HUP0303018A2

HUP0303018A2 - Izocianátok, tiocianátok vagy ezek keverékének alkalmazása depigmentálószerként

Info

Publication number: HUP0303018A2
Application number: HU0303018A
Authority: HU
Inventors: Daniel Jean
Original assignee: Lmd
Priority date: 2001-01-26
Filing date: 2002-01-24
Publication date: 2003-12-29
Also published as: MXPA03006731A; EP1353644A1; FR2820036B1; US20040077715A1; JP2004520371A; FR2820036A1; KR20030086256A; CA2435942A1; CZ20032012A3; PL364826A1; SK9612003A3; WO2002058664A1

Abstract

A találmány tárgya (I) általános képletű izotiocianát R1-N=C=S (I) aképletben R1 jelentése alkil-, alkenil-, alkinil-, aril-, acetil-,alkilkarbonil-, alkoxi-, cikloalkil-, ariloxi-, arilkarbonil-,karbonsav vagy karbonsav-észtercsoport vagy egy -(CH2)nR3 csoport,ahol n értéke 1-5 közötti szám és R3 jelentése egy poláros, funkcióscsoport, előnyösen halogénatom vagy szulfoxid-, karbonil-, nitro-,tio-észter-, tio-éter-, szulfonil-, szulfinil-, nitril-, karbonsav-,karbonsav-észter-, alkiltio- vagy hidroxilcsoport -, vagy egy (II)általános képletű tiocianát R2-S=C=N (II) a képletben R2 jelentésealkil-, alkenil-, alkinil-, aril-, acetil-, alkilkarbonil-, alkoxi-,cikloalkil-, ariloxi-, arilkarbonil-, karbonsav- vagy karbonsav-észtercsoport vagy egy -(CH2)nR3 csoport, ahol n értéke 1-től 5-igterjedő szám és R3 jelentése egy poláros funkciós csoport, előnyösenhalogénatom vagy egy szulfoxid-, karbonil-, nitro-, tio-észter-, tio-éter-, szulfonil-, szulfinil-, nitril-, karbonsav-, karbonsav-észter-,alkiltio- vagy hidroxilcsoport vagy ezek keverékének alkalmazásatyrozináz gátlására szolgáló gyógyszerkészítmény vagy kozmetikaikészítmény előállításánál. Ó

Description

DANUBIA Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

Budapest

Izocianátok, tiocianátok vagy ezek keverékének alkalmazása depigmentálószerként

A találmány depigmentálószerekre, különösen izotiocianátok vagy tiocianátok depigmentálószerként való alkalmazására vonatkozik.

Humán egyedek bőrének pigmentációja egy komplex sejtfolyamat sorozatból származik, ami egyetlen sejtpopulációban, a melanocitákban megy végbe. A melanociták az epidermis alsó részében helyezkednek el és a szerepük egy barna pigment, a melanin szintetizálása, ami védi a testet az ultraviola sugárzás káros hatásaival szemben. A melanin a melanoszomákban rakódik le, ezek a melanociták belsejében elhelyezkedő hólyagocskák, üregek. A melanocitákból a melanoszomák kiürülnek és ezeket a bőr felületén a keratinociták tovább szállítják, amelyek asszimilálják a melanoszomákban lévő melanint. A bőr sötét elszíneződése arányos a melanociták által szintetizált és a keratinocitákkal tovább szállított melanin mennyiségével. Bizonyos esetekben előnyös a melanogenesis-t csökkenteni vagy gátolni, például a bőr halványításával, a kor következtében előforduló foltok eltávolítására vagy csökkenteni a melanociták hiperaktivitását.

A bőr felületén megjelenő foltok, így például szeplők eltávolítására régóta alkalmaznak különböző kozmetikai készítmé99252-1913 OE/Hoj

nyékét, így peroxidot, például hidrogén-peroxidot vagy cinkperoxidot tartalmazó készítményeket. Azonban, a peroxidok különösen instabilak és ezért problematikus a tárolásuk. Továbbá, az ezen peroxidok kozmetikai alapokba való beépítése nehézkes és a peroxidoknak önmagukban sincs elegendő fehérítő hatásuk.

Továbbá alkalmaztak C vitamint, ciszteint vagy kolloid ként tartalmazó kozmetikai készítményeket is a bőr fehérítésére. Azonban ezen anyagok hatása sem kielégítő.

Különböző dermokozmetikai készítményekben régóta alkalmaznak hidrokinont depigmentáló anyagként. Ez a termék azonban nem minden veszély nélküli és jelentős citotxicitású a melanocitákkal szemben, ami irreverzibilis depigmentációt képes kiváltani.

Az utóbbi időben a kojinsavat alkalmazták hatásosan az emberi bőrben a melanin kialakulásának gátlására. Ezért különböző kozmetikai készítményeket hoztak létre, amelyek a bőr depigmentálására szolgálnak és amelyek kojinsavat tartalmaznak (Japán 56-18569 számú közzétételi irat) vagy kojinsav-észtert egy aromás karbonsavval, így cinnamicsavval vagy benzoesavval együtt tartalmaznak (Japán 60/100005 számú közzétételi irat), vagy kojinsav-diésztert tartalmaznak (Japán 61-60801 és 60-17961 számú közzétételi iratok). Ezekről a kojinsavakról és kojinsav-észterekről tehát ismert, hogy képesek gátolni a melanogenesist. Azonban, a kojinsav hatása egyedektől függhet és átlagban nem kielégítő.

E miatt további kutatás szükséges topikális depigmentálószerek kialakítására.

-3Meglepő módon felismertük, hogy bizonyos, a tiocianátok és izotiocianátok csoportjába tartozó molekula jelentős gátló hatással van a tyrozinázra in vitro.

Az izotiocianátokat különböző keresztes virágú fajokból lehet extrahálni, ilyenek a brokkoli, Lepidium dabra és a retek, ezek a vegyületek a szulforafán és szulforafen.

A szulforafánról és ennek bizonyos szintetikus analógjairól ismert, hogy védelmet nyújtanak különböző, kémiai anyagok mutagén hatásával szemben, például a dohányfüstben jelenlévő anyagokkal szemben. Ez a hatás magába foglalja a szervezetből távozó mutagén molekulák ban jelenlévő enzimatikus rendszerek indukálását. Úgy tűnik, hogy ezek a molekulák továbbá közvetlenül hatnak a mutagenézis mechanizmusára is (WO 94/19948, Carcinogenesis, 8, 12, 1987, 1971-1973; Cancer Research, 51, 13, 1991, 2063-2068).

Ezen anyagok depigmentáló hatását azonban eddig még sehol nem ismertették.

A találmány tehát az (I) általános képletű izotiocianátok Ri-N=C=S (I) a képletben

Rí jelentése alkil-, alkenil-, alkinil-, aril-, acetil-, alkilkarbonil-, alkoxi-, cikloalkil-, ariloxi-, arilkarbonil-, karbonsav vagy karbonsav-észtercsoport vagy egy -(CH₂)_nR3 csoport, ahol n értéke 1-5 közötti szám és R₃ jelentése egy poláros, funkciós csoport, előnyösen halogénatom vagy szulfoxid-, karbonil-, nitro-, tio-észter-, tio-éter-, szulfonil-, szulfínil-, nitril-, karbonsav-, karbonsav-észter-, alkiltio- vagy hidroxilcsoport - , vagy

-4egy (II) általános képletű vegyület R₂-S=C=N (II) a képletben

R₂ jelentése alkil-, alkenil-, alkinil-, aril-, acetil-, alkilkarbonil-, alkoxi-, cikloalkil-, ariloxi-, arilkarbonil-, karbonsav- vagy karbonsav-észtercsoport vagy egy -(CH₂)_nR₃csoport, ahol n értéke 1-től 5-ig terjedő szám és R₃ jelentése egy poláros funkciós csoport, előnyösen halogénatom vagy egy szulfoxid-, karbonil-, nitro-, tio-észter-, tio-éter-, szulfonil-, szulfínil-, nitril-, karbonsav-, karbonsav-észter-, alkiltio- vagy hidroxilcsoport vagy ezek keverékeinek alkalmazására vonatkozik tyrozináz gátlására szolgáló gyógyszer vagy kozmetikai készítmény előállításánál.

Az alkilcsoport jelentése a találmány értelmében bármilyen szubsztituált vagy szubsztituálatlan egyenes vagy elágazó láncú 1-10 szénatomos alkilcsoport, előnyösen CH₃ csoport.

Az alkenilcsoport jelentése a találmány értelmében bármilyen szubsztituált vagy szubsztituálatlan egyenes vagy elágazó láncú 2-10 szénatomos alkenilcsoport, különösen vinilcsoport.

Az alkinilcsoport jelentése a találmány értelmében bármilyen szubsztituált vagy szubsztituálatlan egyenes vagy elágazó láncú 2-10 szénatomos alkinilcsoport, különösen etinilcsoport.

Az alkilkarbonilcsoport jelentése a találmány értelmében bármilyen fentiek szerinti alkilcsoport, amely karbonil

-5csoporthoz kapcsolódik. Az alkilkarbonilcsoport jelentése előnyösen acetilcsoport.

Az alkoxicsoport jelentése a találmány értelmében bármilyen szubsztituált vagy szubsztituálatlan egyenes vagy elágazó láncú 1-10 szénatomos alkoxicsoport, különösen OCH₃csoport.

Az cikloalkilcsoport jelentése a találmány értelmében bármilyen 1-10 szénatomot tartalmazó alkilcsoportból álló gyűrű, amely nem szubsztituált, különösen ciklohexilcsoport.

Az arilcsoport jelentése a találmány értelmében egy vagy több aromás, 5-8 szénatomot tartalmazó gyűrű, amely összekapcsolva vagy kondenzálva is lehet, továbbá szubsztituált vagy szubsztituálatlan. Különösen az arilcsoport, fenil- vagy naftilcsoport és a szubsztituens halogénatom, valamely fentiek szerinti alkoxi- vagy alkilcsoport vagy nitrocsoport.

Az ariloxicsoport jelentése a találmány értelmében valamely fentiek szerinti arilcsoport, amely valamely fentiek szerinti alkoxicsoporton keresztül kapcsolódik.

Az aralkilcsoport jelentése a találmány értelmében bármilyen fentiek szerinti arilcsoport, amely valamely fentiek szerinti alkilcsoporton keresztül kapcsolódik, különösen benzilcsoport.

Az arilkarbonilcsoport jelentése a találmány értelmében bármilyen fentiek szerinti arilcsoport, amely karbonilcsoporton keresztül kapcsolódik, különösen benzoilcsoport.

A karbonsav jelentése a találmány értelmében bármilyen fentiek szerinti alkilcsoport, amelyhez egy karboxilcsoport (-COOH) kapcsolódik.

-6A szulfonilcsoport jelentése a találmány értelmében bármelyik fentiek szerinti alkil-, cikloalkil- vagy arilcsoport, amely SO2 csoporton keresztül kapcsolódik.

A szulfinilcsoport jelentése a találmány értelmében alkil-, cikloalkil- vagy arilcsoport, amely SO csoporton keresztül kapcsolódik.

Az alkiltiocsoport jelentése a találmány értelmében valamely fentiek szerinti alkilcsoport, amely kénatomon keresztül kapcsolódik.

A találmány vonatkozik továbbá a fentiek szerinti (I) általános képletű izotiocianátok vagy (II) általános képletű tiocianátok vagy ezek keverékének alkalmazására gyógyszerkészítmények vagy kozmetikai készítmények előállítására, amelyek alkalmasak az epidermis depigmentálására vagy világosítására vagy a kor miatt bekövetkező foltok eltávolítására.

A tiocianát előnyösen olyan (II) általános képletű tiocianát vegyület, amelynek képletében R₂ jelentése aralkilcsoport; még előnyösebben a vegyület benzil-tiocianát.

A (II) általános képletű tiocianátot előnyösen sója, különösen előnyösen nátrium vagy kálium sója formájában alkalmazzuk.

A tiocianátok egyidejűleg az izotiocianátokkal, keresztes növények mirozináz által képzett glikozinolátok bomlása során képződik (Pharmacognosie, Phytochimie, Plantes Médicinales [Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants], Bruneton, kiadó Lavoisier, Párizs, 1993, 177). Néhány ilyen vegyület szintetikus és kereskedelmi forgalomban is beszerezhető, így például a benzil-tiocianát, gyártó Fluka (ref. 13929).

Egy előnyös kiviteli formánál az (I) általános képletű izotiocianát szintetikus izotiocianát, a képletben különösen Rí jelentése aril-, acetil-, alkilkarbonil-, cikloalkil-, arilkarbonilvagy arilalkilcsoport. Az izotiocianát előnyösen ciklohexil-izotiocianát, benzil-izotiocianát, acetil-izotiocianát vagy benzoil-izotiocianát.

A szintetikus izotiocianátok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők, így a ciklohexil-izotiocianát, benzil-izotiocianát és benzoil-izotiocianát az Aldrich cég terméke (ref. C10-540-6, 25,249-2 és 26,165-3) és az acetil-izotiocianát Fluka gyártmány (ref. 01230).

Egyéb izotiocianátokat előállíthatunk például az US 5 411 986 számú szabadalmi leírásban leírtak szerint.

Egy másik előnyös kiviteli formánál az (I) általános képletű izotiocianátot keresztes növényekből nyerjük extrakcióval, ilyenek a brokkoli, Lepidium dabra és a retek. Ezek a vegyületek különösen előnyösen a szulforafán and szulforafen.

A keresztes növények extrakcióját előnyösen a következő lépések szerint végezzük:

a keresztes növényt kezeljük, előnyösen liofilizáljuk vízzel elkeverhető oldószer vagy víz/oldószer keverékkel, előnyösen acetonnal, a kapott oldatot, előnyösen csökkentett nyomáson, betöményítjük, a kapott terméket szűrjük,

0°C-on ezüst-nitráttal kezeljük, a kicsapódó ezüst komplexet szűrjük, a komplexet nátrium-tioszulfáttal kiszorítjuk,

a kapott szuszpenziót vízzel nem elkeverhető szerves oldószerrel extraháljuk, ez előnyösen kloroform, éter, etil-acetát vagy ezek keveréke, még előnyösebben éter/kloroform keverék, a kapott szerves fázist szárítjuk, a kapott terméket adott esetben tisztítjuk, előnyösen vékonyréteg-kromatográfíával.

A következő példákban a korlátozás szándéka nélkül bemutatjuk a szulforafán és szulforafen előállítását keresztes növények extrakciójával.

1. példa

Szulforafán előállítása g liofilizált brokkolit (Brassica oleracea italica) háromszor visszafolyatás közben 75%-os acetonnal kezelünk.

Az extrakciós oldatokat egyesítjük és csökkentett nyomáson 100 g tömegre betöményítjük. A koncentrátumot szűrőpapíron szűrjük, a szűrletet 0°C-ra hűtjük és hozzáadunk 100 ml 60%-os vizes ezüst-nitrát oldatot. A csapadékot ezután színtereit üvegszűrőn szűrjük, 3x100 ml desztillált vízzel átöblítjük, a kiváló csapadékot ezután 100 ml 60%-os vizes nátrium-tioszulfát oldattal kezeljük, ezt 0°C-on 2 órán át való keveréssel végezzük.

A kapott szuszpenziót ezután egy elválasztótölcsérbe viszszük és 6x50 ml etil-éter/kloroform eleggyel (8/2 tf/tf) extraháljuk. A szerves fázist nátrium-szulfáton szárítjuk, majd csökkentett nyomáson betöményítjük. így 32 g nyers szulforafánt nyerünk. A maradékot szilikagél preparatív kromatog-9ráfiás lemezre visszük és az eluálást izopropanol/metanol 7/3 tf/tf elegyével végezzük.

A lemezt ammóniás ezüst-nitrát oldattal egy kis részén vizualizáljuk a szulforafán migrációs szakaszának meghatározására. Ezt a szakaszt lekaparjuk, és a szulforafánt a szilíciumdioxidról kloroformmal extraháljuk. A kloroformot elpárologtatjuk, így 9 mg szulforafánt nyerünk. A szulforafánt gázkromatográfiával és ehhez kapcsolt tömegspektrométerrel azonosítjuk.

2. példa

Szulforafen előállítása

Az előállítást a brokkolinál leírtakhoz hasonlóan végezzük, de retekmagot alkalmazunk (Raphanus sativus).

mg szulforafent nyerünk vékonyréteg-kromatográfiával végzett tisztítás után.

3. példa (D,L)-szulforafán előállítása g 4-klórbutironitrilt (Aldrich C 3,000-0) feloldunk 800 ml abszolút etil-alkoholban, amelyet előzőleg nátriumról desztilláltunk.

Ezt követően 27 g metántioátot (Fluka 71742) adagolunk és a kapott keveréket 25°C-on 15 órán át keverjük. A szuszpenziót ezután szűrőpapíron szűrjük, a szűrletet csökkentett nyomáson betöményítjük, a visszamaradó anyagot 400 ml etiléterben felvesszük, majd a szűrést megismételjük szűrőpapíron keresztül. Az éteres oldat 32 g nyers 4-metiltiobutironitrilt tartalmaz.

- 1025 g lítium-alumínium-hidridet 400 ml etil-éterben szuszpendálunk.

A 4-metiltiobutironitril oldatot fokozatosan a lítium-alumínium-hidrid szuszpenzióhoz adagoljuk és a kapott keveréket 2 óra 30 percen át visszafolyatás közben melegítjük.

A szuszpenziót ezután semlegesítjük lassan, visszafolyatás közben adagolt 80 ml desztillált vízzel. Amikor a forrás megszűnt, 120 ml desztillált vizet adunk a meglévő hidrid teljes semlegesítésére. A keveréket ezután színtereit üvegtölcséren szűrjük, az oldhatatlan anyagot a szűrőn 200 ml etil-éterrel átmossuk, az éteres frakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk, így 26,9 g metiltiobutilamint nyerünk. Ezt 80 ml acetonban felvesszük, hozzáadunk 23 ml 35%-os hidrogénperoxidot adagonként, majd a kapott keveréket 1 éjszakán át vízfürdőn 50°C-on tartjuk.

Ezután kis mennyiségű aktívszenet adagolunk hozzá, a keveréket szűrjük, majd lassan hozzáadunk 200 ml kloroformot, amely 5 ml tiofoszgént tartalmaz, majd ezt követően 300 ml 5%-os vizes nátrium-hidroxid oldatot adagolunk. A reakciót 30 percen át végezzük.

A kapott keveréket ezután ellenáramban extraháljuk 8x200 ml diklórmetánnal. A szerves fázist összegyűjtjük, nátrium-szulfáton szárítjuk és betöményítjük.

A visszamaradó anyagot ezután 130°C-on 7xl0'² torr nyomáson desztilláljuk. így 12,5 g D, L-szulforafánt nyerünk, ezt tömegspektrometriával azonosítjuk.

A következő példákban ismertetjük a tyrozináz gátló hatást a korlátozás szándéka nélkül.

- 11 Tyrozináz gátló hatás meghatározása

A következő reakciót végezzük: színtelen L-Dopa-t (L-3,4-dihidroxifenilalanin, gyártó Sigma (ref. D-9628)) színes dopakrómmá oxidálunk, ez 475 nm-en mutat abszorpciót. A reakciót gomba tyrozinázzal katalizáljuk (EC 1.14.18.1, gyártó Sigma (ref. T-7755)). A reakció kinetikáját az optikai sűrűség változásával követjük (O.D.) az idő függvényében 30°C-on.

A különböző oldatok összetétele a következő:

pH 6,5 puffer
Monokálium-foszfát	0,70 g
Dinátrium-foszfát	0,69 g
Desztillált víz	szükség szerint, 100 ml-ig

Szubsztrát oldat

L-Dopa 0,35% t/tf% pH 6,5 puffer oldatban.

Inhibitor oldatok

A nátrium molekulákat közvetlenül a pH 6,5 pufferban, 50% metanolban (metanol/desztillált víz) vagy tiszta metanolban oldjuk, függően az oldhatóságuktól.

A különböző inhibitorok tömeg%-ban kifejezett koncentrációja a következő: 0,2%, 0,1%, 0,05%, 0,025%, 0,0125%, 0,00625%és0,00312%.

Enzim oldat

Tyrozináz 0,010% t/tf% pH 6,5 pufferban.

A különböző oldatok felhasznált mennyiségét a vizsgálatok során az 1. és 2. táblázatban foglaljuk össze.

-121. táblázat

Enzim-szubsztrátum reakció

	Vakpróba	Teszt
Puffer	1,8 ml	1,3 ml
Szubsztrátum	1 ml	1 ml
Enzim	0 ml	0,5 ml
Inhibitor oldószer	0,2 ml	0,2 ml
Inhibitor	0 ml	0 ml

2. táblázat

Enzim szubsztrátum inhibitor reakció

	Vakpróba	Teszt
Puffer	1,8 ml	1,3 ml
Szubsztrátum	1 ml	1 ml
Enzim	0 ml	0,5 ml
Inhibitor oldószer	0,2 ml	0 ml
Inhibitor különböző koncentrációkban	0 ml	0,2 ml

A tyrozináz hatását a reakció kezdő sebességével határozzuk meg az optikai sűrűsség (O.D.) leolvasásával.

A reakció kezdeti sebességét inhibitor nélkül (0 koncentráció) és a különböző koncentrációknál meghatározott sebességet egy görbén ábrázoljuk. A molekula gátló hatását azzal a koncentrációval jellemezzük, amely a tyrozináz hatását 50%-kal csökkenti.

- 13 Az inhibitorként tesztelt molekulákat az Aldrich vagy Fluka cégtől szereztük be, kivéve a szulforafánt és szulforafent, ez az 1. és 2. példa szerint előállított termék.

A vizsgálati eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze.

Molekula	Koncentráció, amelynél a tyrozináz enzimatikus aktivitása 50%-kal csökken, % (t/tf)
Hidrokinon (Aldrich ref. 24,012-5) (referencia molekula)	0,154
Ciklohexil-izotiocianát (Aldrich ref. Cl0-540-6)	0 ,104
Benzil-izotiocianát (Aldrich ref. 25,249-2)	0,0980
Szulforafán	0,103
Szulforafen	0 ,112
Acetil-izotiocianát (Fluka ref. 01230)	0,055
Benzoil-izotiocianát (Aldrich ref. 26,165-3)	0,0063
Kálium-tiocianát	0,20
Benzil-tiocianát (Fluka ref. 13929)	0,25

A szulforafán a tyrozinázt kb. 1,5-ször nagyobb mértékben gátolja, mint a hidrokinon.

így megállapítottuk, hogy a táblázatban megadott izotiocianát felülmúlja a hidrokinon hatását és hogy ezek közül a leg

- 14aktívabb a benzoil-izotiocianát, ez kb. 24-szer aktívabb, mint a hidrokinon.

A tiocianátok aktivitása hasonló a hidrokinonéhoz.

A benzoil-izotiocianát és szulforafán depigmentáló hatása, viszonyítva a kojinsav és hidrokinon hatásához pigmentált tengerimalacokon

Pigmentált bőrű tengerimalacokat leborotválunk és kétszer naponta 7 nap közül 5 napon át a kezelés 1-2 hónapjában 5% kojinsavat (ref. Aldrich 22,046-9) vagy 5% hidrokinont (ref. Aldrich H 1,790-2) vagy 5% benzoil-izotiocianátot (ref. Aldrich 30,818-8) vagy 5% szintetikus 3. példa szerint előállított szulforafánt tartalmazó krémmel kezeljük. A kezelést 2 cm átmérőjű köralakú területen végezzük, ezt sárga, tartós tintával jelöltük meg.

hetes kezelés után és a hidrokinonnal és benzoil-izotiocianáttal kezelt foltok lehámlasztása után mindegyik termékre szignifikáns mértékű világosodást figyeltünk meg, kivéve a kojinsavat, amelynél nem volt ilyen hatás.

Szulforafán hatásának vizsgálata a kojinsavval összehasonlítva melanin szintézis gátlására tenyésztett melanociták esetén

Ennél a vizsgálatnál hidrokinont nem használhattunk annak igen nagy citotoxicitása miatt.

A vizsgálatot különböző sejt adagokon végeztük, a kísérletek függetlenek voltak és 8-szor ismételtük őket.

Vizsgáltuk a melanin szintézist kinetikailag 6 napon át, napi egyszeri kezelés után; a sejtek életképességét MTT-vel és/vagy kristály viola festékkel való festéssel igazoltuk.

- 15·..'· Η· ^:λ*’

A kapott eredményeket mg/ml melaninban fejezzük ki, amennyiben a sejteket azonos koncentrációban inokuláltuk.

0,00035% koncentrációnál a hidrokinon és szulforafán a melanin szintézisét gátolja, míg a kojinsav és a benzoilizotiocianátnak nincs hatása. Az összes vizsgálat során (8 független vizsgálat) a következő eredményeket kaptuk 0,00035% koncentrációnál az összes termékre:

26,22% inhibició szulforafán esetén, 1% kojinsav esetén, 9,5% benzoil-izotiocianát esetén és 42% hidrokinon esetén.

Melanin szintézist gátló hatás tenyészetben kialakított pigmentált humán bőrre

Type-6 pigmentált epidermis-t (megfelel a fekete bőrnek) vizsgálatonként három párhuzamossal 5 napon át naponta kezeltünk egy kontroll krémmel, amelynek összetétele a következő (tömeg%):

Cetearil-alkohol	7
Nátrium-cetearil-szulfát	0,7
Stearinsav	3
Glicerin	20
Nipa-észterek keveréke fenoxietanolban	0,5
Trietanolamin	0,2
Desztillált víz	68

valamint kojinsavval 3,5x10⁵ t/t koncentrációban és szulforafánnal 3,5x10'⁶ t/t koncentrációban hasonló krém hordozóban.

A kezelés végén a tenyésztett bőrt további 2 napon át hagytuk állni, majd a melanint a kezelt bőrből és a kontroll

- 16bőrből extraháltuk oldószerek és nátrium-hidroxid keverékével (Solvable®, gyártó Packard Bioscience B.V.), majd az extrahált melanint kolorimetriával meghatároztuk ismert módon (Chemical Characterization of Hair Melanins in Various CoatColor Mutants of Mice; Hiroyuki Ozeki és mtársai, J. Invest. Dermatol. 105, 3, 1995, 361-366).

Azt találtuk, hogy a kojinsav a melatonin szintézisét 8%-kal, a szulforafán 30%-kal gátolja, bár ez utóbbi koncentrációja 10-szer alacsonyabb, mint a kojinsavé.

Claims

- 17Szabadalmi igénypontok

1. (I) általános képletű izotiocianát Rj-NOS (I) a képletben

Rí jelentése alkil-, alkenil-, alkinil-, aril-, acetil-, alkilkarbonil-, alkoxi-, cikloalkil-, ariloxi-, arilkarbonil-, karbonsav vagy karbonsav-észtercsoport vagy egy -(CH₂)_nR₃csoport, ahol n értéke 1-5 közötti szám és R₃ jelentése egy poláros, funkciós csoport, előnyösen halogénatom vagy szulfoxid-, karbonil-, nitro-, tio-észter-, tio-éter-, szulfonil-, szulfinil-, nitril-, karbonsav-, karbonsav-észter-, alkiltio- vagy hidroxilcsoport - , vagy (II) általános képletű tiocianát

R₂-S=C=N (II) a képletben

R₂ jelentése alkil-, alkenil-, alkinil-, aril-, acetil-, alkilkarbonil-, alkoxi-, cikloalkil-, ariloxi-, arilkarbonil-, karbonsav- vagy karbonsav-észtercsoport vagy egy -(CH₂)_nR₃csoport, ahol n értéke 1-től 5-ig terjedő szám és R₃ jelentése egy poláros funkciós csoport, előnyösen halogénatom vagy egy szulfoxid-, karbonil-, nitro-, tio-észter-, tio-éter-, szulfonil-, szulfinil-, nitril-, karbonsav-, karbonsav-észter-, alkiltio- vagy hidroxilcsoport vagy ezek keverékének alkalmazása tyrozináz gátlására szolgáló gyógyszerkészítmény vagy kozmetikai készítmény előállításánál.

-18·..· J. ^:·Ε “l· ^:λ’’
2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amelynél a (II) általános képletű tiocianát só formájú, előnyösen nátrium vagy kálium só.
3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amelynél az (I) általános képletű izotiocianát keresztes növények, előnyösen brokkoli, Lepidium dabra vagy retek extrakciójával van előállítva.
4. A 3. igénypont szerinti alkalmazás, amelynél az izotiocianát szulforafán vagy szulforafen.
5. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amelynél az (I) általános képletű izotiocianát valamely következő szintetikus izotiocianát: ciklohexil-izotiocianát, benzil-izotiocianát, acetil-izotiocianát vagy benzoil-izotiocianát.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás gyógyszerkészítmények vagy kozmetikai készítmények előállítására, amelyek alkalmasak az epidermis világosítására vagy depigmentálására vagy korral létrejövő foltok eltávolítására.

A meghatalmazott:

DANUBIA

Szabadqlmi és Védjegy Iroda Kft.

OlchváryMézahé szabadalmi ügyvivő