ES2262308T3 - Ensayos de sensibilidad a antibioticos. - Google Patents
Ensayos de sensibilidad a antibioticos.Info
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Abstract
El uso de un ensayo para adenilato quinasa en un ensayo in vitro para el efecto de las condiciones externas sobre las características de crecimiento de células bacterianas, en el que el ensayo es evaluar la etapa de crecimiento de las bacterias mediante la comparación del contenido de adenilato quinasa extracelular de un cultivo celular con el contenido intracelular y extracelular total.
Description
Ensayos de sensibilidad a antibióticos.
La presente invención se refiere a un método
para ensayar las características de crecimiento de bacterias, en
particular a ensayar la sensibilidad a antibióticos o agentes
biostáticos particulares, así como a kits para uso en el
método.
Las bacterias con resistencia a antibióticos se
están convirtiendo en un problema crecientemente grave. El método
actual para determinar las resistencias a antibióticos de una cepa
de bacterias consume mucho tiempo. Requiere primero el aislamiento
del organismo en cultivo puro. Se prepara después un "césped"
de las bacterias y se permite crecer en presencia de un conjunto de
antibióticos. Las zonas de inhibición del crecimiento alrededor de
un antibiótico particular muestran que las bacterias son sensibles
(indicando el tamaño de la zona el grado de sensibilidad). El
crecimiento no inhibido en presencia de un antibiótico indica
resistencia. A este proceso le lleva al menos dos días completarse,
lo que está lejos del ideal, particularmente en una situación
clínica en la que el régimen de tratamiento óptimo de un individuo
afectado puede determinarse como resultado de estos ensayos.
Existe la necesidad de un ensayo que permita una
evaluación relativamente rápida de resistencia o sensibilidad a
antibióticos, por ejemplo en unas pocas horas.
El documento JP 04.370.100 da a conocer un
método para examinar la sensibilidad a fármacos de un microorganismo
que está basado en la determinación de la cantidad de trifosfato de
adenosina en un cultivo que contiene el fármaco. El documento US
3.933.592 da a conocer un método para la selección de un antibiótico
para tratamiento de infección bacteriana que está basado en una
comparación de los resultados de un ensayo de ATP de cultivos que
contienen antibiótico a diversos intervalos temporales.
Los ensayos para la detección de microorganismos
mediante la medida de la adenilato quinasa son conocidos, por
ejemplo, por las solicitudes de patente internacional nº
PCT/GB94/00118 (publicación internacional nº WO 94/17202) y
PCT/GB94/01513 (WO 96/02665).
En particular, el documento WO 94/17202, que
tiene el equivalente US 5.648.232, da a conocer métodos y kits de
ensayo para determinar la presencia y la cantidad de microorganismos
utilizando un ensayo de adenilato quinasa basado en la construcción
de curvas de calibración.
La adenilato quinasa es una enzima esencial en
todas las células vivas que, en presencia de ADP, cataliza la
reacción productora de ATP mostrada a continuación
2 ADP
\longleftrightarrow ATP +
AMP
En este ensayo, el ADP se añade como reactivo a
la muestra bajo ensayo, preferiblemente en presencia de iones
magnesio. El ATP producido como resultado de la reacción de
adenilato quinasa anteriormente citada puede detectarse, por
ejemplo, utilizando bioluminiscencia de luciérnaga. Para esto, se
añaden reactivos tales como la combinación de luciferina/luciferasa
a la mezcla, generalmente después de un corto periodo de incubación,
por ejemplo de aproximadamente 5 minutos, y se monitoriza la señal
luminiscente producida.
La sensibilidad de este ensayo está limitada
sólo por el nivel de fondo de adenilato quinasa y la pureza de los
reactivos utilizados. Por ejemplo, utilizando E. coli como
sistema modelo, se midió la actividad adenilato quinasa de menos de
100 células en un ensayo de incubación de 5 minutos como se ilustra
en la Figura 1 a continuación en la presente memoria. En los
ensayos utilizados para generar esta figura, el volumen de muestra
fue de 200 \mul.
Los solicitantes han encontrado que la adenilato
quinasa puede utilizarse como un marcador sensible de biomasa y que
las técnicas de ensayo anteriormente citadas pueden utilizarse en
estudios que proporcionan una información mucho más detallada
respecto a las características de crecimiento de células
bacterianas.
Por tanto, la invención proporciona el uso de un
ensayo de adenilato quinasa en un ensayo in vitro para el
efecto de las condiciones externas sobre las características de
crecimiento de células bacterianas, en el que el ensayo es evaluar
la etapa de crecimiento de las bacterias por comparación del
contenido de adenilato quinasa extracelular de un cultivo celular
con el contenido intracelular y extracelular total.
El ensayo de adenilato quinasa proporciona un
medio rápido y sensible para investigar muchos aspectos del
crecimiento e inhibición bacterianos. El tipo de condiciones
externas que puede investigarse utilizando la invención es variado.
Por ejemplo, el ensayo de adenilato quinasa puede utilizarse en
métodos para determinar la sensibilidad de una cepa bacteriana o
cultivo mixto particular a antibióticos o reactivos biostáticos
particulares, o los métodos pueden adaptarse para uso en el examen
de reactivos con propiedades antibióticas o biostáticas. Se ha
encontrado también que una comparación del contenido de adenilato
quinasa extracelular de un cultivo celular con el contenido
intracelular y extracelular total es indicativo del estado de
crecimiento y salud del cultivo celular y, por tanto, el ensayo de
adenilato quinasa puede utilizarse para evaluar estos rasgos.
La configuración del ensayo tendrá en cuenta la
naturaleza de las investigaciones que se están emprendiendo, el tipo
de muestras bacterianas disponibles, la naturaleza de las muestras y
reactivos, si los hubiera, que han de ensayarse y, en particular,
si tienen efectos líticos o no líticos sobre las células. Se
describirán con más detalle a continuación en la presente memoria
diversas formas de estos ensayos.
Sin embargo, en particular, la invención
proporciona un método para determinar la sensibilidad de una
bacteria a un material de ensayo, comprendiendo dicho método ensayar
la adenilato quinasa liberada mediante lisis de las bacterias a
partir de un cultivo que contiene dicho reactivo y comparar los
resultados con los obtenidos a partir de un ensayo de adenilato
quinasa similar que es del cultivo antes de la adición del reactivo
y/o de bacterias lisadas a partir del mismo cultivo en un punto
temporal diferente y/o de bacterias lisadas a partir de un cultivo
similar que no contiene el reactivo.
Los reactivos ensayados pueden ser antibióticos
o agentes biostáticos conocidos, o pueden ser nuevos compuestos o
reactivos no conocidos anteriormente como antibióticos, de modo que
el ensayo forma parte de un programa de examen.
Algunos reactivos, por ejemplo antibióticos
tales como antibióticos de \beta-lactama tales
como penicilinas, como ampicilina y amoxicilina, causarán lisis de
bacterias en el cultivo. Sin embargo, cuando esto no ocurra, puede
ser necesario lisar las bacterias antes de efectuar el ensayo. Esto
puede hacerse mediante diversas técnicas como se entiende en la
técnica, incluyendo tratamiento con agentes líticos así como métodos
físicos tales como someter las bacterias a campos magnéticos o
eléctricos, o sonicación.
Los agentes que producen lisis de bacterias
incluyen detergentes y enzimas tales como bacteriolisina. Sin
embargo, estos son no específicos y liberarán AK a partir de todo el
material vivo presente en la muestra. Esto puede ser adecuado cuando
la muestra comprende un cultivo puro. Sin embargo, cuando las
bacterias bajo investigación son un componente de un cultivo mixto,
pueden adoptarse otras estrategias. Las medidas específicas a
partir de células diana en una muestra mixta pueden conseguirse, por
ejemplo, mediante: 1) la captura específica de las células de
interés para separarlas de organismos contaminantes, seguido de
medidas de adenilato quinasa no específica; 2) el uso de un método
que sólo lisa las células diana, así que sólo se mide la adenilato
quinasa de éstas; o 3) una combinación de los mismos.
La adenilato quinasa a partir de sólo las
células bacterianas diana (2 anteriormente) puede liberarse
utilizando un agente lítico que es específico de las bacterias
particulares bajo investigación, por ejemplo, un bacteriófago que
es específico de las bacterias diana y que causa la lisis de esas
bacterias. Estos bacteriófagos son virus que infectan bacterias,
causando la lisis de las células y la liberación de componentes
intracelulares, incluyendo la adenilato quinasa, en el medio
externo. Esta liberación ocurre generalmente aproximadamente 30 a 60
minutos después de la infección. Se ha encontrado que son
detectables menos de 500 células utilizando este método en un
ensayo que lleva 40
minutos.
minutos.
Los fagos pueden infectar células diana
igualmente bien en cultivo puro o mixto. Al comparar la cantidad de
adenilato quinasa que puede extraerse químicamente a partir de una
muestra con la cantidad liberada después de un tiempo fijado con
infección por fago, puede determinarse la presencia o ausencia de
células diana y medirse los efectos del material de ensayo sobre su
crecimiento.
Para que el bacteriófago se reproduzca, y por lo
tanto cause la lisis, la célula huésped debe estar en la fase
logarítmica de crecimiento. Si el crecimiento se inhibe, por
ejemplo, como resultado de la presencia de un agente
bacteriostático o antibiótico, el bacteriófago no será capaz de
crecer y lisar las células. Esto puede utilizarse como base para una
realización adicional de la invención como se ilustra a
continuación.
Como alternativa o adicionalmente, puede
someterse un cultivo mixto a una etapa de pretratamiento en la que
las células bacterianas diana se enriquecen en el cultivo y/o se
separan de él. Dichas etapas son bien conocidas en la técnica. Por
ejemplo, la separación puede efectuarse utilizando técnicas de
inmunocaptura en las que se utilizan anticuerpos o fragmentos de
unión de los mismos que son específicos de bacterias particulares
para inmovilizar esas células sobre una superficie sólida tal como
perlas, placas de microtitulación, membranas de filtro o columnas.
Las perlas magnéticas pueden proporcionar una superficie sólida
particularmente preferida. La separación de las perlas, cuando sea
apropiado utilizando técnicas de separación magnética, conduce a un
aislamiento sustancial de las bacterias diana como se ilustra a
continuación en la presente memoria. Se ha encontrado que,
típicamente, utilizando perlas magnéticas como soporte sólido, puede
conseguirse la detección de menos de 1.000 células con un tiempo
total de ensayo de aproximadamente 30 min. Pueden utilizarse también
otros materiales como soporte sólido.
Puede ganarse especificidad adicional mediante
el uso de medios de crecimiento selectivo. Estos pueden utilizarse
en la etapa de enriquecimiento para establecer un cultivo en
crecimiento sano, antes del ensayo de inmunocaptura o la infección
por un bacteriófago. Adicionalmente, pueden utilizarse medios
selectivos durante el transcurso de la infección por
bacteriófago.
Dichos medios minimizarán el sobrecrecimiento
por organismos no diana que pueden estar presentes, a veces en un
enorme exceso de las bacterias diana.
Como se citó anteriormente, la invención puede
adaptarse para uso en el ensayo de bacterias para sensibilidad a
antibióticos o agentes bacteriostáticos particulares.
Los antibióticos tales como
\beta-lactamas, como penicilinas, funcionan
desestabilizando la síntesis de pared celular, causando así que las
células pierdan integridad y se lisen durante la replicación. Esto
ocurre de forma relativamente rápida, aproximadamente
10-15 minutos después de la exposición al
antibiótico, a condición de que las bacterias estén creciendo
activamente.
Otros antibióticos, tales como cloranfenicol, no
causan lisis celular sino que inhiben el crecimiento celular de
otros modos, como los agentes biostáticos. Se entiende generalmente
el modo de acción de cualquier agente particular en uso. La
invención puede adaptarse para uso en el ensayo la sensibilidad de
bacterias a cualquiera de estos agentes.
Realizaciones específicas de la invención
incluyen un método para determinar la sensibilidad de una bacteria a
un antibiótico lítico, comprendiendo dicho método las etapas de (I)
separar dichas bacterias de otras especies microbianas, por
ejemplo, utilizando una etapa de inmunocaptura; (ii) determinar el
contenido de adenilato quinasa extracelular de un cultivo de dichas
bacterias; (iii) añadir el antibiótico lítico al cultivo e incubarlo
durante un periodo suficiente para permitir que el antibiótico
ejerza su efecto lítico, y (iv) determinar el contenido de adenilato
quinasa extracelular del cultivo para evaluar si la lisis ha tenido
lugar.
En este ensayo, las bacterias sensibles serían
lisadas por los antibióticos poco después de la adición del mismo,
generalmente en aproximadamente 15 minutos. Por tanto, el contenido
de adenilato quinasa libre del cultivo aumentaría
significativamente después de la adición de los antibióticos a
medida que las células bacterianas se rompieran abriéndose y
liberando adenilato quinasa intracelular. La medida óptima de los
niveles de adenilato quinasa se tomaría poco antes de la adición de
antibiótico, y después de nuevo al menos 15 minutos después de la
adición de antibiótico. El contenido de adenilato quinasa libre de
cultivos de bacterias resistentes permanecería constante en gran
medida. Por lo tanto, sólo se mediría el contenido de adenilato
quinasa extracelular, normalmente presente a bajo nivel, y, como se
explica anteriormente, éste permanece aproximadamente estacionario
para células en crecimiento sanas. Utilizando este método, puede
conseguirse una evaluación de la sensibilidad a antibiótico en un
periodo de aproximadamente 40 minutos.
El cultivo de bacterias utilizado en este método
puede comprender un medio de crecimiento selectivo que favorece
dichas bacterias como se discute anteriormente, ya que éste
minimizará cualquier resultado falso positivo como resultado de
contaminación.
Otras realizaciones de la invención evitan la
necesidad de utilizar cultivos aislados o puros de bacterias. En
particular, la invención proporciona adicionalmente un método para
determinar la sensibilidad de una bacteria a un antibiótico o
agente biostático, comprendiendo dicho método
(a) incubar una primera muestra de un cultivo de
dichas bacterias, una segunda muestra en presencia de dicho
antibiótico, una tercera muestra en presencia de un bacteriófago que
lise específicamente dichas bacterias diana, y una cuarta muestra en
presencia tanto de dicho bacteriófago como de dicho antibiótico;
(b) determinar el contenido de adenilato quinasa
de cada una de las primera a cuarta muestras después de cultivo;
y
(c) determinar la sensibilidad o resistividad de
las bacterias basándose en los resultados del ensayo de adenilato
quinasa y en el modo de acción del antibiótico o agente
biostático.
Puesto que las bacterias deben estar creciendo
activamente para ser sensibles al efecto antibiótico, podrían
utilizarse medios selectivos para una etapa de enriquecimiento
inicial. Ésta puede comprender una incubación de aproximadamente una
hora. Después de ese tiempo, las células diana pueden concentrarse,
si se desea, mediante inmunocaptura en medio selectivo fresco. El
efecto de añadir antibióticos a las células diana podría
determinarse utilizando medidas de adenilato quinasa en combinación
con lisis mediada por bacteriófago.
Para que un bacteriófago se reproduzca, la
célula huésped debe estar en la fase logarítmica de crecimiento. Si
se inhibe el crecimiento, por ejemplo debido a la presencia de un
antibiótico, entonces el fago no será capaz de replicarse y, por lo
tanto, no será capaz de causar la lisis de las células del huésped.
Utilizando el ensayo de adenilato quinasa junto con bacteriófago,
pueden determinarse las sensibilidades a antibióticos de bacterias
en 3 horas. El tiempo adicional es necesario para establecer células
en crecimiento sanas antes de exposición al antibiótico o infección
por el fago. Son posibles dos tipos de resultado de ensayo
dependiendo del modo de acción del antibiótico
referido.
referido.
Los resultados obtenidos se resumen en la Figura
4, en la que "-" indica un resultado que es consistente con la
detección de sólo adenilato quinasa extracelular, "+" indica un
resultado moderadamente positivo consistente con la detección de
adenilato quinasa intra- y extracelular de la muestra existente sin
crecimiento, y "++" indica la detección de niveles elevados de
adenilato quinasa consistentes con la lisis del cultivo en
crecimiento.
Como resulta evidente a partir de la Figura 4,
el patrón de los resultados obtenidos utilizando esta serie de
ensayos puede permitir una fácil distinción entre bacterias
sensibles y resistentes, a condición de que se conozca el modo de
acción (lítico o no lítico) del agente. Se crean diferentes efectos
como resultado de la interacción de los diversos reactivos con las
bacterias, como se explicará con más detalle en los ejemplos dados a
continuación.
Se ha encontrado que una comparación del
contenido de adenilato quinasa extracelular de un cultivo celular
con el contenido intracelular y extracelular total es indicativa del
estado de crecimiento y salud del cultivo celular.
Por lo tanto, una realización adicional más de
la invención proporciona un método de determinación de la fase de
crecimiento de un cultivo celular, comprendiendo dicho método:
(a) someter una primera muestra de dicho cultivo
bacteriano a un reactivo lítico para lisar las células bacterianas
del mismo;
(b) ensayar la adenilato quinasa en dicha
primera muestra y también en una segunda muestra de dicho cultivo
que no se ha expuesto al agente lítico; y
(c) comparar los resultados obtenidos a partir
de dichos primer y segundo cultivos y evaluar la etapa de
crecimiento del cultivo.
Los cultivos en fase logarítmica sanos tienen
niveles relativamente bajos de adenilato quinasa extracelular
(aproximadamente 1% de la adenilato quinasa total), la proporción de
adenilato quinasa extracelular permanece relativamente constante a
lo largo de la fase estacionaria y aumenta a medida que el cultivo
se aproxima a la fase estacionaria. Los cultivos en fase
estacionaria pueden tener como mucho un tercio de la adenilato
quinasa total en el medio de cultivo. Por lo tanto, utilizando la
adenilato quinasa, puede determinarse rápidamente la salud de
células, así como su número.
Este método puede utilizarse, por ejemplo, para
confirmar que un cultivo celular particular está creciendo bien, por
ejemplo, cuando se requiere un crecimiento óptimo, por ejemplo, en
fermentación y otros procesos en que se requieren productos
bacterianos. Como alternativa, puede ser necesario confirmar que las
células están creciendo fuertemente cuando se examinan antibióticos
o compuestos bacteriostáticos, de modo que se eviten resultados
falsos positivos debido a que se estén utilizando cultivos débiles o
en fase estacionaria en el ensayo. Además, puede utilizarse para
determinar qué efecto tienen factores medioambientales, tales como
temperatura o medio de cultivo, sobre el crecimiento de cualquier
cultivo particular.
En cada caso, el contenido de adenilato quinasa
puede evaluarse retirando muestras del cultivo y llevando a cabo un
ensayo de adenilato quinasa, por ejemplo, como se describe en las
solicitudes de patente internacional nº PCT/GB94/00118 (WO
94/17202) y PCT/GB94/01513 (WO 96/02665).
La invención proporciona también kits de ensayo
para efectuar los métodos de la invención. El kit de ensayo
contendrá componentes adecuados que permitan llevar a cabo el ensayo
particular. Por ejemplo, para kits de ensayo de sensibilidad a
antibióticos, puede comprender un intervalo de antibióticos, por
ejemplo, en estados liofilizado u otros conservados. Puede
comprender también reactivos para extraer adenilato quinasa de una
muestra tales como detergentes u otros agentes líticos químicos, así
como reactivos necesarios para ensayar adenilato quinasa, tales como
luciferina/luciferasa, etc. Además, para uso en situaciones en las
que se han de ensayar cultivos bacterianos mixtos, los kits pueden
contener bacteriófagos adecuados, también en estados conservados
tales como bacteriófagos liofilizados. Adicionalmente, los kits
pueden comprender medios de crecimiento selectivo adecuados. Los
reactivos pueden suministrarse en un envase de reacción adecuado tal
como una placa de múltiples pocillos.
La invención se describirá ahora particularmente
a modo de ejemplo con referencia a los dibujos de diagramas adjuntos
en los que:
la Figura 1 es una gráfica que muestra los
resultados de experimentos para medir la actividad adenilato quinasa
de células de E. coli;
la Figura 2 muestra los resultados de ensayos de
inmunocaptura de perlas magnéticas para Salmonella
typhimurium en un cultivo puro y en presencia de 3,5 x 10^{5}
células vegetativas de Bacillus subtilis var niger; en la
que \blacksquare muestra la actividad adenilato quinasa de células
capturadas por perlas; y \square muestra la actividad adenilato
quinasa de células residuales en la muestra (concretamente, en la
gráfica de la izquierda de células de Salmonella no
capturadas y en la gráfica de la derecha de éstas más células no
específicas;
la Figura 3 es una gráfica que muestra los
resultados de un experimento para investigar el transcurso temporal
de la liberación mediada por fago de adenilato quinasa a partir de
un cultivo de células de Escherichia coli;
la Figura 4 es un resumen de los resultados del
ensayo de antibióticos obtenibles utilizando una realización de la
invención;
la Figura 5 es un diagrama que muestra una placa
de ensayo para ensayar muestras bacterianas para resistencia a
antibióticos;
la Figura 6 muestra el efecto del fago 10359 y
ampicilina 50 mg/l con cultivos sensibles y resistentes a ampicilina
de E. coli 10243, en la que \medcirc representa los
resultados con E. coli 10243 sensible con ampicilina y fago
10359, \nabla representa los resultados sin agentes líticos y
\square representa los resultados con E. coli 10243
resistente con ampicilina y fago; y
la Figura 7 muestra el efecto del cloranfenicol
(34 mg/l) y el fago 10359 sobre cultivos de E. coli 10243, en
la que \medcirc representa sólo fago, \nabla representa fago
10359 y cloranfenicol, \square representa cloranfenicol solo y
\lozenge representa sin fago ni cloranfenicol.
Por ejemplo, en una realización, se divide una
muestra de células bacterianas en una primera y segunda muestras.
Se mezcla la primera muestra de células bacterianas con una solución
que contiene ADP y un detergente en presencia de iones magnesio.
Esto extrae la adenilato quinasa de todas las células presentes en
la muestra, permitiendo así que ocurra la reacción generadora de
ATP. Se permite proceder la reacción durante el tiempo necesario,
por ejemplo 5 minutos, después de lo cual se añade reactivo de
bioluminiscencia y se mide la luz resultante en un luminómetro. Un
ensayo realizado de este modo determina la cantidad total de
adenilato quinasa en una muestra, sea extracelular o
intracelular.
La segunda muestra se somete a un ensayo
similar, pero en ausencia de detergente, de modo que se mide sólo la
adenilato quinasa extracelular.
Se llevó a cabo un ensayo de inmunocaptura para
Salmonella typhimurium a partir de una muestra pura y a
partir de una muestra que contenía también 3,5 x 10^{5} células
vegetativas de Bacillus subtilis var niger (BG). El ensayo de
inmunocaptura se llevó a cabo en un volumen total de 300 \mul. La
etapa de inmunocaptura, sobre microperlas magnéticas recubiertas
con anticuerpo específico de S. typhimurium, llevó 10
minutos. Se lavaron las perlas inmovilizadas para retirar las
partículas no unidas, y se llevó a cabo una etapa de lisis no
específica para liberar la adenilato quinasa del material unido.
Ésta se detectó utilizando un ensayo de adenilato quinasa de 5
minutos.
Los resultados se muestran en la Figura 2. Las
gráficas muestran que aproximadamente un 70% de las células diana
pueden retirarse selectivamente de la suspensión, y que ésta no se
ve afectada en gran medida por la presencia de material
contaminante (las células BG).
Se estudió el transcurso temporal de la
liberación de adenilato quinasa a partir de un cultivo de células de
Escherichia coli, algunas de las cuales estaban infectadas
por bacteriófagos específicos de E. coli. Se retiraron
muestras de 100 \mul (que contienen cada una sólo 350 células) a
intervalos cronometrados a partir de un cultivo que se había
infectado con un bacteriófago específico de E. coli, y
después se ensayó la actividad adenilato quinasa extracelular
después de 40 minutos. Se muestran los resultados en la Figura 3, en
la que \medcirc = cultivo infectado y \medbullet = control no
infectado.
Resulta evidente a partir de estos resultados
que son detectables menos de 500 células utilizando este método.
Se dividen células de muestra (que pueden ser
cultivos mixtos o puros) en dos fracciones, y una se infecta con
bacteriófagos. Se divide después adicionalmente cada una de estas
fracciones en dos fracciones, exponiéndose una a antibiótico y
dejándose la otra sin tratar. Los niveles relativos de adenilato
quinasa extracelular producidos en un tiempo fijado muestran los
efectos tanto del antibiótico como del bacteriófago sobre las
células diana. Los resultados de ensayo conseguidos en la práctica
se ilustran en la Tabla 1.
Los resultados muestran el estado de resistencia
a antibióticos tanto de las células como de los controles para
asegurar que el ensayo ha funcionado correctamente.
| (1) Sin antibiótico sin fago | (2) Antibiótico sin fago |
| \begin{minipage}[t]{75mm} Sólo niveles bajos de adenilato quinasa extracelular (sin lisis)\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{75mm} Adenilato quinasa liberada mediante lisis debida a antibiótico\end{minipage} |
| (3) Sin antibiótico más fago | (4) Antibiótico más fago |
| \begin{minipage}[t]{75mm} Adenilato quinasa liberada mediante lisis causada por el fago\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{75mm} Adenilato quinasa liberada mediante lisis debida a antibiótico y fago. Niveles menores que (3) debido al crecimiento celular reducido y a la inhibición de la replicación de fago\end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
Bacterias
resistentes
| (1) Sin antibiótico sin fago | (2) Antibiótico sin fago |
| \begin{minipage}[t]{75mm} Sólo niveles bajos de adenilato quinasa extracelular (sin lisis)\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{75mm} Sólo niveles bajos de adenilato quinasa extracelular (sin lisis). Igual que en (1)\end{minipage} |
| (3) Sin antibiótico más fago | (4) Antibiótico más fago |
| \begin{minipage}[t]{75mm} Adenilato quinasa liberada mediante lisis causada por fago\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{75mm} Adenilato quinasa liberada mediante lisis debida a fago. Igual que en (3)\end{minipage} |
Puede medirse también rápidamente la
sensibilidad de las bacterias a antibióticos que no causan lisis
celular, pero inhiben el crecimiento celular de otros modos (y a
otros productos químicos que inhiben el crecimiento celular
bacteriano tales como agentes biostáticos), utilizando un método
similar.
El ensayo de sensibilidad de bacterias en
cultivo mixto a antibióticos no líticos se llevaría a cabo del mismo
modo que el ensayo de sensibilidad a antibióticos que causan lisis.
Sin embargo, puesto que las bacterias deben estar creciendo
activamente para permitir la infección por bacteriófago, la
sensibilidad a antibiótico se indicaría por una falta de lisis
mediada por fago en la muestra tratada.
Los resultados que se observaron se resumen en
la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
| (1) Sin antibiótico sin fago | (2) Antibiótico sin fago |
| \begin{minipage}[t]{75mm} Sólo bajos niveles de adenilato quinasa extracelular (sin lisis)\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{75mm} Sólo bajos niveles de adenilato quinasa extracelular (sin lisis). Pueden ser incluso menores que (1) por la inhibición del crecimiento\end{minipage} |
| (3) Sin antibiótico más fago | (4) Antibiótico más fago |
| \begin{minipage}[t]{75mm} Adenilato quinasa liberada mediante lisis causada por fago\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{75mm} Sólo bajos niveles de adenilato quinasa extracelular (sin lisis). Pueden ser incluso menores que (1) por la inhibición del crecimiento\end{minipage} |
Bacterias
resistentes
| (1) Sin antibiótico sin fago | (2) Antibiótico sin fago |
| \begin{minipage}[t]{75mm} Sólo bajos niveles de adenilato quinasa extracelular (sin lisis)\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{75mm} Sólo bajos niveles de adenilato quinasa extracelular (sin lisis). Igual que en (1)\end{minipage} |
| (3) Sin antibiótico más fago | (4) Antibiótico más fago |
| \begin{minipage}[t]{75mm} Adenilato quinasa liberada mediante lisis causada por fago\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{75mm} Adenilato quinasa liberada mediante lisis debida a fago. Igual que en (3)\end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
Un kit de ensayo adecuado comprende un envase de
muestra que podría ser típicamente una placa de plástico en la que
se forman una serie de pocillos como se ilustra en la Figura 5. El
volumen total de líquido que podría mantenerse en cada pocillo puede
ser de aproximadamente 0,5 ml. Las placas se prepreparan
adecuadamente de modo que pocillos particulares contengan
preparaciones liofilizadas apropiadas (o conservadas de otro modo)
de antibióticos y/o bacteriófagos, y opcionalmente también medios de
crecimiento selectivo.
En una placa tal como se muestra en la Figura 5,
se designa cada fila de 4 pocillos para utilizarse para ensayar la
resistencia a un antibiótico particular, así, utilizando esta placa,
podrían ensayarse simultáneamente 3 antibióticos.
En el uso, se añaden a cada pocillo
aproximadamente 0,2 ml de volumen de las muestras para ensayar, que
pueden ser cultivos puros, preparaciones enriquecidas por
inmunocaptura, muestras de medios selectivos o muestras puras, según
sea apropiado. Después de incubación, por ejemplo, a 37ºC durante 1
hora, pueden añadirse reactivos para medir la actividad adenilato
quinasa. Estos pueden ser reactivos que producen una señal
colorimétrica en presencia de adenilato quinasa, o más
preferiblemente, reactivos que generan una señal
bioluminiscente.
En particular, se añadieron ADP y una fuente de
iones magnesio, seguido después de 5 minutos por luciferina y
luciferasa. La emisión de luz se determinó en un pocillo cada vez
mediante transferencia a tubos y medida en un luminómetro de tubo
o, preferiblemente, se ensayó automáticamente la placa en un
luminómetro de placa o se formó una imagen de conjunto utilizando un
sistema de cámara CCD.
Se examinaron el efecto de antibióticos líticos
(ampicilina) y no líticos (cloranfenicol) sobre el crecimiento de
cultivo de E. coli.
Se introdujo un plásmido que codificaba
resistencia a la ampicilina (pUC18) en un cultivo puro de E.
coli 10243 para inducir resistencia sin alterar la especificidad
de huésped del fago. Se ensayó también la cepa resistente para
asegurar que portar el plásmido no alteraba su velocidad de
crecimiento o infección por el fago 10359, y se observó que era la
misma que la cepa sensible con respecto a crecimiento e
infección.
Se compararon la adenilato quinasa liberada a
partir de bacterias sensibles (no transformadas) y de bacterias
resistentes en presencia del bacteriófago 10359 de E. coli y
un antibiótico lítico (ampicilina) o no lítico (cloranfenicol).
Se infectaron cultivos en fase logarítmica tanto
de cepas resistentes como sensibles de E. coli 10243 con
10^{3} fagos 10359 a T_{0} y ampicilina 50 \mug/ml a T_{3}.
La lisis celular debida a ampicilina fue evidente a T_{10} y
significativa a T_{20} en la cepa sensible, enmascarando cualquier
efecto lítico debido al bacteriófago. La cepa resistente no se vio
afectada por el antibiótico, pero mostró lisis debido a la infección
por fago hasta T_{40}. Los resultados se muestran en la Figura 6.
Ésta muestra que, después de sólo 40 min de incubación en presencia
de ampicilina y fago, puede determinarse la sensibilidad de un
cultivo de E. coli 10243 hacia la ampicilina.
Se incubaron cultivos en fase logarítmica de
E. coli en presencia del fago 10359 y/o cloranfenicol (34
\mug/ml) durante un periodo de 80 min, y se ensayó la adenilato
quinasa como anteriormente. Los resultados se muestran en la Figura
7.
Se demostró una mayor lisis celular cuando se
incubaron cultivos tanto con bacteriófago como con cloranfenicol,
comparado con cloranfenicol solo. Aunque el cloranfenicol no es un
antibiótico lítico, se exhibieron lisis celulares durante el
transcurso de la incubación, probablemente debido a la muerte
celular. El grado de lisis mediada por fago fue considerablemente
menor en cultivos que contenían el antibiótico, porque las bacterias
no estaban creciendo bien y por tanto evitaban que el fago
completara su ciclo de replicación.
Siguiendo los resultados obtenidos con el
mutante resistente a ampicilina, se esperaría que un mutante
resistente a cloranfenicol se comportara igual tanto en presencia
como en ausencia del antibiótico. Por lo tanto, después de una
incubación de 60 min, el grado de aumento de la luminiscencia de
fondo indicaría si un cultivo era sensible o no al
cloranfenicol.
Claims (27)
1. El uso de un ensayo para adenilato quinasa en
un ensayo in vitro para el efecto de las condiciones externas
sobre las características de crecimiento de células bacterianas, en
el que el ensayo es evaluar la etapa de crecimiento de las
bacterias mediante la comparación del contenido de adenilato quinasa
extracelular de un cultivo celular con el contenido intracelular y
extracelular total.
2. Un método para determinar la sensibilidad de
un bacteria a un reactivo seleccionado de un antibiótico o agente
biostático o un compuesto sospechoso de tener propiedades
antibióticas o biostáticas, comprendiendo dicho método ensayar la
adenilato quinasa liberada mediante lisis de las bacterias a partir
de un cultivo que contiene dicho reactivo y comparar los resultados
con los obtenidos a partir de un ensayo de adenilato quinasa
similar que es del cultivo antes de la adición del reactivo y/o de
bacterias lisadas a partir de un cultivo similar que no contiene el
reactivo.
3. Un método según la reivindicación 2, en el
que las bacterias se lisan utilizando un agente lítico químico.
4. Un método según la reivindicación 2, en el
que el agente lítico es específico de una bacteria particular.
5. Un método según la reivindicación 4, en el
que el agente lítico es un bacteriófago que infecta y lisa un
género, especie o cepa bacteriano específico.
6. Un método según la reivindicación 2, en el
que las bacterias se lisan utilizando una enzima.
7. Un método según la reivindicación 6, en el
que la enzima es bacteriolisina.
8. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 7, en el que las bacterias se someten primero
a una etapa de separación para retirar sustancialmente cualquier
otra bacteria no diana en el cultivo.
9. Un método según la reivindicación 8, en el
que la separación se lleva a cabo utilizando un método de
inmunocaptura.
10. Un método según la reivindicación 9, en el
que dichas bacterias se concentran en una superficie sólida sobre
la que se inmovilizan anticuerpos o fragmentos de unión de los
mismos que son específicos de las bacterias diana.
11. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 10, en el que el cultivo comprende
adicionalmente un medio de crecimiento que favorece selectivamente
dichas bacterias.
12. Un método según la reivindicación 2 para
determinar la sensibilidad de una bacteria a un antibiótico lítico,
comprendiendo dicho método las etapas de (i) separar dichas
bacterias de otras especies microbianas, (ii) determinar el
contenido de adenilato quinasa extracelular de un cultivo de dichas
bacterias, (iii) añadir el antibiótico lítico al cultivo e incubarlo
durante un periodo suficiente para permitir que el antibiótico
ejerza su efecto lítico, y (iv) determinar el contenido de adenilato
quinasa extracelular del cultivo para evaluar si ha tenido lugar la
lisis.
13. Un método según la reivindicación 12, en el
que en la etapa (i) las bacterias se separan utilizando técnicas de
inmunocaptura.
14. Un método según la reivindicación 12 o la
reivindicación 13, en el que dicho cultivo de bacterias comprende
un medio de crecimiento selectivo que favorece dichas bacterias.
15. Un método según la reivindicación 2 para
determinar la sensibilidad de una bacteria a un antibiótico o agente
biostático, comprendiendo dicho método (a) incubar una primera
muestra de un cultivo de dichas bacterias, una segunda muestra en
presencia de dicho antibiótico o agente biostático, una tercera
muestra en presencia de un bacteriófago que lise específicamente
dichas bacterias diana y una cuarta muestra en presencia tanto de
dicho bacteriófago como de dicho antibiótico o agente biostático;
(b) determinar el contenido de adenilato quinasa de cada una de las
primera a cuarta muestras después del cultivo, y (c) determinar la
sensibilidad o resistividad de las bacterias basándose en los
resultados del ensayo de adenilato quinasa y en el modo de acción
del antibiótico o agente biostático.
16. Un método según la reivindicación 15, en el
que los resultados obtenidos en la etapa (c) se comparan con los
resultados dados en la Figura 4 en la presente memoria para
determinar si las bacterias son resistentes o sensibles al
antibiótico o agente biostático.
17. Un método según la reivindicación 15 o la
reivindicación 16, en el que la concentración de dichas bacterias en
el cultivo se aumenta antes de la etapa (a) mediante un
procedimiento de inmunocaptura.
18. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 17, en el que dichas muestras comprenden
adicionalmente un medio de crecimiento selectivo que favorece el
crecimiento de dichas bacterias con preferencia a otras especies
microbianas.
19. Un método de determinación de la fase de
crecimiento de un cultivo bacteriano, comprendiendo dicho método:
(a) someter una primera muestra de dicho cultivo bacteriano a un
reactivo lítico para lisar las células bacterianas en el mismo, (b)
ensayar la adenilato quinasa en dicha primera muestra, (c) ensayar
la adenilato quinasa en una segunda muestra de dicho cultivo que no
se ha expuesto al agente lítico, y (d) comparar los resultados
obtenidos a partir de dichos primer y segundo cultivos y evaluar la
etapa de crecimiento del cultivo.
20. Un método según la reivindicación 19, en el
que, en la etapa (c), los resultados que muestran que los niveles
de adenilato quinasa en la segunda muestra son del orden del 1% de
los niveles encontrados en la primera muestra, son indicativos de
un cultivo en fase logarítmica sano, y los niveles superiores al 1%
son indicativos de una progresión a la fase estacionaria.
21. Un método según la reivindicación 19 o la
reivindicación 20, en el que el agente lítico comprende un
detergente o un bacteriófago que infecta y lisa específicamente
células bacterianas diana particulares.
22. Un kit de ensayo para ensayar la
sensibilidad de las bacterias a reactivos según los métodos de las
reivindicaciones 1-21, comprendiendo dicho kit ADP,
una fuente de iones magnesio, luciferina y luciferasa y uno o más de
un antibiótico o agente biostático lítico y/o no lítico.
23. Un kit de ensayo según la reivindicación 22,
en el que los antibióticos o agentes biostáticos están
liofilizados.
24. Un kit de ensayo según cualquiera de las
reivindicaciones 22 ó 23, que comprende adicionalmente un agente
lítico.
25. Un kit de ensayo según la reivindicación 24,
en el que el agente lítico comprende un agente químico.
26. Un kit de ensayo según la reivindicación 24,
en el que el agente lítico comprende un bacteriófago que es
específico de las células bacterianas diana particulares.
27. Un kit de ensayo según una cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 26, que comprende adicionalmente una placa de
múltiples pocillos.
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