CZ20032012A3

CZ20032012A3 - Použití isothiokyanátu, thiokyanátu nebo jejich směsi jako depigmentačního činidla

Info

Publication number: CZ20032012A3
Application number: CZ20032012A
Authority: CZ
Inventors: Daniel Jean
Original assignee: Lmd
Priority date: 2001-01-26
Filing date: 2002-01-24
Publication date: 2004-01-14
Also published as: HUP0303018A2; MXPA03006731A; EP1353644A1; FR2820036B1; US20040077715A1; JP2004520371A; FR2820036A1; KR20030086256A; CA2435942A1; PL364826A1; SK9612003A3; WO2002058664A1

Description

Použití isothiokyanátu, thiokyanátu nebo jejich směsi jako depigmentačního činidla

Oblast techniky

Přihláška se týká depigmentačních činidel a konkrétně použití isothiokyanátů nebo thiokyanátu jako depigmentačního činidla.

Dosavadní stav techniky

Pigmentace lidské pokožky je výsledkem komplikovaného sledu buněčných procesů, ke kterým dochází v populaci buněk známých jako melanocyty. Melanocyty se nacházejí ve spodní části epidermis a jejich funkcí je syntetizovat hnědé barvivo, melanin, které chrání tělo před poškozujícími účinky ultrafialového záření. Melanin se ukládá v melanozomech, což jsou váčky nacházející se uvnitř melanocytů. Melanozomy jsou vylučovány z melanocytů a transportovány směrem k povrchu pokožky keratinocyty, které vstřebávají melanin přítomný v melanozomech. Tmavá barva pleti je přímo úměrná množství melatoninu syntetizovaného melanocyty a transportovaného keratinocyty. V některých případech je výhodné snížit nebo inhibovat melanogenezi, například pro zesvětlení pokožky, odstranění skvrn způsobených stárnutím nebo snížení hyperaktivity melanocytů.

Pro odstranění skvrn, jako jsou pihy, které se objevují na pokožce, se po dlouhou dobu používají kosmetické přípravky obsahující peroxid, jako je peroxid vodíku nebo peroxid zinku. Peroxidy jsou však extrémně nestálé, a proto obtížně skladovatelné. Navíc je stabilní inkorporace těchto peroxidů do kosmetických bází obtížná a samotné peroxidy nemají dostatečný bělící účinek.

Na druhou stranu se pro účely bělení pokožky začaly používat kosmetické přípravky obsahující vitamin C, cystein nebo koloidní síru. Účinky těchto látek však nejsou uspokojivé.

Hydrochinon byl po dlouhý čas referenční depigmentační molekulou používanou v mnoha dermatokosmetických přípravcích. Tento produkt však není bez nebezpečí a vykazuje značnou cytotoxicitu vzhledem k melanocytům, což s sebou může přinést ireverzibilní depigmentaci.

Kyselina kojová byla nedávno s úspěchem použita pro inhibici tvorby melaninu v lidské pokožce. Následně se objevily různé kosmetické přípravky pro depigmentaci pokožky, které obsahují kyselinu kojovou (japonský patent číslo 56-18 569) nebo ester kyseliny kojové s aromatickou karboxylovou kyselinou, jako jsou kyselina skořicová nebo kyselina benzoová (japonský patent číslo 60/100 005), nebo diester kyseliny kojové (japonské patenty číslo 61-60 801 a 60-17 961). Kyselina kojová a estery kyseliny kojové jsou proto • · • · · ·

známy jako látky schopné inhibovat melanogenezi. Účinnost kyseliny kojové se však liší mezi jednotlivci a v průměru je její účinnost nedostatečná.

V důsledku toho je hledání dalších depigmentačních látek stále velmi zajímavým tématem.

Podstata vynálezu

Přihlašovatelé překvapivě zjistili, že jisté molekuly patřící do rodiny thiokyanátů a isothiokyanátů mají in vitro velmi výrazný inhibiční účinek na tyrosinasu.

Isothiokyanáty, jako jsou sulforafan a sulforafen, mohou být extrahovány z různých druhů brukvovitých rostlin včetně brokolice, Lepidium dabra a ředkví.

Sulforafan a některé jeho syntetické analogy jsou známy tím, že ochraňují proti mutagenním účinkům chemických látek, jako jsou například ty přítomné v tabákovém kouři. Tento účinek zahrnuje indukci enzymatických systémů podílejících se na odstranění mutagenních molekul z těla. Také se zdá, že tyto molekuly přímo účinkují na mechanizmy mutageneze (WO 94/19 948, Carcinogenesis, 8, 12, 1987, strany 1971-1973; Cancer Research, 51, 13, 1991, strany 2063-2068).

Účinek těchto látek jako depigmentačního činidla však nebyl nikdy popsán.

Tato přihláška se tedy týká použití isothiokyanátů následujícího obecného vzorce I:

Ri-N=C=S (I) kde Ri představuje alkylovou skupinu, alkenylovou skupinu, alkinylovou skupinu, arylovou skupinu, acetylovou skupinu, alkylkarbonylovou skupinu, alkoxylovou skupinu, cykloalkylovou skupinu, aryloxylovou skupinu, arylkarbonylovou skupinu, karboxylovou kyselinu nebo karboxylesterovou skupinu nebo skupinu -(CH₂)_nR3, kde n představuje celé číslo od 1 do 5 a R₃ představuje polární funkční skupinu, s výhodou atom halogenu nebo sulfoxidovou skupinu, karbonylovou skupinu, nitroskupinu, thioesterovou skupinu, thioetherovou skupinu, sulfonylovou skupinu, sulfinylovou skupinu, nitrilovou skupinu, karboxylovou kyselinu, karboxyesterovou skupinu, alkylthioskupinu nebo hydroxylovou skupinu, použití thiokyanátů následujícího obecného vzorce II:

R₂-S=C=N (Π)

kde R₂ představuje alkylovou skupinu, alkenylovou skupinu, alkinylovou skupinu, arylovou skupinu, acetylovou skupinu, alkylkarbonylovou skupinu, alkoxylovou skupinu, cykloalkylovou skupinu, aryloxylovou skupinu, arylkarbonylovou skupinu, karboxylovou kyselinu nebo karboxylesterovou skupinu nebo skupinu -(CH₂)_nR3, kde n představuje celé číslo od 1 do 5 a R3 představuje polární funkční skupinu, s výhodou atom halogenu nebo sulfoxidovou skupinu, karbonylovou skupinu, nitroskupinu, thioesterovou skupinu, thioetherovou skupinu, sulfonylovou skupinu, sulfinylovou skupinu, nitrilovou skupinu, karboxylovou kyselinu, karboxyesterovou skupinu, alkylthioskupinu nebo hydroxylovou skupinu, nebo použití jejich směsí pro výrobu léku nebo kosmetického přípravku se záměrem inhibovat tyrosinasu.

Termínem „alkylová skupina“ se v této přihlášce rozumí jakákoliv substituovaná nebo nesubstituovaná a lineární nebo větvená alkylová skupina obsahující 1 až 10 uhlíkových atomů, obzvláště skupina CH₃.

Termínem „alkenylová skupina“ se v této přihlášce rozumí jakákoliv substituovaná nebo nesubstituovaná a lineární nebo větvená alkenylová skupina obsahující 2 až 10 uhlíkových atomů, obzvláště vinylová skupina.

Termínem „alkinylová skupina“ se v této přihlášce rozumí jakákoliv substituovaná nebo nesubstituovaná a lineární nebo větvená alkinylová skupina obsahující 2 až 10 uhlíkových atomů, obzvláště ethinylová skupina.

Termínem „alkylkarbonylová skupina“ se v této přihlášce rozumí jakákoliv alkylová skupina, jak byla definována výše, navázaná na karbonylovou skupinu. Příkladem alkylkarbonylové skupiny je acetylová skupina.

Termínem „alkoxylová skupina“ se v této přihlášce rozumí jakákoliv substituovaná nebo nesubstituovaná a lineární nebo větvená alkoxylová skupina obsahující 1 až 10 uhlíkových atomů, obzvláště skupina OCH3.

Termínem „cykloalkylová skupina“ se v této přihlášce rozumí jakýkoliv kruh obsahující alkylovou skupinu obsahující 1 až 10 uhlíkových atomů, kteiý je substituovaný nebo nesubstituovaný, obzvláště cyklohexylová skupina.

Termínem „arylová skupina“ se v této přihlášce rozumí jeden nebo více aromatických kruhů s 5 až 8 uhlíkovými atomy, kruhy mohou být spojeny nebo sfuzovány a substituovány nebo nesubstituovány. Zejména může být arylovými skupinami fenylová nebo naftylová skupina a substituenty atomy halogenů, alkoxylové skupiny, jak byly definovány výše, alkylové skupiny, jak byly definovány výše, nebo nitroskupina.

Termínem „aryloxylová skupina“ se v této přihlášce rozumí jakákoliv arylová skupina, jak byla definována výše, navázaná na alkoxylovou skupinu, jak byla definována výše.

Termínem „aralkylová skupina“ se v této přihlášce rozumí jakákoliv arylová skupina, jak byla definována výše, navázaná na alkylovou skupinu, jak byla definována výše. Zejména je aralkylovou skupinou benzylová skupina.

Termínem „arylkarbonylová skupina“ se v této přihlášce rozumí jakákoliv arylová skupina, jak byla definována výše, navázaná na karbonylovou skupinu. Příkladem arylkarbonylové skupiny je benzoylová skupina.

Termínem „karboxylová kyselina“ se v této přihlášce rozumí jakákoliv alkylová skupina, jak byla definována výše, na kterou je navázána karboxylová skupina (-COOH).

Termínem „sulfonylová skupina“ se v této přihlášce rozumí jakákoliv alkylová, cykloalkylová nebo arylová skupina, jak byla definována výše, navázaná na skupinu SO2.

Termínem „sulfinylová skupina“ se v této přihlášce rozumí jakákoliv alkylová, cykloalkylová nebo arylová skupina, jak byla definována výše, navázaná na skupinu SO.

Termínem „alkylthioskupina“ se v této přihlášce rozumí jakákoliv alkylová skupina, jak byla definována výše, navázaná na atom síry.

Přihláška se také týká použití isothiokyanátu obecného vzorce I, thiokyanátu obecného vzorce II nebo jejich směsi pro výrobu léku nebo kosmetického přípravku pro zesvětlení nebo depigmentaci epidermis nebo pro odstranění skvrn vzniklých stárnutím.

Thiokyanát je s výhodou thiokyanát obecného vzorce II, jehož R2 představuje aralkylovou skupinu, ještě výhodněji je to benzylthiokyanát.

Thiokyanát obecného vzorce II je s výhodou ve formě soli, ještě výhodněji ve formě sodné nebo draselné soli.

Thiokyanáty mohou být získány současně s isothiokyanáty během rozkladu glukosinolátů brukvovitých rostlin pomocí myrosinasy (Pharmacognosie, Phytochimie, Plantes Médicináles [Pharmacognosy, Phytochemistry, Medicinal Plants], Bruneton, publikováno Lavoisierem, Paříž, 1993, str. 177). Některé jsou syntetické a dostupné komerčně, jako benzylthiokyanát od firmy Fluka (ref. 13 929).

V konkrétním provedení je isothiokyanát obecného vzorce I syntetickým isothiokyanátem, obzvláště takovým, kde Ri je arylová, acetylová alkylkarbonylová, cykloalkylová, arylkarbonylová nebo arylalkylová skupina. Isothiokyanát je s výhodou vybrán ze skupiny obsahující cyklohexylisothiokyanát, benzylisothiokyanát, acetylisothiokyanát a benzoylisothiokyanát.

• · • · • · ·· · · • ·

Syntetické isothiokyanáty jsou dostupné komerčně. Cyklohexylisothiokyanát, benzylisothiokyanát a benzoylisothiokyanát jsou dostupné od firmy Aldrich (ref. Cl0-540-6, 25,249-2, respektive 26,165-3) a acetylisothiokyanát od firmy Fluka (ref. 01230).

Další isothiokyanáty mohou být syntetizovány podle metody a příkladů uvedených v patentu US 5 411 986.

V dalším konkrétním provedení je získáván isothiokyanát obecného vzorce I extrakcí z brukvovitých druhů s výhodou vybraných ze skupiny obsahující brokolici, Lepidium dabra a ředkví. Ještě výhodněji je isothiokyanát vybrán ze skupiny obsahující sulforafan a sulforafen.

Proces extrakce brukvovitých druhů zahrnuje zejména následující kroky:

zpracování brukvovitých druhů, s výhodou lyofilizovaných, vodou mísitelnými rozpouštědly nebo směsí voda/rozpouštědlo, výhodně acetonem koncentraci získaného roztoku, s výhodou za sníženého tlaku filtraci získaného produktu reakci s nitrátem stříbrným při 0 °C filtraci vytvořené sraženiny stříbmatého komplexu nahrazení tohoto komplexu thiosíranem sodným extrakci získané suspenze s vodou nemísitelným organickým rozpouštědlem s výhodou vybraným ze skupiny obsahující chloroform, ether, ethylacetát a jejich směs, ještě výhodněji směs ethylether/chloroform vysušení organické fáze popřípadě purifikaci získaného produktu, obzvláště chromatografii na tenké vrstvě

Následující příklady přípravy sulforafanu a sulforafenu extrakcí brukvovitých rostlin jsou míněny jako ukázky bez jakýchkoliv omezení z nich vyplývajících.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1

Příprava sulforafanu g lyofilizované brokolice (Brassica oleracea italica) se třikrát extrahuje varem pod zpětným chladičem v 75% acetonu.

Extrakční roztoky se smíchají a koncentrují za sníženého tlaku na 100 g. Koncentrát se přefiltruje přes filtrační papír. Filtrát se ochladí na 0 °C a přidá se 100 ml 60% vodného roztoku nitrátu stříbrného. Sraženina se přefiltruje přes filtr se skleněným sintrem a promyje • · • · • · • · · ·

• · · · • · ♦ • · · • · · · · · se třikrát 100 ml destilované vody. Sraženina se následně nechá zreagovat se 100 ml 60% vodného roztoku thiosíranu sodného po dvě hodiny za stálého míchání při 0 °C.

Získaná suspenze se následně extrahuje v separační nálevce šestkrát 50 ml směsi ethylether/chloroform (8/2 v/v). Organická fáze se usuší přes síran sodný a následně se odpaří za sníženého tlaku. Získá se 32 mg hrubého sulforafanu. Sušina se nanese na silikagelovou preparativní chromatografickou desku a provede se eluce pomocí směsi isopropanolu a methanolu (7/3 v/v).

Deska se na malé části obarví pomocí amoniakálního nitrátu stříbrného, aby se stanovila oblast, kam domigroval sulforafan. Tato oblast se seškrábe a sulforafan se extrahuje ze silikagelu chloroformem. Chloroform se odpaří a získá se 9 mg sulforafanu. Sulforafan se identifikuje plynovou chromatografií spojenou s hmotnostní spektrometrií.

Příklad 2

Příprava sulforafenu

Příprava se provádí stejným způsobem jako u brokolice, ale použijí se semena ředkve (Raphanus sativus).

Po purifikaci chromatografií na tenké vrstvě se získá 7 mg sulforafenu.

Příklad 3

Syntéza (D, L)-sulforafanu g 4-chlorbutyrnitrilu (ref. Aldrich C 3,000-0) se rozpustí v 800 ml absolutního ethylalkoholu předtím destilovaného přes sodík.

Poté se přidá 27 g methanthioátu (ref Fluka 71 742) a směs se nechá míchat 15 hodin při 25 °C. Suspenze se přefiltruje přes filtrační papír a filtrát se odpaří za sníženého tlaku. Zbytek se převede do 400 ml ethyletheru. Znovu se vše přefiltruje přes filtrační papír. Získá se etherový roztok obsahující 32 g hrubého 4-methylthiobutymitrilu.

Připraví se suspenze 25 g hydridu hlinitolithného ve 400 ml ethyletheru.

Roztok 4-methylthiobutymitrilu se postupně přidá k suspenzi hydridu hlinitolithného a směs se vaří pod zpětným chladičem po 2 h 30.

Suspenze se při varu pod zpětným chladičem následně zneutralizuje pomalým přidáváním 80 ml destilované vody. Když se var ukončí, přidá se postupně 120 ml destilované vody, aby se dokončila neutralizace zbývajícího hydridu. Směs se přefiltruje přes nálevku se skleněným sintrem. Nerozpustný materiál na filtru se promyje 200 ml ethyletheru. Etherické frakce se smíchají a odpaří do sucha. Získá se 26,9 g methylthiobutylaminu. Produkt se ·· ····

převede do 80 ml acetonu, ke kterému se postupně přidá 23 ml 35% peroxidu vodíku. Směs se ponechá přes noc ve vodní lázni o teplotě 50 °C.

Následně se přidá malé množství aktivního uhlí, směs se přefiltruje a pomalu se přidá 200 ml chloroformu obsahujícího 20 ml thiofosgenu, poté se přidá 300 ml 5% vodného roztoku hydroxidu sodného. Vše se nechá reagovat po 30 min.

Směs se následně protiproudně extrahuje osmkrát 200 ml dichlormethanu. Najímá se organická fáze, usuší se přes síran sodný a odpaří. Zbytek se následně přečistí redestilací při 135 °C při tlaku 7 x 10’² torrů (9,332566 Pa). Získá se 12,5 g D,L-sulforafanu, jehož identita se potvrdí hmotnostní spektrometrií.

Následující příklady měření síly inhibice tyrosinasy jsou uvedeny jako ukázka bez jakýchkoliv vyplývajících omezení.

Měření síly inhibice tyrosinasy

Použije se následující reakce: bezbarvý L-Dopa (L-3,4-dihydroxyfenylalanin, získaný od firma Sigma (ref. D-9628)) se oxiduje na zbarvený dopachrom, který absorbuje při 475 nm. Tato reakce je katalyzována houbovou tyrosinasou (EC 1.14.18.1, získaná od firmy Sigma (ref. T-7755)). Kinetika reakce se zaznamenává měřením optické hustoty (O.D.) při 30 °C jako funkce času.

Složení různých použitých roztoků je následující:

PufrpH6,5:

Dihydrogenfosforečnan draselný 0,70 g

Hydrogenfosforečnan sodný 0,69 g

Destilovaná voda do 100 ml

Roztok substrátu:

0,35% (w/v) L-Dopa v pufru pH 6,5

Roztoky inhibitorů:

Inhibiční molekuly se rozpustí přímo v pufru pH 6,5, v 50% methanolu (methanol/destilovaná voda) nebo v čistém methanolu podle jejich rozpustnosti.

Koncentrace jednotlivých roztoků inhibitorů jsou: 0,2%, 0,1%, 0,05%, 0,025%, 0,0125%, 0,00625% a 0,00312% (w/v).

• 4 ·· ♦ 4 4 • 4 4 4 · · · ·

44·· ··

4« ♦ · • · 4 ♦ · · ·

4 ··· • 4 ·

4444

Roztok enzymu:

0,010% (w/v) tyrosinasa v roztoku pufru pH 6,5.

Množství těchto jednotlivých roztoků použitá během testování jsou pro každou studovanou reakci uvedena v Tabulkách 1 a 2:

Tabulka 1: Reakce enzym-substrát

	Slepý vzorek	Testovaný vzorek
Pufr	1,8 ml	1,3 ml
Substrát	1 ml	1 ml
Enzym	0 ml	0,5 ml
Rozpouštědlo inhibitoru	0,2 ml	0,2 ml
Inhibitor	0 ml	Oml

Tabulka 2: Reakce enzym-substrát-inhibitor

	Slepý vzorek	Testovaný vzorek
Pufr	1,8 ml	1,3 ml
Substrát	1 ml	1 ml
Enzym	Oml	0,5 ml
Rozpouštědlo inhibitoru	0,2 ml	Oml
Inhibitor o různých koncentracích	Oml	0,2 ml

Účinek tyrosinasy je hodnocen počáteční rychlostí reakce naměřené při zaznamenávání O.D..

Počáteční rychlosti reakcí bez inhibitorů (koncentrace 0) a rychlosti při různých testovaných koncentracích se vynesou jako křivka.

Síla inhibice molekuly je definována jako koncentrace, která snižuje účinek tyrosinasy o 50 %.

Molekuly testované jako inhibitory se získají od firem Aldrich nebo Fluka v závislosti na produktu, s výjimkou sulforafanu a sulforafenu, které se připraví podle způsobu popsaného v Příkladech 1 a 2.

Φ ··· • « φφ ·· * φφφ· · φφφ· · • φ Φφφ φ φ • · · · φ φ φ · · • · φ φ φ · φ φ · φφφφ

Výsledky získané s testovanými molekulami jsou shromážděny v následující tabulce:

Molekula	Koncentrace inhibující enzymatickou aktivitu tyrosínasy na 50 %, v % (hmotnost/obj cm)
Hydrochinon (Aldrich ref. 24,012-5) (referenční molekula)	0,154
Cyklohexylisothiokyanát (Aldrich ref. C10- 540-6)	0,104
Benzylisothiokyanát (Aldrich ref. 25,249-2)	0,0980
Sulforafan	0,103
Sulforafen	0,112
Acetylisothiokyanát (Fluka ref, 01230)	0,055
Benzoylisothiokyanát (Aldrich ref. 26,165-3)	0,0063
Thiokyanát draselný	0,20
Benzylthiokyanát (Fluka ref. 13929)	0,25

Sulforafan inhibuje tyrosinasu přibližně l,5x více než hydrochinon.

Je tedy pozorováno, že všechny isothiokyanáty použité v tabulce jsou lepší než hydrochinon a že z nich nejaktivnější, benzoylisothiokyanát, je přibližně 24x aktivnější než hydrochinon.

Thiokyanáty, mají podobnou aktivitu jako hydrochinon.

Testování depigmentační síly benzoylisothiokyanátu a sulforafanu v porovnání s kyselinou kojovou a hydrochinonem na pigmentovaných morčatech

Morčatům s pigmentovanou pokožkou, předtím oholeným, se dvakrát denně, 5 dní do týdne, po dobu jednoho až dvou měsíců aplikuje glycerolová mast obsahující 5% kyselinu kojovou (Aldrich 22,046-9) nebo 5% hydrochinon (ref. Aldrích H 1,790-2) nebo 5% benzoylisothiokyanát (ref. Aldrich 30,818-8) nebo 5% syntetický sulforafan připravený podle Příkladu 3. Tyto přípravky se nanáší na kruhové oblasti o průměru 2 cm vyznačené nesmazatelným žlutým inkoustem.

Po čtyřtýdenním podávání a po deskvamaci pokožky u hydrochinonových a benzoylisothiokyanátových skvrn se pozoruje významné zbělání pokožky u všech produktů kromě kyseliny kojové, která nemá žádný účinek.

toto to ···· to ·· • · ♦ · toto ·· ·· • · · · • ·· · •to · ♦ ·· ·· * *· toto ·· *···

Testování síly sulforafanu inhibovat syntézu melaninu v porovnání s kyselinou kojovou pří použití kultivovaných melanocytů

Hydrochinon se nemůže použít v tomto testu jako referenční produkt vzhledem k jeho velmi vysoké toxicitě.

Tato testování se provedou na různých skupinách buněk, experimenty se provedou na sobě nezávisle a opakovaně (8 krát).

Testuje se syntéza melaninu kineticky nebo po šestidenním ošetřování (jednou denně); viabilita buněk se potvrdí MTT testem a/nebo barvením krystalovou violetí.

Výsledky se vyjádří v mg/ml melaninu, vzhledem k tomu, že se buňky nasadí ve stejné koncentraci.

Při koncentraci 0,00035 % inhibují hydrochinon a sulforafan syntézu melaninu, zatímco kyselina kojová a benzoylisothiokyanát tento účinek nemají. Ze všech testů (8 nezávislých testů) se pro koncentraci 0,00035 % všech produktů získají tyto výsledky:

26,22% inhibice sulforafanem, 1% kyselinou kojovou, 9,5% benzoylisothiokyanátem a 42% inhibice hydrochinonem.

Testování síly inhibice syntézy melaninu při použití pigmentované lidské pokožky rekonstituované v kultuře

Pigmentovaná epidermis typu 6 (odpovídající černé pokožce) ve třech vzorcích na test se ošetřuje denně po 5 dní kontrolní mastí o následujícím složení (jako % hmotnosti):

Cetearylalkohol	7
Cetearylsíran sodný	0,7
Kyselina stearová	3
Glycerol	20
Směs esterů z nipy ve fenoxyethanolu	0,5
Triethanolamin	0,2
Destilovaná voda	68

s kyselinou kojovou v koncentraci 3,5 χ 10'⁵ (w/w) a se sulforafanem v koncentraci

3,5 χ 10’⁶ (w/w) ve stejné masti jako excipientů.

·· ···· • · * • · · • · · · • · ♦ · ♦ · ·· ·· «· ·« ·« • · · * · · · • ··· · ·· * • · · · · ·♦♦· • · · · * ♦

JI ··♦· ·· ·· ·♦

Po skončení aplikace se kultivovaná pokožka ponechá v kultuře po další dva dny a poté se z ošetřované a kontrolní pokožky extrahuje melanin směsí rozpouštědel a hydroxidu sodného (Solvable® od firmy Packard Bioscience Β. V.) a extrahovaný melanin se kolorimetricky kvantifikuje podle dříve popsané metody (Chemical Characterization of Hair Melanins in Various Coat-Color Mutants of Mice; Hiroyuki Ozeki et al., J. Invest. Dermatol. 105, 3, 1995, 361 -366).

Zjistí se, že kyselina kojová inhibuje syntézu melatoninu o 8 % a sulforafan o 30 %, přestože je jeho koncentrace desetkrát nižší než koncentrace kyseliny kojové.

Průmyslová využitelnost

Isothiokyanáty, thiokyanáty a jejich směsi jsou použitelné pro výrobu léku nebo kosmetického přípravku pro zesvětlení nebo depigmentaci epidermis nebo pro odstranění skvrn vzniklých stárnutím.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití isothiokyanátu následujícího obecného vzorce I:

Ri-N=C=S (I) kde Ri představuje alkylovou skupinu, alkenylovou skupinu, alkinylovou skupinu, arylovou skupinu, acetylovou skupinu, alkylkarbonylovou skupinu, alkoxylovou skupinu, cykloalkylovou skupinu, aryloxylovou skupinu, arylkarbonylovou skupinu, karboxylovou kyselinu nebo karboxylesterovou skupinu nebo skupinu -(CH₂)„R₃, kde n představuje celé číslo od 1 do 5 a R3 představuje polární funkční skupinu, s výhodou atom halogenu nebo sulfoxidovou skupinu, karbonylovou skupinu, nitroskupinu, thioesterovou skupinu, thioetherovou skupinu, sulfonylovou skupinu, sulfinylovou skupinu, nitrilovou skupinu, karboxylovou kyselinu, karboxyesterovou skupinu, alkylthioskupinu nebo hydroxylovou skupinu, použití thiokyanátu následujícího obecného vzorce II:

r₂-s=c=n (Π) kde R₂ představuje alkylovou skupinu, alkenylovou skupinu, alkinylovou skupinu, arylovou skupinu, acetylovou skupinu, alkylkarbonylovou skupinu, alkoxylovou skupinu, cykloalkylovou skupinu, aryloxylovou skupinu, arylkarbonylovou skupinu, karboxylovou kyselinu nebo karboxylesterovou skupinu nebo skupinu ~(CH₂)_nR₃, kde n představuje celé číslo od 1 do 5 a R3 představuje polární funkční skupinu, s výhodou atom halogenu nebo sulfoxidovou skupinu, karbonylovou skupinu, nitroskupinu, thioesterovou skupinu, thioetherovou skupinu, sulfonylovou skupinu, sulfinylovou skupinu, nitrilovou skupinu, karboxylovou kyselinu, karboxyesterovou skupinu, alkylthioskupinu nebo hydroxylovou skupinu, nebo použití jejich směsí pro výrobu léku nebo kosmetického přípravku se záměrem inhibovat tyrosinasu.
2. Použití podle předcházejícího nároku 1, kde thiokyanát obecného vzorce lije ve formě soli, s výhodou ve formě sodné nebo draselné soli.

«·· ·· 9 • · • · • · • · ·

99 *
3. Použití podle předcházejícího nároku 1, kde isothiokyanát obecného vzorce I je získán extrakcí brukvovitých druhů s výhodou vybraných ze skupiny obsahující brokolici, Lepidium dabra a ředkve.
4. Použití podle předcházejícího nároku 3, kde isothiokyanát obecného vzorce I je vybrán ze skupiny obsahující sulforafan a sulforafen.
5. Použití podle předcházejícího nároku 1, kde isothiokyanát obecného vzorce I je syntetickým isothiokyanátem vybraným ze skupiny obsahující cyklohexylisothiokyanát, benzylisothiokyanát, acetylisothiokyanát a benzoylisothiokyanát.
6. Použití podle kteréhokoliv předcházejícího nároku 1 až 5 pro výrobu léku nebo kosmetického přípravku se záměrem zesvětlit nebo depigmentovat epidermis nebo odstranit skvrny vzniklé stárnutím.