IT9021021A1 - Composizioni farmaceutiche per la somministrazione orale di irudina - Google Patents

Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo: "COMPOSIZIONI FARMACEUTICHE PER LA SOMMINISTRAZIONE ORALE DI IRUDINA"

La presente invenzione ha per oggetto composizioni farmaceutiche somm inistrabili per via orale contenenti cane principio attivo irudina ricanbinante.

L'invenzione riguarda anche l'uso di un'irudina ricanbinante per la preparazione di un medicamento da somministrarsi oralmente per il trattamento di trombosi venosa e arteriosa.

L'irudina nativa è un polipeptide di p.m. 7.000, existituito da 65 aminoacidi e dotato di elevata e specifica attività antitrombotica. Tale attività è diretta sulla trombina .

L'irudina estratta dalle sanguisughe secondo il metodo di Markwardt (Z. Phys.U. Chem. 388, 147, 1957} è, fra l'altro, dotata di attività anticoagulante ed emorragica (aumento del tempo di sanguinamento).

La ricerca biotecnologica e farmacologica allargata ha reso possibile la preparazione e la caratterizzazione dell'irudina ricanbinante che si differenzia da quella nativa per l'assenza di un gruppo solfato sulla Tyr-63 della sequenza e per alcune peculiari caratteristiche farmacologiche .

L'irudina ricanbinante dell'invenzione non modifica i parametri della coagulazione né in vitro, né in vivo, cioè è priva di attività anticoagulante ; inoltre è priva di attività emorragica in quanto non aumenta il tempo di bleeding nel ratto e nel coniglio.

L'attività che caratterizza l'irudina ricambinante è quella antitrcmbotica nel senso che previene o inibisce la formazione del trombo in diversi modelli animali (Ihromb. Haenostas. 47, 3, 226-229, 1982; Thromb. Res. 43, 613-620, 1986; Pharmazie 43, 202-207, 1988).

Sia l'attività antitrombotica, sia l'assenza di attività anticoagulante e bleeding, alle dosi attive, seno riscontrabili sia per somministrazione intravenosa che sottocutanea.

Studi di faxmacocinetica hanno dimostrato che per

intravenosa nel cane il tenpo di emivita è di circa 60 minuti mentre, per via sottocutanea, la durata di effetto si protrae più a lungo (4-5 ore), con un picco di attività anti-trcmbinica a 90-120 minuti.

Solo nel brevetto francese speciale di medicamento (BSM) n. 3.792 si fa cenno alla possibilità di som inistrare l'irudina nativa per os ma occorre considerare che in tale brevetto si definiva irudina un estratto grezzo di sanguisughe (Hirudo medicinalis) e pertanto non si può trarre alcuna conclusione attendibile sull'effettivo assorbimento orale dell'irudina nativa e tanto meno di quella ricarbinante che è dotato di diverse caratteristiche farmacologiche. E' probabile che l'attività anticoagulante riscontrata dagli inventori di BSM n. 3.792 fosse in realtà dovuta ad altri componenti presenti nell'estratto grezzo utilizzato. Ciò confermerebbe ad esempio quanto riportato da altri Autori (XI Intern ational Congress on Thrombosis and haemostasis - Brussels 6 - 10 July 1987, Abs. n. 280) che hanno presentato i risultati ottenuti somministrando per os nel ratto la saliva di sanguisuga, ottenendo un'attività antitrombot ica, minore rispetto al trattamento endovenoso, che aumentava a seguito di sarministrazioni ripetute. Secondo questi Autori tale effetto anti-trcmbotico non è da attribuirsi all'attività antitrcmbinica dell*irudina. La saliva di sanguisuga, oltre all'irudina, contiene altre proteine quali l'eglina, la ialurondidasi, una collagenasi e apyrase. Nessuna di queste proteine è indicata carne anti-coagulante, conpresa l'eglina che non ha mostrato un effetto anti-trombotico; la sua più evidente attività è risultata quella di inibire la elastasi leucocitica e la catepsina.

Tutta la più recente letteratura scientifica e brevettuale è canunque concorde nel considerare solo ed esclusivamente la somministrazicne parenterale come l'unica efficace per 1'irudina nativa o suoi derivati o frammenti ottenuti per sintesi o con tecniche di DNA ricanbinante, confermando così i risultati già a suo tempo ottenuti da Markwardt et al. (Biomed. Biochim., Acta 46, 4, 237-244, 1987)) che, in prove eseguite sul cane, non hanno trovato alcuna attività farmacologica somministrando irudina per via intraduodenale.

Si è ora trovato, contrariamente a quanto generalmente noto e accettato, che l'irudina ricanbinante, può essere efficacemente somministrata per via orale, dando luogo ad un'attività anti-trombotica dosedipendente e riproducibile.

L'invenzione fornisce pertanto composizioni farmaceutiche somm istrabili oralmente contenenti come principio attivo irudina ricombinante. Le composizioni dell'invenzione possono essere preparate ricorrendo a metodi ed eccipienti convenzionali quali descritti ad esempio in "Remington 's Pharmaceutical Sciences Handbooik", Mack Pub. Co., N.Y., USA.

Esenpi di formulazioni adatte alla somministrazione orale comprendono conpresse, capsule di gelatina dura o molle, granulari, polveri, soluzioni o sospensioni estemporanee e simili. Forme gastro-resistenti, in particolare ottenute da microgranulazione, possano essere vantaggiosamente impiegate nell'ambito della presente invenzione. Dosi unitarie di irudina conterranno tipicamente da 1 a 500 mg, da somministrarsi una o più volte al giorno.

Secondo un aspetto particolarmente preferito dell'invenzione si forniscano inoltre formulazioni liposomiali preparatili incorporando irudina in lecitina d'uovo in presenza di sterilammina o etilfosfato e trattando la miscela con tecniche di sonicazione o di "phase reverse evaporation" . Tali formulazioni consentono una riduzione molto sensibile delle dosi attive anti-tronbootiche di 5-10 volte.

Si riportano di seguito i risultati delle prove farmacologiche condotte somministrando irudina ricombinante per via orale.

Esempio 1

Attività dell'irudina sorauinistrata per os nel modello di trombosi indotta da stasi nella vena giugulare del coniglio.

L'irudina ricombinante saggiata aveva un'attività specifica di 10.000 ATU/mg. Si sono impiegati conigli maschi New Zealand del peso di 2,5-2,7 kg, a digiuno, con acqua a volontà, per 24 ore prima dei trattamenti. L'anestesia viene indotta con ketamina (70 mg-kg i.m.) e xilazina (20 mg/kg i.m.). Si isola la vena giugulare destra per un segmento lungo circa 2 cm; viene inserito in giugulare, attraverso la vena facciale, un filo di cotone della lunghezza di 3 cm. Due pinze emostatiche sono applicate sopra e sotto il filo e lasciate in situ per 30 minuti. Dopo 30 minuti sono rimosse ed il trombo è lasciato a flusso libero per 90 minuti. L’induzione del trombo è dovuta ai due stimoli: la stasi in presenza del filo.

Dopo 90 minuti, il filo con adeso il trombo viene rimosso, portato a secco (80eC, 1 ora) e pesato. L'irudina riccmbinante, disciolta in acqua, è stata somministrata a tre diverse dosi, in volume di 1 ml/kg, per os (sonda gastrica) 60 minuti prima di indurre la formazione del trombo nella vena giugulare di coniglio. Gli animali controllo ricevevano acqua 1 ml/kg os.

Gli esperimenti sono stati condotti in cieco. Ogni esperimento era costituito da 4 conigli: 1 coniglio controllo e 3 conigli trattati con irudina a 3 dosi diverse (specificate nella descrizione dei risultati). Ogni esperimento è stato replicato 10 volte.

I risultati sono stati valutati mediante analisi della varianza, test di Dunnett, regressione; è stata calcolata la DE50.

I risultati ottenuti sono riassunti nella Tabella I.

TABELA I

Attività antitrombotica dell'irudina ricanbinante (r-HIR) somministrata per os nel coniglio 60 minuti prima di indurre la formazione del trombo nella vena giugulare. Determinazione del tempo di trombina (TT) nel plasma prelevato prima e dopo i trattamenti.

Madia ± E.S. di 10 dati per gruppo (trombo), 5 dati per ΊΤ

(r-HIR 5 mg/kg)

* P < 0.05

(testi di Dunnett)

** P < 0.01

L' irudina somministrata per os nel coniglio, nelle condizioni sperimentali descritte, ha sorprendentemente dimostrato attività antitrombotica. L'irudina è stata scmninistrata alle dosi 1,25 - 2,5 - 5 mg/kg e gli effetti seno statisticamente significativi e dose-dipendenti. La DE50 è stata di 3,5 mg/kg.

E· interessante rilevare che l'irudina alla dose più elevata (5 mg/kg os ), che ha inibito la trombosi del 58%, non ha modificato il tempo di trombina determinato ex-vivo 60 e 180 minuti dopo il trattamento.

Esempio 2

Attività dell'irudina (10.000 ATU/mg) ricombinante somministrata per os nella trombosi da copper-coil nel ratto.

Sono stati usati ratti maschi CD (Charles River) del peso di 250-260 g dopo il digiuno di 24 ore. La trombosi è stata indotta in anestesia da pentobarbital (60 mg/kg i.p.), inserendo un copper-coil nella vena cava inferiore via vena iliaca sinistra e posizionato caudalmente alla vena renale sinistra. I trombi seno stati rimossi 1 ora dopo l'inserzione del coil, posti a 80°C per 1 ora e pesati.

In alcuni esperimenti preliminari 1'irudina (irudina ricombinante , lotto F 1-3, 1/88) è stata semminisfrata per os nel ratto alla dose 2,5 mg/kg (1 mi/kg) ai tempi 0,5 - 1- 2 - 4 ore prima di indurre la trombosi, per individuare il tempo di massima risposta al farmaco. In base ai dati ottenuti l'attività antitrombotica dell'irudina è stata valutata alle dosi 0,375 - 0,75 - 1,5 - 3 mg/kg (1 ml/kg) somministrate per os 4 are prima di indurre la trombosi. Nelle stesse condizioni sperimentali è stata saggiata l'eparina calcica (HEP/5).

I risultati seno riportati nella Tabella II.

Attività antitrombotica dell 'irudina (r-H) somministrata per os nel ratto 4 care prima di indurre la trombosi.

Eparina calcica (HSP/5) somministrata nelle stesse condizioni sperimentali, ad una dose estremamente elevata.

M ± ES di 10 dati per gruppo.

* P < 0,05

(test di Tukey)

** P < 0,01

DE50 per irudina = 2,06 mg/kg os

Risultati e conclusioni

L'irudina somministrata per os nel ratto ha dimostrato una notevole attività antitrontootica alle dosi di 1,5 e 3 mg/kg; c'è una tendenza alla relazione dose-effetto, infatti la regressione è risultata significativa.

E' interessante la durata dell'attività: alle 4 ore (tempi osservati: 0,5 - 4 ore), l'irudina ha dimostrato la sua attività più rilevante.

L'eparina calcica ad una dose estremamente elevata (30 mg/kg os) non ha dimostrato effetto anti-trombotico.

Prelievi di sangue, dall'aorta addominale, sono stati effettuati in sodio citrato, prima di rimuovere il trombo (5 ore e 15 minuti dopo i trattamenti) , in 5 ratti controllo e (5 ratti/gruppo) trattati aon irudina (3 mg/kg os) e eparina calcica (30 mg/kg os). E' stato separato il plasma e conservato a -30°C fino alla determinazione, mediante kits, del TT e PT.

Le sostanze in esame, somministrate per os, non hanno modificato i parametri della coagulazione considerati.

Esempio 3

Attività dell'irudina ricombinante (10.000 AOT /mg) microincapsulata in microbeads gastroresistenti, senninistrati per os, nella trenfaosi da stasi nella vena giugulare del coniglio.

Il test viene eseguito nelle stesse condizioni dell'Esempio 1. Le dosi di irudina ricombinante somministrate sono: 0,625 - 1,25 - 2,5 mg/kg. I risultati somo riassunti nella Tabella III.

TABELLA III

r-HIR in microbeads gastroresistenti somministrati per via orale. Trombosi vena giugulare del coniglio.

Esempio 4

attività deli'irudina rioanbinante (10.000 ATU/mg) "entrapped" in liposomi somministrati per sonda gastrica.

I liposcmi sono stati preparati con le tecniche già note; per esempio, incorporando irudina in lecitina d'uovo con 10% di sterilamina o 10% di etilfosfato e trattando la miscela con tecniche di sonreazione o di "phase reverse evaporation". La sospensione di liposcmi viene dispersa in latte di mucca e poi somm inistrata per sonda gastrica. Il test di trombosi nel ratto si esegue come quello descritto nell'Esempio 2. Le dosi di principio attivo sermónistrate sono: 0,3 - 0,6 - 1,2 mg/kg. I risultati sano riassunti nella Tabella IV.

TABELLA IV

Irudina in liposcmi, somministrati per sonda gastrica nel ratto (tranbosi venosa da copper-coil).

I seguenti esempi illustrano ulteriormente l'invenzione.

Esempio 5

Capsule di gelatina dura contenenti irudina ricombinante.

Ogni capsula contiene:

Le capsule possono essere somministrate all'uomo sia tali e quali sia rivestite con sostanze gastroresistenti, tipo Eudragit.

Claims (5)

1. RIVENDICAZICNI 1. Composizioni farmaceutiche per la somministrazione orale di irudina ricombinante .
2. 2. Composizioni secondo la rivendicazione 1 sotto forma di microgranuli gastroresistenti .
3. 3. Composizioni secondo la rivendicazione 1 sotto forma di formulazioni liposomiali.
4. 4. Composizioni secondo una qualunque delle rivendicazioni precedenti comprendenti cane principio attivo irudina riccmbinante.
5. 5. Uso di irudina riccmbinante per la preparazione di un medicamento da somministrarsi oralmente per il trattamento di trcmbosi venosa e arteriosa.