた。
【００８４】
さらに各変異型metA遺伝子の変異点を組合わせるため、部位特異的変異導入をMutan-Super Express Km（宝酒造社製）を用いてその指示に従って行った。配列番号２７記載の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、metA-4変異にmetA-9変異を組合わせてpMWPthrmetA-9+4を作製した。同様にmetA-5変異にmetA-9変異を組合わせてpMWPthrmetA-9+5を作製した。さらに配列番号２８記載の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、metA-9変異にmetA-4及びmetA-5変異を組合わせてpMWPthrmetA-9+4+5を作製した。
【００８５】
これらのプラスミドを用いてWΔBCΔJK-32株を形質転換し、形質転換体を得た。各形質転換体を、50mg/lのアンピシリンを含むLBプレート上、37℃で一晩培養した。菌体をグルコース40g/l、硫酸マグネシウム１g/l、硫安16g/l、リン酸二水素カリウム１g/l、酵母抽出物（Bacto Yeast-Extract (Difco) 2g/l、硫酸マンガン0.01g/l、硫酸鉄0.01g/l、炭酸カルシウム30g/l、アンピシリン50mg/l、Ｌ−スレオニン0.5g/lを含むpH7の培地20mlに植菌し、37℃で48時間培養した。培養物から菌体を除き、アミノ酸分析計（日立社製）にてＬ−メチオニン量を測定した。この結果を表４に示した。Ｌ−メチオニン蓄積量は、野生型metAを導入した株に比べて、変異型のmetAを導入した株では数倍増加した。さらに変異を組合わせることによって、Ｌ−メチオニン生産量のさらなる増加が認められた。
【００８６】
【表４】
【００８７】
【発明の効果】
本発明により、Ｌ−メチオニン生産能を有する微生物が提供される。同微生物は、Ｌ−メチオニン生産菌として、また、Ｌ−メチオニン生産菌の育種の材料として利用することができる。
本発明の変異型metA遺伝子は、Ｌ−メチオニン及びＳＡＭによる協奏阻害が解除されているので、Ｌ−メチオニン生産菌の育種に利用することができる。
【００８８】
【配列表】
【００９１】
【００９２】
【００９３】
【００９４】
【００９５】
【００９６】
【００９７】
【００９８】
【００９９】
【０１００】
【０１０１】
【０１０２】
【０１０３】
【０１０４】
【０１０５】
【０１０６】
【０１０７】
【０１０８】
【０１０９】
【０１１０】
【０１１１】
【０１１２】
【０１１３】
【０１１４】
【０１１５】
【０１１６】
【０１１７】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発酵法によるＬ−メチオニンの製造法に関する。Ｌ−メチオニンは、医薬等として重要なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
メチオニンは、工業的には化学合成により製造されるＤＬ体が中心となっている。Ｌ体が必要な場合は、このＤＬ体をアセチル化してＮ−アセチル−ＤＬ−メチオニンとし、酵素的にＬ体だけを脱アセチル化することによって製造される。
【０００３】
一方、発酵法によるＬ−メチオニンの製造については、メチオニンアナログ耐性変異株を用いる方法が報告されているが、生産量は少なく、またＬ−メチオニン生産に影響を与える因子は明らかではないため、最も発酵生産が困難なアミノ酸の一つである。例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli（E. coli））K-12株を用いる方法が、公開特許公報昭５６−３５９９２あるいは文献（Chattapadhyay, M. K. et al., Med. Sci. Res. 23, 775 (1995)、Chattapadhyay, M. K. et al., Biotechnol. Lett. 17, 567-570 (1995)）に報告されているが、いずれもＬ−メチオニンの生産量は工業的に用いるには不十分であった。
【０００４】
E. coliにおいては、Ｌ−メチオニンの生合成経路は、Ｌ−スレオニンの生合成経路と一部共通であり、Ｌ−ホモセリンが共通の中間体となっている。Ｌ−ホモセリンからＬ−メチオニンへの固有経路の第一段階は、ホモセリントランスサクシニラーゼ（ＨＴＳ）によって触媒されるが、同酵素は最終生産物であるＬ−メチオニンとＬ−メチオニンの代謝物であるＳ−アデノシルメチオニンにより協奏的な阻害を受けることが知られている（Lee, L.-W. et al., J. Biol. Chem. 241, 5479-5480 (1966)）。
【０００５】
E. coliのホモセリントランスサクシニラーゼをコードする遺伝子であるmetA配列は、ダクロスらにより報告されており（Duclos, B. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2856 (1989)）、metAの変異株の取得についても、Ｌ−メチオニンのアナログであるα−メチル−ＤＬ−メチオニン（ＭＭ）に対する耐性を利用した方法が知られている（Chattopadhyay, M. K. et al., J. Gen. Microbiol. 137, 685-691 (1991)）。しかし、ＭＭ耐性株のmetA遺伝子産物であるホモセリントランスサクシニラーゼが、Ｌ−メチオニンとＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）による阻害解除型となるという報告は、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）においてなされているが（Lawrence, D. A. et al., J. Bacteriol. 109, 8-11 (1972)）、変異型metA遺伝子の塩基配列の報告はない。さらに、metAの単独変異株は、Ｌ−メチオニンを排出しないと報告されている（Chattopadhyay, M. K. et al., J. Gen. Microbiol. 137, 685-691 (1991)）。
【０００６】
metAを含めて、ホモセリントランスサクシニラーゼによる反応以降のＬ−メチオニンの固有生合成経路の酵素遺伝子の発現は、metJ遺伝子産物であるリプレッサーによる抑制を受けることも明らかとなっている（Greene, R. C., Biosynthesis of Methionine. in "Escherichai coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition", ed. Neidhardt, F. D., ASM Press, pp. 542-560 (1996).）。metJ遺伝子は、Ｌ−メチオニンへの固有生合成経路の第二の酵素シスタチオニンγ−シンテースをコードするmetB遺伝子と、アスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII（ＡＫ−ＨＤII）をコードするmetLとからなるmetBLオペロンと、逆向きに隣接していることが知られている（Duchange, N. et al., J. Biol. Chem. 258, 14868-14871 (1983)）。
【０００７】
Ｌ−メチオニンからＳ−アデノシルメチオニンへの代謝反応を触媒するＳ−アデノシルメチオニン合成酵素をコードするmetKは、必須遺伝子であることが示唆されている（Greene, R. C., Biosynthesis of Methionine. in "Escherichai coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition", ed. Neidhardt, F. D., ASM Press, pp. 542-560 (1996)）。また、metKの変異株は、ＤＬ−ノルロイシンやエチオニンなどのメチオニンアナログ耐性により得られることが知られているとともに（Chattopadhyay, M. K. et al., J. Gen. Microbiol. 137, 685-691 (1991)）、Ｌ−メチオニンへの固有生合成経路の酵素の発現を上昇させることがと報告されている（Greene, R. C. et al., J. Bacteriol. 115, 57-67 (1973)。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
上記のように、Ｌ−メチオニン生合成に関与する酵素やその遺伝子について、ある程度の報告はあるが、Ｌ−メチオニンの発酵生産に直接結びつく知見はほとんど得られておらず、Ｌ−メチオニン生産菌育種への応用もほとんどなされていない。
【０００９】
本発明は、上記現状に鑑みなされたものであり、Ｌ−メチオニン生産に影響を与える因子を明らかにしてＬ−メチオニン生産菌を育種し、発酵法によるＬ−メチオニンの生産を可能とすることを課題とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
【００１１】
（１）Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサーを欠損し、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有する微生物。
（２）細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性が増強され、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有する微生物。
（３）Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサーを欠損し、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性が増強され、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有する微生物。
【００１２】
（４）さらに細胞内のＳ−アデノシルメチオニンシンテテース活性が弱化した前記（１）〜（３）のいずれかの微生物。
（５）ホモセリントランスサクシニラーゼ活性の増強が、前記微生物細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は同遺伝子の発現調節配列を増強することによるものである（２）〜（４）の微生物。
（６）Ｌ−メチオニンとＳ−アデノシルメチオニンによる協奏阻害が解除されたホモセリントランスサクシニラーゼを保持する（１）又は（４）に記載の微生物。
（７）Ｌ−スレオニン要求性を示すことを特徴とする（１）〜（６）のいずれかの微生物。
（８）細胞内のシスタチオニンγ−シンテース活性及びアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII活性が増強された（１）〜（７）のいずれかの微生物。
（９）エシェリヒア属に属することを特徴とする（１）〜（８）のいずれかの微生物。
【００１３】
（１０）前記（１）〜（１０）のいずれかの微生物を培地に培養し、培地中にＬ−メチオニンを生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−メチオニンの製造法。
【００１４】
（１１）配列番号２６に示すアミノ酸配列において、27位のアルギニンがシステインに置換する変異、296位のイソロイシンがセリンに置換する変異、298位のプロリンがロイシンに置換する変異、27位のアルギニンがシステインに置換しかつ296位のイソロイシンがセリンに置換する変異、296位のイソロイシンがセリンに置換しかつ298位のプロリンがロイシンに置換する変異、298位のプロリンがロイシンに置換しかつ27位のアルギニンがシステインに置換する変異、又は、27位のアルギニンがシステインに置換し、296位のイソロイシンがセリンに置換しかつ298位のプロリンがロイシンに置換する変異のいずれかに相当する変異を有するアミノ酸配列を有し、Ｌ−メチオニンとＳ−アデノシルメチオニンによる協奏阻害が解除されたホモセリントランスサクシニラーゼをコードするＤＮＡ。
【００１５】
本明細書において、Ｓ−アデノシルメチオニンを「ＳＡＭ」、α-メチル-DL-メチオニンを「ＭＭ」、DL-ノルロイシンを「ＮＬ」と呼ぶことがある。また、Ｓ−アデノシルメチオニンシンテテースを「ＳＡＭ合成酵素」、ホモセリントランスサクシニラーゼを「ＨＴＳ」ということがある。また、E. coliのmetB遺伝子産物シスタチオニンγ-シンテースを「シスタチオニン合成酵素」、metL遺伝子産物「アスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII」をＡＫ−ＨＤIIと呼ぶことがある。
【００１６】
本発明において「Ｌ−メチオニン生産能」とは、本発明の微生物を培地に培養したときに、培地中にＬ−メチオニンを蓄積する能力をいう。
【００１７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の微生物は、Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサーを欠損し、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有する微生物、又は、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性が増強され、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有する微生物である。本発明の微生物は、Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサーを欠損し、かつ、細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性が増強されていることが好ましい。
さらに、本発明の微生物は、細胞中のＳＡＭ合成酵素活性が弱化していることが好ましい。
【００１８】
上記のような微生物としては、Ｌ−ホモセリンからアシル転移反応により生じるＯ−アシルホモセリンを経てＬ−メチオニン及びＳＡＭを産生する経路を有し、該アシル転移酵素の発現がリプレッサーによる抑制によって制御されるものであれば、特に制限されない。そのような微生物としては、エシェリヒア属細菌、コリネ型細菌、バチルス属細菌等の細菌が挙げられるが、エシェリヒア属細菌、例えばE. coliが好ましい。
【００１９】
また、本発明の微生物は、E. coliのように、それが保持するＨＴＳがＬ−メチオニン及びＳＡＭによる協奏阻害を受けるものであれば、その阻害を解除することによって、Ｌ−メチオニン生産能を向上させることができる。
【００２０】
メチオニン生合成の固有経路は、E. coli等多くの微生物のようにシスタチニオンを経由するものと、ブレビバクテリウム・フラバムのようにシスタチオニンを経由しないものがある（Ozaki, H. et al., J. Biochem., 91, 1163, (1982)）が、本発明においては、シスタチニオンを経由する経路を有するものが好ましい。そのような微生物においては、細胞内のシスタチオニン合成酵素活性を増強することにより、Ｌ−メチオニン合成能を強化することができる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムのような微生物であっても、Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサーの欠損又は／及びＨＴＳの増強によって、Ｌ−メチオニン生産能を高めることができる。
【００２１】
さらに、上記微生物において、Ｌ−メチオニン生合成及びＬ−スレオニン生合成の共通経路に関与するアスパルトキナーゼ活性又はホモセリンデヒドロゲナーゼ活性の少なくとも一方を増強することによって、一層Ｌ−メチオニン生産能を高めることができる。
【００２２】
上記の各特性の２以上を微生物に付与する場合、その順序は特に制限されず、任意の順序で付与することができる。また、複数の遺伝子を微生物に導入する場合、それらの遺伝子は同じベクターに搭載してもよく、複数の異なるベクターに別個に搭載してもよい。尚、複数のベクターを用いる場合は、異なる薬剤マーカー、及び異なる複製起点を有するベクターを用いることが好ましい。
以下に、上記の各特性を微生物に付与する方法を説明する。
【００２３】
＜１＞Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサーの欠損
微生物のＬ−メチオニン生合成系のリプレッサーを欠損させるには、微生物に変異処理を施し、同リプレッサーを産生しなくなった株を選択することにより、行うことができる。変異処理は、微生物の変異株の取得に通常用いられている方法、例えば紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の突然変異に用いられている変異剤により行うことができる。
【００２４】
また、微生物の染色体ＤＮＡ上の前記リプレッサーをコードする遺伝子を破壊することによっても、同リプレッサーを欠損させることができる。遺伝子の破壊は、コード領域又は発現調節配列の少なくとも一部を欠失した欠失型遺伝子を作製し、該欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子との相同組換えを起こさせ、染色体上の遺伝子を欠失型遺伝子で置換することによって行うことができる（遺伝子置換）。
【００２５】
リプレッサー遺伝子は、例えば、E. coliのＬ−メチオニン生合成系のリプレッサーをコードする遺伝子（metJ）の塩基配列は知られているので（Duchange, N. et al., J. Biol. Chem. 258, 14868-14871 (1983)）、該塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲにより、染色体ＤＮＡから単離することができる。こうして得られる遺伝子断片から一定の領域を制限酵素により切り出し、コード領域又は発現調調節領域の少なくとも一部を欠失させることによって、欠失型遺伝子を作製することができる。
【００２６】
遺伝子置換は、例えば次のようにして行うことができる。温度感受性複製起点を有するベクターに欠失型遺伝子を搭載させて組換えベクターを調製し、同組換えベクターで微生物を形質転換し、欠失型遺伝子と染色体ＤＮＡ上の遺伝子との相同組換えにより染色体ＤＮＡ上の遺伝子に欠失型遺伝子を挿入させる。その後に、形質転換株を前記ベクターが複製できない温度で培養し、細胞質中のベクターを脱落させる。さらに、染色体上の１コピーの遺伝子をベクターとともに脱落させることにより、遺伝子が置換される。目的の遺伝子置換が生じていることは、遺伝子置換株の染色体ＤＮＡをサザン・ハイブリダイゼーションにより解析することにより、確認することができる。
【００２７】
E. coli用の温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えば特願平９−１９４６０３号に記載のプラスミドpMAN997等が、また、コリネ型細菌用の温度感受性複製起点を有するベクターとしては、例えば特開平５−７４９１号公報に記載のプラスミドpHSC4等が挙げられるが、これらに限定されず、他のベクターを用いることもできる。
【００２８】
前述したようにE. coliでは、metJ遺伝子は、metB遺伝子とmetL遺伝子とからなるmetBLオペロンと、逆向きに隣接していることが知られている（Duchange, N. et al., J. Biol. Chem. 258, 14868-14871 (1983)）。したがって、欠失型metJ遺伝子に、適当なプロモーター配列を連結し、上記と同様に遺伝子置換を行うことによって、metJ遺伝子の破壊と、metBLオペロンのプロモーター置換による発現改善とを、一度の相同組換えによって行うことができる。metBLオペロンの発現が向上すると、細胞内のシスタチオニン合成酵素活性及びＡＫ−ＨＤII活性が増強される。
【００２９】
具体的には、E. coli、例えばW3110株染色体DNAを鋳型とし、配列番号５及び配列番号６記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ反応（polymerase chain reaction； White,T.J. et al ;Trends Genet., 5,185(1989)）により得られるmetB遺伝子を含む約１ｋｂの断片と、配列番号７及び配列番号８に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとするＰＣＲ反応により得られるmetJ遺伝子の下流部分を含む約１ｋｂの断片と、配列番号９及び配列番号１０に示すオリゴヌクレオチドをアニールして得られるスレオニンオペロンのプロモーター配列を有する配列の三者を、適当なベクターに挿入して連結することによって、metJの構造遺伝子が欠失し、metBLオペロンのプロモーターがスレオニンプロモーターに置換した構造を有するＤＮＡ断片を含む組換えベクターを得ることができる。
【００３０】
上記のようにして調製した組換えベクターを微生物に導入するには、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel, M. et al., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)）があり、バチルス・ズブチリスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤＮＡを導入する方法（Duncan, C. H. et al., Gene, 1, 153 (1977)）がある。あるいは、バチルス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang, S. et al., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M. J. et al., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形質転換は、電気パルス法（特開平２−２０７７９１号公報参照）によって行うことができる。
【００３１】
metJ、metBL、あるいは後述のmetA、metK及びthrBC等の各遺伝子のクローニング等に用いるベクターとしては、例えばE. coli細胞内で自律複製可能なプラスミド、具体的にはpUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等が挙げられる。また、ファージベクターを用いてもよい。E. coli以外の微生物を用いる場合は、同微生物及びE. coliにおいて自律複製可能なシャトルベクターを用いることが好ましい。例えば、コリネ型細菌で自律複製可能なプラスミドとしては、以下のものが挙げられる。
【００３２】
ｐＡＭ ３３０ 特開昭５８−６７６９９号公報参照
ｐＨＭ １５１９ 特開昭５８−７７８９５号公報参照
ｐＡＪ ６５５ 特開昭５８−１９２９００号公報参照
ｐＡＪ ６１１ 同 上
ｐＡＪ １８４４ 同 上
ｐＣＧ １ 特開昭５７−１３４５００号公報参照
ｐＣＧ ２ 特開昭５８−３５１９７号公報参照
ｐＣＧ ４ 特開昭５７−１８３７９９号公報参照
ｐＣＧ １１ 同 上
ｐＨＫ４ 特開平５−７４９１号公報参照
【００３３】
遺伝子断片とベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、遺伝子断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である
その他、染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡライブラリーの作製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの切断及び連結、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)等に記載されている。
【００３４】
＜２＞ＨＴＳ活性の増強、及び変異型ＨＴＳの付与
微生物細胞内のＨＴＳ活性は、前記微生物細胞内のＨＴＳをコードする遺伝子断片を、同微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型のベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これを前記微生物に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のＨＴＳをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、ＨＴＳ活性が増強される。E. coliでは、ＨＴＳはmetA遺伝子にコードされている。微生物としてエシェリヒア属細菌を用いる場合、導入するＨＴＳ遺伝子は、エシェリヒア属細菌由来の遺伝子を用いることが好ましいが、ホモセリントランスアセチラーゼを有するコリネ型細菌等の他の微生物由来の遺伝子を使用することもできる。
【００３５】
ＨＴＳ活性の増強は、ＨＴＳ遺伝子を微生物宿主の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。コリネバクテリウム属細菌に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にＨＴＳ遺伝子を多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平２−１０９９８５号公報に開示されているように、ＨＴＳ遺伝子をトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のＨＴＳ遺伝子のコピー数が上昇する結果、ＨＴＳ活性が増強される。
【００３６】
ＨＴＳ活性の増強は、上記の遺伝子増強による以外に、ＨＴＳ遺伝子の発現調節配列を増強することによっても達成される。具体的には、染色体ＤＮＡ上又はプラスミド上のＨＴＳ遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換する（特開平１−２１５２８０号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰRプロモーター、ＰLプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、ＨＴＳ遺伝子の発現が強化されることによってＨＴＳ活性が増強される。
【００３７】
E. coliのＨＴＳ遺伝子（metA）は、その塩基配列が知られているので（Blattner, F. R. et al., Science, 277, 1453-1462 (1997)）、該塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲにより、染色体ＤＮＡから単離することができる。そのようなプライマーとして具体的には、配列番号２１及び配列番号２２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【００３８】
上記のようにして微生物細胞内のＨＴＳ活性を増強することによって、Ｌ−メチオニン生合成が強化され、Ｌ−メチオニンの生成量を増加させることができると考えられる。
【００３９】
また、ＨＴＳは、Ｌ−メチオニンとＳＡＭによる協奏的阻害を受けるので、この協奏阻害が解除されたＨＴＳを微生物に保持させることによっても、Ｌ−メチオニン生合成系を強化することができる。前記協奏阻害が解除されたＨＴＳを微生物に保持させることは、微生物に変異処理を施し、同協奏阻害が解除されたＨＴＳを産生する株を選択することにより、行うことができる。変異処理は、微生物の変異株の取得に通常用いられている方法、例えば紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の突然変異に用いられている変異剤により行うことができる。ここで、「Ｌ−メチオニンとＳＡＭによる協奏阻害を解除されたＨＴＳ」とは、Ｌ−メチオニン及びＳＡＭの非存在下でにおける酵素活性に対するＬ−メチオニンもしくはＳＡＭ、又はＬ−メチオニン及びＳＡＭの存在下での酵素活性の比（残存率）が、野生型ＨＴＳのそれよりも高いＨＴＳをいう。具体的には、例えば、１mMのＬ−メチオニン存在下での残存率が４０％以上、好ましくは８０％以上、１mMのSAM存在下での残存率が１０％以上、好ましくは５０％以上、又は、それぞれ0.1mMのＬ−メチオニン及びSAMの存在下での活性が１５％以上、好ましくは６０％以上であるＨＴＳは、Ｌ−メチオニンとＳＡＭによる協奏阻害を解除されたＨＴＳである。
【００４０】
上記のような変異型ＨＴＳを保持する変異株は、親株をα-メチル-DL-メチオニン（ＭＭ）存在下で、例えば１g/lのＭＭを含む培地で培養し、生育する株を選択することにより、取得することができる。ＭＭによる選択は、複数回繰り返してもよい。
【００４１】
変異型ＨＴＳを保持する変異株は、上記のようにして得られるＨＴＳ変異株から変異型ＨＴＳ遺伝子（変異型metA）をクローニングし、同変異型遺伝子で微生物を形質転換することによっても、取得することができる。変異型ＨＴＳ遺伝子の単離、及び同遺伝子の微生物への導入は、前記の野生型ＨＴＳ遺伝子と同様にして行うことができる。変異型metA遺伝子として具体的には、配列番号２６に示すアミノ酸配列において、27位のアルギニンがシステインに置換する変異、296位のイソロイシンがセリンに置換する変異、又は298位のプロリンがロイシンに置換する変異のいずれかに相当する変異を有するＨＴＳが挙げられる。また、これらの変異の任意の２種又は３種を有するＨＴＳも、好ましい変異型ＨＴＳである。
【００４２】
＜３＞ＳＡＭ合成酵素活性の弱化
さらに、細胞内のＳＡＭ合成酵素活性を弱化させることにより、微生物のＬ−メチオニン生産能を上昇させることができる。ＳＡＭ合成酵素活性を欠損させることによっても、微生物のＬ−メチオニン生産能を上昇させることができるが、その場合は微生物を培養する培地にＳＡＭを含有させる必要があるので、ＳＡＭ合成酵素活性を弱化させることが好ましい。ここで、「ＳＡＭ合成酵素活性を弱化させる」とは、微生物細胞タンパク質当たりのＳＡＭ合成酵素の比活性が、野生型ＳＡＭ合成酵素を保持する株よりも低いことをいう。具体的には、弱化の程度は、野生株のＳＡＭ合成酵素に比べて８０〜５０％、好ましくは５０〜３０％、より好ましくは３０〜１０％程度が挙げられる。E. coliでは、ＳＡＭ合成酵素の比活性が１０％より低下すると、細胞分裂が阻害されることが示唆されている（Newman, E. B. et al., J. Bacteriol., 180, 3614-3619 (1998)）。
【００４３】
ＳＡＭ合成酵素活性が弱化した微生物は、酵素タンパク質当たりの比活性が低下したＳＡＭ合成酵素（弱化型ＳＡＭ合成酵素）を産生するものであってもよいし、ＳＡＭ合成酵素遺伝子の転写効率又は翻訳効率が低下したことにより、酵素の発現効率が低下したものであってもよい。
【００４４】
ＳＡＭ合成酵素活性が弱化した変異株は、親株をDL-ノルロイシン（ＮＬ）存在下で、例えば0.1g/lのＮＬを含む培地で培養し、生育する株を選択することにより、取得することができる。ＮＬによる選択は、複数回繰り返してもよい。また、DL-ノルロイシンの代わりにエチオニン又はγ−グルタミルメチルエステルを用いることも可能である。
【００４５】
弱化型ＳＡＭ合成酵素を保持する変異株は、上記のようにして得られるＳＡＭ合成酵素弱化株から弱化型ＳＡＭ合成酵素遺伝子をクローニングし、同変異型遺伝子で微生物染色体上の野生型ＳＡＭ合成酵素遺伝子を置換することによっても、取得することができる。ＳＡＭ合成酵素遺伝子の遺伝子置換は、前記のmetJ遺伝子と同様にして行うことができる。E. coliのＳＡＭ合成酵素遺伝子（metK）は、その塩基配列が知られているので（Blattner, F. R. et al., Science, 277, 1453-1462 (1997)）、該塩基配列に基づいて作製したプライマーを用いたＰＣＲにより、染色体ＤＮＡから単離することができる。そのようなプライマーとして具体的には、配列番号１１及び配列番号１２に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。得られたmetK遺伝子に変異が生じていることは、該遺伝子の塩基配列を決定し、公知の野生型metK遺伝子の塩基配列と比較することにより、確認することができる。
【００４６】
弱化型ＳＡＭ合成酵素をコードする遺伝子として具体的には、配列番号１８に示すアミノ酸配列において、３０３番目のイソロイシンがロイシンに置換する変異、１８５番目のバリンがグルタミン酸に置換する変異、３７８番目のアルギニン以降がアラニン−メチオニン−ロイシン−プロリン−バリン（配列番号２９）からなる配列に変化する変異のいずれかに相当する変異を有するＳＡＭ合成酵素が挙げられる。
【００４７】
＜４＞Ｌ−スレオニン要求性
微生物にＬ−スレオニン要求性を付与することにより、Ｌ−メチオニン生産能を向上させることができる。Ｌ−スレオニン要求性を示す微生物として具体的には、Ｌ−ホモセリンからＬ−スレオニンに至るＬ−スレオニン生合成の固有経路に関与する酵素にいずれかが欠損した微生物が挙げられる。E. coliにおいては、Ｌ−スレオニンの生合成に関与する酵素の遺伝子は、スレオニンオペロン（thrABC）として存在し、thrBC部分を欠失させることによってＬ−ホモセリン以降の生合成能を失ったＬ−スレオニン要求株を取得することができる。尚、thrA遺伝子はＬ−メチオニン及びＬ−スレオニンの共通経路の酵素であるアスパルトキナーゼのアイソザイムの一つをコードしており、欠失させないことが好ましい。
【００４８】
thrBCを欠失させるには、染色体ＤＮＡ上のスレオニンオペロン中のthrBC部分を破壊すればよい。thrBCの破壊は、一部を欠失したthrBCで微生物染色体上のthrBC部分を置換することによって行うことができる。thrBCの遺伝子置換は、前記metJ遺伝子の遺伝子置換と同様に行えばよい。欠失を含むthrBCは、E. coli染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号１及び２に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲによりthrB遺伝子の上流部分を含む約１ｋｂの断片を増幅し、同様に配列番号３及び４に示す塩基配列を有するプライマーを用いてＰＣＲによりthrC遺伝子の下流部分を含む約１ｋｂの断片を増幅し、これらの増幅断片を連結することによって取得することができる。
【００４９】
＜５＞Ｌ−メチオニンの製造
上記のようにして得られるＬ−メチオニン生産能を有する微生物を培地に培養し、該培地中にＬ−メチオニンを生産蓄積せしめ、これを該培地から採取することにより、Ｌ−メチオニンを製造することができる。
【００５０】
使用する培地は、微生物に応じて従来より用いられてきた周知の培地を用いてかまわない。つまり、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。本発明を実施するための特別な培地は必要とされない。
【００５１】
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類等を用いることができる。
【００５２】
窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。
【００５３】
有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−スレオニン、Ｌ−チロシンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００５４】
培養は、利用される微生物に応じて従来より用いられてきた周知の条件で行ってかまわない。例えば、好気的条件下で１６〜１２０時間培養を実施するのがよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
【００５５】
培養終了後の培地液からのＬ−メチオニンの採取は、本願発明において特別な方法が必要とされることはない。すなわち、本発明は従来より周知となっているイオン交換樹脂法、沈澱法その他の方法を組み合わせることにより実施できる。
【００５６】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００５７】
【実施例１】
エシェリヒア・コリW3110株からのL-スレオニン要求株及びmetJ欠損株の取得
＜１＞欠失を有するthrBC構造遺伝子を含む組換え用プラスミドの調製
ゲノムDNA精製キット（アドバンスドジェネティクテクノロジー社製）を用い、その指示に従ってE. coliの野生型K-12株の誘導体であるW3110株から染色体DNAを調製した。配列表の配列番号１及び配列番号２に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを合成した。これをプライマーとし、前記染色体ＤＮＡを鋳型として、エルリッチらの方法（PCR Technology-Principles and Applications for DNA Amplification, ed. Erlich, H. A., Stockton Press）に従って、ＰＣＲ反応を行い、thrB遺伝子の上流部分を含む約１ｋｂの断片の増幅を行った。この増幅断片は、両端にプライマーに由来するEcoRI及びSalIの認識配列が導入されている。得られた増幅断片を、導入した認識部位を切断する制限酵素で切断した。
【００５８】
同様に、配列番号３及び配列表番号４に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、thrC遺伝子の下流部分を含む約１ｋｂの断片の増幅を行った。この増幅断片は、両端にプライマーに由来するSalI及びHindIIIの認識配列が導入されている。得られた増幅断片を、導入した認識部位を切断する制限酵素で切断した。上記２つの増幅断片と、EcoRI及びHindIIIで切断したpHSG398（宝酒造社製）とを、ライゲーションキット（宝酒造）を用いて連結し、E. coli JM109コンピテントセル（宝酒造）を形質転換した。形質転換体からプラスミドを、プラスミド抽出機PI-50（倉敷紡績社製）を用いてアルカリ法（Boirnboim, H. C. et al., Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523 (1979)）に基づいて調製した。得られた組換えプラスミドから、EcoRI及びHindIII認識部位に２つの断片がSalI認識部位を介して挿入されたプラスミドを、挿入断片の長さによって選択した。このプラスミドは、thrBCの構造遺伝子の上流と下流を含んでおり、thrBCの構造遺伝子のほぼ全長が欠失した遺伝子断片を含んでいる。
【００５９】
＜２＞遺伝子組換えによるthrBC構造遺伝子欠損株の作製
上記プラスミドと、特願平９−１９４６０３号に記載の温度感受性複製起点を有するプラスミドpMAN997を、EcoRI及びHindIIIで切断した後、これらを連結し、得られた組換えプラスミドでE. coli JM109株を形質転換した。形質転換体からプラスミドを抽出し、pMAN997にthrBC欠失遺伝子断片が挿入された構造を有するものを選択し、pMANΔBCとした。このプラスミドを用いてW3110株を形質転換し、常法に従って遺伝子組換えを行った。すなわち、組換え株の選択は、Ｍ９培地（Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, A.3 (1989)）におけるL-スレオニン要求性によって行い、得られたL-スレオニン要求株をWΔBC株とした。
【００６０】
＜３＞W3110株及びWΔBC株からのmetJ欠損株の作製
次に、W3110株染色体DNAを鋳型とし、配列番号５及び配列番号６記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、metB遺伝子を含む約１ｋｂの断片の増幅を行った。この増幅断片は、両端にEcoRI及びSphIの認識配列が導入されている。得られた増幅断片を、導入した認識部位を切断する制限酵素で切断した。
【００６１】
同様に配列番号７及び配列番号８に記載の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、metJ遺伝子の下流部分を含む約１ｋｂの断片の増幅を行った。この増幅断片は、両端にHindIII及びEcoRIの認識配列が導入されている。得られた増幅断片を、導入した認識部位を切断する制限酵素で切断した。
【００６２】
次に、配列番号９に示した、両端にSphI及びHindIII認識部位を有し、スレオニンオペロンのプロモーター配列を有する配列を、配列番号１０に示した相補鎖とともに合成し、これらをアニールさせた後に、制限酵素SphI及びHindIIIで切断した。このようにして得たスレオニンプロモーター断片と、EcoRIで切断したpHSG298（宝酒造社製）と、前記２つのPCR増幅断片とを混合した後、連結反応を行った。この連結反応液で、JM109株を形質転換し、形質転換体からプラスミドを抽出した。得られた組換えプラスミドから、４者が連結されたプラスミドを選択した。このプラスミドは、metJの構造遺伝子が欠失し、metBLオペロンのプロモーターがスレオニンプロモーターに置き換わった構造を有している。
【００６３】
上記で得られたプラスミド、及び特願平９−１９４６０３号に記載の温度感受性複製起点を有するプラスミドpMAN997をEcoRIで切断し、ライゲーションを行い、pMAN997にmetJ欠失断片が挿入された構造を有するものを選択し、pMANΔJとした。このプラスミドを用いてW3110株及びWΔBC株を形質転換し、常法に従って遺伝子組換えを行った。得られた組換え株は、菌体から調製したＤＮＡを鋳型とし、配列番号６及び配列番号８に示したオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法による増幅産物の長さで選択した。W3110株及びWΔBC株から得られたmetJ欠失株を、それぞれWΔJ株及びWΔBCΔJ株とした。
【００６４】
組換えによるmetJ欠失の効果を確認するため、菌体から粗酵素抽出液を調製し、ＨＴＳ及びシスタチオニン合成酵素の活性を測定した。W3110株とWΔJ株を２mlのLB培地に植菌し、37℃で一晩培養した。この培養液１mlを5,000rpmで10分間遠心分離し、菌体を0.9%の食塩水で２度洗浄した。得られた菌体を１mlの0.9%食塩水に懸濁し、そのうちの0.5mlを、50mlの5mMのL-メチオニンを含むデイビス−ミンジオリ最少培地（Davis, B. D., and Mingioli, E. S., J. Bacteriol. 60, 17-28 (1950)）に植菌した。これを37℃で24時間培養し、培養液を8,000rpmで10分間遠心分離し、菌体を0.9%食塩水で２度洗浄した。菌体を3mlの１mMジチオスレイトールを含む50mMリン酸カリウムバッファー（pH7.5）に懸濁した。この懸濁液を超音波破砕機（久保田社製）を用いて、４℃にて150Wで５分間細胞破砕処理を行った。破砕液を15,000rpmで30分間遠心処理した上清をセファデックスG-50カラム（ファルマシア社製）にて脱塩処理したものを粗酵素抽出液とした。粗酵素抽出液中のＨＴＳ活性とシスタチオニン合成酵素の活性を測定した。
【００６５】
ＨＴＳ活性は、粗酵素抽出液5μlを0.1Mリン酸カリウム（pH7.5）、１mMサクシニルコエンザイムA（シグマ社製）、0.2nM DL-[14C]ホモセリン（室町化学工業社製）、及び0.2mM L-ホモセリンからなる反応液に加えて50μlとし、30℃で10分間反応を行った。反応液1μlを、セルロースプレート（メルク社製）にスポットし、アセトン、ブタノール、水、ジエチルアミンを１０：１０：５：２の割合で含む添加溶媒で展開した。プレートを風乾した後、イメージアナライザー（富士写真工業社製）にてオートラジオグラフィーを行った。
【００６６】
シスタチオニン合成酵素は、Ｌ−システイン非存在下ではＯ−サクシニルホモセリンをα−ケト酪酸、アンモニア及びコハク酸を生じることが知られており、簡便な検出方法として利用できる（Holbrook, E. L. et al., Biochemistry 29, 435-442 (1990)）。粗酵素抽出液１００μlを、0.2Mトリス−塩酸（pH8）、5mMＯ−サクシニルホモセリン（シグマ社製）、及び0.25mMピリドキサルリン酸（シグマ社製）からなる反応液に加え1mlとし、37℃で20分間反応を行った後氷冷した。この反応液中のＯ−サクシニルホモセリンを逆相ＨＰＬＣ（ジーエルサイエンス社製）で定量し、粗酵素抽出液非添加の反応液から減少したＯ−サクシニルホモセリン量を算出した。ピリドキサルリン酸非添加の反応を同時に行い、ピリドキサルリン酸依存のＯ−サクシニルホモセリン減少を、シスタチオニン合成酵素活性とした。
【００６７】
上記のようにして測定したＨＴＳ活性とシスタチオニン合成酵素のそれぞれの比活性の測定結果を表１に示した。ＨＴＳ活性はW3110株ではL-メチオニン添加の効果によりほとんど検出されないが、WΔJ株においては顕著な活性を示した。シスタチオニン合成酵素活性も、WΔJ株においてはW3110株に比して顕著な増大が認められた。これらの結果から組換えによるmetJ欠失とmetBLオペロンのプロモーター置換の効果が確認された。
【００６８】
【表１】
【実施例２】
W3110株からのmetK変異株の取得
W3110株をＬＢ培地（Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning A Laboratory Manual/Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, A.1 (1989)）にて37℃で一晩培養した。培養した培養液１mlを5,000rpmで10分間遠心分離し、菌体を0.9%の食塩水で２度洗浄した。得られた菌体を100μlの0.9%食塩水に懸濁し、そのうちの10μlを５mlの0.1g/lのDL-ノルロイシン（ＮＬ）を含むデイビス−ミンジオリ最少培地に植菌した。これを３７℃で５日間培養した。
【００７０】
生育してきたコロニーの幾つかをLB寒天培地上でコロニー分離し、再度0.1g/lのＮＬを含むデイビス−ミンジオリ最小培地での生育を確認し、12株のＮＬ耐性株を選抜した。これらの耐性株から染色体DNAを調製した。これを鋳型として配列番号１１及び１２に示す配列を有する２種のプライマーを用いてPCR反応を行いmetK遺伝子の増幅を行った。この増幅断片の塩基配列を、配列番号１１及び１２に示した増幅用プライマー、及び配列番号１３、１４、１５、及び１６に示す配列を有するプライマーを用いて決定した。塩基配列の決定はダイターミネーターサイクルシークエンシングキット（パーキンエルマー社製）を用いて、373S型DNAシークエンサー（パーキンエルマー社製）にてそれぞれの指示に従って行った。対照として決定した野生株W3110の塩基配列はブラットナーらが報告しているmetKの配列（Blattner, F. R. et al., Science, 277, 1453-1462 (1997)）と完全に一致した。この配列を配列番号１７に示した。また、この配列がコードし得るＳＡＭ合成酵素のアミノ酸配列を配列番号１８に示した。
【００７１】
ＮＬ耐性株のうち、metKの構造遺伝子中に変異点が見いだされたものは１２株の内３株あり、これらをWNL2、WNL24、及びWNL32と名付けた。これらの変異株のmetK塩基配列は、配列番号１７に示す野生型の塩基配列上で、WNL2株では９０７番目のアデニンがシトシンに、WNL24株では５５４番目のチミンがアデニンに、WNL32株では1132番目のシトシン塩基の欠失が認められた。この結果、配列番号１８に示したＳＡＭ合成酵素のアミノ酸配列において、WNL2株のＳＡＭ合成酵素は３０３番目のイソロイシンがロイシンに、WNL24株では１８５番目のバリンがグルタミン酸に、WNL32株では１塩基欠失によって３７８番目のアルギニン以降がアラニン−メチオニン−ロイシン−プロリン−バリンからなる配列に変化していることが明らかとなった。これらの株はＳＡＭ合成酵素活性が弱化していることが推定された。
【００７２】
【実施例３】
metK変異の導入と野生型metA遺伝子の増幅によるL-メチオニン生産
（１）WΔBCΔJ株へのmetK変異の導入
metK遺伝子変異株であるWNL2株、WNL24株、及びWNL32株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号１９及び配列番号２０記載のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、metK遺伝子を含む約2.5kbの断片の増幅を行った。この増幅断片は両端にHindIIIの認識配列が導入されている。得られた増幅断片をそれぞれHindIIIで切断した。HindIIIで切断したpSTV28（宝酒造社製）及びPCR増幅断片を混合後連結反応を行い、JM109株を形質転換した。形質転換体からプラスミドを抽出した。得られた組換えプラスミドからPCR増幅断片が挿入されたプラスミドを選択した。これらのプラスミドはmetKの構造遺伝子に変異を有していることを塩基配列を決定し確認した。
【００７３】
これらのプラスミドのHindIII切断断片を、HindIIIで切断したpMAN997にクローニングし、それぞれpMANK-2，pMANK-24，pMANK-32と名付けた。これらのプラスミドを用いてWΔBCΔJ株を形質転換し、常法に従って遺伝子組換えを行った。組換え株から染色体DNAを抽出して鋳型とし、配列番号１１及び配列番号１２に示したオリゴヌクレオチドをプライマーとしたＰＣＲ法による増幅産物の塩基配列を調べた。それぞれの変異が認められたものを選択した。得られたWΔBCΔJ株由来のmetK変異株をそれぞれWΔBCΔJK-2株、WΔBCΔJK-24株、及びWΔBCΔJK-32株とした。
【００７４】
（２）metA遺伝子の増幅
W3110株染色体DNAを鋳型とし、配列番号２１及び配列番号２２記載の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲ反応を行い、metA遺伝子を含む約１kbの断片の増幅を行った。この増幅断片は両端にそれぞれSphI及びSalIの認識配列が導入されている。得られた増幅断片を、導入した認識部位を切断する制限酵素で切断した。これをSphI及びSalIで切断したpHSG398にクローニングした。挿入断片の塩基配列を配列番号２１及び２２に示した増幅用プライマー、並びに配列番号２３及び２４に示す配列を有するプライマーを用いて決定した。決定した野生株W3110のmetAの塩基配列はブラットナーらが報告しているmetAの配列（Blattner, F. R. et al., Science, 277, 1453-1462 (1997)）と完全に一致した。この配列を配列番号２５に示した。また、この配列がコードし得るＨＴＳのアミノ酸配列を配列番号２６に示した。
【００７５】
このプラスミドのSphI及びSalIによる切断物、実施例１に記載のスレオニンプロモーターのHindIII及びSphIによる切断物、及びHindIII及びSalIで切断したpMW118（日本ジーン社製）を混合後、連結反応を行った。この反応液でJM109株を形質転換し、形質転換体からプラスミドを抽出した。得られた組換えプラスミドから３者が連結されたプラスミドを選択した。このプラスミドはスレオニンプロモーターの下流にmetA遺伝子が配置されており、スレオニンプロモーターによりmetAが発現する構造をとっている。このプラスミドをpMWPthmetA-Wと名付けた。このプラスミドを用いてW3110株、WΔBC株、WΔBCΔJ株、WΔBCΔJK-2株、WΔBCΔJK-24株、及びWΔBCΔJK-32株を形質転換し、形質転換体を得た。
【００７６】
各形質転換体を50mg/lのアンピシリンを含むLBプレート上、37℃で一晩培養した。菌体をグルコース40g/l、硫酸マグネシウム1g/l、硫安16g/l、リン酸二水素カリウム１g/l、酵母抽出物（Bacto Yeast-Extract (Difco)）2g/l、硫酸マンガン0.01g/l、硫酸鉄0.01g/l、炭酸カルシウム30g/l、アンピシリン50mg/l、Ｌ−スレオニン0.5g/lを含むpH7の培地20mlに植菌し、37℃で48時間培養した。
【００７７】
培養物から菌体を除き、アミノ酸分析計（日立社製）にてＬ−メチオニン量を測定した。この結果を表３に示した。W3110株では認められなかったＬ−メチオニンが、WΔBC株、WΔBCΔJ株において増加した。metKの変異は、WΔBCΔJK-2株ではＬ−メチオニン量は低下したものの、WΔBCΔJK-32株においては同等、WΔBCΔJK-24株では上昇が認められ、Ｌ−メチオニン生産に効果が認められた。プラスミドpMWPthrmetA-Wを保持したWΔBCΔJK-24株は、プライベートナンバーAJ13425が付与され、平成１０年５月１４日より、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-8566 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に寄託されており、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１６８０８が付与されている。
【００７８】
【表２】
【実施例４】
metA変異株及び阻害解除型metA遺伝子の取得
W3110株を２mlのLB培地に植菌し、37℃で８時間培養した。この培養液１mlを5,000rpmで10分間遠心分離し、菌体を0.9%の食塩水で２度洗浄した。得られた菌体を１００μlの０．９%食塩水に懸濁し、そのうちの５μlを５mlの１g/lのα-メチル-DL-メチオニン（ＭＭ）を含むデイビス−ミンジオリ最少培地に植菌した。これを37℃で３日間培養した。この培養液を適当に希釈の後、１g/lのＭＭを含むデイビス−ミンジオリ最少培地に塗布し、37℃で一晩培養した。生育してきたコロニーの幾つかをLB寒天培地上でコロニー分離し、再度１g/lのＭＭを含むデイビス−ミンジオリ最小培地での生育を確認した。この操作を９回独立に行い、６個の独立した耐性株を得て，それぞれをWMM4、WMM5、WMM6、WMM7、WMM8、及びWMM9と名付けた。
【００８０】
これらの耐性株から染色体DNAを調製した。これを鋳型として配列番号２１及び２２に示す配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ反応を行いmetA遺伝子の増幅を行った。この増幅断片の塩基配列を配列番号２１及び２２に示した増幅用プライマー、並びに配列番号２３及び２４に示す配列を有するプライマーを用いて決定した。耐性株のmetA塩基配列は、配列番号２５に示す野生型metAの塩基配列上で、WMM4株では887番目のチミンがグアニンに、WMM5株では893番目のシトシンがチミンに、WMM6株では野生型、WMM7及びWMM8株では886番目から890番目の塩基に相当するATCTCなる配列が反復して存在しその間に約1300塩基からなるIS2と呼ばれる挿入配列（Ghosal, D. et al., Nucleic Acids Res. 6, 1111-1122 (1979)）が存在し、WMM9株では79番目のシトシンがチミンに変化していた。この結果、配列番号２６に示したＨＴＳのアミノ酸配列において、WMM4株のＨＴＳは296番目のイソロイシンがセリンに、WMM5株では298番目のプロリンがロイシンに、WMM7及びWMM8株では挿入配列によって298番目のプロリン以降がアルギニン−ロイシン−アラニン−プロリンからなる配列に、WMM9株では27番目のアルギニンがシステインに変化していることが明らかとなった。
【００８１】
metA構造遺伝子に変異が認められたWMM4、WMM5、WMM9、及びWMM7株をLB培地にて37℃で一晩試験管培養した培養液１mlを5,000rpmで10分間遠心した後、１mlの0.9%の食塩水で２度洗浄した。これを１mlの0.9%の食塩水に懸濁し、0.5mlを50mlの最少培地に植菌し、37℃で一日培養した。培養液を8,000rpmで10分間遠心した後、１mlの0.9%の食塩水で２度洗浄した。得られた菌体を３mlの50mMリン酸カリウム（pH7.5）、１mMジチオスレイトールからなる緩衝液に懸濁し、実施例１に示したのと同じ操作を行い粗酵素抽出液を得た。粗酵素抽出液中のＨＴＳ活性を、阻害剤の存在下で実施例１に記載の反応組成で測定した結果を、表２に示した。WMM7株については活性を検出することが出来なかったが，これは挿入配列によるアミノ酸配列の変化により比活性が大きく低下したものと考えられた。それ以外の株の比活性は野生株の約１／４程度であった。ＭＭによる阻害はWMM4、WMM5、及びWMM9株のいずれにおいても解除されており、L-メチオニンによる阻害もかなり緩和していた。ＳＡＭによる阻害はWMM9株でほとんど解除が認められなかったが、WMM4及びWMM5株では解除する傾向が認められた。野生株ＨＴＳ活性に最も強力な阻害を示したL-メチオニン及びＳＡＭの組合わせもWMM4及びWMM5株で顕著な緩和が認められた。
【００８２】
【表３】
【実施例５】
変異型metAの導入によるL-メチオニン生産
実施例４で得られたmetAの変異株のうち、WMM9株、WMM4株、及びWMM5株の染色体DNAを鋳型とし、配列番号２１及び配列番号２２記載の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてそれぞれＰＣＲ反応を行い、metA遺伝子を含む断片を増幅した。この増幅断片は、両端にSphI及びSalIの認識配列が導入されている。この増幅断片の両端をSphI及びSalIで切断し、SphI及びSalIで切断したpHSG398にクローニングした。挿入断片の塩基配列を決定し、変異点を確認した。このプラスミドのSphI及びSalIによる切断物、実施例１に記載のスレオニンプロモーターのHindIII及びSphIによる切断物、及びHindIII及びSalIで切断したpMW118（日本ジーン社製）を混合後、連結反応を行った。この反応液でJM109株を形質転換し、形質転換体からプラスミドを抽出した。得られた組換えプラスミドから３者が連結されたプラスミドを選択した。これらをそれぞれpMWPthrmetA-9、pMWPthrmetA-4、及びpMWPthrmetA-5と名付けた。
【００８４】
さらに各変異型metA遺伝子の変異点を組合わせるため、部位特異的変異導入をMutan-Super Express Km（宝酒造社製）を用いてその指示に従って行った。配列番号２７記載の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、metA-4変異にmetA-9変異を組合わせてpMWPthrmetA-9+4を作製した。同様にmetA-5変異にmetA-9変異を組合わせてpMWPthrmetA-9+5を作製した。さらに配列番号２８記載の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いて、metA-9変異にmetA-4及びmetA-5変異を組合わせてpMWPthrmetA-9+4+5を作製した。
【００８５】
これらのプラスミドを用いてWΔBCΔJK-32株を形質転換し、形質転換体を得た。各形質転換体を、50mg/lのアンピシリンを含むLBプレート上、37℃で一晩培養した。菌体をグルコース40g/l、硫酸マグネシウム１g/l、硫安16g/l、リン酸二水素カリウム１g/l、酵母抽出物（Bacto Yeast-Extract (Difco) 2g/l、硫酸マンガン0.01g/l、硫酸鉄0.01g/l、炭酸カルシウム30g/l、アンピシリン50mg/l、Ｌ−スレオニン0.5g/lを含むpH7の培地20mlに植菌し、37℃で48時間培養した。培養物から菌体を除き、アミノ酸分析計（日立社製）にてＬ−メチオニン量を測定した。この結果を表４に示した。Ｌ−メチオニン蓄積量は、野生型metAを導入した株に比べて、変異型のmetAを導入した株では数倍増加した。さらに変異を組合わせることによって、Ｌ−メチオニン生産量のさらなる増加が認められた。
【００８６】
【表４】
【発明の効果】
本発明により、Ｌ−メチオニン生産能を有する微生物が提供される。同微生物は、Ｌ−メチオニン生産菌として、また、Ｌ−メチオニン生産菌の育種の材料として利用することができる。
本発明の変異型metA遺伝子は、Ｌ−メチオニン及びＳＡＭによる協奏阻害が解除されているので、Ｌ−メチオニン生産菌の育種に利用することができる。
【００８８】
【配列表】
Claims (8)
- ホモセリントランスサクシニラーゼをコードする遺伝子のコピー数を高めること、又は同遺伝子の発現調節配列を増強することによって細胞内のホモセリントランスサクシニラーゼ活性が増強され、Ｌ−スレオニン要求性を示し、かつ、Ｌ−メチオニン生産能を有する微生物。
- Ｌ−スレオニン要求性が、ｔｈｒB遺伝子及びｔｈｒC遺伝子の欠失による、請求項１に記載の微生物。
- さらに、Ｌ−メチオニン生合成系のリプレッサーを欠損し、かつ、シスタチオニンγ−シンテースをコードする遺伝子、およびアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼ II をコードする遺伝子のコピー数を高めること、又はこれらの遺伝子の発現調節配列を増強することによって細胞内のシスタチオニンγ−シンテース活性及びアスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナーゼII活性が増強された、請求項１または２に記載の微生物。
- 配列番号２６に示すアミノ酸配列において、27位のアルギニンがシステインに置換する変異、296位のイソロイシンがセリンに置換する変異、又は298位のプロリンがロイシンに置換する変異のいずれかに相当する変異を有するＬ−メチオニンとＳ−アデノシルメチオニンによる協奏阻害が解除されたホモセリントランスサクシニラーゼを保持する請求項１〜３のいずれかに記載の微生物。
- さらに、配列番号１８に示すアミノ酸配列において、３０３番目のイソロイシンがロイシンに置換する変異、１８５番目のバリンがグルタミン酸に置換する変異、３７８番目のアルギニン以降がアラニン−メチオニン−ロイシン−プロリン−バリンからなる配列に変化する変異のいずれかに相当する変異を有するＳ−アデノシルメチオニンシンテテースを保持することにより、細胞内のＳ−アデノシルメチオニンシンテテース活性が弱化した請求項３または４に記載の微生物。
- エシェリヒア属に属することを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の微生物。
- 請求項１〜６のいずれか一項に記載の微生物を培地に培養し、培地中にＬ−メチオニンを生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特徴とするＬ−メチオニンの製造法。
- 配列番号２６に示すアミノ酸配列において、27位のアルギニンがシステインに置換する変異、296位のイソロイシンがセリンに置換する変異、298位のプロリンがロイシンに置換する変異、27位のアルギニンがシステインに置換しかつ296位のイソロイシンがセリンに置換する変異、296位のイソロイシンがセリンに置換しかつ298位のプロリンがロイシンに置換する変異、298位のプロリンがロイシンに置換しかつ27位のアルギニンがシステインに置換する変異、又は、27位のアルギニンがシステインに置換し、296位のイソロイシンがセリンに置換しかつ298位のプロリンがロイシンに置換する変異のいずれかに相当する変異を有するアミノ酸配列を有し、Ｌ−メチオニンとＳ−アデノシルメチオニンによる協奏阻害が解除されたホモセリントランスサクシニラーゼをコードするＤＮＡ。
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