HUP0101276A2 - Eljárás és tesztkészlet baktériumok érzékenységének kimutatására - Google Patents
Eljárás és tesztkészlet baktériumok érzékenységének kimutatására Download PDFInfo
- Publication number
- HUP0101276A2 HUP0101276A2 HU0101276A HUP0101276A HUP0101276A2 HU P0101276 A2 HUP0101276 A2 HU P0101276A2 HU 0101276 A HU0101276 A HU 0101276A HU P0101276 A HUP0101276 A HU P0101276A HU P0101276 A2 HUP0101276 A2 HU P0101276A2
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- culture
- bacteria
- adenylate kinase
- antibiotic
- kinase activity
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/18—Testing for antimicrobial activity of a material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
A találmány olyan, a külső körülményeknek abaktériumsejtek növekedési jellemzőire gyakorolt hatását vizsgáló invitro tesztre vonatkozik, amely az adenilát-kroáz enzim aktivitásánakmérésén alapszik. Az ilyen tesztek közelebbről a baktériumoknak azantibiotiku-mok, illetve a biosztatikus szerek iránti érzékenységétvizsgálják azáltal, hogy a baktériumsejtek növekedési és fiziológiaiállapotára vonatkozó információt szolgáltatnak. A találmány aszóbanforgó tesztek kivitelezési módjára és az erre szolgálókészletekre is vonatkozik. Ó
Description
······ ··;
····»·· ··· p Π 4 fl ..< .-. ™
Eljárás és tesztkészlet baktériumok érzékenységének kimutatására
A találmány tárgya tesztmódszer baktériumok növekedési jellemzőinek vizsgálatára, közelebbről antibiotikumok, illetve biosztatikus szerek iránti érzékenységük kimutatására. A találmány tárgyához tartoznak a szóbanforgó tesztmódszer kivitelezésére szolgáló készletek is.
A baktériumok antibiotikumok iránti rezisztenciája egyre komolyabb gondot okoz. A baktériumtörzsek antibiotikumrezisztenciájának kimutatására szolgáló jelenlegi módszerek meglehetősen időigényesek. Alkalmazásuk során először is arra van szükség, hogy a szóbanforgó mikroorganizmus tiszta tenyészetét állítsuk elő. Ezután a baktériumsejtekből pázsitot kell készítenünk, hogy különféle antibiotikumok jelenlétében vizsgáljuk növekedésüket. Az egyes antibiotikumok körül látható növekedés-gátlási zóna mutatja, hogy a baktérium érzékeny az antibiotikumra (a zóna mérete pedig az érzékenység mértékét jelzi). Az antibiotikum jelenlétében tapasztalt nem-gátolt növekedés rezisztenciára utal. Ennek a módszernek a kivitelezése legalább két napot igényel, ami korántsem tekinthető ideálisnak, különösen nem klinikai esetben, midőn a fertőzött személy optimális kezelését a teszt alapján határozható meg.
Igény van tehát olyan módszerre, mely az antibiotikumrezisztencia vagy -érzékenység viszonylag gyors, néhány órán belül történő kimutatására alkalmas.
Ismretesek olyan módszerek, melyek az adenilát-kináz enzim aktivitásának mérése alapján mutataják ki mikroorganiz92697-8684-GI «···· · · · f • ·· ·*· · · · musok jelenlétét (pl. PCT/GB94/00118 és PCT/GB94/01513 számú iratok). Az adenilát-kináz esszenciális enzim valamennyi élő sejtben, és ADP jelenlétében az ATP keletkezéséhez vezető reakciót katalizálja, az alábbiak szerint:
ADP ATP + AMP
A módszer kivitelezése során reagensként ADP-t adnak a vizsgált mintához, előnyösen magnéziumionok jelenlétében. Az adenilát-kináz által katalizált reakció eredményeképp keletkező ATP kimutatása például a tűzlégy biolumineszcencia alkalmazásával történhet. Ennek érdekében reagenseket, mint például luciferin/luciferáz kombinációt adnak az elegyhez, általában rövid inkubációs idő, például 5 perc elteltével, és a lumineszcenciás jelet mérik.
A kimutatási módszer érzékenységét csak az adenilátkináz aktivitás háttérértéke és a felhasznált reagensek tisztasága korlátozza. Escherichia coli baktérium modellrendszerben például száznál kevesebb sejt esetén is kimutatható az adenilát-kináz aktivitás 5 perces inkubációs idő alatt, amint azt az 1. ábrán láthatjuk. Az ábra alapjául szolgáló módszer kivitelezése során 200 μΐ térfogatú mintát használtunk.
Úgy találtuk, hogy az adenilát-kináz aktivitás érzékeny jelzője a biomassza jelenlétének, és az ismertetett technika alkalmas olyan vizsgálatokra, amelyek részletesebb információt nyújtanak a baktériumsejtek növekedési jellemzőire vonatkozóan.
Fentieknek megfelelően a találmány olyan, a külső körülményeknek a baktériumsejtek növekedési jellemzőire gyakorolt hatását vizsgáló in vitro tesztre vonatkozik, amely az adenilát-kináz enzim aktivitásának mérésén alapszik.
Az adenilát-kináz aktivitásának meghatározása gyors és érzékeny módszert biztosít a bakteriális növekedésnek, illetve a növekedés gátlásának a vizsgálatára. A találmány szerinti módszerrel különböző külső körülmények hatásának vizsgálatára van mód. Az adenilát-kináz aktivitás mérése például alkalmas valamely adott baktériumtörzs vagy kevert tenyészet antibiotikum vagy biosztatikum iránti érzékenységének kimutatására, illetve a módszer adaptálható antibiotikus vagy biosztatikus hatású vegyületek vizsgálatára. Azt is felismertük, hogy egy adott tenyészet extracelluláris és összes (extracelluláris + intracelluláris) adenilát-kináz aktivitásának összehasonlítása alkalmas a tenyészet növekedési és fiziológiai állapotának jellemzésére.
A találmány szerinti módszer kivitelezése során figyelembe kell venni az elvégzendő vizsgálat természetét, a baktériumminta típusát, az esetleg a vizsgálni kívánt vegyületek jellegét, különösen abban a tekintetben, hogy litikus vagy nem litikus hatásúax az alkalmazott sejtekre. A módszer kivitelezési módjait részletesebben a későbbiekben ismertetjük.
A találmány közelebbről olyan módszerre vonatkozik, amely alkalmas valamely baktériumnak egy adott vegyület iránti érzékenységének kimutatására, amelynek során a szóbanforgó vegyületet tartalmazó tenyészet lizátumában mért adenilát-kináz aktivitást megmérjük, és összehasonlítjuk a tenyészetben a reagens adagolása előtt és/vagy annak lizátumából ·“· ·..* ...* különböző időpontokban vett mintákban és/vagy ugyanolyan, reagens nélküli tenyészet lizátumában mért adenilát-kináz aktivitás értékekkel.
A találmány szerinti módszerrel vizsgált vegyületek lehetnek ismert antibiotikumok vagy biosztatikumok, illetve új vegyületek, melyek antibiotikus hatása korábban nem volt ismeretes, így a találmány szerinti módszer szűrővizsgálat részét is képezheti.
Egyes vegyületek, például az antibiotikumok, így pl. a béta-laktám antibiotikumok, amilyenek az ampicillin és az amoxicillin, a baktériumtenyészet lízisét idézik elő. Amenynyiben ez nem következik be, úgy előfordulhat, hogy a módszer kivitelezése előtt a tenyészetet lizálni kell. Ez megoldható különböző, a szakmában ismert módszerekkel, így például lítikus szerekkel történő kezeléssel, vagy fizikai behatással, amilyen például a mágneses vagy elektromos erőtér, illetve az ultrahang alkalmazása.
A baktériumtenyészet lízálására alkalmas szerek lehetnek detergensek vagy enzimek, amilyen például a bakteriolizin. Ezek azonban nem specifikus szerek, és szabaddá teszik az adenilát-kinázt a mintában lévő összes élő anyagból. Mindez nem okoz gondot, amennyiben a minta tiszta tenyészetet tartalmaz. Abban az esetben azonban, ha a vizsgált baktérium kevert tenyészetben van, más megoldáshoz kell folyamodnunk. A kevert tenyészetben lévő célsejtek specifikus mérése történhet például 1) a célsejtek specifikus elválasztását követően az adenilát-kináz nemspecifikus mérésével; 2) olyan módszer alkalmazásával, mely kizárólag a célsejteket lizálja, és ezek adenilát-kináz aktivitását méri; vagy 3) ezen módszerek kombinálásával.
Az adenilát-kináz felszabadítása kizárólag a célsejtekből (2. megoldás) megvalósítható például olyan lizálószer alkalmazásával, amely specifikus a szóbanforgó, vizsgált baktériumra, így például az adott baktériumra specifikus, a sejtek lízisét kiváltó fág alkalmazásával. Az ilyen fágok a baktériumokat fertőző vírusok, melyek a sejtek lízisét, és így a sejtalkotók, így az adenilát-kináz környezetbe jutását idézik elő. Ez a jelenség rendszerint a fertőzést követő 30 60 percen belül bekövetkezik. Azt tapasztaltuk, hogy ilyen módszerrel kevesebb, mint 500 sejt kimutatható egy 40 perces meghatározás keretében.
A fágok képesek a sejteket ugyanolyan hatékonysággal megfertőzni tiszta, illetve kevert tenyészetben egyaránt. A mintából kémiai módszerrel extrahált, illetve adott idővel a fágfertőzést követően mért adenilát-kináz aktivitás összehasonlítása révén kimutatható a célsejtek jelenléte, illetve hiánya, valamint mérhető a vizsgált vegyületeknek a célsejtek növekedésére gyakorolt hatása.
A bakteriofágok szaporodásához és lítikus hatásukhoz arra van szükség, hogy a gazdasejtek exponenciális növekedési fázisban legyenek. Ha például növekedésük valamely antibiotikum vagy bakteriosztatikus szer jelenléte következtében gátolt, úgy á bakteriofág nem képes szaporodni és lizálni a sejteket. Ez a találmány szerinti megoldás egy további megvalósítási formáját képezheti, amint azt a későbbiekben részletesen ismertetjük.
···· ·..· ...· ; .t,
Eljárhatunk úgy is, hogy egy kevert tenyészetet előkezelésnek vetünk alá, melynek során a baktérium célsejteket feldúsítjuk a tenyészetben, vagy pedig elválasztjuk őket. Az ilyen megoldások a szakmában közismertek. Az elválasztás megvalósítható például immunbefogásos technikával, midőn a szóbanforgó baktériumokra specifikus antitesteket vagy azok kötőfragmenseit alkalmazzuk szilárd hordozók felületén, így például műanyag- vagy üveggyöngyön, mikrotiter lemezen, szűrőmembránon vagy oszlopon rögzítve. A mágneses tulajdonságú gyöngyök különösen alkalmas szilárd felületnek tekinthetők. A gyöngyök elválasztása - adott esetben mágneses szeparációs technikával - a célbaktérium izolálásához vezet, a későbbiekben ismertetett módon. Szilárd hordozóként mágneses gyöngyöket alkalmazva jellemzően kevesebb, mint 1000 sejt kimutatása valósítható meg, mindössze 30 perces eljárással. Természetesen más anyagok is felhasználhatók szilárd hordozóként.
A módszer specifikussága tovább fokozható szeletív tápközeg használatával. Ez a megoldás alkalmazható a dúsítási lépés során egészségesen növekvő tenyészet létrehozására, akár immunbefogásos kimutatást, akár pedig fágfertőzést megelőzően. A szelektív tápközeg alkalmazható továbbá a fágfertőzés során is.
Az ilyen tápközeg használata visszaszorítja a mintában jelelévő nem’ célorganizmusok növekedését, melyek némelykor a célbaktériumokat jelentősen meghaladó mennyiségben fordulnak elő.
A fentieknek megfelelően a találmány szerinti módszer alkalmas baktériumok valamely adott antibiotikum vagy bakteriosztatikus szer iránti érzékenységének kimutatására.
Az olyan antibiotikumok, mint a béta-laktámok, így például a penicillinek, a sejtfal bioszintézisének gátlása révén fejtik ki hatásukat, és ezáltal a sejtek elvesztik épségüket, szaporodás közben pedig lizálnak. Ez a jelenség viszonylag gyorsan, mintegy 10 — 15 perccel az antibiotikum expozíció után bekövetkezik, amennyiben a baktériumtenyészet aktív növekedésben van.
Más antibiotikumok, így például a kloramfenikol, nem okozzák a sejtek lízisét, hanem más hatásmechanizmussal gátolják a sejtek növekedését, csakúgy, mint a biosztatikus szerek. Az alkalmazásban lévő szerek hatásmechanizmusa általában ismert. A találmány szerinti módszer adaptálható ezen szerek bármelyikével kapcsolatos érzékenységi vizsgálatok célj ára.
A találmány egy konkrét foganatosítási módja eljárás valamely baktérium lítikus antibiotikum iránti érzékenységének meghatározására, melynek lépései a következők: i) a szóbanforgó baktériumot elválasztjuk a többi mikrobafajtól, például immunbefogásos technikával;
ii) meghatározzuk a szóbanforgó baktérium tenyészetében mérhető extracelluláris adenilát-kináz aktivitást;
iii) lítikus hatású antibiotikumot adunk a tenyészethez, amelyet elégendő ideig inkubálunk ahhoz, hogy az antibiotikum kifejthesse lítikus hatását, és iv) meghatározzuk a tenyészetben mérhető extracelluláris adenilát-kináz aktivitást, annak érdekében, hogy igazol- «·«· · · · · • «· ··· · ·* · hassuk a lízis megtörténtét.
A vizsgálati módszer kivitelezése során az érzékeny baktériumok sejtjei röviddel az antibiotikum hozzáadása után, általában 15 percen belül lizálnak. Ennek következtében az antibiotikum hozzáadása után jelentősen megnő a tenyészet szabad adenilát-kináz aktivitása, minthogy a széteső sejtekből a bennük lévő adenilát-kináz felszabadul. Az adenilátkináz szintjének optimális meghatározásához úgy járunk el, hogy mérjük az adenilát-kináz szintet röviddel az antibiotikum adagolása előtt, majd legalább 15 perccel az antibiotikum adagolása után. Rezisztens baktériumok esetében a tenyészet szabad adenilát-kináz aktivitása lényegében változatlan marad. Ebben az esetben csak a normálisan is jelen lévő, alacsony extracelluláris adenilát-kináz aktivitás mérhető, és - a fenti magyarázattal összhangban - ez az érték többé-kevésbé állandó marad az egészségesen növekvő sejteknél. A módszer alkalmazásával az antibiotikum-érzékenység kimutatása elvégezhető kb. 40 perc alatt.
A módszer kivitelezése során alkalmazhatunk szelektív tápközeget, amely a szóbanforgó baktériumsejtek szaporodását segíti elő a korábban ismertetetteknek megfelelően, és minimalizálja az esetleges fertőzés eredményeképp bekövetkező hamis pozitív eredmény valószínűségét.
A találmány szerinti megoldás egy másik megvalósítási módja olyan -eljárás, melyben valamely baktérium nem lítikus antibiotikum iránti érzékenységét határozzuk meg, melynek lépései a következők:
i) a szóbanforgó baktériumot elválasztjuk a többi mikroba- ··:· ... « fajtól, például immunbefogásos technikával;
ii) a szóbanforgó baktérium tenyészetét a nem-lítikus hatású antibiotikum vagy biosztatikus szer jelenlétében, adott esetben a szóbanforgó baktérium növekedését támogató, szelektív tápközegben inkubáljuk;
íii) megvizsgáljuk, hogy a tenyészetben mérhető összes adenilát-kináz aktivitás az inkubálás során növekvő vagy csökkenő tendenciát mutat, oly módon, hogy időközönként mintát veszünk, a mintában lévő baktériumsejteket lizáljuk, és meghatározzuk az így előkészített minták adenilát-kináz aktivitását.
Ebben az esetben a kémiai lizist követően mérhető adenilát-kináz aktivitás bizonyos ideig, például egy órán át lényegében változatlan marad, amennyiben a baktérium érzékeny az antibiotikumra. Ennek a jelenségnek az az oka, hogy a baktérium nem képes szaporodni az antibiotikum jelenlétében. Ezzel ellentétben a rezisztens baktériumok zavartalanul növekednek, így az adenilát-kináz aktivitás az időben emelkedő tendenciát mutat.
Fentiek alapján a találmány szerinti eljárással valamely tiszta baktériumtenyészet érzékenysége gyorsan meghatározható mind lítikus, mind pedig nem lítikus hatású antibiotikumok iránt, a módszer első lépésének alkalmazásával.
A találmány szerinti megoldás további megvalósítási módjai esetén szükségtelen izolált vagy tiszta baktériumtenyészetek alkalmazása. A találmány közelebbről olyan módszert biztosít valamely baktérium antibiotikum vagy biosztatikus szer iránti érzékenységének kimutatására, melynek *·*·· · ·· · • »<·'' ·*· lépései a következők:
a) a szóbanforgó baktérium tenyészetéből négy mintát veszünk, melyek közül az elsőt kontroll körülmények között inkubáljuk, a másodikat az adott antibiotikum jelenlétében, a harmadikat a célbaktériumot specifikusan lizáló bakteriofág jelenlétében, a negyediket pedig a bakteriofág és az antibiotikum együttes jelenlétében;
b) az inkubálás után az egyes minták adenilát-kináz aktivitását meghatározzuk, és
c) az adenilát-kináz aktivitási eredmények, valamint az antibiotikum vagy biosztatikus szer hatásmechanizmusa alapján meghatározzuk a szóbanforgó baktérium érzékenységét, illetve rezisztenciáját.
Mivel az antibiotikus hatás eléréséhez aktívan növekedő baktériumtenyészetre van szükség, a tenyésztés kezdeti, dúsítási lépése során szelektív tápközeget használhatunk. Ez a lépés mintegy egyórás inkubálást jelenthet. A dúsítás után, kívánt esetben a célsejtek immunbefogásos technika alkalmazásával, friss szelektív táptalajban koncentrálhatok. Az antibiotikum célsejtekhez történő hozzáadásának hatása a bakteriofággal előidézett lízis és az adenilát-kináz aktivitás mérésének kombinációjával értékelhető.
Annak érdekében, hogy a bakteriofág szaporodni tudjon, a gazdasejteknek az exponenciális növekedési fázisban kell lenniük. Amennyiben a növekedés gátolt, például egy antibiotikum jelenlétének köszönhetően, úgy a fág nem lesz képes szaporodni, és ezáltal nem lesz képes előidézni a gazdasejt lízisét. Az adenilát-kináz mérést bakteriofággal kombinálva a baktériumok antibiotikum-érzékenysége 3 óra alatt meghatározható. Ezt megelőzően további idő szükséges az antibiotikum expozícióhoz, illetve a fágfertőzéshez szükséges, egészséges és növekedésben lévő sejtek előállításához. A vizsgált antibiotikum hatásmechanizmusától függően a vizsgálat kétféle típusú eredményt adhat.
A kapott eredményeket a 4. ábra foglalja össze, melyben a jel olyan eredményt jelent, mely csak az extracelluláris adenilát-kináz aktivitásnak felel meg, a + jel mérsékelten pozitív, a növekedést nem mutató mintában mérhető intra- és extracelluláris adenilát-kináz aktivitásnak felel meg, a ++ jel pedig a növekedésben lévő és lizáló tenyészetre jellemző, megemelkedett szintű adenilát-kináz aktivitásra utal.
A 4. ábra alapján nyilvánvaló, hogy a tesztsorozattal kapott mintázat lehetővé teszi az érzékeny, illetve a rezisztens baktériumok egyértelmű megkülönböztetését, feltéve, hogy a vizsgált (lítikus vagy nem lítikus hatású) vegyület hatásmechanizmusával tisztában vagyunk. A különböző jelenségek a különféle reagensek és a baktériumok kölcsönhatásának eredményeként jönnek létre, amint azt a későbbi példákban részletesebben ismertetjük.
Úgy találtuk, hogy a tenyészet extracelluláris adenilát-kináz aktivitásának és összes (extracelluláris + intracelluláris) adenilát-kináz aktivitásának összehasonlítása az adott tenyészet növekedési és fiziológiai állapotát jellemző információt szolgáltat.
Ennek megfelelően a találmány szerinti megoldás egy további megvalósítási módja egy baktériumtenyészetek: növekedési fázisának meghatározására alkalmas módszer, amelynek lépései a következők:
a) a szóbanforgó baktériumtenyészet egyik mintáját lítikus reagenssel kezelve a sejtek lízisét idézzük elő;
b) a kezelt mintában, illetve egy kezeletlen másik mintában megmérjük az adenilát-kináz aktivitást, és
c) a két mérés eredményét összehasonlítva meghatározzuk a tenyészet növekedési fázisát.
Az egészséges, exponenciális növekedési fázisban lévő tenyészetek extracelluláris adenilát-kináz aktivitása viszonylag alacsony (az összes adenilát-kináz aktivitásnak mintegy 1 százaléka), és ez a szint nagyjából állandó marad az exponenciális növekedés ideje alatt, majd a stacioner fázisban növekszik. A stacioner növekedési fázisban lévő tenyészetek esetében az összes adenilát-kináz aktivitásnak mintegy harmada mérhető a tápközegben. Mindezek alapján azadenílát kinaz aktivitás mérésévé! mind a sejtek fiziológiai állapota, mind pedig számuk gyorsan meghatározható.
Ez a módszer felhasználható például annak igazolására, hogy egy adott tenyészet jól növekszik, például olyan esetben, ahol optimális növekedés szükséges, így például fermentációs vagy egyéb eljárások során, melyeknél bakteriális termékekre van szükség. Más esetben arra lehet igény, hogy a sejtek erőteljes növekedését igazoljuk, midőn antibiotikumokra vagy bakteriosztatikus szerekre szkrínelünk, hogy elkerülhessük a szűrővizsgálat során a gyenge növekedést mutató vagy éppen stacioner növekedési fázisban lévő tenyészetek esetén kapható hamis pozitív eredményeket. A módszer arra is alkalmas, hogy kimutassa a környezeti tényezők (pl. hőmérséklet vagy tápközeg) hatását egy adott tenyészet növekedésére .
A felsorolt valamennyi esetben az adenilát-kináz aktivitás mérése kivitelezhető a tenyészetből történő mintavétellel és az adenilát-kináz aktivitás mérésével, amelyet például a PCT/GB94/00118 vagy a PCT/GB94/01513 számú iratokban ismertetett módon végezhetünk.
A találmány tárgykörébe tartoznak a találmány szerinti eljárás kivitelezésére alkalmas tesztkészletek is. Ezek a tesztkészletek olyan kompomemseket tartalmaznak, melyek segítségével az adott vizsgálat eredményesen elvégezhető. Az antibiotikum-érzékenység vizsgálatához például a tesztkészlet egy sor antibiotikumot tartalmazhat, például liofilizált vagy más módon konzervált alakban. A készlet részét képezhetik az adenilát-kináz extrakciójára szolgáló reagensek, így például detergensek vagy más lítikus vegyszerek, továbbá az adenilátkináz kimutatására alkalmas reagensek, mint például a luci— ferin/luciferáz stb. Ezen túlmenően, ha a vizsgálandó tenyészetek kevert baktériumtenyészetek, a készlet tartalmazhat alkalmas bakteriofágokat, ugyancsak konzervált állapotban, így például liofilizálva. A készlet tartalmazhat továbbá szelektív tápközeget is. A szóbanforgó reagensek megfelelő reakcióedényben, így például sokmélyedéses mikrotiter lemezben forgalmazhatók.
A találmány lényegét közelebbről a következő példákkal, és ábrákkal szemléltetjük, mely utóbbiak az alábbiakat tar talmazzák.
1. ábra: az Escherichia coli sejtek adenilát-kináz aktivitásának mérésére végzett kísérletek adatait tartalmazó diagram;
2. ábra: a mágneses tulajdonságú gyöngyökön immunbefogásos technika alkalmazásával, Salmonella typhimurium sejtek tiszta tenyészetében, illetve 3,5xl05 Bacillus subtilis var. niger vegetatív sejtek jelenlétében végzett meghatározás eredményeinek diagramja, melyen mutatja a gyöngyökön megkötött sejtek adenilát-kináz aktivitásának értékeit, és □ mutatja a mintában maradt sejtek adenilát-kináz aktivitásának értékéit (azaz a baloldali diagramon a Salmonella sejtek, a jobboldali diagramon pedig ezek és a nemspecifikus sejtek együttes adatai láthatók);
3. ábra: az Escherichia coli sejtekből fággal felszabadított adenilát-kináz aktivitás időbeli alakulására végzett kísérlet adatait tartalmazó diagram;
4. ábra: a találmány szerinti antibiotikumteszt kivitelezése során kapható eredmények összefoglaló diagramja;
5. ábra: a baktérium minták antibiotikum rezisztenciájának meghatározására alkalmas mikrotiter lemez vázlata;
6. ábra: diagram, mely a 10359 jelű fág és 50 mg/1 ampicillin hatását mutatja ampicillin rezisztens, illetve ampicillin szenzitív E. coli 10243 tenyészetre, és amelyen 0 jelzi a szenzitív E. coli 10243 törzzsel ampicillin és a 10359 fág jelenlétében kapott értékeket, V jelzi a lítikus ágens távollétében kapott értékeket, □ pedig a rezisztens E. coli 10243 törzzsel ampicillin és a fág jelenlétében kapott értékeket; és
7. ábra: diagram, mely a 10359 jelű fág és 34 mg/l kioramfeniko1 hatását mutatja E. coli 10243 tenyészetre, és amelyen 0 jelzi a csupán fág hozzáadásával kapott értékeket, V jelzi a 10359 fág és kloramfenikol jelenlétében kapott értékeket, □ jelzi a csupán kloramfenikol hozzáadásával kapott értékeket, és 0 jelzi a fág- és kloramfenikol-mentes kontrollal kapott értékeket.
1. példa
Baktériumtenyészet extracelluláris és összes adenilát-kináz aktivitásának összehasonlítása
A találmány szerinti tesztmódszernek megfelelően a baktériumsejtek egy mintáját két részre osztjuk. Az első mintát magnéziumionok jelenlétében ADP és detergens tartalmú oldattal elegyítjük. Ezzel a megoldással a mintában lévő sejtekből extraháljuk az adenilát-kinázt, lehetővé téve ezáltal az ATP keletkezéséhez vezető reakciót. A reakciót a szükséges ideig, pl. 5 percig folytatjuk, majd biolumineszcenciás reagenst adunk az elegyhez, és a kibocsátott fény intenzitását luminométerrel megmérjük. Az így elvégzett meghatározás a minta összes (extracelluláris + intracelluláris) adenilátkináz aktivitására vonatkozó információt szolgáltat.
A másik mintával ugyanígy járunk el, de nem használunk detergenst, miáltal csupán az extracelluláris adenilát-kináz aktivitást mérjük.
η-::·:::· f λ
2. példa
Immunbefogásos technika alkalmazása a célsejtek kevert tenyészetből történő elválasztására
Immunbefogásos technikával végezzük el az adenilátkináz aktivitás meghatározását, Salmonella typhimurium tiszta tenyészetéből vett mintában, illetve 3,5x10s Bacillus subtilis var. niger (BG) vegetatív sejtet is tartalmazó tenyészetből vett mintában. Az immunbefogásos módszert 300 μΐ teljes térfogatban hajtjuk végre. Az immunbefogásos lépés, melynek során S. typhlmurium specifikus antitestekkel bevont mágneses tulajdonságú mikrogyöngyöket használunk, 10 percig tart. A gyöngyöket ezután elválasztjuk, a nem kötött részecskék eltávolítására mossuk, majd nem-specifikus lízist hajtunk végre a megkötött anyagban lévő adenilát-kináz felszabadítására. Az adenilát-kináz aktivitást 5 perces méréssel meghatározzuk.
Az így kapott eredményeket a 2. ábra mutatja. A diagramon látható, hogy ezzel a módszerrel a tenyészetben lévő célsejtek kb. 70 százaléka szelektíven kinyerhető, és a kinyerés hatásfoka lényegében független a szennyező mikrobák (BG sejtek) jelenlététől.
3. példa
Fág segítségével végzett lízis alkalmazása
Megvizsgáltuk az adenilát-kináz felszabadulását Escherichia .'coli sejtek tenyészetében, midőn a sejtek egy részét E. coli specifikus bakteriofággal fertőztük. Az E. coli specifikus fággal fertőzött tenyészetéből időközönként 100 pl térfogatú (350 sejtet tartalmazó) mintákat vettünk, és 17 : “7 ·:
:·:· :7· 77 7.
perc múlva meghatároztuk bennük az extracelluláris adenilát-kináz aktivitást. A kapott eredmények a 3. ábrán láthatók, ahol 0 jelzi a fertőzött, · pedig a kontroll tenyészetben mért értékeket.
Fentiek alapján nyilvánvaló, hogy a módszer alkalmazása révén 500-nál kevesebb sejt is kimutatható.
4. példa
Antibiotikum-érzékenység kimutatása litikus hatású antibiotikum esetében
A tiszta vagy kevert tenyészetből származó minta sejtjeit két részre osztjuk, és ezek egyikét bakteriofággal fertőzzük. Mindkét így kapott frakciót további két részre osztjuk, melyek egyikéhez antibiotikumot adunk, a másikat pedig kezeletlenül marad. Meghatározott idő után mért adenilátkináz aktivitások relatív értéke megmutatja az antibiotikum, illetve a bakteriofág célsejtekre gyakorolt hatását. A vizsgálat során kapott értékeket az 1. táblázat tartalmazza.
Az eredmények tükrözik a sejteket antibiotikum rezisztencia állapotát, és a kontrollok viselkedését, bizinyítva ezáltal, hogy a tesztmódszer helyesen működik.
Érzékeny baktérium
1. táblázat
| (1) Antibiotikum nélkül, fág | (2) Antibiotikummal, fág nélkül Adenilát-kináz felszabadulás az antibiotikum által előidézett lizis hatására. |
| nélkül Alacsony szintű extracelluláris adenilátkináz aktivitás (nincs lizis). | |
| (3) Antibiotikum nélkül, tággal Adenilát-kináz felszabadulás a fág által előidézett lizis hatására. | (4) Antibiotikummal és tággal Adenilát-kináz felszabadulás az antibiotikum és a fág által előidézett lizis hatására. Az aktivitás szintje alacsonyabb, mint (3) esetében, mivel a sejtnövekedés csökkent mértékű, és így a fág szaporodása gátolt. |
Rezisztens baktérium
| (1) Antibiotikum nélkül, fág nélkül Alacsony szintű extracelluláris adenilátkináz aktivitás (nincs lizis). | (2) Antibiotikummal, fág nélkül Alacsony szintű extracelluláris adenilátkináz aktivitás (nincs lizis). Ugyanaz, mint (1) esetében. |
| (3) Antibiotikum nélkül, fággal Adenilát-kináz felszabadulás a fág által előidézett lizis hatására. | (4) Antibiotikummal és fággal Adenilát-kináz felszabadulás a fág által előidézett lizis hatására. Ugyanaz, mint (3). |
:·:· ü? :* d.
5. példa
Antibiotikum-érzékenység kimutatása nem lítikus hatású antibiotikum vagy biosztatikus szer esetében
A baktériumok olyan antibiotikumok (és egyéb, a baktérium sejtek növekedését akadályozó vegyületek, így biosztatikus szerek) iránti érzékenysége is gyorsan kimutatható a találmány szerinti tesztmódszer alkalmazásával, amelyek nem a sejtek lízisét idézik elő, hanem más módon gátolják a sejtek növekedését.
A kevert tenyészetben lévő baktériumok nem lítikus hatású antibiotikumok iránti érzékenységének kimutatása ugyanúgy történik, mint a lítikus hatású antibiotikumok Iránti érzékenységé. Mivel azonban a bakteriofágfertőzéshez aktív növekedésben lévő tenyészetre van szükség, az antibiotikum iránti érzékenységet a fág által előidézett lízis elmaradása jelzi a kezelt mintában.
A kísérlet során kapható eredményeket a 2. táblázatban foglaljuk össze.
2. táblázat
Érzékeny baktérium
| (1) Antibiotikum nélkül, fág | (2) (2) Antibiotikummal, fág nélkül |
| nélkül | |
| Alacsony szintű | Alacsony szintű |
| extracelluláris adenilát- | extracelluláris adenilát- |
| kináz aktivitás (nincs | kináz aktivitás (nincs |
| lizis) . | lizis). Az aktivitás szintje a növekedés gátlása miatt akár alacsonyabb is lehet, mint (1) esetében. |
| (3) Antibiotikum nélkül, | (4) Antibiotikummal és |
| fággal | fággal |
| Adenilát-kináz felszabadulás | Alacsony szintű |
| a fág által előidézett lizis | extracelluláris adenilát- |
| hatására. | kináz aktivitás (nincs lizis). Az aktivitás szintje a növekedés gátlása miatt akár alacsonyabb is lehet, mint (1) esetében. |
Rezisztens baktérium
| (1) Antibiotikum nélkül, fág nélkül Alacsony szintű extracelluláris adenilátkináz aktivitás (nincs lizis). | (2) (2) Antibiotikummal, fág |
| nélkül Alacsony szintű extracelluláris adenilátkináz aktivitás (nincs lizis). Ugyanaz, mint (1) esetében. | |
| (3) Antibiotikum nélkül, | (4) (4) Antibiotikummal és |
| fággal Adenilát-kináz felszabadulás a fág által.előidézett lizis hatására. | fággal Adenilát-kináz felszabadulás a fág által előidézett lizis hatására. Ugyanaz, mint (3). |
:·:·:* ·»·
6. példa
Tesztkészlet antibiotikum-rezisztencia kimutatására
A teszt kivitelezésére alkalmas készlet lényegében egy műanyag mintatartó, melyen mélyedések vannak kialakítva, amint az 5. ábrán látható. Az egyes mélyedések körülbelül 0,5 ^1 folyadék befogadására alkalmas térfogatinak. A mintatartót megfelelően előkészítjük, oly módon, hogy bizonyos mélyedések liofolizált (vagy más módon konzervált) antibiotikum készítményt és/vagy bakteriofágot, valamint adott esetben szelektív tápközeget tartalmazzanak.
Az 5. ábrán látható mintatartó lemez minden sorában négy mélyedés van egy adott antibiotikum iránti rezisztencia kimutatására, így a lemez használatával egyidejűleg 3 antibiotikum tesztelhető.
A készlet felhasználása során 0,2 ml térfogatú mintát tiszta tenyészetet, immunbefogással dúsított készítményt, szelektív tápközeg alkalmazásával készített tenyészetet vagy más alkalmas vizsgálati anyagot - mérünk az egyes mélyedésekbe. Inkubálást (pl. 37°c, egy óra) követően hozzáadjuk az adenilát—kináz aktivitás mérésére szolgáló reagenseket. Ezek olyen reagensek lehetnek, amelyek adenilát-kináz jelenlétében kolorimetriás vagy - előnyösebben - biolumineszcenciás jelet adnak.
Közelebbről ADP és magnéziumionok, majd 5 perccel ezt követően luciferin és luciferáz hozzáadására kerülhet sor. A fénykibocsátás mérése történhet például mélyedésenként oly módon, hogy a mélyedések tartalmát kémcsőbe töltjük, és a mérést kémcsöves luminométerben végezzük el, de ennél előnyö :·:· ·*.
sebb, ha automatikus luminometriás lemezleolvasót vagy CCD kamerás képi megjelenítő módszert alkalmazunk.
7. példa
Litikus es nem-lítikus hatású antibiotikumok növekedésre gyakorolt hatásának összehasonlítása
Megvizsgáltuk a litikus (ampicillin) és nem-lítikus (kloramfenikol) hatású antibiotikumok E. coli tenyészet növekedésére gyakorolt hatását.
Ampicillin rezisztenciát kódoló plazmidot (pUC18) juttattunk E. coli 10243 tiszta tenyészetébe, hogy antibiotikum rezisztenciát idézzünk elő, a fág gazdaspecifitásának megváltoztatása nélkül. A rezisztens törzset teszteltük annak igazolására, hogy a plazmid jelenléte nem változtatta meg növekedési jellemzőit, és a 10359 fág fertőzőképességét. Az eredmények azt mutatták, hogy a növekedési és fágfertőzési tulajdonságok megegyeznek az antibiotikum érzékeny törzs esetében megfigyelhetőkkel.
A kísérlet során összehasonlítottuk az érzékeny (nem transzformált) és a rezisztens baktériumokból E. coli 10359 bakteriofág jelenlétében, litikus (ampicillin), illetve nemlítikus (kloramfenikol) hatású antibiotikum hatására felszabaduló adenilát-kináz aktivitását.
Az E. coli 10243 baktérium érzékeny, illetve rezisztens törzseinek exponenciális növekedési fázisban lévő tenyészeueit To időpontban 10 számú, 10359 jelű fággal fertőztük, és T5 időpontban 50 pg/ml ampicillint adtunk hozzájuk. Az ampicillin hatására bekövetkező sejtlízis Tio időpontra nyilvánvaló, T20 időpontra pedig jelentős lett az érzékeny törzs • · «·· ··· · · -:· ·♦.· ..·* . ·*.
esetében, és elfedte a bakteriofág lítikus hatását. A rezisztens törzset az antibiotikum nem befolyásolta, de a fágfertőzésnek köszönhetően 20 perc elteltével lízis mutatkozott, ami azonban nem volt jelentős mértékű T40 időpontig. A kapott eredményeket a 6. ábra mutatja. Mindezek alapján egy E. coli 10243 tenyészet ampicillin iránti érzékenységének kimutatására ampicillin és fág jelenlétében csak 40 perc elteltével van mód.
Exponenciális növekedési fázisban lévő E. coli 10243 tenyészetet 80 percen át inkubáltunk 10359 jelű fág és/vagy kloramfenikol (34 pg/ml) jelenlétében, majd a korábbiak szerint meghatároztuk az adenilát-kináz aktivitást. A kapott eredményeket a 7. ábra mutatja.
Nagyobb mértékű sejtlizis volt megfigyelhető a bakteriofággal és kloramfenikollal együttesen végzett inkubálás esetén, mint csupán kloramfenikol jelenlétében. Jóllehet a kloramfeniko1 nem lítikus hatasu antibiotikum, az inkubálás során mégis megfigyelhető volt bizonyos mértékű sejtlizis, ami vélhetőleg a sejtpusztulás következménye. A fág által előidézett lízis mértéke határozottabban kisebb volt az antibiotikumot is tartalmazó tenyészetekben, mivel ezekben a baktérium nem tudott megfelelőképpen növekedni, és ez megakadályozta a fág szaporodási ciklusának teljes lezajlását.
Az ampicillin-rezisztens mutánssal végzett kísérlet eredményeinek tükrében az lenne várható, hogy egy kloramfenikol-rezisztens mutáns ugyanúgy viselkedne az antibiotikum jelenlétében, illetve távollétében. Ebben az esetben 60 perc inkubálasi idő után a háttér lumineszcencia emelkedésének
Claims (34)
- mértéke szolgáltathat információt arra vonatkozóan, hogy az adott tenyészet érzékeny-e a kloramfenikolra.Szabadalmi igénypontok1. Adenilát-kináz kimutatási módszer alkalmazása ín vitro tesztben a környezeti tényezők baktériumsejtek növekedési jellemzőit befolyásoló hatásának vizsgálatára.
- 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amelynek során baktériumok antibiotikumok vagy biosztatikus szerek iránti érzékenységét határozzuk meg.
- 3. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, amelynek során baktériumok növekedési fázisának megállapítását végezzük.4· Eljárás baktériumok vegyületek iránti érzékenységének meghatározására, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó vegyületet tartalmazó baktériumtenyészet lízise során felszabaduló adenilát-kináz aktivitását megmérjük, és a kapott adatot összehasonlítjuk a vegyület hozzáadása előtti tenyészetben és/vagy a lizált tenyészetben különböző időpontokban és/vagy hasonló, de a szóbanforgó vegyületet nem tartalmazó baktériumtenyészet lizátumában mért értékekkel.
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a baktériumtenyészetet lítikus hatású vegyszerrel kezeljük.25 ; r- ^-· .1ΗΓΟ A θ· igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az adott baktériumra specifikus lizálószert alkalmazunk.
- 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a lizálószerként olyan bakteriofágot alkalmazunk, amely baktérium nemzetségeket, fajokat vagy törzseket specifikusan képes megfertőzni és lizálni.
- 8. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a baktériumok lizisét enzim alkalmazásával idézzük elő.
- 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy enzimként bakteriolizint használunk.
- 10. A3 - 9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a baktériumokat előbb elválasztási lépésnek vetjük alá, melynek során a tenyészetben lévő nem célsejteket lényegében eltávolítjuk.
- 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy elválasztási lépést immunbefogásos technikával végezzük.
- 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó baktériumokat olyan szilárd felületen koncentráljuk, melyen az adott baktériumra specifikus antitesteket vagy azok kötő fragmenseit immobil!záltünk.
- 13. A 4 - 12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyészet előállítását a szóbanforgó baktériumok növekedését támogató, szelektív tápközegben végezzük.
- 14. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy baktériumok litikus hatású antibiotikum iránti érzékenységének meghatározását végezzük a következő lépésekben:i) a szóbanforgó baktériumot elválasztjuk a többi • Il <-·« *·· · c· :mikrobafajtól, célszerűen immunbefogásos technikával;ii) meghatározzuk a szóbanforgó baktérium tenyészetében mérhető extracelluláris adenilát-kináz aktivitást;ül) litikus hatású antibiotikumot adunk a tenyészethez, melyet elegendő ideig inkubálunk ahhoz, hogy az antibiotikum kifejthesse litikus hatását, és iv) a tenyészetben mérhető extracelluláris adenilátkináz aktivitás meghatározásával igazoljuk, hogy a lizis megtörtént.
- 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépés során a baktériumok elválasztását immunbefogásos technikával végezzük.
- 16. A 14. vagy 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó baktériumtenyészet előállítását a célbaktérium növekedését támogató, szelektív tápközegben végezzük.
- 17. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy baktériumok nem-lítikus hatású antibiotikum vagy biosztatikus szer iránti érzékenységének meghatározását végezzük a következő lépésekben:i) a szóbanforgó baktériumot elválasztjuk a többi mikrobafaj tói;ii) a szóbanforgó baktérium tenyészetét a nem-lítikus hatású antibiotikum vagy biosztatikus szer jelenlétében inkubáljuk; 1 iii) megvizsgáljuk, hogy a tenyészetben mérhető összes adenilát-kináz aktivitás az inkubálás során növekvő vagy csökkenő tendenciát mutat, oly módon, hogy időközönként min tát veszünk, a mintában lévő baktériumsejteket lizáljuk, és meghatározzuk az így előkészített minták adenilát-kináz aktivitását .
- 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a baktériumok tenyészetét lítikus hatású vegyszerrel kezeljük.19· A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (i) lépés során a baktériumok elválasztását immunbefogásos technikával végezzük.
- 20. A 17 - 19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó baktériumtenyészet előállítását a célbaktérium növekedését támogató, szelektív tápközegben végezzük.
- 21. Eljárás baktériumok antibiotikum vagy biosztatikus szer iránti érzékenységének meghatározására, azzal jellemezve, hogya) a szóbanforgó baktérium tenyészetéből négy mintát veszünk, melyek közül az elsőt kontroll körülmények között inkubáljuk, a másodikat az adott antibiotikum jelenlétében inkubáljuk, a harmadikat a célbaktériumot specifikusan lizáló bakteriofág jelenlétében inkubáljuk, a negyediket pedig a bakteriofág és az antibiotikum együttes jelenlétében inku— báljuk;b) az inkubálás után az egyes minták adenilát-kináz aktivitását meghatározzuk, ésc) az adenilát-kináz aktivitási eredmények, valamint az antibiotikum vagy biosztatikus szer hatásmechanizmusa alapján meghatározzuk a szóbanforgó baktérium érzékenységét vagy ··:· ·..·... .· .:. rezisztenciáját.
- 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (c) lépésben kapott eredményeket a 4. ábrában megadott eredményekkel összehasonlítva határozzuk meg, hogy a baktérium rezisztens vagy érzékeny az adott antibiotikumra vagy biosztatikus hatású szerre.
- 23. A 21. vagy 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyészetben a szóbanforgó baktérium koncentrációját az (a) lépést megelőzően immunbefogásos technikával megnöveljük.
- 24. A 21 - 23. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szóbanforgó baktériumtenyészet előállítását a célbaktérium növekedését a többi mikrobafajhoz képest szelektíven támogató tápközegben végezzük.
- 25. Eljárás baktériumtenyészet növekedési fázisának meghatározására, azzal jellemezve, hogya) a szóbanforgó baktériumtenyészet egyik mintáját lítikus reagenssel kezelve a sejtek lízisét idézzük elő,b) a kezelt mintában megmérjük az adenilát-kináz aktivitást,c) egy kezeletlen másik mintában megmérjük az adenilátkináz aktivitást, ésd) a két mérés eredményét összehasonlítva meghatározzuk a tenyészet növekedési fázisát.
- 26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy amennyiben (c) lépésben kapott eredmények azt mutatják, hogy a második mintában mért adenilát-kináz aktivitás az első mintában mért érték 1 százalékának nagyságrendjébe esik, úgv ····· · ·« f • ♦ · · · · · ·*· az egészséges, exponenciális növekedési fázisban lévő tenyészetet jelez, az 1 százalékot meghaladó érték pedig a stacioner növekedési fázisba való átmenetre utal.
- 27. A 25. vagy 26. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy lítikus reagensként valamely detergenst, vagy a bakteriális célsejteket specifikusan lizálni képes bakteriofágot használunk.
- 28. Tesztkészlet baktériumok antibiotikum érzékenységének vizsgálatára, mely egy vagy több antibiotikumot és az adenilát-kináz aktivitás méréséhez szükséges egy vagy több reagenst tartalmaz.
- 29. A 28. igénypont szerinti tesztkészlet, amely az adenilát-kináz aktivitás méréséhez szükséges reagensként ADPt, magnéziumionokat, luciferint és luciferázt tartalmaz.
- 30. A 28. vagy 29. igénypont szerinti tesztkészlet, amely az antibiotikumokat liofilizált állapotban tartalmazza.
- 31. A 28 - 30. igénypontok bármelyike szerinti tesztkészlet, amely lítikus reagenst is tartalmaz.
- 32. A 31. igénypont szerinti tesztkészlet, amely lítikus reagensként egy vegyszert tartalmaz.
- 33. A 31. igénypont szerinti tesztkészlet, amely lítikus reagensként a bakteriális célsejteket specifikusan lizálni képes bakteriofágot tartalmaz.
- 34. A 28 - 30. igénypontok bármelyike szerinti tesztkészlet, amely megjelenési formája többmélyedéses lemez.
- 35. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az lényegében a példákban ismerteti módon történik.
- 36. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kivitelezése lényegében a példákban ismerteit módon történik.*
- 37. Tesztkészlet, melynek kialakítása lényegében a 6. > példa szerinti.A meghatalmazott:DANIIT’?ASzabadalmi c; V; ; - .yDr.Gárdí>nyí 77
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9801126.5A GB9801126D0 (en) | 1998-01-21 | 1998-01-21 | Antibiotic sensitivity testing |
| GBGB9816993.1A GB9816993D0 (en) | 1998-01-21 | 1998-08-06 | Antibiotic sensitivity testing |
| PCT/GB1999/000089 WO1999037799A1 (en) | 1998-01-21 | 1999-01-12 | Antibiotic sensitivity testing |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0101276A2 true HUP0101276A2 (hu) | 2001-08-28 |
| HUP0101276A3 HUP0101276A3 (en) | 2006-03-28 |
Family
ID=26312981
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0101276A HUP0101276A3 (en) | 1998-01-21 | 1999-01-12 | Antibiotic sensitivity testing |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6861230B1 (hu) |
| EP (1) | EP1049798B1 (hu) |
| JP (1) | JP2002500892A (hu) |
| CN (1) | CN1152963C (hu) |
| AT (1) | ATE330025T1 (hu) |
| AU (1) | AU751388C (hu) |
| BR (1) | BR9907161A (hu) |
| CA (1) | CA2318367C (hu) |
| DE (1) | DE69931892T2 (hu) |
| DK (1) | DK1049798T3 (hu) |
| ES (1) | ES2262308T3 (hu) |
| GB (1) | GB2348702B (hu) |
| HU (1) | HUP0101276A3 (hu) |
| NO (1) | NO20003708L (hu) |
| NZ (1) | NZ505847A (hu) |
| WO (1) | WO1999037799A1 (hu) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9911095D0 (en) | 1999-05-13 | 1999-07-14 | Secr Defence | Microbiological test method and reagents |
| GB0030727D0 (en) | 2000-12-15 | 2001-01-31 | Lumitech Uk Ltd | Methods and kits for detecting kinase activity |
| GB0122790D0 (en) * | 2001-09-21 | 2001-11-14 | Secr Defence | Method of determining the presence of target bacteria |
| GB0308199D0 (en) * | 2003-04-09 | 2003-05-14 | Acolyte Biomedica Ltd | Combined microbiology system |
| GB2400659B8 (en) | 2003-04-17 | 2007-07-09 | Cambrex Bio Science Nottingham | Assay methods and materials |
| CA2956645A1 (en) | 2003-07-12 | 2005-03-31 | David A. Goldberg | Sensitive and rapid biodetection |
| US20120077206A1 (en) | 2003-07-12 | 2012-03-29 | Accelr8 Technology Corporation | Rapid Microbial Detection and Antimicrobial Susceptibility Testing |
| EP2570130B1 (en) | 2003-07-23 | 2014-11-26 | Biocontrol Limited | Therapeutic agents containing bacteriophages against P. aeruginosa |
| GB0324650D0 (en) * | 2003-10-22 | 2003-11-26 | Acolyte Biomedica Ltd | Using nucleic acids for clinical microbiology testing |
| US20060014136A1 (en) * | 2004-07-14 | 2006-01-19 | Inimex Pharmaceuticals, Inc. | Method of screening for protection from microbial infection |
| WO2006050193A2 (en) * | 2004-11-01 | 2006-05-11 | Strategic Diagnostics, Inc. | Bacteriophages as selective agents |
| WO2006066216A2 (en) * | 2004-12-16 | 2006-06-22 | Accelr8 Technology Corporation | Rapid microbial detection and antimicrobial susceptibility testing |
| GB2432660A (en) | 2005-11-29 | 2007-05-30 | Bacterioscan Ltd | System for counting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics |
| US20080220465A1 (en) * | 2007-03-05 | 2008-09-11 | Pocared Diagnostics, Inc. | Antibiotic Sensitivity Testing Method |
| GB0704553D0 (en) * | 2007-03-09 | 2007-04-18 | Harper David R | Beneficial effects of bacteriophage treatments |
| US8455186B2 (en) * | 2007-06-15 | 2013-06-04 | MicroPhage™ Incorporated | Method of detection of microorganisms with enhanced bacteriophage amplification |
| WO2011084882A2 (en) | 2010-01-05 | 2011-07-14 | Contrafect Corporation | Methods and compositions for enhanced immunological therapy and targeting of gram-positive bacteria |
| ES2551922T3 (es) | 2011-03-07 | 2015-11-24 | Accelerate Diagnostics, Inc. | Sistemas rápidos de purificación celular |
| US10254204B2 (en) | 2011-03-07 | 2019-04-09 | Accelerate Diagnostics, Inc. | Membrane-assisted purification |
| US9677109B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-06-13 | Accelerate Diagnostics, Inc. | Rapid determination of microbial growth and antimicrobial susceptibility |
| JP6914037B2 (ja) * | 2013-07-03 | 2021-08-04 | クヴェッラ コーポレーション | 標的抗生物質の感受性試験方法 |
| EP2821499B1 (en) | 2013-07-04 | 2017-02-15 | ABM Technologies, LLC | Method for the rapid determination of susceptibility or resistance of bacteria to antibiotics |
| JP2016540237A (ja) | 2013-12-06 | 2016-12-22 | バクテリオスキャン エルティーディー | 自由表面を有する液体の光学測定 |
| CN106062531B (zh) | 2013-12-06 | 2019-03-08 | 百克特瑞欧扫描有限责任公司 | 用于对液体样品内粒子的特性进行光学测量的试管组件 |
| US10233481B2 (en) | 2014-12-05 | 2019-03-19 | Bacterioscan Ltd | Multi-sample laser-scatter measurement instrument with incubation feature and systems for using the same |
| US20160161404A1 (en) | 2014-12-05 | 2016-06-09 | Bacterioscan Ltd | System Using Laser-Scatter Measurement Instrument For Organism Identification And Related Network |
| US10065184B2 (en) | 2014-12-30 | 2018-09-04 | Bacterioscan Ltd. | Pipette having integrated filtration assembly |
| EP3048174B1 (en) * | 2015-01-21 | 2018-11-07 | ABM Technologies, LLC | Procedure for the rapid determination of bacterial susceptibility to antibiotics that inhibit protein synthesis |
| CN107209115A (zh) | 2015-01-26 | 2017-09-26 | 百克特瑞欧扫描有限责任公司 | 具有转盘式流体样品装置的激光散射测量仪器 |
| WO2016161022A2 (en) | 2015-03-30 | 2016-10-06 | Accerlate Diagnostics, Inc. | Instrument and system for rapid microorganism identification and antimicrobial agent susceptibility testing |
| US10253355B2 (en) | 2015-03-30 | 2019-04-09 | Accelerate Diagnostics, Inc. | Instrument and system for rapid microorganism identification and antimicrobial agent susceptibility testing |
| WO2019010447A1 (en) | 2017-07-07 | 2019-01-10 | Epicentrx, Inc. | COMPOSITIONS FOR PARENTERAL ADMINISTRATION OF THERAPEUTIC AGENTS |
| US11099121B2 (en) | 2019-02-05 | 2021-08-24 | BacterioScan Inc. | Cuvette device for determining antibacterial susceptibility |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3933592A (en) * | 1965-02-17 | 1976-01-20 | Hazleton Laboratories, Incorporated | Method of detecting living microorganisms |
| JPH04370100A (ja) | 1991-06-19 | 1992-12-22 | Mercian Corp | 微生物の薬剤感受性試験法 |
| GB9220027D0 (en) * | 1992-09-22 | 1992-11-04 | Mini Agriculture & Fisheries | Method and kits for detection of bacteria |
| GB9301118D0 (en) | 1993-01-21 | 1993-03-10 | Secr Defence | Enzyme linked assays |
| US5648232A (en) * | 1993-01-21 | 1997-07-15 | The Secretary Of State For Defence In Her Britannic Majesty's Government Of The United Kingdom Of Great Britain And Northern Ireland | Microbiological best method and reagents |
| DE69414577T2 (de) * | 1993-07-12 | 1999-06-24 | Procter & Gamble | Starkschaumende shampoos mit haarkonditionnierenden eigenschaften |
| CA2194457C (en) * | 1994-07-13 | 2009-05-12 | David James Squirrell | Microbiological test method and reagents |
| GB9414096D0 (en) * | 1994-07-13 | 1994-08-31 | Secr Defence | Labelled capture assay |
-
1999
- 1999-01-12 EP EP99901020A patent/EP1049798B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-12 JP JP2000528706A patent/JP2002500892A/ja not_active Ceased
- 1999-01-12 GB GB0017298A patent/GB2348702B/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-01-12 ES ES99901020T patent/ES2262308T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-12 AT AT99901020T patent/ATE330025T1/de active
- 1999-01-12 NZ NZ505847A patent/NZ505847A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-01-12 DE DE69931892T patent/DE69931892T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-12 AU AU20653/99A patent/AU751388C/en not_active Ceased
- 1999-01-12 HU HU0101276A patent/HUP0101276A3/hu unknown
- 1999-01-12 CA CA2318367A patent/CA2318367C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-01-12 CN CNB998042692A patent/CN1152963C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-01-12 US US09/600,398 patent/US6861230B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-01-12 DK DK99901020T patent/DK1049798T3/da active
- 1999-01-12 BR BR9907161-4A patent/BR9907161A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-01-12 WO PCT/GB1999/000089 patent/WO1999037799A1/en active IP Right Grant
-
2000
- 2000-07-19 NO NO20003708A patent/NO20003708L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69931892T2 (de) | 2006-12-21 |
| ATE330025T1 (de) | 2006-07-15 |
| AU751388C (en) | 2004-01-15 |
| WO1999037799A1 (en) | 1999-07-29 |
| GB0017298D0 (en) | 2000-08-30 |
| DE69931892D1 (de) | 2006-07-27 |
| EP1049798A1 (en) | 2000-11-08 |
| DK1049798T3 (da) | 2006-10-09 |
| GB2348702B (en) | 2003-04-02 |
| BR9907161A (pt) | 2000-10-24 |
| EP1049798B1 (en) | 2006-06-14 |
| CA2318367C (en) | 2011-04-26 |
| AU2065399A (en) | 1999-08-09 |
| AU751388B2 (en) | 2002-08-15 |
| ES2262308T3 (es) | 2006-11-16 |
| NZ505847A (en) | 2002-09-27 |
| GB2348702A (en) | 2000-10-11 |
| JP2002500892A (ja) | 2002-01-15 |
| GB2348702A8 (en) | 2001-02-08 |
| NO20003708D0 (no) | 2000-07-19 |
| HUP0101276A3 (en) | 2006-03-28 |
| US6861230B1 (en) | 2005-03-01 |
| CN1152963C (zh) | 2004-06-09 |
| CA2318367A1 (en) | 1999-07-29 |
| CN1294634A (zh) | 2001-05-09 |
| NO20003708L (no) | 2000-09-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUP0101276A2 (hu) | Eljárás és tesztkészlet baktériumok érzékenységének kimutatására | |
| Squirrell et al. | Rapid and specific detection of bacteria using bioluminescence | |
| Westerhausen et al. | A NanoLuc luciferase‐based assay enabling the real‐time analysis of protein secretion and injection by bacterial type III secretion systems | |
| EP0714450B1 (en) | Method and test kits for detection of bacteriophage | |
| CA2869472C (en) | Sample preparation for flow cytometry | |
| JP2002500892A5 (hu) | ||
| AU773714B2 (en) | Cell assay, method and reagents | |
| CA2648359A1 (en) | Method for detecting microorganism | |
| AbdelRahim et al. | Prevalence, plasmids and antibiotic resistance correlation of enteric bacteria in different drinking water resources in sohag, egypt | |
| Zaouri et al. | DNAzyme-based biosensor as a rapid and accurate verification tool to complement simultaneous enzyme-based media for E. coli detection | |
| Blanch et al. | Fast and easy methods for the detection of coliphages | |
| US20110097702A1 (en) | Methods and compositions for in situ detection of microorganisms on a surface | |
| Yan et al. | ATP bioluminescence rapid detection of total viable count in soy sauce | |
| US20050250096A1 (en) | Microorganism detection using bacteriophage amplification | |
| US4774173A (en) | Microbiological assay kit and method for detecting de novo biomolecular synthesis inhibitors | |
| KR100592693B1 (ko) | 항생제 민감성 시험방법 및 시험 키트 | |
| CN110684822A (zh) | 一种基于丙酮酸激酶检测样品中微生物的方法及试剂盒 | |
| JPH11266863A (ja) | 細菌の検出方法 | |
| TRUDIL et al. | ATP SCREENING OF BACTERIA/SPORES IN ENVIRONMENTAL SAMPLES BY FIRST RESPONDERS | |
| FOOTE et al. | Applications of adenylate kinase detection using bioluminescence | |
| RESPONDERS | DP TRUDIL, J TARTAL, C TRUDIL | |
| RESPONDERS | ATP SCREENING OF BACTERIA/SPORES IN ENVIRONMENTAL SAMPLES BY FIRST RESPONDERS DP TRUDIL, J TARTAL, C TRUDIL | |
| Rogers et al. | Identification of bacteria by rapid spectrophotofluorometric methods | |
| GB2348438A (en) | Detecting microbes by bioluminescence |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FA9A | Lapse of provisional patent protection due to relinquishment or protection considered relinquished |