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KR100905381B1 - Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법 - Google Patents

Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 ｌ-메치오닌전구체로부터의 ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법 Download PDF

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KR100905381B1
KR100905381B1 KR1020070076045A KR20070076045A KR100905381B1 KR 100905381 B1 KR100905381 B1 KR 100905381B1 KR 1020070076045 A KR1020070076045 A KR 1020070076045A KR 20070076045 A KR20070076045 A KR 20070076045A KR 100905381 B1 KR100905381 B1 KR 100905381B1
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최경오
장진숙
조영욱
박영훈
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Abstract

본 발명은 L-메치오닌 전구체를 생산할 수 있는 균주를 제작하고, 이 균주를 배양하여 미생물 발효법을 통하여 L-메치오닌 전구체를 생산하는 단계; 및 상기 L-메치오닌 전구체의 효소 반응 공정으로 L-메치오닌 및 유기산을 생산하는 2단계로 구성된 L-메치오닌 및 유기산 생산 방법과 각 단계에서 사용되는 미생물 균주에 관한 것이다.
L-메치오닌, L-메치오닌 전구체, O-숙시닐-L-호모세린, O-아세틸-L-호모세린, 메칠머캅탄, 전환 효소, 숙신산, 아세트산

Description

Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 상기 Ｌ-메치오닌 전구체로부터의 Ｌ-메치오닌 및 유기산의 생산방법{MICROORGANISM PRODUCING L-METHIONINE PRECURSOR AND METHOD OF PRODUCING L-METHIONINE AND ORGANIC ACID FROM THE L-METHIONINE PRECUROSR}
본 발명은 L-메치오닌 및 유기산 생산 방법에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명에 따라 제조된 L-메치오닌 전구체 생산 균주를 사용하여 제조된 L-메치오닌 전구체로부터 효소 전환 반응을 이용하여 L-메치오닌 및 유기산을 고수율로 생산함으로써 기존의 방법에 비하여 환경친화적인 방법으로 L-메치오닌을 생산하고, L-메치오닌을 선택적으로 생산함으로써 사료 및 식품 첨가제, 의약용 및 의약품의 원료 등의 다양한 분야에 널리 사용하기 위한 것이다.
메치오닌은 생체내의 필수 아미노산의 한 종류로 사료 및 식품 첨가제로 널리 사용되며, 의약용으로 수액제, 의약품의 합성 원료로도 사용된다. 메치오닌은 콜린(레시틴)과 크레아틴과 같은 화합물의 전구체로 작용하며 시스테인과 타우린의 합성원료로도 쓰인다. 또한, 황을 제공하는 역할을 한다. S-아데노실-메치오닌은 L-메치오닌으로부터 유래하며 생체내에서 메칠기를 제공하는 역할을 하며 뇌의 다 양한 신경전달물질(neurotransmitter) 합성에 관련되어 있다. 메치오닌 및/또는 S-아데노실-L-메치오닌(SAM)은 생체 내에서 간과 동맥에서 지방축적을 억제하고 우울, 염증, 간질환, 근육통을 완화하는 등의 다양한 역할을 한다.
지금까지 알려진 메치오닌 및/또는 S-아데노실-L-메치오닌의 생체내 역할은 다음과 같다.
1) 지방대사를 촉진하는 간과 동맥에서 지방 침착을 억제하며, 뇌, 심장, 신장의 혈류를 증진시키는 역할을 한다(J Hepatol. Jeon BR et al., 2001 Mar; 34(3): 395-401).
2) 소화를 촉진하고, 독성물질의 해독과 배설을 촉진, 납과 같은 중금속의 배설을 촉진한다.
3) 메치오닌은 하루 매일 800-1,600mg의 투여로 우수한 항우울제가 된다고 알려져 있다(Am J Clin Nutr. Mischoulon D. et al., 2002 Nov; 76(5): 1158S-61S).
4) 간질환에서 간기능 향상 작용을 한다(FASEB J. Mato JM., 2002 Jan; 16(1): 15-26). 특히 알코올에 의한 간질환에 효과적이다(Cochrane Database Syst Rev., Rambaldi A., 2001; (4): CD002235).
5) 골관절 질환에 항염효과가 좋고 관절회복을 촉진한다(ACP J Club. Sander O., 2003 Jan-Feb; 138(1): 21, J Fam Pract., Soeken KL et al., 2002 May; 51(5): 425-30).
6) 메치오닌은 머리카락에 필수영양소이다. 잘 부서지는 머리카락에 영양을 공급하고 탈모를 방지한다(Audiol Neurootol., Lockwood DS et al., 2000 Sep-Oct; 5(5): 263-266).
메치오닌은 상기와 같이 동물 사료를 비롯한 식품과 의약품에서 이용하기 위해서 화학합성과 생물학적 합성을 통하여 생산할 수 있다.
화학합성은 주로 5-(β-메틸머캅토에틸)하이단토인(5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin)을 가수분해시키는 반응을 통하여 L-메치오닌을 생산한다. 그러나 이런 화학 합성을 통하여 생산된 메치오닌은 L-형과 D-형이 혼합된 형태로 생산된다는 단점이 있다.
생물학적 합성은 메치오닌 생성에 관여하는 단백질을 이용하는 방법이다. L-메치오닌은 metA, metB, metC, metE, metH 유전자로부터 발현되는 효소 단백질의 작용에 의하여 호모세린에서 메치오닌으로 생합성된다. 구체적으로, metA는 메치오닌 생합성의 첫 번째 효소인 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라제(homoserine O-succinyltransferase)를 코딩하는 유전자로 호모세린을 O-숙시닐-L-호모세린으로 전환하는 기능을 한다. metB가 코딩하는 O-숙시닐호모세린 리아제(O-succinylhomoserine lyase) , 또는 시스타치오닌 감마 신타아제 효소는 O-숙시닐-L-호모세린을 시스타치오닌(cystathionine)으로 전환하는 기능을 한다. metC가 코딩하는 시스타치오닌 베타 리아제(cystathionine beta lyase) 효소는 시스타치오닌을 L-호모시스테인으로 전환하는 기능을 한다. metE가 코딩하는 코발라민-비의존적 메치오닌 신타제와 metH가 코딩하는 코발라민-의존적 메치오닌 신타제가 L-호모시스테인을 L-메치오닌으로 전환시킨다. 이 때 metF가 코딩하는 5,10-메틸렌테 트라하이드로폴레이트 리덕타제(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase)와 glyA가 코딩하는 세린 하이드록시메틸트랜스퍼라아제(serin hydroxymethytransferase)는 함께 작용하여 L-메치오닌 합성에 필요한 메틸기를 제공하는 N(5)-메틸테트라아하이드로폴레이트(N(5)-methyltetraahydrofolate)를 합성하는 기능을 한다.
L-메치오닌은 상기 효소들에 의한 일련의 유기적인 반응을 통하여 합성되며, 상기 단백질 또는 상기 단백질에 영향을 주는 단백질에 유전적인 조작을 가할 경우 L-메치오닌 합성과 그 조절에 유용하게 이용할 수 있다. 예를 들어, 일본국 공개 특허 공보 제2000/139471호에는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 게놈 유전자상의 thrBC, metJ를 제거하고, metBL을 과발현시키고, metK를 리키형으로 제작하여 L-메치오닌을 생산하는 방법이 기술되어 있다. 또한, 미국 특허 출원 공개 제US2003/0092026 A1호에는 코리네박테리움(Corynerbacterium) 속에 속하며 L-메치오닌 합성의 저해인자인 metD 유전자를 제거한 미생물을 이용하는 방법이 기술되어 있다. 미국 특허 출원 공개 제US2002/0049305호에는 5,10-메틸렌테트라하이드로폴레이트 리덕타제(metF)의 발현을 증가시켜 L-메치오닌 생산을 증가시키는 방법이 기재되어 있다.
2005년 미국 특허 US2005/0054060A1에 의하면 L-메치오닌을 생산하는 미생물을 제작하기 위하여 시스타치오닌 신타아제 (O-succinylhomoserine lyase) 에 변이를 가하여 시스테인을 이용하지 않고 직접 H2S 또는 CH3SH를 이용하여 호모시스테인 또는 메치오닌을 합성하도록 하였다. 이 방법에서는 변이된 시스타치오닌 신타아제를 직접 세포에 도입하여 세포내의 메치오닌 합성과정에 따라 메치오닌을 합성하였다. 그러나, 이 방법에서는 세포내의 메치오닌 대사경로를 이용하기 때문에 효소의 반응 과정이 비효율적이고, H2S 또는 CH3SH가 세포에 독성을 가진다는 점에서 실효성이 떨어지며, 메틸머캅탄(CH3SH)에 대한 기질 선택성이 슈도모나스 또는 크로모박테리움 속 유래의 숙시닐호모세린 리아제에 비하여 매우 낮은 활성을 가지고 있음이 확인되었다.
시스타치오닌 감마 신타아제의 경우 문헌에 의하면 서로 다른 기질과 반응하여 서로 다른 물질을 생산하는 경향이 크다. 시스타치오닌 감마 신타아제는 호모시스테인과 O-숙시닐-L-호모세린을 결합하여 매우 높은 효율로 호모란티오닌이라는 물질을 생산한다는 보고가 있다(J.Bacteriol (2006) vol 188:p609-618). 이와 같이 시스타치오닌 감마 신타아제가 세포내에 존재할 경우 서로 다른 메치오닌 전구체와 결합할 수 있으며 이 결합에 의해 부산물을 만드는 효율성 또한 매우 높다. 특히 시스타치오닌 감마 신타아제를 과발현할 경우 더 많은 부산물을 생성할 가능성이 있어 세포내 반응의 효율은 매우 떨어진다.
또한 기존의 생물학적 합성으로 생산되는 메치오닌은 L 형이라는 장점이 있으나 그 양이 매우 미량이다. 이는 메치오닌의 합성 경로가 매우 잘 조절되는 피드백 조절 시스템을 갖고 있기 때문이다. 메치오닌이 일정 수준이상으로 합성되면 최종 산물인 메치오닌이 메치오닌 합성을 개시하는 초기 단백질 metA 유전자 전사 를 피드백으로 억제한다. metA 유전자는 전사 단계에서는 메치오닌에 의해 저해를 받고 해독 단계에서는 세포내의 단백질 분해효소들에 의해 분해되는 기작으로 메치오닌 양을 조절하므로, metA 유전자 고발현만으로는 메치오닌의 양을 일정수준 이상으로 증가시킬 수 없다 (Dvora Biran, Eyal Gur, Leora Gollan and Eliora Z. Ron : Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli by proteolysis : Molecular Microbiology (2000) 37(6), 1436-1443). 따라서 기존의 많은 특허들은 metA 유전자의 피드백을 해제하는 연구에 치중되어 있다 (WO2005/108561, WO1403813).
또한 생물학적 시스템으로 메치오닌을 생산할 경우 메치오닌의 분해대사 경로인 S-아데노실메치오닌 신타아제에 의하여 생성된 메치오닌이 S-아데노실메치오닌으로 변환된다. S-아데노실메치오닌은 세포에 필수적인 물질로 S-아데노실메치오닌 신타아제를 결손시킬 수 없기 때문에 기존에는 이 유전자를 약화시키는 방향으로 메치오닌 생산을 증가하고자 하는 특허가 출원된 바 있다 (WO2005/108561).
상기 종래기술은 세포내 메치오닌 대사 경로 중 시스타치오닌 감마 신타아제 대사 경로를 이용하기 때문에 효소의 반응 과정이 비효율적이고, 황화물 특유의 기질 독성 문제 및 부산물 생성의 문제점이 있으며, 또한 메치오닌 합성 경로의 피드백 조절에 의하여 충분한 양의 메치오닌을 합성할 수 없다는 문제점이 있다.
따라서, 본 발명은 기존의 생물학적 메치오닌 생산공정을 대체하여 발효에 의한 L-메치오닌 전구체 생산 및 상기 L-메치오닌 전구체의 효소 전환 공정의 2단계 공정을 사용함으로써 종래의 상기한 문제점을 극복한 L-메치오닌의 생산방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 L-메치오닌만을 선택적으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 별도의 생산공정 없이 부산물로서 유기산을 동시에 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 1) L-메치오닌 전구체를 생산할 수 있는 균주를 제작하고, 이 균주를 배양하여 발효에 의해 L-메치오닌 전구체를 생산하는 단계, 2) 생산된 상기 L-메치오닌 전구체를 기질로 이용하여 효소 반응을 일으킴으로써 L-메치오닌 및 유기산을 생산하는 단계로 구성되는 L-메치오닌 및 유기산을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 기존의 생물학적 메치오닌 생산공정을 발효에 의한 L-메치오닌 전구체 생산 공정 및 상기 L-메치오닌 전구체를 효소에 의하여 L-메치오닌으로 전환하는 공정으로 구성되는 2단계 공정으로 나눔으로써, 기존에 문제가 되었던 황화물 특유의 기질 독성 문제, 메치오닌과 SAMe에 의한 균주의 피드백 조절 문제, 시스타치오닌 감마 신타아제 (cystathionine gamma synthase), O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 및 O-아세틸호모세린 설피드릴라 아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 특유의 중간 산물 분해 활성 문제를 모두 해결할 수 있는 획기적 방법이다. 또한 L-메치오닌만을 선택적으로 생산할 수 있어 DL-메치오닌을 동시에 생산하는 기존의 화학 합성 공정에 비하여 우수한 공정이며, 추가적으로 동일한 반응을 통하여 부산물로서 유기산, 보다 구체적으로는 숙신산, 아세트산을 동시에 생산 할 수 있는 매우 우수한 공정이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 2단계 공정으로 구성된 L-메치오닌 및 유기산 생산 방법을 제공한다.
상기의 2단계 공정은 1단계로서 L-메치오닌 전구체를 생산할 수 있는 균주에 의하여 L-메치오닌 전구체를 생산하는 단계; 및 2단계로서 상기 단계로 생산된 L-메치오닌 전구체를 효소 반응에 의하여 L-메치오닌과 유기산을 생산하는 단계로 구성된다.
보다 구체적으로, 상기 1단계 공정은 L-메치오닌 전구체 생산 균주를 제작하고, 이 균주를 이용한 발효법으로 L-메치오닌 전구체를 배양액에 축적하는 공정이다. 이 때, L-메치오닌 전구체 생산균주는 본 발명에 의하여 고안된 방법에 의하여 제작된다. 따라서, 본 발명은 이러한 균주 및 균주의 제조 방법도 포함된다.
상기 L-메치오닌 전구체는 하기의 화학식;
Figure 112007055153336-pat00001
으로 구성된 O-아실호모세린(O-acyl homoserine) 그룹에 해당하며, 여기에서 R 그룹은 C, H, O, N 및 기타 화합물을 포함하는 물질로서 최대 15개의 탄소 분자를 포함하는 그룹이다. 예를 들어, 상기 O-아실호모세린 그룹은 O-아세틸-L-호모세린 (O-Acetyl-L-homoserine), O-숙시닐-L-호모세린 (O-succinyl-L-homoserine), 프로피오닐 호모세린 (Propionyl homoserine), 아세토아세틸 호모세린 (Acetoacetyl homoserine ), 쿠마로일 호모세린 (Coumaroyl homoserine), 말로닐 호모세린 (Malonyl homoserine), 하이드록시메틸글루타릴 호모세린 (Hydroxymethylglutaryl homoserine), 피메릴 호모세린 (Pimelylhomoserine)을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 L-메치오닌 전구체는 바람직하게는, O-아세틸-L-호모세린 (O-Acetyl-L-homoserine) 또는 O-숙시닐-L-호모세린 (O-succinyl-L-homoserine)이다.
본 발명에서 "L-메치오닌 전구체 생산 균주"란 L-메치오닌 전구체를 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 및 진핵 미생물 균주로서, 본 발명에 따른 조작에 의하여 L-메치오닌 전구체를 축적할 수 있는 미생물 균주를 말한다. 예를 들어, L-메치오닌을 생산하는 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacteria) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 렙토스피라(Leptospira) 속, 살모넬라(Salmonellar) 속, 브레비박테리아(Brevibacteria) 속, 하이포모나스(Hypomononas) 속, 크로모박테리움(Chromobacterium) 속 및 노카디아(Norcardia) 속 또는 곰팡이류(fungi) 또는 효모류(yeast)에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 바람직하게는 O-숙시닐-L-호모세린을 생산하기 위하여 슈도모나스속, 노카디아속, 에스케리키아 속의 미생물이 사용될 수 있으며, O-아세틸-L-호모세린을 생산하기 위하여 에스케리키아속, 코리네박테리움속, 렙토스피라속, 효모류 등이 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물 균주, 보다 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli; 이하 E.coli라 함)가 사용될 수 있다. 또한 에스케리키아 속 균주에 외래의 유전자를 도입함으로서 O-숙시닐-L-호모세린 및 O-아세틸-L-호모세린을 선택적으로 생산할 수 있다.
본 발명은 상기의 균주로부터 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린의 분해에 관여하는 유전자를 결손 또는 약화시키고, O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린의 합성에 관여하는 유전자를 도입 또는 강화시킨 균주를 L-메치오닌 전구체 생산 균주로 제공한다. 또한 선택적으로는 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린의 생산 강화를 위하여 쓰레오닌 생합성 경로를 차단 또는 약화한 균주를 제공한다.
보다 상세하게는, 본 발명은 L-메치오닌 전구체 분해에 관여하는 metB 유전자를 결손시키고, 쓰레오닌 생합성 경로에 관여하는 thrB 유전자를 결손시키고, L-메치오닌 전구체 생산 유전자의 전사를 조절하는 metJ 유전자를 결손시킨 균주에, L-메치오닌 전구체를 합성하는데 관여하는 metA 또는 metX 유전자의 발현을 강화시키거나, 또는 metX 유전자를 결손시키고 metA 유전자를 도입시킨 L-메치오닌 전구체 생산 균주를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자의 결손은 유전체 상에서 상기 유전자 부위를 절제하거나 특정 유전자 서열을 삽입하여 단백질 서열을 변형시킴으로서 수행될 수 있으며, 유전자의 약화는 상기 유전자의 프로모터 부위 및 5'-UTR 부위의 염기 서열을 변형시킴으로써 단백질의 발현을 약화시키거나 또는 해당 유전자의 ORF 부위에 변이를 도입함으로서 단백질의 활성을 약화시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유전자의 발현 강화는 상기 유전자의 프로모터 부위 및 5-UTR 부위의 염기 서열에 변형을 시킴으로서 단백질 발현을 강화시킬 수 있으며, 해당 유전자의 ORF 부위에 변이를 도입함으로서 단백질의 활성을 강화시킬 수 있으며, 해당 유전자를 염색체 상에 추가 도입함으로서 발현을 강화시킬 수 있으며, 해당 유전자를 벡터 상에 자가 프로모터 또는 강화된 별개의 프로모터와 함께 도입하여 균주에 형질 전환시킴으로써 단백질의 발현량을 강화시킬 수 있다.
본 발명의 구체적 실시 양태에서, 상기 L-메치오닌 전구체 생산 균주를 제조하는 방법은 다음과 같다;
1단계로서, L-메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 축적할 수 있도록 하기 위하여, 균주로부터 시스타치오닌 감마 신타아제 (cystathionine gamma synthase-) 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 또는 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase)등의 단백질을 코딩하는 유전자를 결손 또는 약화시킨다.
상기 시스타치오닌 감마 신타아제를 코딩하는 유전자를 통칭 metB, O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase)를 코딩하는 유전자를 통칭 metZ, O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase)를 코딩하는 유전자를 통칭 metY로 표기한다. 상기와 같은 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자는 예를 들어, 에스케리키아 콜라이(E.coli)에서 공지되어 있는 metB가 있다. 이는 문헌(Blattner et. al., Science 277 : 1453-1462 (1997))에 의하여 공개된 E.coli의 게놈 서열로부터 얻을 수 있다(Accession no. AAC75876). 또한, 상기 유전자 서열은 미국생물공학정보센터(NCBI) 및 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 같은 데이터베이스로부터도 얻을 수 있다. 이 외에도 같은 활성을 갖는 유전자로서, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속의 metB 및 metY, 슈도모나스(Pseudomonas) 속 유래의 metZ 등이 보고되어 있다.
상기 시스타치오닌 감마 신타아제 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 또는 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제는 하기 반응식에 나타난 바와 같이 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 시스타치오닌 또는 호모시스테인으로 합성하는 활성을 가지고 있다. 따라서 이러한 활성을 가지는 유전자를 결손 또는 약화시킬 경우 O-숙시닐호모세린 또는 O-아세틸호모세린이 배양액에 과량 축적된다.
L-시스테인 + O-숙시닐-L-호모세린 <=> 숙시네이트 + 시스타치오닌
L-시스테인 + O-아세틸-L-호모세린 <=> 아세테이트 + 시스타치오닌
HS- + O-숙시닐-L-호모세린 <=> 숙시네이트 + 호모시스테인
HS- + O-아세틸-L-호모세린 <=> 아세테이트+ 호모시스테인
2단계로서, 제1단계에서 제조된 균주에서 호모세린 키나아제를 코딩하는 thrB 유전자를 약화 또는 결손시킨다. thrB 유전자는 호모세린으로부터 O-포스포호모세린 (O-phosphohomoserine) 을 합성하며, 이는 다시 thrC 유전자에 의하여 쓰레오닌이 된다. 합성된 호모세린이 전량 메치오닌의 전구체 합성에 이용될 수 있도록 하기 위하여 thrB 유전자를 결손 또는 약화시킨다.
3단계로서, metA 유전자의 전사를 조절하는 조절유전자인(regulator) metJ 유전자를 결손 또는 약화시킨다. 메치오닌 전구체의 합성에 관여하는 metA 유전자는 메치오닌에 의하여 피드백 조절을 받는데, 상기 metJ 유전자는 metA 유전자의 전사시에 관여하는 조절 유전자이다. metA가 항상 과량으로 발현되어 높은 활성을 가지고 메치오닌 전구체를 합성할 수 있도록 하기 위해서는metA 유전자의 전사를 조절하는 조절유전자를 제거하는 것이 유리하다. 따라서, E.coli에서 metJ 유전자가 제거되면 metA 유전자의 발현이 항상 촉진된 상태가 되어 L- 메치오닌 전구체를 대량 합성할 수 있다.
상기의 2, 3 단계는 전구체 생산 균주에 따라 달라질 수 있으며 전구체 생산균주를 제작하기 위하여 필수적이지는 않다. 보다 바람직하게는 에스케리키아 속의 미생물에서 전구체 생산 경로를 강화하기 위하여 실시할 수 있다.
4단계로서, 메치오닌 전구체의 합성을 증가시키기 위하여 메치오닌 생합성 경로 중 첫번째 과정을 매개하는 효소인 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라아제 또는 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 metA 유전자 또는metX 유전자의 발현을 강화시킨다. metA 유전자는 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자의 통칭이며, metX 유전자는 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자의 통칭이다. 상기 metA 또는 metX 유전자의 발현을 강화하기 위하여 유전자의 추가 도입 또는 5'-UTR또는 프로모터를 변화시키거나 각 유전자 ORF 에 변이를 도입한다. 이 유전자의 발현을 강화할 경우 L-메치오닌 전구체의 합성이 크게 증가할 수 있다.
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또는, O-숙시닐-L-호모세린을 생산하는 균주로부터 O-아세틸-L-호모세린의 생산을 증가시키기 위하여, 염색체 내에 존재하는 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 metA 유전자를 결손시킬 수 있다. metA 유전자를 결손시켜 O-숙시닐-L-호모세린의 생산을 막고, 추가로 metX 유전자를 도입하여 O-아세틸-L-호모세린을 생산할 경우, metA 유전자가 존재시 metX 유전자를 도입한 경우에 비하여 높은 수율의 O-아세틸-L-호모세린을 생산할 수 있다.
또한, O-아세틸-L-호모세린을 생산하는 균주로부터 O-숙시닐-L-호모세린의 생산을 증가시키기 위하여, 염색체 내에 존재하는 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 metX 유전자를 결손시킬 수 있다. metX 유전자를 결손시켜 O-아세틸-L-호모세린의 생산을 막고 추가로 metA 유전자를 도입하여 O-숙시닐-L-호모세린을 생산할 경우, 더 높은 수율의 O-숙시닐-L-호모세린을 생산할 수 있다.
상기 1 내지 4 단계 중 일부 또는 전체를 도입한 균주를 제작하여 L-메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 축적할 수 있다.
상기 L-메치오닌 전구체 생산 균주는 L-라이신, L-쓰레오닌 또는 L-이소루이신 생산 균주를 이용하여 제조할 수도 있다. 바람직하게는, L-쓰레오닌 생산 균주를 이용하여 제조할 수 있다. 이 경우에는 이미 호모세린까지의 합성이 원할하게 이루어지는 균주로서, 더 많은 양의 메치오닌 전구체를 합성할 수 있다. 따라서, L-쓰레오닌 생산균주를 이용하여 쓰레오닌 합성경로에 관여하는 유전자를 결손 또는 약화시키고, metB 또는 metY, 또는 metZ 유전자를 결손 또는 약화시켜 메치오닌 전구체를 축적할 수 있다. 보다 바람직하게는 thrB 유전자를 결손 또는 약화시킨 후, metB 또는 metY 또는 metZ 유전자를 결손 또는 약화시켜 메치오닌 전구체를 합성할 수 있다. 또한 metA 또는 metX 유전자의 발현을 강화하여 보다 많은 양의 메치오닌 전구체를 합성할 수 있다.
본 발명에서 "L-쓰레오닌 생산 균주"란 L-쓰레오닌을 생물체내에서 생산할 수 있는 원핵 및 진핵 미생물 균주를 말한다. 예를 들어, L-쓰레오닌을 생산하는 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아 (Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 바람직하게는, 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 미생물 균주, 보다 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 가 사용될 수 있다.
또한, L-쓰레오닌 생산 균주는 천연 미생물 균주뿐만 아니라 변이 미생물도 포함한다. 이러한 변이 미생물의 예에는 이소루이신 리키형 요구성, L-라이신 유사체에 대한 내성 및 α-아미노부티릭산 내성을 가지는 미생물; 내재적 포스포에놀 파이루베이트 카르복실레이즈(ppc) 유전자가 게놈 함유된 유전자 외에 추가로 1 카피 이상 염색체 DNA 중에 삽입된 변이 미생물; L-메치오닌 생합성 중간체인 옥살로아세테이트(oxaloacetate, OAA)를 포스포에놀 파이루베이트(PEP)로 전환하는데 관여하는 pckA 유전자가 불활성화된 미생물; L-메치오닌의 생합성에 관여하는 tyrB 유전자의 발현을 억제하는 tyrR 유전자가 불활성화된 미생물; 및 당전달에 관련된 galP 유전자의 발현을 억제하는 galR 유전자가 불활성화된 미생물이 포함된다. 상기 L-라이신 유사체는 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 및 δ-메틸-L-라이신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물일 수 있다.
본 발명의 구체예에서는 L-쓰레오닌을 생산하는 E.coli 변이 균주 TF4076(KFCC 10718, 한국특허공고 제92-8365호)을 변이시킨 L-쓰레오닌 생산 및 L- 메치오닌-비요구성 CJM002를 사용하였다. TF4076은 메치오닌 요구성, 메치오닌 유사체 (예, α-아미노-β-히드록시 발레릭산, AHV)에 대한 내성, 라이신 유사체 (예, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인, AEC)에 대한 내성, 이소루이신 유사체 (예, α-아미노부티릭산) 대한 내성, 메치오닌의 유사체 (예, 에티오닌)에 대한 내성 등의 특성을 가지고 있다.
L-쓰레오닌 생산균주인 TF4076(KFCC 10718, 한국 특허공고 제92-8365호)는 메치오닌 요구성, 메치오닌 유사체 (예, α-아미노-β-히드록시 발레릭산, AHV)에 대한 내성, 라이신 유사체 (예, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인, AEC)에 대한 내성, 이소루이신 유사체 (예, α-아미노부티릭산) 대한 내성 등의 특성을 가지고 있다. 상기 한국 특허의 전체 내용은 원용에 의하여 본 명세서에 포함되어진다. 이러한 TF4076은 메치오닌 요구성 균주로 세포내에서 메치오닌은 합성하지 못한다. 본 발명자들은 이러한 메치오닌 요구성을 해제하여 메치오닌 생산 균주로 이용하기 위하여 NTG를 이용한 인공적인 돌연변이 법을 사용하여 메치오닌 요구성이 해제된 쓰레오닌 생산 균주인 E.coli CJM002를 제조하였다. 상기 E.coli CJM002는 Escherichia coli MF001로 KCCM(Korean Culture Center of Microorganism, 대한민국 서울 서대문구 홍재 1동 유림 빌딩, 361-221)에 2004년 4월 9일자로 제KCCM-10568호로 기탁하였다. 또한 상기의 방법을 통하여 제작한 O-숙시닐-L-호모세린 생산균주인 Escherichia coli CJM-BTJ (pMetA-CL) 균주는 2006년 7월 21일에 제 KCCM-10767호로 기탁하였으며, Escherichia coli CJM-BTJ (pCJ-MetA-CL) 균주는 2007년 7 월 5 일에 제KCCM-10872호로 기탁하였다. 또한 상기의 방법을 통하여 제작한 O-아세틸-L-호모세린 생산균주인 Escherichia coli CJM-BTJA (pCJ-MetX-CL) 균주는 2007년 7 월 5 일에 제KCCM-10873호로 기탁하였다.
상기 제조된 L-메치오닌 전구체 생산 균주의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들어 문헌("Biochemical Engineering" by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176)에 개시되어 있다.
배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 다양한 미생물의 배지는 예를 들어 문헌("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., 미국, 1981)에 개시되어 있다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 사용될 수 있는 탄소원의 예에는, 포도당, 자당, 유당, 과당(fructose), 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리셀롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원의 예에는, 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함된다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 이 외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 통상 20 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃이다. 배양 기간은 원하는 L-메치오닌 전구체의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.
제 2단계 공정은 상기 L-메치오닌 전구체 생산 균주에 의하여 생산된 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린과 메칠 머캅탄을 기질로 이용하여 시스타치오닌 감마 신타제(Cystathionine gamma synthase) 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 또는 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 활성을 가지는 효소 또는 상기 효소를 포함한 균주를 이용한 효소반응을 통하여 L-메치오닌 및 유기산을 생산하는 공정을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 상기의 방법으로 축적된 호모세린 (homoserine), O-포스포호모세린(O-phospho homoserine), O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 기질로 이용하여 시스타치오닌 감마 신타아제 (cystathionine gamma synthase) 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 또는 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 등의 효소 반응을 이용하여 L-메치오닌을 생산하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 기질로 이용한다.
본 발명에서 상기 시스타치오닌 감마 신타아제 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 또는 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제는 에스케리치아속(Escherichia Sp.), 슈도모나스속(Pseudomonas sp.), 렙토스피라속(Leptospira sp.), 코리네박테리움속(Corynebacterium sp .), 사카로마이세스속(Saccharomyces sp .), 크로모박테리움속(Chromobacterium sp .), 노카디아속(Nocardia sp .), 브라디리조비움속(Bradyrhizobium sp.), 하이호모나스속(Hyphomonas sp .), 메틸로코커스속(Methylococcus sp.), 메틸로바실러스속(Methylobacillus sp.), 니트로소모나스속(Nitrosomonas sp.), 크렙시엘라속(Klesiella sp.), 바실러스속(Bacillus sp.), 쉬겔라속(Shigella sp .), 코웰리아속(Colwellia sp.), 살모넬라속(Salmonella sp.), 효모 (yeast), 펀자이 (fungi)에 속하는 미생물 균주로부터 유래된 것일 수 있다.
상기2단계 공정에서 O-숙시닐-L-호모세린을 L-메티오닌 전구체로 사용하는 경우, 바람직하게는 슈도모나스속(Pseudomonas sp.), 노카디아속 (Nocardia sp.) 크로모박테리움속(Chromobacterium sp.)에 속하는 미생물 균주, 보다 바람직하게는 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aurogenosa), 노카디아 파르시니카 (Nocardia Farcinica), 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida), 크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium Violaceum)에 속하는 미생물 균주로부터 유래된 시스타치오닌 감마 신타아제 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 또는 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제가 사용될 수 있다.
상기 2단계 공정에서 O-아세틸-L-호모세린을 L-메티오닌 전구체로 사용하는 경우, 바람직하게는 렙토스피라속(Leptospira sp.), 크로모박테리움속(Chromobacterium sp.), 하이포모나스속(Hyphomonas sp.)에 속하는 미생물 균주, 보다 바람직하게는 렙토스피라 메에리(Leptospira meyeri), 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aurogenosa), 하이포모나스 넵튜니움(Hyphomonas Neptunium), 크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium Violaceum)에 속하는 미생물 균주로부터 유래된 시스타치오닌 감마 신타아제 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 또는 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제가 사용될 수 있다.
상기의 반응은 하기와 같으며 그 구조식은 도 2와 같다.
CH3SH + O-숙시닐-L-호모세린 <=> 숙시네이트 + 메치오닌
CH3SH + O-아세틸-L-호모세린 <=> 아세테이트 + 메치오닌
상기의 반응에서는 도 2에 표기된 화학식과 같이 메칠머캅탄의 CH3S- 잔기가 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린의 숙시네이트 (succinate) 또는 아세테이트 (acetate) 잔기와 치환되어 메치오닌을 생성하게 된다. 반응시 메칠머캅탄 (CH3SH) 은 여러가지 형태로 첨가가 가능하다.
상기 활성을 가지는 효소를 코딩하는 유전자의 서열은 미국생물공학정보센터(NCBI) 및 일본의 DNA 데이터 뱅크(KEGG)와 같은 데이터베이스로부터도 얻을 수 있다.
생물학적 전환반응을 위하여 상기에서 획득한 유전자 서열로부터 유전자를 클로닝하여 발현 벡터에 삽입한 후, 재조합 균주로부터 상기의 효소를 활성형으로 발현시킨다. 발현된 효소 및 효소 발현 균주 모두 상기의 반응에 직접 이용될 수 있다.
상기의 유전자를 발현시킨 효소 및 효소 발현 균주는 L-메치오닌 전구체를 축적한 발효 상등액 또는 발효액과 직접 혼합 또는 부분적 혼합 반응을 이용하여 반응을 유도한다. 구체적인 실시예에서, 발효액에 축적된 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린은 슈도모나스속, 크로모박테리움속, 렙토스피라속, 하이포모나스속 유래의 시스타치오닌 감마 신타아제 (cystathionine gamma synthase) 또는 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase)에 의하여 메치오닌으로 전환될 수 있다.
보다 바람직하게는, 발효액에 축적된 O-숙시닐-L-호모세린은 슈도모나스 아에루지노사 또는 슈도모나스 푸티다 또는 크로모박테리움 비오라슘 유래의 시스타치오닌 감마 신타아제 (cystathionine gamma synthase) 및 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 및 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase)에 의하여 메치오닌으로 전환될 수 있다.
또는 발효액에 축적된 O-아세틸-L-호모세린은 렙토스피라 메에리(Leptospira meyeri), 하이포모나스 넵튜니움(Hyphomonas Neptunium), 크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium Violaceum) 유래의 시스타치오닌 감마 신타아제 (cystathionine gamma synthase) 및 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 및 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase)에 의하여 메치오닌으로 전환될 수 있다.
이를 위하여 각각의 유전자는 E.coli 용 발현벡터인 pCL-CJ1벡터 (한국 CJ사)에서 발현되었으며, 발현된 단백질은 초음파(sonication)을 이용한 세포파쇄로 효소액을 획득하였다. 획득한 효소액을 O-숙시닐-L-호모세린 및 O-아세틸-L-호모세린이 축적된 발효액에 첨가하였으며, 이와 함께 메칠머캅탄 용액을 함께 첨가하여 반응을 유도한다. 반응의 진행여부는 DTNB (5,5-dithiobis(2-nitro-benzoic acid, 미국 sigma사) 를 이용하여 확인하였으며, 반응 산물은 HPLC를 통하여 분석되었다.
또한, 본 발명에서는 O-숙시닐-L-호모세린, O-아세틸-L-호모세린과 CH3SH와의 반응을 통하여 L-메치오닌 이외에도 O-숙시닐-L-호모세린의 경우 숙신산을, O-아세틸-L-호모세린의 경우 아세트산을 별도의 생산공정 없이 부산물로 얻을 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
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실시예 1 : 메치오닌 전구체 생산균주의 제작
1-1) metB 유전자의 결손
E.coli 균주에서 시스타치오닌 감마 신타아제를 코딩하는 유전자인 MetB 유전자를 결손시키기 위하여, FRT-one-step PCR deletion 방법을 사용하였다 (PNAS (2000) vol97: P6640-6645). 서열번호 1, 2번의 프라이머를 이용하여 pKD3 벡터(PNAS (2000) vol97: P6640-6645)를 주형으로 하여 PCR 반응으로 결손 카세트 (deletion cassette)를 제작하였다. 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하였다.
그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.2 kbp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편은 pKD46 벡터 (PNAS (2000) vol97: P6640-6645)를 미리 형질 전환시킨 E.coli (K12) W3110 균주에 일렉트로포레이션하였다. 일렉트로포레이션을 위하여 pKD46으로 형질전환된 W3110 균주는 100ug/L 암피실린 (ampicilin) 과 5mM 아라비노스 (l-arabinose) 가 포함된 LB 배지를 이용하여 30oC에서 OD600=0.6 까지 배양시킨 후, 멸균 증류수로 2 회, 10%글리세롤 (glycerol) 로 1회 세척하여 사용하였다. 일렉트로포레이션은 2500V로 가하였다. 회수된 균주를 25μg/L 클로람페니콜 (chloramphenichol)을 포함한 LB 평판 배지에 도말하여 37℃ 에서 하루밤 배양한 후 내성을 보이는 균주를 선별하였다.
선별된 균주는 균주를 주형으로 하여 동일한 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR 한후 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.2Kb로 관찰되는 것을 확인함으로서 metB 유전자의 결손을 확인하였다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터 (PNAS (2000) vol97: P6640-6645) 로 형질전환시켜 LB 배지에서 배양하였으며, 다시 동일한 조건의 PCR을 통하여 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 150 bp로 작아진 최종 metB 유전자 결손 균주를 제작하였고, 크로람페니콜 마커가 제거되었음을 확인하였다. 제작된 균주를 W3-B 로 명명하였다.
1-2) thrB 유전자의 결손
호모세린 키나아제를 코딩하는 유전자인 thrB 유전자를 결손시킴으로써 호모세린으로부터 O-숙시닐-L-호모세린의 합성량을 증가시키고자 하였다. 특히 쓰레오닌 생산균주를 이용할 경우 호모세린의 이용 활성이 매우 크기 때문에 이 유전자의 결손이 꼭 필요하다. 상기 제작된 W3-B 균주에서 thrB 유전자를 결손시키기 위하여, metB 유전자 결손시와 동일한 FRT one step PCR deletion 방법을 사용하였다.
thrB 결손 카세트를 제작하기 위하여 pKD4 벡터 (PNAS (2000) vol97: P6640-6645) 를 주형으로, 서열번호 3, 4 의 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 진행하였다.
그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.6kbp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편을 pKD46 벡터로 미리 형질 전환시킨 W3-B 균주에 일렉트로포레이션하였다. 회수된 균주를 50 μg/L 카나마이신 (kanamycin)을 포함한 LB 평판 배지에 도말하여 37℃ 에서 하루밤 배양한 후, 내성을 보이는 균주를 선별하였다.
선별된 균주는 균주를 직접 주형으로 하여 서열번호 3, 4 의 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR 한후, 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.6Kb로 확인되는 균주를 선별함으로써 thrB 유전자의 결손을 확인하였다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터로 형질전환시켜 LB 배지에서 배양하였으며, 다시 동일한 조건의 PCR을 통하여 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 150 bp로 작아진 최종 thrB 유전자 결손 균주를 제작하고, 가나마이신 마커가 제거되었음을 확인하였다. 제작된 균주는 W3-BT 균주로 명명하였다.
1-3) metJ 유전자의 결손
메치오닌 전구체의 합성에 관여하는 metA 유전자의 조절 유전자인 metJ 유전 자를 결손시키기 위하여, metB 유전자 결손시와 동일한 FRT one step PCR deletion 방법을 사용하였다.
metJ 유전자 결손 카세트를 제작하기 위하여, 서열번호 5, 6 의 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하였다.
그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.2 kbp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편을 pKD46 벡터로 미리 형질 전환시킨 W3-BT 균주에 일렉트로포레이션하였다. 회수된 균주를 클로람페니콜을 포함한 LB 평판 배지에 도말하여 37℃ 에서 하루밤 배양한 후 내성을 보이는 균주를 선별하였다.
선별된 균주는 균주를 직접 주형으로 하여 서열번호 7, 8 의 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR 한후, 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.6Kb로 변화되는 것을 확인함으로서 metJ 유전자의 결손을 확인하였다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터를 형질전환하여 LB 배지에서 배양하였으며 다시 동일한 조건의 PCR을 통하여 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 600 bp로 작아진 최종 metJ 유전자 결손 균주를 제작하고, 크로람페니콜 마커가 제거되었음을 확인하였다. 제작된 균주를 W3-BTJ 로 명명하였다.
1-4-1) metA 유전자의 과다 발현
보다 많은 메치오닌 전구체의 합성을 위하여, 메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 합성에 관여하는 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라아제 (homoserine O-succinyl transferase) 효소를 코딩하는 metA 유전자를 과발현하고자 하였다.
이를 위하여 E.coli w3110의 크로모좀(chromosome)을 주형으로 하여, 서열번호 9, 10 번의 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 25 회 수행하는 PCR 반응을 수행하였다.
그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.2kbp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편은 pCL1920 벡터를 SmaI 으로 절단하여 얻어진 DNA 절편과 연결시켰다. 연결된 벡터를 E.coli에 형질전환시켜 50μg/L 스펙티노마이신(spectinomycin)이 포함된 LB 배지에서 배양한 후 선별하였다. 이와 같이 제조된 벡터를 pMetA-CL 로 명명하였다. pMetA-CL 벡터의 모식도는 도 3과 같다. 상기 벡터를 W3-BTJ 균주에 형질전환시켜 제작된 균주를 W3-BTJ/pMetA-CL로 명명하고, O-숙시닐-L-호모세린의 증가를 관찰하였다.
metA 유전자의 발현을 더욱 증가시키기 위한 다른 방법으로서, 상기의 metA 유전자를 pCL1920 벡터에 CJ1 프로모터 (한국, CJ사) 와 EcoRV 제한 효소를 이용하여 연결시켰다. 연결된 벡터를 E.coli 균주에 형질전환시키고 50μg/L 스펙티노마이신이 포함된 LB 배지에서 배양한 후 선별하였다. 이와 같이 제조된 벡터를 pCJ-MetA-CL 로 명명하였다. 상기 벡터를 W3-BTJ 균주에 형질전환시켜 제작된 균주를 W3-BTJ/ pCJ-MetA-CL로 명명하고, O-숙시닐-L-호모세린의 증가를 관찰하였다.
1-4-2) metX 유전자의 과다 발현
O-아세틸-L-호모세린의 합성을 위하여, 메치오닌 전구체인 O-아세틸-L-호모세린 합성 유전자인 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제 (homoserine O-acetyl transferase) 를 코딩하는 metX 유전자를 과발현하고자 하였다.
이를 위하여 렙토스피라 메예리(Leptospira meyeri)의 크로모좀(chromosome)을 주형으로 하여 서열번호 11, 12 번의 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 25 회 수행하는 PCR 반응을 수행하였다.
그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.1kbp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편을 pCL1920 벡터에 CJ1 프로모터와 EcoRV 제한 효소를 이용하여 연결시켰다. 연결된 벡터를 E.coli 에 형질전환시켜 50μg/L 스펙티노마이신이 포함된 LB 배지에서 배양한 후 선별하였다. 이와 같이 제조된 벡터를 pCJ1-MetXlme-CL 로 명명하였다. 상기 벡터를 W3-BTJ 균주에 형질전환시켜 제작된 균주를 W3-BTJ/ pCJ-MetXlme-CL로 명명하고, O-아세틸-L-호모세린의 증가를 관찰하였다.
metX 유전자의 과발현을 위한 또 다른 방법으로서, 코리네박테리움 크로모좀(chromosome)을 주형으로 하여 서열번호 68, 69번의 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 25 회 수행하는 PCR 반응을 수행하였다.
그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편을 pCL1920 벡터에 CJ1 프로모터와 EcoRV 제한 효소를 이용하여 연결시켰다. 연결된 벡터를 E.coli 에 형질전환시켜 50μg/L 스펙티노마이신이 포함된 LB 배지에서 배양한 후 선별하였다. 이와 같이 제조된 벡터를 pCJ-MetXcgl-CL 로 명명하였다. 상기 벡터를 W3-BTJ 균주에 형질전환시켜 제작된 균주를 W3-BTJ/ pCJ-MetXcgl-CL로 명명하고, O-아세틸-L-호모세린의 증가를 관찰하였다.
1-4-3) metA 유전자의 결손
O-아세틸-L-호모세린의 생산량을 증가시키기 위하여, W3-BTJ 균주에서 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라아제를 코딩하는 유전자인 metA를 결손시켰다. metX 유전자만을 도입한 경우 일정량의 O-숙시닐-L-호모세린이 축적됨이 관찰되었기 때문에, metA 유전자를 결손시킬 경우 더 많은 양의 O-아세틸-L-호모세린을 축적할 수 있을 것으로 추정하였다(표 3 참조). metA 유전자를 결손시키기 위하여 FRT one step PCR deletion 방법을 사용하였다.
metA유전자 결손 카세트를 제작하기 위하여 서열번호 70, 71 의 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하였다.
그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.2 kbp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편을 pKD46 벡터로 미리 형질 전환시킨 E.coli W3-BTJ 균주에 일렉트로포레이션하였다. 회수된 균주를 클로람페니콜을 포함한 LB 평판 배지에 도말하여 37℃ 에서 하루밤 배양한 후, 내성을 보이는 균주를 선별하였다.
선별된 균주는 균주를 직접 주형으로 하여 서열번호 70, 71 의 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR 한후, 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.1Kb로 변화되는 것을 확인함으로써 metA 유전자의 결손을 확인하였다. 확인된 균주를 다시 pCP20 벡터로 형질전환시켜 LB 배지에서 배양하였으며, 다시 동일한 조건의 PCR을 통하여 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 100 bp로 작아진 최종 metA 유전자 결손 균주를 제작하고, 클로람페니콜 마커가 제거되었음을 확인하였다. 제작된 균주를 W3-BTJA 로 명명하였다. W3-BTJA 균주를 상기 pCJ-MetXlme-CL 벡터로 형질전환시켜 제작된 균주를 W3-BTJA/pCJ-MetX-CL로 명명하였다. 상기 균주를 동일한 방법으로 배양한 결과, O-숙시닐-L-호모세린의 축적은 관찰되지 않았으며 O-아세틸-L-호모세린의 생산량이 W3-BTJ 대비 약 20% 유의적으로 증가함을 확인하였다.
1-5) L-쓰레오닌 생산 균주의 전환
메치오닌 요구성이 해제된 L-쓰레오닌 생산 균주인 에스케리키아 콜라이CJM002(KCCM-10568호) 를 이용하여 상기 1-1 내지 1-3 와 동일한 방법으로 메치오닌 전구체 생산균주를 제작하였다. 제작된 균주는 각각 CJM-BTJ, CJM-BTJ/pMetA-CL 및 CJM-BTJ/pCJ-MetA-CL로 명명하였다. 또한, 이 CJM-BTJ 균주를 사용하여 상기 1-4-3의 방법으로 metA 유전자를 결손시킨 균주를 제작하였으며, 제작된 균주를 CJM-BTJA 로 명명하였다.
실시예2 : L-메치오닌 전구체 생산을 위한 발효
1-1) 플라스크 배양 실험
실시예 1에서 제작된 균주의 메치오닌 전구체 생산량을 실험하기 위하여 삼각플라스크 배양을 실시하였다. 항생제 스펙티노마이신이 함유된 평판 LB 배지에 W3-BTJ 와 CJM-BTJ및 metA, metX 발현 벡터로 형질전환시킨 W3-BTJ 균주를 접종하여 31℃에서 하루밤 배양한 후, 단일 콜로니를 스펙티노마이신이 포함된3ml LB 배지에 접종한 후 31℃ 에서 5 시간 배양하고, 다시 25ml 메치오닌 전구체 생산 배지를 포함한 250ml 삼각플라스크에 200배 희석하여 31℃ 200 rpm에서 64시간 배양하여 HPLC 분석을 통하여 메치오닌 전구체 생산량을 비교하였다(표 2 및 표 3). 그 결과, 메치오닌 요구성이 해제된 쓰레오닌 생산 균주를 사용하여 제작된 메치오닌 전구체 생산 균주의 경우에 있어서, 메치오닌 전구체 생산량이 현저하게 증가하였음을 알 수 있었다.
메치오닌 전구체 생산 플라스크 배지 조성
조성 농도(리터당)
포도당 40 g
황산암모늄 17 g
KH2PO4 1.0 g
MgSO4ㆍ7H2O 0.5 g
FeSO4ㆍ7H2O 5 mg
MnSO4ㆍ8H2O 5 mg
ZnSO4 5 mg
탄산칼슘 30 g
효모엑기스 2 g
메치오닌 0.15g
쓰레오닌 0.15g
플라스크 배양을 통한 메치오닌 전구체(O-숙시닐-L-호모세린) 생산
OD 포도당 소모(g/L) O-숙시닐-L-호모세린 (g/L)
W3-BTJ 10 40 0.3
W3-BTJ/ pMetA-CL 12 40 1.2
W3-BTJ/ pCJ-MetA-CL 12 40 1.8
CJM-BTJ 5.0 33 0.6
CJM-BTJ/ pMetA-CL 6.0 36 5.2
CJM-BTJ/pCJ-MetA-CL 6.0 40 10.1
플라스크 배양을 통한 메치오닌 전구체(O-아세틸-L-호모세린) 생산
OD 포도당 소모(g/L) O-아세틸-L-호모세린 (g/L)
W3-BTJ 10 40 0
W3-BTJ/pCJ-MetXlme-CL 12 40 1.5
W3-BTJ/pCJ-metXcgl-CL 12 40 1.4
W3-BTJA/pCJ-metXlme-CL 11 40 1.8
CJM-BTJ 5.0 33 0
CJM-BTJ/pCJ-metXlme-CL 5.5 40 4.8
CJM-BTJ/pCJ-MetXcgl-CL 6.0 36 4.6
CJM-BTJA/pCJ-metX-CL 5.8 40 6.5
1-2) 대형 발효조 실험
실시예 1에서 가장 뛰어난 메치오닌 전구체 생산능을 보인 균주를 이용하여 메치오닌 전구체를 대량 생산하기 위하여 5L 발효조 배양을 실시하였다. 항생제 스펙티노마이신이 함유된 평판 LB 배지에 CJM-BTJ/pCJ-metA-CL균주 또는 CJM-BTJA/pCJ-metXlme-CL균주를 접종하여 31℃에서 하루밤 배양하였다. 그 후, 단일 콜로니를 스펙티노마이신이 포함된10 ml LB 배지에 접종한 후 31℃ 에서 5 시간 배양하고, 다시 200ml 메치오닌 전구체 Seed 배지를 포함한 1000ml 삼각플라스크에 100배 희석하여 31℃ 200 rpm에서 3~10시간 배양후 5L 발효조에 접종하여 유가식 배양(Fed batch) 발효법으로 50~100시간 배양하였다. 이렇게 배양한 발효액에서 메치오닌 전구체 농도를 HPLC로 분석한 결과는 표5와 같았다.
메치오닌 전구체 생산 발효조 배지 조성
조성 Seed media Main media Feed media
Glucose(g/L) 10.1 40 600
MgSO47H20(g/L) 0.5 4.2
Yeast extract(g/L) 10 3.2
KH2PO4 3 3 8
Ammonium sulfate(g/L) 6.3
NH4Cl(g/L) 1
NaCl(g/L) 0.5
Na2HPO412H2O(g/L) 5.07
DL-Methionine(g/L) 0.5 0.5
L-Isoleucine(g/L) 0.05 0.5 0.5
L-Threonine(g/L) 0.5 0.5
발효조에서의 메치오닌 전구체 생산
O-숙시닐-L호모세린생산 (g/L) O-아세틸-L-호모세린생산 (g/L)
CJM-BTJ/pCJ-MetA-CL >80 0
CJM-BTJA/pCJ-MetXlme-CL 0 >55
실시예 3 : 메치오닌 전환효소의 생산
1-1) E.coli 유래의 시스타치오닌 감마 신타아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 E.coli유래의 시스타치오닌 감마 신타아제를 코딩하고 있는 metB 유전자를 클로닝하였다.
E.coli의 크로모좀을 주형으로 하여 프라이머 서열 13,14 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 25 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NcoI/HindIII로 절단하여, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 최종 제작된 벡터를 pCJ-MetB-CL이라 명명하였으며, 모식도는 도 4 와 같다. 클로닝된 벡터를 E.coli W3110 세포에 형질전환시키고, 50 μg/L의 스펙티노마이신이 포함된 LB 평판배지에서 배양한 후 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니를 50 μg/L의 스펙티노마이신이 포함된 LB 배지 3ml 에 접종하여 하루밤 동안37℃ 에서 배양하였다. 배양된 세포는 다시 회수하여 0.1M 포타슘포스페이트 완충액 (potassium phosphate, pH7.5)으로 세척하여 다시 200 μl 의 포타슘포스페이트 완충액에 현탁하고, 30초 간격으로 5회 소니케이션하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄된 세포추출액을 12,000rpm에서 10 분간 원심분리한 후, 상등액을 취하여 Bio-Rad 단백질 정량액 (미국 BIO-Rad 사) 을 이용하여 단백질 총량을 정량하였다. 또한 SDS-PAGE법을 이용하여 단백질의 발현을 확인하였다. 회수된 세포 추출액의 상등액을 효소 전환 반응에 사용하였다.
1-2) 슈도모나스속 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 슈도모나스속(Pseudomonas Sp.) 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제를 코딩하는 metZ 유전자를 클로닝하였다. 슈도모나스는 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 및 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 의 2종을 사용하였다.
각각의 균주의 크로모좀을 주형으로 하여, 슈도모나스 아에루지노사의 경우 프라이머 서열 15,16 번, 슈도모나스 푸티다의 경우 서열 17, 18 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NdeI/PacI로 절단하여, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환 반응에 사용하였다.
1-3) 슈도모나스속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 슈도모나스속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 코딩하는 metY 유전자를 클로닝하였다.
슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 균주의 크로모좀을 주형으로 하고, 서열 19, 20 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NdeI/PacI로 절단하여, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환 반응에 사용하였다.
1-4) 코리네박테리엄 글루타미컴 유래의 시스타치오닌 감마 신타아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 코리네박테리엄 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum) 유래의 시스타치오닌 감마 신타아제를 코딩하는 metB 유전자를 클로닝하였다.
코리네박테리엄 글루타미컴의 크로모좀을 주형으로 하고, 프라이머 서열 21, 22 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NcoI/HindIII로 절단하여, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환반응에 사용하였다.
1-5) 코리네박테리엄 글루타미컴 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 코리네박테리엄 글루타미컴 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 코딩하는 metZ 유전자를 클로닝하였다.
코리네박테리엄 글루타미컴의 크로모좀을 주형으로 하고, 프라이머 서열 23, 24 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NdeI/AvrII로 절단하고, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환반응에 사용하였다.
1-6) 렙토스피라속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 렙토스피라 메예리 (Leptospira meyeri) 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 코딩하는 metY 유전자를 클로닝하였다.
렙토스피라 메예리 의 크로모좀을 주형으로 하고, 프라이머 서열 25, 26 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NdeI/AvrII로 절단하고, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환 반응에 사용하였다
1-7) 사카로마이세스속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제를 코딩하는 met25 유전자를 클로닝하였다.
사카로마이세스 세레비지애의 크로모좀을 주형으로 하고, 프라이머 서열 27, 28 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NdeI/PacI으로 절단하고, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환 반응에 사용하였다
1-8) 크로모박테리움속 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium Violaceum)유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제를 코딩하는 metZ 유전자를 클로닝하였다.
크로모박테리움 비오라슘의 크로모좀을 주형으로 하고, 프라이머 서열 29, 30 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NdeI/AvrII으로 절단하고, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환반응에 사용하였다
1-9) 노카디아속 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 노카디아 파르시니카 (Nocardia Farcinica) 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제를 코딩하는 metZ 유전자를 클로닝하였다.
노카디아 파르시니카의 크로모좀을 주형으로 하고, 프라이머 서열 31, 32 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NdeI/AvrII으로 절단하고, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환반응에 사용하였다
1-10) 브라디리조비움속 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 브라디리조비움 자포니쿰 (Bradyrhizobium Japonicum)유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제를 코딩하는 metZ 유전자를 클로닝하였다.
브라디리조비움 자포니쿰의 크로모좀을 주형으로 하고, 프라이머 서열 33, 34 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NdeI/AvrII으로 절단하고, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환반응에 사용하였다
1-11) 하이포모나스속 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 하이포모나스 넵튜니움 (Hyphomonas Neptunium) 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제를 코딩하는 metZ 유전자를 클로닝하였다.
하이포모나스 넵튜니움의 크로모좀을 주형으로 하고, 프라이머 서열 35, 36 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 BamHII/HindIII으로 절단하고, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환반응에 사용하였다
1-12) 메틸로코커스속 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 메틸로코커스 캡슐라투스 (Methylococcus Capsulatus) 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제를 코딩하는 metZ 유전자를 클로닝하였다.
메틸로코커스 캡슐라투스의 크로모좀을 주형으로 하고, 프라이머 서열 37, 38 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NdeI/AvrII으로 절단하고, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환반응에 사용하였다
1-13) 메틸로바실러스속 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 메틸로바실러스 플라겔라투스 (Methylobacillus Flagellatus) 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제를 코딩하는 metZ 유전자를 클로닝하였다.
메틸로바실러스 플라겔라투스의 크로모좀을 주형으로 하고, 프라이머 서열 39, 40 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NdeI/AvrII으로 절단하고, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환반응에 사용하였다
1-14) 니트로소모나스속 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 니트로소모나스 유로파에 (Nitrosomonas Europaea) 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제를 코딩하는 metZ 유전자를 클로닝하였다.
니트로소모나스 유로파에의 크로모좀을 주형으로 하고, 프라이머 서열 41, 42 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NdeI/AvrII으로 절단하고, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환반응에 사용하였다
1-15) 크렙시엘라속 유래의 시스타치오닌 감마 신타아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 크렙시엘라 뉴모니애 (Klesiella Pneumoniae) 유래의 시스타치오닌 감마 신타아제를 코딩하는 metB 유전자를 클로닝하였다.
크렙시엘라 뉴모니애의 크로모좀을 주형으로 하고, 프라이머 서열 43, 44 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NdeI/AvrII로 절단하고, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환반응에 사용하였다
1-16) 바실러스속 유래의 시스타치오닌 감마 신타아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 바실러스속 서브틸리스 (Bacillus Subtilis) 유래의 시스타치오닌 감마 신타아제를 코딩하는 metB 유전자를 클로닝하였다.
바실러스속 서브틸리스의 크로모좀을 주형으로 하고, 프라이머 서열 45, 46 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NdeI/AvrII로 절단하고, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환반응에 사용하였다
1-17) 쉬겔라속 유래의 시스타치오닌 감마 신타아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 쉬겔라속 플렉스네리 2457T (Shigella flexneri 2457T) 유래의 시스타치오닌 감마 신타아제를 코딩하는 metB 유전자를 클로닝하였다.
쉬겔라속 플렉스네리 2457T의 크로모좀을 주형으로 하고, 프라이머 서열 47,48 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NdeI/AvrII로 절단하고, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환반응에 사용하였다.
1-18) 코웰리아속 유래의 시스타치오닌 감마 신타아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 코웰리아 사이크레리스라애 (Colwellia Psychrerythraea)유래의 시스타치오닌 감마 신타아제를 코딩하는 metB 유전자를 클로닝하였다.
코웰리아 사이크레리스라애의 크로모좀을 주형으로 하고, 프라이머 서열 49, 50 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NdeI/AvrII로 절단하고, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환반응에 사용하였다
1-19) 살모넬라속 유래의 시스타치오닌 감마 신타아제
메치오닌 전구체인 O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸-L-호모세린을 메치오닌으로 전환시킬 효소로서 사용될 살모넬라 엔티가 혈청형 파라티푸스 (Salmonella enterica serovar Paratyphi A)유래의 시스타치오닌 감마 신타아제를 코딩하는 metB 유전자를 클로닝하였다.
살모넬라 엔티가 혈청형 파라티푸스의 크로모좀을 주형으로 하고, 프라이머 서열 51, 52 번을 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 수행하여 획득하였다.
획득한 DNA 절편을 NdeI/AvrII로 절단하고, 동일하게 절단한 pCL-CJ1 벡터 (한국, CJ사) 의 벡터에 클로닝하였다. 클로닝된 벡터를 상기 1-1) 과 동일한 방법을 사용하여 세포추출액의 상등액을 회수하고, 효소 전환반응에 사용하였다
1-20) OSHS 을 기질로 한 전환효소의 활성 비교
상기의 1-1) 에서 1-19) 의 방법으로 획득한 각각의 효소액을 활성 비교하여 최적의 메치오닌 전환효소를 선별하였다.
이를 위하여 O-숙시닐-L-호모세린(Sigma 사) 를 3 mM의 농도로 0.1M 포타슘포스페이트 완충액 (pH 7.5) 에 용해하였다. 또한 이 반응액에 조효소로 사용되는 피리독살포스페이트 (pyridoxal 5'-phosphate, 미국 Sigma 사) 를 최종농도 10 μM 이 되도록 첨가하였다. 반응액에 또 다른 기질로서 사용되는 메칠머캅탄(Methyl mercaptan, 일본 동경 화성공업주식회사) 을 최종농도 2mM 로 첨가하였다. 이 반응액 1ml을 37℃ 에 위치한 후, 각 효소추출액을 단백질 농도 5mg/ml 로 맞추어서 10μl 첨가하였다. 반응의 진행 여부는 매 5-10 분 간격으로 100μl의 반응액을 회수하여 4mg/ml의 DTNB (미국 Sigma 사) 용액 900μl 에 첨가한 후, 415 nm 에서의 흡광도를 측정함으로써 확인하였다.
DTNB는 반응액 중에 잔존하는 메칠머캅탄의 SH 그룹과 반응하여 노란색의 물질을 합성한다. 따라서, 반응액상의 메칠머캅탄이 반응에 의해 메치오닌으로 전환됨에 따라 반응액의 노란색이 사라지는 것으로서 반응의 진행을 확인할 수 있다.
실험 결과 도 5와 같이 크로모박테리움 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제, 노카디아 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제, 슈도모나스 속 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 및 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제가 매우 높은 활성을 보였다. 기타의 효소들도 모두 어느 정도의 활성은 보였으나 반응 진행 속도가 상대적으로 느림을 확인하였다. 각 효소의 기질에 대한 반응성을 요약한 표는 표 6과 같다. 또한, 1 시간의 반응이 종료된 후 선별된 반응액으로부터 HPLC 분석을 통하여 최종 생성된 메치오닌 및 숙신산의 생성을 확인한 결과는 표 7 과 같다.
1-21) OAHS를 기질로 한 전환효소의 활성 비교
상기1-20 항과 동일한 반응을 O-아세틸-L-호모세린을 이용하여 반응시켰다. O-아세틸-L-호모세린은 발효 상등액으로부터 정제하였다. O-숙시닐-L-호모세린과 동일한 반응액 및 동일한 효소액을 이용하여 반응시킨 결과, 도 6와 같이 하이포모나스 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제, 슈도모나스 속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제, 크로모박테리움 속 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 및 렙토스피라 속 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제가 높은 활성을 보였다. 기타의 효소들도 모두 어느 정도의 활성은 보였으나 반응 진행 속도가 상대적으로 느림을 확인하였다. 각 효소의 기질에 대한 반응성을 요약한 표는 표 6 와 같다. 또한, 1 시간의 반응이 종료된 후 선별된 반응액으로부터 HPLC 분석을 통하여 최종 생성된 메치오닌 및 아세트산의 양을 확인한 결과는 표8과 같다.
각 균주 유래의 효소를 이용한 O-숙시닐-L-호모세린 및 O-아세틸-L-호모세린의 전환반응
균주 균주번호 (ATCC) 유전자명 (KEGG) 기질특이성
OSH OAH
에스케리치아 콜리 (Escherichia Coli K12) 55151 MetB + +
슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aurogenosa) 17933 MetZ +++ +
MetY ++++ ++++
슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 17390 MetZ ++++ +
코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) 13032 MetB + +
MetY + +
렙토스피라 메에리 (Leptospira meyeri) 43278 MetY + ++
사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 2704 Met25 + +
크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium Violaceum) 12472 MetZ ++++ +++
노카디아 파르시니카 (Nocardia Farcinica) 3318 MetZ ++++ +
브라디리조비움 자포니쿰 (Bradyrhizobium Japonicum) 10324 MetZ + +
하이호모나스 넵튜니움 (Hyphomonas Neptunium) 49408 MetZ + ++++
메틸로코커스 캡슐라투스 (Methylococcus Capsulatus) 19069D-5 MetZ + +
메틸로바실러스 플라겔라투스 (Methylobacillys Flagellatus) 51484D MetZ + +
니트로소모나스 유로파에 (Nitrosomonas Europaea) 19718D MetZ + +
크렙시엘라 뉴모니애 (Klesiella Pneumoniae) 25955 MetB + +
바실러스속 섭틸리스 (Bacillus Subtilis) 10783 MetB + +
쉬겔라속 플렉스네리 2457T (Shigella flexneri 2457T) 700930D-5 MetB + +
코웰리아 사이크레리스라애 (Cowwellia Psychrerythraea) BAA-618D MetB + +
살모넬라 엔티가 세로바 파라티피 A (Salmonella enterica serovar Paratyphi A) 9150D MetB + +
각 효소를 이용한 O-숙시닐-L-호모세린으로부터의 메치오닌 및 숙신산 생성량
효소의 유래 유전자 이름 생성 메치오닌 양 (g/L) 생성 숙신산 양 (g/L)
코리네박테리엄 글루타미컴 metB 0.05 0.03
에스케리키아 콜라이 metB 0.14 0.1
노카디아 파시니카 metZ 0.21 0.17
슈도모나스 푸티다 metZ 0.22 0.17
슈도모나스 아에루지노사 metZ 0.22 0.17
크로모박테리움 비오라슘 0.22 0.17
슈도모나스 아에루지노사 metY 0.21 0.17
각 효소를 이용한 O-아세틸-L-호모세린으로부터의 메치오닌 생성량.
효소의 유래 유전자 이름 생성 메치오닌 양 (g/L) 생성 아세트산 양 (g/L)
슈도모나스 아에루지노사 metY 0.22 0.081
크로모박테리움 비오라슘metZ 0.18 0.068
하이포모나스 넵튜니움 metZ 0.22 0.082
코리네박테리엄 글루타미컴 metY 0.05 0.015
렙토스피라 메예리 metY 0.15 0.05
1-22) 전환효소의 피드백 저해 확인
상기1-20 및 21 과 동일한 방법을 사용하여 메치오닌의 존재 유무에 따른 피드백 저해 반응을 확인하였다. 상기와 동일한 반응액을 제조하고 각 반응액에 각각 5g/L의 메치오닌을 첨가 또는 비첨가하여 동일한 반응진행을 하였다. 메치오닌을 첨가하지 않았을 경우의 반응 진행 속도를 100% 로 하였을 때, 메치오닌 존재시의 잔존 활성을 %로 표기하여 표 9에 나타내었다.
그 결과 슈도모나스 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제, 노카디아 유래의 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제 및 렙토스피라 유래의 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제가 메치오닌에 의한 활성 저해를 보임을 확인하였다. 따라서 이들 효소는 메치오닌에 의한 피드백 저해를 가지고 있는 것으로 추정되었으며, 추후 반응에는 피드백 저해가 없는 효소를 사용하였다. 상기의 실시예에서 피드백 저해를 받는 효소 역시 피드백 저해가 해제되는 변이주를 사용할 경우 동일한 반응에 사용될 수 있을 것으로 추정되었다.
메치오닌에 의한 효소의 활성 저해
효소 유래 유전자명 잔존활성(%)
OSHS OAHS
크로모박테리움 비오라슘 metZ 97 100
슈도모나스 애루기노사 metY 54 53
노카디아 파르시니카 metZ 68
슈도모나스 푸티다 metZ 98
슈도모나스 애루기노사 metZ 98
렙토스피라 메에리 metY 45
하이호모나스 넵튜니움 metZ 100
1-23) 전환효소의 상동성 비교
전환반응에 사용된 각 효소간의 상동성을 비교하여 O-숙시닐-L-호모세린 및 O-아세틸-L-호모세린에 대한 반응성 및 피드백 조절 저해와의 상관관계를 확인하였다.
사용된 효소의 상동성을 비교한 결과, O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제로 명명되는 metZ 간의 상동성 및 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제로 명명되는 metY 간의 상동성이 상호간의 상동성에 비하여 상대적으로 높음을 알수 있었다. 상기의 실시예와 연관하여 볼 때 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제로 명명된 metZ의 경우에는 피드백 조절 저해를 보이지 않는 경우가 더 많은데 비하여, O-아세틸호모세린 설피드릴라아제로 명명된 metY의 경우에는 실시예에 사용된 효소 모두가 피드백 조절 저해를 보여 상대적으로 높은 피드백 조절 저해를 가지고 있는 것으로 확인되었다. O-숙시닐 호모세린 및 O-아세틸호모세린에 대한 선택성은 metZ 유전자군은 O-숙시닐호모세린에 대한 선택성이 높으며, metY 유전자군은 O-아세틸호모세린에 대한 선택성이 높았으나, 슈도모나스 푸디다 유래의 metY 및 크로모박테리움 비오라슘 유래의 metZ 는 특이적으로 두가지의 기질 모두에 대하여 높은 반응성을 보였다.
실시예에 사용된 모든 효소를 아미노산 서열에 의거하여 서열정렬 프로그램인 클러스탈 더블류 프로그램(ClustalW program ;DNAstar) 로 정렬(align) 한 결과, 다음과 같은 서열로 명기되는 도메인을 공통적으로 가지고 있음을 확인하였다. 따라서, 다음과 같은 도메인을 공통적으로 가지는 효소는 모두 동일한 방법으로 메치오닌을 제조할 수 있는 것으로 확인되었다.
도메인 1: Y-(S, I, T, V)-R-X-X ?(N,S)
도메인 2:
(V,A,I)-(V,L,I)-D-N-X-(F,V,M,I)-X-(T,S)-(P,A)-X-(L,I)-(Q,C,V)-X-(P,G)-(L,F)-X-(L,M,H)-G-(A,V)-(D,H)
도메인3:
(S,A,G,P)-(P,A,V)-F-(N,D)-(A,S)-(W,F,Y)-X-X-X-(K,Q,R,S)-G-(L,M,V,I,M)-(E,K,D,R)-T-(L,M)-
도메인 5: (H,Y)-(P,A)-(A,S)-(T,S)-(T,M,Q)-(T,S)-H
도메인 6: (V,I,L)-R-(V,I,L,F)-(S,A)-(V,I,T)-G-(L,I)-E-
실시예 4 : 메치오닌 전환효소에 의한 메치오닌 전환반응
1-1) 전환효소의 대량 생산
실시예 2 (1-2, 1-8)에서 제작된 메치오닌 전환효소 생산균주를 대량 생산하기 위하여 1L 발효조 배양을 실시하였다. 항생제 스펙티노마이신이 함유된 평판 LB 배지에, W3110을 슈도모나스 유래 metZ 발현 벡터로 형질전환 또는 하이포모나스 유래metZ 발현 벡터로 형질전환시킨 균주를 각각 접종하여 30~40℃에서 하루밤 배양한 후 단일 콜로니를 스펙티노마이신이 포함된40 ml LB 배지에 접종한 후 30~40℃ 에서 5 시간 배양하였다. 이렇게 배양된 슈도모나스 유래 metZ 발현 균주 및 하이포모나스 유래 metZ 발현 균주를 1L 발효조에서 600~900rpm, 30~40℃, 15~30시간 배양하였다. 배양에 사용된 배지 조성은 표 10에 나타내었다.
배양이 끝난 메치오닌 전환효소 발효액을 초음파 전동을 이용하여 세포를 파쇄하여 메치오닌 전환 효소액을 제작하였다.
전환효소 생산 플라스크 배지 조성
2XYT 배지조성
효모 추출물(g/L) 10
트립토판(g/L) 16
글루코스(g/L) 40
스펙티노마이신(g/L) 50
1-2) 메치오닌 전환 반응
상기의 실시예 2 (1-2)번에서 생산된 O-숙시닐-L-호모세린 발효액과 O-아세틸-L-호모세린 발효액에 각각 실시예 4 (1-1)번에서 제작된 슈도모나스 유래 O-숙시닐-L-호모세린 전환 효소액 및 하이포모나스 유래의 O-아세틸-L-호모세린 전환 효소액을 사용하여 메치오닌 전환 반응을 수행하였다.
세포를 제거하지 않은 메치오닌 전구체 발효액 2.0L에 파쇄한 효소배양액 0.1L를 첨가한 후 15% Na-메칠머캅탄 0.3L을 첨가하여 반응을 개시하고, 2 시간 경과 후 발효액을 회수하여 세포를 제거한 후 HPLC를 통하여 메치오닌 생성을 확인하였다.
그 결과를 표 11에 나타내었다.
L-메치오닌(g/L) 숙신산(g/L) 아세트산(g/L)
O-숙시닐-L-호모세린 발효액 (>80g/L) >42 >33 0
O-아세틸-L-호모세린 발효액 (>55 g/L) >40 0 >15
상기의 결과에서와 같이, 기존의 발명에서는 10g/L이하의 낮은 농도의 L-메치오닌을 생산하는 것에 비하여 상기의 발명에서는 30g/L이상의 L-메치오닌을 생성하여 L-메치오닌을 대량으로 생산 가능함을 확인하였다.
도 1은 메치오닌 전구체 생산 균주의 유전자 조작도이다.
도 2는 2단계 공정으로 메치오닌을 생산하기 위한 화학구조도이다.
도 3 은 metA 유전자의 발현을 위한 벡터 pMetA-CL의 모식도이다.
도 4는 metB 유전자의 발현을 위한 벡터 pCJ-MetB-CL의 모식도이다.
도 5 는 다양한 효소의 O-숙시닐-L-호모세린 소모에 대한 반응 곡선이다.
각 번호에 사용된 효소액의 유래는 다음과 같다. 21번은 특정 유전자를 포함하지 않은 세포 추출액을 이용하였다.
균주 균주번호 (ATCC) 유전자명 (KEGG) 기질특이성
OSH OAH
에스케리치아 콜리 (Escherichia Coli K12) 55151 MetB + +
슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aurogenosa) 17933 MetZ +++ +
MetY ++++ ++++
슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 17390 MetZ ++++ +
코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) 13032 MetB + +
MetY + +
렙토스피라 메에리 (Leptospira meyeri) 43278 MetY + ++
사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 2704 Met25 + +
크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium Violaceum) 12472 MetZ ++++ +++
노카디아 파르시니카 (Nocardia Farcinica) 3318 MetZ ++++ +
브라디리조비움 자포니쿰 (Bradyrhizobium Japonicum) 10324 MetZ + +
하이호모나스 넵튜니움 (Hyphomonas Neptunium) 49408 MetZ + ++++
메틸로코커스 캡슐라투스 (Methylococcus Capsulatus) 19069D-5 MetZ + +
메틸로바실러스 플라겔라투스 (Methylobacillys Flagellatus) 51484D MetZ + +
니트로소모나스 유로파에 (Nitrosomonas Europaea) 19718D MetZ + +
크렙시엘라 뉴모니애 (Klesiella Pneumoniae) 25955 MetB + +
바실러스속 섭틸리스 (Bacillus Subtilis) 10783 MetB + +
쉬겔라속 플렉스네리 2457T (Shigella flexneri 2457T) 700930D-5 MetB + +
도 6은 다양한 효소의 O-아세틸-L-호모세린 소모에 대한 반응 곡선이다. 각 번호는 도 5와 같다.
도7 은 전환반응에 사용된 각 효소의 아미노산 서열을 DNAstar의 megalign 방법을 이용하여 정렬한 그림이다.
도8 또한 전환반응에 사용된 각 효소의 아미노산 서열을 DNAstar의 megalign 방법을 이용하여 정렬한 그림이다.
<110> CJ Corporation <120> Microorganism producing L-methionine precursor and method of producing L-methionine and organic acid using the L-methionine precursor <130> PP07-0108 <150> KR 10-2006-71581 <151> 2006-07-28 <160> 71 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of Chloramphenichol <400> 1 ttactctggt gcctgacatt tcaccgacaa agcccaggga acttcatcac gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of Chloramphenichol <400> 2 ttaccccttg tttgcagccc ggaagccatt ttccaggtcg gcaattaaat catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 3 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of kanamycin <400> 3 aaagaatatg ccgatcggtt cgggcttagg ctccagtgcc tgttcggtgg gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 4 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of kanamycin <400> 4 agacaaccga catcgctttc aacattggcg accggagccg ggaaggcaaa catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 5 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of Chloramphenichol <400> 5 atggctgaat ggagcggcga atatatcagc ccatacgctg agcacggcaa ggtgtaggct 60 ggagctgctt c 71 <210> 6 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of Chloramphenichol <400> 6 gtattcccac gtctccgggt taatccccat ctcacgcatg atctccatat gaatatcctc 60 cttag 65 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 7 gggctttgtc ggtgaaatg 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 8 actttgcgat gagcgagag 19 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 9 aatggatcct gccgtgagcg gcgaatac 28 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 10 agctctagac tgctgaggta cgtttcgg 28 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Leptospira meyeri <400> 11 catatgccta cctccgaaca gaa 23 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Leptospira meyeri <400> 12 aagctttcaa aggaaaactc cttcgt 26 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 13 gagatatacc atggtgacgc gtaaacaggc cac 33 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 14 ccgcaagctt tttacccctt gtttgcagcc 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 15 ggaattccat atgactcagg actgggatgc 30 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 16 ccttaattaa tcacagcgcg gccagcc 27 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 17 ggaattccat atgacggatc aatgggatgc 30 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Pseudomonas putida <400> 18 ccttaattaa tcacaatgcc gccagcc 27 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 19 ggaattccat atgaagctgg aaacgcttg 29 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 20 ccttaattaa tcagccgcgg ctggcctc 28 <210> 21 <211> 29 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 21 cgcaggccat ggtgtctttt gacccaaac 29 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 22 ccgccgaagc ttctaaaggt tattgag 27 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 23 agtcgtcata tgccaaagta cgacaattcc 30 <210> 24 <211> 31 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 24 ctggcaccta ggctagattg cagcaaagcc g 31 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Leptospira meyeri <400> 25 agtcgtcata tggtaggacc atcggggg 28 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Leptospira meyeri <400> 26 ctggcaccta ggttatcaga tattttttaa tgcctctt 38 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 27 ggaattccat atgccatctc atttcgat 28 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 28 ccttaattaa tcatggtttt tggccagc 28 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Chromobacterium violaceum <400> 29 catatggcat ccgacgcgcc g 21 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Chromobacterium violaceum <400> 30 cctaggttag tcaaggcccc gcaa 24 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Nocardia farcinica <400> 31 catatggtga tcaccggcgg cgcg 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Nocardia farcinica <400> 32 cctaggtcag ctcagcgcgt gctc 24 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Bradyrhizobium japonicum <400> 33 catatggtgg atatatccag gccg 24 <210> 34 <211> 24 <212> DNA <213> Bradyrhizobium japonicum <400> 34 cctaggtcac gccttctcca gcgc 24 <210> 35 <211> 25 <212> DNA <213> Hyphomonas Neptunium <400> 35 ggatccgatg gcggatgcac ccggc 25 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Hyphomonas Neptunium <400> 36 aagctttcac aagctgttaa gcga 24 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Methylococcus capsulatus <400> 37 catatggaga cccgggccgt g 21 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Methylococcus capsulatus <400> 38 cctaggtcag gcgaagcgag cca 23 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Methylobacillus Flagellatus <400> 39 catatgagtc agcatgaatg gcatg 25 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Methylobacillus Flagellatus <400> 40 cctaggagtc agcatgaatg gcatg 25 <210> 41 <211> 22 <212> DNA <213> Nitrosomonas europaea <400> 41 catatgacga acgatctgga tc 22 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Nitrosomonas europaea <400> 42 cctaggttat tgcaatccgc gagca 25 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Klesiella pneumoniae <400> 43 catatgacgc gtaaacaggc cac 23 <210> 44 <211> 25 <212> DNA <213> Klesiella pneumoniae <400> 44 cctaggttat tcctcgtttg ctgcc 25 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 45 catatgtcac agcacgttga aac 23 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 46 cctaggttac tcaaatgaaa cagctcc 27 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Shigella flexneri 2457T <400> 47 catatgacgc gtaaacaggc cacc 24 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> Shigella flexneri 2457T <400> 48 cctaggttac cccttgtttg cagcccg 27 <210> 49 <211> 33 <212> DNA <213> Colwellia Psychrerythraea <400> 49 catatgtcga ttactaaaaa aggtaatatt acc 33 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Colwellia Psychrerythraea <400> 50 cctaggttac agttggctct gcgttaaacc 30 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Salmonella enterica serovar Paratyphi A <400> 51 catatgacgc gtaaacaggc cac 23 <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> Salmonella enterica serovar Paratyphi A <400> 52 cctaggttac cccttgtttg cagcccg 27 <210> 53 <211> 403 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 53 Met Thr Gln Asp Trp Asp Ala Gly Arg Leu Asp Ser Asp Leu Glu Gly 1 5 10 15 Ala Ala Phe Asp Thr Leu Ala Val Arg Ala Gly Gln Arg Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Gly Glu His Gly Glu Ala Leu Phe Thr Thr Ser Ser Tyr Val Phe 35 40 45 Arg Thr Ala Ala Asp Ala Ala Ala Arg Phe Ala Gly Glu Val Pro Gly 50 55 60 Asn Val Tyr Ser Arg Tyr Thr Asn Pro Thr Val Arg Thr Phe Glu Glu 65 70 75 80 Arg Ile Ala Ala Leu Glu Gly Ala Glu Gln Ala Val Ala Thr Ala Ser 85 90 95 Gly Met Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Met Ser Leu Cys Ser Ser Gly 100 105 110 Asp His Val Leu Val Ser Arg Ser Val Phe Gly Ser Thr Ile Ser Leu 115 120 125 Phe Asp Lys Tyr Phe Lys Arg Phe Gly Ile Gln Val Asp Tyr Pro Pro 130 135 140 Leu Ser Asp Leu Ala Ala Trp Glu Ala Ala Cys Lys Pro Asn Thr Lys 145 150 155 160 Leu Phe Phe Val Glu Ser Pro Ser Asn Pro Leu Ala Glu Leu Val Asp 165 170 175 Ile Ala Ala Leu Ala Glu Ile Ala His Ala Lys Gly Ala Leu Leu Ala 180 185 190 Val Asp Asn Cys Phe Cys Thr Pro Ala Leu Gln Gln Pro Leu Lys Leu 195 200 205 Gly Ala Asp Val Val Ile His Ser Ala Thr Lys Tyr Ile Asp Gly Gln 210 215 220 Gly Arg Gly Met Gly Gly Val Val Ala Gly Arg Gly Glu Gln Met Lys 225 230 235 240 Glu Val Val Gly Phe Leu Arg Thr Ala Gly Pro Thr Leu Ser Pro Phe 245 250 255 Asn Ala Trp Leu Phe Leu Lys Gly Leu Glu Thr Leu Arg Ile Arg Met 260 265 270 Gln Ala His Ser Ala Ser Ala Leu Ala Leu Ala Glu Trp Leu Glu Arg 275 280 285 Gln Pro Gly Ile Glu Arg Val Tyr Tyr Ala Gly Leu Gln Ser His Pro 290 295 300 Gln His Glu Leu Ala Arg Arg Gln Gln Ser Gly Phe Gly Ala Val Val 305 310 315 320 Ser Phe Asp Val Lys Gly Gly Arg Asp Ala Ala Trp Arg Phe Ile Asp 325 330 335 Ala Thr Arg Met Val Ser Ile Thr Thr Asn Leu Gly Asp Thr Lys Thr 340 345 350 Thr Ile Ala His Pro Ala Thr Thr Ser His Gly Arg Leu Ser Pro Glu 355 360 365 Asp Arg Ala Arg Ala Gly Ile Gly Asp Ser Leu Ile Arg Val Ala Val 370 375 380 Gly Leu Glu Asp Leu Asp Asp Leu Lys Ala Asp Met Ala Arg Gly Leu 385 390 395 400 Ala Ala Leu <210> 54 <211> 403 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 54 Met Thr Asp Gln Trp Asp Ala Gly Arg Leu Asp Ser Asp Leu Glu Gly 1 5 10 15 Val Gly Phe Asp Thr Leu Ala Val Arg Ala Gly Gln His Arg Thr Pro 20 25 30 Glu Gly Glu His Ser Glu Ala Leu Phe Leu Thr Ser Ser Tyr Val Phe 35 40 45 Arg Thr Ala Ala Asp Ala Ala Ala Arg Phe Ala Gly Glu Thr Pro Gly 50 55 60 Asn Val Tyr Ser Arg Tyr Thr Asn Pro Ser Val Arg Ala Phe Glu Glu 65 70 75 80 Arg Leu Ala Ala Met Glu Gly Ala Glu Gln Ala Val Gly Thr Ser Thr 85 90 95 Gly Met Ala Ala Ile Leu Ala Val Val Met Ser Leu Cys Ser Ala Gly 100 105 110 Asp His Val Leu Val Ser Gln Ser Val Phe Gly Ser Thr Ile Ser Leu 115 120 125 Phe Glu Lys Tyr Phe Lys Arg Phe Gly Val Gln Val Asp Tyr Val Pro 130 135 140 Leu Val Asp Leu Ala Gly Trp Glu Lys Ala Ile Lys Ala Asn Thr Arg 145 150 155 160 Leu Leu Ile Val Glu Ser Pro Ser Asn Pro Leu Ala Glu Leu Val Asp 165 170 175 Ile Thr Ala Leu Ser Glu Ile Ala His Ala His Gly Ala Met Leu Val 180 185 190 Val Asp Asn Cys Phe Ser Thr Pro Ala Leu Gln Gln Pro Leu Lys Leu 195 200 205 Gly Ala Asp Ile Val Phe His Ser Ala Thr Lys Phe Ile Asp Gly Gln 210 215 220 Gly Arg Cys Met Gly Gly Val Val Ala Gly Arg Ala Glu Gln Met Lys 225 230 235 240 Glu Val Val Gly Phe Leu Arg Thr Ala Gly Pro Thr Leu Ser Pro Phe 245 250 255 Asn Ala Trp Ile Phe Thr Lys Gly Leu Glu Thr Leu Arg Leu Arg Met 260 265 270 Arg Ala His Cys Glu Ser Ala Gln Ala Leu Ala Glu Trp Leu Glu Gln 275 280 285 Gln Asp Gly Val Glu Lys Val His Tyr Ala Gly Leu Pro Ser His Pro 290 295 300 Gln His Ala Leu Ala Lys Arg Gln Met Ser Gly Phe Gly Ala Val Val 305 310 315 320 Ser Phe Glu Val Lys Gly Gly Lys Glu Gly Ala Trp Arg Phe Ile Asp 325 330 335 Ala Thr Arg Val Ile Ser Ile Thr Thr Asn Leu Gly Asp Ser Lys Thr 340 345 350 Thr Ile Ala His Pro Ala Thr Thr Ser His Gly Arg Leu Ser Pro Gln 355 360 365 Glu Arg Glu Ala Ala Gly Ile Arg Asp Ser Leu Ile Arg Val Ala Val 370 375 380 Gly Leu Glu Asp Val Ala Asp Leu Gln Ala Asp Leu Ala Arg Gly Leu 385 390 395 400 Ala Ala Leu <210> 55 <211> 425 <212> PRT <213> Pseudomonas putida <400> 55 Met Lys Leu Glu Thr Leu Ala Ile His Ala Gly Phe Ser Pro Asp Pro 1 5 10 15 Thr Thr Lys Ala Val Ala Val Pro Ile Tyr Gln Thr Thr Ser Phe Ala 20 25 30 Phe Asp Asp Thr Gln His Gly Ala Asp Leu Phe Asp Leu Lys Val Ala 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Ser Arg Ile Met Asn Pro Thr Asn Asp Val Leu Glu 50 55 60 Gln Arg Met Ala Ala Leu Glu Gly Gly Val Gly Ala Leu Ala Val Ala 65 70 75 80 Ser Gly Met Ala Ala Ile Thr Tyr Ala Ile Gln Thr Val Ala Glu Ala 85 90 95 Gly Asp Asn Ile Val Ser Val Ala Lys Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Asn 100 105 110 Leu Leu Ala His Thr Leu Pro Arg Met Gly Ile His Thr Arg Phe Ala 115 120 125 Ala His Asp Asp Ile Ala Ala Leu Glu Ala Leu Ile Asp Ala Arg Thr 130 135 140 Lys Ala Val Phe Cys Glu Ser Ile Gly Asn Pro Ala Gly Asn Ile Val 145 150 155 160 Asp Ile Ala Ala Leu Ala Glu Ala Ala His Arg His Gly Val Pro Leu 165 170 175 Ile Val Asp Asn Thr Val Ala Thr Pro Val Leu Cys Arg Pro Phe Glu 180 185 190 His Gly Ala Asp Ile Val Val His Ser Leu Thr Lys Tyr Ile Gly Gly 195 200 205 His Gly Thr Ser Ile Gly 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Nocardia farcinica <400> 57 Val Ile Thr Gly Gly Ala Phe Asp Lys Pro Leu Pro Glu Gly Val Gly 1 5 10 15 Pro Ala Thr Leu Gly Val Arg Gly Gly Leu Arg Arg Ser Gly Phe Glu 20 25 30 Glu Thr Ala Glu Ala Leu Tyr Leu Thr Ser Gly Phe Val Tyr Glu Ser 35 40 45 Ala Glu Ala Ala Glu Ala Ala Phe Thr Gly Glu Val Glu His Phe Val 50 55 60 Tyr Ser Arg Tyr Gly Asn Pro Thr Val Ala Met Phe Glu Glu Arg Ile 65 70 75 80 Arg Leu Met Asp Gly Ala Glu Ala Ala Phe Ala Thr Ala Ser Gly Met 85 90 95 Ser Ala Val Phe Thr Ala Leu Gly Ala Leu Leu Gly Ala Gly Asp Arg 100 105 110 Leu Val Ala Ala Arg Ser Leu Phe Gly Ser Cys Phe Val Val Cys Asn 115 120 125 Glu Ile Leu Pro Arg Trp Gly Val Glu Thr Val Phe Val Asp Gly Glu 130 135 140 Asp Leu Asp Gln Trp Glu Arg Ala Leu Ser Val Pro Thr Ala Ala Val 145 150 155 160 Phe Phe Glu Thr Pro Ala Asn Pro Met Gln Thr Leu Val Asp Val Arg 165 170 175 Arg Val Thr Glu Leu Ala His Ala Ala Gly Ala Lys Val Val Leu Asp 180 185 190 Asn Val Phe Ala Thr Pro Leu Leu Gln Lys Gly Phe Asp Leu Gly Ala 195 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Japonicum <400> 58 Val Asp Ile Ser Arg Pro Val Phe Phe Val Thr Val Phe Asp Glu Thr 1 5 10 15 Val Met Ser Glu Val Pro Met Ser Lys Ser Pro Ala Thr Tyr Arg Pro 20 25 30 Glu Thr Arg Leu Val His Ser Gly Thr Leu Arg Ser Gln Phe Gly Glu 35 40 45 Thr Ser Glu Ala Leu Phe Leu Thr Gln Gly Tyr Val Tyr Asn Ser Ala 50 55 60 Glu Glu Cys Glu Ala Arg Phe Lys Gly Glu Asp Pro Gly Phe Ile Tyr 65 70 75 80 Ser Arg Tyr Ser Asn Pro Thr Ile Ser Met Phe Glu Arg Arg Met Ile 85 90 95 Glu Leu Glu Gly Ala Glu Ala Ala Arg Ser Ala Ala Thr Gly Met Ala 100 105 110 Ala Val Thr Thr Ala Ile Leu Ala Pro Leu Lys Thr Gly Asp His Val 115 120 125 Val Ala Ser Arg Ala Leu Phe Gly Ser Cys Leu Tyr Val Ile Gln Asp 130 135 140 Leu Leu Pro Arg Tyr Gly Ile Glu Thr Thr Leu Val Asp Gly Leu Asp 145 150 155 160 Leu Asp Gln Trp Gln Arg Ala Leu Arg Pro Asn Thr Lys Thr Phe Phe 165 170 175 Leu Glu Ser Pro Thr Asn Pro Thr Leu Asp Val Leu Asp Ile Pro Gly 180 185 190 Ile Ala Glu Ile Ala His Lys Gly Gly Ala Arg Leu Val Val Asp Asn 195 200 205 Val 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Methylococcus Capsulatus <400> 60 Met Glu Thr Arg Ala Val Arg Ala Gly Gln Arg Arg Thr Met Glu Gln 1 5 10 15 Glu His Ala Glu Pro Ile Phe Ala Thr Ser Ser Tyr Val Phe Ala Ser 20 25 30 Ala Ala Glu Ala Ala Glu Arg Phe Ala Gly Lys Ala Ala Gly Asn Ile 35 40 45 Tyr Ser Arg Phe Thr Asn Pro Thr Val Arg Thr Phe Glu Glu Arg Leu 50 55 60 Ala Ala Leu Glu Gly Gly Glu Arg Cys Val Ala Val Gly Ser Gly Met 65 70 75 80 Ala Ala Ile Ala Ser Thr Ala Phe Gly Leu Leu Lys Ala Gly Asp His 85 90 95 Val Val Cys Ser Arg Ser Val Phe Gly Asn Thr Thr Leu Leu Phe Gln 100 105 110 Asn Tyr Leu Ala Lys Phe Gly Val Pro Thr Thr Phe Val Gly Leu Thr 115 120 125 Asp Tyr Asp Gly Trp Ala Ala Ala Ile Arg Pro Glu Thr Arg Phe Leu 130 135 140 Phe Ile Glu Thr Pro Ser Asn Pro Leu Thr Glu Ile Ala Asp Ile Pro 145 150 155 160 Arg Leu Ala Glu Ile Ala His Ser Arg Gly Cys Leu Leu Val Val Asp 165 170 175 Asn Cys Phe Cys Thr Pro Ala Leu Gln Arg Pro Leu Ala Leu Gly Ala 180 185 190 Asp Ile Val Ile His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Asp Gly Gln Gly Arg 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Phe Ser Ser Gly Met Ala Ala Ile 65 70 75 80 Gln Thr Ile Met Ala Leu Phe Lys Ser Gly Asp Glu Leu Ile Val Ser 85 90 95 Ser Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Glu Trp Lys 100 105 110 Lys Tyr Gly Leu Thr Phe His Tyr Asp Asp Phe Ser Asp Glu Asp Cys 115 120 125 Leu Arg Ser Lys Ile Thr Pro Asn Thr Lys Ala Val Phe Val Glu Thr 130 135 140 Pro Thr Asn Pro Leu Met Gln Glu Ala Asp Ile Glu His Ile Ala Arg 145 150 155 160 Ile Thr Lys Glu His Gly Leu Leu Leu Ile Val Asp Asn Thr Phe Tyr 165 170 175 Thr Pro Val Leu Gln Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Asp Ile Val Ile 180 185 190 His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Leu Leu Ala Gly 195 200 205 Leu Val Val Val Lys Asp Glu Arg Leu Gly Glu Glu Met Phe Gln His 210 215 220 Gln Asn Ala Ile Gly Ala Val Leu Pro Pro Phe Asp Ser Trp Leu Leu 225 230 235 240 Met Arg Gly Met Lys Thr Leu Ser Leu Arg Met Arg Gln His Gln Ala 245 250 255 Asn Ala Gln Glu Leu Ala Ala Phe Leu Glu Glu Gln Glu Glu Ile Ser 260 265 270 Asp Val Leu Tyr Pro Gly Lys Gly Gly Met 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Phe Asp Ser Leu Ala 100 105 110 Lys Arg Gly Cys Tyr Arg Val Leu Phe Val Asp Gln Gly Asp Glu Gln 115 120 125 Ala Leu Arg Ala Ala Leu Ala Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Val Glu 130 135 140 Ser Pro Ser Asn Pro Leu Leu Arg Val Val Asp Ile Ala Lys Ile Cys 145 150 155 160 His Leu Ala Arg Glu Val Gly Ala Val Ser Val Val Asp Asn Thr Phe 165 170 175 Leu Ser Pro Ala Leu Gln Asn Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Leu Val 180 185 190 Leu His Ser Cys Thr Lys Tyr Leu Asn Gly His Ser Asp Val Val Ala 195 200 205 Gly Val Val Ile Ala Lys Asp Pro Asp Val Val Thr Glu Leu Ala Trp 210 215 220 Trp Ala Asn Asn Ile Gly Val Thr Gly Gly Ala Phe Asp Ser Tyr Leu 225 230 235 240 Leu Leu Arg Gly Leu Arg Thr Leu Val Pro Arg Met Glu Leu Ala Gln 245 250 255 Arg Asn Ala Gln Ala Ile Val Lys Tyr Leu Gln Thr Gln Pro Leu Val 260 265 270 Lys Lys Leu Tyr His Pro Ser Leu Pro Glu Asn Gln Gly His Glu Ile 275 280 285 Ala Ala Arg Gln Gln Lys Gly Phe Gly Ala Met Leu Ser Phe Glu Leu 290 295 300 Asp Gly Asp Glu Gln Thr Leu Cys Arg Phe Leu Gly Gly Leu Ser Leu 305 310 315 320 Phe Thr Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Ser His 325 330 335 Ala Ala Thr Met Thr His Ala Gly Met Ala Pro Glu Ala Arg Ala Ala 340 345 350 Ala Gly Ile Ser Glu Thr Leu Leu Arg Ile Ser Thr Gly Ile Glu Asp 355 360 365 Gly Glu Asp Leu Ile Ala Asp Leu Glu Asn Gly Phe Arg Ala Ala Asn 370 375 380 Lys Gly 385 <210> 66 <211> 388 <212> PRT <213> Colwellia Psychrerythraea <400> 66 Met Ser Ile Thr Lys Lys Gly Asn Ile Thr Thr Ser Ala Val Arg Ala 1 5 10 15 Gly Ile Asn Thr Asp Gln Gln His Gly Ala Val Val Ala Pro Ile Tyr 20 25 30 Leu Ser Ser Thr Tyr Ser Leu Lys Gly Phe Asn Asn Lys Arg Gln Phe 35 40 45 Asp Tyr Ser Arg Thr Gly Asn Pro Thr Arg Ala Thr Phe Ala Gly Ala 50 55 60 Ile Ala Glu Leu Glu Gln Gly Ser Val Gly Ile Val Thr Ser Thr Gly 65 70 75 80 Met Ala Ala Val His Leu Ile Cys Gln Leu Leu Ser Thr Gln Asp Thr 85 90 95 Val Val Ile Pro His Asp Cys Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Leu Phe Thr 100 105 110 His Leu Ala Lys Arg Gly Gln Phe Lys Leu Ile Val Val Asp Gln Asn 115 120 125 Asp Gln Gln Ala Leu Asp Asn Ala Leu Ala His Lys Pro Lys Leu Val 130 135 140 Leu Leu Glu Ser Pro Ser Asn Pro Leu Leu Arg Leu Val Asp Ile Glu 145 150 155 160 Val Val Thr Lys Ala Cys His Ala Val Gly Ala Leu Val Ala Val Asp 165 170 175 Asn Thr Phe Leu Ser Pro Ala Leu Gln Gln Pro Leu Thr Leu Gly Ala 180 185 190 Asp Ile Val Phe His Ser Thr Thr Lys Tyr Ile Asn Gly His Ser Asp 195 200 205 Val Val Gly Gly Val Val Val Ala Lys Thr Glu Glu Leu Gly Glu Gln 210 215 220 Leu Ala Trp Trp Ala Asn Cys Ile Gly Ile Thr Gly Ser Ala Phe Asp 225 230 235 240 Ser Phe Leu Ala Leu Arg Gly Leu Lys Thr Leu Pro Val Arg Met Lys 245 250 255 Gln His Gln Glu Asn Ala Leu Arg Val Ala Asp Phe Leu Lys Asn His 260 265 270 Asp Ala Ile Asp Ala Ile Tyr Phe Pro Gly Phe Pro Glu His Thr Gly 275 280 285 His His Ile Ala Lys Lys Gln Gln Tyr Gly Phe Gly Ala Met Leu Ser 290 295 300 Phe Glu Ile Lys Gly Asp Val Glu Ala Val Lys Lys Leu Phe Glu Asn 305 310 315 320 Leu Glu Leu Phe Thr Leu Ala Gln Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu 325 330 335 Ile Ser His Pro Ser Thr Met Thr His Ala Gly Met Thr Ile Pro Asp 340 345 350 Gln Leu Glu Ala Gly Ile Thr Gln Ser Leu Val Arg Ile Ser Val Gly 355 360 365 Ile Glu Asp Ile Asp Asp Ile Leu Ala Asp Leu Ala His Gly Leu Thr 370 375 380 Gln Ser Gln Leu 385 <210> 67 <211> 386 <212> PRT <213> Salmonella enterica serovar Paratyphi A <400> 67 Met Thr Arg Lys Gln Ala Thr Ile Ala Val Arg Ser Gly Leu Asn Asp 1 5 10 15 Asp Glu Gln Tyr Gly Cys Val Val Pro Pro Ile His Leu Ser Ser Thr 20 25 30 Tyr Asn Phe Thr Gly Phe Asn Glu Pro Arg Ala His Asp Tyr Ser Arg 35 40 45 Arg Gly Asn Pro Thr Arg Asp Val Val Gln Arg Ala Leu Ala Glu Leu 50 55 60 Glu Gly Gly Ala Gly Ala Val Leu Thr Asn Thr Gly Met Ser Ala Ile 65 70 75 80 His Leu Val Thr Thr Val Phe Leu Lys Pro Gly Asp Leu Leu Val Ala 85 90 95 Pro His Asp Cys Tyr Gly Gly Ser Tyr Arg Leu Phe Asp Ser Leu Ala 100 105 110 Thr Arg Gly Cys Tyr Cys Val Arg Phe Val Asp Gln Gly Asp Glu Arg 115 120 125 Ala Leu Gln Ala Ala Leu Glu Glu Lys Pro Lys Leu Val Leu Val Glu 130 135 140 Ser Pro Ser Asn Pro Leu Leu Arg Val Val Asp Ile Ala Lys Ile Cys 145 150 155 160 Arg Leu Ala Arg Glu Ala Gly Ala Val Ser Val Val Asp Asn Thr Phe 165 170 175 Leu Ser Pro Ala Leu Gln Asn Pro Leu Ala Leu Gly Ala Asp Leu Val 180 185 190 Leu His Ser Cys Thr Lys Tyr Leu Asn Gly His Ser Asp Val Val Ala 195 200 205 Gly Val Val Ile Ala Lys Asp Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Ala Trp 210 215 220 Trp Ala Asn Asn Ile Gly Val Thr Gly Gly Ala Phe Asp Ser Tyr Leu 225 230 235 240 Leu Leu Arg Gly Leu Arg Thr Leu Val Pro Arg Met Glu Leu Ala Gln 245 250 255 Arg Asn Ala Gln Ala Ile Val Lys Tyr Leu Gln Thr Gln Pro Leu Val 260 265 270 Lys Lys Leu Tyr His Pro Ser Leu Pro Glu Asn Gln Gly His Glu Ile 275 280 285 Ala Ala Arg Gln Gln Lys Gly Phe Gly Ala Met Leu Ser Phe Glu Leu 290 295 300 Asp Gly Asp Glu Glu Thr Leu Arg Arg Phe Leu Gly Gly Leu Ser Leu 305 310 315 320 Phe Thr Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Ser His 325 330 335 Ala Ala Thr Met Thr His Ala Gly Met Ser Pro Gln Ala Arg Ala Ala 340 345 350 Ala Gly Ile Ser Glu Thr Leu Leu Arg Ile Ser Thr Gly Ile Glu Asp 355 360 365 Gly Glu Asp Leu Ile Ala Asp Leu Gly Asn Gly Phe Arg Ala Ala Asn 370 375 380 Lys Gly 385 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 68 catatgccca ccctcgcgcc 20 <210> 69 <211> 25 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 69 aagcttttag atgtagaact cgatg 25 <210> 70 <211> 70 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 70 caatttcttg cgtgaagaaa acgtctttgt gatgacaact tctcgtgcgt gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 71 <211> 70 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 71 aatccagcgt tggattcatg tgccgtagat cgtatggcgt gatctggtag catatgaata 60 tcctccttag 70

Claims (58)

1) O-아세틸-L-호모세린 또는 O-숙시닐-L-호모세린으로부터 선택되는 O-아실호모세린의 분해에 관여하는 시스타치오닌 감마 신타아제(cystathionine gamma synthase) 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라아제(O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 또는 O-아세틸호모세린 설피드릴라아제(O-acetylhomoserine sulfhydrylase)의 활성을 결손 또는 약화시키고, 동시에
호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라아제(homoserine O-succinyl transferase) 또는 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제(homoserine O-acetyl transferase)의 활성을 강화시킨 O-아실호모세린 생산균주를 배양하여 발효에 의해 O-아실호모세린을 생산하는 단계; 및
2) 상기 단계로부터 생산된 O-아실호모세린을 기질로 이용하여, 시스타치오닌 감마 신타아제 (cystathionine gamma synthase), O-숙시닐호모세린 설피드릴라제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 및 O-아세틸호모세린 설피드릴라제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase)의 활성을 갖는 효소로 이루어진 군 중에서 선택된 전환효소를 이용하여 효소 반응을 일으킴으로써 L-메치오닌 및 유기산을 생산하는 단계;
를 포함하는 L-메치오닌 및 유기산을 생산하는 방법.
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제 1 항에 있어서,
상기 시스타치오닌 감마 신타아제 (cystathionine gamma synthase) 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 또는 O-아세틸호모세린 설피드릴라제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase)는 각각 metB, 또는 metZ, 또는 metY 유전자에 의해 코딩되고, O-숙시닐 트랜스퍼라아제는 metA 유전자로 코딩되며, 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제는 metX 유전자로 코딩되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 O-아실호모세린 생산 균주는 쓰레오닌 생합성 경로가 약화 또는 결손된 균주를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서,
쓰레오닌 생합성 경로에 관여하는 호모세린 카이네이즈 효소가 결손 또는 약화된 것을 특징으로 하는 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 호모세린 카이네이즈를 코딩하는 유전자가 thrB 인 것을 특징으로 하는 방법.
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제1항에 있어서,
상기 O-아실호모세린의 1종인 O-아세틸-L-호모세린의 합성을 강화시키기 위하여, 미생물 균주 고유의 호모세린 O-숙시닐 트랜스퍼라아제를 결손시킨 후 신규의 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라아제를 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
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제1항에 있어서,
상기 O-아실호모세린 생산 균주가 메치오닌 요구성이 해제된 쓰레오닌 생산균주인 Escherichia coli MF001 (수탁번호 : KCCM-10568)로부터 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 O-아실호모세린 생산 균주가 O-숙시닐 호모세린 생산균주인 Escherichia coli CJM-BTJ(pMetA-CL) (수탁번호: KCCM-10767)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 O-아실호모세린 생산 균주가 O-숙시닐 호모세린 생산균주인 Escherichia coli CJM-BTJ(pCJ-MetA-CL) (수탁번호: KCCM-10872)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 O-아실호모세린 생산 균주가 O-아세틸 호모세린 생산균주인 Escherichia coli CJM-BTJA(pCJ-MetX-CL) (수탁번호: KCCM-10873)인 것을 특징으로 하는 방법.
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제 1 항에 있어서,
2단계의 O-아실호모세린을 메치오닌으로 전환하는 전환 효소가 에스케리키아(Escherichia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 슈도모나스 (Pseudomonas) 속, 렙토스피라 (Leptospira) 속, 살모넬라(Salmonellar) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 하이포모나스 (hyphomonas) 속, 크로모박테리움 (Chromobactorium) 속, 노카디아 (Norcardia) 속 또는 효모류 (yeast) 에서 선택되는 균주로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
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제 1 항에 있어서,
2단계의 O-아실호모세린을 메치오닌으로 전환하는 전환 효소가 하기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 균주로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 방법.
균주 에스케리치아 콜리 (Escherichia Coli ) 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aurogenosa) 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida) 코리네박테리아 글루타미컴 (Corynebacteria glutamicum) 렙토스피라 메에리 (Leptospira meyeri) 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 크로모박테리움 비오라슘 (Chromobacterium Violaceum) 노카디아 파르시니카 (Nocardia Farcinica) 브라디리조비움 자포니쿰 (Bradyrhizobium Japonicum) 하이호모나스 넵튜니움 (Hyphomonas Neptunium) 메틸로코커스 캡슐라투스 (Methylococcus Capsulatus) 메틸로바실러스 플라겔라투스 (Methylobacillus Flagellatus) 니트로소모나스 유로파에 (Nitrosomonas Europaea) 크렙시엘라 뉴모니애 (Klesiella Pneumoniae) 바실러스속 섭틸리스 (Bacillus Subtilis) 쉬겔라속 플렉스네리 (Shigella flexneri ) 코웰리아 사이크레리스라애 (Colwellia Psychrerythraea) 살모넬라 엔티가 serovar Paratyphi A (Salmonella enterica serovar Paratyphi A)
제1항에 있어서,
2단계의 O-아실호모세린을 L-메치오닌으로 전환하는 전환 효소가 슈도모나스 푸티다, 슈도모나스 애루기노사, 크로모박테리움 비오라슘, 렙토스피라 메에리, 하이포모나스 넵튜니움으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
제1 항에 있어서,
2단계의 O-아실호모세린을 메치오닌으로 전환하는 효소 반응이 시스타치오닌 감마 신타아제 (cystathionine gamma synthase) 또는 O-숙시닐호모세린 설피드릴라제 (O-succinylhomoserine sulfhydrylase) 또는 O-아세틸호모세린 설피드릴라제 (O-acetylhomoserine sulfhydrylase) 의 활성을 갖는 효소 또는 이 효소 활성을 보유하고 있는 균주를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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제 1 항에 있어서,
상기 유기산이 숙신산 또는 아세트산인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 1) 단계의 O-아실호모세린 생산균주가 에스케리키아(Escherichia) 속에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 1)단계의 O-아실호모세린 생산 균주로 에스케리키아 콜라이(Escherichia Coli)를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
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