KR101136248B1

KR101136248B1 - Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 이를 이용한 ｌ-메치오닌 전구체의 생산 방법

Info

Publication number: KR101136248B1
Application number: KR1020090029634A
Authority: KR
Inventors: 신용욱; 김소영; 장진숙; 조영욱; 이한진; 허인경; 나광호; 서창일; 김철하; 엄혜원
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2008-04-04
Filing date: 2009-04-06
Publication date: 2012-04-20
Anticipated expiration: 2029-04-06
Also published as: KR20090106365A

Abstract

본 발명은 L-메치오닌 전구체의 생산 균주 및 상기 균주를 이용하여 L-메치오닌 전구체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 1) 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성(EC2.3.1.46)이 도입 및 증진되며, 상기 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제는 메치오닌에 대한 피드백 저항성을 가지며; 및 2) 아스파토키나아제 또는 호모세린 디하드로게나아제 활성(EC2.7.2.4 또는 1.1.1.3)이 증진된, O-숙시닐호모세린을 생산할 수 있는 균주 및 상기 균주를 이용하여 L-메치오닌 전구체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

메티오닌, O-숙시닐트랜스퍼라아제

Description

Ｌ-메치오닌 전구체 생산 균주 및 이를 이용한 Ｌ-메치오닌 전구체의 생산 방법 {Microorganism producing L-methionine precursor and the method of producing L-methionine precursor using the microorganism }

본 발명은 L-메치오닌 전구체(Methionine precursor)의 전구체인 O-숙시닐호모세린(O-succinylhomoserine)을 생산하는 균주와 이 균주를 이용하여 L-메치오닌 전구체를 생산하는 방법에 관한 것이다.

메치오닌은 인간에게 필요한 필수 아미노산 중의 하나로 사료 및 음식물 첨가제뿐만 아니라 의학용제 및 의학보충제의 합성 원료로도 사용된다. 메치오닌은 콜린(레시틴)과 크레아틴과 같은 합성물의 전구체 역할을 하는 동시에 시스테인(Cycteine) 및 타우린(Taurin)의 합성 원료로도 사용된다. 또한, 메치오닌은 황(Sulfur)을 제공하는 역할을 한다. S-아데노실-메치오닌(S-adenosyl-methionine)은 L-메치오닌으로부터 유래하며, 생체 내 메칠(Methyl)기를 제공하는 역할을 하고 두뇌에서 다양한 신경전달물질의 합성에 관여한다. 메치오닌 및/또는 S-아데노실-메치오닌(SAM) 은 생체 내에서 간과 동맥의 지방 축적을 억제하고 우울증, 염증, 간질환 및 근육통을 완화시키는 등 다양한 역할을 한다.

지금까지 알려진 메치오닌 및/또는 S-아데노실-메치오닌의 생체 내(in vivo) 기능은 다음과 같다.

1) 지방대사를 촉진하는 간과 동맥에서 지방축적을 억제하며, 뇌, 심장, 신장의 혈액순환을 향상시킨다(J Hepatol. Jeon BR et al., 2001 Mar; 34(3): 395-401).

2) 소화 작용, 독성물질의 해독이나 배출, 및 납(Pb)과 같은 중금속의 배출을 증진시킨다.

3) 하루에 800-1,600 mg의 투여량으로 항우울증제으로 투여될 수 있다(Am J Clin Nutr. Mischoulon D. et al., 2002 Nov; 76(5): 1158S-61S).

4) 간 기능을 증진시키고(FASEB J. Mato JM., 2002 Jan; 16(1): 15-26) 특히, 알코올에 의해 야기되는 간질환에 효과적이다(Cochrane Database Syst Rev., Rambal야 A., 2001; (4): CD002235).

5) 골관절 질환에 대한 항염증 효과를 보이며 관절회복을 촉진한다(ACP J Club. Sander O., 2003 Jan-Feb; 138(1): 21, J Fam Pract., Soeken KL et al., 2002 May; 51(5): 425-30)

6) 머리카락의 필수영양소이다. 머리카락에 영양을 공급함으로써 탈모를 막는다(Audiol Neurootol., Lockwood DS et al., 2000 Sep-Oct; 5(5): 263-266).

메치오닌은 동물 사료, 식품, 의약품에 적용하기 위하여 화학적으로 또는 생 물학적으로 합성될 수 있다.

화학적인 합성은 주로 5-(β-메칠머캅토에틸)-하이단토인(5-(β-methylmercaptoethyl)-hydantoin)의 가수분해시키는 반응을 통하여 메티오닌을 생산한다. 그러나 이와 같이 화학적으로 합성된 메치오닌은 L-형과 D-형이 혼합된 형태로 생산된다는 단점을 가지고 있다.

생물학적인 합성은 메치오닌 합성에 관여하는 단백질들을 사용하는 방법이다. L-메치오닌은 대장균(E. coli)에서 metA, metB, metC, metE 및 metH와 같은 유전자로부터 발현되는 효소의 작용에 의해 호모세린으로부터 생합성된다. 특히, metA는 메치오닌 생합성의 첫 번째 효소인 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제(succinyltransferase)를 코딩하는 유전자로, 호모세린을 O-숙시닐-L-호모세린(O-succinyl-L-homoserine)으로 전환하는 기능을 한다. metB 유전자에 의해 코딩되는 O-숙시닐호모세인 리아제(O-succinylhomoserine lyase) 또는 시스타치오닌 감마 신차아제(cystathionine gamma synthase)는 O-숙시닐-L-호모세린을 시스타치오닌으로 전환한다. metC가 코딩하는 시스타치오닌 베타 리아제는(cystathionine veta lyase)는 시스타치오닌을 L-호모시스테인(L-homocysteine)으로 전환하는 기능을 한다. metE가 코딩하는 코발라민-비의존적 메치오닌 신차아제(cobalamine-independent methionine synthase)와 metH가 코딩하는 코발라민-비의존적 메치오닌 신차아제(cobalamine-dependent methionine synthase)는 L-호모시스테인을 L-메치오닌으로 전환시킨다. 여기에 metF가 코딩하는 5,10-메칠렌테트라히드로폴레이트 리덕타아제(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase)와 glyA가 코딩하는 세린 히드록시메칠트랜스퍼라아제(serine hydroxymethytransferase)는 함께 작용하여 L-메치오닌 합성에 필수적인 메칠기를 제공하는 N(5)-메칠테트라히드로폴레이트(N(5)-methyltetrahydrofolate)를 합성하는 기능을 한다.

L-메치오닌은 상기 효소에 의한 연쇄적인 유기반응에 의해 합성되며, 상기 단백질 또는 상기 단백질에 영향을 주는 단백질에 유전적인 조작을 가할 경우 L-메치오닌 합성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 일본특허공개공보 제2000/139471호는에스케리치아 (Escherichia sp.)에 하는 게놈 상에 thrBC와 metJ를 제거하고 metBL를 과발현시키고 metK를 리키형으로 제작하여 L-메치오닌을 생산하는 방법을 기재하고 있다. 또한, 미국특허공개공보 제US2003/0092026호는 코리네박테리움 (Corynerbacterium sp.)에 하며 metD(L-메치오닌 합성 저해제) 유전자를 넉아웃(knock-out)시킨 균주를 사용하는 방법을 기재하고 있다. 미국특허공개공보 제2002/0049305호는 5,10-메칠렌테트라히드로폴레이트 리덕타아제(metF) 발현을 증가시켜 L-메치오닌 생산을 증가시키는 방법을 기재하고 있다.

또한, 생물학적 방법에 의해서 생산되는 메치오닌은 L-형이라는 장점이 있으나 그 양이 매우 미량이다. 이는 메치오닌 생합성 경로가 매우 잘 조절되는 피드백 체계를 가지고 있기 때문이다. 메치오닌이 일정 수준 이상으로 합성되면 최종 산물인 메치오닌이 메치오닌 생합성을 개시하는 초기 단백질응ㄹ 코댕하는 metA 유전자 전사를 피드백으로 억제한다. metA 유전자는 전사 단계에서는 메치오닌에 의해 저해를 받고 번역 단계에서는 세포내 프로테아제(Protease)들에 의해 분해되는 기작으로 메치오닌 양을 조절하므로, metA 유전자 고발현만으로는 메치오닌의 양을 일 정수준 이상으로 증가시킬 수 없다 (Dvora Biran, Eyal Gur, Leora Gollan and Eliora Z. Ron: Control of methionine biosynthesis in Escherichia coli by proteolysis: Molecular Microbiology (2000) 37(6), 1436-1443). 따라서, 이전의 많은 특허들은 피드백 조절 체계로부터 metA 유전자의 피드백을 해제하는 연구에 집중되어 있다(국제특허공개공보 제2005/108561호 및 제1403813호).

미국특허공개공보 제2005/0054060호는 황의 원천으로 시스테인을 이용하지 않고 직접 메칠머캅탄(CH₃SH) 또는 히드로겐 설파이드(H₂S)를 사용하도록 변형된 시스타치오닌 신차아제(O-숙시닐호모세린 리아제)에 의해 호모시스테인 또는 메치오닌을 합성하는 방법에 대해 기재하고 있다. 그러나 시스타치오닌 신차아제는 세포에서 다양한 메치오닌 전구체와 결합할 수 있고 그로 인해 높은 수준의 부산물을 생산할 수 있다고 알려져 있다. 예를 들어, 시스타치오닌 신차아제는 O-숙시닐호모세린과 호모시스테인의 부수 반응에 의해 높은 수준의 호모란치오닌(homolanthionin)을 축적한다고 보고되었다(J.Bacteriol (2006) vol 188:p609-618). 따라서, 시스타치오닌 신차아제의 과발현은 부수 반응의 증가에 기인한 세포내 반응의 효율성을 감소시킬 수 있다. 또한, 이 방법에서는 세포 내의 메치오닌 대사경로를 이용하기 때문에 효소의 반응 과정이 비효율적이고, 세포에 심한 독성을 가지는 H₂S 또는 CH₃SH를 사용한다는 점에서 실효성이 떨어지며, 메치오닌 합성 경로의 피드백 조절에 의하여 충분한 양의 메치오닌을 합성할 수 없다는 문제가 있다.

이러한 문제들을 해결하기 위해, 본 발명자는 2 단계, (1) 대장균 (E.coli) 발효에 의해 L-메치오닌 전구체를 생산하는 단계 및 (2) 효소반응에 의해 L-메치오닌 전구체를 L-메치오닌으로 전환시키는 단계로 구성되는 과정을 개발한 바 있다(PCT/KR2007/003650). 상기 두 단계 과정에 의할 경우 황화물 특유의 기질 독성 문제, 메치오닌과 SAMe에 의한 균주의 피드백 조절 문제, 세포 내 효소(예를 들면, 시스타치오닌 감마 신차아제, O-숙시닐호모세린 설프히드릴라아제 및 O-아세틸호모세린 설프히드릴라아제)에 의한 중간산물의 분해 활성 문제를 모두 해결할 수 있다. 게다가, D-메치오닌과 L-메치오닌가 혼합된 형태를 생산하는 화학적인 합성방법과 비교하여, 상기 2 단계 과정은 L-메치오닌만을 선택적으로 생산하는데 매우 효과적이다.

상기 2 단계 과정에서, 메치오닌 전구체의 생산량은 메치오닌 생산량의 증가에 핵심요소 중에 하나이다. 메치오닌 전구체인 O-아세틸 호모세린의 합성량을 증가시키기 위해서, 강력한 아스파토키나아제(aspartokinase), 호모세린 트랜스퍼라아제 및 O-아세틸 호모세린 트랜스퍼라아제의 조합이 정말로 중요하다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 1) 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성(EC2.3.1.46)이 도입 및 증진되며, 상기 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제는 메치오닌에 대한 피드백 저항성을 가지며; 및 2) 아스파토키나아제 또는 호모세린 디하드로게나아제 활성(EC2.7.2.4 또는 1.1.1.3)이 증진된, O-숙시닐호모세린 생산 균주를 개발하였다. 이 균주는 배양액 속의 메치오닌 농도에 상관없이 L-메치오닌 전구체를 높은 농도로 생산할 수 있는 능력을 가지며 L-메치오닌 전구체의 생산이 현저하게 증가될 수 있다.

본 발명의 목적은 1) 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성(EC2.3.1.46)이 도입 및 증진되며, 상기 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제는 메치오닌에 대한 피드백 저항성을 가지며; 및 2) 아스파토키나아제 또는 호모세린 디하드로게나아제 활성(EC2.7.2.4 또는 1.1.1.3)이 증진된, O-숙시닐호모세린을 생산할 수 있는 에스케리치아 (Escherichia sp.) 유래 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 L-메치오닌 전구체를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 1) 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성(EC2.3.1.46)이 도입 및 증진되며, 상기 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제는 메치오닌에 대한 피드백 저항성을 가지며; 및 2) 아스파토키나아제 또는 호모세린 디하드로게나아제 활성(EC2.7.2.4 또는 1.1.1.3)이 증진된, O-숙시닐호모세린을 생산할 수 있는 에스케리치아 (Escherichia sp.) 유래 균주에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 용어, "L-메치오닌 전구체"는 메치오닌 특화 대사 경로의 일부분인 대사물질 또는 이 대사물질에서 파생된 물질을 말한다. 특히 본원에서의 L-메치오닌 전구체란 O-숙시닐호모세린을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어,“L-메치오닌 전구체 생산 균주”란 L-메치오닌 전구체를 생물체 내에서 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주로서, 본 발명에 따른 조작에 의해 L-메치오닌 전구체를 축적할 수 있는 균주를 말한다. 예를 들어, 균주는 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.) , 세라티아 속(Serratia sp.), 프로비덴시아 속(Providencia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacteria sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 렙토스피라 속(Leptospira), 살모넬라 속(Salmonellar sp.), 브레비박테리아 속(Brevibacteria sp.), 하이포모나스 속(Hypomononas sp.), 크로모박테리움 속(Chromobacterium sp.) 및 노카디아 속(Norcardia) 또는 곰팡이류(fungi) 또는 효모류(yeast)에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있다. 바람직하게는, 에스케리치아 속, 코리네박테리움 속, 렙토스피라 속의 미생물 균주와 효모이다. 더 바람직하게는, 에스케리치아 속의 미생물 균주이고, 가장 바람직하게는, 대장균 (E. coli)이다.

다양한 구체예로서, 본 발명은 상기 균주로부터 온전한 O-숙시닐호모세린 또는 O-아세틸호모세린의 분해에 관여하는 유전자를 결손 또는 약화시키고, 피드백 저항성이 있는 O-숙시닐호모세린의 합성에 관여하는 유전자를 도입하거나 증강시킨 균주를 L-메치오닌 전구체 생산 균주로 제공한다. 또한, 본 발명은 O-숙시닐호모세린 생산을 증강시키기 위해서 트레오닌 생합성 경로를 차단 또는 약화시킨 균주를 제공한다. 또한,본 발명은 아스파토키나아제 또는 호모세린 디히드로게나아제가 과발현되거나 활성 증강된 균주를 제공한다. 또한, 본 발명은 피드백 조절 체계로부 터 자유로운 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제의 도입, 과발현, 또는 활성증강되는 동시에 아스파토키나아제 또는 호모세린 디히드로게나아제가 과발현 또는 활성 증강된 균주를 제공한다.

더욱 상세하게는, 본 발명은 L-메치오닌 전구체 분해에 관여하는 metB 유전자, 트레오닌 생합성 경로에 관여하는 thrB 유전자 및 L-메치오닌 전구체 생산 유전자의 전사를 조절하는 metJ 유전자를 결손시킨 L-메치오닌 전구체 생산 균주를 제공한다. 또한 본 발명은 메치오닌 전구체의 합성에 관여하는 본래의 metA 또는 metX 유전자를 넉아웃시키고, 피드백이 해제된 외부 metA 유전자를 도입한 L-메치오닌 전구체 생산 균주를 제공한다. 또한, 본 발명은 thrA 유전자에 의해서 코딩되는 활성을 증강시킨 L-메치오닌 전구체 생산 균주를 제공한다.

더욱 바람직하게는, 본 발명은 본래의 metA 또는 metX 유전자를 넉아웃하고, 피드백 저항성 metA 유전자를 도입하고, thrA 유전자를 증진시킨 L-메치오닌 전구체 생산 균주를 제공한다.

본원에서 사용되는 용어,“비활성”이란 유전자의 감쇠 또는 결실을 말한다. 유전자의 결실은 유전자의 절단하거나 또는 염색체상에 특정 유전자 서열을 삽입하여 단백질의 서열을 변형시킴으로써 수행된다. 여기서 “감쇠(attenuation)” 또는 “약화(weakening)”라는 용어는 미생물 균주에서 상응하는 DNA에 의해 코딩되는 하나 이상의 효소에 대한 세포 내 활성을 제거하거나 감소시키는 것을 의미하는데 예로, 유전자의 프로모터(promoter) 부위 및 5'-UTR 부위의 염기서열을 변형시킴으로써 단백질의 발현을 약화시키거나 해당 유전자의 ORF 부위에 돌연변이를 도입함 으로써 단백질의 활성을 약화시킬 수 있다. 감쇠 측정에 따르면, 상응하는 단백질의 농도 또는 활성은 일반적으로 야생형(wild-type) 또는 초기 미생물 균주의 농도 또는 활성에 비해 0~75%, 0~50%, 0~25%, 0~10% 또는 0~5%로 감소된다.

감쇠를 이루기 위해, 예로, 유전자의 발현 또는 효소 단백질의 촉매 활성을 감소시키거나 제거할 수 있고, 상기 두 가지 방법을 선택적으로 조합할 수 있다.

적절한 배양에 의해, 유전자 발현의 신호구조의 변형에 의해, 또는 안티센스(antisense)-RNA 기술에 의해 유전자 발현을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 신호 구조는, 예를 들어 억제(repressor) 유전자, 활성화(activator) 유전자, 작동자(operator), 프로모터, 감쇠자(attenuator), 리보솜 결합 자리, 시작 코돈(codon) 그리고 종료자(terminator) 들이다. 이와 관련하여, Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191 195 (1998)), Carrier and Keasling (Biotechnology Progress 15: 58 64 (1999)), Franch and Gerdes (Current Opinion in Microbiology 3: 159 164 (2000)), 및 유전학과 분자생물학의 잘 알려진 교과서인 Knippers ("Molecular Genetics", 6th edition, 1995) 또는 Winnacker ("Genes and Clones", 1990) 등을 참고할 수 있다.

효소 단백질의 촉매 활성의 변화 또는 감소를 유도하는 돌연변이들은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, Qiu와 Goodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611 8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95: 5511 5515 (1998)), 및 Wente and Schachmann (Journal of Biological Chemistry 266: 20833 20839 (1991) 의 논문, 또는 Hagemann ("General Genetics", 1986) 등을 참고할 수 있다.

가능한 돌연변이들은 전이(transitions), 전환(transversions), 삽입(insertions) 그리고 결실(deletions)에 의한 돌연변이이다. 효소 활성과 관계되는 아미노산 서열의 변화 여부에 따라 미스센스(missense) 돌연변이 또는 논센스(nonsense) 돌연변이로 구분할 수 있다. 유전자에서 최소한 하나 이상의 염기쌍데, 이 돌연변이는 잘못된 아미노산을 도입하게 되고 번역이 조숙한 중단을 유도하게 된다. 만일 정지 코돈이 돌연변이의 결과로써 코딩 지역에 형성이 되면 이것 또한 번역의 미성숙 종료(termination)를 유도하게 된다. 전형적으로 여러 개의 코돈들이 결실되면 효소 활성이 완전히 손실된다. 이러한 돌연변이들의 발생에 관한 구체적인 내용은 Knippers ("Molecular Genetics", 6th edition, 1995), Winnacker ("Genes and Clones", , 1990) 또는 Hagemann ("General Genetics", 1986)와 같은 저명한 유전학 및 분자생물학 교과서를 참고할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어, “증진(enhancement)”이란 상응하는 DNA에 의해 코딩되는 효소의 세포 내 활성의 증가를 말한다. 효소의 세포 내 활성 증진은 유전자의 과발현에 의해 이루어질 수 있다. 목적 유전자의 과발현은 상기 유전자의 프로모터 지역 또는 5‘-UTR 지역의 염기서열을 변형시킴으로써 단백질 발현을 증진시킬 수 있으며, 목적 유전자를 염색체상에 추가 도입함으로써 발현을 강화시킬 수 있으며, 목적 유전자를 벡터 상에 자가 프로모터 또는 강화된 별개의 프로모터와 함께 도입하여 균주에 형질전환시킴으로써 단백질의 발현량을 강화시킬 수 있다. 또한, 효소의 세포 내 활성의 증진은 또한 목적 유전자의 ORF(open reading frame) 지역에 돌연변이를 도입함으로써 이루어질 수 있다. 증진 측정에 따르면, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형 단백질이나 초기의 미생물균주에서의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 일반적으로 최소 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% or 500%, 최대 1000% 또는 2000% 까지 증가되는 것을 알 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시 양태로서, L-메치오닌 전구체 생산 균주를 준비하는 방법은 다음과 같다;

1 단계에서, O-숙시닐호모세린 또는 O-아세틸호모세린과 같은 L-메치오닌 전구체를 축적하기 위해서, 시스타치오닌 감마 신차아제, O-숙시닐호모세린 설프히드릴라아제 또는 O-아세틸호모세린 설프히드릴라아제와 같은 단백질을 코딩하는 유전자를 균주에서 결손 또는 약화시킨다.

시스타치오닌 감마 신차아제를 코딩하는 유전자를 통칭 metB 라고 표시하고, O-숙시닐호모세린 설프히드릴라아제를 코딩하는 유전자를 통칭 metZ라고 표시하고, O-아세틸호모세린 설프히드릴라아제를 코딩하는 유전자를 통칭 metY 라고 표시한다. 상기 언급된 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 유전자는, 예를 들어 대장균(Escherichia coli.)에서 공지되어 있는 metB 이다. 이 유전자의 게놈염기서열은 이전의 문헌(Blattner et. al., Science 277: 1453-1462 (1997))에 의해 공개된 E coli의 게놈염기서열(Accession no. AAC75876)로부터 얻을 수 있다. 또한 상기 유전자 서열은 미국생물공학정보센터 (NCBI, National Center for Biotechnology Information) 및 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ, DNA Data Bank Japan)로부터 얻을 수 있다. 이 외에도 같은 활성을 가진 유전자로서, 코리네박테리움(Corynebacterium.)의 metB 와 metY, 슈도모나스(Pseudomonas.) 유래의 metZ 등을 예시할 수 있다.

시스타치오닌 감마 신차아제 또는 O-숙시닐호모세린 설프히드릴라아제 또는 O-아세틸호모세린 설프히드릴라아제는 다음의 반응식에 나타난 것처럼 O-숙시닐호모세린 또는 O-아세틸호모세린을 시스타치오닌 또는 호모시스테인으로 전환하는 능력을 가지고 있다. 그러므로 이 활성을 가진 유전자를 또는 약화시킬 경우 O-숙시닐호모세린 또는 O-아세틸호모세린이 배양액에 과량 축적된다.

L-시스테인 + O-숙시닐-L-호모세린 <=> 숙시네이트 + 시스타치오닌

L-시스테인 + O-아세틸-L-호모세린 <=> 아세테이트 + 시스타치오닌

HS^- + O-숙시닐-L-호모세린 <=> 숙시네이트 + 호모시스테인

HS^- + O-아세틸-L-호모세린 <=> 아세테이트 + 호모시스테인

2 단계로서, 단계 1에서 준비된 균주에 호모세린 키나아제를 코딩하는 thrB 유전자를 제거하거나 약화시킨다. ThrB 유전자는 호모세린으로부터 O-포스포호모세린(phosphohomoserine)의 합성을 수반하며 뒤이어 thrC 유전자에 의해 트레오닌으로 전환된다. 합성된 호모세린이 전량 메치오닌의 전구체 합성에 이용될 수 있도록 하기 위하여 thrB 유전자를 결손 또는 약화시킨다.

3 단계로서, 메치오닌 합성경로의 전사조절자를 결손 또는 약화시킨다. 메치오닌 합성을 수반하는 metA, metB, metC, metE 및 metF 유전자는 피드백 조절 체계에 의해 억제된다. metJ 유전자는 E. coli 에서 전형적인 전사조절자 유전자이다. 메치오닌 전구체를 합성하기 위해 metA 또는 metX 유전자를 과발현시켜야 하며 이를 위해 metJ의 제거가 필요하다. 따라서 E. coli 에서 metJ 유전자를 제거하면 metA 또는 metX 유전자 발현을 항상 촉진된 상태가 되어, L-메치오닌 전구체를 대량 생산할 수 있다.

상기 2 단계와 3 단계는 전구체 생산 균주에 따라서 달라질 수 있으며 전구체 생산 균주를 제작하기 위하여 필수적이지는 않다. 보다 바람직하게는 에스케리치아 속(Escherichia sp.)의 미생물에서 전구체 생산 경로를 강화하기 위하여 실시할 수 있다.

4단계로서, 메치오닌 생합성 경로의 첫 과정을 매개하는 피드백 저항성 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제가 도입된다. metA는 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제의 활성을 가진 단백질을 코딩하는 유전자의 통칭이다. 피드백 저항성 metA 유전자 돌연변이에 의해 피드백 저항성 호모세인 O-숙시닐 활성이 발생한다. PCT/US2007/009146은 피드백 저항성 metA 유전자의 제조 방법이 기재되어 있다. 상기 국제특허에 포함된 일반적인 정보는 청구항에 본 발명의 범위를 포함된다. 본 발명에서, 피드백 저항성 metA 10 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열번호 18에, metA 11 유전자는 서열번호 20에, metA 32 유전자는 서열번호 14에, metA 37 유전자는 서열번호 16에, metA 41 유전자는 서열번호 22 에 나타나 있다(PCT/US2007/009146). 또한, 본 발명은 상기 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제는 서열번호 30의 아미노산 서열(GenBank Accession No: AP 004514 에 따른 아미노산 서열) 중에서 24, 29, 79, 114, 140, 163, 222, 275, 290, 291, 295, 297, 304 또는 305 번 위치 중 하나 이상의 위치에서 돌연변이를 가지고 있다.

metA 유전자의 도입과 증진은 유전자의 도입에 의해, 또는 5'-UTR의 뉴클레오타이드(nucleotide) 서열과 유전자의 프로모터 지역의 변형에 의해, 또는 목적 유전자의 ORF 지역에 돌연변이를 도입함으로써 이루어질 수 있다. 피드백 조절 체계에서 해제된 돌연변이 metA 유전자의 도입에 의하여 배지 내 메치오닌의 농도에 관계없이 L-메티오닌 전구체 생성이 증가하게 된다.

또한, O-숙시닐호모세린 생산은 염색체에서 본래의 metA 유전자를 제거하고 그곳에 돌연변이 metA 유전자를 도입함으로써 더욱 증가될 수 있다. metJ 유전자의 결손에 의하여 프로모터 활성이 증진된 metA 프로모터 하에서, 피드백 저항성 metA 유전자는 더욱 많은 O-숙시닐호모세린을 생산할 수 있다.

5 단계로서, O-숙시닐호모세린의 전구체인 호모세린의 합성을 증가시키기 위해서 아스파토키나아제 또는 호모세린 디히드로게나아제의 활성을 증진시킨다. thrA는 아스파토키나아제 및 호모세린 디히드로게나아제의 활성을 가진 펩타이드를 코딩하는 유전자의 통칭이다. thrA 유전자 활성의 증진은 thrA 유전자에 돌연변이를 도입함으로써, 염색체 상에 thrA 유전자를 다수로 도입함으로써, 또는 thrA를 포함하는 플라스미드를 도입함으로써 수행된다.

바람직하게는, 아스파토키나아제 및 호모세린 디히드로게나아제는 유니프로 데이터베이스 등록번호 AP_000666(Unipro database No: AP_000666)의 유전자에 의해 코딩된다. 더욱 바람직하게는, thrA 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열번호 29에 나타내었는데 아미노산 위치 345에 돌연변이를 가지고 있다. ThrA 활성의 증진은 thrA 유전자에 돌연변이 도입에 의해, 염색체상에 목표 유전자를 추가적으로 도입함으로써, 과정처리된 플라스미드(plasmid)를 추가적으로 도입함으로써 이루어질 수 있다.

L-메치오닌 전구체인 O-숙시닐호모세린은 상기 단계 1에서 5까지의 전체 과정 또는 일부분을 이용함으로써 균주에 축적될 수 있다.

L-메치오닌 전구체 생산 균주는 L-라이신(lysine), L-트레오닌, L-이소류신(isoleusine)을 생산하는 균주를 이용하여 제조할 수 있다. 바람직하게는 L-트레오닌을 생산하는 균주를 사용함으로써 제조한다. 이 경우에는 이미 호모세린까지의 합성이 원활하게 이루어진 균주로서, 더 많은 양의 메치오닌 전구체를 합성할 수 있다. 따라서, 트레오닌 생산 균주를 이용하여 트레오닌 생합성 경로에 관여하는 유전자 및 metA, metY, metZ를 결손 또는 약화시킴으로써 메치오닌 전구체를 축적될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어, “L-트레오닌-생산 균주”란 생체 내에서 L-트레오닌을 생산할 수 있는 원핵 또는 진핵 미생물 균주를 말한다. 예를 들어, 에스케리치아 속(Escherichia sp.), 어위니아 속(Erwinia sp.) , 세라티아 속(Serratia sp.), 프로비덴시아 속(Providencia sp.), 코리네박테리움 속(Corynebacteria sp.), 또는 브레비박테리아 속(Brevibacteria sp.)에 속하는 L-트레오닌 생산 미생물 균주가 포함될 수 있다. 이들 중에서, 에스케리치아 속(Escherichia sp.)이 바람직하며, 대장균(Escherichia coli)이 더욱 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구체예로서, L-트레오닌을 생산하는 E. coli 돌연변이 균주인 TF4076(KFCC 10718, 대한민국 특허공고 제92-8365호)로부터 형질 전환된 L-트레오닌 생산 및 독립 균주인 CJM002를 사용하였다. TF4076은 메치오닌 요구성, 메치오닌 유사체(예를 들어, α-아미노-β-히드록시 발레릭산, AHV), 라이신 유사체(예를 들어, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인, AEC)에 대한 내성, 이소루이신 유사체(예를 들어, α-아미노부티릭산)에 대한 내성 등의 특징을 갖는다. TF4076은 메치오닌 요구성 균주로 세포 내에서 메치오닌은 합성하지 못한다. 본 발명자들은 이러한 메치오닌 요구성을 해제하여 메치오닌 생산 균주로 이용하기 위하여 NTG를 이용한 인공적인 돌연변이 법을 사용하여 메치오닌 요구성이 해제된 트레오닌 생산균주 E.coli CJM002를 제조하였다. 상기 E.coli CJM002는 Escherichia coli MF001로써 명명되었고 2004년 4월 9일에 KCCM(Korean Culture Center of Microorganism, 대한민국, 서울시 서대문구 홍제1동 유림 빌딩 361-221)에 KCCM-10568호로 기탁하였다.

본 발명에서, E.coli CJM002 균주의 metB, thrB, metJ 및 metA 유전자를 결손시킨 다음 피드백 저항성 metA 를 도입하였고, 이와 같이 제조된 최종적인 L-메치오닌 전구체 생산 균주는 CJM-A11로 명명하였다. CJM-X 균주에 thrA 발현 벡터를 형질 전환시키고 이를 CJM-A11(pthrA(M)-CL)라고 명명하였다. 이렇게 제조한 O-숙시닐호모세린 생산 균주 Escherichia coli CJM-A11은 2008년 1월 23일에 기탁번호 KCCM 10922P로 기탁하였다.

본 발명의 바람직한 구체예로서, PCT/KR2005/00344에서 기재된 L-트레오닌 생산 균주인 FTR2533를 사용할 수 있다. FTR2533은 Escherichia coli 기탁번호 KCCM10236로부터 파생된 Escherichia coli TFR7624 로부터 유래하였다. Escherichia coli 기탁번호 KCCM10236은 Escherichia coli TF4076 으로부터 유래하였다. Escherichia coli 기탁번호 KCCM10236은 PEP로부터 옥살로아세테이트(oxaloacetate) 형성을 촉매 작용하는 ppc 유전자와 아스파테이트로 부터 트레오닌을 생합성하기 위해 필요한 효소, 예를 들면 thrA : 아스파토키나아제(aspartokinaze) 1- 호모세린 디히드로게나아제, thrB : 호모세린 키나아제, thrC : 트레오닌 신차아제를 높은 수준으로 발현하므로 L-트레오닌 생산의 증가시킬 수 있다. 또한, Escherichia coli FTR7624(KCCM10538)는 L-트레오닌 생합성을 위해 필요한 tyrB 유전자의 발현을 억제하는 비활성된 tyrR 유전자를 가지고 있다. 또한, Escherichia coli FTR2533 (KCCM10541)은 비활성된 galB 유전자를 가진 L-트레오닌 생산 균주이자 L-트레오닌 생산 E.coli 돌연변이 균주이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, E. coli FTR2533 균주의 metB, thrB, metJ 및 metA 유전자를 결손시킨 후 피드백 저항성 metA 유전자를 도입하였고, 이와 같이 제조된 최종적인 L-메치오닌 전구체는 CJM2-A11로 명명하였다. CJM2-A11 균주를 thrA 발현 벡터로 형질 전환시키고 이를 CJM2-A11(pthrA(M)-CL)로 명명하였다. 상기 방법에 의해 제조한 Escherichia coli CJM2-A11(pthrA(M)-CL)는 2008년 2월 12일에 기탁번호 KCCM 10924P로 기탁하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 L-메치오닌 전구체를 생산하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 : a) 상기 미생물 균주들을 발효시키는 단계; b) 배지 또는 균주들 내에서 O-숙시닐호모세린의 배양하는 단계; 및 c) O-숙시닐호모세린을 분리하는 단계를 포함하는, O-숙시닐호모세린의 생산 방법에 관한 것이다.

상기에서 제조된 L-메치오닌 전구체 생산 균주의 배양은 당업계에 알려진 적합한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양 방법의 예로, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 다양한 배양 방법은 예를 들어 문헌("Biochemical Engineering"by James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp 138-176.)에 기재되어 있다.

배양에 사용되는 배지는 특정한 균주의 요구조건을 적절하게 만족시켜야 한다. 다양한 미생물 배양 배지들은 예를 들어 문헌 ("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981.)에 기재되어 있다. 이들 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분들을 포함한다. 탄소원은 포도당(glucose), 젖당(lactose), 자당(sucrose), 과당(fructose), 맥아당(maltose), 녹말(starch) 및 섬유소(cellulose)와 같은 탄수화물; 콩 기름(soybean oil), 해바라기 기름(sunflower oil), 베버 기름(castor oil) 및 코코넛 기름(coconut oil)과 같은 지방; 팔미트산(palmitic acid), 스테아르산(stearic acid) 및 리놀레산(linoleic acid)산과 같은 지방산; 글리세롤(glycerol) 및 에탄올(ethanol)과 같은 알코올과 아세트 산(acetic acid)과 같은 유기산(organic acid)을 포함한다. 이들 탄소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 질소원으로는 펩톤(peptone), 효모추출액(yeast extract), 육수(gravy), 맥아추출액(malt extract), 옥수수침출액(corn steep liquor (CSL)) 및 콩가루(bean flour)와 같은 유기 질소원 및 요소(urea), 암모늄 설페이트(ammonium sulfate), 암모늄 클로라이드(chloride), 암모늄 포스페이트(phosphate), 암모늄 카보네이트(carbonate) 및 암모늄 니트레이트(nitrate)와 같은 무기 질소원을 포함한다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인산원으로서 추가적으로 포타슘 디히드로겐 포스페이트(potassium dihydrogen phosphate), 포타슘 디히드로겐 포스페이트(dipotassium hydrogen phosphate) 및 상응하는 소듐 포함 염들(sodium-containing salts)을 포함할 수 있다. 또한 배지는 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate) 또는 아이언 설페이트(iron sulfate)와 같은 금속을 포함할 수 있다. 또한, 아미노산, 비타민 및 적합한 전구체 등이 첨가될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

또한, 배양 중에 암모늄 히드록사이드(ammonium hydroxide), 포타슘 히드록사이드(potassium hydroxide), 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 적절한 방식으로 첨가함으로써 배양물의 pH 를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에 지방산 폴리글리콜 에스테르(polyglycol ester)와 같은 소포제를 사용함으로써 배양하는 동안 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양액의 호기성(aerobic) 조건을 유지하기 위해서, 배양액 내로 산소 또는 산소를 포함한 가스(예, 공기)가 배양액에 주입될 수 있다. 배양물의 온도는 일반적으로 20-45℃, 바람직하게는 25-40℃이다. 배양의 기간은 L-메치오닌 전구체의 생산이 원하는 수준에 도달할 때까지 계속될 수 있고 바람직한 배양시간은 10-160 시간이다.

본 발명의 메치오닌 전구체 생산 균주를 사용하는 경우, 메치오닌은 전형적인 화학적 메치오닌 합성 방법보다 환경 친화적으로 생산할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 균주로부터 생산된 O-숙시닐호모세린에서 전환된 L-메치오닌은 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제뿐만 아니라 인간의 식품 또는 식품 첨가제의 생산에 널리 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 메치오닌 전구체 생산 균주의 제조

<1-1> metB 유전자의 결손

E. coli 균주에서 시스타치오닌 신차아제를 코딩하는 metB 유전자를 결손시키기 위해서, FRT-one-step PCR deletion 방법을 수행하였다(PNAS (2000) vol97: P6640-6645). 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머(primer)를 이용하여 pKD3 벡터(PNAS (2000) vol97: P6640-6645)를 주형(template)으로 하여 PCR 반응으로 결손 카세트(cassette)를 구성하였다. PCR은 94℃에서 30초 동안 변성과정(denaturation), 55℃에서 30초 동안 접합과정(annealing), 72℃에서 1분 동안 신장과정을 30회 반복하였다.

그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.2 kbp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편은 pKD46 벡터 (PNAS (2000) vol97: P6640-6645)를 미리 형질 전환시킨 E.coli(K12) W3110 균주에 일렉트로포레이션하였다. 일렉트로포레이션을 위하여 pKD46으로 형질전환된 W3110 균주는 100ug/L 암피실린 (ampicilin) 과 5mM 아라비노스 (l-arabinose) 가 포함된 LB 배지를 이용하여 OD₆₀₀이 0.6에 도달할 때 까지 30℃에서 배양하였다. 멸균 증류수로 2 회, 10%글리세롤 (glycerol) 로 1회 세척하여 사용하였다. 일렉트로포레이션은 2500V로 가하였다. 회수된 균주를 25μg/L 클로람페니콜 (chloramphenichol)을 포함한 LB 평판 배지에 도말하여 37℃ 에서 하루밤 배양한 후 내성을 보이는 균주를 선별하였다.

선별된 균주는 균주를 주형으로 하여 동일한 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR 한후 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.2Kb로 관찰되는 것을 확인함으로서 metB 유전자의 결손을 확인하였다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터 (PNAS (2000) vol97: P6640-6645) 로 형질전환시켜 LB 배지에서 배양하였으며, 다 시 동일한 조건의 PCR을 통하여 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 150 bp로 작아진 최종 metB 유전자 결손 균주를 제작하였고, 클로람페니콜 마커가 제거되었음을 확인하였다. 제작된 균주를 W3-B 로 명명하였다.

<1-2> thrB 유전자의 결손

호모세린 키나아제를 코딩하는 유전자인 thrB 유전자를 결손시킴으로써 호모세린으로부터 O-숙시닐호모세린의 합성량을 증가시키고자 하였다. 특히 쓰레오닌 생산균주를 이용할 경우 호모세린의 이용 활성이 매우 크기 때문에 이 유전자의 결손이 꼭 필요하다. 상기 제작된 W3-B 균주에서 thrB 유전자를 결손시키기 위하여, metB 유전자 결손시와 동일한 FRT one step PCR deletion 방법을 사용하였다.

thrB 결손 카세트를 제작하기 위하여 pKD4 벡터 (PNAS (2000) vol97: P6640-6645) 를 주형으로, 서열번호 3, 4 의 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하는 PCR 반응을 진행하였다.

그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.6kbp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편을 pKD46 벡터로 미리 형질 전환시킨 W3-B 균주에 일렉트로포레이션하였다. 회수된 균주를 50 μg/L 카나마이신 (kanamycin)을 포함한 LB 평판 배지에 도말하여 37oC 에서 하루밤 배양한 후, 내성을 보이는 균주를 선별하였다.

선별된 균주는 균주를 직접 주형으로 하여 서열번호 3, 4 의 프라이머를 이 용하여 같은 조건으로 PCR 한후, 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.6Kb로 확인되는 균주를 선별함으로써 thrB 유전자의 결손을 확인하였다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터로 형질전환시켜 LB 배지에서 배양하였으며, 다시 동일한 조건의 PCR을 통하여 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 150 bp로 작아진 최종 thrB 유전자 결손 균주를 제작하고, 카나마이신 (kanamycin) 마커가 제거되었음을 확인하였다. 제작된 균주는 W3-BT 균주로 명명하였다.

<1-3> metJ 유전자의 결손

메치오닌 전구체의 합성에 관여하는 metA 유전자의 조절 유전자인 metJ 유전자를 결손시키기 위하여, metB 유전자 결손시와 동일한 FRT one step PCR deletion 방법을 사용하였다. metJ 유전자 결손 카세트를 제작하기 위하여, 서열번호 5, 6 의 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하였다.

그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.2 kbp 크기의 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편을 pKD46 벡터로 미리 형질 전환시킨 W3-BT 균주에 일렉트로포레이션하였다. 회수된 균주를 클로람페니콜을 포함한 LB 평판 배지에 도말하여 37℃ 에서 하루밤 배양한 후 내성을 보이는 균주를 선별하였다.

선별된 균주는 균주를 직접 주형으로 하여 서열번호 7, 8 의 프라이머를 이 용하여 같은 조건으로 PCR 한후, 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.6Kb로 변화되는 것을 확인함으로서 metJ 유전자의 결손을 확인하였다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터를 형질전환하여 LB 배지에서 배양하였으며 다시 동일한 조건의 PCR을 통하여 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 600 bp로 작아진 최종 metJ 유전자 결손 균주를 제작하고, 클로람페니콜 마커가 제거되었음을 확인하였다. 제작된 균주를 W3-BTJ 로 명명하였다.

<1-4> metA 유전자의 결손

염색체에 피드백 저항성 metA 유전자를 도입하기 위해, W3-BTJ 균주의 염색체 상에서 본래의 metA 유전자를 결손시켰다. metA 유전자를 제거하기 위해, FRT one step PCR deletion 방법을 수행하였다.

metA 유전자 결손 카세트를 제작하기 위하여, 서열번호 9, 10 의 프라이머를 이용하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1분 동안 실시하고, 이를 30 회 수행하였다.

선별된 균주는 균주를 직접 주형으로 하여 서열번호 9, 10 의 프라이머를 이용하여 같은 조건으로 PCR 한후, 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 1.1Kbp로 변화되는 것을 확인함으로서 metA 유전자의 결손을 확인하였다. 확인된 균주는 다시 pCP20 벡터를 형질전환하여 LB 배지에서 배양하였으며 다시 동일한 조건의 PCR을 통하여 1.0% 아가로스 겔 상에서 유전자의 크기가 100 bp로 작아진 최종 metA 유전자 결손 균주를 제작하고, 클로람페니콜 마커가 제거되었음을 확인하였다. 제작된 균주를 W3-BTJA 로 명명하였다.

<1-5> 피드백 저항성 metA 유전자의 도입

L-메치오닌 전구체인 O-숙시닐호모세린의 생산을 증가시키기 위해 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제를 코딩하는 피드백 저항성 metA 유전자를 과발현시켰다.

피드백 저항성 metA 10 유전자는 서열번호 17에 나타나 있고 이를 코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 18에 나타나 있다. metA 11 유전자는 서열번호 19에 나타나 있고 이를 코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 20에 나타나 있다. metA 32 유전자는 서열번호 13에 나타나 있고 이를 코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 14에 나타나 있다. metA 37 유전자는 서열번호 15에 나타나 있고 이를 코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 16에 나타나 있다. metA 41 유전자는 서열번호 21에 나타나 있고 이를 코딩하는 아미노산 서열은 서열번호 22에 나타나 있다(PCT/US2007/009146).

PCR은 상기 유전자들을 주형으로 하여 서열번호 11, 12 를 프라이머로 사용 하여 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초, 연장(extension) 단계는 72℃에서 2분 동안 실시하고, 이를 25 회 수행하였다.

그 결과 얻어진 PCR 산물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후, 1.2 kbp 밴드로부터 DNA를 정제하였다. 회수된 DNA 절편을 제한(restriction) 효소 SmaIdm로 절단된 pCL1920 벡터에 연결하였다. 연결된 벡터를 E.coli 에 형질전환시켜 50μg/L 스펙티노마이신이 포함된 LB 배지에서 배양한 후 선별하였다. 제조된 벡터의 구성을 도 3에 나타내었다.

상기에서 제조된 벡터들은 W3-BTJA 균주에 각각 일렉트로포레이션하였고 균주의 생산능력이 실시예 2-1에서 설명된 것처럼 플라스크(flask) 배양을 사용하여 검정하였다. 변형된 균주의 O-숙시닐호모세린 생산은 야생형 균주의 O-숙시닐호모세린 생산능력을 100% 로 기준으로 하여 각각 측정하였다. 그 결과, 변형된 균주 모두에서 야생형의 생산량에 비해 현저히 증가하였다. 특히, metA 11, metA 10 및 metA 32에서 가장 효과적인 생산을 보였다.

100mM 메치오닌 존재하에서의 돌연변이 metA의 피드백 저항성

% of specific activity retention	야생형	#10	#11	#32	#37	#41
Control	100	100	100	100	100	100
w/100mM Met	7.6	97	94	79	83	74

W3-BTJA 균주에서 피드백 저항성 metA의 O-숙시닐호모세린 생산량

metA	O-숙시닐호모세린 생산량 (%)
야생형(WT)	100
# 10	392
# 11	425
# 32	396
# 37	227
# 41	389

가장 효과적인 생산을 보여주는 pMetA10-CL, pMetA11-CL 및 pMetA32-CL의 안정적인 발현을 위해서, 이들 유전자들을 E.coli의 염색체에 도입하였다.

우선, pKD3 vector를 사용하고 클로람페니콜 마커 유전자를 주형으로 하여 서열번호 23, 24를 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하였다. PCR 절편은 젤-추출(elution)에 의해 정제하였다. metA 유전자는 서열번호 9, 10을 프라이머로 하여 PCR 증폭하였고, metA 유전자의 3'-UTR 지역은 주형으로써 W3110 wt 염색체을 사용하여 서열번호 25, 26을 프라이머로 하여 PCR 증폭하였다. 그 결과 얻어진 PCR 산물들을 젤-추출에 의해 분리하고 절편의 혼합물은 서열번호 9, 26을 프라이머로 PCR 증폭하여 클로람페니콜 표지를 포함한 metA 유전자 절편을 제조하였다. 회수된 DNA 절편을 pKD46 벡터로 형질 전환된 W3BTJA 균주에 일렉트로포레이션하고, 클로람페니콜 저항성 균주를 선별하였으며, 서열번호 9, 10의 프라이머를 사용하여 metA 가 성공적으로 클로닝된 것을 확인하였다. 변형된 metA 유전자 10, 11, 32가 도입된 것으로 확인된 균주들은 각각 W3BTJ-A10, 11 및 32로 명명하였다. 각 균주의 O-숙시닐호모세린 생산량은 각 metA 플라스미드를 함유하고 있는 W3-BTJA의 생산량과 비슷하였다.

<1-6> thrA 유전자의 과발현

O-숙시닐호모세린의 생산을 더욱 효과적으로 증가시키기 위해, thrA 유전자를 과발현시켰다.

이를 위해, L-트레오닌 생산 균주인 E.coli CJM002 (KCCM10568)의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 27, 28의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하였다. 증폭된 DNA 절편은 젤-추출을 통하여 분리하였고 제한효소 EcoRV를 사용하여 pCL1920 벡터의 CJ1 프로모터에 연결하고 스펙티노마이신(spectinomycin)을 50μg/L 함유하는 LB 배지에서 선별하였다. 선별된 벡터는 pCJ-thrA(M)-CL로 명명하였다. thrA 유전자에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 서열번호 29에 나타내었고 아미노산 위치 345에 돌연변이를 가지고 있다. 또한, E.coli W3110 균주의 야생형 thrA 유전자는 상기에서 설명된 것과 같은 방법으로 PCR 증폭하여 pCJ-thrA-CL이라고 명명한 벡터에 클로닝하였다. 이 벡터들은 각각 W3BTJ-A11로 일렉트로포레이션하였고 각 균주의 O-숙시닐호모세린 생산량을 실시예 2-1에서 설명된 플라스크 배양으로 검정하였다. 그 결과, 돌연변이 형태의 thrA 유전자를 가진 벡터로 형질 전환된 균주는 아주 높은 수준으로 O-숙시닐호모세린을 축적하였다.

thrA 발현벡터의 존재하에서의 O-숙시닐호모세린 생산량

	플라스미드	OSH 생산량 (%)
W3BTJA11	pCL1920	100
	pCJ-thrA-CL	119
	pCJ-thrA(M)-CL	153

<1-7> L-트레오닌 생산 균주의 전환

메치오닌 요구성이 해제된 L-트레오닌 생산 균주인 대장균 CJM002(KCCM-10568호) 를 이용하여 상기 1-1 내지 1-5 와 동일한 방법으로 O-숙시닐호모세린 생산 균주를 제작하였다. 염색체 상에 돌연변이 metA 유전자를 함유하는 균주를 각각 CJM-A10, CJM-A11, 및 CJM-A32로 명명하였다. 또한, PCT/KR2005/00344 에 기재된 L-트레오닌 생산 균주인 대장균 FTR2533 (KCCM10541) 를 이용하여 상기 1-1 내지 1-5 와 동일한 방법으로 메치오닌 전구체 생산균주를 제작하여 CJM-A11로 명명하였다. 또한, 각각의 균주는 실시예 1-6에 설명된 것처럼 thrA 발현 벡터를 형질전환시키고, 실시예 2-1에 기재된 플라스크 배양에 의하여 이들 균주의 메치오닌 전구체 생산을 측정하였다. 그 결과, pCJ-thrA(m)-CL 플라스미드를 함유하는 CJM-A11은 아주 높은 O-숙시닐호모세린 생산을 보였다.

플라스크 배양에 의한 메치오닌 전구체(O-숙시닐호모세린) 생산량

	O-숙시닐호모세린 (%)
CJM-A10	100
CJM-A11	113
CJM-A32	80
CJM2-A11	94
CJM-A11 (pCJ-thrA(m)-CL)	127

실시예 2: L-메치오닌 전구체의 생산을 위한 발효

<2-1> 플라스크 배양 실험

실시예 1에서 제작된 균주의 메치오닌 전구체 생산량을 실험하기 위하여 삼각플라스크 배양을 실시하였다. 평판 LB 배지에 각 균주를 접종하여 31℃에서 하루밤 배양하였다. 단일 콜로니를 3ml LB 배지에 접종한 후 31℃ 에서 5 시간 배양하고, 다시 25ml 메치오닌 전구체 생산 배지를 포함한 250ml 삼각플라스크에 200배 희석하여 31℃ 200 rpm에서 64시간 배양하여 HPLC 분석을 통하여 메치오닌 전구체 생산량을 비교하였다. 그 결과, 메치오닌 생산 능력은 메치오닌 요구성에서 자유로운 L-메치오닌 생산 균주로부터 제조된 메치오닌 전구체 생산 균주에서 현저한 증가를 보였다.

메치오닌 전구체 생산을 위한 플라스크 배지 조성

조성	농도 (/L)
포도당(Glucose)	40 g
암모늄 설페이트(Ammonium sulfate)	17 g
KH₂PO₄	1.0 g
MgSO₄ㆍ7H₂O	0.5 g
FeSO₄ㆍ7H₂O	5 mg
MnSO₄ㆍ8H₂O	5 mg
ZnSO₄	5 mg
칼슘 카보네이트(Calcium carbonate)	30 g
효모 추출액(Yeast extract)	2 g
메치오닌(Methionine)	0.15g
트레오닌(Threonine)	0.15g

<2-2> 대용량 발효

O-숙시닐호모세린을 대량 생산하기 위해서, O-숙시닐호모세린 생산 능력을 보이는 몇몇의 균주들이 선택하여 5 L 발효조에서 배양하였다. 각각의 균주를 항생제 스펙티노마이신이 함유된 평판 LB 배지에 접종하여 31℃에서 밤새 배양하였다. 그 다음 단일 콜로니를 스펙티노마이신을 함유하는 LB 배지 10 ml에 접종한 후 31℃에서 5 시간 동안 배양하였다. 배양액은 200 ml의 메치오닌 전구체 시드(seed) 배지를 함유하는 1000 ml 삼각 플라스크에 100배 희석하여 31℃ 200 rpm에서 3~10시간 배양후 5L 발효조에 접종하여 유가식 배양(Fed batch) 발효법으로 20~100시간 배양하였다. 이렇게 배양한 발효액에서 메치오닌 전구체 농도를 HPLC로 분석한 결과는 표 7과 같았다.

메치오닌 전구체 생산을 위한 발효조 배지 조성

조성	Seed media	Main media	Feed media
포도당(Glucose)(g/L)	10.1	40	600
MgSO₄7H₂0(g/L)	0.5	4.2
효모 추출액(Yeast extract)(g/L)	10	3.2
KH₂PO₄	3	3	8
암모늄 설페이트(Ammonium sulfate)(g/L)		6.3
NH₄Cl(g/L)	1
NaCl(g/L)	0.5
Na₂HPO₄12H₂O(g/L)	5.07
DL-메치오닌(Methionine)(g/L)		0.5	0.5
L-이소류신(Isoleucine)(g/L)	0.05	0.5	0.5
L-트레오닌(Threonine)(g/L)		0.5	0.5

발효조에서의 메치오닌 전구체 생산량

	O-숙시닐호모세린 (g/L)
CJM-BTJ/pCJ-MetA-CL	> 80
CJM-A11/ pCJ-thrA(M)-CL	> 100
CJM2-A11/pCJ-thrA(M)-CL	> 90

도 1은 메치오닌 전구체 생산균주의 유전적 조작을 설명하는 그림이다.

도 2는 메치오닌 생산을 위한 2 단계과정의 화학적인 구조를 설명한 그림이다.

도 3은 피드백 저항성 metA 유전자의 발현을 위한 pMetA-CL의 개열지도를 나타낸 것이다.

<110> CJ Jeiljedang Corporation <120> MICROORGANISM PRODUCING L-METHIONINE PRECURSOR AND THE METHOD OF PRODUCING L-METHIONINE PRECURSOR USING THE MICROORGANISM <130> PA090118/KR <150> US12/062,927 <151> 2008-04-04 <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of Chloramphenichol <400> 1 ttactctggt gcctgacatt tcaccgacaa agcccaggga acttcatcac gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of Chloramphenichol <400> 2 ttaccccttg tttgcagccc ggaagccatt ttccaggtcg gcaattaaat catatgaata 60 tcctccttag 70 <210> 3 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of kanamycin <400> 3 aaagaatatg ccgatcggtt cgggcttagg ctccagtgcc tgttcggtgg gtgtaggctg 60 gagctgcttc 70 <210> 4 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of kanamycin <400> 4 agacaaccga catcgctttc aacattggcg accggagccg 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Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala 225 230 235 240 Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp 245 250 255 Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr 260 265 270 Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp 275 280 285 Leu His Tyr Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Met 290 295 300 Asn Pro Thr Leu Asp 305 <210> 19 <211> 930 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 19 atgccgattc gtgtgccgga cgagctaccc gccgtcaatt tcttgcgtga agaaaacgtc 60 tttgtgatga caacttctcg tgcgcctggt caggaaattc gtccacttaa ggttctgatc 120 cttaacctga tgccgaagaa gattgaaact gaaaatcagt ttctgcgcct gctttcaaac 180 tcacctttgc aggtcgatat tcagctgttg cgcatcgatt cccgtgaatc gcgcaacacg 240 cccgcagagc atctgaacaa cttctactgt aactttgaag atattcagga tcagaacttt 300 gacggtttga ttgtaactgg tgcgccgctg ggcctggtgg ggtttaatga tgtcgcttac 360 tggccgcaga tcaaacaggt gctggagtgg tcgaaagatc acgtcacctc gacgctgtct 420 gtctgctggg cggtacaggc cgcgctcaat atcctctacg gcattcctaa gcaaactcgc 480 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Phe Glu Asp Ile Gln 85 90 95 Asp Gln Asn Phe Asp Gly Leu Ile Val Thr Gly Ala Pro Leu Gly Leu 100 105 110 Val Gly Phe Asn Asp Val Ala Tyr Trp Pro Gln Ile Lys Gln Val Leu 115 120 125 Glu Trp Ser Lys Asp His Val Thr Ser Thr Leu Ser Val Cys Trp Ala 130 135 140 Val Gln Ala Ala Leu Asn Ile Leu Tyr Gly Ile Pro Lys Gln Thr Arg 145 150 155 160 Thr Glu Lys Leu Ser Gly Val Tyr Glu His His Ile Leu His Pro His 165 170 175 Ala Leu Leu Thr Arg Gly Phe Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser 180 185 190 Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu 195 200 205 Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser 210 215 220 Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala 225 230 235 240 Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp 245 250 255 Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr 260 265 270 Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp 275 280 285 Leu Asn Tyr Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Met 290 295 300 Asn Pro Thr Leu Asp 305 <210> 21 <211> 930 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 21 atgccgattc gtgtgccgga cgagctaccc gccgtcaatt tcttgcgtga agaaaacgtc 60 tttgtgatga caacttctcg tgcgtctggt caggaaattc gtccacttaa ggttctgatc 120 cttaacctga tgccgaagaa gattgaaact gaaaatcagt ttctgcgcct gctttcaaac 180 tcacctttgc aggtcgatat tcagctgttg cgcatcgatt cccgtgaatc gcgcagcacg 240 cccgcagagc atctgaacaa cttctactgt aactttgaag atattcagga tcagaacttt 300 gacggtttga ttgtaactgg tgcgccgctg ggcctggtgg agtttaatga tgtcgcttac 360 tggccgcaga tcaaacaggt gctggagtgg tcgaaagatc acgtcacctc gacgctgatt 420 gtctgctggg cggtacaggc cgcgctcaat atcctctacg gcattcctaa gcaaactcgc 480 accgaaaaac tctctggcgt ttacgagcat catattctcc atcctcatgc gcttctgacg 540 cgtggctttg atgattcatt cctggcaccg cactcgcgct atgctgactt tccggcagcg 600 ttgattcgtg attacaccga tctggaaatt ctggcagaga cggaagaagg ggatgcatat 660 ctgtttgcca gtaaagataa gcgcattgcc tttgtgacgg gccatcccga atatgatgcg 720 caaacgctgg cgcaggaatt tttccgcgat gtggaagccg gactagaccc ggatgtaccg 780 tataactatt tcccgcacaa tgatccgcaa aatacaccgc gagcgagctg gcgtagtcac 840 ggtaatttac tgtttaccaa ctggctcaac aattacgtct accagatcac gccatacgat 900 ctacggcact tgaatccaac gctggattaa 930 <210> 22 <211> 309 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 22 Met Pro Ile Arg Val Pro Asp Glu Leu Pro Ala Val Asn Phe Leu Arg 1 5 10 15 Glu Glu Asn Val Phe Val Met Thr Thr Ser Arg Ala Ser Gly Gln Glu 20 25 30 Ile Arg Pro Leu Lys Val Leu Ile Leu Asn Leu Met Pro Lys Lys Ile 35 40 45 Glu Thr Glu Asn Gln Phe Leu Arg Leu Leu Ser Asn Ser Pro Leu Gln 50 55 60 Val Asp Ile Gln Leu Leu Arg Ile Asp Ser Arg Glu Ser Arg Ser Thr 65 70 75 80 Pro Ala Glu His Leu Asn Asn Phe Tyr Cys Asn Phe Glu Asp Ile Gln 85 90 95 Asp Gln Asn Phe Asp Gly Leu Ile Val Thr Gly Ala Pro Leu Gly Leu 100 105 110 Val Glu Phe Asn Asp Val Ala Tyr Trp Pro Gln Ile Lys Gln Val Leu 115 120 125 Glu Trp Ser Lys Asp His Val Thr Ser Thr Leu Ile Val Cys Trp Ala 130 135 140 Val Gln Ala Ala Leu Asn Ile Leu Tyr Gly Ile Pro Lys Gln Thr Arg 145 150 155 160 Thr Glu Lys Leu Ser Gly Val Tyr Glu His His Ile Leu His Pro His 165 170 175 Ala Leu Leu Thr Arg Gly Phe Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser 180 185 190 Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu 195 200 205 Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser 210 215 220 Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala 225 230 235 240 Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp 245 250 255 Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr 260 265 270 Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp 275 280 285 Leu Asn Asn Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Leu 290 295 300 Asn Pro Thr Leu Asp 305 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for integration of metA <400> 23 tttccgaaac gtacctcagc aggtgtaggc tggagctgct tc 42 <210> 24 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for integration of metA <400> 24 gaataaaatt tattcacctg ctgcatatga atatcctcct tag 43 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for integration of metA <400> 25 cagcaggtga ataaatttta ttc 23 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for integration of metA <400> 26 cgcgaatgga agctgtttcc 20 <210> 27 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for ampilification thrA <400> 27 ctggcaaagc tttcaaagga aaactccttc gt 32 <210> 28 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for ampilification of thrA <400> 28 agtcgtgata tcatgcgagt gttgaagttc gg 32 <210> 29 <211> 820 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(820) <223> homoserine dehydrogenase fused with aspartate kinase <400> 29 Met Arg Val Leu Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asn Ala Glu Arg 1 5 10 15 Phe Leu Arg Val Ala Asp Ile Leu Glu Ser Asn Ala Arg Gln Gly Gln 20 25 30 Val Ala Thr Val Leu Ser Ala Pro Ala Lys Ile Thr Asn His Leu Val 35 40 45 Ala Met Ile Glu Lys Thr Ile Ser Gly Gln Asp Ala Leu Pro Asn Ile 50 55 60 Ser Asp Ala Glu Arg Ile Phe Ala Glu Leu Leu Thr Gly Leu Ala Ala 65 70 75 80 Ala Gln Pro Gly Phe Pro Leu Ala Gln Leu Lys Thr Phe Val Asp Gln 85 90 95 Glu Phe Ala Gln Ile Lys His Val Leu His Gly Ile Ser Leu Leu Gly 100 105 110 Gln Cys Pro Asp Ser Ile Asn Ala Ala Leu Ile Cys Arg Gly Glu Lys 115 120 125 Met Ser Ile Ala Ile Met Ala Gly Val Leu Glu Ala Arg Gly His Asn 130 135 140 Val Thr Val Ile Asp Pro Val Glu Lys Leu Leu Ala Val Gly His Tyr 145 150 155 160 Leu Glu Ser Thr Val Asp Ile Ala Glu Ser Thr Arg Arg Ile Ala Ala 165 170 175 Ser Arg Ile Pro Ala Asp His Met Val Leu Met Ala Gly Phe Thr Ala 180 185 190 Gly Asn Glu Lys Gly Glu Leu Val Val Leu Gly Arg Asn Gly Ser Asp 195 200 205 Tyr Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Cys Leu Arg Ala Asp Cys Cys Glu 210 215 220 Ile Trp Thr Asp Val Asp Gly Val Tyr Thr Cys Asp Pro Arg Gln Val 225 230 235 240 Pro Asp Ala Arg Leu Leu Lys Ser Met Ser Tyr Gln Glu Ala Met Glu 245 250 255 Leu Ser Tyr Phe Gly Ala Lys Val Leu His Pro Arg Thr Ile Thr Pro 260 265 270 Ile Ala Gln Phe Gln Ile Pro Cys Leu Ile Lys Asn Thr Gly Asn Pro 275 280 285 Gln Ala Pro Gly Thr Leu Ile Gly Ala Ser Arg Asp Glu Asp Glu Leu 290 295 300 Pro Val Lys Gly Ile Ser Asn Leu Asn Asn Met Ala Met Phe Ser Val 305 310 315 320 Ser Gly Pro Gly Met Lys Gly Met Val Gly Met Ala Ala Arg Val Phe 325 330 335 Ala Ala Met Ser Arg Ala Arg Ile Phe Val Val Leu Ile Thr Gln Ser 340 345 350 Ser Ser Glu Tyr Ser Ile Ser Phe Cys Val Pro Gln Ser Asp Cys Val 355 360 365 Arg Ala Glu Arg Ala Met Gln Glu Glu Phe Tyr Leu Glu Leu Lys Glu 370 375 380 Gly Leu Leu Glu Pro Leu Ala Val Thr Glu Arg Leu Ala Ile Ile Ser 385 390 395 400 Val Val Gly Asp Gly Met Arg Thr Leu Arg Gly Ile Ser Ala Lys Phe 405 410 415 Phe Ala Ala Leu Ala Arg Ala Asn Ile Asn Ile Val Ala Ile Ala Gln 420 425 430 Gly Ser Ser Glu Arg Ser Ile Ser Val Val Val Asn Asn Asp Asp Ala 435 440 445 Thr Thr Gly Val Arg Val Thr His Gln Met Leu Phe Asn Thr Asp Gln 450 455 460 Val Ile Glu Val Phe Val Ile Gly Val Gly Gly Val Gly Gly Ala Leu 465 470 475 480 Leu Glu Gln Leu Lys Arg Gln Gln Ser Trp Leu Lys Asn Lys His Ile 485 490 495 Asp Leu Arg Val Cys Gly Val Ala Asn Ser Lys Ala Leu Leu Thr Asn 500 505 510 Val His Gly Leu Asn Leu Glu Asn Trp Gln Glu Glu Leu Ala Gln Ala 515 520 525 Lys Glu Pro Phe Asn Leu Gly Arg Leu Ile Arg Leu Val Lys Glu Tyr 530 535 540 His Leu Leu Asn Pro Val Ile Val Asp Cys Thr Ser Ser Gln Ala Val 545 550 555 560 Ala Asp Gln Tyr Ala Asp Phe Leu Arg Glu Gly Phe His Val Val Thr 565 570 575 Pro Asn Lys Lys Ala Asn Thr Ser Ser Met Asp Tyr Tyr His Gln Leu 580 585 590 Arg Tyr Ala Ala Glu Lys Ser Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Asp Thr Asn 595 600 605 Val Gly Ala Gly Leu Pro Val Ile Glu Asn Leu Gln Asn Leu Leu Asn 610 615 620 Ala Gly Asp Glu Leu Met Lys Phe Ser Gly Ile Leu Ser Gly Ser Leu 625 630 635 640 Ser Tyr Ile Phe Gly Lys Leu Asp Glu Gly Met Ser Phe Ser Glu Ala 645 650 655 Thr Thr Leu Ala Arg Glu Met Gly Tyr Thr Glu Pro Asp Pro Arg Asp 660 665 670 Asp Leu Ser Gly Met Asp Val Ala Arg Lys Leu Leu Ile Leu Ala Arg 675 680 685 Glu Thr Gly Arg Glu Leu Glu Leu Ala Asp Ile Glu Ile Glu Pro Val 690 695 700 Leu Pro Ala Glu Phe Asn Ala Glu Gly Asp Val Ala Ala Phe Met Ala 705 710 715 720 Asn Leu Ser Gln Leu Asp Asp Leu Phe Ala Ala Arg Val Ala Lys Ala 725 730 735 Arg Asp Glu Gly Lys Val Leu Arg Tyr Val Gly Asn Ile Asp Glu Asp 740 745 750 Gly Val Cys Arg Val Lys Ile Ala Glu Val Asp Gly Asn Asp Pro Leu 755 760 765 Phe Lys Val Lys Asn Gly Glu Asn Ala Leu Ala Phe Tyr Ser His Tyr 770 775 780 Tyr Gln Pro Leu Pro Leu Val Leu Arg Gly Tyr Gly Ala Gly Asn Asp 785 790 795 800 Val Thr Ala Ala Gly Val Phe Ala Asp Leu Leu Arg Thr Leu Ser Trp 805 810 815 Lys Leu Gly Val 820 <210> 30 <211> 309 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(309) <223> homoserine O-succinyltransferase with GenBank Accession No. AP 004514 <400> 30 Met Pro Ile Arg Val Pro Asp Glu Leu Pro Ala Val Asn Phe Leu Arg 1 5 10 15 Glu Glu Asn Val Phe Val Met Thr Thr Ser Arg Ala Ser Gly Gln Glu 20 25 30 Ile Arg Pro Leu Lys Val Leu Ile Leu Asn Leu Met Pro Lys Lys Ile 35 40 45 Glu Thr Glu Asn Gln Phe Leu Arg Leu Leu Ser Asn Ser Pro Leu Gln 50 55 60 Val Asp Ile Gln Leu Leu Arg Ile Asp Ser Arg Glu Ser Arg Asn Thr 65 70 75 80 Pro Ala Glu His Leu Asn Asn Phe Tyr Cys Asn Phe Glu Asp Ile Gln 85 90 95 Asp Gln Asn Phe Asp Gly Leu Ile Val Thr Gly Ala Pro Leu Gly Leu 100 105 110 Val Glu Phe Asn Asp Val Ala Tyr Trp Pro Gln Ile Lys Gln Val Leu 115 120 125 Glu Trp Ser Lys Asp His Val Thr Ser Thr Leu Phe Val Cys Trp Ala 130 135 140 Val Gln Ala Ala Leu Asn Ile Leu Tyr Gly Ile Pro Lys Gln Thr Arg 145 150 155 160 Thr Glu Lys Leu Ser Gly Val Tyr Glu His His Ile Leu His Pro His 165 170 175 Ala Leu Leu Thr Arg Gly Phe Asp Asp Ser Phe Leu Ala Pro His Ser 180 185 190 Arg Tyr Ala Asp Phe Pro Ala Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp Leu 195 200 205 Glu Ile Leu Ala Glu Thr Glu Glu Gly Asp Ala Tyr Leu Phe Ala Ser 210 215 220 Lys Asp Lys Arg Ile Ala Phe Val Thr Gly His Pro Glu Tyr Asp Ala 225 230 235 240 Gln Thr Leu Ala Gln Glu Phe Phe Arg Asp Val Glu Ala Gly Leu Asp 245 250 255 Pro Asp Val Pro Tyr Asn Tyr Phe Pro His Asn Asp Pro Gln Asn Thr 260 265 270 Pro Arg Ala Ser Trp Arg Ser His Gly Asn Leu Leu Phe Thr Asn Trp 275 280 285 Leu Asn Tyr Tyr Val Tyr Gln Ile Thr Pro Tyr Asp Leu Arg His Met 290 295 300 Asn Pro Thr Leu Asp 305

Claims

에스케리치아 속(Escherichia sp.) 균주의 1) 시스타치오닌 감마 신차아제 활성이 약화되거나 비활성화되어 있으며; 2) 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제 활성(EC2.3.1.46)이 도입 또는 증진되어 있으며, 상기 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제는 메치오닌에 대한 피드백 저항성을 가지며; 및 3) 아스파토키나아제 또는 호모세린 디하드로게나아제 활성(EC2.7.2.4 또는 1.1.1.3)이 증진된, O-숙시닐호모세린 생산용 균주.
제1항에 있어서, 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제는 서열번호 30의 아미노산 서열 중에서 24, 29, 79, 114, 140, 163, 222, 275, 290, 291, 295, 297, 304 또는 305 번 위치 중 하나 이상의 위치에서 돌연변이를 가지고, 24번 위치에서는 트레오닌이 세린으로 29번 위치에서는 세린이 프롤린으로79번 위치에서는 아스파라긴이 세린으로114번 위치에서는 글루탐산이 글리신으로140번 위치에서는 페닐알라닌이 세린 또는 이소류신으로163번 위치에서는 라이신이 글루타민으로222번 위치에서는 페닐알라닌이 류신으로275번 위치에서는 알라닌이 글루탐산으로290번 위치에서는 아스파라긴이 히스티딘으로291번 위치에서는 티로신이 아스파라긴으로295번 위치에서는 글루타민이 아르기닌으로297번 위치에서는 트레오닌이 알라닌으로304번 위치에서는 메치오닌이 류신으로305번 위치에서는 아스파라긴이 티로신으로 돌연변이되는 것인 균주.
제1항에 있어서, 호모세린 O-숙시닐트랜스퍼라아제는 서열번호 14, 16, 18, 20, 또는 22 의 아미노산 서열을 가지는 것인 균주.
삭제
제1항에 있어서, 아스파토키나아제 또는 호모세린 디히드로게나아제는 서열번호 29의 아미노산 서열을 가지는 것인 균주.
제1항에 있어서, 상기 에스케리치아 속 균주는 L-트레오닌, L-이소류신 또는 L-라이신 생산 균주인 것인 균주.
제1항에 있어서, 상기 에스케리치아 속 유래 균주는 대장균(Escherichia coli.) 인 균주.
삭제
제1항에 있어서, 상기 O-숙시닐호모세린 생산용 균주는 호모세린 키나아제가 약화되거나 비활성화되어 있는 균주.
제1항에 있어서, 상기 O-숙시닐호모세린 생산용 균주는 메치오닌 합성 경로의 전사 조절자가 약화되거나 비활성화되어 있는 균주.
삭제
제1항에 있어서, 상기 O-숙시닐호모세린 생산용 균주는 호모세린 키나아제를 코딩하는 thrB 유전자, 및 metA 유전자의 전사 조절자인 metJ 유전자가 약화되거나 비활성화되어 있는 균주.
제1항에 있어서, 상기 에스케리치아 속 균주는 L-메치오닌-의존성으로부터 자유로운 트레오닌 생산 균주인 대장균 MF001 (Escherichia coli MF001, 기탁번호 KCCM 10568)인 균주.
제1항에 있어서, 상기 에스케리치아 속 균주는 트레오닌 생산 균주인 대장균 FTR2533(Escherichia coli FTR2533, 기탁번호 KCCM 10541)인 균주.
제1항에 있어서, 상기 O-숙시닐호모세린 생산용 균주는 기탁번호 KCCM 10922P로 표시되는 것인 균주.
제1항에 있어서, 상기 O-숙시닐호모세린 생산용 균주는 기탁번호 KCCM 10924P로 표시되는 것인 균주.
1) 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제7항, 제9항 내지 제10항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 O-숙시닐호모세린 생산용 균주를 발효시키는 단계; 2) 배지 또는 균주들 내에서 O-숙시닐호모세린을 생산하는 단계; 및 3) 생산된 O-숙시닐호모세린을 분리하는 단계를 포함하는, O-숙시닐호모세린의 생산 방법.